ES2629183T3 - Aptámeros para diagnóstico de Clostridium difficile - Google Patents

Abstract

Un aptámero que se une a la Toxina B de C. difficile en donde dicho aptámero comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66-74, 32-65 y 75-108

Description

Aptámeros para diagnóstico de Clostridium difficile

5 Campo de la invención

La presente divulgación se refiere generalmente al campo de los ácidos nucleicos y más particularmente a aptámeros capaces de unirse a toxinas producidas por C. difficile y útiles para ensayos de diagnóstico para C. difficile. La divulgación se refiere adicionalmente a materiales y métodos para diagnosticar contaminación e infección

10 por C. difficile.

Antecedentes

La siguiente descripción proporciona un sumario de información relevante para la presente divulgación y no es una

15 admisión de que cualquiera de la información proporcionada o publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento sea técnica anterior para la presente divulgación.

La infección por C. difficile (CDI) ha aumentado en todo el mundo en los últimos años. Las consecuencias clínicas y económicas son sustanciales, con más de medio millón de casos y gastos estimados de 3,2 mil millones de dólares

20 al año para la gestión de CDI solamente en Estados Unidos (O’Brien, J.A., et al., Infect. Control Hosp. Epidemiol., 2007. 28 (11): p. 1219-27).

La CDI es una afección inflamatoria del intestino grueso caracterizada por diarrea y su gravedad puede variar de leve a fulminante. Los síndromes de CDI más graves son colitis pseudomembranosa y megacolon tóxico. La mayoría 25 de los casos de CDI se producen en pacientes de edades avanzadas en un entorno hospitalario o en hogares para personas de edades avanzadas. La hospitalización, sin embargo, aumenta el riesgo de colonización también para adultos sanos. En Estados Unidos, las hospitalizaciones por CDI y las tasas de mortalidad de casos relacionados con la CDI se duplicaron entre 2000 y 2005. Se ha informado de una serie de brotes recientes en los que los casos de CDI eran principalmente de naturaleza clonal. Un tipo de cepa clasificado como BI/NAP1/027 fue responsable de 30 más de la mitad de los casos y las características de esta cepa de "brote" epidémico son alta morbilidad y mortalidad, mayor resistencia a los antibióticos (por ejemplo, fluoroquinolonas), la presencia de un gen variante de tcdC, e hiperproducción de toxinas (Freeman, J., et al., Clin. Microbiol. Rev., 2010. 23 (3): p. 529-49; Rupnik, M.,

M.H. Wilcox, y D.N. Gerding, Nat. Rev. Microbiol., 2009. 7 (7): p. 526-36).

35 El uso de antibióticos es un fuerte factor de predisposición a la CDI debido a la alteración de la flora intestinal normal que de otra forma suprime a C. difficile. La ingestión de esporas es la principal vía de colonización del intestino humano por C. difficile. Las esporas son extremadamente resistentes a los desinfectantes y pueden persistir en el entorno durante más de 12 meses con poca pérdida de viabilidad o patogenicidad. Las esporas también están implicadas en el 20-25 % de los casos de CDI que recaen después del tratamiento. Los regímenes de tratamiento

40 actuales para la CDI son vancomicina o metronidazol. Varios agentes nuevos y más selectivos que prometen reducir las tasas de recurrencia de CDI se encuentran en desarrollo clínico.

La inflamación del revestimiento intestinal está causada por dos toxinas (toxina A y toxina B) que se expresan por algunas cepas de C. difficile. La Toxina A y la toxina B son glucosiltransferasas que se dirigen a pequeñas GTPasas 45 hospedadoras pequeñas diana en la superfamilia Ras. Están codificadas en el locus de patogenicidad de 19,6 kb y las cepas que carecen de estos genes de toxina no son patógenas. Las cepas toxinogénicas se pueden clasificar adicionalmente en toxinotipos de acuerdo con la variabilidad de secuencias dentro del locus de patogenicidad. Ambas toxinas contribuyen a la CDI, como se muestra mediante el uso de mutantes isogénicos que producen tanto toxina A como toxina B solas y fueron citotóxicos in vitro y virulentos in vivo (Kuehne, S.A., et al., Nature, 2010. 467

50 (7316): p. 711-3). Se está estudiando un prototipo de vacuna basado en toxinas A y B inactivadas (toxoides) y anticuerpos monoclonales anti-toxina para su eficacia en la prevención de la CDI recurrente.

La Toxina A y la toxina B son toxinas grandes de PM ~ 300 kDa, relacionadas estructuralmente, y consisten en un dominio catalítico amino-terminal (glucosiltransferasa), un dominio C80 de peptidasa central, un dominio de

55 translocación y múltiples repeticiones de la horquilla β carboxi-terminal. Se ha demostrado que el mecanismo de acción de las toxinas clostridiales implica la unión de estas repeticiones de la horquilla β a los carbohidratos presentes en la superficie de las células gastrointestinales, escisión mediada por endopeptidasa e internalización del dominio catalítico (Pfeifer, G., et al., J. Biol. Chem., 2003. 278 (45): p. 44535-41).

60 Algunas cepas de C. difficile producen una toxina binaria que posee actividad de ADP-ribosiltransferasa. Aunque su papel en la patogénesis no está claro, la presencia de toxina binaria es un buen marcador para la cepa BI/NAP1/027 epidémica del brote. La toxina binaria se compone de dos subunidades, que son la cadena de toxina A binaria de actina ADP-ribosiltransferasa y la cadena de toxina B binaria formadora de poros. Se segregan a partir de las células bacterianas como polipéptidos separados y tienen el potencial de combinarse para formar una citotoxina potente que

65 se ha mostrado que elimina las células Vero (Sundriyal, A., et al., Protein Expr. Purif., 2010. 74 (1): p. 42-8).

El diagnóstico rápido y preciso de la CDI es importante para el cuidado del paciente, control de la infección y vigilancia. Las toxinas A y B de C. difficile son de alta relevancia en diagnóstico clínico ya que son dianas suficientemente específicas de patógenos y la demostración de su presencia es importante para el diagnóstico de la IDC. Todos los ensayos de diagnóstico de IDC usados en la actualidad son cualitativos y pertenecen a uno de tres

5 tipos: (i) ensayo de citotoxinas (cultivo tisular), (ii) ensayos de toxinas no moleculares (EIA), y (iii) ensayos moleculares (PCR).

El ensayo de citotoxina basado en cultivo tisular se considera el criterio de referencia, pero es incómodo y no se realiza de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios clínicos. En esencia, este ensayo detecta la toxina de C. 10 difficile a través del efecto citopático de la toxina en cultivo celular que se puede neutralizar con anti-sueros específicos. El ensayo de citotoxicidad detecta tan poco como 10 pg de toxina B y es el ensayo confirmatorio recomendado para presentaciones de 510(k) en el "Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile" que fue lanzado en noviembre de 2010 por la FDA,

15 http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/uc m234868.htm. 2010.

Los ensayos moleculares para CDI están disponibles en varias compañías de diagnóstico. El ensayo Cepheid GeneXpert™ se basa en PCR multiplex (tcdB, cdt, tcdC), con sensibilidad y especificidad anunciadas de > 95 % y tiempo para el resultado de 30 min. El ensayo Meridian illumigene™ de C. difficile detecta la presencia de la región 20 productora de toxina por amplificación de bucle isotérmico y anunció que proporcionaba resultados en una hora. El ensayo BD GeneOhm™ Cdiff es un método de PCR en tiempo real para la detección del gen de la toxina B (tcdB) directamente a partir de muestras de heces, con un tiempo de protocolo de ensayo de menos de dos horas, sensibilidad de un 93,8 % y especificidad de un 95,5 %. Gen-Probe ofrece el ensayo Prodesse ProGastro Cd que también detecta el gen de la toxina B (tcdB) por PCR y se anuncia que proporciona resultados en tres horas con una

25 sensibilidad de un 91,7 % y especificidad de un 94,7 %.

También hay disponibilidad de ensayos no moleculares para detección de toxina de C. difficile en muestras de heces de pacientes de los que se sospecha que tienen CDI. Los inmunoensayos enzimáticos (EIA) son los métodos de detección rápida más ampliamente usados para antígeno común y antígenos de toxina A/B de C. difficile, pero los 30 EIA tradicionales tienen sensibilidad y especificidad modestas. Entre los EIA de tipo de pocillo, el ensayo de las Toxinas A/B Meridian Premier™ y el ensayo Techlab TOX A/B II™ se consideran los ELISA de mejor funcionamiento y detectan ambas toxinas en muestras de heces en menos de 1 hora. Estos ensayos tenían una sensibilidad de aproximadamente un 80 % y una especificidad de un 98 % cuando se someten a ensayo independientemente. Los anticuerpos de la toxina B para las Toxinas A/B de Premier™ (Meridian) y para las TOX A/B II™ de C. difficile 35 (TechLab) eran capaces de detectar 125 pg y 250 pg de toxina B, respectivamente, cuando se sometían a ensayo lado a lado (Novak-Weekley, S.M. y M.H. Hollingsworth. Clin Vaccine Immunol, 2008. 15 (3): p. 575-8). Otros muchos ensayos de EIA de tipo pocillo se han llevado al mercado (antígeno de C. difficile de GA, Toxina A/B de RBiopharm’s Ridascreen™; Toxina A/B de ProSpect™ de Remel) pero se usan con menos frecuencia en Estados Unidos. Los ensayos de EIA de Membrana realizados con dispositivos de flujo lateral son los ensayos de Toxinas A

40 y B de Meridian ImmunoCard™, los de Techlab Tox A/B Quik Chek™, y los de Remel Xpect™.

En el mercado existe un ensayo automatizado, VIDAS™ de Toxina A y B de C. difficile de bioMérieux, que combina el ensayo de toxina y la identificación basada en cultivo con la tira API® 20A y formación de fanáticos bacterianos automatizados con el sistema DiversiLab®.

45 Los ensayos de toxina de C. difficile basados en aptámeros, como los EIA, tienen la ventaja con respecto a los ensayos moleculares de que no requieren grandes inversiones en equipos o reactivos caros. Los aptámeros tienen varias ventajas distintas con respecto a los anticuerpos que se usan en la actualidad en ensayos no moleculares, tales como los EIA: los aptámeros generalmente tienen menor peso molecular, proporcionan mayores capacidades

50 de multiplexación (baja reactividad cruzada, condiciones de ensayo universalmente aplicables), estabilidad química (al calor, secado y disolventes, renaturalización reversible), proporcionan facilidad de fabricación de reactivos, rendimiento coherente de lote a lote y se pueden producir con un coste más bajo. Cohen et al., 2010, Infect Control Hosp Epidemiol 31 (5): 431-455 desvela métodos para la detección de de la toxina B de C. difficile toxina.

55 Los aptámeros se pueden generar contra prácticamente cualquier diana de proteína, no solo las toxinas A/B, sino también la toxina binaria para la que no hay ensayo basado en anticuerpos de lo que los Solicitantes son conscientes. Los métodos de detección y lectura pueden ser los mismos que para los ensayos existentes, minimizando de ese modo las necesidades de equipos y requisitos de entrenamiento. Gold et al., 2010, PLoS ONE 5:12, e15004 desvela métodos para producir aptámeros.

Sumario

La presente invención proporciona aptámeros y métodos que usan aptámeros tal como se define en las reivindicaciones.

La presente divulgación proporciona diversos aptámeros que se unen a toxinas producidas por C. difficile. Se incluyen kits de diagnóstico y métodos de diagnóstico que comprenden tales aptámeros; y métodos para preparar y usar tales aptámeros.

5 Los aptámeros proporcionados se unen a la toxina A, toxina B, cadena de toxina A binaria, o cadena de toxina B binaria de C. difficile. Se proporcionan métodos de diagnóstico para detectar una toxina de C. difficile que comprende un aptámero para una toxina producida por C. difficile que incluyen, pero no se limitan a ensayos de captación, ensayos de transferencia puntual, ensayos de PCR y ensayos de sándwich.

Los aptámeros proporcionados comprenden opcionalmente al menos una pirimidina modificada en una posición C-5 y pueden comprender al menos una modificación química adicional. También se proporcionan aptámeros y métodos para identificar o producir tales aptámeros que se unen a una toxina de C. difficile que tienen una tasa de disociación lenta de la toxina. Además se proporcionan aptámeros y métodos para identificar o producir tales aptámeros que se unen a una toxina de C. difficile que tiene resistencia a nucleasas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A ilustra la estructura cristalina de la toxina A de C. difficile (rTcdA) que incluye cinco repeticiones de unión a receptor carboxi-terminales (Ho, J.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005. 102 (51): p. 18373-8); muestra la purificación de la toxina A como una proteína etiquetada recombinante purificada a través de cromatografía por afinidad con Ni-NTA agarosa y resina de Estrep·Tactina usando la etiqueta de His y la etiqueta de Estrep de la toxina A; y amplificación por PCR de la porción correspondiente del gen de toxina que codifica la toxina A (tcdA). La Figura 1B ilustra la estructura cristalina del dominio catalítico amino-terminal de la toxina B de

C. difficile (rTcdB) (Reinert, D.J. et al., (2005), J. Mol. Biol. 351: 973-981); muestra la purificación de la toxina B

25 como una proteína etiquetada recombinante purificada a través de cromatografía por afinidad con Ni-NTA agarosa y resina de Estrep·Tactina usando la etiqueta de His y la etiqueta de Estrep de la toxina B; y amplificación por PCR de la porción correspondiente del gen de toxina que codifica la toxina B (tcdB). La Figura 1C ilustra la estructura cristalina de la cadena de toxina A binaria de longitud completa de C. difficile (rCdtA) (Sundriyal, A., et al., J Biol. Chem. 2009. 284 (42): p. 28713-9); muestra la purificación de la cadena de toxina A binaria como una proteína etiquetada recombinante purificada a través de cromatografía por afinidad con Ni-NTA agarosa y resina de Estrep·Tactina usando la etiqueta de His y la etiqueta de Estrep de la cadena de toxina A binaria; y amplificación por PCR de la porción correspondiente del gen de toxina que codifica la cadena de toxina A binaria (cdtA). La Figura 1D ilustra la estructura modelada de la cadena de toxina B binaria de cadena completa de C. difficile (rCdtB); muestra la purificación de la cadena de toxina B binaria como una proteína

35 etiquetada recombinante purificada a través de cromatografía por afinidad con Ni-NTA agarosa y resina de Estrep·Tactina usando la etiqueta de His y la etiqueta de Estrep de la cadena de toxina B binaria; y amplificación por PCR de la porción correspondiente del gen de toxina que codifica la cadena de toxina B binaria (cdtB). La Figura 2A ilustra los resultados de un ensayo de captación de toxina A recombinante y nativa usando aptámeros de toxina A que muestran alta especificidad con respecto a la toxina B o BSA de la proteína de control. La Figura 2B ilustra los resultados de un ensayo de captación de toxina B recombinante y nativa usando aptámeros de toxina B que muestran alta especificidad con respecto a la toxina A recombinante y nativa de las proteínas de control. La Figura 2C ilustra los resultados de un ensayo de captación de toxina binaria con aptámeros para la cadena de toxina A binaria que muestran especificidad para la cadena de toxina A binaria con respecto a la cadena de toxina B binaria y la proteína de control BSA.

45 La Figura 2D ilustra los resultados de un ensayo de captación de toxina A recombinante y nativa así como de toxina B recombinante y nativa con aptámeros aleatorios que no muestran proteínas presentes en la fracción de captación. La Figura 3A ilustra la detección de toxina A de C. difficile en transferencias puntuales usando aptámeros biotinilados para toxina A y conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La Figura 3B ilustra la detección de toxina B de C. difficile en transferencias puntuales usando aptámeros biotinilados para toxina B y conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La Figura 4A ilustra la detección cuantitativa de la toxina A mediante cPCR de aptámeros eluidos a partir de una muestra que contiene aptámeros que forman complejos con la toxina A en la que los aptámeros no unidos se han retirado antes de la medición cuantitativa de los aptámeros como una medición indirecta para la toxina A. La

55 Figura 4B ilustra la detección cuantitativa de la toxina B mediante cPCR de aptámeros eluidos a partir de una muestra que contiene aptámeros que forman complejos con la toxina B en la que los aptámeros no unidos se han retirado antes de la medición cuantitativa de los aptámeros como una medición indirecta para la toxina B. La Figura 5A ilustra resultados de detección de toxina A de C. difficile mediante ensayo de sándwich en placa con estreptavidina (aptámero-diana-anticuerpo), usando aptámeros biotinilados para la toxina A y anticuerpos monoclonales de ratón para la toxina A detectados con anticuerpos de cabra-anti-ratón. La Figura 5B ilustra resultados de detección de toxina B de C. difficile mediante ensayo de sándwich en placa con estreptavidina (aptámero-diana-anticuerpo), usando aptámeros biotinilados para la toxina B y anticuerpos monoclonales de ratón para la toxina B detectados con anticuerpos de cabra-anti-ratón. La Figura 6 ilustra resultados de detección de toxina A y B de C. difficile mediante ensayos de sándwich

65 (anticuerpo-diana-aptámero) en nitrocelulosa, en los que los anticuerpos monoclonales se aplican puntualmente en nitrocelulosa y se secan al aire, se bloquean, se añaden nuestras que contienen toxina A o B, se lavan, se

añaden aptámeros biotinilados, se lavan, y se desarrollan con conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La Figura 7 ilustra resultados de detección de cadena de toxina A binaria de C. difficile en un ensayo de sándwich (aptámero-diana-aptámero) con un primer aptámero biotinilado para la cadena de toxina A binaria unido a perla de estreptavidina, adición de diana, y adición de un segundo aptámero radioetiquetado para la

5 cadena de toxina A binaria. La Figura 8 ilustra etapas relevantes de un ensayo de Toma 1 -Toma 2. La Figura 9 ilustra ejemplos de pirimidinas modificadas en la posición C-5 que se ponen usar en los métodos para preparar los aptámeros que se describen en el presente documento.

Descripción detallada

A continuación se hará referencia con detalle a realizaciones representativas de la invención. Aunque la invención se describirá en conjunto con las realizaciones enumeradas, se entenderá que la invención no pretende quedar limitada por esas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones, y

15 equivalentes que se pueden incluir dentro del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones.

Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, que se podrían usar y que están dentro del alcance de la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos.

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entiende alguien con una experiencia habitual en la materia o materias a las que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica o ensayo de la invención se puede usar cualquier método,

25 dispositivo y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento, los métodos, dispositivos y materiales preferentes se describen a continuación.

Todas las publicaciones, documentos de patentes publicados, y solicitudes de patentes citados en la presente divulgación son indicativos del nivel de experiencia en la materia o materias a las que pertenece la divulgación.

Como se usa en la presente divulgación, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno", y "el" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto lo indiqué claramente de otro modo, y se usan indistintamente con "al menos uno" y "uno o más". Por lo tanto, la referencia a "un aptámero" incluye mezclas de aptámeros, y similares.

35 Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" representa una modificación o variación insignificante del valor numérico de modo que la función básica del elemento al que se refiere el valor numérico no cambia.

Como se usa en el presente documento, la expresión "clon de aptámero" se refiere a un aptámero de una secuencia de nucleótidos en particular. En el presente documento los clones de aptámero se identifican por "ID de Aptámero N.º" así como por "SEQ ID NO:".

Como se usa en el presente documento, "molécula competidora" y "competidor" se usan indistintamente para hacer

45 referencia a cualquier molécula que pueda formar un complejo no específico con una molécula no diana. Una "molécula competidora" o "competidor" es un conjunto de copias de un tipo de especies de molécula. Las "moléculas competidoras" o "competidores" se refieren a más de uno de tal conjunto de moléculas. Las moléculas competidoras incluyen oligonucleótidos, polianiones (por ejemplo, heparina, ADN de esperma de salmón de una sola hebra, y polidextranos (por ejemplo, sulfato de dextrano)), polímeros de fosfodiéster abásico, dNTPs, y pirofosfato. En el caso de una estimulación cinética que use un competidor, el competidor también puede ser cualquier molécula que pueda formar un complejo no específico con un aptámero. Las moléculas competidoras de este tipo incluyen policationes (por ejemplo, espermina, espermidina, polilisina, y poliarginina) y que aminoácidos (por ejemplo, arginina y lisina).

Como se usa en las tablas 4, 6, 8 y 10, el término "recuento" se refiere al número de apariciones de una secuencia

55 de aptámeros en particular entre todos los aptámeros que se clonaron y se secuenciaron a partir de una combinación que resultó a partir de SELEX.

Como se usa en el presente documento, la expresión "transferencia puntual" se refiere a un ensayo en el que una mezcla que contiene la molécula diana a detectar se aplica directamente en un sustrato como un punto seguido de detección de la presencia de la molécula diana mediante una molécula de afinidad, en el que la molécula de afinidad puede ser, pero no se limita a, un aptámero o anticuerpo.

El término "cada" cuando se usa en el presente documento para hacer referencia a una pluralidad de artículos pretende hacer referencia a al menos dos de los artículos. No es necesario que todos los artículos que forman la

65 pluralidad satisfagan una limitación adicional asociada.

Como se usa en el presente documento, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "incluye", "contiene", "que contiene", y cualquier variación de los mismos, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva, de modo que un proceso, método, subproducto del proceso, o composición de materia que comprende, incluye, o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solamente sus elementos sino que puede incluir otros elementos no

5 enumerados de forma expresa o inherentes a tal proceso, método, subproducto del proceso, o composición de materia.

Como se usa en el presente documento, "secuencia consenso", cuando se usa en referencia a una serie de ácidos nucleicos relacionados, se refiere a una secuencia de nucleótidos que refleja la elección más común de base en cada posición en la secuencia en la que la serie de ácidos nucleicos relacionados se ha sometido a análisis matemático y/o de secuencias.

Como se usa en el presente documento, el término "nucleótido" se refiere a un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido, o una forma modificada del mismo, así como un análogo del mismo. Los nucleótidos incluyen

15 especies que incluyen purinas (por ejemplo, adenina, hipoxantina, guanina, y sus derivados y análogos) así como pirimidinas (por ejemplo, citosina, uracilo, timina, y sus derivados y análogos).

Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico", "oligonucleótido", y "polinucleótido" se usan indistintamente para hacer referencia a un polímero de nucleótidos e incluyen ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN y modificaciones de estos tipos de ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos, en los que está incluida la unión de diversas entidades o restos en las unidades de nucleótidos en cualquier posición. Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", y "ácido nucleico" incluyen moléculas de dos o de una hebra así como moléculas de triple hélice. Ácido nucleico, oligonucleótido, y polinucleótido son términos más amplios que el término aptámero y, por lo tanto, los términos ácido nucleico, oligonucleótido, y polinucleótido incluyen polímeros de nucleótidos que

25 son aptámeros pero los términos ácido nucleico, oligonucleótido, y que polinucleótido no se limitan a los aptámeros.

Como se usa en el presente documento, los términos "modificar", "modificado", "modificación", y cualquier variación de los mismos, cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, se refiere a que al menos una de las cuatro bases de nucleótidos constituyentes (es decir, A, G, T/U, y C) del oligonucleótido es un análogo o éster de un nucleótido de origen natural. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado confiere resistencia a nucleasa para el oligonucleótido. Una pirimidina con una sustitución en la posición C-5 es un ejemplo de un nucleótido modificado. Las modificaciones pueden incluir modificaciones de la estructura principal, metilaciones, combinaciones no habituales de emparejamiento de bases tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en las posiciones 3’ y 5’, tales como protección. Otras 35 modificaciones pueden incluir sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones de internucleótido tales como, por ejemplo, os que presentan uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y los que presentan uniones con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que presentan intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen agentes quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen agentes alquilantes, y los que presentan uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo habitualmente presentes en el azúcar de un nucleótido se pueden sustituir por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; se pueden proteger con grupos protectores convencionales; o se pueden activar para preparar uniones adicionales a nucleótidos adicionales o a un soporte sólido. Los grupos OH 5’ y 3’ terminales se pueden fosforilar o sustituir con aminas, restos de grupos de protección 45 orgánicos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, polímeros de polietilenglicol (PEG) que en una realización varían de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa, polímeros de PEG que en otra realización varían de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 kDa, u otro polímero biológico o sintético hidrófilo

o hidrófobo. En una realización, las modificaciones se realizan en la posición C-5 de las pirimidinas. Estas modificaciones se pueden producir a través de un enlace de amida directamente en la posición C-5 o mediante otros tipos de enlaces.

Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de los azúcares ribosa o desoxirribosa que por lo general se conocen en la técnica, incluyendo 2’-O-metil-, 2’-O-alilo, 2’-fluoro-o 2’-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares α-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de 55 piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásico tales como metil ribósidi. Como se ha indicado anteriormente, uno o más enlaces fosfodiéster se pueden sustituir por grupos de unión alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen realizaciones en las que el fosfato está sustituido por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR’, CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R

o R’ es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o sin sustituir que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La sustitución de las formas análogas de azúcares, purinas, y pirimidinas puede ser ventajosa para diseñar un producto final, al igual que lo pueden ser las estructuras de cadena principal alternativas tales como una cadena principal de poliamida, por ejemplo.

65 Como se usa en el presente documento, la expresión "pirimidina modificada en la posición C-5" se refiere a una pirimidina con una modificación en la posición C-5 que incluye, pero no se limita a, los restos que se ilustran en la

Figura 9. Los ejemplos de una pirimidina modificada en la posición C-5 incluyen los que se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 5.719.273 y 5.945.527. Los ejemplos de una modificación en la posición C-5 incluyen sustitución de desoxiuridina en la posición C-5 con un sustituyente seleccionado independientemente entre: bencilcarboxiamida (como alternativa bencilaminocarbonilo) (Bn), naftilmetilcarboxiamida (como alternativa naftilmetilaminocarbonilo) (Nap), triptaminocarboxiamida (como alternativa triptaminocarbonilo) (Trp), tirosilcarboxiamida (como alternativa tirosilaminocarbonilo) (Tyr), 2-naftilmetilcarboxiamida (como alternativa 2naftilmetilaminocarbonilo) (2Nap) y fenetil-1-carboxiamida (como alternativa fenetil-1-aminocarbonilo) (PE), como se ilustra inmediatamente a continuación.

Las modificaciones químicas de una pirimidina modificada en la posición C-5 también se pueden combinar con, de forma individual o en cualquier combinación, modificaciones de azúcar en la posición 2’, modificaciones en aminas exocíclicas, y sustitución de 4-tiouridina y similares.

15 Las pirimidinas modificadas en la posición C-5 representativas incluyen: 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(Ntriptaminocarboxiamida)-2’-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(Ntriptaminocarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NapdU), 5-(N

20 naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2’desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-(2naftilmetil)carboxiamida)-2’-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-(2-naftilmetil)carboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-(2naftilmetil)carboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-fenetil-1-carboxiamida)-2’-desoxiuridina (PEdU), 5-(N-fenetil-1carboxiamida)-2’-O-metiluridina, o 5-(N-fenetil-1-carboxiamida)-2’-fluorouridina.

25 Si estuviera presente, una modificación en la estructura de nucleótidos se puede impartir antes o después del ensamblaje de un polímero. Una secuencia de nucleótidos se puede interrumpir mediante componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de su polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de etiquetado.

30 Como se usa en el presente documento, la expresión "al menos una pirimidina", cuando se refiere a modificaciones de un ácido nucleico, se refiere a uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o todas las pirimidinas en el ácido nucleico, lo que indica que cualquiera o todas las apariciones de cualquiera o todos de C, T, o U en un ácido nucleico pueden estar modificados o no.

35 Como se usa en el presente documento, las expresiones "estimulación por vía cinética" y "estimulación cinética" se refieren a un proceso de enriquecimiento para un complejo de afinidad de aptámero de un conjunto de complejos

que incluye un complejo de afinidad de aptámero y complejos no específicos, mediante aplicación de presión cinética y haciendo uso de las diferentes características de afinidad de los componentes de tales clases de complejos, incluyendo tasas de disociación. Una estimulación cinética por lo general da como resultado un aumento de la especificidad, ya que los complejos de aptámero-no diana por lo general son reducidos en comparación con los 5 complejos de aptámero-diana. Como se usa en el presente documento, la expresión "presión cinética" se refiere a un medio para proporcionar una oportunidad para disociación natural de complejos y/o inhibir la nueva unión de moléculas que se disocian a partir de un complejo de forma natural. La presión cinética se puede aplicar mediante la adición de una molécula competidora, o mediante difusión de la muestra, o mediante lavados extensos cuando los complejos se unen a un soporte sólido, o mediante cualquier otro medio conocido por un experto en la materia. Como observará alguien con una experiencia habitual en la materia, dado que una estimulación cinética depende de las tasas de disociación diferentes de los complejos de afinidad de aptámero y los complejos de aptámero-no diana, la duración de la estimulación cinética se elige de modo que retenga una proporción elevada de los complejos de afinidad de aptámero a la vez que se reduce sustancialmente el número de complejos de aptámero-no diana. Para que una estimulación cinética sea eficaz, preferentemente la tasa de disociación para el complejo de afinidad de

15 aptámero es significativamente menor que las que se usan para complejos de aptámero-no diana. Dado que un aptámero se prevé seleccionar para que incluya propiedades en particular, se pueden diseñar componentes de un complejo de afinidad de aptámero para que tengan una tasa de disociación comparativamente baja, es decir, una tasa de disociación lenta.

Como se usa en el presente documento, "ligando de ácido nucleico", "aptámero", y "clon" se usan indistintamente para hacer referencia a un ácido nucleico de origen natural que tiene una acción deseada en una molécula diana. Una acción deseable incluye, pero no se limita a, unión de la diana, cambio de la diana por vía catalítica, reacción con la diana de un modo que modifique o altere y la diana o la actividad funcional de la diana, unión covalente a la diana (como en un inhibidor suicida), y facilitar la reacción entre la diana y otra molécula. En una realización, la 25 acción es afinidad de unión específica para una molécula diana, siendo tal molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido que se una al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que es independiente del emparejamiento de bases de Watson/Crick o formación de triple hélice triple, en el que el aptámero no es un ácido nucleico que tenga la función fisiológica conocida de ser unido por la molécula diana. Los aptámeros para una diana dada incluyen ácidos nucleicos que se identifican a partir de una f mezcla de ácidos nucleicos candidata, en la que el aptámero es un ligando de la diana, mediante un método que comprende: (a) poner en contacto la mezcla candidata con la diana, en el que los ácidos nucleicos que tienen un aumento de la afinidad hacia la diana con respecto a otros ácidos nucleicos en la mezcla candidata se pueden repartir desde el resto de la mezcla candidata; (b) repartir los ácidos nucleicos con un aumento de la afinidad del resto de la mezcla candidata; y

(c) amplificar los ácidos nucleicos con un aumento de la afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos

35 enriquecida en ligandos, en la que se identifican los aptámeros de la molécula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestión de grado; sin embargo, en este contexto, la "afinidad de unión específica" de un aptámero hacia su diana se refiere a que el aptámero se une a su diana generalmente con un grado de afinidad mucho más elevado que con el que se une a otros componentes no diana en una mezcla o muestra. Un "aptámero" o "ligando de ácido nucleico" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos en particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos. Los "aptámeros" se refieren a más de uno de tales conjuntos de moléculas. Los aptámeros diferentes pueden tener cualquiera del mismo número o diferente de nucleótidos. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN y pueden ser de una hebra, de doble hebra, o pueden contener regiones de doble hebra o de triple hebra.

45 Como se usa en el presente documento, los códigos de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC son: M = A o C; R = A o G; W = A o N; S = C o G; Y = C o N; K = G o N (N representa el dU modificado específico de la combinación).

Como se usa en el presente documento, "meseta" se refiere a una región de una curva de unión (en la que la fracción de aptámeros unidos aumenta hacia arriba del eje y, y la concentración de diana aumenta hacia la derecha en el eje x) en el que se alcanza una meseta ya que el aumento de la concentración de la diana producido un cambio relativamente pequeño en la fracción de aptámeros unidos a la diana. El porcentaje de la meseta proporcionado en el presente documento es con respecto a un 100 % de los aptámeros que se están uniendo la diana.

55 Como se usa en el presente documento, "proteína" se usa como sinónimo de "péptido", "polipéptido", o "fragmento de péptido". Un polipéptido, proteína, péptido, o fragmento de péptido "purificados" está sustancialmente libre de material celular otras proteínas contaminantes de la célula, tejido, o fuente sin células a partir de la que se obtiene la secuencia de aminoácidos, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza por vía química.

Como se usa en el presente documento, "ensayo de captación" se refiere a un ensayo que comprende la retirada de una diana de la solución en el que la retirada se consigue mediante una interacción de afinidad selectiva entre la diana y una segunda molécula. En una realización, la molécula que tiene afinidad selectiva hacia la molécula diana

65 es un aptámero. En otra realización, la molécula que tiene afinidad selectiva hacia la molécula diana es un anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, "PCR" se refiere a una reacción en cadena de la polimerasa usada para amplificar el número de copias de una molécula de ADN. Como se usa en el presente documento, "cPCR" o "PCR cuantitativa" se refiere a una reacción en cadena de la polimerasa que se usa para amplificar y cuantificar de forma simultánea una molécula de ADN se tiene como diana.

5 Como se usa en el presente documento, "ensayo de sándwich" se refiere a un ensayo capaz de detectar la presencia o de cuantificar la cantidad de una diana de interés. El ensayo requiere el uso de dos moléculas de afinidad diferentes capaces de unir dos regiones que no se solapan (no competitivas), diferentes en una diana de interés. Las moléculas de afinidad incluyen, pero no se limitan a, aptámeros y anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, "sustrato" se refiere a una superficie, que incluye, pero no se limita a, la superficie de una placa, perla o membrana a la que se puede unir una molécula orgánica. Un sustrato puede comprender o no una primera molécula que media la unión de una segunda molécula, tal como un sustrato que comprende estreptavidina que puede mediar la unión de biotina o una molécula que comprende un resto de biotina.

15 En una realización, el sustrato es nitrocelulosa.

Como se usa en el presente documento, "muestra de ensayo" se refiere a una muestra en la que se desconocen la presencia o cantidad de uno o más analitos de interés (por ejemplo, toxina A, toxina B, cadena de toxina A binaria, o cadena de toxina B binaria de C. difficile) y que se pueden determinar en un ensayo, preferentemente un ensayo de diagnóstico que comprende un aptámero. En una realización, la muestra de ensayo puede ser una "muestra biológica" tal como material biológico celular y no celular, que incluye, pero no se limita a, muestras de tejido, sangre, suero, otros fluidos corporales y excrementos. En otra realización, la muestra de ensayo puede ser una "muestra ambiental" que se puede obtener a partir de agua, suelo o aire. Normalmente no es necesario ningún cultivo anterior para la detección de C. difficile en muestras ambientales.

25 El método SELEX

Los términos "SELEX" y "proceso SELEX" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia generalmente a una combinación de (1) la selección de ácidos nucleicos que interactúan con una molécula diana de una manera deseable, por ejemplo la unión a una proteína con afinidad elevada, con (2) la amplificación de esos ácidos nucleicos seleccionados. El proceso SELEX se puede usar para identificar aptámeros con afinidad elevada hacia una molécula o biomarcador diana específicos.

El SELEX generalmente incluye preparar una mezcla de ácidos nucleicos candidata, unir la mezcla candidata a la

35 molécula diana deseada para formar un complejo de afinidad, separar los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos no unidos, separar y aislar el ácido nucleico del complejo de afinidad, purificar el ácido nucleicos, e identificar una secuencia de aptámeros especifica. El proceso puede incluir múltiples rondas para refinar adicionalmente la afinidad del aptámero seleccionado. El proceso puede incluir etapas de amplificación en uno o más puntos en el proceso. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.475.096, titulado "Nucleic Acid Ligands". El proceso SELEX se puede usar para generar un aptámero que se una de forma covalente a su diana así como a un aptámero que no se une de forma covalente a su diana. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.705.337 titulado "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".

45 El proceso SELEX se puede usar para identificar aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas en el aptámero, tales como, por ejemplo, mejora de la estabilidad in vivo o mejora de las características de administración. Los ejemplos de las modificaciones de este tipo incluyen sustituciones químicas en las posiciones de la ribosa y/o fosfato y/o base. Los aptámeros identificados con el proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.660.985, titulado "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5’ y 2’ de las pirimidinas. El documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.580.737, véase anteriormente, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2’-amino (2’-NH2), 2’-fluoro (2’-F), y/o 2’-O-metilo (2’-OMe). Véase también, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 2009/0098549,

55 titulada "SELEX and PHOTOSELEX", que describe bibliotecas de ácidos nucleicos que tienen propiedades físicas y químicas ampliadas y su uso en SELEX y photoSELEX.

Los oligonucleótidos resistentes a nucleasa incluyen al menos una pirimidina modificada en la posición C-5 con un grupo seleccionado entre los que se establecen en la Figura 9. En diversas realizaciones, las modificaciones incluyen sustitución de desoxiuridina en la posición C-5 con un sustituyente seleccionado independientemente entre: bencilcarboxiamida (Bn), naftilmetilcarboxiamida (Nap), triptaminocarboxiamida (Trp), tirosilcarboxiamida (Tyr), (2naftilmetil)carboxiamida (2Nap), y fenetil-1-carboxiamida (PE) como se ha ilustrado anteriormente.

El SELEX también se puede usar para identificar aptámeros que tengan características deseables de tasa de

65 disociación. Véase también la Publicación de Patente de Estados Unidos N.º 2009/0004667, titulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", que describe métodos de SELEX mejorados para generar

aptámeros que se puedan unir a moléculas diana. Se describen métodos para producir aptámeros y fotoaptámeros que tienen tasas de disociación más lentas a partir de sus respectivas moléculas diana. Los métodos implican poner en contacto la mezcla candidata con la molécula diana, permitir que se produzca la formación de complejos de ácido nucleico-diana, y realizar un proceso de enriquecimiento con una tasa de disociación lenta en el que los complejos

5 de ácido nucleico-diana con tasas de disociación rápidas se disocian y no se reforman, mientras que los complejos con tasas de disociación lentas permanecen intactos. Además, los métodos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas candidatas de ácidos nucleicos para generar aptámeros con un aumento del rendimiento de la tasa de disociación (Véase la Publicación de Patente de Estados Unidos N.º 2009/0098549, titulada "SELEX and PhotoSELEX").

En el presente documento "diana" o "molécula diana" o "diana" hace referencia a cualquier compuesto sobre el que puede actuar un ácido nucleico de una forma deseable. Una molécula diana puede ser una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, patógeno, sustancia tóxica, sustrato, metabolito, análogo en estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, colorante, 15 nutriente, factor de crecimiento, célula, tejido, cualquier arqueo fragmento de cualquiera de los mencionados anteriormente, etc., sin limitación. Prácticamente cualquier efector químico o biológico c puede ser una diana adecuada. Las moléculas de cualquier tamaño pueden servir como dianas. Una diana también se puede modificar de ciertas maneras para aumentar la probabilidad o fuerza de una interacción entre la diana y el ácido nucleico. Una diana también puede incluir cualquier variación menor de un compuesto o molécula en particular, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo, variaciones menores en la secuencia de aminoácidos, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado, que no adquiere de forma sustancial la identidad de la molécula. Una "molécula diana" o "diana" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptámero. Las "moléculas diana" o "dianas" se refieren a más de uno de tales conjuntos

25 de moléculas. Las realizaciones del proceso SELEX en las que la diana es un péptido se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.º 6.376.190, titulado "Modified SELEX Processes Without Purified Protein". En el presente caso, las dianas incluyen toxina A, toxina B, toxina binaria, cadena de toxina A binaria, o cadena de toxina B binaria de C. difficile.

Métodos para Identificar o Producir un Aptámero para una toxina de C. difficile

La presente divulgación proporciona métodos para identificar o producir un aptámero de tasa de disociación lenta que se une a una toxina producida por C. difficile en el que dicha toxina se selecciona entre toxina A, toxina B, cadena de toxina A binaria, y cadena de toxina B binaria, método que comprende:

(a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos candidata, en el que la mezcla candidata comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada, ácido nucleico de la mezcla candidata comprende una modificación química en una posición C-5; (b) poner en contacto la mezcla candidata con una diana que es dicha toxina producida por C. difficile y exponer la mezcla candidata a un proceso de enriquecimiento con tasa de disociación lenta, en el que los ácidos nucleicos que tienen una tasa de disociación lenta de la diana con respecto a otros ácidos nucleicos en la mezcla candidata se unen a la diana, formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) repartir los ácidos nucleicos con una tasa de disociación lenta de la mezcla candidata; y (d) amplificar los ácidos nucleicos con una tasa de disociación lenta para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con secuencias de ácidos nucleicos que son capaces 45 de unirse a la molécula diana con una tasa de disociación lenta, de modo que se pueda identificar un aptámero de tasa de disociación lenta para la molécula diana. Los métodos para identificar o producir un aptámero con una tasa de disociación lenta para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una pirimidina en la que una modificación química en una posición C-5 se elige independientemente entre al menos una de las modificaciones mostradas en la Figura 9. Los métodos para identificar o producir un aptámero con una tasa de disociación lenta para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una pirimidina en la que una modificación química en una posición C-5 se elige independientemente entre bencilcarboxiamida, naftilmetilcarboxiamida, triptaminocarboxiamida, tirosilcarboxiamida, 2-naftilmetilcarboxiamida y fenetil-1carboxiamida. Los métodos para identificar o producir un aptámero con una tasa de disociación lenta para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una modificación química adicional, en los que dicha al menos 55 una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones seleccionadas independientemente entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición de fosfato, y una posición de base. Además, los métodos para identificar o producir un aptámero con una tasa de disociación lenta para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una modificación química adicional, en los que dicha al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una modificación de azúcar en la posición 2’, una modificación en la posición 2’-amino (2’-NH2), en la posición 2’-fluoro (2’-F), en la posición 2’-O-metilo (2’-OMe) en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5-bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de estructura principal, metilación, una protección en la posición 3’, y una protección en la posición 5’. Los métodos para identificar o producir un aptámero con una

65 tasa de disociación lenta para una toxina de C. difficile pueden comprender un proceso de enriquecimiento con una tasa de disociación lenta seleccionado entre incubación de una mezcla candidata con una molécula

competidora, dilución de una mezcla candidata, o dilución de una mezcla candidata en presencia de una molécula competidora.

La presente divulgación también proporciona métodos para producir un aptámero que tenga una tasa de disociación

5 lenta a partir de una toxina producida por C. difficile en el que dicha toxina se selecciona entre toxina A, toxina B, cadena de toxina A binaria, y cadena de toxina B binaria, comprendiendo dicho método la etapa de preparar o sintetizar un aptámero basándose en una secuencia de ácidos nucleicos identificada mediante un proceso que comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos candidata, en el que la mezcla candidata comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada, ácido nucleico de la mezcla candidata comprende una modificación química en una posición C-5; (b) poner en contacto la mezcla candidata con una diana que es dicha toxina producida por C. difficile y exponer la mezcla candidata a un proceso de enriquecimiento con tasa de disociación lenta, en la que los ácidos nucleicos que tienen una tasa de disociación lenta de la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos en la mezcla candidata se unen a la molécula diana, formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) repartir los ácidos nucleicos con

15 una tasa de disociación lenta de la mezcla candidata; y (d) amplificar los ácidos nucleicos con una tasa de disociación lenta para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con una tasa de disociación lenta, de modo que se identifica un aptámero de tasa de disociación lenta para la molécula diana. Tales métodos para producir un aptámero que tenga una tasa de disociación lenta a partir de una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una pirimidina en la que una modificación química en una posición C-5 se elige independientemente entre al menos una de las modificaciones mostradas en la Figura 9. Los métodos para producir un aptámero que tenga una tasa de disociación lenta a partir de una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una pirimidina en la que una modificación química en una posición C-5 se elige independientemente entre bencilcarboxiamida, naftilmetilcarboxiamida, triptaminocarboxiamida, tirosilcarboxiamida, 2-naftilmetilcarboxiamida y fenetil-1-carboxiamida. Los métodos para producir un aptámero que

25 tenga una tasa de disociación lenta a partir de una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una modificación química adicional, en los que dicha al menos una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones seleccionadas independientemente entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición de fosfato, y una posición de base. Además, los métodos para producir un aptámero que tenga una tasa de disociación lenta a partir de una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una modificación química adicional, en los que dicha al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una modificación de azúcar en la posición 2’, una modificación en la posición 2’-amino (2’-NH2), en la posición 2’-fluoro (2’-F), en la posición 2’-Ometilo (2’-OMe) en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de estructura principal, metilación,

35 una protección en la posición 3’, y una protección en la posición 5’. Los métodos para producir un aptámero que tenga una tasa de disociación lenta a partir de una toxina de C. difficile pueden comprender un proceso de enriquecimiento con una tasa de disociación lenta seleccionado entre incubación de una mezcla candidata con una molécula competidora, dilución de una mezcla candidata, o dilución de una mezcla candidata en presencia de una molécula competidora.

La presente divulgación también proporciona métodos para producir un aptámero resistente a nucleasa que se una a una toxina producida por C. difficile en el que dicha toxina se selecciona entre toxina A, toxina B, cadena de toxina A binaria, y cadena de toxina B binaria, método que comprende preparar o sintetizar dicho aptámero resistente a nucleasa basándose en una secuencia de ácidos nucleicos identificada mediante un proceso que comprende: (a) 45 preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos modificados, en el que la mezcla candidata comprende ácidos nucleicos modificados en los que al menos una pirimidina en al menos uno, o en cada, ácido nucleico de la mezcla candidata comprende una modificación química en una posición C-5; (b) poner en contacto la mezcla candidata con una diana que es dicha toxina producida por C. difficile, en la que los ácidos nucleicos que tienen un aumento de la afinidad hacia la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos en la mezcla candidata se unen a la molécula diana, formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) repartir los ácidos nucleicos con un aumento de la afinidad del resto de la mezcla candidata; y (d) amplificar los ácidos nucleicos con un aumento de la afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con un aumento de la afinidad y que son resistentes a nucleasa, de modo que se identifica un aptámero resistente a nucleasa para la molécula diana. Los métodos para producir un aptámero resistente a 55 nucleasa para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una pirimidina en la que una modificación química en una posición C-5 se elige independientemente entre al menos una de las modificaciones mostradas en la Figura 9. Los métodos para producir un aptámero resistente a nucleasa para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una pirimidina en la que una modificación química en una posición C-5 se elige independientemente entre bencilcarboxiamida, naftilmetilcarboxiamida, triptaminocarboxiamida, tirosilcarboxiamida, 2-naftilmetilcarboxiamida y fenetil-1-carboxiamida. Los métodos para producir un aptámero resistente a nucleasa para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una modificación química adicional, en los que dicha al menos una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones seleccionadas independientemente entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición de fosfato, y una posición de base. Además, los métodos para producir un aptámero resistente a nucleasa 65 para una toxina de C. difficile pueden comprender al menos una modificación química adicional, en los que dicha al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una

modificación de azúcar en la posición 2’, una modificación en la posición 2’-amino (2’-NH2), en la posición 2’-fluoro (2’-F), en la posición 2’-O-metilo (2’-OMe) en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5-bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de estructura principal, metilación, una protección en la posición 3’, y una protección en la posición 5’.

5 Aptámeros

Los aptámeros para toxinas de C. difficile de la presente divulgación se identificaron usando el método SELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen tasas de disociación lentas, como se ha descrito anteriormente. La forma de las toxinas de C. difficile usadas en el proceso de selección eran toxinas recombinantes preparadas mediante amplificación por PCR de fragmentos de genes deseados de ADN genómico de C. difficile, como se describe en el Ejemplo 1.

El SELEX se realizó usando proteínas etiquetadas con His purificadas obtenidas a partir de la sobreexpresión de

15 fragmentos clonados de genes de toxina de C. difficile. Se usaron bibliotecas de secuencias aleatorias de 40meros que contenían uno de seis nucleótidos modificados, 5-tirosilcarboxiamida-dU (TyrdU), 5-bencilcarboxiamida-dU (BndU), 5-naftilmetilcarboxiamida-dU (NapdU), 5-triptaminocarboxiamida-dU (TrpdU), 5-(2-naftilmetil)carboxiamida (2NapdU), o 5-fenetil-1-carboxiamida (PEdU) en lugar de dU. Se realizaron siete u ocho rondas de selección, y se aplicó una estimulación cinética con sulfato de dextrano en las rondas 2-8. Las combinaciones de aptámeros obtenidas después de la última ronda de SELEX se sometieron a ensayo para afinidad hacia sus dianas en ensayos de unión con filtro, y se determinaron las Kd y las mesetas (Tabla 2). Todas las combinaciones con una afinidad suficiente (Kd de ~10 nM o inferior) se clonaron y se determinaron las secuencias de al menos 48 clones por combinación.

25 Aptámeros para la Toxina A

Para la toxina A, la combinación de aptámero 4943 (TrpdU) presentaba una afinidad excelente con una Kd = 2,42 nM. Las combinaciones 4936 (TyrdU) y 4939 (NapdU) eran activas, con las Kd de 11,5 y 10,8 nM, respectivamente. Las combinaciones 5564 (2NapdU) y 5577 (2NapdU) presentaban buena afinidad, con las Kd de 4,63 y 6,40 nM. Para la toxina A, la combinación de aptámero 5570 (PEdU) era la mejor, con una Kd = 1,61 nM. Los clones de aptámero con buenas afinidades para la toxina A se aislaron de todas las combinaciones con nucleótidos modificados con TrpdU, TyrdU, NapdU, 2NapdU, y PEdU (Tabla 3); las secuencias de aptámeros de toxina A de C. difficile se enumeran en la Tabla 4. Además para identificar clones de aptámero con buena afinidad de unión para la toxina A, se identificaron secuencias consenso entre tales clones de aptámero.

35 El clon de aptámero líder de la combinación 5570 (PEdU) era 5570-54, con Kd = 0,12 nM para la toxina A recombinante y Kd = 6,91 nM para la toxina A nativa.

Algunos clones de aptámero demostraron una afinidad excelente tanto para la toxina A recombinante como para la toxina A nativa, por ejemplo el clon de aptámero 4943-51 (TrpdU) tenía Kd = 1,23 nM para la toxina A recombinante y Kd = 1,78 nM para la toxina A nativa; el clon de aptámero 5564-49 (2NapdU) tenía Kd = 1,13 nM para la toxina A recombinante y Kd = 1,78 nM para la toxina A nativa.

Algunos clones de aptámero demostraban una disminución de la afinidad relativamente pequeña entre la toxina A

45 recombinante y la toxina A nativa, por ejemplo el clon de aptámero 5577-1 (2NapdU) tenía Kd = 1,59 nM para la toxina A recombinante y Kd = 4,97 nM para la toxina A nativa; el clon de aptámero 5577-3 (2NapdU) tenía Kd = 1,73 nM para la toxina A recombinante y Kd = 5,52 nM para la toxina A nativa; el clon de aptámero 4943-60 (TrpdU) tenía Kd = 2,65 nM para la toxina A recombinante y Kd = 4,57 nM para la toxina A nativa.

Además para identificar clones de aptámero con buena afinidad de unión para la toxina A, se identificaron secuencias consenso entre tales clones de aptámero.

Aptámeros para la Toxina B

55 Las afinidades de los aptámeros para la toxina B eran generalmente muy buenas y se correlacionaban bien entre el dominio catalítico amino-terminal de 68,8 kDa del fragmento de la toxina B de C. difficile que se había usado en SELEX y la toxina B de longitud completa, nativa de 270 kDa. Los clones de aptámero con Kd sub-nanomolares para la toxina B se aislaron de todas las combinaciones con nucleótidos modificados con TyrdU, BndU, NapdU, TrpdU, 2NapdU y PEdU (Tabla 5); las secuencias de aptámeros de toxina B de C. difficile se enumeran en la Tabla 6, con los mejores clones mostrados en negrita.

Los de afinidad más elevada aptámeros eran clones con nucleótidos modificados con NapdU o TrpdU. Cinco aptámeros demostraban Kd muy bajas de < 0,1 nM: El clon de aptámero 4940-1 (NapdU) tenía Kd = 0,04 nM para la toxina B recombinante y Kd = 0,06 para la toxina B nativa; el clon de aptámero 4940-23 (NapdU) tenía Kd = 0,07 nM 65 para la toxina B recombinante y Kd = 0,09 nM para la toxina B nativa; el clon de aptámero 4940-27 (NapdU) tenía Kd = 0,10 nM para la toxina B recombinante y Kd = 0,09 nM para la toxina B nativa; el clon de aptámero 4944-5

(TrpdU) tenía Kd = 0,08 nM para la toxina B recombinante y Kd = 0,09 nM para la toxina B nativa; y el clon de aptámero 4944-30 (TrpdU) tenía Kd = 0,06 nM para la toxina B recombinante y Kd = 0,08 nM para la toxina B nativa. Los clones de aptámero con buenas afinidades para la toxina B se aislaron de todas las combinaciones con nucleótidos modificados con TrpdU, TyrdU, NapdU, 2NapdU, BndU y PEdU (Tabla 5); las secuencias de aptámeros

5 de toxina B de C. difficile se enumeran en la Tabla 6. Además para identificar clones de aptámero con buena afinidad de unión para la toxina B, se identificaron secuencias consenso entre tales clones de aptámero.

Aptámeros para la Toxina Binaria (cadena A)

El SELEX con la cadena de toxina A binaria (CdtA) recombinante proporcionó aptámeros activos con nucleótidos modificados con TrpdU, 2NapdU y PEdU (Tabla 7). Las secuencias y los patrones de secuencias comunes de aptámeros de CdtA se muestran en la Tabla 8. La clonación de la combinación 4758 (TrpdU) desveló el clon 4758-6 que comprendía un 18 % de las secuencias en esa combinación y presentaba buena afinidad (Kd = 0,86 nM) hacia la toxina binaria de CdtA. Se obtuvieron veinte secuencias de combinaciones de 2NapdU, la mayoría de ellas con

15 afinidad subnanomolar, y se identificaron varios patrones de secuencias entre estos clones de 2NapdU. Las combinaciones de PEdU contenían cinco aptámeros activos.

Aptámeros para la Toxina Binaria (cadena B)

El SELEX con la cadena de toxina B binaria (CdtB) recombinante proporcionó aptámeros activos con nucleótidos modificados con 2NapdU (Tabla 9). Las secuencias y los patrones de secuencias comunes de aptámeros de CdtB se muestran en la Tabla 10. El clon más activo era 5556-51 con Kd = 1,68 nM.

La presente divulgación proporciona aptámeros para toxinas producidas por C. difficile identificados usando el

25 método SELEX y enumerados en las Tablas 4, 6, 8 y 10. Los aptámeros para las toxinas producidas por para C. difficile que son sustancialmente homólogos a cualquiera de los aptámeros enumerados y que tienen una capacidad sustancialmente similar para unirse a la respectiva toxina producida por by C. difficile como la de un aptámero seleccionado entre el grupo de aptámeros que se establecen en las Tablas 4, 6, 8 y 10 también están incluidos en la presente divulgación. Además, los aptámeros para la respectiva toxina producida por C. difficile que tienen sustancialmente la misma forma estructural que la de los aptámeros identificados en el presente documento y que tienen una capacidad sustancialmente similar para unirse a la respectiva toxina producida por C. difficile como la de un aptámero seleccionado entre el grupo de aptámeros que se establecen en las Tablas 4, 6, 8 y 10 también están incluidos en la presente divulgación.

35 En un aspecto, la presente divulgación proporciona un aptámero que se une de forma específica a una toxina producida por C. difficile e incluye una secuencia primaria de ácidos nucleicos. En una realización, la secuencia primaria de ácidos nucleicos se selecciona entre una secuencia desvelada en la Tabla 4, 6, 8, o 10. En otras realizaciones, la secuencia primaria de ácidos nucleicos se selecciona de modo que sea idéntica en al menos aproximadamente un 75 %, idéntica en al menos aproximadamente un 80 %, idéntica en al menos aproximadamente un 85 %, idéntica en al menos aproximadamente un 90 %, o idéntica en al menos aproximadamente un 95 % a la secuencia primaria de ácidos nucleicos desvelada en la Tabla 4, 6, 8 o 10.

Las expresiones "identidad de secuencias", "porcentaje de identidad de secuencias", "porcentaje de identidad", "% idéntica", "% de identidad", y variaciones de las mismas, cuando se usan en el contexto de dos o más secuencias de 45 ácidos nucleicos, se usan indistintamente para hacer referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje de nucleótidos especificado que es el mismo, cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, tal como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Para comparaciones de secuencias, por lo general una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, y si fuera necesario se diseñan coordenadas de subsecuencias, y se diseñan parámetros de programa de algoritmo de secuencias. A continuación con el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad es secuencias para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa diseñados. El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación se puede

55 realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 1981. 2: 482, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 1970. 48: 443, mediante la búsqueda con el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 1988. 85: 2444, mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase generalmente, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987)).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias es el algoritmo usado en la herramienta de búsqueda de alineamientos local básica (en lo sucesivo en el presente 65 documento "BLAST"), véase, por ejemplo Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990. 215: 403-410 y Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997. 15: 3389-3402. El software para realizar análisis con BLAST está disponible al público a través del

National Center for Biotechnology Information (en lo sucesivo en el presente documento "NCBI"). Los parámetros por defecto usados en la determinación de la identidad de secuencias usando el software disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) se describen en McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32: W20-W25.

5 Como se usa en el presente documento, cuando se describe el porcentaje de identidad de un ácido nucleico, tal como un aptámero con respecto a una toxina producida por C. difficile, cuya secuencia es al menos, por ejemplo, idéntica en aproximadamente un 95 % a una secuencia de nucleótidos de referencia, tiene como intención que la secuencia de ácidos nucleicos sea idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia de ácidos nucleicos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de ácidos nucleicos deseada, cuya secuencia es al menos idéntica en aproximadamente un 95 % a una secuencia de ácidos nucleicos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden experimentar deleción o sustitución con otro nucleótido, o un cierto número de nucleótidos hasta un 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de

15 referencia se puede insertar en la secuencia de referencia (denominada inserción en el presente documento). Estas mutaciones de la secuencia de referencia para generar la secuencia deseada se pueden producir mutaciones en las posiciones 5’ o 3’ terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea de forma individual entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La secuencia de referencia (consulta) puede ser uno cualquiera de la secuencia de nucleótidos completa mostrada en la Tabla 4, 6, 8 o 10, o cualquier fragmento de cualquiera de estas secuencias.

En un aspecto, una secuencia consenso seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23, 28, 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95, 98, 110, 124, 125, 134, 139, 145, 151, 152 o 157 se puede modificar para que 25 comprenda al menos una inserción, una deleción y/o una transposición. En una realización, la secuencia consenso seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23, 28, 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95, 98, 110, 124, 125, 134, 139, 145, 151, 152 o 157 se modifica de modo que al menos un nucleótido se inserte en la secuencia consenso. En otra realización, una secuencia consenso seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23, 28, 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95, 98, 110, 124, 125, 134, 139, 145, 151, 152 o 157 se modifica de modo que al menos un nucleótido experimente deleción de la secuencia consenso. En otra realización, una secuencia consenso seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23, 28, 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95, 98, 110, 124, 125, 134, 139, 145, 151, 152 o 157 se modifica de modo que al menos un nucleótido experimente transposición desde una posición en la secuencia consenso ha otra posición en la secuencia consenso. También se reconoce que una secuencia consenso seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23,

35 28, 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95, 98, 110, 124, 125, 134, 139, 145, 151, 152 o 157 se puede modificar para que comprenda una combinación de una o más inserciones, deleciones o transposiciones mientras que aún mantiene una afinidad adecuada con respecto a una toxina producida por C. difficile para que tenga utilidad en un ensayo de diagnóstico.

En diversas realizaciones, el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de nucleótidos contiguos incluidos en cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10. En diversas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contiguos en el aptámero para una toxina producida por C. difficile puede incluir cualquier número de nucleótidos que sean idénticos al mismo número de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos contiguos incluidos en 45 cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10. En diversas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contiguos en el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos incluidos en cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10. En una realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de 40 nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de 40 nucleótidos contiguos incluidos en cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10 que tiene 40 o más nucleótidos contiguos. En una realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de 30 nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de 30 nucleótidos contiguos incluida en cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10. En otra realización a modo de ejemplo,

55 el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de 20 nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de 20 nucleótidos contiguos incluida en cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10. Además, en otra realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de 8 nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de 8 nucleótidos contiguos incluidos en cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o 10. Además, en otra realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile incluye una secuencia de 4 nucleótidos contiguos que es idéntica a una secuencia de 4 nucleótidos contiguos incluidos en cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 4, 6, 8 o10.

En una realización, el aptámero para la toxina A se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4, 6

65 10, 12-14, 16-22, 24-27, o 29-31. En otra realización más, el aptámero para la toxina A se obtiene a partir de una secuencia consenso seleccionada entre una cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23 o 28. En una realización, el

aptámero para la toxina A es idéntico en al menos aproximadamente un 95 %, idéntico en al menos aproximadamente un 90 %, idéntico en al menos aproximadamente un 85 %, idéntico en al menos aproximadamente un 80 %, o idéntico en al menos aproximadamente un 75 % a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31. En otra realización, el aptámero para la toxina A incluye una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31 o fragmentos

5 de cualquiera de las mismas.

En una realización, el aptámero para la toxina B se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 33-46, 48-65, 67-74, 76-82, 84-89, 91-94, 96-97, o 99-108. En otra realización más, el aptámero para la toxina B se obtiene a partir de una secuencia consenso seleccionada entre una cualquiera de las SEQ ID NO: 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95 y 98. En una realización, el aptámero para la toxina B es idéntico en al menos aproximadamente un 95 %, idéntico en al menos aproximadamente un 90 %, idéntico en al menos aproximadamente un 85 %, idéntico en al menos aproximadamente un 80 %, o idéntico en al menos aproximadamente un 75 % a cualquiera de las SEQ ID NO: 32

108. En otra realización, el aptámero para la toxina B incluye una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 32108 o fragmentos de cualquiera de las mismas.

15 En una realización, el aptámero para la cadena de toxina A binaria se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 109, 111-123, 126-133, 135-138, 140-144, o 146-150. En otra realización más, el aptámero para la cadena de toxina A binaria se obtiene a partir de una secuencia consenso seleccionada entre una cualquiera de las SEQ ID NO: 110, 124-125, 134, 139, o 145. En una realización, el aptámero para la cadena de toxina A binaria es idéntico en al menos aproximadamente un 95 %, idéntico en al menos aproximadamente un 90 %, idéntico en al menos aproximadamente un 85 %, idéntico en al menos aproximadamente un 80 %, o idéntico en al menos aproximadamente un 75 % a cualquiera de las SEQ ID NO: 109-150. En otra realización, el aptámero para la cadena de toxina A binaria incluye una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 109-150 o fragmentos de cualquiera de las mismas.

25 En una realización, el aptámero para la cadena de toxina B binaria se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 153-156, 158-162. En otra realización más, el aptámero para la cadena de toxina B binaria se obtiene a partir de la secuencia consenso of SEQ ID NO: 151, 152 o 157. En una realización, el aptámero para la cadena de toxina B binaria es idéntico en al menos aproximadamente un 95 %, idéntico en al menos aproximadamente un 90 %, idéntico en al menos aproximadamente un 85 %, idéntico en al menos aproximadamente un 80 %, o idéntico en al menos aproximadamente un 75 % a cualquiera de las SEQ ID NO: 151-162. En otra realización, el aptámero para la cadena de toxina B binaria incluye una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 151-162 o fragmentos de cualquiera de las mismas.

35 El aptámero para una toxina producida por C. difficile puede contener cualquier número de nucleótidos además de la región que se une a la toxina de C. difficile. En diversas realizaciones, el aptámero puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleótidos, hasta aproximadamente 95 nucleótidos, hasta aproximadamente 90 nucleótidos, hasta aproximadamente 85 nucleótidos, hasta aproximadamente 80 nucleótidos, hasta aproximadamente 75 nucleótidos, hasta aproximadamente 70 nucleótidos, hasta aproximadamente 65 nucleótidos, hasta aproximadamente 60 nucleótidos, hasta aproximadamente 55 nucleótidos, hasta aproximadamente 50 nucleótidos, hasta aproximadamente 45 nucleótidos, hasta aproximadamente 40 nucleótidos, hasta aproximadamente 35 nucleótidos, hasta aproximadamente 30 nucleótidos, hasta aproximadamente 25 nucleótidos, y hasta aproximadamente 20 nucleótidos.

45 El aptámero para una toxina producida por C. difficile se puede seleccionar para que tenga cualquier constante de disociación (Kd) adecuada para la respectiva toxina. En una realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile tiene una constante de disociación (Kd) para la respectiva toxina de aproximadamente 10 nM o inferior. En otra realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile tiene una constante de disociación (Kd) para la respectiva toxina de aproximadamente 15 nM o inferior. Además, en otra realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile tiene una constante de disociación (Kd) para la respectiva toxina de aproximadamente 20 nM o inferior. Además, en otra realización a modo de ejemplo, el aptámero para una toxina producida por C. difficile tiene una constante de disociación (Kd) para la respectiva toxina de aproximadamente 25 nM o inferior. Una constante de disociación adecuada se puede determinar con un ensayo de unión usando una valoración en múltiples puntos y ajustando la

55 ecuación y = (máx -mín)(Proteína)/(Kd + Proteína) + mín. Se debe observar que la determinación de las constantes de disociación es altamente dependiente de las condiciones en las que se miden y por lo tanto estos números pueden variar de forma significativa con respecto a factores tales como el tiempo de equilibrio, etc. En otras realizaciones, el aptámero para una toxina producida por C. difficile es un aptámero con una Kd que es inferior o igual a la Kd de un aptámero seleccionado entre las secuencias que se desvelan en las Tablas 4, 6, 8 y 10.

Dado que la toxina binaria está formada por una cadena A y una cadena B, la unión más eficaz se puede conseguir usando una forma dimérica u otra forma multimérica del aptámero. Por lo tanto, en otra realización, el aptámero es una multimerización de cualquier combinación de las secuencias de la Tabla 8 y las secuencias de la Tabla 10. Las mismas estrategias se podrían aplicar a cualquier secuencia de aptámeros con las características de unión

65 apropiadas para la toxina binaria. En otra realización, se podría usar un aptámero para la cadena A en conjunto con un aptámero para la cadena B para detectar toxina binaria en un ensayo de sándwich.

Kits Que Comprenden Aptámeros para Toxinas Producidas por C. difficile

La presente divulgación proporciona kits que comprenden cualquiera de los aptámeros para toxinas producidas por

C. difficile descritas en el presente documento. Tales kits pueden comprender, por ejemplo, (1) al menos un

5 aptámero para una toxina producida por C. difficile; y (2) al menos un reactivo de ensayo de diagnóstico, tal como un disolvente o solución. Los componentes adicionales del kit pueden incluir opcionalmente, por ejemplo: (1) al menos un envase, vial o aparato similar para alojar y/o mezclar los componentes del kit; y (2) aparato para recoger una muestra a someter a ensayo para la presencia de una toxina de C. difficile.

Métodos para Detectar Toxinas Producidas por C. difficile

La presente divulgación proporciona métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que se une a una toxina producida por C. difficile en el que dicha toxina se selecciona entre toxina A, toxina B, cadena de toxina A binaria, y 15 cadena de toxina B binaria. Además, se desvelan métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile que comprenden aptámeros que comprenden al menos una pirimidina modificada en una posición C-5 en los que dicha al menos una pirimidina modificada en una posición C-5 comprende una modificación en la posición C-5 independientemente elegidos entre al menos una de las modificaciones mostradas en la Figura 9. También se desvelan métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile que comprende aptámeros que comprenden al menos una pirimidina modificada en una posición C-5 en los que dicha al menos una pirimidina modificada en una posición C-5 comprende una modificación en la posición C-5 se elige independientemente entre bencilcarboxiamida, naftilmetilcarboxiamida, triptaminocarboxiamida, tirosilcarboxiamida, 2-naftilmetilcarboxiamida y fenetil-1-carboxiamida. Los métodos para detectar una toxina de C. difficile desvelados en el presente documento pueden comprender un aptámero que comprende al menos una modificación química adicional, en los que dicha al

25 menos una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones seleccionadas independientemente entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición de fosfato, y una posición de base. Además, los métodos para detectar una toxina de C. difficile desvelados en el presente documento pueden comprender al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una modificación de azúcar en la posición 2’, una modificación en la posición 2’-amino (2’-NH2), en la posición 2’-fluoro (2’-F), en la posición 2’-O-metilo (2’-OMe) en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5-bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de estructura principal, metilación, una protección en la posición 3’, y una protección en la posición 5’.

35 La presente divulgación proporciona métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile en una muestra de ensayo en la que el método de detección se selecciona entre un ensayo de captación, ensayo de transferencia puntual, ensayo de PCR o ensayo de sándwich.

La presente divulgación también proporciona métodos para detectar la presencia de la toxina A de C. difficile en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4, 6-10, 12-14, 16-22, 24-27, o 29-31 o un fragmento de las mismas. Los métodos para detectar la presencia de la toxina A de C. difficile en una muestra de ensayo pueden comprender un ensayo de captación, ensayo de transferencia puntual, ensayo de PCR o ensayo de sándwich. Los ensayos de sándwich usados para detectar la presencia de la toxina A de C. difficile se pueden

45 seleccionar entre un ensayo de aptámero-diana-anticuerpo, ensayo de anticuerpo-diana-aptámero, y ensayo de aptámero-diana-aptámero. Los métodos para detectar la presencia de la toxina A de C. difficile en una muestra de ensayo pueden proporcionar una medida cuantitativa de la toxina A.

La presente divulgación también proporciona métodos para detectar la presencia de la toxina B de C. difficile en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 33-46, 48-65, 67-74, 76-82, 84-89, 9194, 96-97, o 99-108 o un fragmento de las mismas. Los métodos para detectar la presencia de la toxina B de C. difficile en una muestra de ensayo pueden comprender un ensayo de captación, ensayo de transferencia puntual, ensayo de PCR o ensayo de sándwich. Los ensayos de sándwich usados para detectar la presencia de la toxina B

55 de C. difficile se pueden seleccionar entre un ensayo de aptámero-diana-anticuerpo, ensayo de anticuerpo-dianaaptámero, y ensayo de aptámero-diana-aptámero. Los métodos para detectar la presencia de la toxina B de C. difficile en una muestra de ensayo pueden proporcionar una medida cuantitativa de la toxina B.

La presente divulgación también proporciona métodos para detectar la presencia de la cadena de toxina A binaria de

C. difficile en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 109, 111-123, 126-133, 135-138, 140-144, o 146-150 o un fragmento de las mismas. Los métodos para detectar la presencia de la cadena de toxina A binaria de C. difficile en una muestra de ensayo pueden comprender un ensayo de captación, ensayo de transferencia puntual, ensayo de PCR o ensayo de sándwich. Los ensayos de sándwich usados para detectar la

65 presencia de la cadena de toxina A binaria de C. difficile se pueden seleccionar entre un ensayo de aptámero-dianaanticuerpo, ensayo de anticuerpo-diana-aptámero, y ensayo de aptámero-diana-aptámero. Los métodos para

detectar la presencia de la cadena de toxina A binaria de C. difficile en una muestra de ensayo pueden proporcionar una medida cuantitativa de la cadena de toxina A binaria.

La presente divulgación también proporciona métodos para detectar la presencia de la cadena de toxina B binaria de

5 C. difficile en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 153-156, 158-162 o un fragmento de las mismas. Los métodos para detectar la presencia de la cadena de toxina B binaria de C. difficile en una muestra de ensayo pueden comprender un ensayo de captación, ensayo de transferencia puntual, ensayo de PCR o ensayo de sándwich. Los ensayos de sándwich usados para detectar la presencia de la cadena de toxina B

10 binaria de C. difficile se pueden seleccionar entre un ensayo de aptámero-diana-anticuerpo, ensayo de anticuerpodiana-aptámero, y ensayo de aptámero-diana-aptámero. Los métodos para detectar la presencia de la cadena de toxina B binaria de C. difficile en una muestra de ensayo pueden proporcionar una medida cuantitativa de la cadena de toxina B binaria.

15 La presente divulgación también proporciona métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que comprende una secuencia consenso seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 15, 23, 28, 32, 47, 66, 75, 83, 90, 95, 98, 110, 124-125, 134, 139, 145, 151-152 y 157 o un fragmento de las mismas. Los métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile con un aptámero que comprende tal secuencia consenso en una

20 muestra de ensayo pueden comprender un ensayo de captación, ensayo de transferencia puntual, ensayo de PCR o ensayo de sándwich. Los ensayos de sándwich usados para detectar la presencia de una toxina de C. difficile se pueden seleccionar entre un ensayo de aptámero-diana-anticuerpo, ensayo de anticuerpo-diana-aptámero, y ensayo de aptámero-diana-aptámero. Los métodos para detectar la presencia de una toxina de C. difficile en una muestra de ensayo pueden proporcionar una medida cuantitativa de tal toxina de C. difficile.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas. Todos los ejemplos descritos en el presente documento

30 se deberían considerar en el contexto de las técnicas convencionales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la materia. Se pueden realizar técnicas de biología molecular de rutina m como se describe en manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

35 Ejemplo 1. SELEX con Toxinas A/B y Toxina Binaria de C. difficile: Obtención de Diana

Obtención de Diana

Las dianas adecuadas para SELEX se prepararon mediante amplificación con PCR de los fragmentos de genes

40 deseados a partir de ADN genómico de C. difficile, clonación el marco en el vector pET-51b entre las secuencias de la etiqueta de Estrep y de la etiqueta de His, y sobreexpresión en Rosetta de E. coli (Tabla 1). Para la toxina A, se obtuvo un polipéptido recombinante que consistía en las repeticiones 17-32 de la horquilla β carboxi-terminal. Este dominio de toxina se eligió ya que se había publicado una estructura cristalina para un péptido de toxina A similar sólo con cinco repeticiones de unión a receptor (Ho, J.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005. 102 (51): p.

45 18373-8). Para la toxina B, el dominio catalítico amino-terminal se purificó; se obtuvo una estructura cristalina de este dominio (Reinert, D.J., et al., J. Mol. Biol., 2005. 351 (5): p. 973-81). Para la toxina binaria, la subunidad CdtA de longitud completa pero sin la secuencia señal predicha se produjo en forma recombinante (estructura cristalina disponible (Sundriyal, A., et al., J. Biol. Chem., 2009. 284 (42): p. 28713-9)), y se produjo un fragmento de CdtB (restos 30-207 del aminoácido) que representa el denominado dominio de activación que supuestamente se ha

50 retirado por escisión de la proteína precursora de CdtB (Perelle, S., et al., Infect. Immun., 1997. 65 (4): p. 1402-7). La clonación y la purificación de todas las toxinas de C. difficile se muestra en la Figura 1A-1D, junto con estructuras cristalinas disponibles. Las proteínas con doble etiqueta, recombinantes se purificaron mediante cromatografía por afinidad sobre Ni-NTA agarosa y estreptactina agarosa usando protocolos convencionales.

55 Tabla 1. Amplificación con PCR de genes de toxina de C. difficile para clonación y sobreexpresión

Amplificación con PCR

Proteína diana

Gen Cebadores de PCR

Amplicón (nucleótidos) Proteína (UniProt) Dominio (restos) Tamaño (kDa) (etiquetado)

tcdA tcdA-6 + tcdA-2 tcdB tcdB-5 +

6751-8127 1-1638 Toxina A (TOXA CLODI) Toxina B 2250-2709 1-546 57,1 68,8

cdtA cdtB

tcdB-7 cdtA-1 + cdtA-2 cdtB-15 + cdtB-16 (TOXB_CLODI) 103-1387 Toxina A Binaria 35-463 54,7 (O32738_CLODI) 90-622 Toxina B Binaria 30-207 26,0 (O32739_CLODI)

SEQ ID NO:

Cebador Cebador de Secuencia (sitios de restricción para clonación subrayados)

163 164 165 166 167 168 169 170

tcdA-6 tcdA-2 tcdB-5 tcdB-7 cdtA-1 cdtA-2 cdtB-15 cdtB-16 GCGCAAGCTTCTTCAAAATGGATATATTACTATTGAAAG GCGCGAGCTCCATATATCCCAGGGGCTTTTAC GCGCAAGCTTATGAGTTTAGTTAATAGAAAACAGTTAG GCGCAAGCTTCATCTTCACCAAGAGAACCTTC GCGCAAGCTTCAAGACTTACAAAGCTATAGTG GCGCGAGCTCCAGGTATCAATGTTGCATCAAC GCGCAAGCTTCAAACTAGTACAAGTAATC GCGCGAGCTCGGTCAAAGAAATTGTTATTTGGG

Ejemplo 2. SELEX con Toxinas A/B y Toxina Binaria C. difficile: Afinidades de SELEX y Combinación

El SELEX con las proteínas etiquetadas con His purificadas se realizó usando reparto de Dynabeads® (Talon® o

5 Etiqueta de His). Se usaron bibliotecas de secuencias aleatorias de 40meros que contenían uno de los seis nucleótidos modificados, 5-tirosilcarboxiamida-dU (TyrdU), 5-bencilcarboxiamida-dU (BndU), 5naftilmetilcarboxiamida-dU (NapdU), 5-triptaminocarboxiamida-dU (TrpdU), 5-(2-naftilmetil)carboxiamida (2NapdU), o 5-fenetil-1-carboxiamida (PEdU) en lugar de dU. Se realizaron siete u ocho rondas de selección, y en las rondas 2-8 se aplicó una estimulación cinética con sulfato de dextrano. Las combinaciones de aptámero obtenidas después de

10 la última ronda de SELEX se sometieron a ensayo para afinidad hacia sus dianas en ensayos de unión con filtro, y las Kd y las mesetas se determinaron (Tabla 2).

Las combinaciones de aptámero obtenidas después de la última ronda de SELEX se sometieron a ensayo para afinidad hacia sus dianas en ensayos de unión con filtro, y las Kd y las mesetas se determinaron (Tabla 2). Para la

15 toxina A, la combinación de aptámero 4943 (TrpdU) presentaba buena afinidad con una Kd = 2,42 nM. Las combinaciones 4936 (TyrdU) y 4939 (NapdU) eran activas, con las Kd de 11,5 y 10,8 nM, respectivamente. Las combinaciones 5564 (2NapdU) y 5577 (2NapdU) también eran activas, con las Kd de 4,63 y 6,40 nM. Para la toxina A, la combinación de aptámero 5570 (PEdU) era la mejor, con una Kd = 1,61 nM.

20 Para la toxina B, las combinaciones de aptámeros de TyrdU, BndU, NapdU, TrpdU, 2NapdU y PEdU demostraban afinidades excelentes con las Kd en el intervalo de 0,11-1,11 nM.

La cadena de la toxina A binaria también se usó de forma satisfactoria en la selección de aptámeros de alta afinidad y proporcionó la combinación 4758 (TrpdU) con Kd = 0,40 nM; combinación 5567 (2NapdU) con Kd = 0,19 nM; y

25 combinación 5574 (PEdU) con Kd = 0,30 nM. La cadena de la toxina B binaria se usó para seleccionar la combinación 5556 (2NapdU) activa, con Kd = 7,58 nM.

Todas las combinaciones con una afinidad suficiente (Kd de ~10 nM o inferior) se clonaron y se determinaron las secuencias de al menos 48 clones por combinación. 30 Tabla 2. SELEX con toxinas de C. difficile

Diana Biblioteca MOD ID de la Muestra Combinación Kd (nM) Meseta

Toxina A 40N29.14 TyrdU, S247-R8-S1 4936 11,50 42 % BndU S247-R8-S9 n/d1 70,30 40 % NapdU S247-R8-S17 4939 10,80 48 % TrpdU S247-R8-S25 4943 2,42 46 %

Ejemplo 3. Clones de Aptámero de Toxina A

5 Los clones representativos de las combinaciones 4936 (TyrdU), 4939 (NapdU), 4943 (TrpdU), 5564 (2NapdU), 5577 (2NapdU), y 5570 (PEdU) de SELEX se evaluaron para afinidad hacia la toxina A en ensayos de unión en filtro. Casi todos los clones presentaban buena afinidad hacia el fragmento de la toxina A recombinante de 57,1 kDa que se había usado para selección, sin embargo, solamente algunos de los clones demostraban afinidad hacia la toxina A de 308 kDa, nativa. Esto no es sorprendente, ya que algunos de los epítopos en la proteína recombinante, más

10 pequeña pueden no ser accesibles para la unión a aptámero de la toxina nativa, de longitud completa.

Las afinidades (Kd) y las mesetas de las curvas de unión se muestran en la Tabla 3 y las secuencias correspondientes se enumeran en la Tabla 4, con los mejores clones mostrados en negrita.

15 Clones de la Combinación 4936 (TyrdU): el clon 4936-4 representaba un 20 % de las secuencias en la combinación y era el más activo con Kd = 3,8 nM para el dominio de la toxina A recombinante y Kd = 14,5 nM para la toxina A nativa.

Clones de la Combinación 4939 (NapdU): se encontraron tres secuencias no relacionadas cinco veces cada una en

20 esta combinación. El clon 4939-280 era el clon más activo en esta combinación, con Kd = 2,34 nM para la proteína recombinante y Kd = 15,3 nM para la toxina A nativa.

Clones de la Combinación 4943 (TrpdU): en esta combinación se encontraron cuatro clones con buena afinidad (nanomolar baja) para la toxina A nativa. El mejor clon, 4943-51 (Kd = 1,78 nM para la toxina A nativa), representaba

25 un 19 % de todas las secuencias en esta combinación. Los otros tres clones presentaban el motivo común NNANAnnCNNNCnnCnN (N = TrpdU; n = A, G, C, o TrpdU). Los clones 4943-50, 4943-60, y 4943-49 que poseían solamente 32 nucleótidos en lugar de los 40 habituales dentro de la región aleatoria (las Kd, 5,60 nM, 4,57 nM, y 7,91 nM para la toxina A nativa respectivamente) presentaban buena afinidad.

30 Clones de la Combinación 5564 (2NapdU): El clon más activo de esta combinación era 5564-49 (Kd = 1,78 nM para la toxina A nativa). Varios otros clones también estarán presentes en esta combinación, compartiendo uno de los tres patrones de secuencias NAAAGNAGGN, GNNRNCMKNCNGA (SEQ ID NO: 15), o CGGGNCGNGACAGANCGCA, respectivamente (N = 2NapdU; R = A o G; M = A o C; K = G o N).

Clones de la Combinación 5570 (PEdU): El clon líder, 5570-54, con Kd = 0,12 nM para la toxina A recombinante y Kd = 6,91 nM para la toxina A nativa, era la secuencia más abundante en esta combinación.

Clones de la Combinación 5577 (2NapdU): los clones activos compartían todo o parte del patrón NACCGAACGNNnNCAG-NCNGA (N = 2NapdU; n = A, G, C o 2NapdU). Estas secuencias se habían seleccionado en un SELEX especial, en el que una aptámero de la toxina A de competición (4943-51) estaba presente en un exceso de dos veces con respecto a la concentración de la proteína diana.

Tabla 3. Afinidades de Clones de Aptámero de SELEX con toxina A de C. difficile.

Aptámero de Toxina A (TOXA_CLODI)

Afinidad hacia proteína recombinante (Diana de SELEX) Afinidad hacia proteína madura (diana nativa)

ID de Clon ID de Aptámero MOD

Kd (nM) Meseta Kd (nM) Meseta

247-8-1-1 4936-1_0 TyrdU 247-8-1-3 4936-3_0 TyrdU 247-8-1-4 4936-4_0 TyrdU 247-8-1-9 4936-9_0 TyrdU 247-8-1-13 4936-13_0 TyrdU 247-8-1-18 4936-18_0 TyrdU 247-8-1-32 4936-32_0 TyrdU

17,0 33 % 23,9 27 % 3,80 37 % 33,3 11 % 25,7 45 % 74,5 36 % 19,9 40 % 14,5 29 %

247-8-17-195 4939-195_0 NapdU 247-8-17-196 4939-196_0 NapdU 247-8-17-194 4939-194_0 NapdU 247-8-17-280 4939-280_0 NapdU 247-8-17-281 4939-281_0 NapdU 247-8-17-209 4939-209_0 NapdU 247-8-17-202 4939-202_0 NapdU 247-8-17-246 4939-246_0 NapdU

23,3 9 % 8,63 34 % 20,5 8 % 2,34 28 % 1,35 24 % 11,4 27 % 13,2 34 % 12,5 34 % > 100 2 % 61,6 37 % 15,3 30 % >100 0 % 202 55 % 104 50 % 58,4 31 %

247-8-25-49 4943-49_0 TrpdU 247-8-25-50 4943-50_0 TrpdU 247-8-25-51 4943-51_0 TrpdU

1,39 49 % 2,81 36 % 1,23 43 % 7,91 43 % 5,60 54 % 1,78 54 %

247-8-25-60 4943-60_0 TrpdU 247-8-25-71 4943-71_0 TrpdU 247-8-25-73 4943-73_0 TrpdU 247-8-25-91 4943-91_0 TrpdU

2,65 46 % 6,26 18 % 0,82 13 % 0,43 10 % 4,57 46 %

270-8-1-49 5564-49_0 2NapdU 270-8-1-50 5564-50_0 2NapdU 270-8-1-52 5564-52_0 2NapdU 270-8-1-58 5564-58_0 2NapdU 270-8-1-65 5564-65_0 2NapdU 270-8-1-84 5564-84_0 2NapdU

1,13 30 % 6,99 31 % 1,86 41 % 6,29 43 % 2,80 20 % 2,87 46 % 1,78 11 % >100 0 % 19,30 20 % 46,00 25 % >100 1 % >100 1 %

270-8-1-89 5564-89_0 2NapdU 270-8-1-66 5564-66_0 2NapdU 270-8-1-161 5564-161_0 2NapdU

3,40 34 % 7,17 41 % 2,71 67 % 11,90 17 % >100 2 % 6,15 12 %

270-8-9-50

5570-50_0 PEdU 4,87 23 % >100 0 %

270-8-9-54

5570-54_0 PEdU 0,12 24 % 6,91 8 %

270-8-29-1

5577-1_0 2NapdU 1,59 48 % 4,97 21 %

270-8-29-3

5577-3_0 2NapdU 1,73 39 % 5,52 22 %

270-8-29-12

5577-12_0 2NapdU 6,48 53 % 12,90 19 %

Ejemplo 4. Clones de Aptámero de Toxina B

Las afinidades de los aptámeros para la toxina B generalmente eran muy buenas y se correlacionaban bien entre el dominio catalítico amino-terminal de 68,8 kDa del fragmento de la toxina B de C. difficile que se habían usado en

5 SELEX y la toxina B de longitud completa, nativa de 270 kDa. Los clones de aptámero clones con Kd subnanomolares para la toxina B se aislaron de todas las combinaciones con nucleótidos modificados con TyrdU, BndU, NapdU, TrpdU, 2NapdU y PEdU (Tabla 5); las secuencias de aptámeros de toxina B de C. difficile se enumeran en en la Tabla 6, con los mejores clones mostrados en negrita.

10 Clones de la Combinación 4937 (TyrdU): los alineamientos de los aptámeros de TyrdU indicaban la presencia de los patrones de secuencias distintos (YNNSSNGAAW (SEQ ID NO: 32), YGAAWN (SEQ ID NO: 47)), (N = TyrdU; W = A

o N; S = C o G; Y = C o N), así como una secuencia huérfana.

Clones de la Combinación 4938 (BndU): esta combinación contenía tres secuencias no relacionadas, todas estaban 15 presentes en múltiples copias.

Clones de la Combinación 4940 (NapdU): las secuencias más abundantes, incluyendo cuatro de los clones líder, contenían todo o parte del patrón KSGANNGGRW (SEQ ID NO: 66) (N = NapdU; R = A o G; W = A o N; S = C o G; K = G o N). Además, estaban presentes tres secuencias huérfanas no relacionadas.

20 Clones de la Combinación 4944 (TrpdU): la mayoría de las secuencias contenían el patrón NnCYnnnNCNNnAARWNMAMSYN (SEQ ID NO: 75); otras dos secuencias compartían un patrón diferente, CNnGnANCNGGAAAN, (N = TrpdU; n = A, G, C o TrpdU; M = A o C; R = A o G; W=A o N; S = C o G; Y = C o N), y también estaban presentes cuatro secuencias huérfanas.

25 Clones de la Combinación 5566 (2NapdU): Patrón

En un par de clones se encontró AnCnNNNAAGNGAACNNNnAnnnnnnnnnGnGNNnANA (N = 2NapdU; n = A, G, C o 2NapdU). Esta combinación contenía dos secuencias no relacionadas adicionales en múltiples copias.

30 Clones de la Combinación 5573 (PEdU): se identificaron dos patrones, GCCNNNCNNGNNAAACGNCCNNGANGGCAGCGNN y AGNNNGANCCC (N = PEdU). Estaban presentes seis clones no relacionados, adicionales.

35 Clones de la Combinación 5578 (NapdU): dos clones activos estaban presentes en múltiples copias. Estas secuencias se habían seleccionado en un SELEX especial, en el que un aptámero de toxina B (4940-23) de competición estará presente en un exceso de dos veces con respecto a la concentración de la proteína diana.

Los aptámeros de la afinidad más elevada aptámeros eran clones con nucleótidos modificados con NapdU o TrpdU. 40 Cinco aptámeros demostraron Kd muy bajas < 0,1 nM para la toxina B nativa.

Tabla 5. Afinidades de Clones de Aptámero de SELEX con toxina B de C. difficile.

Aptámero de Toxina B (TOXB_CLODI)

Afinidad hacia proteína recombinante (Diana de SELEX) Afinidad hacia proteína madura (diana nativa)

ID de Clon ID de Aptámero MOD

Kd (nM) Meseta Kd (nM) Meseta

247-8-3-49 4937-49_0 TyrdU 247-8-3-50 4937-50_0 TyrdU

0,19 23 % 0,36 26 % 0,16 6 % 0,27 4 %

247-8-3-51 4937-51_0 TyrdU 247-8-3-55 4937-55_0 TyrdU 247-8-3-57 4937-57_0 TyrdU 247-8-3-66 4937-66_0 TyrdU 247-8-3-67 4937-67_0 TyrdU 247-8-3-81 4937-81_0 TyrdU 247-8-3-85 4937-85_0 TyrdU 247-8-3-94 4937-94_0 TyrdU

0,60 31 % 0,15 39 % 0,15 35 % 0,63 34 % 0,11 21 % 0,23 19 % 0,27 32 % 0,27 27 % 1,07 14 % 0,15 15 % 0,12 11 % 0,59 14 % 0,23 16 % 0,28 13 % 0,72 25 % 0,36 12 %

247-8-11-1 4938-1_0 BndU

0,84 23 % 2,03 20 %

247-8-11-6 247-8-11-17

4938-6_0 4938-17_0 BndU BndU 1,02 0,36 16 % 32 % 1,52 0,50 17 % 16 %

247-8-19-1 247-8-19-3 247-8-19-6 247-8-19-8 247-8-19-19 247-8-19-23 247-8-19-27

4940-1_0 4940-3_0 4940-6_0 4940-8_0 4940-19_0 4940-23_0 4940-27_0 NapdU NapdU NapdU NapdU NapdU NapdU NapdU 0,04 1,04 0,05 0,19 0,11 0,07 0,10 24 % 27 % 15 % 33 % 23 % 37 % 34 % 0,06 0,67 0,43 0,27 0,14 0,09 0,09 14 % 12 % 7 % 10 % 8 % 13 % 12 %

247-8-27-1 247-8-27-4 247-8-27-5 247-8-27-9 247-8-27-11 247-8-27-14 247-8-27-20 247-8-27-30 247-8-27-34

4944-1_0 4944-4_0 4944-5_0 4944-9_0 4944-11_0 4944-14_0 4944-20_0 4944-30_0 4944-34_0 TrpdU TrpdU TrpdU TrpdU TrpdU TrpdU TrpdU TrpdU TrpdU 0,20 0,10 0,08 0,18 0,14 0,24 0,12 0,06 0,07 26 % 29 % 33 % 36 % 24 % 20 % 25 % 28 % 35 % 0,13 0,16 0,09 0,14 0,22 0,70 0,18 0,08 0,41 10 % 11 % 10 % 9 % 6 % 9 % 7 % 9 % 10 %

270-8-5-53 270-8-5-74 270-8-5-77

5566-53_0 5566-74_0 5566-77_0 2Napd 2Napd 2Napd 0,02 0,04 NT 5 % 6 % NT 0,22 0,25 0,23 15 % 21 % 6 %

270-8-13-2 270-8-13-3 270-8-13-4 270-8-13-5 270-8-13-9 270-8-13-11 270-8-13-14 270-8-13-23 270-8-13-24

5573-2_0 5573-3_0 5573-4_0 5573-5_0 5573-9_0 5573-11_0 5573-14_0 5573-23_0 5573-24_0 PEdU PEdU PEdU PEdU PEdU PEdU PEdU PEdU PEdU 0,03 0,04 0,03 0,06 0,01 6,82 0,04 1,49 0,02 33 % 52 % 54 % 49 % 45 % 36 % 21 % 35 % 33 % 0,11 0,25 0,08 0,55 0,14 2,70 0,33 0,55 0,11 15 % 12 % 12 % 14 % 13 % 8 % 9 % 9 % 10 %

270-8-30-66 270-8-30-73

5578-66_0 5578-73_0 2Napd U 2Napd 0,98 1,62 14 % 18 % NT NT NT NT

Tabla 6. Clones de Aptámero de Toxina B de C. difficile. Las secuencias líder tienen su "ID de Aptámero N.º" en negrita y las secuencias consenso están subrayadas y aparecen bajo la etiqueta "Patrón de la Secuencia". La base con "N" mayúscula representa el nucleótido modificado como se indica para la combinación en particular (TyrdU,

5 BndU, NapdU, TrpdU, 2NapdU, o PEdU). La base de "n" en letra minúscula en la secuencia consenso indica una base variable dentro de un motivo que se selecciona entre A, G, C o el nucleótido modificado para la combinación en particular (TyrdU, NapdU, TrpdU, 2NapdU, o PEdU). Se usaron los códigos de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC: M = A o C; R = A o G; W= A o N; S = C o G; Y = C o N; K = G o N (con N representando el dU modificado específico de la combinación), y para definir el consenso se usó un punto de corte de un 90 % de la representación.

Clones de la Combinación 4938 (BndU) SEQ ID NO. N.º de ID del Aptámero Recuento Pct 63 4938-1 5 10 % NNGGCGCCGNNNGCGGNANGACNCCCNNNNCNNANGGCNG 64 4938-6 4 8 % AGNGCNAGCGACNCCGCGGNACNACNNCNCCCNACNAGN 65 4938-17 3 6 % NANAAAGANCNNGCCNNNGNAANNCCNCANGACANAAANA

Clones de la Combinación 4940 (NapdU) SEQ ID NO. N.º de ID del Aptámero Recuento Pct Patrón de la Secuencia KSGANNGGRW 67 4940-1 9 20 % NCCNNNGCGAANCGGGANNGGANNACGGNNGGGCAANAGN 68 4940-23 4 9 % AGGCNCAANGGNGNANCGANNGGAAAGCAGNNAANCGAN 69 4940-19 2 5 % GCGCNCAGNNGGNNGGANNGGGAGNNGGAANNAGGNAGCA 70 4940-31 1 2 % NGGGNCNCAAGNNGGNNGGCCCANNGGGANNGGAAGNCCN 71 4940-6 2 5 % CCCNGCGCNGANNNGCAANNAGCACGGCNGNCGGNGAACN 72 4940-3 1 2 % NCCANCGGGACCACNAACGNNAGCNCCAGGCGGGACNGNC (huérfana) 73 4940-8 1 2 % NANCAGACCNCCANCGCGNCACNNANGAGNNGAACACGA (huérfana) 74 4940-27 1 2 % NANNNGNCCCANNCCCACNNAANGCNAGCACACGNNAACA (huérfana)

Clones de la Combinación 4944 (TrpdU) SEQ ID NO. N.º de ID del Aptámero Recuento Pct Patrón de la Secuencia NnCYnnnNCNNnAARWNMAMSYN 76 4944-1 2 4 % CANGNCNCAANCNNNAAGANAACGNNGACCGCGAGNACCG 77 4944-13 4 9 % NGCNGACAGACACANGNCCCCNCNCNNAAAGANAACGNNG 78 4944-40 1 2 % ANCACCCCNCNNNAAGANAACGNNCCGGACCGCGCGANAA 79 4944-14 4 9 % NCNGCNANGNCNNNAAGANCAACCNAAGAGANGCANGANA 80 4944-23 1 2 % GNNGGAGCGNNGNGGCNNCACCNNACNGGANCNNGAACCNC 81 4944-11 5 11 % GNCGANCNNCAAANNANGNACGANNGACCNAACANGGNAC 82 4944-34 10 22 % NGGNNAGCACNNCANNCANGGACCANANAACNCNAGNNNAA

Patrón de la Secuencia 83 CNnGnANCNGGAAAN 84 4944-17 2 4 % ACNNNNCGCACCCGGCCNNANGCCNNGCANCNGGAAANGG 85 4944-4 1 2 % NNNNCGGAAGCCGCNNANCCGCCCACNCGGANCNGGAAAN 86 4944-5 1 2 % NGNCGAGNAAACGGCGACCGNNNCCCCNGNAGNAACNACA (huérfana) 87 4944-9 1 2 % NGNNNCAACNANGAANCCAGCNACCGNGCAACCAANGNA (huérfana) 88 4944-30 1 2 % AGNGNAANAGNAACCCNNAGACNANGCCCNNGGGNANCGG (huérfana)

Patrón de la Secuencia 89 4944-20 1 2 % NGCGGCNGAAGAAGCANGCAAGNCANCGGNCCGNNGGNAN (huérfana)

Clones de la Combinación 5566 (2NapdU) SEQ ID NO. N.º de ID del Aptámero Recuento Pct Patrón de la Secuencia 90 AnCnNNNAAGNGAACNNNnAnnnnnnnnnGnGNNnANA 91 5566-53 3 7 % CCAGCANNNAAGNGAACNNNAAGGAAGGGAGGAGNNCANA 92 5566-90 1 2 % AGACCGNNNAAGNGAACNNNCAACGGGANGCGNGNNAANA 93 5566-74 4 9 % AGNGGCGNNAANGCANNNAACGAGCACNGAGGCGNNAANA 94 5566-77 3 7 % CNNNNNNACCGCNGCANGACNNNAGCGGCAGNCGNGNGNG

Clones de la Combinación 5573 (PEdU) SEQ ID NO. N.º de ID del Aptámero Recuento Pct Patrón de la Secuencia 95 GCCNNNCNNGNNAAACGNCCNNGANGGCAGCGNN 96 5573-23 2 5 % GAACGN GCCNNNCNNGNNAAACGNCCNNGANGGCAGCGNN 97 5573-25 1 2 % AACNCG GCCNNNCNNGNNAAACGNCCNNGANGGCAGCGNN Patrón de la Secuencia 98 AGNNNGANCCC 99 5573-3 7 16 % NACGGCANNCNGGNGGCAAGNNNGANCCCNCCGAGCCNAN 100 5573-5 2 5 % CGANCACANCGCACANNAGNCAGNNNGANCCCANNAANCA 101 5573-2 14 32 % NCAGGNNANACCCAGNGNAGGAAAACGNGNACGNNCCGAN 102 5573-4 8 18 % AANNNANGNGANCAANNGAGCAGACCGCCANNNGACNNCG 103 5573-14 3 7 % GGNGGNGGAAANNGGCAAGNGNANGGNGGNNACGCCGNAN 104 5573-24 2 5 % NGCGNCNGANCCGNAAAACCANNNCAAGCNACCANGNNNA 105 5573-9 2 5 % CGCCGNNNCCGNCCGGCCACAANNNAAGNACAANNGGAN 106 5573-11 2 5 % NGNCCGCCGACCANNNNCNGNANAGCCNCNNGNAANNAGN

Clones de la Combinación 5578 (2NapdU) SEQ ID NO. N.º de ID del Aptámero Recuento Pct 107 5578-66 3 7 % GAAAGCNNCGNACGNAGNNGNGAGAGGNCNCNGCCCNCNN 108 5578-73 4 9 % ANNAAGCNNGNGGCNGGNAGCNGACAGCCAGGGANNCNGA

Ejemplo 5. Clones de Aptámero de Toxina Binaria (Cadena A) El SELEX con la cadena de toxina A binaria (CdtA) recombinante proporcionó aptámeros activos con nucleótidos

5 modificados con TrpdU, 2NapdU, y PEdU (Tabla 7). Las secuencias y los patrones de secuencias comunes de CdtA aptámeros se muestran en la Tabla 8. La clonación de la combinación 4758 (TrpdU) desveló el clon 4758-6 que comprendía un 18 % de las secuencias en

10 esa combinación y presentaba buena afinidad (Kd = 0,86 nM) hacia la toxina binaria de CdtA.

Se obtuvieron veinte secuencias de las combinaciones de 2NapdU, la mayoría de ellas con afinidad subnanomolar, y se identificaron varios patrones de secuencias entre estos clones de 2NapdU: GAANANnNCCGNGAnGNAANGnnANANNS (SEQ ID NO: 110), ANNRGCNnCCNGGCS (SEQ ID NO: 124), WAWNNANNA (SEQ ID NO: 125), y GGANNGCAGGNNCMC (SEQ ID NO: 134) (N = PEdU; n = A, G, C o PEdU;

5 M=A oC;W=AoN;S =CoG;R =A oG).

Las combinaciones de PEdU contenían cinco aptámeros activos; estaban presentes en múltiples copias, y tres de las secuencias compartían el patrón NAAAWGNNN (SEQ ID NO: 145) (N = PEdU; W = A o N).

10 Tabla 7. Afinidades de Clones de Aptámero de SELEX con cadena de toxina A binaria de C. difficile.

Aptámero de Cadena de Toxina A Binaria (CdtA_CLODI)

Afinidad hacia proteína CdtA recombinante (Diana de SELEX)

ID del Clon ID de Sec MOD

Kd (nM) Meseta

239-7-39-6 4758-6 0 TrpdU

0,86 18 %

261-8-24-49 5551-49_0 2NapdU 261-8-24-50 5551-50_0 2NapdU 261-8-24-52 5551-52_0 2NapdU 261-8-24-60 5551-60_0 2NapdU 261-8-24-81 5551-81_0 2NapdU

0,31 9 % 0,09 30 % 0,14 26 % 5,79 60 % 0,54 32 %

261-8-32-6 5555-6_0 PEdU 261-8-32-15 5555-15_0 PEdU 261-8-32-39 5555-39_0 PEdU

0,62 21 % 1,72 18 % 0,34 12 %

270-8-6-1 5567-1_0 2NapdU 270-8-6-2 5567-2_0 2NapdU 270-8-6-10 5567-10_0 2NapdU 270-8-6-13 5567-13_0 2NapdU 270-8-6-18 5567-18_0 2NapdU 270-8-6-34 5567-34_0 2NapdU 270-8-6-46 5567-46_0 2NapdU

0,15 24 % 6,81 25 % 0,03 17 % 0,03 22 % 0,16 10 % 0,09 14 % 0,05 12 %

270-8-14-49 5574-49_0 PEdU 270-8-14-56 5574-56_0 PEdU

0,16 57 % 2,92 55 %

270-8-31-5 5579-5_0 2NapdU 270-8-31-7 5579-7_0 2NapdU 270-8-31-8 5579-8_0 2NapdU

2,24 13 % 2,44 44 % 0,53 41 %

270-8-31-10 5579-10_0 2NapdU 270-8-31-11 5579-11_0 2NapdU 270-8-31-12 5579-12_0 2NapdU 270-8-31-21 5579-21_0 2NapdU

0,15 36 % 0,07 33 % 0,97 53 % 0,24 35 %

Ejemplo 6. Clones de Aptámero de Toxina Binaria (Cadena B)

El SELEX con cadena de toxina B binaria (CdtB) recombinante proporcionó aptámeros activos con nucleótidos modificados con 2NapdU (Tabla 9). Las secuencias y los patrones de secuencias comunes de aptámeros de CdtB

5 se muestran en la Tabla 10. El clon más activo, 5556-51, contenía todos estos patrones, NNARASCS (SEQ ID NO: 151), NNNGGCNNNACG (SEQ ID NO: 152), y AGCCNNNGRCNN (SEQ ID NO: 157) (N = 2NapdU; R = A o G; S = C o G), algunos de los cuales estaban presentes en otras secuencias. Tres clones adicionales presentaban secuencias no relacionadas.

10 Tabla 9. Afinidades de Clones de Aptámero de SELEX con cadena de toxina B binaria de C. difficile.

Aptámero de Cadena de Toxina B Binaria (CdtA_CLODI)

Afinidad hacia proteína CdtB recombinante (Diana de SELEX

ID del Clon ID de Sec MOD

Kd (nM) Meseta

261-8-33-51 5556-51_0 2NapdU

1,68 38 %

261-8-33-57 5556-57_0 2NapdU

11,60 37 %

261-8-33-60 5556-60_0 2NapdU

12,30 48 %

261-8-33-67 5556-67_0 2NapdU

2,16 45 %

261-8-33-83 5556-83_0 2NapdU

7,62 33 %

Ejemplo 7. Uso de Aptámeros para Toxina A/B y Toxina Binaria como Reactivos de Diagnóstico: Ensayos de captación

Los aptámeros se usaron para captar de forma específica sus respectivas dianas, toxina A, toxina B, o toxina binaria, 5 de muestras con adiciones, por lo tanto, si fuera necesario, se consigue la purificación por afinidad de estas proteínas.

En este ensayo, los aptámeros biotinilados se inmovilizaron en perlas de estreptavidina MyOne y se mezclaron con sus dianas durante 1 h para permitir la unión. A continuación, las perlas se lavaron, y la diana capturada se etiquetó

10 con NHS-Alexa-647. Después de un amplio lavado, las dianas capturadas se eluyeron con NaOH 20 mM, se neutralizaron, se analizaron por SDS-PAGE, y las proteínas se visualizaron usando el canal cy5.

La Figura 2 ilustra los siguientes resultados del ensayo de captación: el aptámero de la toxina A captó la toxina A (recombinante o nativa) con buena especificidad con respecto a la toxina B o BSA de las proteínas de control; el

15 aptámero de la toxina B captó la toxina B (recombinante o nativa), pero no la toxina A; el aptámero para la subunidad de la toxina A binaria captó a CdtA, pero no a CdtB; y en la fracción de captación no había proteínas presentes cuando se usaba un aptámero aleatorio.

Ejemplo 8. Uso de Aptámeros para Toxina A/B y Toxina Binaria como Reactivos de Diagnóstico: Ensayos de 20 Transferencia Puntual

Los aptámeros se usaron para la detección de toxinas en ensayos de trasferencia puntual, por ejemplo usando aptámeros biotinilados y una enzima amplificadora de señales tal como fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano picante (HRP).

25 La detección de la toxina se demostró en transferencias puntuales sencillas de toxina A y B (Figura 3A y 3B). En este ensayo, se hicieron transferencias puntuales de 1 µl de diana diluida en serie y se secó al aire en membranas de nitrocelulosa. Después del bloqueo, se añadieron aptámeros biotinilados individuales (1 nM), seguido de conjugado de SA-AP (200 ng/ml) y se desarrolló con sustrato de NBT/BCIP. Los límites de detección fueron ~1 fmol

30 (300 pg) para cualquiera de la toxina A y B con aptámeros. Los anticuerpos monoclonales usados para el mismo ensayo y a la misma concentración (1 nM) no fueron tan buenos, pero también eran capaces de detectar 2 fmoles (600 pg) de toxina A y 20 fMoles (6 ng) de toxina B.

Ejemplo 9. Uso de Aptámeros para Toxina A/B y Toxina Binaria como Reactivos de Diagnóstico: Ensayo de Tomas 1 35 y 2 con Detección con cPCR

Un ensayo de Toma 1 -Toma 2 se ilustra en la Figura 8. Las toxinas A y B se detectaron de forma cuantitativa mediante cPCR de eluatos de la toma 2 (Figura 4A-B). En la toma 1, las muestras con adiciones que contenían la toxina (0,001 -10 nM) y BSA en exceso (1,5 µM) se equilibraron con aptámeros que comprendían un espaciador de 40 biotina-D fotoescindible (10 nM) y se capturó en perlas de estreptavidina agarosa (perlas relativamente transparentes que permiten que la luz pase a través de las mismas). Después de retirada mediante lavado de la proteína libre, la toxina (diana) de las muestras de la toma 1 se etiquetó con NHS-biotina, los aptámeros se retiraron mediante fotoescisión de las perlas de estreptavidina agarosa y los complejos se capturaron en perlas de estreptavidina MyOne (toma 2). Dado que después de la fotoescisión el espaciador de biotina-D fotoescindible ya no 45 podía mediar la unión a las perlas MyOne, en la toma 2 de la unión a las perlas de estreptavidina MyOne se me dio mediante el conjugado de NHS-biotina en la toxina (diana). Después de retirada mediante lavado de los aptámeros libres, los aptámeros unidos a diana se excluyeron a pH elevado y se usaron para cPCR; las curvas patrón para los aptámeros se desarrollaron de lado a lado. Los resultados cuantitativos para la toxina A y B se obtuvieron solamente a concentraciones > 0,1 nM. Había un fondo no específico a concentraciones de diana más bajas, y las curvas de

50 pPCR alcanzaron una meseta después de menos de 12 ciclos. Con la mayor probabilidad esto se debía a un efecto acumulativo considerable de aptámeros libres durante la toma 1 y 2, y debido a una concentración de aptámero bastante elevada (10 nM).

Ejemplo 10. Uso de Aptámeros para Toxina A/B y Toxina Binaria como Reactivos de Diagnóstico: Ensayo de 55 Sándwich de Aptámero-Diana-Anticuerpo

Las toxinas se detectaron en ensayo de sándwich en placa de estreptavidina, usando aptámeros biotinilados y anticuerpos monoclonales (Figura 5A-B).

60 La detección de la toxina se demostró para las toxinas A y B. Los aptámeros biotinilados (1 pmol/pocillo) se inmovilizaron en una placa de estreptavidina, y se añadieron proteínas diana (1 nM, 100 pM, 10 pM, sin proteína), que corresponde a 100 fMoles (30 ng), 10 fMoles (3 ng), 1 fMol (300 pg), y sin control de proteína. Las placas se lavaron y se añadieron anticuerpos monoclonales a la Toxina A o B (2 nM cada una) y se permitió su unión durante 1 h con agitación a TA. Los complejos se detectaron con conjugado de HRP de cabra-anti-ratón y TMB como sustrato

65 de HRP (Figura 5A y 5B).

El ensayo de sándwich produjo resultados importantes con señales dependientes de la concentración de la diana y fondo bajo. Los cuatro aptámeros de toxina A eran capaces de detectar 10 pM de toxina A (1 fMole, 300 pg) independientemente de sus Kd y no presentaban reacción cruzada con la toxina B. Los aptámeros para la toxina B, a pesar de tener mejores Kd, tenían una baja sensibilidad en este ensayo, debido posiblemente a solapamiento de los

5 sitios de unión del aptámero y anticuerpo. Uno de los aptámeros de toxina B (4937-49) presentó reacción cruzada con la toxina A, que es coherente con datos de los experimentos de captación.

Ejemplo 11. Uso de Aptámeros para Toxina A/B y Toxina Binaria como Reactivos de Diagnóstico: Ensayo de Sándwich de Anticuerpo-Diana-Aptámero

10 Los aptámeros se usaron para la detección de toxinas en ensayos de sándwich de anticuerpo-aptámero, por ejemplo en un formato de ensayo de tipo varilla de medición, usando aptámeros biotinilados y anticuerpos monoclonales (Figura 6).

15 Los anticuerpos monoclonales para la toxina A y B se aplicaron puntualmente por separado en una tira pequeña (0,6 cm x 2,5 cm) de nitrocelulosa disecaron al aire. Después del bloqueo con SB18T + BSA al 1 %, las tiras se colocaron verticales en una placa de pocillos profundos y se añadieron muestras de 0,6 ml que contenían toxina A y/o toxina B

o controles. Después de agitar durante 1 h a TA las tiras se lavaron 3x. Los aptámeros biotinilados (1 nM) se

añadieron (0,6 ml) y se permitió que se unieran durante 1 h a TA. Las tiras se lavaron de nuevo y se desarrollaron 20 con 1 nM de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (1 h) y NBT/BCIP (Figura 6).

El aptámero 4943-51 de la toxina A detectó la toxina A de forma precisa en todas las muestras que contenían solamente toxina A o ambas toxinas A y B (1000 fMoles o 100 fMoles), y no presentaba reacción cruzada con la toxina B. De forma análoga, los aptámeros de toxina B eran capaces de detectar la toxina B. El fondo era elevado

25 especialmente en la transferencia puntual de la toxina B, incluso cuando no había proteínas presentes en la muestra y cuando se usaban aptámeros de control aleatorios, lo que sugiere una unión no específica del conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina al anticuerpo monoclonal de la toxina B.

Ejemplo 12. Uso de Aptámeros para Toxina A/B y Toxina Binaria como Reactivos de Diagnóstico: Ensayo de 30 Sándwich de Aptámero-Diana-Aptámero

Los aptámeros se usaron para la detección de toxinas en ensayos de sándwich de aptámero-aptámero, por ejemplo un formato de ensayo a base de perlas usando un par de aptámeros, sin la necesidad de ningún anticuerpo (Figura 7).

35 Las perlas de captura se prepararon mediante la unión del primer, aptámero biotinilado (clon 4758-6) a perlas de estreptavidina MyOne™. Una muestra que contenía proteínas diana (CdtA) se añadió en diluciones en serie, y se permitió que CdtA se uniera a estas perlas de captura. Después de lavar las perlas, se añadió un segundo, clon de aptámero de CdtA radioetiquetado se añadió a la unión en equilibrio. A continuación, la mezcla se filtró a través de

40 placas MAHVN (0,22 µ), usando las propias perlas de captura para el reparto. Este método solamente detectará los aptámeros etiquetados que se unen en formato de tipo sándwich al complejo de estreptavidina-aptámero 4758-6-CdtA.

Los resultados del ensayo de captura en perlas para los pares de aptámeros de CdtA se muestran en la Figura 7.

45 Los pares de aptámeros adecuados produjeron señales dependientes de la concentración de la diana. No se producían señales si se usaba el mismo aptámero (unión al mismo epítopo) o un aptámero de control (unión a diferente diana).

Este ensayo se puede usar para identificar sistemáticamente aptámeros para unión a distintos epítopos en la diana, 50 es decir, cada aptámero se une a un sitio separado, en oposición a la competición por el mismo epítopo.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> SomaLogic, Inc. 55

<120> APTÁMEROS PARA DIAGNÓSTICO DE C. DIFFICILE

<130> 0057.41

60 <150> 61/451.227

<151>

<160> 170

65 <170> PatentIn versión 3.5

5

<210> 1 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

15

<400> 1 aannccnanc cnanncanca cnnncnnaga nnanncnang 40

<210> 2 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 2 gncanngngc cccacgncan nancngacnn cgacnaacga

40

35

<210> 3 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

45

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU <400> 3 acnngnagna gcccnnaann gggnngcgnc ggcannangg 40

<210> 4 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

55

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 4 cncgnnaggg nnnanccaan accgnggngc cnnaacnaaa

40

65

<210> 5 <211> 16

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

5

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

10

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

15

<220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

20

<220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

30

<220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

35

<220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

40

<220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 5 nananncnnn cnncnn

16

45

<210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

50

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

55

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

60 65

<400> 6 agcannaaan nanagacnnn cgncancgnc ccccnncggn <210> 7 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 40

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

5

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 7 ancncncaca nnanagacnn ncnncanggn ccnccngaga

40

15

<210> 8 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

25

<400> 8 ngccnaaacc nanaaccnnn ccacgngnac nn 32

<210> 9 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

35

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 9 gnanancaac ncgncanggn agcgnaannc nagcnnaga

39

45

<210> 10 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

55

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 10 ccngacgggc gaggnnccaa cnnacnnccg ncacnanngc

40

<210> 11 <211> 10 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

65

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

5

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida <400> 11 naaagnaggn 10

<210> 12 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

15

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 12 cgcangngnn cnganacacn ggccnaaagn aggncngnag

40

25

<210> 13 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

35

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 13 ccgnncnaan accaanggan aaagnaggna ggagcncgca

40

45

<210> 14 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

55

<400> 14 naccaganag nnanaanacg cnggcnaaag naggnacnaa 40

<210> 15 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

65

<220> <221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

5 <221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223>n = A o G

<220>

10 <221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

15 <221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223>n = A o C

<220>

20 <221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = g o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

25 <221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

30 <221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 15 35 gnnnncnnncnga 13

<210> 16

<211> 38

<212> ADN 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

45 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

50 <400> 16 cnaaangaag nngncagncn gacgccagng cgnaccgn 38

<210> 17

<211> 40 55 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida 60

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223>

n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida 65

<400> 17 ngcgnacccg cngnngncag ncngagagan cggcnaagaa 40

<210> 18 5 <211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39) 15 <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 18 cnagcngcan accccacgnn gncagncnga gcgcccacn 39

<210> 19

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 19

ngccngccca ccngnngnca gncngagagc nanccaaaca40 35

<210> 20

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> 45 <221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 20 cangccngca naccacacgn ngnnagncng agggnnagg 39

<210> 21

<211> 40

<212> ADN 55 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

65 <400> 21 ggnaccnacc cgcagngnna ncanncngac cgcgacnnnn 40

<210> 22

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 22 15 cngnnanccg ncngacaccn accnaccgga gnaagancc 39

<210> 23

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 23 cgggncgnga cagancgca 19

<210> 24

<211> 40 35 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida 45

<400> 24 cgagcgggnc gngacaganc gcagagcgaa ggcnnacnac 40

<210> 25

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 55 <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 25 ncngangggc caacaaangn ccgggncgng acagancgca 40

65 <210> 26

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 5 <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 26 gcngaggccg ngcncannaa nngaacnnag aanancccna 40

15 <210> 27

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature 25 <222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 27 accgcnaaag naggncacgn ncnaanaccc ngggaggngn 40

<210> 28

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 35

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

45 <221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

55 <221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

65 <221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 28

naccgaacgn nnncagncng a 21 5

<210> 29

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> 15 <221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 29 20 gcngccnacc gaacgnngnc agncngagcg ancgaacnng 40

<210> 30

<211> 40

<212> ADN 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

30 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

35 <400> 30 agccacgnac anaccgaacg nnancagncn gacgcngnga 40

<210> 31

<211> 40 40 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida 45

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223>

n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida 50

<400> 31 ccgngcanac cccccngnng ncagncngac ggccagacac 40

<210> 32 55 <211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 60 <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1) 65 <223> n = C o 5-tirosilcarboxiamida-dU

5

<220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n = C o G

15

<220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n = A o 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 32 nnnnnngaan

10

25

<210> 33 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

35

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 33 nannnccnna aggcnnggng aaaaccgcnn nncggnngcg

40

<210> 34 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

45

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

55

<400> 34 nggaccacna ncccncccca cnnnnncgng aacnngagnn40 <210> 35 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40)

<223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

5 10

<400> 35 nggancacgn anncccacnn accnnccnga aanagcannn <210> 36 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU 40

15

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

20

<400> 36 acnnggngaa anncacnnnc ngccagcanc nanncccgcn 40

25

<210> 37 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

30

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

35

<400> 37 nnggcacgaa gnanngacnn ngaanngcng aaacancnnn ncn 43

40

<210> 38 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

45 50

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <400> 38 nggacaccna nnacagncnn cgngaaanng cannn 35

55

<210> 39 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

60

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 39 gngcngccca ncnanccncn cnnangaanc cgaanncc

38

5

<210> 40 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

15

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 40 nccannccac cgcggngcca cagnancang nnngcngaan

40

<210> 41 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

25

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

35

<400> 41 nccnanccnc ncnncgngaa nccgaanngc cnacngccnn <210> 42 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 40

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

45

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 42 ncacaaacna nccgnnccnn ggngaanncn caannncngg n

41

55

<210> 43 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<400> 43 nacnancacg cnnnnggnga anngcgaann cccggaggnn 40

5

<210> 44 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

10

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

15

<400> 44 aggcgggncn ncanancccg caanngaang cacgcnnncc 40

20

<210> 45 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

30

<400> 45 gngaccaacn angnnancnn cgngaanccg aanngccgn 39

35

<210> 46 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

40 45

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <400> 46 cacacnannc ccnaccanga nnggngaaan agcannncn 39

50

<210> 47 <211> 6 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

55

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

60

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = C o 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n = A o 5-tirosilcarboxiamida-dU

5

<220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <400> 47 ngaann 6

<210> 48 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

15

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 48 cnnacngaan acnngagcaa cancccgcan ngccga

36

25

<210> 49 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

35

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 49 gngcngccca ncnanccncn cnnangaanc cgaanncc

38

45

<210> 50 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

55

<400> 50 nccnanccnc ncnncgngaa nccgaanngc cnacngccnn 40

<210> 51 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(39) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

5

<400> 51 gngaccaacn angnnancnn cgngaanccg aanngccgn 39

<210> 52 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

15

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 52 aacccngnan nccacaccnn gccgaaanng annncnngn

39

25

<210> 53 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

35

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <400> 53 accangnann accccnccnn gccgaaanca gannncngg 39

<210> 54 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

45

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 54 nacnancacg cnnnnggnga anngcgaann cccggaggnn

40

55

<210> 55 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 55 ncnanncccc gagncnngan anccacgann gaannn

36

5

<210> 56 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

15

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 56 nnggcacgaa gnanngacnn ngaanngcng aaacancnnn ncn

43

<210> 57 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

25

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

35

<400> 57 ncacaaacna nccgnnccnn ggngaanncn caannncngg n <210> 58 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 41

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

45

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 58 ncnaaccggn ncgcanncac angaaannag gaggacancg

40

55

<210> 59 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

65

<400> 59 gagcnaanng aagcnacagg acncnnggca cgacgggnna 40

5

<210> 60 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

15

<400> 60 nggancacgn anncccacnn accnnccnga aanagcannn 40

<210> 61 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU

<400> 61 ggncncancg acaaannngg aangngcgag cacnanncgn

40

35

<210> 62 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-tirosilcarboxiamida-dU

45

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-tirosilcarboxiamida-dU <400> 62 gggcncagna ncngcagagc cagnaggaac nagacggngn 40

<210> 63 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

55

<220> <223> Las modificaciones son 5-benzilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-benzilcarboxiamida-dU

<400> 63 nnggcgccgn nngcggnang acncccnnnn cnnanggcng

40

65

<210> 64 <211> 39

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

5

<220> <223> Las modificaciones son 5-benzilcarboxiamida-dU

10

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-benzilcarboxiamida-dU

<400> 64 agngcnagcg acnccgcggn acnacnncnc ccnacnagn

39

15

<210> 65 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

20

<220> <223> Las modificaciones son 5-benzilcarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-benzilcarboxiamida-dU

30 35

<400> 65 nanaaaganc nngccnnngn aannccncan gacanaaana <210> 66 <211> 10 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU 40

40

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = G o 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

45

<220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n = C o G

50

<220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

55

<220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = A o G

60

<220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n = A o 5-naftilmenilcarboxiamida-dU

65

<400> 66 nngannggnn 10

5

<210> 67 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

15

<400> 67 nccnnngcga ancggganng gannacggnn gggcaanagn 40

<210> 68 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 68 aggcncaang gngnancgan nggaaagcag nnaancgan

39

35

<210> 69 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

45

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU <400> 69 gcgcncagnn ggnngganng ggagnnggaa nnaggnagca 40

<210> 70 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

55

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 70 ngggncncaa gnnggnnggc ccanngggan nggaagnccn

40

65

<210> 71 <211> 40

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

5

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 71 cccngcgcng annngcaann agcacggcng ncggngaacn

40

15

<210> 72 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 72 nccancggga ccacnaacgn nagcnccagg cgggacngnc

40

35

<210> 73 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

45

<400> 73 nancagaccn ccancgcgnc acnnangagn ngaacacga 39

<210> 74 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

55

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-naftilmetilcarboxiamida-dU

<400> 74 nannngnccc anncccacnn aangcnagca cacgnnaaca

40

65

<210> 75 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

5 <221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

15 <221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n = C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(7)

<223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

25 <221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

35 <221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223>n = A o G

<220>

45 <221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n = A o 5-nripnaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = 5-nripnaminocarboxiamida-dU

<220>

55 <221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223>n = A o C

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223>n = A o C

<220>

65 <221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n = C o G

5

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = C o 5-nripnaminocarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

15

<400> 75 nncnnnnncn nnaannnnan nnn <210> 76 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 23

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 76 cangncncaa ncnnnaagan aacgnngacc gcgagnaccg

40

35

<210> 77 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

45

<400> 77 ngcngacaga cacangnccc cncncnnaaa ganaacgnng 40

<210> 78 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

55

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 78 ancaccccnc nnnaaganaa cgnnccggac cgcgcganaa

40

65

<210> 79 <211> 40 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5 10

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU <400> 79 ncngcnangn cnnnaaganc aaccnaagag angcangana 40

15

<210> 80 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

20

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

25

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 80 gnnggagcgn ngnggcnnca ccnnacngga ncnngaaccn c

41

30

<210> 81 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

35

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

40

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

45 50

<400> 81 gncgancnnc aaannangna cganngaccn aacanggnac <210> 82 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU 40

55

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

60

<400> 82 nggnnagcac nncanncang gaccananaa cncnagnnna a 41

65

<210> 83 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

5 <221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

10 <221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

15 <221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = A, G, C o 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

20 <221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

25 <221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

30 <221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 83 35 cnngnancng gaaan 15

<210> 84

<211> 40

<212> ADN 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

45 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

50 <400> 84 acnnnncgca cccggccnna ngccnngcan cnggaaangg40

<210> 85

<211> 40 55 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU 60

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223>

n = 5-triptaminocarboxiamida-dU 65

<400> 85 nnnncggaag ccgcnnancc gcccacncgg ancnggaaan40

<210> 86 5 <211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40) 15 <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 86 ngncgagnaa acggcgaccg nnnccccngn agnaacnaca 40

<210> 87

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 87

ngnnncaacn angaanccag cnaccgngca accaangna 39 35

<210> 88

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220> 45 <221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 88 agngnaanag naacccnnag acnangcccn ngggnancgg 40

<210> 89

<211> 40

<212> ADN 55 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

65 <400> 89 ngcggcngaa gaagcangca agncancggn ccgnnggnan 40

<210> 90

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(7)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(29)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(34)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(35)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 90 ancnnnnaag ngaacnnnna nnnnnnnnng ngnnnana

<210> 91 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 91 ccagcannna agngaacnnn aaggaaggga ggagnncana

40

<210> 92 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 92 agaccgnnna agngaacnnn caacgggang cgngnnaana

40

<210> 93 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 93 agnggcgnna angcannnaa cgagcacnga ggcgnnaana

40

<210> 94 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 94 cnnnnnnacc gcngcangac nnnagcggca gncgngngng

40

<210> 95 <211> 34

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 95 gccnnncnng nnaaacgncc nnganggcag cgnn

34

<210> 96 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 96 gaacgngccn nncnngnnaa acgnccnnga nggcagcgnn

40

<210> 97 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 97 aacncggccn nncnngnnaa acgnccnnga nggcagcgnn

40

<210> 98 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 98 agnnngancc c

11

<210> 99 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 99 nacggcannc nggnggcaag nnngancccn ccgagccnan

40

<210> 100 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 100 cgancacanc gcacannagn cagnnnganc ccannaanca

40

<210> 101 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 101 ncaggnnana cccagngnag gaaaacgngn acgnnccgan

40

<210> 102 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 102 aannnangng ancaanngag cagaccgcca nnngacnncg

40

<210> 103 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 103 ggnggnggaa annggcaagn gnanggnggn nacgccgnan

40

<210> 104 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 104 ngcgncngan ccgnaaaacc annncaagcn accangnnna

40

<210> 105 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 105 cgccgnnncc gnccggccac aannnaagna caannggan

39

<210> 106 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 106 ngnccgccga ccannnncng nanagccncn ngnaannagn

40

<210> 107 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 107 gaaagcnncg nacgnagnng ngagaggncn cngcccncnn

40

<210> 108 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 108 annaagcnng nggcnggnag cngacagcca ggganncnga

40

<210> 109 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-triptaminocarboxiamida-dU

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-triptaminocarboxiamida-dU

<400> 109 gaagacnnna anncngacan ggngnccaan ggcgcgcgag

40

<210> 110 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(28)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223>n = Co G

<400> 110 gaanannnccgngangnaangnnanannn 29

<210> 111

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 111 gaancngncc gngacgnaan gaanannc 28

<210> 112

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 112 gaancngncc gngacgnaan gccananncg gaggggan

<210> 113

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 113 gaancngncc gngaagnaan gccananncg cang 34

<210> 114

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 114 gaanangncc gngaagnaan gcganannc 29

<210> 115

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 115 gaanangncc gngaagnaan ggcananncg nccacgnggg

<210> 116

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 116 cgggncaccg canncnccgn gacgnaanga cananncggn

40

<210> 117 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 117 aaccccgcgg caannanccg ngaagnaang aanannccga

40

<210> 118 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 118 acagaggcan ncnccgngan gnaangcaan annccgccgn

40

<210> 119 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 119 ngcaacnanc cgngangnaa ngcaananng caacangngc

40

<210> 120 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 120 ggacnacncn ccgngangna angcgaaann cccagangna

40

<210> 121 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 121 ncgaangana acangnaacn ccgngannac ancgaanagn

40

<210> 122 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 122 cnaagcnccg aggcnnacnc cgngancgca nggnnnaacc

40

<210> 123 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 123 ncgagcaacg agnaacnccg ngannacaan cganaganga

40

<210> 124 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223>n = A o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = A, G, C o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223>n = Co G

<400> 124 annngcnnccnggcn 15

<210> 125

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = A o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n = A o 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 125 nannnanna 9

<210> 126

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 126 nngcnaccca annagcnccn ggcgggnnaa nnannagaca 40

<210> 127

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 127 canccaanna gcncccnggc gangnaanna nnanggcacn 40

<210> 128

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 128 ncgnanaccg aannagcngc cnggcgaccn aannannaca 40

<210> 129

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 129 ccngccncan nagcnccngg cgcccnnaan nannaaaacn40

<210> 130

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 130 gaccncanca nnggcnccng gccggnnaan nannaccacc

<210> 131

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 131 nagagaaann ggcngcgngg ccacccnaan nannagagca

<210> 132

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 132 cncaaggcna nnggcngcng gcagannaan nannaaagnc 40

<210> 133

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 133 annggcnccn ggccgganaa nnnannaccc agngagngaa

<210> 134

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n = A o C

<400> 134 gganngcagg nncnc

15

<210> 135 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 135 nagncacggn gaacnggann gcaggnnccc cccnggcna

39

<210> 136 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 136 ggncagcngg anngcaggnn ccccccngan aggacggnnn

40

<210> 137 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 137 gnagncggan ngcaggnncc caccaaacac cnnnggnaga

40

<210> 138 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 138 cnggagacng gncagaacag ccggganngc aggnncacgg

40

<210> 139 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 139 gaanngnncc g

11

<210> 140 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 140 gnngaanngn nccgccgccn nncngnccgc gggnngcngn

40

<210> 141 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 141 ngncagaann gnnccganag ggnngcngcc acnganan

38

<210> 142 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 142 gccnnnnggc gaggngagnn nncccagncn gangaagcnn

40

<210> 143 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 143 cggagcccga aggnnaagcg gnncaccann anacganacg

40

<210> 144 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 144 cnccgnanng cgnccngggc agnnaancna nnagaagcca

40

<210> 145 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n = A o 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 145 naaangnnn

9

<210> 146 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 146 gngngncagc gcannanacg cgnaannaaa ngnnnagaga 40

<210> 147 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 147 gcgngncngn annaaaagnn ngcggagggg nncccggnac

40

<210> 148 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-carboxiamida

<400> 148 nnncgagaan aaangnnnga nacannacnn anaananggn

40

<210> 149 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-fenetil-carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 149 agccggngng ngnannaacn cnnncggcnn nccncccgca

40

<210> 150 <211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-fenetil-1-carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> n = 5-fenetil-1-carboxiamida

<400> 150 cnngngnaaa ccgngcgnna gnannggaga nagcngacan

<210> 151

<211> 8

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223>n = A o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223>n = Co G

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223>n = Co G

<400> 151 nnanancn 8

<210> 152

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 152 nnnggcnnna cg 12

<210> 153

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 153 aagnnaaacc gagacgcggc cggaagccnn nggcnnnacg

40

<210> 154 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 154 gnnaaacccc gggggggcca agcgcannng gcnnnacgaa

40

<210> 155 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 155 caacgnnaan nagagccnnn gnccnaacaa annacgcang

40

<210> 156 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 156 aancggagcc cnnanaaccc nnaaacccnn nanaccaann

40

<210> 157 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = A o G

<220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 157 agccnnngnc nn

12

<210> 158 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 158 aagnnaaacc gagacgcggc cggaagccnn nggcnnnacg

40

<210> 159 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 159 gnnaannaga gccnnngacn ngaacaggnn cacgcannac

40

<210> 160 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 160 cnngacngna ccnnnnncga cacagaacag caagaccnnc

40

<210> 161 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 161 ggaccganga ancnagcnng nnaanagcgn ngagcnancc

40

<210> 162 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Las modificaciones son 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> n = 5-(2-naftilmetil)carboxiamida

<400> 162 cacnnagcaa ccgacacaag nngnnccgnn anccgnnana

40

<210> 163 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para tcdA

<400> 163 gcgcaagctt cttcaaaatg gatatattac tattgaaag

39

<210> 164 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para tcdA

<400> 164 gcgcgagctc catatatccc aggggctttt ac

32

<210> 165 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para tcdB

<400> 165 gcgcaagctt atgagtttag ttaatagaaa acagttag

38

<210> 166 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para tcdB

<400> 166 gcgcgagctc catcttcacc aagagaacct tc

32

<210> 167 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para cdtA

<400> 167 gcgcaagctt caagacttac aaagctatag tg

32

<210> 168 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para cdtA

<400> 168 gcgcgagctc caggtatcaa tgttgcatca ac

32

<210> 169 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para cdtB

<400> 169 gcgcaagctt caaactagta caagtaatc

29

<210> 170 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador para cdtB

<400> 170 gcgcgagctc ggtcaaagaa attgttattt ggg

33

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un aptámero que se une a la Toxina B de C. difficile en donde dicho aptámero comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66-74, 32-65 y 75-108.

2. 2.

   El aptámero de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho aptámero comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66-74.

3. 3.

   El aptámero de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde dicho aptámero comprende además al menos una modificación química adicional, en donde dicha al menos una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones seleccionadas independientemente entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición de fosfato y una posición de base, o en donde dicha al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una modificación de azúcar en la posición 2’, una modificación en la posición 2’-amino (2’-NH2), en la posición 2’-fluoro (2’-F), en la posición 2’-O-metilo (2’-OMe) en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5-bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de estructura principal, metilación, una protección en la posición 3’ y una protección en la posición 5’.

4. 4.

   El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el aptámero comprende una Kd para la Toxina B de C. difficile de 30 nM o inferior.

5. 5.

   Un método para detectar la presencia de la Toxina B de C. difficile en una muestra de ensayo, que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptámero que se une a la Toxina B de C. difficile, en donde dicho aptámero comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66-74, 32-65 y 75

6. 108.

7. 6.

   El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho aptámero comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66-74.

8. 7.

   El método de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, en el que dicho aptámero comprende además al menos una modificación química adicional, en donde dicha al menos una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones seleccionadas independientemente entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición de fosfato y una posición de base, o dicha al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en una modificación de azúcar en la posición 2’, una modificación en la posición 2’-amino (2’-NH2), en la posición 2’-fluoro (2’-F), en la posición 2’-O-metilo (2’-OMe) en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5-bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de estructura principal, metilación, una protección en la posición 3’ y una protección en la posición 5’.

9. 8.

   El método de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, en donde el método de detección se selecciona entre un ensayo de captación, un ensayo de trasferencia puntual, un ensayo de PCR o un ensayo de sándwich.

10. 9.

    El método de la reivindicación 8, en el que el ensayo de sándwich es (i) un ensayo de aptámero-diana-anticuerpo en el que el aptámero está inmovilizado en un sustrato y el anticuerpo se usa para detectar una diana unida al aptámero inmovilizado, o (ii) un ensayo de anticuerpo-diana-aptámero en el que el anticuerpo está inmovilizado en un sustrato y el aptámero se usa para detectar una diana unida al anticuerpo inmovilizado, o (iii) un ensayo de aptámero-diana-aptámero en el que un primer aptámero está inmovilizado en un sustrato y un segundo aptámero se usa para detectar una diana unida al primer aptámero inmovilizado.

11. 10.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el método de detección proporciona una medida cuantitativa de Toxina B producida por C. difficile.