ES2628841T3 - Proteínas de fusión npp1 - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un componente de NPP1 fusionado a una fracción diana, en la que el componente de NPP1 es una NPP1 truncada que comprende la región rica en cisteína y un dominio catalítico que tiene una actividad pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa pero cuyo dominio N-terminal citosólico y el dominio transmembrana se han eliminado, en la que la fracción diana es capaz de potenciar la orientación selectiva de la proteína de fusión a un sitio de calcificación, y en la que dicha fracción diana se fusiona al extremo C-terminal del componente de NPP1.

Description

DESCRIPCION

Protelnas de fusion NPP1

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

5

[0001] La ectonucleotido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1 (NPP1/ENPP1/PC-1) es una glicoprotelna transmembrana de tipo II que forma un homodlmero. La protelna escinde una variedad de sustratos, incluyendo enlaces fosfodiester de nucleotidos y azucares de nucleotidos y enlaces pirofosfato de nucleotidos y azucares de nucleotidos. La protelna NPP1 funciona para hidrolizar el nucleosido-5'-trifosfato en cualquiera de los monofosfatos

10 correspondientes, y tambien hidroliza polifosfatos diadenosina. Las mutaciones en el gen de NPP1 se han asociado a la calcificacion arterial idiopatica infantil (CAII), resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatemico y osificacion del ligamento longitudinal posterior de la columna vertebral.

[0002] CAII, una enfermedad recesiva autosomica rara y casi siempre un trastorno mortal, se caracteriza por

15 la calcificacion de la lamina elastica interna de las arterias musculares y estenosis debida a la proliferacion

miolntima. Existen mas de 160 casos de CAII que se han notificado en todo el mundo. Los slntomas de la enfermedad suelen aparecen en la primera infancia, y la enfermedad es letal a los 6 meses de edad, en general debido a la cardiomiopatla isquemica y otras complicaciones de la arteriopatla obstructiva incluyendo estenosis de la arteria renal. En mas de una docena de casos notificados de CAII, tambien se desarrollaron en la infancia 20 calcificaciones periarticulares de las grandes articulaciones. Rutsch y col. (2003) notificaron que las mutaciones en ENPP1 se asocian a CAII caracterizada por las calcificaciones periarticulares y aorticas espontaneas en la vida temprana y la reduccion sistemica de la actividad nucleotido pirofosfatasa/fosfodiesterasa en los individuos afectados.

25 [0003] Johnson y col. (Journal of Bone and Mineral Research, 2003, 13(6): 994-1004) notifican que la

deficiencia extracelular de PPi promovio la deficiencia de osteopontina (OPN) y que la correccion de la deficiencia de OPN previene la hipercalcificacion. Este documento no contiene ensenanza alguna para utilizar moleculas de NPP1 u OPN terapeuticamente solubles, y no hace referencia alguna en lo que respecta a las formas de NPP1 a las que se orienta selectivamente.

30

[0004] Millan y col. (Journal of Bone and Mineral Research, 2008, 23(6): 777-787) describen una terapia de reemplazo enzimatico en ratones Akp2~/~, en la que una forma de la fosfatasa alcalina humana (TNALP) recombinante orientada selectivamente al hueso se expresa y se utiliza para prevenir la hipofosfatasia murina. Este documento no hace referencia en cuanto a la actividad u orientacion selectiva de las protelnas de fusion NPP1.

35

[0005] Aunque los defectos en la protelna NPP1 se han implicado en tales enfermedades graves como CAII, no existe un tratamiento disponible en la tecnica para aquellos que estan afectados por la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad imperiosa de una composicion, formulacion y medicamento eficaces y seguros para el tratamiento de la CAII, resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatemico y osificacion del ligamento longitudinal

40 posterior de la columna vertebral.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0006] La presente invention se presenta en las reivindicaciones anexas y se describe en lo sucesivo.

45

[0007] La presente description se dirige en general a protelnas de fusion de dominios truncados de NPP1 (es decir, un componente de NPP1) fusionados a una fraction diana. La fraction diana funciona para potenciar la eficiencia en la orientacion selectiva de la protelna de fusion NPP1 a un sitio de importancia cllnica o biologica (por ejemplo, sitio de la calcificacion en un sujeto que necesita reducir la calcificacion). Sin desear limitar la invencion a

50 teorla alguna o mecanismo de operation particular, se cree que la funcion del componente de NPP1 inhibe la calcificacion al potenciar la formation de pirofosfato (PPi) y/o al escindir pirofosfato para producir fosfato soluble (Pi) y/o al aumentar la disponibilidad de adenosln monofosfato (AMP) y/o adenosina. Se contempla que la fraccion diana puede fijarse al extremo N-terminal y/o al extremo C-terminal del componente de NPP1 en cualquier position util. Adicionalmente, la protelna de fusion NPP1 descrita en esta invencion tambien puede incluir uno o mas de un 55 fragmento Fc, PEG, enlazador polipeptldico u otros polipeptidos adicionales para potenciar la actividad, estabilidad u orientacion selectiva enzimatica.

[0008] Las protelnas de fusion de la presente descripcion pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de afecciones en un sujeto. Cualquier afeccion que puede tratarse de forma beneficiosa por la administration de una

protelna de fusion como se describe en esta invencion se incluye dentro del alcance de la descripcion. Por ejemplo, el tratamiento de afecciones que pueden mejorarse mediante la reduccion y/o eliminacion de una o mas estructuras de calcificacion y/o la prevencion de las estructuras de calcificacion de la formacion en un sujeto, tal como un mamlfero, por ejemplo, un paciente humano, esta dentro del alcance de la descripcion. Las afecciones, tales como 5 obstruccion arterial, se contemplan para el tratamiento mediante el empleo de protelnas de fusion de la descripcion. En un caso particularmente util, la afeccion a tratar se generaliza como la calcificacion arterial de la infancia, tambien referida como calcificacion arterial idiopatica de la infancia y calcificacion arterial de la media de la infancia. Asimismo, se contemplan afecciones, tales como resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatemico y osificacion del ligamento longitudinal posterior de la columna vertebral para el tratamiento.

10

[0009] Las protelnas de fusion de la descripcion pueden producirse en cualquier sistema util de expresion de protelnas, incluyendo, sin limitacion, cultivo celular (por ejemplo, celulas CHO, celulas COS, celulas HEK203), bacterias tales como Escherichia coli (E. coli) y animales transgenicos, incluyendo, entre otros, mamlferos y aves (por ejemplo, pollos, codornices, patos y pavos).

15

[0010] La fabricacion de composiciones farmaceuticas (o formulaciones farmaceuticas) es bien conocida en la materia y tales composiciones farmaceuticas se contemplan para su uso de acuerdo con protelnas de fusion de la descripcion.

20 [0011] En general, la dosificacion de protelnas de fusion administrada a un sujeto variara en funcion de

factores conocidos, tales como la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento y similares. Por lo general, una dosificacion de principio activo (es decir, protelna de fusion) puede comprenderse entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal. La dosificacion precisa, la frecuencia de administracion y el lapso de tiempo del tratamiento pueden 25 determinarse por un medico experto en la materia de administracion de protelnas terapeuticas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0012]

30

La Figura 1 ilustra la secuencia de aminoacidos de la protelna NPP1 de tipo natural. Las regiones citosolicas y transmembrana estan subrayadas. Los sitios potenciales de N-glicosilacion estan en negrita. PSCAKE en cursiva es el inicio de NPP1 soluble que incluye la region rica en cistelna.

La Figura 2 ilustra la secuencia de aminoacidos del dominio o dominios catallticos de la protelna NPP1 que no 35 tiene una fraccion diana unida ("sssNPP1").

La Figura 3 ilustra la secuencia de aminoacidos de TAGsssNPP1. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo N-terminal de sssNPP1.El peptido senal esta subrayado y la fraccion diana se indica en negrita.

La Figura 4 ilustra la secuencia de aminoacidos de TAGsssNPP1 que contiene la fraccion diana de diez residuos 40 de acido aspartico consecutivos fusionados al extremo C-terminal de sssNPP1.El peptido senal esta subrayado y la fraccion diana se indica en negrita.

La Figura 5 ilustra la secuencia de acido nucleico de la protelna de fusion TAGssNPP1. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo N-terminal de ssNPP1.

La Figura 6 ilustra la secuencia de aminoacidos de la protelna de fusion TAGssNPP1. La fraccion diana de ocho 45 residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo N-terminal de ssNPP1. El peptido senal esta subrayado y la fraccion diana se indica en negrita.

La Figura 7 ilustra la secuencia de acido nucleico de ssNPP1.

La Figura 8 ilustra la secuencia de aminoacidos de ssNPP1. El peptido senal esta subrayado.

La Figura 9 ilustra la secuencia de acido nucleico de sNPP1.

50 La Figura 10 ilustra la secuencia de aminoacidos de sNPP1. El peptido senal esta subrayado.

La Figura 11 ilustra la secuencia de acido nucleico de TAGsNPP1. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo N-terminal de sNPP1.

La Figura 12 ilustra la secuencia de aminoacidos de TAGsNPP1. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo N-terminal de ssNPP1. El peptido senal esta subrayado y la 55 fraccion diana se indica en negrita.

La Figura 13 ilustra la secuencia de acido nucleico de TAGsNPP1. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo C-terminal de sNPP1.

La Figura 14 ilustra la secuencia de aminoacidos de TAGsNPP1. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo N-terminal de sNPP1. El peptido senal esta subrayado y la fraccion

diana se indica en negrita.

La Figura 15 ilustra la secuencia de aminoacidos de un peptido enlazador.

La Figura 16 ilustra la secuencia de aminoacidos de un segmento Fc de inmunoglobulina.

La Figura 17 ilustra la secuencia de aminoacidos de TAGsssNPP1 que contiene la fraccion diana de ocho 5 residuos de acido aspartico consecutivos fusionados al extremo N-terminal de sssNPPI por un enlazador peptldico. El segmento Fc se fusiona al extremo N-terminal de la fraccion diana. El peptido senal esta subrayado y la fraccion diana se indica en negrita. El enlazador peptldico esta en cursiva.

La Figura 18 ilustra la secuencia de aminoacidos de TAGsssNPPI que contiene la fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos fusionados al extremo C-terminal de sssNPPI por un enlazador 10 peptldico. El segmento Fc se fusiona al extremo N-terminal de sssNPPI. El peptido senal esta subrayado y la fraccion diana se indica en negrita. El enlazador peptldico esta en cursiva.

La Figura 19 es una representacion esquematica de un vector de expresion (es decir, pTT22) que contiene una construccion de TAGsNPPI. La fraccion diana de ocho residuos de acido aspartico consecutivos se fusiona al extremo C-terminal de sNPPI.

15 La Figura 20 ilustra el analisis por membrana Western de TAGsNPPI. R, condicion reductora; NR, condicion no reductora.

La Figura 21 demuestra la actividad enzimatica de TAGsNPPI producida y aislada a partir de celulas HEK293. Las Figuras 22A-22C ilustran esquemas de construcciones de protelnas de fusion TAGNPP1 descritas en esta invencion.

20

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0013] La presente descripcion proporciona protelnas de fusion NPP1 innovadoras humanas que son solubles y contienen dominio o dominios truncados y biologicamente activos de NPP1 (es decir, componentes de

25 NPP1 que contienen al menos un dominio catalltico extracelular de NPP1 de origen natural para la actividad pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa) y una o mas fracciones diana (es decir, "TAG"). Las protelnas de fusion NPP1 de la presente descripcion comprenden al menos el dominio NPP1 esencial para llevar a cabo la actividad pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa. Por consiguiente, la descripcion presenta protelnas de fusion aisladas que comprenden los residuos de aminoacidos A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1 fusionados a una o mas fracciones diana. La fraccion 30 diana puede fusionarse de manera recombinante o unirse qulmicamente (por ejemplo, enlace covalente, enlace ionico, enlace hidrofobo y fuerza de Van der Waals) al componente de NPP1 por procedimientos bien conocidos en la materia y dirigir el componente de NPP1 a un determinado sitio diana en el que el componente de NPP1 adjunto tendra un efecto deseable (por ejemplo, catalisis de una reaccion, tal como la solubilizacion de un sustrato, tal como PPi o prevencion de la formacion de un sustrato, tal como PPi) en un sujeto al que se administra la protelna de 35 fusion de la presente descripcion.

TAGNPP1s

[0014] Todas las protelnas de fusion NPP1 ("TAGNPP1s") de la presente descripcion tienen el dominio N- 40 terminal citosolico y el dominio transmembrana de la NPP1 humana de origen natural eliminados. Opcionalmente,

las protelnas de fusion TAGNPP1s de la presente descripcion tambien pueden contener un truncamiento C-terminal de NPP1 de tipo natural en varias longitudes. La secuencia de aminoacidos de NPP1 de longitud completa de tipo natural se expone en la SEC. ID. N:° 1.

45 [0015] La protelna de fusion de la presente invencion es una protelna de fusion que comprende un

componente de NPP1 fusionado a una fraccion diana, en la que el componente de NPP1 es una NPP1 truncada que comprende la region rica en cistelna y un dominio catalltico que tiene una actividad pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa pero cuyo dominio N-terminal citosolico y el dominio transmembrana se han eliminado, en la que la fraccion diana es capaz de potenciar la orientacion selectiva de la protelna de fusion a un sitio de calcification, y en la que dicha 50 fraccion diana se fusiona al extremo C-terminal del componente de NPP1.

[0016] En un caso, la protelna de fusion contiene un polipeptido que comprende los residuos de aminoacidos

A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1 ("sssNPP1") fusionados a tAg en el extremo N- o C-terminal del polipeptido ("TAGsssNPP1"). En un caso, la protelna de fusion comprende un polipeptido que comprende los residuos de 55 aminoacidos A205 a D925 de la SEC. ID. N.° 1 ("ssNPP1") fusionados a TAG en el extremo N- o C-terminal ("TAGssNPP1"). En un caso, la protelna de fusion comprende un polipeptido que comprende los residuos de aminoacidos A205 a D925 de la SEC. ID. N.° 1 ("sNPP1") fusionados a TAG en el extremo C-terminal del polipeptido. Asimismo, en esta invencion se describe cualquier fragmento consecutivo de sNPP1 que comprende al menos los residuos de aminoacidos A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1 y el fragmento polipeptldico se fusiona a TAG

en el extremo N- o C-terminal.

[0017] Cuando se expresa en un cultivo celular o en un animal transgenico, las protelnas de fusion TAGNPP1

pueden comprender ademas un peptido senal (o una secuencia llder) en su extremo N-terminal. El peptido senal co- 5 traduccionalmente o post-traduccionalmente dirige el transporte de las protelnas de fusion TAGNPP1 a traves de los organulos subcelulares de la celula que expresa las protelnas de fusion TAGNPP1 y, determina as! la modificacion post-traduccional de las protelnas de fusion TAGNPP1. Queda entendido que debido a que el peptido senal se escinde en la etapa co-traduccional o post-traduccional de la protelna de fusion, las protelnas de fusion TAGNNP1 carecen generalmente del peptido senal cuando se secretan y alslan. Por consiguiente, se describen en los casos

10 en los que se dirigen a las secuencias de acidos nucleicos que codifican las protelnas de fusion TAGNPP1, tambien se contemplan las secuencias llder como se utiliza en la presente descripcion. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos expuesta en la SEC. ID. N.° 2 contiene un ejemplo de la secuencia llder para TAGNNP1 en su extremo 5'.

15 [0018] Cada una de las protelnas de fusion descritas en esta invention se contempla con una o mas

fracciones diana ("TAG"). El componente de TAG de acuerdo con la presente descripcion comprende cuatro o mas aminoacidos cargados negativamente, tales como acido aspartico y acido glutamico. El componente de TAG puede ser una extension de residuos de aminoacidos cargados negativamente, por ejemplo, acidos aspartico y/o acidos glutamico que se comprenden entre aproximadamente 4 y aproximadamente 20 residuos de aminoacidos de

20 longitud. El TAG puede fusionarse al extremo N- o C-terminal del componente de NPP1. El TAG tambien puede fusionarse a ambos extremos N- y C-terminales del componente de NPP1. Por consiguiente, la secuencia de aminoacidos de la protelna de fusion TAGsNPP1, por ejemplo, incluye PSCAKE al extremo C-terminal del componente de NPP1 y una o mas fracciones diana (por ejemplo, etiqueta de acido poliglutamico o etiqueta de acido poliaspartico) en los extremos N- y/o C-terminal del componente de NPP1. La protelna de fusion que comprende el

25 componente de NPP1 que tiene TAG fusionado al extremo C-terminal es un caso particularmente util. En un caso muy especlfico, TAG que tiene una extension de ocho acidos asparticos se emplea como puede apreciarse en las secuencias ejemplares para TAGsNPP1 y TAGssNPP1 en las Figuras, aunque se puede utilizar cualquier numero util de residuos de aminoacidos cargados negativamente (por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18). El componente de TAG se indica como "A" en las Figuras.

30

[0019] La descripcion tambien abarca polinucleotidos que codifican diversas protelnas de fusion TAGNPP1 descritas en esta invencion. Por consiguiente, cualquier secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos de cualquier protelna de fusion TAGNPP1 se puede utilizar para generar moleculas recombinantes que expresan la protelna de fusion TAGNPP1 correspondiente. En un caso particular, la descripcion abarca el

35 polinucleotido que comprende la secuencia de acido nucleico de la SEC. ID. N.° 2 como se muestra en la Fig. 2.

[0020] En ciertos casos especlficos, la protelna de fusion comprende multiples polipeptidos como se describe en esta invencion, o comprende al menos un polipeptido como se describe en esta invencion y una secuencia no relacionada. Un determinado polipeptido preferente puede, por ejemplo, ayudar en la dimerization y la estabilidad o

40 minimizar la agregacion de las protelnas de fusion. Por ejemplo, el polipeptido adicional puede ser la region Fc de la inmunoglobulina G1 para aumentar la estabilidad en suero. El uso del segmento Fc es bien conocido en la materia y se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.902.151 y en la patente de Estados Unidos n.° 7.858.297. La region rica en cistelna de NPP1 de tipo natural (es decir, PSCAKE a NEPQCP; la secuencia de aminoacidos de P99 a P204 de la SEC. ID. N.° 1) se puede emplear para facilitar la dimerizacion de las protelnas de fusion TAGNPP1.

45

[0021] En otro caso, el polietilenglicol (PEG) se pueden conjugar con las protelnas de fusion TAGNPP1. Otros polipeptidos pueden seleccionarse a efectos de minimizar la agregacion y la inmunogenicidad para aumentar la solubilidad de la protelna o para permitir que la protelna se oriente selectivamente a los sitios deseados de importancia cllnica o biologica.

50

[0022] TAGNPP1 puede tambien fusionarse o conjugarse con un enlazador polipeptldico apropiado u otra secuencia para facilitar su identification, slntesis, o purification de la protelna de fusion o para preservar mejor la estructura nativa del componente de NPP1 que puede potenciar la actividad y la orientation selectiva de TAGNPP1. Especlficamente, una secuencia enlazadora peptldica puede emplearse para separar el primer y el segundo

55 componentes polipeptldicos por una distancia suficiente para asegurar que cada polipeptido se pliegue en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia enlazadora peptldica se incorpora en la protelna de fusion entre el componente de NPP1 y el componente de TAG utilizando tecnicas estandares bien conocidas en la materia. Las secuencias enlazadoras peptldicas adecuadas pueden elegirse basandose en su capacidad para adoptar una conformation extendida flexible y su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podrla interactuar con

la porcion funcional en NPP1, TAG u otros polipeptidos secundarios descritos en esta invencion (por ejemplo, Fc). Las secuencias enlazadoras peptldicas preferentes contienen residuos de Gly, His, Asn y Ser. Los enlazadores peptldicos utiles incluyen, sin limitation, poli-Gly, poli-His, poli-Asn o poli-Ser. Otros aminoacidos casi neutros, tales como Thr y Ala tambien se pueden utilizar en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoacidos que se 5 pueden emplear de forma util como enlazadores incluyen las descritas en Maratea y col, Gene 40:39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE. UU. 83:8258-8262, 1986; patente de Estados Unidos n.° 4.935.233 y patente de Estados Unidos n.° 4.751.180. La secuencia enlazadora puede comprender de 1 a aproximadamente 20 residuos de aminoacidos de longitud. Preferentemente, el enlazador polipeptldico comprende entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12 aminoacidos de longitud. En un caso preferente, el enlazador peptldico utilizado en la 10 invencion es GGGGSGGGGS (SEC. ID. N.° 15), aunque se puede emplear cualquier combination funcional de Gly, Ser, His o Asn.

[0023] Las protelnas de fusion tambien pueden comprender TAGNPP1 de la presente description junto con un polipeptido no relacionado. Preferentemente, el polipeptido no relacionado es capaz de potenciar la orientation

15 selectiva de la protelna de fusion al sitio de importancia cllnica o biologica (por ejemplo, sitio de calcification). Por ejemplo, los peptidos que tienen una elevada afinidad al hueso se describen en la patente de Estados Unidos n.° 7.323.542.

[0024] TAGNPP1 se puede preparar utilizando procedimientos estandares, incluyendo tecnicas 20 recombinantes o conjugation qulmica bien conocidas en la materia. Las tecnicas utiles para el aislamiento y la

caracterizacion de los acidos nucleicos y protelnas de la presente descripcion son bien conocidas por los expertos en la materia y la biologla molecular estandar y pueden consultarse los manuales de bioqulmica para seleccionar protocolos adecuados para su uso sin experimentation indebida. Vease, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor. Brevemente, las secuencias de ADN que 25 codifican los componentes polipeptldicos pueden ensamblarse por separado y ligarse a un vector de expresion apropiado. Por ejemplo, el extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica el componente NPP1 se liga, con o sin un enlazador peptldico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptldico, tal como TAG PEG, o Fc de modo que los marcos de lectura de las secuencias estan en fase. Esto permite la traduction en una unica protelna de fusion que retiene la actividad biologica de ambos polipeptidos componentes. 30 Las secuencias de ADN ligadas se vinculan operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados incluyendo un promotor. Los elementos reguladores responsables de la expresion de ADN se localizan solo en 5' en la secuencia de ADN que codifica el primer polipeptido, tal como la secuencia llder que codifica un peptido senal. De manera similar, los codones de termination requeridos para finalizar las senales de terminacion de la traduccion y de la transcription solo estan presentes en 3' en la secuencia de ADN que codifica 35 el segundo polipeptido.

[0025] La presente descripcion tambien abarca variantes de TAGNPP1. Una variante de TAGNPP1 preferente es una que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y mas preferentemente 96 % con respecto a la secuencia de aminoacidos A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1. Una variante

40 de TAGNPP1 mas preferente es una que tiene identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 97 % con respecto a la secuencia de aminoacidos A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1.

[0026] La descripcion tambien se refiere a una secuencia polinucleotldica que comprende el complemento de la SEC. ID. N.° 2 o variantes de la misma. Ademas, la presente descripcion tambien cuenta con secuencias

45 polinucleotldicas que se hibridan en condiciones rigurosas a la SEC. ID. N.° 2 y cuya secuencia antisentido es 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % identica a la SEC. ID. N.° 2. Las condiciones de hibridacion se basan en la temperatura de fusion (Tf) del acido nucleico unido a un complejo o sonda, como se ensena en Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511), y se puede utilizar en una rigurosidad definida.

50

[0027] La descripcion contempla adicionalmente secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos, oligonucleotidos, acidos nucleicos peptldicos (ANP), fragmentos, porciones o moleculas antisentido de los mismos.

[0028] Aunque las secuencias nucleotldicas que codifican TAGNPP1 y sus variantes son preferentemente 55 capaces de hibridarse a la secuencia nucleotldica de TAGNPP1 en condiciones de rigurosidad apropiadamente

seleccionadas, puede resultar ventajoso producir secuencias nucleotldicas que codifican TAGNPP1 o sus derivados que poseen un uso de codon sustancialmente diferente. Los codones se pueden seleccionar para aumentar la tasa a la que la expresion del peptido se produce en un huesped procariota o eucariota particular de acuerdo con la frecuencia con la que los codones particulares son utilizados por el huesped. Otras razones para alterar

sustancialmente la secuencia de nucleotidos que codifica TAGNPP1 y sus derivados sin alterar las secuencias de aminoacidos codificadas incluyen la production de transcritos de ARN que tienen propiedades mas deseables, tales como una mayor semivida.

5 [0029] Las secuencias alteradas de acido nucleico que codifican TAGNPP1 abarcadas por la description

incluyen deleciones, inserciones, o sustituciones de diferentes nucleotidos que resultan en un polinucleotido que codifica el mismo o un equivalente funcional de TAGNPP1. La protelna codificada tambien puede contener deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos de aminoacidos que producen un cambio silencioso y resultan en un equivalente funcional de TAGNPP1. Las sustituciones deliberadas de aminoacidos pueden efectuarse sobre la 10 base de similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipatica de los residuos, siempre que se retenga la actividad biologica de TAGNPP1. Por ejemplo, los residuos de aminoacidos cargados positivamente incluyen Lys y Arg; los residuos de aminoacidos cargados negativamente incluyen Asp y Glu; y los aminoacidos con grupos principales polares no cargados que tienen hidrofilicidad similar pueden incluir Leu, Ile, y Val; Gly y Ala; Asp y Gln; Ser y Thr; Phe y Tyr.

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Vector de expresion

[0030] Los procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia se pueden utilizar para

construir vectores de expresion que contienen secuencias que codifican TAGNPP1 y elementos de control 20 transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos procedimientos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas, y recombination genetica in vivo. Tales tecnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. y col. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., y Ausubel, F. M. y col. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y..

25 [0031] Una variedad de sistemas de vector de expresion /huesped puede utilizarse para contener y expresar

secuencias que codifican TAGNPP1. Estos incluyen, entre otros, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresion de ADN bacteriofagos recombinantes, plasmldicos, o cosmidos; levaduras transformadas con vectores de expresion de levaduras; sistemas de celulas de insecto infectados por vectores de expresion de virus (por ejemplo, baculovirus) o por vectores de expresion bacterianos (por ejemplo, plasmidos Ti o 30 pBR322); o sistemas de celulas animales (por ejemplo, vector pTT22).

[0032] Los elementos de control o secuencias reguladoras pueden incluir aquellas regiones no traducidas de

vector-potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' que interaction con protelnas celulares del huesped para llevar a cabo la transcription y la traduction. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. 35 Dependiendo del sistema de vector y huesped utilizados, se puede utilizar cualquier numero de elementos de transcripcion y traduccion adecuados, incluyendo, promotores especlficos del tejido, promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden utilizarse promotores inducibles, tales como el promotor lacZ hlbrido del fagomidio Bluescript™ (Stratagene, LaJolla, California) o plasmido pSport1™ (Gibco BRL) y similares. En los sistemas de celulas de mamlferos, se prefieren promotores de genes de mamlfero o 40 de virus de mamlferos. Si es necesario generar una estirpe celular que contenga multiples copias de una secuencia que codifica TAGNPP1, se pueden utilizar vectores basados en SV40 o VEB con un marcador de selection apropiado. Cuando se utiliza un sistema de expresion aviar, los vectores adecuados para la expresion de diversas construcciones de TAGNPP1 se describen en la patente de Estados Unidos n.° 6.730.822; patente de Estados Unidos n.° 6.825.396; patente de Estados Unidos n.° 6.875.588; patente de Estados Unidos n.° 7.294.507; patente 45 de Estados Unidos n.° 7.521.591; patente de Estados Unidos n.° 7.534.929; y solicitud de patente de Estados Unidos numero de serie 11/376.023. Brevemente, cuando se emplea un sistema de expresion aviar para expresar TAGNPP1, se contemplan promotores especlficos adecuados de oviducto, por ejemplo, y sin limitation, promotores ovomucoide, promotores de ovoalbumina, promotores de lisozima, promotores de conalbumina, promotores de ovomucina, promotores de ovotransferrina y porciones funcionales de cada uno de estos promotores. Los 50 promotores no especlficos adecuados pueden incluir, por ejemplo y sin limitacion, promotores de citomegalovirus (CMV), promotores de MDOT y promotores del virus del sarcoma de Rous (VSR), promotores del virus de la leucemia murina (VLM), promotores del virus del tumor mamario de raton (VTMR) y promotores SV40 y porciones funcionales de cada uno de estos promotores. Ejemplos no limitantes de otros promotores que pueden ser utiles incluyen, sin limitacion, promotores Pol III (por ejemplo, promotores Pol III de tipo 1, tipo 2 y tipo 3), tales como 55 promotores H1, promotores U6, promotores de ARNt, promotores MPR de RNasa y porciones funcionales de cada uno de estos promotores. Normalmente, las secuencias de termination funcionales se seleccionan para su uso en la presente descripcion de acuerdo con el promotor que se emplea.

Celulas huesped

[0033] La presente descripcion incluye la production de TAGNPP1 soluble en un sistema aviar transgenico (por ejemplo, pollo transgenico) como es bien conocido en la materia, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7.534.929. La produccion del sistema aviar (por ejemplo, en el oviducto aviar) de un componente de NPP1 con o

5 sin una fraction diana (por ejemplo, ssNPPI, sNPPl, TAGsNPPI y TAGssNPPI) esta dentro del alcance de la descripcion. Ademas, tAgnPpI producido en cualquier sistema de expresion de protelnas util, incluyendo, sin limitation, aves transgenicas, mamlferos transgenicos, cultivo celular (por ejemplo, celulas CHO, celulas HEK293 y celulas COS), bacterias tales, como E. coli, animales transgenicos, tales como mamlferos y aves (por ejemplo, pollos, codornices, patos y pavos) y en sistemas vegetales que incluyen lentejas de agua, se contempla en esta 10 invention.

[0034] Una cepa de celula huesped puede elegirse por su capacidad para modular la expresion de las secuencias insertadas o para procesar la TAGNPPIs expresada de la manera deseada. Tales modificaciones del polipeptido de TAGNNP1 incluyen, sin limitacion, acetilacion, carboxilacion, sialilacion, glicosilacion, fosforilacion,

15 lipidacion, y acilacion. Diferentes celulas huesped, tales como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293, y W138, que tienen una maquinaria celular especlfica y mecanismos caracterlsticos para tales actividades post-traduccionales, se pueden elegir para asegurar la modification y procesamiento correctos de la protelna de fusion de la presente descripcion. La estirpe celular tumoral aviar tambien se contempla como una celula huesped para expresar el polipeptido de la presente descripcion. Ejemplos de estirpes celulares aviar utiles (por ejemplo, una estirpe celular 20 tumoral en oviducto aviar) que se pueden emplear en la presente descripcion se describen en la publication de patente de Estados Unidos n.° 2009/0.253.176.

Produccion de TAGNPP1

25 [0035] TAGNPP1 puede producirse utilizando cualquiera de una variedad de tecnicas bien conocidas.

TAGNPP1 codificada por secuencias de ADN, como se describe anteriormente, se puede preparar con facilidad a partir de las secuencias de ADN utilizando cualquiera de una variedad de vectores de expresion descritos en esta invencion o bien conocidos por los expertos en la materia. La expresion puede lograrse en cualquier celula huesped apropiada que ha sido transformada o transfectada con un vector de expresion que contiene una molecula de ADN 30 que codifica un polipeptido recombinante de la presente descripcion. Los sobrenadantes de sistemas de huesped/vector adecuados que secretan una protelna de fusion recombinante o polipeptido en medios de cultivo pueden en primer lugar concentrarse utilizando un filtro disponible comercialmente. Despues de la concentration, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purification adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio ionico. Una o mas etapas de HPLC en fase inversa pueden emplearse para purificar adicionalmente un 35 polipeptido recombinante.

[0036] Para la produccion de protelnas recombinantes de alto rendimiento, se prefiere la expresion estable. Las estirpes celulares que expresan de forma estable TAGNPP1 se pueden transformar utilizando vectores de expresion que contienen orlgenes virales de replication y/o elementos de expresion endogenos y/o un gen marcador

40 seleccionable en el mismo o en un vector separado. Tras la introduction del vector, las celulas pueden cultivarse durante 1-2 dlas en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selection, y su presencia permite el crecimiento y la recuperation de celulas que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de celulas transformadas de manera estable pueden proliferar utilizando tecnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de 45 celula. Los procedimientos para producir protelna exogena en estirpes celulares de mamlfero son bien conocidos en la materia. Los ejemplos ilustrativos de este y otros aspectos y casos de la presente divulgation para la produccion de polipeptidos heterologos, tales como protelnas de fusion TAGNPP1 en celulas aviares, se describen completamente en la solicitud de patente de Estados Unidos numero de serie 09/877.374, depositada el 8 de junio de 2001, publicada como el documento US 2002/0108132-A1 el 8 de agosto de 2002, y la solicitud de patente de 50 Estados Unidos numero de serie 10/251.364, depositada el 18 de septiembre de 2002. Ejemplos de la produccion de protelnas exogenas en estirpes celulares tumorales aviares tambien se describen en la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 2009/0.253.176.

[0037] Se contempla especlficamente la produccion de las protelnas TAGNPP1 descritas en esta invencion 55 en un sistema aviar transgenico. En un caso particularmente util, la descripcion se representa con respecto a la

produccion de TAGNPP1 que puede producirse en el oviducto de un ave transgenica, tal como un pollo. Ejemplos de la produccion de protelnas exogenas en el sistema de expresion aviar transgenica tambien se describen en la patente de Estados Unidos n.° 6.730.822. Brevemente, un vector aviar adecuado descrito anteriormente que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica una protelna de fusion TAGNPP1, vinculado operativamente

a un promotor especlfico de tejido o constitutivo que estimula la expresion de la secuencia codificante en el oviducto de pollo se introduce en las celulas embrionarias de pollo en etapa X. Las celulas embrionarias transformadas se incuban en condiciones que conducen a incubar pollos vivos. Los pollos vivos se crlan en un pollo quimerico maduro que se apareo con un pollo no transgenico de forma natural o por inseminacion artificial. Un pollo transgenico se 5 identifica mediante identificacion sistematica de la progenie para la incorporacion de la llnea germinal de la secuencia que codifica la protelna. La progenie transgenica puede aparearse con otro pollo transgenico o un pollo no transgenico para producir huevos que contienen la protelna de fusion TAGNPP1. A continuation, se alsla TAGNPP1 y se purifica por procedimientos bien conocidos en la materia. Por consiguiente, la description proporciona protelnas de fusion TAGNPP1 recombinantes que se han producido por aves transgenicas.

10

Composition farmaceutica

[0038] La presente descripcion tambien presenta composiciones farmaceuticas que comprenden TAGNPP1 aislada y sustancialmente purificada o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma. La composicion

15 farmaceutica de la presente descripcion tambien puede incluir un vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable del mismo. Las composiciones que comprenden tales vehlculos, incluyendo moleculas de compuestos, se formulan por procedimientos convencionales bien conocidos (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 14a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.). El vehlculo puede comprender un diluyente. En un caso, el vehlculo farmaceutico puede ser un llquido y la protelna de fusion pueden estar en forma de una solution. El vehlculo 20 farmaceutico puede ser cera, grasa o alcohol. En otro caso, el vehlculo farmaceuticamente aceptable puede ser un solido en forma de polvo, un polvo liofilizado, o un comprimido. En un caso, el vehlculo puede comprender un liposoma o una microcapsula.

[0039] Las composiciones farmaceuticas pueden estar en forma de un polvo liofilizado esteril para inyeccion 25 despues de la reconstitution con un diluyente. El diluyente puede ser agua para inyeccion, agua bacteriostatica para

inyeccion o solucion salina esteril. El polvo liofilizado puede ser producido liofilizando una solucion de la protelna de fusion para producir la protelna en forma seca. Como se conoce en la materia, la protelna liofilizada ha aumentado en general la estabilidad y posee una vida util mas larga que una solucion llquida de la protelna.

30 Definiciones:

[0040] Como se utiliza en esta invention, el termino "aceptable" con respecto a una formulation, composicion o ingrediente, tal como se utiliza en esta invencion, significa que no tiene efecto perjudicial persistente sobre la salud general del sujeto que esta siendo tratado.

35

[0041] Como se utiliza en esta invencion, el termino "administration" o "administrar" se refiere a proporcionar una protelna de fusion de la descripcion a un sujeto en necesidad de tratamiento.

[0042] "Alteraciones", como se utiliza en esta invencion, comprenden cualquier alteration en la secuencia de 40 polinucleotidos que codifica TAGNPP1 incluyendo deleciones, inserciones y mutaciones puntuales que pueden

detectarse utilizando ensayos de hibridacion.

[0043] El termino "animal" se utiliza en esta invencion para incluir todos los animales vertebrados, incluyendo aves y mamlferos, tales como rata, raton y ser humano. Tambien incluye un animal individual en todas las etapas del

45 desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.

[0044] Cuando "secuencia de aminoacidos" se recita en esta invencion para referirse a una secuencia de aminoacidos de una molecula de protelna de fusion, "secuencia de aminoacidos" y terminos similares, tales como "polipeptido" o "protelna" no tienen por objeto limitar la secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos

50 completa asociada a la molecula de protelna o de polipeptido recitado.

[0045] El termino "aviar", como se utiliza en esta invencion, se refiere a cualquier especie, subespecie o cepa de organismo de clase aviar taxonomica, tal como, entre otros, organismos tales como pollos, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos y ratites incluyendo avestruz, emu y casuario. El termino

55 incluye las diversas cepas conocidas de la especie Gallus gallus, o pollos, (por ejemplo, White Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Menorca, Amrox, California Gray, perdiz coloreada italiana), as! como cepas de pavos, faisanes, codornices, patos, avestruces y otras aves de corral criadas habitualmente en cantidades comerciales.

[0046] La expresion "basado en" o "derivado de" al igual que en un vector retroviral se basa en o se deriva de un retrovirus particular o se basa en una secuencia nucleotldica de un retrovirus particular, significa que el genoma del vector retroviral contiene una porcion sustancial de la secuencia nucleotldica del genoma del retrovirus particular. La porcion sustancial puede ser un gen particular o secuencia nucleotldica, tal como la secuencia nucleotldica que

5 codifica las protelnas gag, pol y/o env u otra secuencia nucleotldica estructural o funcional del genoma del virus, tal como secuencias que codifican las RTLs o puede ser sustancialmente el genoma de retrovirus completo, por ejemplo, la mayor parte (por ejemplo, mas de 60 % o mas de 70 % o mas de 80 % o mas de 90 %) o la totalidad del genoma de retrovirus, como resultara evidente a partir del contexto en la memoria descriptiva como el conocimiento de un experto en la materia. Los ejemplos de vectores retrovirales que se basan en o derivan de un retrovirus son 10 los vectores retrovirales NL (por ejemplo, NLB) que se basan en el retrovirus ALV como se describe en Cosset y col., Journal of Virology (1991) vol. 65, pags. 3388-3394.

[0047] La expresion "biologicamente activa", como se utiliza en esta invention, se refiere a una protelna de fusion que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioqulmicas de pirofosfatasa/fosfodiesterasa de una protelna

15 NPP1 de origen natural.

[0048] El termino "construction", como se utiliza en esta invencion, se refiere a una secuencia nucleotldica lineal o circular, tal como ADN que se ha ensamblado a partir de mas de un segmento de la secuencia nucleotldica que se ha aislado de una fuente natural o se ha sintetizado qulmicamente, o combinaciones del mismo.

20

[0049] El termino "complementario", como se utiliza en esta invencion, se refiere a dos moleculas de acido nucleico que pueden formar interacciones especlficas entre si. En las interacciones especlficas, una base adenina en una cadena de un acido nucleico puede formar dos enlaces hidrogeno con timina en una segunda cadena de acido nucleico cuando las dos cadenas de acido nucleico presentan polaridades opuestas. Tambien en las

25 interacciones especlficas, una base de guanina en una cadena de un acido nucleico puede formar tres enlaces hidrogeno con citosina en una segunda cadena de acido nucleico cuando las dos cadenas de acido nucleico presentan polaridades opuestas. Los acidos nucleicos complementarios referidos en esta invencion pueden comprender ademas bases modificadas en las que una adenina modificada puede formar enlaces hidrogeno con una timina o timina modificada y una citosina modificada puede formar enlaces hidrogeno con una guanina o una 30 guanina modificada.

[0050] Una "deletion", como se utiliza en esta invencion, se refiere a un cambio en cualquiera de las secuencia de aminoacidos o nucleotldica en la que uno o mas residuos de aminoacidos o nucleotidos, respectivamente, estan ausentes.

35

[0051] El termino "expresado" o "expresion", como se utiliza en esta invencion, se refiere a la transcription de un gen para dar una molecula de acido nucleico de ARN al menos complementaria en parte a una region de una de las dos cadenas de acido nucleico del gen. El termino "expresado" o "expresion", como se utiliza en esta invencion, tambien puede referirse a la traduction del ARN para producir una protelna o peptido.

40

[0052] La expresion "vector de expresion", como se utiliza en esta invencion, se refiere a un vector de acido nucleico que comprende una region de control de la expresion genica, tal como un promotor o componente promotor vinculado operativamente a una secuencia nucleotldica que codifica al menos un polipeptido.

45 [0053] "Porcion funcional" o "fragmento funcional" se utiliza de forma intercambiable y, como se utiliza en esta

invencion, significa una porcion o fragmento de un todo capaz de realizar, en su totalidad o en parte, una funcion del conjunto. Por ejemplo, una porcion biologicamente funcional de una molecula significa una porcion de la molecula que realiza una funcion biologica de la molecula completa o molecula intacta. Por ejemplo, una porcion funcional de una region de control de la expresion genica es un fragmento o porcion de la region de control de la expresion 50 genica especificada, en su totalidad o en parte, que regula o controla la expresion genica (por ejemplo, facilita en su totalidad o en parte) en un sistema biologico (por ejemplo, un promotor). Las porciones funcionales pueden ser de cualquier tamano util.

[0054] La expresion "region de control de la expresion genica", como se utiliza en esta invencion, se refiere a

55 secuencias nucleotldicas que se asocian a una secuencia codificante y que regulan, en su totalidad o en parte, la expresion de la secuencia codificante, por ejemplo, regulan, en su totalidad o en parte, la transcripcion de la secuencia codificante. Las regiones de control de la expresion genica pueden aislarse a partir de una fuente de origen natural o puede sintetizarse qulmicamente y pueden incorporarse en un vector de acido nucleico para permitir la transcripcion regulada en celulas apropiadas. Las "regiones de control de la expresion genica" pueden preceder,

pero no se limitan a preceder, la region de una secuencia de acido nucleico que esta en la region 5' del extremo de una secuencia codificante que puede transcribirse en ARNm.

[0055] Los terminos "heterologo", "exogeno" y "extrano" se utilizan indistintamente en esta invencion y en

5 general se refieren a una biomolecula, tal como un acido nucleico o una protelna que no se encuentra normalmente en un determinado organismo o en una celula determinada, tejido u otro componente contenido o producido por un organismo. Por ejemplo, una protelna que es heterologa o exogena a un huevo es una protelna que no se encuentra normalmente en el huevo. Como se utiliza en esta invencion, los terminos "heterologo", "exogeno" y "extrano" con referencia a los acidos nucleicos, tales como ADN y ARN, se utilizan indistintamente y se refieren a un acido 10 nucleico que no se produce naturalmente como parte de un cromosoma, un genoma o celula en la que esta presente o que se encuentra en un emplazamiento o emplazamientos y/o en cantidades que difieren del emplazamiento o emplazamientos y/o cantidades en las que se produce en la naturaleza. Puede ser acido nucleico que no es endogeno al genoma, cromosoma o celula y se ha introducido de manera exogena en el genoma, cromosoma o celula. Ejemplos de ADN heterologo incluyen, entre otros, un ADN que comprende una region de control de la 15 expresion genica y el ADN que codifica un producto o productos, por ejemplo, ARN o producto proteico. Ejemplos de aDn heterologo incluyen, entre otros, las regiones de control de la expresion genica o promotores descritos en esta invencion, una vez aislados de aves y como se utiliza a parti r de entonces, por ejemplo, despues de la reintroduccion en un genoma aviar.

20 [0056] La expresion "acido nucleico aislado", como se utiliza en esta invencion, incluye, por ejemplo, (a) un

ADN que tiene la secuencia de parte de una molecula genomica de origen natural pero no esta flanqueada por al menos una de las secuencias que flanquean esa parte de la molecula en el genoma de las especies en las que se produce de forma natural; (b) un acido nucleico que se ha incorporado en un vector o en el aDn genomico de una procariota o eucariota de una manera tal que el vector resultante o ADN genomico no es identico al ADN de origen 25 natural a partir del cual se obtuvo acido nucleico; (c) una molecula separada, tal como un ADNc, un fragmento genomico, un fragmento producido por reaccion en cadena de la polimerasa (RCP), reaccion en cadena de la ligasa (RCL) o slntesis qulmica, o un fragmento de restriccion; (d) una secuencia nucleotldica recombinante que es parte de un gen hlbrido, es decir, un gen que codifica una protelna de fusion, y (e) una secuencia nucleotldica recombinante que forma parte de una secuencia hlbrida que es de origen no natural. Las moleculas de acido 30 nucleico aisladas de la presente description pueden incluir, por ejemplo, variantes alelicas naturales, as! como moleculas de acido nucleico modificadas por deleciones, inserciones, inversiones o sustituciones de nucleotidos,.

[0057] Un "insertion" o "adicion", como se utiliza en esta invencion, se refiere a un cambio en una secuencia de aminoacidos o de nucleotidos que resulta en la adicion de uno o mas residuos de aminoacidos o nucleotidos,

35 respectivamente, en comparacion con la molecula de TAGNPP1.

[0058] La expresion "acido nucleico", como se utiliza en esta invencion, se refiere a cualquier conjunto lineal o secuencial de nucleotidos y nucleosidos, por ejemplo ADNc, ADN genomico, ARNm, ARNt, oligonucleotidos, oligonucleosidos y derivados de los mismos. Para facilitar la discusion, los acidos nucleicos de origen no natural

40 pueden referirse en esta invencion como construcciones. Los acidos nucleicos pueden incluir vectores plasmldicos bacterianos que incluyen vectores de expresion, de donation, cosmidos y de transformation, tales como, vectores virales animales, tales como, entre otros, adenovirus modificados, virus de la gripe, virus de la polio, virus de la viruela, retrovirus, tales como virus de la leucosis aviar (VLA) vector retroviral, un vector retroviral del virus de la leucemia murina (VLM), y un vector lentivirus, y similares, y fragmentos de los mismos. Ademas, el acido nucleico 45 puede ser una RTL de un vector retroviral del virus de la leucosis aviar (VLA), un vector retroviral del virus de la leucemia murina (VLM), o un vector lentivirus y fragmentos de los mismos. Los acidos nucleicos tambien pueden incluir vectores NL, tales como NLB, NLD y NLA y fragmentos de los mismos y oligonucleotidos sinteticos, tales como ADN o ARN sintetizado qulmicamente. Los acidos nucleicos pueden incluir nucleotidos y nucleosidos modificados o derivatizados, tales como, entre otros, nucleotidos halogenados, tales como, pero no solo, 550 bromouracilo, y nucleotidos derivatizados, tales como nucleotidos marcados con biotina.

[0059] "Secuencia de acido nucleico", como se utiliza en esta invencion, se refiere a un oligonucleotido, nucleotido, o polinucleotido, y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN o ARN de origen genomico o sintetico que puede ser mono o bicatenario, y representa la cadena codificante o no codificante.

55

[0060] La expresion "vinculado operativamente" se refiere a una disposition de elementos en la que los componentes as! descritos estan configurados de modo que realizan su funcion habitual. Las regiones de control de la expresion genica o promotores (por ejemplo, componentes promotores) vinculados operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresion de la secuencia codificante. Las secuencias de control

no tienen que ser contiguas a la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir la expresion de las mismas. Asl, por ejemplo, las secuencias intermedias no traducidas pero transcritas pueden estar presentes entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavla puede considerarse "vinculada operativamente" a la secuencia codificante.

5

[0061] La expresion "promotor especlfico de oviducto", como se utiliza en esta invencion, se refiere a

promotores y componentes promotores que son funcionales, es decir, proporcionan la transcripcion de una secuencia codificante, en gran medida, por ejemplo, principalmente (es decir, mas del 50 % del producto de transcripcion producido en el animal por un tipo de promotor particular que se produce en celulas de oviducto) o 10 exclusivamente en las celulas de oviducto de un ave. Ejemplos de promotores especlficos de oviducto utiles incluyen, sin limitacion, el promotor de ovoalbumina, el promotor de ovomucoide, el promotor ovoinhibidor, el promotor de la lisozima y el promotor de ovotransferrina y porciones funcionales de estos promotores, por ejemplo, componentes promotores.

15 [0062] Las expresiones "polinucleotido", "oligonucleotido", "secuencia nulceotldica" y "secuencia de acido

nucleico" se pueden utilizar indistintamente en esta invencion e incluyen, entre otros, secuencias de codificacion, es decir, polinucleotido o polinucleotidos o secuencia o secuencias de acido nucleico que se transcriben y traducen en un polipeptido in vitro o in vivo cuando se colocan bajo el control de secuencias reguladoras o de control apropiadas; secuencias de control, por ejemplo, codones de inicio y codones de terminacion de la traduccion, secuencias 20 promotoras, sitios de union al ribosoma, senales de poliadenilacion, sitios de union de factores de transcripcion, secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores aguas arriba y aguas abajo, potenciadores, silenciadores, secuencias de ADN a las que un factor o factores de transcripcion se unen y alteran la actividad del promotor de un gen, ya sea positiva (induccion) o negativamente (represion) y similares. No se sugiere limitacion en cuanto a la longitud o al origen sintetico por los terminos descritos en esta invencion.

25

[0063] Como se utiliza en esta invencion, los terminos "polipeptido" y "protelna" se pueden utilizar indistintamente y se refieren a un pollmero de aminoacidos de tres o mas aminoacidos en un conjunto de serie, vinculado a traves de enlaces peptldicos. El termino "polipeptido" incluye protelnas, tales como protelnas de fusion, fragmentos de protelnas, analogos de protelnas, oligopeptidos y similares. El termino "polipeptido" incluye

30 polipeptidos como se define anteriormente que estan codificados por los acidos nucleicos, producidos a traves de tecnologla recombinante (por ejemplo, aislados de un ave transgenica), o sintetizados qulmicamente.

[0064] Como se utiliza en esta invencion, el termino "promotor" se refiere a una secuencia de ADN util para iniciar el comienzo de la transcripcion por una ARN polimerasa en una celula aviar. Un "componente promotor" es

35 una secuencia de ADN que puede, por si misma o, en combinacion con otras secuencias de ADN efectuar o facilitar la transcripcion. Los componentes promotores especlficos, tales como componentes promotores de ovoalbumina, componentes promotores ovomucoide y componentes promotores de la lisozima y otros promotores y componentes promotores descritos y reivindicados en esta invencion no describen una secuencia promotora especlfica. Mas bien, abarcan cualquier secuencia o fragmento de la secuencia del promotor respectivo que es util para efectuar o facilitar 40 la transcripcion de una secuencia codificante. Por ejemplo, un componente promotor ovomucoide incluye, sin limitacion, los promotores ovomucoides de aproximadamente 1,8 kb, aproximadamente 3,9 kb y aproximadamente 10 kb descritos en la publication de Estados Unidos n.° 11/649.543, publicada el 17 de mayo de 2007. "Componentes promotores" tambien pueden abarcar las regiones de control de la expresion del gen reordenado que funcionan para iniciar la transcripcion de ARN y las moleculas de ADN hlbridas compuestas de secuencias de ADN 45 de origen natural y/o secuencias de ADN sinteticas que funcionan para iniciar la transcripcion del ARN.

[0065] Las expresiones "acido nucleico recombinante" y "ADN recombinante", como se utilizan en esta invencion, se refieren a combinaciones de al menos dos secuencias de acido nucleico que no se encuentran de forma natural en una celula eucariota o procariota. Las secuencias de acido nucleico pueden incluir, entre otros,

50 vectores de acido nucleico, elementos reguladores de la expresion genica, orlgenes de replication, secuencias genicas adecuadas que, cuando se expresan, confieren resistencia a los antibioticos, secuencias de codification de protelnas y similares. Se tiene por objeto que la expresion "polipeptido recombinante" o "protelna recombinante" incluye un polipeptido producido por tecnicas de ADN recombinante, de manera tal que es distinto de un polipeptido de origen natural, ya sea en su emplazamiento, pureza o estructura. Generalmente, un polipeptido recombinante de 55 este tipo estara presente en una celula en una cantidad diferente a la que se observa normalmente en naturaleza.

[0066] La expresion "condiciones rigurosas", como se utiliza en esta invencion, es la "rigurosidad", que se produce en un intervalo de aproximadamente Tf -5 °C (5 °C por debajo de la temperatura de fusion (Tf) de la sonda) a aproximadamente 20 °C a 25 °C por debajo de Tf. Como se entendera por los expertos en la materia, la

rigurosidad de la hibridacion puede ser alterada con el fin de identificar o detectar secuencias polinucleotidicas identicas o relacionadas.

[0067] Como se utiliza en esta invencion, el termino "sujeto" o "paciente" abarca mamlferos y no mamlferos. 5 Ejemplos de mamlferos incluyen, entre otros, seres humanos, chimpances, simios, monos, ganado, caballos, ovejas,

cabras, cerdos, conejos, perros, gatos, ratas, ratones, cobayas, y similares. Ejemplos de no mamlferos incluyen, entre otros, aves, peces y similares.

[0068] Una "sustitucion", como se utiliza en esta invencion, se refiere al reemplazo de uno o mas 10 aminoacidos o nucleotidos por diferentes aminoacidos o nucleotidos, respectivamente.

[0069] Como se utiliza en esta invencion, la expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a cualquier cantidad de un compuesto que, en comparacion con un sujeto correspondiente que no ha recibido dicha cantidad, da como resultado un tratamiento mejorado, curacion, prevention, o mejora de una enfermedad, trastorno,

15 o efecto secundario, o una disminucion en la velocidad de avance de una enfermedad o trastorno. El termino tambien incluye dentro de su alcance cantidades eficaces para potenciar la funcion fisiologica normal.

[0070] Como se utiliza en esta invencion, las expresiones "TAGNPP1", "proteina de fusion", "polipeptido de TAGNPP1" y "componente de NPP1 fusionado a una fraction diana" se utilizan indistintamente.

20

[0071] Como se utiliza en esta invencion, el termino "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a procedimientos para aliviar, remitir o mejorar slntomas de una enfermedad o afeccion, prevenir los slntomas adicionales, mejorar o prevenir las causas subyacentes de los slntomas, inhibir la enfermedad o afeccion, detener el desarrollo de la enfermedad o afeccion, aliviar la enfermedad o afeccion, provocar la regresion de la enfermedad o

25 afeccion, aliviar una condition causada por la enfermedad o afeccion, o detener los slntomas de la enfermedad o afeccion, ya sea profilactica y/o terapeuticamente.

[0072] Una "variante" de TAGNPP1, como se utiliza en esta invencion, se refiere a una secuencia de aminoacidos que esta alterada por uno o mas aminoacidos. Preferentemente, una variante contiene sustituciones

30 conservadoras. Una "sustitucion conservadora" es una en la que un aminoacido es sustituido con otro aminoacido con propiedades similares, de manera que un experto en la materia de la qulmica peptldica esperarla que la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido este sustancialmente inalterada. Las sustituciones de aminoacidos pueden efectuarse generalmente sobre la base de similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipatica de los residuos. Por ejemplo, aminoacidos cargados 35 negativamente incluyen Asp y Glu; aminoacidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y aminoacidos con grupos principales polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similar incluyen Leu, Ile y Val; Gly y Ala; Asp y Gln; y Ser, Thr, Phe y Tyr. Otros grupos de aminoacidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; y (5) Phe, Tyr, Trp, His. Una variante puede tambien, o alternativamente, contener cambios no 40 conservadores. En un caso preferido, los polipeptidos variantes difieren de una secuencia nativa por sustitucion, deletion o adicion de cinco aminoacidos o menos, o, por ejemplo, reemplazo de Gly por Trp. Las variantes pueden tambien (o alternativamente) modificarse mediante, por ejemplo, la delecion o adicion de aminoacidos que tienen una influencia minima en la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropatica del componente de NPP1. La guia para determinar que residuos de aminoacidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin abolir la 45 actividad biologica o inmunologica puede encontrarse utilizando programas informaticos bien conocidos en la materia.

[0073] La expresion "vector" y "vector de acido nucleico", como se utiliza en esta invencion, se refiere a un plasmido monocatenario o bicatenario natural o sintetico o molecula de acido nucleico viral que puede transfectarse

50 o transformarse en celulas y replicarse independientemente, o dentro del genoma de la celula huesped. Un vector bicatenario circular se puede linealizar por el tratamiento con una enzima de restriction apropiada basandose en la secuencia de nucleotidos del vector. Un acido nucleico se puede insertar en un vector cortando el vector con enzimas de restriccion y ligando las piezas deseadas entre si.

55 [0074] El termino "portion", como se utiliza en esta invencion, con respecto a una proteina de fusion se

refiere a fragmentos de esa proteina. Los fragmentos pueden variar en tamano a partir de cuatro residuos de aminoacidos con respecto a la secuencia completa de aminoacidos sin aminoacido. De este modo, una proteina "que comprende al menos una porcion de la secuencia de aminoacidos de la SEC. ID. N.° 1" abarca TAGNPP1 de longitud completa y fragmentos de la misma.

[0075] "Transformation" o "transfection", como se utiliza en esta invention, describe un procedimiento por el cual el ADN exogeno entra y cambia una celula receptora utilizando diversos procedimientos bien conocidos en la materia. La transformacion puede basarse en cualquier procedimiento conocido para la insertion de secuencias de acido nucleico extrano en una celula huesped procariota o eucariota. El procedimiento se selecciona basandose en

5 la celula huesped que esta siendo transformada y puede incluir, entre otros, electroporation, bombardeo de partlculas, infection viral y lipofeccion. Tales celulas "transformadas" incluyen celulas en las que el ADN insertado es capaz de replicarse, ya sea como un plasmido de replication autonoma o como parte del cromosoma huesped. Tambien incluyen celulas que expresan transitoriamente el ADN o ARN insertado durante periodos limitados de tiempo.

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EJEMPLOS

[0076] La presente invencion se ejemplifica adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos tienen un fin meramente ilustrativo y no tienen por objeto, ni deben interpretarse como limitantes de la invencion de

15 modo alguno.

Ejemplo I

[0077] La construction TAGsNNPI que contiene la fraction diana que tiene ocho acidos aspartico 20 consecutivos fusionados a sNPPI se ligo en un vector pTT22 utilizando sitios EcoRI y Hindlll (pTT22-sNPP1.D8; Fig.

19). pTT22-sNPP1.D8 se transfecto en celulas HEK203E y los transformantes se cultivaron para expresar TAGsNNP1.TAGsNNP1 se aislo de los medios de cultivo y se purifico parcialmente como es bien conocido en la materia. Despues de la purification, se midio la actividad pirofosfasa/fosfodiesterasa de TAGsNPP1 por su capacidad para hidrolizar p-nitrofenil ester de timidina 5'-monofosfato. Brevemente, TAGsNPP1 se diluyo a 1 ng/pl 25 en Tris 50 mM, NaCl 250 mM, pH 9,5. En una placa que contiene 50 pl de 1 ng/pl de TAGsNPP1, se anadieron 50 pl de sustrato de 10 mM de p-nitrofenil ester de timidina 5'-monofosfato (Sigma™, catalogo n.° T4510). La actividad enzimatica de TAGsNPP1 se midio a 405 nm (absorbancia) en modo cinetico durante 5 minutos. Como se muestra en la Fig. 21, se detecto la actividad de TAGsNPP1 por encima del nivel observado en el control que no contiene TAGsNPP1. En particular, TAGsNPP1 producido a partir de HEK203D6 exhibio el nivel mas elevado de la actividad 30 enzimatica. Estos resultados sugieren encarecidamente que la NPP1 truncada fusionada a una fraccion diana (es decir, D8) mantiene suficientemente su funcion normal como nucleasa.

Ejemplo II

35 [0078] Este ejemplo profetico no limitante describe como tratar la calcification arterial idiopatica infantil

mediante la administration de una formulation que comprende una protelna de fusion TAGNPP1.

[0079] Un medico cllnico utiliza un ensayo de diagnostico para verificar que un paciente tiene altos niveles de calcificacion en la arteria. Un ensayo genetico tambien se puede realizar para defectos de NPP1 como se describe

40 en Rutsch y col. (2003), Nature Genetics 34:379-81.

[0080] Las composiciones farmaceuticas de la presente description se administran preferentemente por via intravenosa, aunque se emplean administracion interadermica, intramuscular u oral en ciertas circunstancias.

45 [0081] El medico cllnico determina una dosis que puede variar dependiendo del sexo, la edad, la salud, y el

peso del paciente. La determination de la dosificacion o via de administracion apropiada esta bien dentro de la habilidad de un medico ordinario.

[0082] La formulacion que contiene TAGNPP1 puede ser infundida semanalmente, entre aproximadamente 50 10 mg/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg por semana. 10-30 mg/kg se pueden administrar una vez. Durante el

periodo de infusion, los pacientes son observados de cerca y se realiza la intervention cllnica en caso de un evento adverso. El tratamiento tiene una duration de al menos 1 mes o durante la vida del paciente. Una ventana de 48 horas puede permitirse para cada infusion. Una pauta de infusion en la que la tasa de infusion aumentada con el tiempo reduce o elimina eventos adversos. Las infusiones para lactantes se pueden administrar de acuerdo con la 55 siguiente pauta: 5-10 cc/h durante 60 minutos en cada intervalo.

[0083] Por otra parte, cuando se desea la administracion intravenosa continua, un ejemplo tlpico de sistemas de liberation lenta comprende que 1-100 mg/kg de protelnas TAGNPP1 eficaces pueden liberarse de forma continua durante mas de 1 dla.

[0084] Si bien esta invencion se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones de

ejemplo de las mismas, se entendera por los expertos en la materia que diversos cambios en forma y detalles pueden efectuarse en la misma sin apartarse del alcance de la invencion abarcado por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   I. Una protelna de fusion que comprende un componente de NPP1 fusionado a una fraccion diana, en la que el componente de NPP1 es una NPP1 truncada que comprende la region rica en cistelna y un dominio catalltico

   5 que tiene una actividad pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa pero cuyo dominio N-terminal citosolico y el dominio transmembrana se han eliminado, en la que la fraccion diana es capaz de potenciar la orientacion selectiva de la protelna de fusion a un sitio de calcificacion, y en la que dicha fraccion diana se fusiona al extremo C-terminal del componente de NPP1.

   10 2. La protelna de fusion de la reivindicacion 1, en la que dicha fraccion diana se vincula qulmicamente a

   dicho componente de NPP1.
2. 3. La protelna de fusion de la reivindicacion 1 que comprende un polipeptido que comprende los residuos de aminoacidos P99 a D925 de la SEC. ID. N.° 1 como se muestra en la Figura 1.

   15
3. 4. La protelna de fusion de la reivindicacion 1 que comprende un polipeptido que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 80 % con respecto a la secuencia de aminoacidos A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1 como se muestra en la Figura 1.

   20 5. La protelna de fusion de la reivindicacion 1, en la que dicha fraccion diana es un peptido que

   comprende al menos cuatro residuos de aminoacidos cargados negativamente.
4. 6. La protelna de fusion de la reivindicacion 1 que comprende los residuos de aminoacidos A205 a L591 de la SEC. ID. N.° 1 como se muestra en la Figura 1, en la que dicha fraccion diana es un peptido que comprende

   25 entre cinco y quince residuos de aminoacidos cargados negativamente.
5. 7. La protelna de fusion de la reivindicacion 5, en la que dichos residuos de aminoacidos cargados negativamente comprenden al menos un acido aspartico o acido glutamico, o comprenden al menos cuatro residuos de acido aspartico, o comprenden al menos cuatro residuos de acido glutamico o comprenden ocho residuos de

   30 acido aspartico consecutivos.
6. 8. La protelna de fusion de la reivindicacion 1, que comprende ademas un enlazador polipeptldico entre el componente de NPP1 y la fraccion diana.

   35 9. La protelna de fusion de la reivindicacion 1, que comprende ademas una region Fc de

   inmunoglobulina, o que comprende ademas un peptido senal.
7. 10. La protelna de fusion de la reivindicacion 1, en la que dicha protelna de fusion forma un homodlmero,

   o en la que dicha protelna de fusion es un monomero.

   40

   II. Un acido nucleico aislado que codifica la protelna de fusion de la reivindicacion 1.
8. 12. Un vector de replication o de expresion que lleva el acido nucleico aislado de la reivindicacion 11.

   45 13. Una celula huesped transformada con el vector de replicacion o de expresion segun la reivindicacion

   12, opcionalmente en la que dicha celula huesped se selecciona entre el grupo que consiste en celulas CHO, celulas HEK293 o celulas COS, u opcionalmente en la que dicha celula huesped es una celula tumoral aviar.
9. 14. Un animal transgenico no humano que produce la protelna de fusion de la reivindicacion 1, 50 opcionalmente en el que dicho animal transgenico no humano es mamlfero o aviar.
10. 15. Un procedimiento de production de dicha protelna de fusion de la reivindicacion 1, el procedimiento comprende el cultivo de la celula huesped transformada con un vector de expresion segun la reivindicacion 13.

    55 16. Una composition farmaceutica que comprende la protelna de fusion de la reivindicacion 1 para su uso

    en terapia.
11. 17. La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 16, en la que dicha composicion es

    para su uso en el tratamiento de un sujeto que es un mamlfero, opcionalmente en la que dicho mamlfero es un ser

    humano.
12. 18. Una composicion farmaceutica que comprende la protelna de fusion de la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de un trastorno que es calcificacion arterial, resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatemico u

    5 osificacion del ligamento longitudinal posterior de la columna vertebral.
13. 19. La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 18, en la que dicho trastorno es la calcificacion arterial, opcionalmente en la que el tratamiento reduce la calcificacion en la arteria, opcionalmente en la que la calcificacion arterial es la calcificacion arterial generalizada de la infancia.

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