ES2628511T3 - Mezcla de vacunas meningocócicas liofilizadas con vacunas de D-T-Pa - Google Patents

Abstract

Un kit para su uso en el refuerzo de la respuesta inmunitaria de un paciente con una edad entre 10 y 18 años que se ha inmunizado previamente frente a (a) difteria, tétanos y tos ferina o (b) difteria, tétanos, tos ferina y meningitis meningocócica, que comprende: (i) un componente acuoso, que comprende una mezcla de toxoide de la difteria, toxoide del tétanos y antígenos de la tos ferina acelulares, en el que la concentración de toxoide de la difteria es < 10 Lf/ml y en el que el contenido de toxoide de la difteria medido en unidades Lf es menor que el contenido de toxoide del tétanos medido en unidades Lf; y (ii) un componente liofilizado, que comprende sacáridos capsulares conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis, en el que el componente acuoso y el componente liofilizado se han de combinar para administración para dar una vacuna líquida combinada que es adecuada para inyección.

Description

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DESCRIPCION

Mezcla de vacunas meningococicas liofilizadas con vacunas de D-T-Pa Campo tecnico

La presente invencion esta en el campo de la formulacion de vacunas de combinacion para inmunizar frente a difteria, tetanos, tos ferina y meningitis meningococica.

Antecedentes de la invencion

Las vacunas que contienen antfgenos de mas de un organismo patogeno en una dosis individual se conocen como vacunas "multivalentes" o de "combinacion", por ejemplo, las vacunas de difteria, tetanos y tos ferina ("DTP") y las vacunas de sarampion, paperas y rubeola ("MMR"). Las vacunas de combinacion ofrecen a los pacientes la ventaja de recibir un numero reducido de inyecciones, lo que conduce a la ventaja clmica de un aumento de cumplimiento (por ejemplo, vease el capftulo 29 de la referencia 1), particularmente para vacunacion pediatrica. Sin embargo, al mismo tiempo, presentan dificultades debidas a factores que incluyen: incompatibilidad ffsica y bioqmmica entre antigenos y otros componentes; interferencia inmunologica; y estabilidad. Algunas de estas dificultades se pueden abordar mediante la formulacion adecuada de la vacuna.

Las vacunas DTP se han combinado anteriormente con conjugados meningococicos. Por ejemplo, la referencia 2 preparo una vacuna completamente lfquida 8-valente de D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenC-MenWl35-MenY. Tambien desvela vacunas preparadas por mezcla de componentes acuosos de D-T-Pw-HBsAg con mezclas liofilizadas de conjugados meningococicos. Se desvela una formulacion lfquida/liofilizada similar en la referencia 3, donde se preparo una vacuna de combinacion 7-valente mediante el uso de una vacuna de combinacion lfquida 4-valente de D-T-Pw-HBsAg (TRITANRIX HEPB™) para reconstituir un componente de conjugado liofilizado de Hib-MenA-MenC (veanse tambien las referencias 29, 30, 76 y 99). De forma similar, la referencia 4 preparo una vacuna de combinacion 7-valente mediante el uso de una vacuna de combinacion lfquida 5-valente de D-T-Pa-IPV-HBsAg (INFANRIX PENTA™) para reconstituir un componente de conjugado liofilizado de MenC-MenY. La concentracion de antfgeno y adyuvante en estos tres documentos fueron, por mililitro:

Ref. 2 Ref. 3 Ref. 4

Toxoide de la difteria

15 Lf 15 Lf 50 Lf

Toxoide del tetanos

6,5 Lf 6,5 Lf 20 Lf

Tos ferina

Pw: 30 OU Pw: 30 OU Pa: 50 pg PT, 50 pg FHA, 16 pg PRN

Al+++

0,6 mg 1,26 mg 1,4 mg

El ejemplo 13 del documento de Patente US2005/0002948 A1 desvela un ensayo clmico en el que se administra un refuerzo de Td simultaneamente con TetraMenD a pacientes con una edad de l1 a 17 anos.

Es un objetivo de la invencion proporcionar formulaciones adicionales y mejoradas para vacunas de combinacion que incluyen antfgenos de difteria, tetanos, tos ferina y meningococicos, especialmente formulaciones que sean utiles para inmunizacion de adolescentes (por ejemplo, refuerzos).

Divulgacion de la invencion

De acuerdo con la invencion, se usa un componente lfquido que contiene antfgenos de D-T-Pa para reconstituir un componente meningococico liofilizado. En comparacion con las referencias 2 a 4, se usa un contenido menor de toxoide de la difteria, de un modo tal que las composiciones reconstituidas finales incluyen < 10 Lf/ml de toxoide de la difteria. A diferencia de las referencias 2 a 4, el contenido de toxoide de la difteria es menor que el contenido de toxoide del tetanos (medido en unidades Lf). En algunas realizaciones, tambien se usa un bajo contenido de toxoide de la tos ferina (< 25 pg/ml). Tambien se puede usar un bajo contenido de aluminio (< 0,84 mg/ml, medido como Al+++).

Mediante el uso de antfgenos de tos ferina acelulares (“Pa”), en lugar de antfgenos de tos ferina celulares (“Pw”), las vacunas de la invencion se pueden caracterizar con mas facilidad, de forma mas consistente y menos reactogenica que las vacunas de las referencias 2 y 3.

Mediante el uso de un contenido de toxoide de la difteria menor que la tecnica anterior, las vacunas de la invencion ofrecen una reactogenicidad menor y ademas, en adolescentes, abordan el potencial de supresion epitopica inducida por vefnculo, en la que el uso en exceso de un componente proteico, ya sea como un inmunogeno o como una protema vefnculo de conjugado, puede dar como resultado una eficacia reducida (vease tambien la introduccion de la referencia 5). Como la vacunacion pediatrica de rutina implica en la actualidad la administracion de diversos derivados de la toxina de la difteria (los ninos reciben el toxoide de la difteria en vacunas de la difteria y como

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protema vehnculo de la vacuna de conjugado meningococico 4-valente MENACTRA™, y reciben el mutante CRM197 de la toxina de la difteria como protema vehnculo en diversas vacunas de conjugado, que incluyen HIBTITER™, PREVENAR™, MENJUGATE™ y MENINGITEC™) entonces es util reducir la cantidad de toxoide de la difteria administrada en las vacunas, particularmente en vacunas de refuerzo de adolescentes. La dosificacion menor del componente que contiene DTPa tambien ayuda a mantener una dosis global menor de toxoide de la difteria cuando un conjugado meningococico usa toxoide de la difteria o un mutante del mismo como vehnculo.

Mediante el uso de un contenido de toxoide del tetanos menor que la vacuna DTPa de la tecnica anterior de la referencia 4 (por ejemplo, < 15 Lf/ml), se pueden preparar vacunas que aborden el potencial de supresion epitopica inducida por vehnculo cuando la vacunacion pediatrica implique un vehnculo de toxoide del tetanos, por ejemplo, del producto HIBERIX™. La dosificacion menor en el componente que contiene DTPa tambien ayuda a mantener una dosis global menor de toxoide del tetanos cuando un conjugado meningococico usa toxoide del tetanos como vehnculo.

Tambien se ha informado que la reduccion del contenido de toxoide de la tos ferina [6] y de la dosis de aluminio [7] es ventajosa en adolescentes.

De ese modo, la invencion proporciona un kit para su uso en el refuerzo de la respuesta inmunitaria de un paciente de una edad entre 10 y 18 anos que ha sido inmunizado previamente frente a (a) difteria, tetanos y tos ferina o (b) difteria, tetanos, tos ferina y meningitis meningococica que comprende: (i) un componente acuoso, que comprende una mezcla de toxoide de la difteria, toxoide del tetanos y antfgenos de la tos ferina acelulares, en el que la concentracion de toxoide de la difteria es <10 Lf/ml y en el que el contenido de toxoide de la difteria medido en unidades Lf es menor que el contenido de toxoide del tetanos medido en unidades Lf; y (ii) un componente liofilizado, que comprende sacaridos capsulares conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis. Para la administracion a un paciente, se combinan los componentes acuoso y liofilizado, para dar una vacuna lfquida combinada que es adecuada para inyeccion.

Por lo tanto, la invencion tambien proporciona una vacuna lfquida combinada para su uso en el refuerzo de la respuesta inmunitaria de un paciente de una edad entre 10 y 18 anos que ha sido inmunizado previamente frente a (a) difteria, tetanos y tos ferina o (b) difteria, tetanos, tos ferina y meningitis meningococica que comprende toxoide de la difteria, toxoide del tetanos, antfgenos de la tos ferina acelulares y sacaridos capsulares conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis, en la que la concentracion de toxoide de la difteria es < 10 Lf/ml y el contenido de toxoide de la difteria medido en unidades Lf es menor que el contenido de toxoide del tetanos medido en unidades Lf y en la que la vacuna incluye uno o mas estabilizadores de liofilizacion.

En la totalidad de estas realizaciones, el componente acuoso incluira por lo general un adyuvante, tal como una o mas sales de aluminio. En tales componentes, el contenido de aluminio es habitualmente menor que 1,7 mg/ml, y puede ser menor que 0,84 mg/ml, como se explica con mayor detalle posteriormente. El componente liofilizado tambien puede incluir un adyuvante, o en su lugar puede estar sin adyuvante.

En la totalidad de estas realizaciones, la concentracion de toxoide de la tos ferina en el componente acuoso sera por lo general menos que 25 pg/ml.

Componente liquido

Los kits y los procedimientos de la invencion implican el uso de un componente antigenico acuoso que incluye una mezcla de toxoide de la difteria, toxoide del tetanos y antfgenos de la tos ferina acelulares. La concentracion de toxoide de la difteria en el componente acuoso es <10 Lf/ml, por ejemplo < 5 Lf en un volumen de dosis de 0,5 ml. La concentracion de toxoide del tetanos en el componente acuoso es habitualmente < 15 Lf/ml, por ejemplo < 7,5 Lf en un volumen de 0,5 ml. La concentracion de toxoide de la difteria es menor que la concentracion de toxoide del tetanos, midiendose ambas concentraciones en unidades Lf.

La toxina de la difteria se produce por Corynebacterium diphtheriae, la causa de la difteria. La toxina se puede tratar (por ejemplo, usando formalina o formaldehndo) para retirar toxicidad mientras se retiene la capacidad de inducir anticuerpos espedficos anti-toxina despues de inyeccion. Estos toxoides de la difteria se usan en vacunas de la difteria, y se desvelan con mayor detalle en el capftulo 13 de la referencia 1. Los toxoides de la difteria preferentes son los preparados por tratamiento con formaldetndo. El toxoide de la difteria se puede obtener por crecimiento de C. diphtheriae en medio de crecimiento (por ejemplo, medio de Fenton, o medio de Linggoud y Fenton), que se puede complementar con extracto bovino, seguido de tratamiento con formaldehndo, ultrafiltracion y precipitacion. El material de toxoide se puede tratar a continuacion mediante un procedimiento que comprende filtracion esteril o dialisis.

La toxina del tetanos se produce por Clostridium tetani, la causa del tetanos. Como la difteria, la toxina del tetanos se puede tratar para dar un toxoide protector. Los toxoides se usan en vacunas del tetanos, y se desvelan con mayor detalle en el capftulo 27 de la referencia 1. Los toxoides preferentes del tetanos son los que se preparan por tratamiento con formaldehndo. El toxoide del tetanos se puede obtener por crecimiento de C. tetani en medio de crecimiento (por ejemplo, un medio de Latham obtenido a partir de casema bovina), seguido de tratamiento con formaldehndo, ultrafiltracion y precipitacion. El material se puede tratar despues mediante un procedimiento que

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comprende filtracion esteril y/o dialisis.

La Bordetella pertussis causa la tos ferina. Los anffgenos de la tos ferina de las vacunas comerciales son celulares (celula completa, en la forma de celulas inactivadas de B. pertussis; “Pw”) o acelulares (anffgenos espedficos de B. pertussis purificados; “Pa”). La invencion usa anffgenos de la tos ferina acelulares, que habitualmente incluyen uno, dos o (preferentemente) tres de los siguientes anffgenos purificados: (1) toxina de la tos ferina inactivada (toxoide de la tos ferina, o “PT”); (2) hemaglutinina filamentosa (“FHA”); (3) pertactina (tambien conocida como “protema de membrana exterior de 69 kiloDalton" o “PRN”). Estos tres anffgenos se pueden preparar por aislamiento de un cultivo de B. pertussis que ha crecido en medio ffquido modificado de Stainer-Scholte. La toxina de la tos ferina y la FHA se pueden aislar del caldo de fermentacion (por ejemplo, por adsorcion sobre gel de hidroxiapatita), mientras que la pertactina se puede extraer de las celulas por tratamiento termico y floculacion (por ejemplo, usando cloruro de bario). Los anffgenos se pueden purificar en etapas cromatograficas y/o de precipitacion sucesivas. La toxina de la tos ferina y la FHA se pueden purificar, por ejemplo, por cromatograffa hidrofoba, cromatograffa por afinidad y cromatograffa por exclusion de tamano. La pertactina se puede purificar, por ejemplo, por cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa hidrofoba y cromatograffa por exclusion de tamano. La FHA y la pertactina se pueden tratar con formaldetffdo antes del uso de acuerdo con la invencion. La toxina de la tos ferina se puede inactivar (destoxificar), para dar PT, por tratamiento con formaldetffdo y/o glutaraldehffdo; como alternativa a este procedimiento de detoxificacion qrnmica, PT puede ser una toxina mutante en la que se ha reducido la actividad enzimatica mediante mutagenesis [8] (por ejemplo, el mutante 9K/129G [9]), pero la detoxificacion por tratamiento qrnmico es mas habitual. Ademas del PT, la fHa y la pertactina, tambien es posible incluir fimbrias (por ejemplo, aglutinogenos 2 y 3) en un componente de anffgeno de la tos ferina acelular.

La concentracion de toxoide de la difteria en el componente acuoso es < 10 Lf/ml (es decir, < 5 Lf en un volumen de dosis de 0,5 ml). Dentro de este intervalo, una concentracion habitual de toxoide de la difteria esta entre 2 Lf/ml y 7 Lf/ml o entre 3 Lf/ml y 6 Lf/ml. Las concentraciones preferentes son aproximadamente 4 Lf/ml o aproximadamente 5 Lf/ml. La unidad “Lf” ("unidades de floculacion" o "dosis de floculacion calcarea") se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla de floculacion optima [10]. Para medir estas cantidades, el NIBSC, por ejemplo, suministra “Toxoide de Difteria, Normal” [11], que contiene 300 Lf por ampolla, y tambien suministra el "1° reactivo de referencia internacional para toxoide de la difteria para ensayo de floculacion" [12] que contiene 900 Lf por ampolla.

La concentracion de toxoide del tetanos en el componente acuoso puede estar en el intervalo de 1-30 Lf/ml. Dentro de este intervalo, una concentracion habitual de toxoide del tetanos esta entre 5 Lf/ml y 25 Lf/ml o entre 8 Lf/ml y 15 Lf/ml. Idealmente, el contenido es <15 Lf/ml, y preferentemente es aproximadamente 10 Lf/ml. Para medir las unidades Lf, el NIBSC, por ejemplo, suministra el "1° reactivo de referencia internacional para toxoide del tetanos para ensayo de floculacion" [13] que contiene 1000 Lf por ampolla.

El contenido de toxoide de la difteria es menor que el contenido de toxoide del tetanos, medido en unidades Lf, por ejemplo, una proporcion D:T entre 1:2 y 1:4, por ejemplo aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:2,5 o aproximadamente 1:3.

Cuando el componente acuoso incluye PT en un anffgeno de la tos ferina acelular, su concentracion puede estar en el intervalo de 1 pg/ml a 100 pg/ml o entre 2 pg/ml y 55 pg/ml. Una concentracion inferior a 25 pg/ml o inferior a 18 pg/ml es particularmente util, por ejemplo aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 16 pg/ml.

Cuando el componente acuoso incluye FHA en un anffgeno de la tos ferina acelular, su concentracion puede estar en el intervalo de 1 pg/ml a 100 pg/ml o entre 5 pg/ml y 55 pg/ml, por ejemplo aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 16 pg/ml.

Cuando el componente acuoso incluye pertactina en un anffgeno de la tos ferina acelular, su concentracion puede estar en el intervalo de 2 pg/ml a 20 pg/ml o entre 4 pg/ml y 10 pg/ml, por ejemplo aproximadamente 5 pg/ml o aproximadamente 6 pg/ml.

Cuando el componente acuoso incluye cada uno de PT, FHA y pertactina, sus proporciones en peso pueden variar, pero pueden ser, por ejemplo aproximadamente 16:16:5 o aproximadamente 5:10:6 (PT:FHA:PRN).

Cuando el componente acuoso incluye los tipos 2 y 3 de fimbrias en un anffgeno de la tos ferina acelular, su concentracion combinada puede estar en el intervalo de 2 pg/ml a 20 pg/ml o entre 5 pg/ml y 15 pg/ml, por ejemplo aproximadamente 10 pg/ml.

Un componente de la tos ferina acelular util tiene 10 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 5 pg/ml de FHA y 5 pg/ml de PRN. Otro componente de la tos ferina acelular util tiene 5 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 2,5 pg/ml de FHA y 2,5 pg/ml de PRN.

Ademas de los anffgenos D, T y Pa, el componente acuoso puede incluir un adyuvante. El ayudante puede comprender una o mas sales de aluminio, tales como hidroxido de aluminio y/o fosfato de aluminio. El contenido de aluminio (medido como Al+++) es habitualmente menor que 1,7 mg/ml, y puede ser menor que 0,84 mg/ml, por

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ejemplo entre 0,4-0,8 mg/ml, entre 0,5-0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,66 mg/ml, aproximadamente 0,27 mg/ml, etc.

Cuando la sal o sales de aluminio estan presentes en el componente acuoso, los antigenos D, T y/o Pa se pueden adsorber a ellas. Por ejemplo, todos los antigenos D, T y Pa se pueden adsorber individualmente a un adyuvante de hidroxido de aluminio y a continuacion mezclarse para preparar el componente acuoso. Como alternativa, todos los antigenos D, T y Pa se pueden adsorber individualmente a un adyuvante de fosfato de aluminio y a continuacion mezclarse. Tambien se pueden usar adsorcion secuencial, como tambien adsorcion a mezclas de diferentes sales de aluminio. Por lo general, los antigenos se adsorben completamente, aunque en ocasiones se puede evitar la adsorcion total para el toxoide del tetanos, por ejemplo, se puede usar una adsorcion entre un 0-10 % del toxoide del tetanos total.

Un componente de la tos ferina acelular util con adyuvante tiene 10 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 5 pg/ml de FHA, 5 pg/ml de PRN, 2 mg/ml de hidroxido de aluminio, 9 mg/ml de cloruro sodico y 0,1 mg/ml de timerosal. Otro componente de la tos ferina acelular util con adyuvante tiene 5 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 2,5 pg/ml de FHA, 2,5 pg/ml de PRN, 2 mg/ml de hidroxido de aluminio,

9 mg/ml de cloruro sodico y 0,1 mg/ml de timerosal.

Cuando se adsorben los antfgenos, una composicion puede ser una suspension con un aspecto turbio, lo que significa que la contaminacion microbiana puede no ser visible facilmente. De ese modo, un componente acuoso puede contener un conservante, particularmente cuando la vacuna se envasa en recipientes de multiples dosis. Sin embargo, es preferente no usar conservantes con mercurio (por ejemplo, timerosal), pero si no se puede evitar el mercurio entonces las composiciones debenan contener < 25 ng/ml de mercurio. Son preferentes las composiciones exentas de mercurio, y un conservante util que no tiene mercurio es 2-fenoxietanol (2-PE). Los niveles de 2-PE menores que 10 mg/ml son habituales, por ejemplo entre 4-7 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 5 mg/ml, o aproximadamente 6,6 mg/ml.

El componente acuoso estara habitualmente exento de sacarido o sacaridos capsulares meningococicos.

Dieciseis realizaciones espedficas del componente acuoso incluyen: (a) una mezcla exenta de conservante que comprende 2,5 Lf de toxoide de la difteria, 5 Lf de toxoide del tetanos, 2,5 pg de pertactina, 8 pg de FHA y 8 pg de toxoide de la tos ferina, habitualmente en un volumen de 0,5 ml; (b) una mezcla exenta de conservante que comprende 2,5 Lf de toxoide de la difteria, 5 Lf de toxoide del tetanos, 2,5 pg de pertactina, 8 pg de FHA, 8 pg de toxoide de la tos ferina, 4,5 mg de cloruro sodico y un adyuvante de hidroxido de aluminio con < 0,4 mg de Al+++, por ejemplo 0,3 mg de Al+++; (c) una mezcla que comprende 2,5 Lf de toxoide de la difteria, 5 Lf de toxoide del tetanos,

2.5 pg de pertactina, 8 pg de FHA, 8 pg de toxoide de la tos ferina, 4,5 mg de cloruro sodico, 2,5 mg de 2- fenoxietanol y un adyuvante de hidroxido de aluminio con < 0,6 mg de Al+++; (d) una mezcla exenta de conservante que comprende 5 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 5 pg/ml de pertactina, 16 pg/ml de FHA y 16 pg/ml de toxoide de la tos ferina; (e) una mezcla exenta de conservante que comprende 5 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 5 pg/ml de pertactina, 16 pg/ml de fHa, 16 pg/ml de toxoide de la tos ferina, 9 mg/ml de cloruro sodico y un adyuvante de hidroxido de aluminio con < 0,8 mg/ml de Al+++, por ejemplo 0,6 mg/ml de Al+++; (f) una mezcla que comprende 5 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 5 pg/ml de pertactina, 16 pg/ml de FHA, 16 pg/ml de toxoide de la tos ferina, 9 mg/ml de cloruro sodico, 5 mg/ml de 2-fenoxietanol y un adyuvante de hidroxido de aluminio con < 1,1 mg/ml de Al+++; (g) a (i) son las realizaciones (a) a (c) pero que incluyen tambien 40 DU de poliovirus de tipo 1, 8 DU de poliovirus de tipo 2, y 32 DU de poliovirus de tipo 3; (j) a (1) son las realizaciones (d) a (f) pero que incluyen tambien 80 DU/ml de poliovirus de tipo 1, 16 DU/ml de poliovirus de tipo 2, y 64 DU/ml de poliovirus de tipo 3; (m) una mezcla que comprende 2 Lf de toxoide de la difteria, 5 Lf de toxoide del tetanos, 3 pg de pertactina, 5 pg de FHA, 2,5 pg de toxoide de la tos ferina, 5 pg de los tipos 2 y 3 de fimbrias de la tos ferina, 3,3 mg de 2-fenoxietanol y un adyuvante de fosfato de aluminio con < 0,35 mg de Al+++; (n) una mezcla exenta de conservante que comprende 2 Lf de toxoide de la difteria, 5 Lf de toxoide del tetanos, 3 pg de pertactina, 5 pg de FHA, 2,5 pg de toxoide de la tos ferina, 5 pg de los tipos 2 y 3 de fimbrias de la tos ferina, y un adyuvante de fosfato de aluminio con < 0,35 mg de Al+++; (o) una mezcla que comprende 4 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 6 pg/ml de pertactina, 10 pg/ml de FHA, 5 pg/ml de toxoide de la tos ferina,

10 pg/ml de los tipos 2 y 3 de fimbrias de la tos ferina, 6,6 mg/ml de 2-fenoxietanol y un adyuvante de fosfato de aluminio con < 0,7 mg/ml de Al+++; (p) una mezcla exenta de conservante que comprende 4 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 6 pg/ml de pertactina, 10 pg/ml de FHA, 5 pg/ml de toxoide de la tos ferina, 10 pg/ml de los tipos 2 y 3 de fimbrias de la tos ferina, y un adyuvante de fosfato de aluminio con < 0,7 mg de Al+++. Siete realizaciones adicionales del componente acuoso comprenden: (a) 20 Lf/ml de toxoide del tetanos, 50 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 5 pg/ml de FHA y 5 pg/ml de PRN; (b) 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 25 Lf/ml de toxoide de la difteria, 5 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 2,5 pg/ml de FHA y 2,5 pg/ml de PRN; (c) 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 30 Lf/ml de toxoide de la difteria, 5 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 2,5 pg/ml de FHA y 2,5 pg/ml de PRN; (d) 20 Lf/ml de toxoide del tetanos, 50 Lf/ml de toxoide de la difteria, 5 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G),

2.5 pg/ml de FHA y 2,5 pg/ml de PRN; (e) 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 5 Lf/ml de toxoide de la difteria, 10 pg/ml de Pt (preferentemente el mutante 9K/129G), 5 pg/ml de FHA y 5 pg/ml de PRN; (f) 10 Lf/ml de toxoide del tetanos, 4 Lf/ml de toxoide de la difteria, 5 pg/ml de PT (preferentemente el mutante 9K/129G), 2,5 pg/ml de FHA y 2,5 pg/ml de PRN; y (g) entre 5-15 Lf/ml de toxoide del tetanos, entre 2-8 Lf/ml de toxoide de la difteria, entre 1-20 pg/ml de PT

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preferentemente como el mutante 9K/129G, entre 1-20 pg/ml de FHA, y 1-20 pg/ml de PRN.

Componente liofilizado (secado por congelacion)

Los kits y los procedimientos de la invencion usan un componente antigenico liofilizado que incluye conjugados de sacaridos capsulares meningococicos. La administracion de los conjugados meningococicos da como resultado preferentemente una respuesta de anticuerpo bactericida, con un aumento en el tftulo de ensayo bactericida en suero (SBA) para el serogrupo pertinente de al menos 4 veces, y preferentemente al menos 8 veces, medido con complemento humano [14]. Si se usa complemento de conejo para medir los tttulos de SBA, entonces el aumento de tftulo es preferentemente al menos 128 veces.

Se han aprobado vacunas monovalentes conjugadas frente al serogrupo C para uso humano, e incluyen MENJUGATE™ [15], MENINGITEC™ y NEISVaC-C™. Se conocen mezclas de conjugados de los serogrupos A+C [16,17] y se ha informado de mezclas de conjugados de los serogrupos A+C+W135+Y [18-21] y se aprobaron en 2005 como el producto acuoso MENACTRA™. El componente liofilizado usado con la invencion incluye sacaridos de los cuatro serogrupos A, C, W135 e Y.

Los conjugados de cada serogrupo pueden estar presentes en masas basicamente iguales, por ejemplo la masa de cada sacarido de serogrupo esta dentro de un ± 5 % entre sf. Sin embargo, en otras realizaciones la masa de sacarido de un serogrupo puede diferir de la masa de sacarido de otro serogrupo, por ejemplo un serogrupo puede tener una dosis 2 x que otro serogrupo. Una cantidad habitual de sacarido por serogrupo esta entre 1 pg y 20 pg, por ejemplo entre 2 y 10 pg. Para un serogrupo individual, la masa de sacarido por dosis de vacuna (por ejemplo, por volumen final de 0,5 ml) puede ser, por ejemplo, aproximadamente 2,5 pg, aproximadamente 4 pg, aproximadamente 5 pg o aproximadamente 10 pg.

Para composiciones que incluyen sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, algunos ejemplos de proporciones en masa adecuadas de A:C:W135:Y son 1:1:1:1, 2:1:1:1, 1:4:1:1, 1:2:1:1 y 2:2:1:1.

El sacarido capsular del meningococo del serogrupo A es un homopolfmero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato con uniones (a1^-6), con O-acetilacion parcial en las posiciones C3 y C4. La acetilacion en la posicion C-3 puede ser de un 70-95 %. Las condiciones usadas para purificar el sacarido pueden dar como resultado la des-O-acetilacion (por ejemplo, en condiciones basicas), pero es util retener OAc en esta posicion C-3. En algunas realizaciones, al menos un 50 % (por ejemplo, al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mas) de los restos de manosamina en los sacaridos del serogrupo A estan O-acetilados en la posicion C-3. Los grupos acetilo se pueden reemplazar con grupos bloqueantes para evitar la hidrolisis [22], y tales sacaridos modificados aun son sacaridos del serogrupo A dentro del significado de la invencion.

El sacarido capsular del serogrupo C es un homopolfmero de acido sialico con uniones (a 2^-9) (acido N-acetil neurammico, o “NeuNAc”). La estructura del sacarido se escribe como ^-9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(a2^-. La mayona de las cepas del serogrupo C tienen grupos O-acetilo en C-7 y/o C-8 de los restos de acido sialico, pero aproximadamente un 15% de los aislados clmicos carecen de estos grupos O-acetilo [23,24]. La presencia o ausencia de grupos OAc genera epttopos unicos, y la especificidad de la union del anticuerpo al sacarido puede afectar a su actividad bactericida frente a cepas O-acetiladas (OAc-) y des-O-acetiladas (OAc+) [25-27]. Los sacaridos del serogrupo C usados con la invencion se pueden preparar a partir de cepas OAc+ u OAc-. Las vacunas del conjugado MenC con licencia incluyen sacaridos tanto OAc- (NEIsVaC-C™) como OAc+ (MENJUGATE™ y MENINGITEC™). En algunas realizaciones, las cepas para la produccion de conjugados del serogrupo C son cepas OAc+, por ejemplo del serotipo 16, el serosubtipo P1,7a,1, etc. De ese modo, se pueden usar cepas OAc+ de C:16:P1,7a,1. Tambien son utiles las cepas OAc+ en el serosubtipo P1,1, tales como la cepa C 11.

El sacarido del serogrupo W135 es un polfmero de unidades de disacarido de acido sialico-galactosa. Al igual que el sacarido del serogrupo C, tiene una O-acetilacion variable, pero en las posiciones 7 y 9 del acido sialico [28]. La estructura se escribe como: ^4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2^6)-D-Gal-a-(1^-. Los sacaridos del serogrupo W135 usados de acuerdo con la invencion pueden tener cierto grado de O-acetilacion como se observa en los sacaridos capsulares nativos del serogrupo W135, o pueden estar parcial o totalmente des-O-acetilados en una o mas posiciones del anillo de sacarido, o pueden estar hiper-O-acetilados con respecto a los sacaridos capsulares nativos. En algunas realizaciones, no mas de un 50% (por ejemplo, como maximo un 40%, 30%, 20%, o 10%; por ejemplo, entre un 40% y un 45%) de los restos de acido sialico en un sacarido del serogrupo W135 estan O- acetilados en la posicion o posiciones C-7 y/o C-9.

El sacarido del serogrupo Y es similar al sacarido del serogrupo W135, excepto en que la unidad de repeticion de disacarido incluye glucosa en lugar de galactosa. Al igual que el serogrupo W135, tiene una O-acetilacion variable en las posiciones 7 y 9 del acido sialico [28]. La estructura del serogrupo Y se escribe como: ^4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)- a-(2^6)-D-Glc-a-(1^. Los sacaridos del serogrupo Y usados de acuerdo con la invencion pueden tener cierto grado de O-acetilacion como se observa en los sacaridos capsulares del serogrupo Y, o pueden estar parcial o totalmente des-O-acetilados en una o mas posiciones del anillo de sacarido, o pueden estar hiper-O-acetilados con respecto a los sacaridos capsulares nativos. En algunas realizaciones, no mas de un 50 % (por ejemplo, como maximo un 40 %, 30 %, 20 %, o 10 %; por ejemplo, entre un 40 % y un 45 %) de los restos de acido sialico en un sacarido del

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serogrupo Y estan O-acetilados en la posicion o posiciones C-7 y/o C-9.

Los restos de sacarido en los conjugados pueden comprender sacaridos de longitud completa que se preparan a partir de meningococos, y/o pueden comprender fragmented de sacaridos de longitud completa, es decir, los sacaridos pueden ser mas cortos que los sacaridos capsulares nativos observados en las bacterias. De ese modo, los sacaridos pueden estar despolimerizados, produciendose la despolimerizacion durante o despues de la purificacion del sacarido pero antes de la conjugacion. La despolimerizacion reduce la longitud de cadena de los sacaridos. Un procedimiento de despolimerizacion implica el uso de peroxido de hidrogeno [18]. El peroxido de hidrogeno se anade al sacarido (por ejemplo, para dar una concentracion final de H2O2 de un 1 %), y la mezcla se incuba a continuacion (por ejemplo, a aproximadamente 55 °C) hasta que se consigue la reduccion de longitud de cadena deseada. Otro procedimiento de despolimerizacion implica hidrolisis acida [19]. Otros procedimientos de despolimerizacion se conocen en la tecnica. Los sacaridos usados para preparar los conjugados para su uso de acuerdo con la invencion se pueden obtener mediante cualquiera de estos procedimientos de despolimerizacion. La despolimerizacion se puede usar con el fin de proporcionar una longitud de cadena optima para inmunogenicidad y/o para reducir la longitud de cadena para manejabilidad ffsica de los sacaridos. En algunas realizaciones, los sacaridos tienen el siguiente intervalo de grados medios de polimerizacion (Dp): A = 10-20; C = 12-22; W135 = 1525; Y = 15-25. En terminos de peso molecular, en lugar de Dp, los intervalos utiles son, para todos los serogrupos: < 100 kDa; 5 kDa-75 kDa; 7 kDa-50 kDa; 8 kDa-35 kDa; 12 kDa-25 kDa; 15 kDa-22 kDa.

Los sacaridos usados de acuerdo con la invencion pueden estar O-acetilados con el mismo patron de O-acetilacion que se observa en los sacaridos capsulares nativos, o pueden estar parcial o totalmente des-O-acetilados en una o mas posiciones de los anillos de sacarido, o pueden estar hiper-O-acetilados con respecto a los sacaridos capsulares nativos.

Algunas protemas vehteulo utiles (vease posteriormente) incluyen CRM197, toxoide de la difteria y/o toxoide del tetanos. Cuando el componente liofilizado incluye conjugados de mas de un serogrupo meningococico, entonces los diversos conjugados pueden usar diferentes protemas vehteulo (por ejemplo, un serogrupo en CRM197, otro en toxoide del tetanos) o pueden usar la misma protema vehteulo (por ejemplo, los sacaridos de dos serogrupos se conjugan por separado a CRM197 y a continuacion se combinan).

Los conjugados meningococicos adecuados se pueden preparar mediante los procedimientos que se desvelan, por ejemplo, en cualquiera de las referencias 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 75, 76, 97 y/o 99, o mediante cualquier otro procedimiento adecuado.

Un componente liofilizado preferente incluye los conjugados meningococicos de los serogrupos A, C, W135 e Y que se describen en las referencias 33 y 34.

Otro componente liofilizado util es sin adyuvante e incluye 5 |jg de sacarido capsular por cada uno de los serogrupos A, C, W135 e Y, conjugandose por separado cada sacarido de serogrupo a un vehteulo de toxoide del tetanos, como se describe en la referencia 35.

Como alternativa a la purificacion de sacaridos a partir de bacterias, se pueden preparar sacaridos mediante smtesis qmmica, en su totalidad o en parte [36,37].

Por razones de estabilidad, un componente liofilizado puede incluir un estabilizador tal como lactosa, sacarosa, trehalosa o manitol, asf como las mezclas de los mismos, por ejemplo mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol, etc. El uso de una mezcla de sacarosa/manitol puede acelerar el procedimiento de secado.

Un componente liofilizado tambien puede incluir cloruro sodico.

Los componentes solubles en el material liofilizado se retendran en la composicion despues de la reconstitucion. De ese modo, la vacuna combinada final puede contener uno o mas estabilizadores (por ejemplo, puede incluir lactosa y/o sacarosa) y puede contener cloruro sodico.

El componente liofilizado puede incluir o no incluir un adyuvante, tal como una sal de aluminio.

El componente liofilizado estara habitualmente exento de antfgeno o antfgenos de la tos ferina. Tambien estara habitualmente exento de toxoide de la difteria y toxoide del tetanos, excepto por cualquier toxoide que se haya usado como protema vehteulo durante la conjugacion del conjugado o conjugados meningococicos.

Algunas realizaciones espedficas del componente liofilizado incluyen: (a) una mezcla que comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a CRM197, para dar una dosis final de vacuna de 10 jg para el serogrupo A y 5 jg para los serogrupos C, W135 e Y; (b) una mezcla que comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a toxoide de la difteria, para dar una dosis final de vacuna de 5 jg para cada serogrupo; (c) una mezcla que comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a toxoide del tetanos, para dar una dosis final de vacuna de 2,5 jg para cada serogrupo; (d) una mezcla que comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a toxoide del tetanos, para dar una dosis final de vacuna de 5 jg para cada serogrupo; (e) una mezcla que

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comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a toxoide del tetanos, para dar una dosis final de vacuna de 2,5 |jg para los serogrupos A, W135 e Y y 10 |jg para el serogrupo C; (f) una mezcla que comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a toxoide del tetanos, para dar una dosis final de vacuna de 2,5 jg para los serogrupos A, W135 e Y y 5 jg para el serogrupo C; y (g) una mezcla que comprende sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Y, cada uno conjugado por separado a toxoide del tetanos, para dar una dosis final de vacuna de 2,5 jg para los serogrupos W135 e Y y 5 jg para los serogrupos A y C.

Envasado de las composiciones de la invencion

Los componentes humedos y secos usados con la invencion se deben mantener separados entre sf antes de su uso. De ese modo, se envasan por separado en forma de un kit. El kit puede tener diversas formas.

En algunas realizaciones, los dos componentes se envasan en recipientes separados. En otras realizaciones, los dos componentes se envasan en camaras separadas de un recipiente individual, por ejemplo, en recipientes separados de una jeringa de multiples camaras. Una jeringa de camara doble permite que se mantengan por separado dos composiciones individuales durante su almacenamiento, pero que se mezclen cuando se activa el embolo de la jeringa.

El material liofilizado se presentara habitualmente en un vial cerrado hermeticamente. El vial tendra una abertura (por ejemplo, un sello de caucho, un cuello rompible, etc.) que puede mantener la esterilidad mientras permite la retirada de sus contenidos y/o la introduccion de material acuoso para reconstitucion. Los viales se pueden fabricar de diversos materiales, por ejemplo, de vidrio, de plastico, etc.

El material acuoso tambien se puede presentar en un vial, pero como alternativa se puede presentar, por ejemplo, en una jeringa. De nuevo, el recipiente sera capaz de mantener la esterilidad mientras que permita la retirada de sus contenidos. Una jeringa se puede aplicar con o sin una aguja unida a ella; en el ultimo caso, se puede envasar una aguja separada con la jeringa para su montaje y uso, y la jeringa tendra generalmente un tapon de punta para cerrar hermeticamente la punta antes de la union de una aguja. Son preferentes las agujas de seguridad. Son habituales agujas de calibre 23 de 2,54 cm, calibre 25 de 2,54 cm y calibre 25 de 1,56 cm. El embolo de la jeringa puede tener un tope para evitar que el embolo se retire accidentalmente durante la aspiracion. Las jeringas se pueden fabricar de diversos materiales, por ejemplo, de vidrio, plastico, etc.

Un vial puede tener un tapon (por ejemplo, un cierre de tipo Luer) adaptado de un modo tal que la jeringa se pueda insertar en el tapon, los contenidos de la jeringa se puedan expeler al vial (para reconstituir el material liofilizado en el mismo), y los contenidos del vial se puedan retirar de vuelta a la jeringa. Despues de la retirada de la jeringa del vial, se puede acoplar a continuacion una aguja y la composicion se puede administrar a un paciente. El tapon se puede situar en el interior de un sello o cubierta, de un modo tal que el sello o la cubierta se tenga que retirar antes de que se pueda acceder al tapon.

Cuando el material se envasa en un recipiente, el recipiente se esterilizara habitualmente antes de que se anada el material al mismo.

Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringa o un vial), entonces se puede fabricar de forma util de vidrio de borosilicato en lugar de vidrio sodocalcico.

Reconstitucion

Antes de la administracion a un paciente, la invencion implica la reconstitucion de un componente antigenico liofilizado (que contiene al menos un conjugado meningococico) con un componente acuoso (que contiene al menos antfgenos de D-T-Pa). La reconstitucion puede implicar diversas etapas.

Si los componentes estan presentes en una jeringa de multiples camaras, entonces el accionamiento de la jeringa combinara los materiales acuoso y seco. Cuando los componentes estan presentes en recipientes separados, se pueden usar diferentes procedimientos de mezcla. En algunas realizaciones, el material acuoso en un vial se puede extraer a una jeringa (por ejemplo, a traves de una aguja), o ya puede estar presente en una jeringa. El material acuoso se puede transferir a continuacion de la jeringa a un vial que contiene el material liofilizado (por ejemplo, a traves de una aguja, que puede ser igual o diferente que la aguja usada previamente para extraer el material acuoso del vial). El material liofilizado se reconstituye de ese modo y se puede extraer (por ejemplo, a traves de una aguja, de nuevo siendo igual o diferente que la aguja usada anteriormente) a una jeringa (por ejemplo, igual o diferente que la jeringa usada anteriormente), desde la que se puede inyectar a un paciente (por ejemplo, a traves de una aguja, de nuevo siendo igual o diferente que la aguja usada anteriormente).

Una vez se han combinado el material liofilizado y el material acuoso y estan presentes en un dispositivo de suministro (por lo general una jeringa), entonces la composicion se puede administrar a un paciente. La reconstitucion tendra lugar por lo general inmediatamente antes de la administracion a un paciente, por ejemplo no mas de 30 minutos antes de la inyeccion.

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Despues de la reconstitucion, la composicion para la administracion a un paciente incluira toxoide de la difteria, toxoide del tetanos, antigeno o antfgenos de la tos ferina acelulares y conjugado o conjugados meningococicos. Los antigenos de D, T y Pa tienen su origen en el material acuoso original y el conjugado meningococico tiene su origen en el material liofilizado original. Habitualmente, el componente acuoso estara exento de sacaridos capsulares meningococicos.

Procedimientos de tratamiento y administracion de la vacuna

La invencion implica la administracion conjunta de D, T, Pa y conjugados meningococicos en forma de una vacuna de combinacion. Las composiciones reconstituidas son adecuadas para administracion a pacientes humanos, y la invencion se refiere al uso de las composiciones reconstituidas en un procedimiento para aumentar la respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende la etapa de administrar al paciente una composicion de la invencion.

Las composiciones reconstituidas de la invencion son vacunas, para su uso en la reduccion o prevencion de difteria, tetanos, tos ferina y meningitis. Las vacunas se usan como vacunas de refuerzo en pacientes que se han inmunizado previamente frente a (a) difteria, tetanos y tos ferina o (b) difteria, tetanos, tos ferina y meningitis meningococica.

Los pacientes que reciben las composiciones de la invencion son adolescentes con una edad entre 10 y 18 anos.

Las composiciones de la invencion se pueden administrar mediante inyeccion intramuscular, por ejemplo en el brazo, pierna o nalgas.

Cuando las composiciones de la invencion incluyen un adyuvante basado en aluminio, se puede producir la sedimentacion de los componentes durante el almacenamiento. Por lo tanto, las composiciones acuosas se tendnan que agitar antes y despues de la reconstitucion, antes de la administracion a un paciente.

Conjugacion

La invencion usa conjugados meningococicos en los que se conjugan sacaridos capsulares a protemas vehmulo. Algunas protemas vetnculo utiles para conjugacion covalente son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de la difteria o toxoide del tetanos, o derivados de los mismos tales como el mutante de la toxina de la difteria CRM197 [38-40]. Otras protemas vetnculo adecuadas incluyen la protema de membrana exterior de N. meningitidis [41], peptidos sinteticos [42,43], protemas de choque termico [44,45], protemas de la tos ferina [46,47], citoquinas [48], linfoquinas [48], hormonas [48], factores de crecimiento [48], protemas artificiales que comprenden multiples epftopos de linfocitos T humanos CD4+ de diversos antfgenos derivados de patogenos [49] tales como N19 [50], protema D de H. influenzae [51-53], neumolisina [54] o sus derivados no toxicos [55], protema de superficie neumococica PspA [56], protemas de captacion de hierro [57], toxina A o B de C. difficile [58], exoprotema A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [59], etc.

En la actualidad, el toxoide de la difteria (Dt), el toxoide del tetanos (Tt) y CRM197 son los vehmulos principales en uso en vacunas pediatricas, por ejemplo los conjugados de Hib de GSK (por ejemplo, como los presentes en HIBERIX™ y INFANRIX HEXA™) usan Tt como vehmulo, el producto HIBTITER™ usa CRM197, los conjugados neumococicos de PREVENAR™ usan CRM197, los productos MENJUGATE™ y MENINGITEC™ usan CRM197, y NEISVAC-C™ usa Tt.

Se pueden usar conjugados con una proporcion de sacarido:protema (p/p) entre 1:5 (es decir, protema en exceso) y 5:1 (es decir, sacarido en exceso), por ejemplo proporciones entre 1:2 y 5:1 y proporciones entre 1:1,25 y 1:2,5.

Se pueden usar conjugados junto con protema vehmulo libre [60], particularmente cuando el vehmulo de uno o mas conjugados es un toxoide de la difteria, toxoide del tetanos o antfgeno de la tos ferina.

Por lo general, el sacarido se activara o se funcionalizara antes de la conjugacion. La activacion puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianacion tales como CDAP (por ejemplo, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio [61,62,etc.]). Otras tecnicas adecuadas usan esteres activos, carbodiimidas, hidrazidas, norborano, acido p- nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; vease tambien la introduccion a la referencia 94). Se puede usar aminacion reductora para introducir un grupo amino reactivo.

Se puede usar un procedimiento que implica la introduccion de grupos amino en el sacarido (por ejemplo, por reemplazo de los grupos =O terminales con -NH2) seguido de derivatizacion con un diester adfpico (por ejemplo, N- hidroxisuccinimido diester del acido adfpico) y reaccion con la protema vehmulo. En otra reaccion util, se derivatiza un sacarido con un reactivo de cianacion, seguido de acoplamiento a una protema (directo, o despues de la introduccion de un grupo nucleofilo tiol o hidrazida en el vehmulo), sin la necesidad de usar un conector. Algunos reactivos de cianacion adecuados incluyen tetrafluoroborato de 1-ciano-4-(dimetilamino)-piridinio (“CDAP”), cianato de p-nitrofenilo y tetrafluoroborato de N-cianotrietilamonio (“CTEA”).

La protema vehmulo se puede conjugar covalentemente al sacarido directamente o a traves de un conector. Se conocen diversos conectores, por ejemplo un conector de acido adfpico, que se puede usar por acoplamiento de un

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grupo -NH2 libre (por ejemplo, introducido en un sacarido mediante aminacion reductora) con un acido ad^pico activado (usando, por ejemplo, activacion con diimida), y a continuacion acoplamiento de una protema al compuesto intermedio de sacarido-acido ad^pico resultante [63,64]. Otro tipo de union es un conector de carbonilo, que se puede formar por reaccion de un grupo hidroxilo libre de un glicano modificado con CDI [65,66] seguido de reaccion con una protema para formar una union carbamato. Otros conectores incluyen p-propionamido [67], nitrofenil- etilamina [68], haluros de haloacilo [69], uniones glicosfdicas [70], acido 6-aminocaproico [71], N-succinimidil-3-(2- piridilditio)-propionato (SPDP) [72], dihidrazida del acido ad^pico ADH [73], restos C4 a C12 [74], etc. Tambien se puede usar condensacion con carbodiimida [75]. La union mas preferente entre un vehmulo y un sacarido es a traves de un conector de acido adfpico.

Los sacaridos se uniran por lo general covalentemente, ya sea directamente o a traves de un conector, a un vehmulo a traves de un grupo -NH2 libre en el vehmulo, por ejemplo, en una cadena lateral de lisina, una cadena lateral de arginina o en N-terminal. La union a traves de -SH tambien es posible, por ejemplo en una cadena lateral de cistema.

Los conjugados de CRM197 de la invencion se pueden obtener como se describe en la referencia 33.

Como se describe en la referencia 76, una mezcla puede incluir un conjugado con una union directa de sacarido/protema y otro conjugado con union a traves de un conector. Sin embargo, de acuerdo con la invencion es preferente que cada conjugado incluya un conector.

Despues de la conjugacion, se pueden separar los sacaridos libres y conjugados. Existen numerosos procedimientos adecuados para esta separacion, incluyendo cromatograffa hidrofoba, ultrafiltracion tangencial, diafiltracion, etc. (veanse tambien las referencias 77 y 78, etc.). Si una vacuna comprende un sacarido dado tanto en forma libre como conjugado, la forma sin conjugar es, de forma util, no mas de un 20 % en peso de la cantidad total de ese sacarido en la composicion en su conjunto (por ejemplo < 15 %, <10 %, < 5 %, < 2 %, < 1 %).

La cantidad de vehmulo (conjugado y sin conjugar) de cada conjugado puede ser no mas de 100 pg/ml, por ejemplo < 30 pg/ml de protema vehmulo de cada conjugado. Algunas composiciones incluyen una concentracion total de vehmulo menor que 500 pg/ml, por ejemplo < 400 pg/ml, < 300 pg/ml, < 200 pg/ml, < 100 pg/ml, < 50 pg/ml, etc.

Caractensticas de las composiciones de la invencion

Ademas de los componentes antigenicos descritos anteriormente, las composiciones de la invencion (tanto antes como despues de mezclarse) incluiran generalmente un componente no antigenico. El componente no antigenico puede incluir vehmulos, adyuvantes, excipientes, tampones, etc., como se describe con mayor detalle posteriormente.

Las composiciones de la invencion incluiran habitualmente uno o mas vehmulos y/o excipientes farmaceuticos. La solucion salina fisiologica tamponada con fosfato exenta de pirogenos esteril es un vehmulo habitual. Una discusion minuciosa de excipientes farmaceuticamente aceptables esta disponible en la referencia 79.

Para controlar la tonicidad, es util incluir una sal fisiologica, tal como una sal sodica. El cloruro sodico (NaCl) es una de tales sales, que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml.

Las composiciones acuosas (antes y/o despues de reconstitucion del material liofilizado) tendran generalmente una osmolalidad entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo entre 240-360 mOsm/kg, o dentro del intervalo de 290-320 mOsm/kg.

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas tampones. Algunos tampones habituales incluyen: un tampon de fosfato; un tampon de Tris; un tampon de borato; un tampon de succinato; un tampon de histidina; o un tampon de citrato. Los tampones se incluiran por lo general en el intervalo de 5-20 mM. Tales tampones se pueden incluir en los componentes acuoso y/o liofilizado.

El pH de una composicion acuosa estara generalmente entre 5,0 y 7,5, y mas habitualmente entre 5,0 y 6,0 para una estabilidad optima, o entre 6,0 y 7,0.

Las composiciones de la invencion son preferentemente esteriles.

Las composiciones de la invencion son preferentemente no pirogenicas conteniendo, por ejemplo, < 1 EU (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis, y preferentemente <0,1 EU por dosis.

Las composiciones de la invencion pueden estar exentas de gluten.

Las composiciones de la invencion se pueden administrar a pacientes en dosis de 0,5 ml. Se entendera que las referencias a dosis de 0,5 ml incluyen la varianza normal, por ejemplo 0,5 ml ± 0,05 ml. De ese modo, un componente acuoso usado con la invencion puede tener un volumen de 0,5 ml.

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Adyuvantes

Las composiciones de la invencion pueden incluir un adyuvante, y este adyuvante puede comprender una o mas sales de aluminio, y particularmente un adyuvante de fosfato de aluminio y/o un adyuvante de hidroxido de aluminio. Los componentes antigenicos usados para preparar las composiciones de la invencion pueden incluir adyuvantes de aluminio antes de usarse, es decir, estan "premezclados" o "preadsorbidos" en el adyuvante o adyuvantes.

En la actualidad, los adyuvantes de aluminio en uso se denominan por lo general adyuvantes de "hidroxido de aluminio" o de "fosfato de aluminio". Sin embargo, estos son nombres dados por conveniencia, ya que ninguno de los dos es una descripcion precisa de la composicion qmmica real que esta presente (por ejemplo, vease el capftulo 9 de la referencia 80). La invencion puede usar cualquiera de las sales de "hidroxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes.

Los adyuvantes conocidos como "hidroxido de aluminio" son por lo general sales de oxihidroxido de aluminio, que son habitualmente al menos parcialmente cristalinas. El oxihidroxido de aluminio, que se puede representar mediante la formula AIO(OH), se puede distinguir de otros componentes de aluminio, tales como hidroxido de aluminio Al(OH)3, mediante espectroscopfa infrarroja (IR), en particular mediante la presencia de una banda de absorcion a 1070 cm-1 y un hombro fuerte a 3090-3100 cm-1 (capftulo 9 de la referencia 80).

Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son por lo general hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo tambien contienen una pequena cantidad de sulfato. Se pueden obtener por precipitacion, y las condiciones de reaccion y las concentraciones durante la precipitacion pueden influir en el grado de sustitucion de fosfato por hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos tienen por lo general una proporcion molar de PO^Al entre 0,3 y 0,99. Los hidroxifosfatos se pueden distinguir del AlPO4 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda del espectro IR a 3164 cm-1 (por ejemplo cuando se calienta a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capftulo 9 de la referencia 80).

La proporcion molar de PO4/Al3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estara generalmente entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y mas preferentemente 0,95 ± 0,1. El fosfato de aluminio sera generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante habitual es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporcion molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio estara generalmente formado por particulas. Los diametros habituales de las particulas estan en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo aproximadamente 5-1 pm) despues de la adsorcion de antigeno.

El PZC del fosfato de aluminio es inversamente proporcional al grado de sustitucion de fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitucion puede variar dependiendo de las condiciones de reaccion y la concentracion de reactivos usadas para preparar la sal por precipitacion. El PZC tambien se altera por cambio de la concentracion de los iones fosfato libres en solucion (mas fosfato = PZC mas acido) o por adicion de un tampon tal como un tampon de histidina (hace el PZC mas basico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invencion tendran generalmente un PZC entre 4,0 y 7,0, mas preferentemente entre 5,0 y 6,5 por ejemplo aproximadamente 5,7.

Una solucion de fosfato de aluminio usada para preparar una composicion de la invencion puede contener un tampon (por ejemplo, un tampon de fosfato o de histidina o de Tris), pero esto no siempre es necesario. La solucion de fosfato de aluminio es preferentemente esteril y exenta de pirogenos. La solucion de fosfato de aluminio puede incluir iones fosfato acuosos libres, por ejemplo presentes en una concentracion entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y mas preferentemente aproximadamente 10 mM. La solucion de fosfato de aluminio tambien puede comprender cloruro sodico. La concentracion de cloruro sodico esta preferentemente en el intervalo de 0,1 a 100mg/ml (por ejemplo 0,5-50 mg/ml, 1-20 mg/ml, 2-10 mg/ml) y es mas preferentemente aproximadamente 361 mg/ml. La presencia de NaCl facilita la medida correcta de pH antes de la adsorcion de antigenos.

Antigenos adicionales que se pueden incluir

Ademas de incluir antigenos de D, T, Pa y de sacaridos de N. meningitidis conjugados, las composiciones pueden incluir uno o mas antigenos adicionales. Por ejemplo, pueden incluir antigenos de otros patogenos, particularmente de bacterias y/o virus. Algunos antigenos adicionales adecuados se pueden seleccionar entre:

antigeno de superficie del virus de la hepatitisB (VHB) ("HBsAg"); vacuna de poliovirus inactivada (IPV); sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B; sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae; antigeno del virus de la hepatitis A (VHA).

Estos antigenos pueden tener su origen en el componente acuoso o liofilizado de la invencion.

Antigeno de superficie del virus de la hepatitis B

El virus de la hepatitis B (VHB) es uno de los agentes conocidos que causa hepatitis viral. El virion del VHB consiste en un nucleo interior rodeado por un revestimiento proteico exterior o capside, y el nucleo viral contiene el genoma

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de ADN viral. El componente principal de la capside es una protema conocida como antigeno de superficie del VHB o, mas habitualmente, "HBsAg", que es por lo general un polipeptido de 226 aminoacidos con un peso molecular de ~24 kDa. Todas las vacunas existentes de hepatitis B contienen HBsAg, y cuando este antigeno se administra a un individuo vacunado normal estimula la produccion de anticuerpos anti-HBsAg que protegen frente a la infeccion del VHB.

Para la fabricacion de la vacuna, se produce HBsAg de dos formas. El primer procedimiento implica purificar el antigeno en forma de partmulas a partir del plasma de portadores de hepatitis B cronicos, ya que se sintetizan grandes cantidades de HBsAg en el hngado y se liberan al torrente sangumeo durante la infeccion por VHB. La segunda via implica expresar la protema mediante procedimientos de ADN recombinante. El HBsAg para el uso con el procedimiento de la invencion se expresa preferentemente de forma recombinante en celulas de levadura. Tales levaduras incluyen, por ejemplo, hospedadores de Saccharomyces (tal como S. cerevisiae) o Hanensula (tal como H. polymorpha).

El HBsAg esta habitualmente sin glicosilar. A diferencia del HBsAg nativo (es decir, como producto purificado de plasma), el HBsAg expresado en levadura esta generalmente sin glicosilar, y esta es la forma mas preferente de HBsAg para su uso con la invencion, debido a que es altamente inmunogenico y se puede preparar sin el riesgo de contaminacion del producto sangumeo.

El HBsAg estara generalmente en forma de partmulas basicamente esfericas (diametro medio de aproximadamente 20 nm), que incluyen una matriz lipfdica que contiene fosfolfpidos. Las partmulas de HBsAg expresadas en levadura pueden incluir fosfatidilinositol, que no se encuentra en los viriones naturales del VHB. Las partmulas tambien pueden incluir una cantidad no toxica de LPS con el fin de estimular el sistema inmune [81]. El HBsAg puede estar en forma de partmulas que incluyen una matriz lipfdica que contiene fosfolfpidos, fosfatidilinositol y polisorbato 20.

Todos los subtipos de VHB conocidos contienen el determinante comun "a". Combinado con otros determinantes y subdeterminantes, se han identificado nueve subtipos: aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- y adrq+. Ademas de estos subtipos, han surgido otras variantes, tales como mutantes del VHB que se han detectado en individuos inmunizados ("mutantes de escape"). El subtipo habitual de VHB de acuerdo con la invencion es el subtipo adw2.

Ademas de la secuencia “S”, el antfgeno de superficie puede incluir la totalidad o una parte de una secuencia pre-S, tal como la totalidad o una parte de una secuencia pre-S1 y/o pre-S2.

Las cantidades de HBsAg se expresan por lo general en microgramos, y una cantidad habitual de HBsAg por dosis de vacuna esta entre 5 y 25 |jg, por ejemplo 10 jg/dosis.

Aunque el HBsAg se puede adsorber en un adyuvante de hidroxido de aluminio en la vacuna final (como en el producto bien conocido ENGERlX-B™), o puede permanecer sin adsorber, generalmente se adsorbera en un adyuvante de fosfato de aluminio [82].

Cuando se usa con la invencion, HBsAg estara por lo general en el componente acuoso.

Vacuna de poliovirus inactivada

El poliovirus causa la poliomielitis. En lugar de usar la vacuna de poliovirus oral, la invencion puede usar IPV, como se desvela con mayor detalle en el capftulo 24 de la referencia 1.

Los poliovirus se pueden cultivar en cultivo celular, y un cultivo preferente usa una lmea celular Vero, obtenida a partir de rinon de mono. Las celulas Vero se pueden cultivar convenientemente sobre microvehmulos. Despues del crecimiento, los viriones se pueden purificar usando tecnicas tales como ultrafiltracion, diafiltracion, y cromatograffa. Antes de la administracion a los pacientes, los poliovirus se deben inactivar, y esto se puede conseguir por tratamiento con formaldehndo.

La poliomielitis puede estar causada por uno de tres tipos de poliovirus. Los tres tipos son similares y causan smtomas identicos, pero son antigenicamente muy diferentes y la infeccion con un tipo no protege frente a la infeccion con los demas. Por lo tanto, es preferente usar tres antfgenos de poliovirus en la invencion: poliovirus de Tipo 1 (por ejemplo, la cepa Mahoney), poliovirus de Tipo 2 (por ejemplo, la cepa MEF-1), y poliovirus de Tipo 3 (por ejemplo, la cepa Saukett). Tambien se pueden usar cepas Sabin (veanse, por ejemplo, las referencias 83 y 84). Preferentemente, los virus se cultivan, se purifican y se inactivan individualmente, y a continuacion se combinan para dar una mezcla trivalente a granel para su uso con la invencion.

Las cantidades de IPV se expresan por lo general en la unidad "DU" ("unidad de antfgeno D" [85]). Es habitual incluir entre 1-100 DU por tipo viral por dosis, por ejemplo aproximadamente 80 DU/ml de poliovirus de tipo 1, aproximadamente 16 DU/ml de poliovirus de tipo 2, y aproximadamente 64 DU/ml de poliovirus de tipo 3. Sin embargo, tambien se pueden usar dosis inferiores, como se desvela en la referencia 86.

Preferentemente, los antfgenos de poliovirus no estan adsorbidos en ningun adyuvante de sal de aluminio antes de

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usarse para fabricar las composiciones de la invencion, pero pueden conseguir adsorberse sobre el adyuvante o adyuvantes de aluminio en la composicion de vacuna durante el almacenamiento.

Cuando se usa con la invencion, IPV estara por lo general en el componente acuoso.

Sacaridos de Hib

El antigeno de sacarido capsular de H. influenzae de tipo B (“Hib”) se conoce bien [por ejemplo, capftulo 14 de la referencia 1] y su preparacion esta bien documentada [por ejemplo, referencias 87 a 96]. El sacarido de Hib se conjuga a una protema vehmulo con el fin de mejorar su inmunogenicidad, especialmente en ninos. La invencion puede usar cualquier conjugado de Hib adecuado.

El resto de sacarido del conjugado de Hib puede ser un polisacarido (por ejemplo, fosfato de poliribosilribitol (PRP) de longitud completa), pero tambien es posible usar oligosacaridos (por ejemplo, MW de ~1 a ~5 kDa). Los oligosacaridos se forman convenientemente por fragmentacion de PRP purificado (por ejemplo, mediante hidrolisis), lo que habitualmente ira seguido de purificacion de los fragmentos del tamano deseado. Cuando la composicion de la invencion incluye un oligosacarido conjugado, la preparacion de los oligosacaridos debena preceder a la conjugacion.

La concentracion del conjugado de Hib en las composiciones de la invencion estara habitualmente en el intervalo de 0,5 |jg/ml a 50 pg/ml, por ejemplo de 1 pg/ml a 20 pg/ml, de 12 pg/ml a 16 pg/ml, etc. La concentracion puede ser aproximadamente 15 pg/ml o aproximadamente 12,5 pg/ml en algunas realizaciones. Una masa menor de 5 pg por dosis puede ser adecuada [97], por ejemplo en el intervalo de 1-5 pg, 2-4 pg, o aproximadamente 2,5 pg. Como se describe posteriormente, la dosis de sacarido de Hib se puede seleccionar basandose en la dosis del sacarido meningococico (en particular, con multiples serogrupos meningococicos, su masa media). Las caractensticas adicionales de los conjugados de Hib son como se ha desvelado anteriormente para los conjugados meningococicos, incluyendo la seleccion de la protema vehmulo (por ejemplo, CRM197 o toxoide del tetanos), uniones, proporciones, etc.

Un conjugado de Hib puede estar adsorbido en una sal de aluminio o puede estar sin adsorber. Se ha informado que la adsorcion en adyuvantes de fosfato de aluminio es ventajosa en algunas circunstancias [98], mientras que se ha informado que la no adsorcion es ventajosa en otras circunstancias [3]. Estas posibilidades se pueden investigar facilmente y comparar para cualquier combinacion particular.

Se conocen diversos conjugados de Hib diferentes. Por ejemplo, la Tabla 14-7 de la referencia 1 da las caractensticas de cuatro conjugados de Hib diferentes. Estos difieren en diversos parametros, por ejemplo la protema vehmulo. La invencion puede usar cualquier protema vehmulo adecuada (vease posteriormente), tal como CRM197 (como en “HbOC”), toxoide del tetanos (como en “PRP-T”) y el complejo de membrana exterior de N. meningitidis (como en “PRP-OMP”).

Cuando una composicion de la invencion incluye sacaridos de mas de un serogrupo meningococico, existe una masa media de sacarido por serogrupo. Si se usan masas basicamente iguales de cada serogrupo entonces la masa media sera la misma que cada masa individual; cuando no se usan masas iguales entonces la media diferira, por ejemplo con una cantidad de 10:5:5:5 pg para una mezcla MenACWY, la masa media es 6,25 pg por serogrupo. Si tambien se incluye un sacarido de Hib entonces, en algunas realizaciones, su masa sera basicamente la misma que la masa media de sacarido meningococico por serogrupo. En algunas realizaciones, la masa de sacarido de Hib sera mayor (por ejemplo, al menos 1,5 x) que la masa media de sacarido meningococico por serogrupo. En algunas realizaciones, la masa de sacarido de Hib sera menor (por ejemplo, en al menos 1,5 x) que la masa media de sacarido meningococico por serogrupo [99].

Cuando se usa con la invencion, un conjugado de Hib puede estar en el componente acuoso o en el componente liofilizado. A menudo estara en el componente liofilizado.

Sacaridos neumococicos

Los antfgenos neumococicos conjugados comprenden antfgenos de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae conjugados a protemas vehmulo [por ejemplo, referencias 100 a 102]. Es normal incluir sacaridos de mas de un serotipo de S. pneumoniae: se usan ampliamente mezclas de polisacaridos de 23 serotipos diferentes, como son las vacunas de conjugado con polisacaridos entre 5 y 11 serotipos diferentes [103]. Por ejemplo, PREVNAR™ [104] contiene antfgenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F) con cada sacarido conjugado individualmente a CRM197 mediante aminacion reductora, con 2 pg de cada sacarido por dosis de 0,5 ml (4 pg de serotipo 6B).

Las composiciones de la invencion pueden incluir antfgenos de sacarido para al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Se pueden seleccionar serotipos adicionales entre: 1, 3, 4, 5, 7F, 9V y 18C. Es particularmente util una cubierta 7-valente (como en PREVNAR™), 9-valente (por ejemplo, los 7 serotipos de PREVNAR, mas 1 y 5), 10-valente (por ejemplo, los 7 serotipos de PREVNAR, mas 1, 5 y 7F) y 11-valente (por ejemplo, los 7 serotipos de PREVNAR, mas 1, 3, 5 y 7F) de serotipos neumococicos. Es ventajosa una combinacion 13-valente de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A,

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6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.

Las caractensticas adicionales de los conjugados neumococicos son como se han desvelado anteriormente para los conjugados meningococicos, incluyendo la seleccion de la protema vetffculo (por ejemplo, CRM197 o toxoide del tetanos), uniones, proporciones, etc. Cuando una composicion incluye mas de un conjugado, cada conjugado puede usar la misma protema vetffculo o una protema vetffculo diferente. La referencia 105 describe posibles ventajas cuando se usan protemas vetffculo diferentes en vacunas de conjugado neumococico multivalentes.

Por lo general, una composicion incluira entre 1 |jg y 20 |jg (medidos como sacarido) por dosis de cada serotipo que este presente.

Cuando se usan con la invencion, el conjugado o los conjugados neumococicos pueden estar en el componente acuoso o en el componente liofilizado.

Antigenos del virus de la hepatitis A

El virus de la hepatitis A (VHA) es uno de los agentes conocidos que causan hepatitis viral. Se desvelan vacunas de VHA en el capftulo 15 de la referencia 1. Un componente de VHA util se basa en virus inactivado, y la inactivacion se puede conseguir mediante tratamiento con formalina. Se puede cultivar el virus en fibroblastos diploides de pulmon embrionario humano, tales como celulas MRC-5. Una cepa de VHA util es HM175, aunque tambien se puede usar CR326F. Las celulas se pueden cultivar en condiciones que permitan el crecimiento viral. Las celulas se lisan, y la suspension resultante se puede purificar mediante ultrafiltracion y cromatograffa de permeacion en gel.

La cantidad de anffgeno de VHA, medida en UE (Unidades de Elisa), es por lo general al menos aproximadamente 500 UE/ml.

General

La expresion "que comprende" incluye "que incluye" asf como "que consiste", por ejemplo, una composicion "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

La palabra "basicamente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composicion que esta "basicamente exenta" de Y puede estar completamente exenta de Y. Cuando sea necesario, la palabra "basicamente" se puede omitir de la definicion de la invencion.

El termino "aproximadamente", con respecto a un valor numerico x, es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10 %.

A menos que se indique espedficamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezcla de dos o mas componentes no requiere ningun orden espedfico de mezcla. De ese modo, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces dos componentes se pueden combinar entre sf, y a continuacion la combinacion se puede combinar con el tercer componente, etc.

Las concentraciones de conjugados se definen en el presente documento en terminos de masa de sacarido, con el fin de evitar la variacion debido a la seleccion de vetffculo.

Cuando se describe que un anffgeno esta "adsorbido" en un adyuvante, es preferente que al menos un 50 % (en peso) de ese anffgeno este adsorbido, por ejemplo un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas. Es preferente que el toxoide de la difteria y el toxoide del tetanos esten ambos totalmente adsorbidos, es decir, no sea detectable ninguna cantidad en el sobrenadante. Tambien es preferente la adsorcion total del HBsAg.

Cuando se usan materiales de animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de celulas, se debeffan obtener de fuentes que esten exentas de encefalopaffas espongiformes transmisibles (TSE), y en particular exentos de encefalopaffa espongiforme bovina (BSE).

Modos de realizar la invencion

Los sacaridos capsulares se purifican de meningococos de los serogrupos A, C, W135 e Y siguiendo los procedimientos que se desvelan en las referencias 19 y 33. Se conjugan a CRM197 siguiendo los procedimientos que se desvelan en las referencias 19 y 33. En realizaciones alternativas se conjugan a toxoide del tetanos.

Los conjugados se mezclan y a continuacion se liofilizan para dar cantidades finales por dosis de 12 jg de MenA y 6 jg de cada uno de MenC, MenW135 y MenY. Se incluye sacarosa a 30 mg/dosis para estabilizacion.

Los contenidos total y libre de sacaridos de cada uno de los conjugados CRM-MenA, CRM-MenC, CRM-MenY y CRM-MenW se confirmaron usando cromatograffa de intercambio anionico de alto rendimiento acoplada a deteccion amperimetrica pulsada (HPAEC-PAD) y mediante procedimientos colorimetricos. La distribucion de tamano molecular se determino usando cromatograffa de exclusion por tamano acoplada a PAD y electroforesis de zona capilar (CZE), para monitorizar la integridad de estos conjugados despues de la liofilizacion. Los resultados indicaron que la liofilizacion no tuvo ningun impacto negativo en el contenido de sacaridos o la distribucion de peso molecular

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de los glicoconjugados cuando se compara con los conjugados preliofilizados.

Tambien se uso RMN para analizar la identidad y estabilidad de los conjugados, ambos en masas monovalentes y tambien en la mezcla combinada final (despues de la reconstitucion en forma acuosa). Dado que cada combinacion liofilizada contiene un gran exceso de sacarosa, las muestras se dializaron a 4 °C durante 48 horas con cuatro cambios de tampon fosfato sodico 10 mM, pH 7,2 para retirar la sacarosa.

Se desarrollo un ensayo de identidad seleccionando una ventana restringida de 0,7 ppm (desde el valor campo abajo a 5,6 ppm al valor campo arriba a 4,9 ppm) donde se detectaron y asignaron las senales del proton anomerico de los conjugados meningococicos. Seleccionando una region espectral restringida, el ensayo fue muy sencillo pero pudo identificar todos los antfgenos de polisacarido conjugado de la vacuna combinada, detectando dos senales para MenA y una senal para cada uno de MenC, MenW135 y MenY.

El liofilizato de conjugado 4-valente combinado se reconstituye con una vacuna acuosa tal como BOOSTRIX™, KINRIX™ o ADACEL™.

En diferentes experimentos, se administro vacuna conjugada MenACWY 4-valente meningococica cuadrivalente con vehfculo CRM197 a adolescentes al mismo tiempo que BOOSTRIX™. En este estudio de Fase III de centro individual, 1620 sujetos de 11-18 anos de edad, recibieron la vacuna meningococica 4-valente al mismo tiempo que BOOSTRIX™. Se determinaron las actividades bactericidas en suero (SBA) espedficas de serogrupo meningococico, y anticuerpos frente a antfgenos Tdap, antes y 1 mes despues de las respectivas vacunaciones. Las proporciones de los sujetos con tttulos de SBA > 1:8 para todos los serogrupos (A, C, W-135, Y) no fueron inferiores en comparacion con los pacientes que recibieron la vacuna de conjugado Men-ACWY sola. Las respuestas inmunes a los antfgenos de BOOSTRIX™ fueron comparables a las conseguidas cuando la vacuna se dio sola, aunque los aumentos en los tttulos de anti-FHA y anti-PRN fueron menores. Hubo un aumento notable en las respuestas anti- difteria cuando las vacunas se administraron al mismo tiempo, probablemente debido a la presencia de CRM197 en el componente de conjugado meningococico.

Se ha de entender que la invencion se ha descrito unicamente a modo de ejemplo, y que se pueden realizar modificaciones mientras se permanece dentro del ambito de las reivindicaciones anexas.

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Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un kit para su uso en el refuerzo de la respuesta inmunitaria de un paciente con una edad entre 10 y 18 anos que se ha inmunizado previamente frente a (a) difteria, tetanos y tos ferina o (b) difteria, tetanos, tos ferina y meningitis meningococica, que comprende: (i) un componente acuoso, que comprende una mezcla de toxoide de la difteria, toxoide del tetanos y antigenos de la tos ferina acelulares, en el que la concentracion de toxoide de la difteria es < 10 Lf/ml y en el que el contenido de toxoide de la difteria medido en unidades Lf es menor que el contenido de toxoide del tetanos medido en unidades Lf; y (ii) un componente liofilizado, que comprende sacaridos capsulares conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis, en el que el componente acuoso y el componente liofilizado se han de combinar para administracion para dar una vacuna lfquida combinada que es adecuada para inyeccion.
2. 2. El kit para el uso de la reivindicacion 1, en el que la concentracion de toxoide del tetanos es < 15 Lf/ml.
3. 3. El kit para el uso de la reivindicacion 1 o 2, en el que el componente acuoso incluye un adyuvante, en el que opcionalmente el adyuvante comprende una o mas sales de aluminio, en el que opcionalmente la concentracion de aluminio es menor de 0,84 mg/ml.
4. 4. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que:

   • la concentracion de toxoide de la difteria en el componente acuoso es 4 Lf/ml o 5 Lf/ml;

   • la concentracion de toxoide del tetanos en el componente acuoso es 10 Lf/ml;

   • la proporcion de toxoide de la difteria con respecto a toxoide del tetanos en el componente acuoso es 1:2 o 1:2,5, medida en unidades Lf.
5. 5. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que el antigeno de la tos ferina acelular en el componente acuoso comprende toxina de la tos ferina (“PT”) inactivada, hemaglutinina filamentosa (“FHA”) y pertactina; en el que opcionalmente

   • la concentracion de PT en el componente acuoso es menor de 25 pg/ml;

   • la concentracion de toxoide de la tos ferina en el componente acuoso es 5 pg/ml o 16 pg/ml;

   • la concentracion de FHA en el componente acuoso es 10 pg/ml o 16 pg/ml;

   • la concentracion de pertactina en el componente acuoso es 5 pg/ml o 6 pg/ml; o

   • las proporciones en peso de PT:FHA:pertactina son 16:16:5 o 5:10:6.
6. 6. El kit para el uso de la reivindicacion 4 o 5, en el que el toxoide de la difteria, el toxoide del tetanos y los antfgenos de la tos ferina acelulares en el componente acuoso estan adsorbidos en hidroxido de aluminio o en fosfato de aluminio.
7. 7. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente acuoso esta exento de conservantes o exento de sacaridos capsulares meningococicos.
8. 8. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que la proporcion en masa de sacaridos de los serogrupos A, C, W135 e Yes 1:1:1:1,2:1:1:1, 1:4:1:1, 1:2:1:1 o2:2:1:1 (A:C:W135:Y).
9. 9. El kit para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que la masa de sacarido capsular por dosis de vacuna es 2,5 pg/serogrupo, 4 pg/serogrupo, 5 pg/serogrupo o 10 pg/serogrupo, y en el que la masa de cada serogrupo puede ser igual o diferente.
10. 10. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que al menos un conjugado meningococico en el componente liofilizado tiene

    • una protema vehmulo CRM197, en el que opcionalmente todos los conjugados meningococicos en el componente liofilizado tienen una protema vehmulo CRM197; o

    • una protema vehmulo toxoide del tetanos, en el que opcionalmente todos los conjugados meningococicos en el componente liofilizado tienen una protema vehmulo toxoide del tetanos.
11. 11. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente liofilizado incluye

    • un estabilizador de liofilizacion, en el que opcionalmente el estabilizador de liofilizacion comprende lactosa, sacarosa, trehalosa o manitol; o

    • cloruro sodico y/o un adyuvante.
12. 12. El kit para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el componente liofilizado esta exento de adyuvante o en el que el componente liofilizado esta exento de antfgeno o antfgenos de la tos ferina.
13. 13. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente acuoso incluye una vacuna de poliovirus inactivada (IPV).
14. 14. El kit para el uso de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente liofilizado incluye un sacarido capsular conjugado de Haemophilus influenza, en el que opcionalmente el sacarido capsular de Haemophilus influenzae esta presente con una masa de 5 |jg o 10 |jg por cada ml de componente acuoso.
15. 15. Vacuna lfquida combinada para su uso en el refuerzo de la respuesta inmunitaria de un paciente con una edad 5 entre 10 y 18 anos que ha sido inmunizado previamente frente a (a) difteria, tetanos y tos ferina o (b) difteria,

    tetanos, tos ferina y meningitis meningococica que comprende toxoide de la difteria, toxoide del tetanos y antfgenos de la tos ferina acelulares y sacaridos capsulares conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis, en la que la concentracion de toxoide de la difteria es <10 Lf/ml y el contenido de toxoide de la difteria medido en unidades Lf es menor que el contenido de toxoide del tetanos medido en unidades Lf y en la que la 10 vacuna incluye uno o mas estabilizadores de liofilizacion.
16. 16. La vacuna combinada para el uso de la reivindicacion 15, en la que la concentracion de toxoide del tetanos es < 15 Lf/ml.