ES2630024T3 - Variantes de la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B y de antígenos de superficie y sus procedimientos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de determinación del potencial para que un VHB presente sensibilidad reducida a un análogo nucleósido, comprendiendo dicho procedimiento el aislamiento de ADN o del correspondiente ARNm de dicho VHB y la búsqueda de una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la ADN polimerasa del VHB, lo que da como resultado que se seleccione al menos la mutación de un aminoácido de una o más de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I, siendo la presencia de tal mutación una indicación de la probabilidad de resistencia a dicho análogo nucleósido.

Description

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DESCRIPCION

Variantes de la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B y de antfgenos de superficie y sus procedimientos Campo de la invencion

La presente invencion versa en general sobre variantes virales que presentan sensibilidad reducida a agentes y, en particular, a analogos nucleosidos. Mas en particular, la presente invencion va dirigida a variantes del virus de la hepatitis B que presentan resistencia completa o parcial a analogos nucleosidos. Las variantes tambien pueden comprender mutaciones que afectan a la interactividad inmunologica a componentes superficiales virales. La presente invencion contempla, ademas, ensayos para detectar tales variantes virales, ensayos que son utiles en la monitorizacion de regfmenes terapeuticos antivirales y en el desarrollo de vacunas nuevas o modificadas dirigidas contra agentes virales y, en particular, variantes del virus de la hepatitis B. La presente invencion tambien contempla el uso de las variantes virales para buscar agentes capaces de inhibir la infeccion, la replica y/o la liberacion del virus.

Antecedentes de la invencion

Los detalles bibliograficos de las publicaciones a las que se hace referencia numerica en esta memoria estan recogidos al final de la descripcion.

Las mutaciones especfficas en una secuencia de aminoacidos son representadas en la presente memoria como “XaainXaa2”, siendo Xaai el residuo aminoacido original antes de la mutacion, siendo n el numero de residuo y siendo Xaa2 el aminoacido mutante. La abreviatura “Xaa” puede ser el codigo de tres letras o de una sola letra (es decir, “X”). Los residuos aminoacidos para la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B son numerados, siendo el residuo metionina en el motivo Tyr Met Asp Asp (YMDD) el residuo numero 550.

El virus de la hepatitis B (VHB) puede causar estados de una enfermedad debilitante y puede llevar a una insuficiencia hepatica aguda. El VHB es un virus ADN que se replica mediante un ARN intermediario y utiliza transcripcion inversa en su estrategia de replicacion (1). El genoma del VHB es de naturaleza compleja, teniendo una estructura de ADN parcialmente bicatenaria con marcos de lectura abiertos con solapamiento que codifican genes de superficie, centrales, de polimerasa y X. La naturaleza compleja del genoma del VHB esta representada en la Figura 1.

La presencia de una ADN polimerasa del VHB ha llevado a la propuesta de que los analogos nucleosidos pudieran actuar como agentes antivirales eficaces. Ejemplos de analogos nucleosidos objeto de ensayo en la actualidad son penciclovir y su forma oral fanciclovir [FAM] (2,3,4,5) y lamivudina [LAM] (6,7). El adefovir tambien ha resultado tener actividad anti-VHB eficaz in vitro.

La hepatitis, debido a la reactivacion del virus de la hepatitis B (VHB), es una causa importante de morbidez y mortalidad en pacientes positivos al antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg+) que se someten a trasplante de medula osea (BMT) (8-10). La patogenia subyacente esta relacionada con una inmunosupresion intensa, durante una terapia citotoxica o inmunosupresora, que potencia la replicacion viral con el consiguiente aumento en la infeccion de los hepatocitos. La reconstitucion subsiguiente con celulas madre de donantes, junto con la disminucion progresiva de los agentes inmunosupresores opuestos al injerto contrario al anfitrion, restaura la funcion inmunologica. Esto da como resultado la rapida destruccion de los hepatocitos infectados (11). El resultado del BMT alogeno tambien se ve afectado por la situacion en cuanto al VHB del donante (11). De hecho, se demostro que el aclaramiento serologico del HBsAg en receptores HBsAg+ despues del BMT alogeno estaba asociado con el injerto de medula positiva con los anticuerpos de superficie de la hepatitis B (anti-HBs) y con los anticuerpos centrales de la hepatitis B (anti-HBc) (12-17).

Segun se ha afirmado anteriormente, FAM es el profarmaco oral del penciclovir [9-(4-hidroxi-3-hidroximetilbut-1-il) guanina; BRL 39123], que se demostro que inhibfa la replicacion de los hepadnavirus en estudios tanto in vitro como in vivo (18-22). Recientemente, han sido usados con exito FAM y LAM ((-)-p-2'-desoxi-3'-tiacitidina o 3TC) para prevenir/tratar la hepatitis relacionada con la reactivacion del VHB al quitar la quimioterapia/inmunosupresion (23, 24) y para prevenir la reaparicion del VHB tras un trasplante ortotopico de hfgado [OLT] (25-28).

Como la de la LAM, la resistencia al FAM en el contexto posterior al OLT ha sido identificada en sujetos tanto inmunosuprimidos como inmunocompetentes. Las mutaciones documentadas de la polimerasa por FAM asociadas con el “brote” incluyen G518E (29), V519L (30), G520C (29), P523L (30), L526M (30), L526V (31), T530S (29), V553I (32). Dado que el gen de la polimerasa del VHB se solapa con el gen de la envoltura, las mutaciones en el dominio catalftico de la polimerasa pueden afectar a la secuencia de aminoacidos de la protefna de la envoltura y viceversa. En particular, la secuencia genetica para el dominio de neutralizacion del VHB denominada determinante “a”, que se encuentra dentro del HBsAg y esta situada entre los aminoacidos 99 y 169, se solapa en realidad con las regiones catalfticas fundamentales de la protefna de la polimerasa viral, y en particular con los dominios A y B (33). De hecho, V519L, V553I, G518E estan asociadas con cambios al HBsAg de la E164D, codon de parada en 199, y de la E164K, respectivamente (30,32,33). En cambio, el uso de la HBIG para la profilaxis contra la reincidencia del

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VHB despues de un OLT fue asociado con variantes en el HBsAg, que podrfa tener cambios concomitantes en el gen de la polimerasa (34-36). En un trabajo que condujo hasta la presente invencion, los inventores identificaron la seleccion de las variantes del VHB en receptores positivos al HBsAg tratados con FAM y/o LAM tras un trasplante de medula osea alogena y despues de un OLT. Ademas de las mutaciones unicas en la VHB polimerasa y del HBsAg seleccionado durante el tratamiento, hubo varios cambios de aminoacidos en algunos aislados de VHB que fueron coherentes con un cambio del genotipo del VHB en la poblacion predominante del virus.

El documento WO 00/61758 (D1) si da a conocer mutaciones en la posicion 584; sin embargo, no las mutaciones especfficas divulgadas en la presente solicitud de patente. Ademas, tampoco ha sido dado a conocer el uso de estos mutantes adicionales para determinar el potencial de que un VHB presente sensibilidad reducida a dichos compuestos.

Segun la presente invencion, los inventores han identificado variantes del VHB, seleccionadas siguiendo un tratamiento con FAM y/o LAM, con mutaciones en la ADN polimerasa del gen del VHB que reducen la sensibilidad del VHB a este analogo nucleosido. Tambien ocurren mutaciones correspondientes en el antfgeno de superficie. La identificacion de estas variantes del VHB es importante para el desarrollo de ensayos para monitorizar la resistencia al FAM y/o a la LAM y/o la resistencia a otros regfmenes terapeuticos analogos con nucleosidos y buscar agentes que sean utiles como agentes terapeuticos alternativos.

Sumario de la invencion

En toda esta memoria, a no ser que el contexto requiera algo distinto, se entendera la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, implica la inclusion de un elemento o de un entero o de un grupo de elementos o de enteros especificados, pero no la exclusion de ningun otro elemento o entero o grupo de elementos o de enteros.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos son objeto de referencia mediante un numero identificador de secuencia (N° ID SEC:). Los Nos ID SEC se corresponden numericamente con los identificadores de secuencias <400>1, <400>2, etc. Se proporciona un listado de secuencias despues de las reivindicaciones.

Un aspecto de la presente descripcion esta dirigido a una variante aislada del VHB, comprendiendo dicha variante una mutacion de nucleotidos en un gen que codifica una ADN polimerasa que de como resultado la sustitucion de al menos un aminoacido a dicha ADN polimerasa del VHB seleccionada de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I y presentando dicha variante una menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

Otro aspecto de la presente descripcion proporciona una variante del VHB que comprende una mutacion en un marco de lectura abierto con solapamiento en su genoma, estando dicha mutacion en una region definida por uno o mas de los dominios F y A a E de la ADN polimerasa del VHB y presentando dicha variante una menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

Otro aspecto adicional de la presente descripcion proporciona una variante del VHB que comprende una mutacion en la secuencia de nucleotidos que codifica una ADN polimerasa que de como resultado una adicion, una sustitucion y/o una delecion de aminoacidos en dicha ADN polimerasa en uno o mas de los aminoacidos mostrados en las Formulas I y/o II:

FORMULA I L, B1 B2, D, W, G, P, C, B3, B4, H, G, B5, H, B6, I, R, B7, P, R, T, P, B8,

P, H, N, T, B10, E, S, B11, L, B12, V, D, F, S, Q, F, S, R, G, B13, B14, B15, V, S, W, P. L, L, S*

R, V, B9, G, G, V, F, L, V, D, K, N, K, F, A, V, P, N, L, B16, S, L, T, N,

en la que:

B1

es L, o R, o I

B2

es E, o D

B3

es T, o D, o A, o N, o Y

B4

es E, o D

B5

es E, o K, o Q

B6

es H, o R o N

B7

es I, o T

B8

es A, o S

B9

es T o R

B10

es A, o T, o S

B11

es R, o T

B12

es V, o G

B13

es S, o I, o T, o N, o V

B14

es T, o S, o H, o Y

B15

es R, o H o K, o Q

Bia es Q, o P;

y

FORMULA II S Zi L S W L S L D V S A A F Y H Z2 P L H P A A M P H L L Z3 G S S G L Z4 R Y V A R L S S Z5 S Za Z7 X N Za Q Z9 Z10 X X X Z11 L H Z12 Z13 C S R Z14 L Y V S L Z15 L L Y Zia T Z17 G Zia K L H L Z19 Z20 H P I Z21 L G F R K Z22 P M G Z23 G L S P F L L A Q F T S A I Z24 Z25 Z2a Z27 Z2a R A F Z29 H C Z30 Z31 F Z32 Y M* D D Z33 V L G A 5 Z34 Z35 Z3a Z37 H Z38 E Z39 L Z40 Z41 Z42 Z43 Z44 Z45 Z4a L L Z47 Z4a G I H L N P Z49 K T K R W G Y S L N F M G Y Z50 I

G

en la que:

X

es cualquier aminoacido

Zi

es N o D;

Z2

es I o P;

Z3

es I o V;

Z4

es S o D;

Z5

es T o N;

Za

es R o N;

Z7

es N o I;

Za

es N o Y o H;

Z9

es H o Y;

Zi0

es G o R;

Zii

es D o N;

Zi2

es D o N;

Zi3

es S o Y;

Zi4

es N o Q;

Zi5

es L o M;

Zia

es K o Q;

Zi7

es Y o F;

Zia

es R o W;

Zi9

es Y o L;

Z20

es S o A;

Z2i

es I o V;

Z22

es I o L;

Z23

es V o G;

Z24

es C o L;

Z25

es A o S;

Z2a

es V o M;

Z27

es V o T;

Z2a

es R o C;

Z29

es F o P;

Z30

es L o V;

Z3i

es A o V;

Z32

es S o A;

Z33

es V o L o M;

Z34

es K o R;

Z35

es S o T;

Z3a

es V o G;

Z37

es Q o E;

Z3a

es L o S o R;

Z39

es S o F;

Z40

es F o Y;

Z4i

es T o A;

Z42

es A o S;

Z43

es V o I;

Z44

es T o C;

Z45

es N o S;

Z4a

es F o V;

Z47

es S o D;

Z4a

es L o V;

Z49

es N o Q;

Z50

es V o I; y

M*

es el aminoacido 550;

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y en la que S* en la Formula I esta designada como el aminoacido 420 y la primera S en la Formula II esta designada como el aminoacido 421;

y en la que dicha variante presenta menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

La presente invencion contempla un procedimiento de determinacion del potencial de que un VHB presente sensibilidad reducida a un analogo nucleosido, comprendiendo dicho procedimiento el aislamiento de ADN o del correspondiente ARNm de dicho VHB y la busqueda de una mutacion en la secuencia de nucleotidos que codifica la ADN polimerasa del VHB, lo que da como resultado que se seleccione al menos la mutacion de un aminoacido de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I, siendo la presencia de tal mutacion una indicacion de la probabilidad de resistencia a dicho analogo nucleosido.

Otro aspecto de la presente descripcion proporciona una composicion que comprende una variante de VHB que comprende una mutacion en la ADN polimerasa del VHB seleccionada de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584i resistente al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos o un antfgeno de superficie del VHB de dicha variante del VHB o una forma recombinante o derivada de la misma o su equivalente qufmico y uno o mas vehfculos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables.

Otro aspecto adicional de la presente descripcion proporciona un uso de una variante de VHB en el que dicha variante comprende una mutacion de nucleotidos en un gen que codifica una ADN polimerasa que de como resultado al menos una adicion o una sustitucion de aminoacidos en dicha ADN polimerasa seleccionada de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I resistente al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la hepatitis.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 es una representacion diagramatica que muestra el genoma parcialmente bicatenario del ADN del VHB que muestra los marcos de lectura abiertos con solapamiento que codifican los genes de superficie (S), centrales (C), de polimerasa (P) y X.

La Figura 2 es una representacion que muestra regiones conservadas de los dominios A a E (subrayadas) del VHB. M en YMDD esta designada como el aminoacido numero 550. El sfmbolo A*= indica mas de tres posibilidades de aminoacidos en esta posicion de la secuencia de consenso. La Formula I de la presente memoria muestra la secuencia de consenso que define el dominio A.

Descripcion detallada de las realizaciones preferentes

La presente descripcion se refiere, en parte, a la identificacion y el aislamiento de variantes resistentes a analogos nucleosidos del VHB tras el tratamiento de pacientes con FAM y/o LAM y, opcionalmente, con otros analogos nucleosidos. En particular, los pacientes tratados con FAM y/o LAM dieron origen a variantes del VHB que presentaban una sensibilidad menor o reducida al FAM y/o a la LAM. La referencia en la presente memoria a “menor” o “reducida” en relacion con la sensibilidad al FAM y/o a la LAM incluye y abarca una resistencia completa o sustancial al analogo nucleosido, asf como una resistencia parcial, e incluye una tasa de replicacion o eficacia de replicacion que es superior a la del tipo natural en presencia de un analogo nucleosido. En un aspecto, esta esta medida por un aumento en la carga viral hasta un nivel similar o mayor que los niveles previos al tratamiento.

En consecuencia, un aspecto de la presente descripcion va dirigido a una variante aislada del VHB, comprendiendo dicha variante una mutacion de nucleotidos en un gen que codifica una ADN polimerasa que da como resultado la adicion, la sustitucion y/o la delecion de al menos un aminoacido a dicha ADN polimerasa y presentando dicha variante menos sensibilidad al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

Ademas de una mutacion en el gen que codifica la ADN polimerasa, debido a la naturaleza solapada del genoma del VHB (Figura 1), tambien puede producirse una correspondiente mutacion en el gen que codifica el antfgeno de superficie (HBsAg) que de como resultado una menor interactividad de reactivos inmunologicos tales como anticuerpos y celulas inmunologicas con el HBsAg. La reduccion en la interactividad de los reactivos inmunologicos con un componente de la superficie viral generalmente incluye la ausencia de memoria inmunologica para reconocer o reconocer sustancialmente el componente de superficie viral. Por lo tanto, la presente invencion describe, una variante del VHB que presenta menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM e interactividad reducida de un reactivo inmunologico con el HBsAg, seleccionandose la variante para el tratamiento posterior con FAM y/o con LAM.

Por lo tanto, una variante viral puede llevar la mutacion solamente en la ADN polimerasa o tanto en la ADN polimerasa como en el HBsAg. El termino “mutacion” ha de ser entendido en su contexto mas amplio, e incluye mutaciones multiples.

En consecuencia, otro aspecto de la presente descripcion proporciona una variante del VHB que comprende una mutacion en un marco de lectura abierto con solapamiento en su genoma, estando dicha mutacion en una region

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definida por uno o mas dominios F y A a E de la ADN polimerasa del VHB y presentando dicha variante una menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

Otro aspecto preferente de la presente descripcion contempla una variante del VHB que comprende una mutacion en la secuencia de nucleotidos que codifica el HBsAg que da como resultado la adicion, la sustitucion y/o la delecion de aminoacidos en dicho HBsAg en una region correspondiente a la secuencia de aminoacidos mostrada en las Formulas I y II y presentando dicha variante menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

Preferentemente, las variantes estan en forma aislada, de modo que han experimentado al menos una etapa de purificacion alejadas de un fluido corporal presente de forma natural. Alternativamente, las variantes pueden ser mantenidas en un fluido corporal aislado o pueden estar en forma de ADN. La presente descripcion tambien va dirigida a clones moleculares infecciosos que comprenden el genoma o partes del mismo de una variante de VHB.

Las mutaciones en la ADN polimerasa del VHB incluyen, por ejemplo, variantes seleccionadas de pacientes con recurrencia del VHB tras un tratamiento con FAM y/o LAM. El tratamiento con un analogo nucleosido puede ocurrir en relacion con un procedimiento de trasplante (por ejemplo, trasplante de medula osea (BMT) o oLt) o tras un tratamiento de pacientes a los que se les ha diagnosticado hepatitis. Tras la seleccion de las variantes, son obtenibles cargas virales a niveles mayores que los niveles previos al tratamiento.

Las mutaciones en la ADN polimerasa del VHB incluyen, por ejemplo, una o mas de Q471K, Q471N, Y472Q, T474A, L478L/M, N485H, Y487Y/PARADA, V/G/E488L, L493L/W, F524F/L, I533I/V, V537I, S548G, S548S/C, N/S/H584T, N/S/H584A, H584I, R588R/S e I599A. El termino “PARADA” significa un codon de parada. Tambien pueden producirse mutaciones correspondientes en el antfgeno de superficie (es decir, HBsAg). Las del HBsAg incluyen, por ejemplo, una o mas de T118R, N131T, M133K/M, M133I, C139C/G y W182/PARADA.

La identificacion de las variantes de la presente invencion permite la generacion de una gama de ensayos para detectar tales variantes. La deteccion de tales variantes puede ser importante en la identificacion de variantes resistentes para determinar la forma apropiada de quimioterapia y/o para monitorizar protocolos de vacunacion y desarrollar preparaciones de vacunas nuevas o modificadas.

En consecuencia, otro aspecto de la presente descripcion contempla un procedimiento para determinar el potencial de que un VHB presente sensibilidad reducida al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos, comprendiendo dicho procedimiento el aislamiento de ADN o del correspondiente ARNm de dicho VHB y la busqueda de una mutacion en la secuencia de nucleotidos que codifica la ADN polimerasa del VHB, lo que da como resultado la sustitucion, la delecion y/o la adicion de al menos un aminoacido en uno cualquiera o mas de los dominios F y A a E o de una region proximal a los mismos de dicha ADN polimerasa y esta asociada con la resistencia o una menor sensibilidad al FAM y/o a la LAM, siendo la presencia de tal mutacion una indicacion de la probabilidad de resistencia a dicho FAM y/o dicha LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos.

Segun la invencion, el ensayo detecta una o mas de las mutaciones siguientes en la ADN polimerasa del VHB: N/S/H584T, N/S/H584A y H584I.

La deteccion del VHB o de sus componentes en celulas, lisados celulares, fluido sobrenadante cultivado y fluido corporal puede efectuarse mediante cualquier medio conveniente, incluyendo cualquier medio de deteccion a base de acidos nucleicos; por ejemplo, mediante tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos o mediante una o mas reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). La expresion “fluido corporal” incluye cualquier fluido derivado de la sangre, la linfa, sistemas de tejidos u organos, incluyendo suero, sangre completa, biopsia y fluido de biopsia, explantes de organos y suspension de organos, tales como suspensiones hepaticas. La invencion tambien abarca el uso de diferentes formatos de ensayo de dichos medios de deteccion a base de acidos nucleicos, incluyendo polimorfismo de la longitud de fragmentos de restriccion (RFLP), polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo de cadena monocatenaria (SSCP), deteccion por amplificacion y discrepancia (AMD), reaccion en cadena de la polimerasa de secuencia repetitiva intercalada (IRS-PCR), reaccion en cadena de la polimerasa inversa y reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR), entre otros. Otras formas de deteccion incluyen transferencias de Northern, transferencias de Southern, secuenciacion PCR, procedimientos de anticuerpos, tales como ELISA, transferencia de Western e immunohistoqufmica. Un ensayo particularmente util incluye los reactivos y los componentes requeridos para los sistemas de deteccion arbitrados por oligonucleotidos u oligopeptidos inmovilizados.

Tambien se pueden detectar variantes con referencia al HBsAg. Las mutaciones preferentes del HBsAg incluyen una o mas de T118R, N131T, M133K/M, M133I, C139C/G y W182/PARADA.

La deteccion de variantes de aminoacidos de la ADN polimerasa se logra convenientemente por referencia a la secuencia de aminoacidos de consenso mostrada en la Figura 2 y en las Formulas I y II. Los polimorfismos mostrados representan las variaciones mostradas en diversas bases de datos para cepas patogenas activas del VHB. Cuando una variante del VHB comprende un aminoacido diferente de lo que se representa, entonces se considera que tal aislado es una variante putativa del VHB que tiene una actividad alterada de la ADN polimerasa.

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La presente descripcion contempla, ademas, agentes que inhiben las variantes del VHB resistentes al FAM y/o a la LAM. Tales agentes seran particularmente utiles si el clfnico contempla un tratamiento a largo plazo con FAM y/o LAM y/u, opcionalmente, otros analogos nucleosidos. Los agentes pueden ser ADN o ARN o moleculas qufmicas proteinaceas o no proteinaceas. Tambien se contempla la busqueda de productos naturales, tales como los derivados de plantas, coral y microorganismos como una fuente potencial util de agentes enmascarantes. Los agentes pueden estar en forma aislada o en forma de una composicion farmaceutica y pueden ser administrados secuencial o simultaneamente con el analogo nucleosido.

La presente descripcion contempla un procedimiento de deteccion de un agente que presenta actividad inhibidora a un VHB con sensibilidad reducida al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos, comprendiendo dicho procedimiento:

generar una estructura genetica que comprende una cantidad eficaz competente para la replicacion del genoma de dicho VHB resistente al famciclovir contenida o fundida en una cantidad de un genoma de baculovirus eficaz para infectar celulas y luego infectar dichas celulas con dicha estructura;

poner dichas celulas, antes, durante y/o despues de la infeccion, en contacto con el agente que ha de ser sometido a ensayo;

cultivar dichas celulas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que el VHB y, opcionalmente, el VHB adicional se repliquen, expresen secuencias geneticas y/o ensamblen y/o liberen virus o partfculas de tipo virus si son resistentes a dicho agente; y

someter a las celulas, a los lisados celulares o al fluido sobrenadante del cultivo a medios de deteccion viral o de componentes virales para determinar si el virus ha sido replicado o no, ha expresado o no material genetico y/o se ha ensamblado o no y/o se ha liberado o no en presencia de dicho FAM y/o dicha LAM.

En una realizacion alternativa, la presente invencion proporciona un procedimiento de deteccion de un agente anti VHB que presenta actividad inhibidora a un VHB con sensibilidad reducida al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos, comprendiendo dicho procedimiento:

generar una estructura genetica que comprende una cantidad eficaz competente para la replicacion del genoma de dicho VHB contenida o fundida en una cantidad de un genoma de baculovirus eficaz para infectar celulas y luego infectar dichas celulas con dicha estructura;

poner dichas celulas, antes, durante y/o despues de la infeccion, en contacto con el agente que ha de ser sometido a ensayo;

cultivar dichas celulas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que el VHB se replique, exprese secuencias geneticas y/o ensamble y/o libere virus o partfculas de tipo virus si son resistentes a dicho agente; y someter a las celulas, a los lisados celulares o al fluido sobrenadante del cultivo a medios de deteccion viral o de componentes virales para determinar si el virus ha sido replicado o no, ha expresado o no material genetico y/o se ha ensamblado o no y/o se ha liberado o no en presencia de dicho FAM y/o dicha LAM.

En una realizacion alternativa adicional de la presente invencion, se proporciona un procedimiento de deteccion de un agente anti VHB que presenta actividad inhibidora a un VHB con sensibilidad reducida al FAM y/o a la LAM y, opcionalmente, a otros analogos nucleosidos, comprendiendo dicho procedimiento:

generar una lfnea celular continua que comprende una copia infecciosa del genoma de dicho VHB en una cantidad eficaz competente para la replicacion de modo que dicho genoma infeccioso del VHB se integre de manera estable en dicha lfnea celular continua, tal como, sin limitacion, 2.2.15 o AD;

poner dichas celulas en contacto con el agente que ha de ser sometido a ensayo;

cultivar dichas celulas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que el VHB se replique, exprese secuencias geneticas y/o ensamble y/o libere virus o partfculas de tipo virus si son resistentes a dicho agente; y

someter a las celulas, a los lisados celulares o al fluido sobrenadante del cultivo a medios de deteccion viral o de componentes virales para determinar si el virus ha sido replicado o no, ha expresado o no material genetico y/o se ha ensamblado o no y/o se ha liberado o no en presencia de dicho FAM y/o dicha LAM.

La presente descripcion describe, ademas, un HBsAg aislado de las variantes del VHB descritas en la presente memoria. Mas en particular, la presente descripcion proporciona un HBsAg o una forma recombinante del mismo o un derivado o un equivalente qufmico del mismo. El componente de superficie aislado y, mas en particular, el antfgeno de superficie aislado o sus equivalentes recombinante, derivado o qufmico son utiles en el desarrollo de composiciones biologicas tales como formulaciones de vacunas.

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En consecuencia, la presente descripcion contempla una composicion que comprende una variante de VHB resistente al famciclovir o a un antfgeno de superficie del vHb de dicha variante del VHB o a una forma recombinante o derivada de la misma o su equivalente qufmico. La composicion puede ser considerada una composicion biologica.

Generalmente, si se usa un VHB, es atenuado primero. La composicion biologica segun este aspecto de la presente invencion generalmente comprende, ademas, uno o mas vehfculos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables.

La composicion biologica puede comprender el HBsAg o una molecula semejante de una variante del VHB, o la composicion puede ser un coctel de varios HBsAg o moleculas semejantes de una gama de variantes del VHB resistentes al FAM y/o a la LAM. Se aplican inclusiones similares cuando la composicion comprende un VHB.

La presente invencion se extiende a juegos de ensayos para una variante de VHB que comprende una mutacion en la AdN polimerasa del VHB seleccionada de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I resistentes al FAM y/o a la LAM. Tales juegos pueden contener, por ejemplo, los reactivos provenientes de la PCR o de otra tecnologfa de hibridacion de acidos nucleicos o reactivos para tecnicas de deteccion basadas en la inmunologfa. Un ensayo particularmente util incluye los reactivos y los componentes requeridos para los sistemas de deteccion arbitrados por oligonucleotidos u oligopeptidos inmovilizados.

La presente invencion contempla, ademas, el uso de una variante de VHB resistente al FAM y/o a la LAM, comprendiendo dicha variante una mutacion de nucleotidos en un gen que codifica una ADN polimerasa que da como resultado que la sustitucion de al menos un aminoacido a dicha AdN polimerasa se seleccione de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la hepatitis.

La presente invencion tambien contempla el uso de las presentes variantes del VHB para buscar agentes antivirales. Estos agentes antivirales inhiben el virus. El termino “inhibir” incluye contrarrestar o prevenir de otra manera la infeccion, la replicacion, el ensamblado y/o la liberacion o cualquier etapa intermedia. Los agentes antivirales preferidos influyen analogos nucleosidos; sin embargo, la presente invencion se extiende a moleculas no nucleosidas.

En consecuencia, otro aspecto de la presente invencion contempla el uso de una variante del VHB resistente al FAM y/o a la LAM, comprendiendo dicha variante una mutacion de nucleotidos en un gen que codifica una ADN polimerasa que da como resultado que la sustitucion de al menos un aminoacido a dicha ADN polimerasa se seleccione de una o mas de N/S/H584t, N/S/H584A y H584I para buscar un agente antiviral capaz de inhibir dicha variante del VHB.

La presente descripcion versa, ademas, sobre una variante del VHB que comprende la mutacion S548G o la S548C seleccionada tras el tratamiento con LAM de un paciente sometido previamente a una terapia con FAM/HBIG antes de un trasplante de hfgado. La mutacion S548G se produjo concurrentemente con las mutaciones L526M, M550V y Y472Q detectadas por secuenciacion de clones derivados de un producto amplificado por PCR. En un VHB aislado de un paciente tratado con LAM se detecto una mutacion adicional: la S548S/C.

La presente invencion es descrita adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Pacientes y tratamiento

Fueron estudiados ocho pacientes que recibieron BMT alogeno en el Centro de Trasplantes de Medula Osea en el Hospital Queen Mary, de Hong Kong. Todos fueron tratados con FAM como profilaxis contra la reactivacion del VHB tras el BMT, segun se habfa documentado previamente (23). Brevemente, todos los pacientes recibieron 250 mg de FAM oral tres veces al dfa durante al menos una semana (intervalo: 1-12 semanas) antes del BMT y luego siguieron recibiendolo 24 semanas despues del BMT. Los niveles de FAM fueron incrementados hasta 500 mg tres veces al dfa en pacientes que presentaron ya fuera niveles elevados de ADN de VHB o la deteccion inicial del HBsAg como marcador de la reactivacion del VHB. Dos pacientes fueron tratados con FAM y/o LAM despues de un trasplante de hfgado.

El ensayo de cuantificacion del ADN del VHB en el suero y de serologfa de la hepatitis, los marcadores serologicos de la hepatitis B, incluyendo los HBsAg, anti-HB, HBeAg, anti-HBe, el antivirus de la hepatitis C (VHC; de EIA II), el antivirus de la hepatitis D y el anti VIH fueron analizados mediante inmunoensayos enzimaticos disponibles comercialmente (Abbott Laboratories, Chicago, Illinois, EE. UU.). El anticuerpo central total de la hepatitis B (anti- HbC) fue analizado mediante radioinmunoensayo (Corab, Abbott Laboratories, Chicago, Illinois, EE. UU.). El ADN del VHB serico fue cuantificado mediante el ensayo de amplificacion de senal de ADNr (bDNA Quantiplex TM HBV DNA, Chiron, Emeryville, California, EE. UU.). Para minimizar la variacion entre ensayos, fueron sometidas a ensayo muestras secuenciales dentro de una sola tanda.

Ejemplo 2

Extraccion de ADN del VHB de suero del paciente

Se recogieron sueros de 10 pacientes en varios puntos temporales y se extrajo el ADN del VHB. Se mezclaron partes alfcuotas de 50 pl de los sueros con 150 pl de TE (10 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,5), 2 mmol/l de EDTA), 1% p/v de dodecilsulfato sodico y 1 mg/ml de proteinasa K y fueron incubadas a 55°C durante 30 minutos. El ADN fue 5 desproteinizado con fenol/cloroformo, precipitado con isopropanol y disuelto en 40 pl de agua sin nucleasas.

Ejemplo 3

Amplificacion por PCR

Se amplificaron el dominio catalftico de la protefna polimerasa y el determinante “a” de la protefna de superficie. En la amplificacion se usaron el cebador codificante (5'GCC TCA TTT T GTG GGT CAC CAT A-3' [N° ID SEC:1]) y el 10 cebador no codificante (5'-TCT CTG ACA TAC TTT CCA AT-3' [N° ID SEC:2]) de la primera ronda (Bresatec,

Adelaida, Australia). Cada reaccion se llevo a cabo usando 5 pl del ADN extrafdo como plantilla, 1,5 U de polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut), 1 pmol/l de cebadores codificantes y no codificantes, 200 pmol/l de Tris-HCl (pH 8,3) y 0,01% p/v de gelatina. Se llevo a cabo la PCR mediante 40 ciclos de desnaturalizacion (94°C durante 45 segundos), hibridacion (55°C durante 45 seg) y extension (72°C durante 1,5 min), seguido por una 15 extension final de 7 min (Perkin-Elmer 2400, Cetus, Norwalk, Connecticut). Cuando hizo falta, se llevo a cabo una

ronda adicional semianidada de amplificacion usando 2 pl del producto de la primera ronda como plantilla y cebador 5' CAC AAC AAT CCA CCA AGC T3' [N° ID SEC:3] como cebador codificante. Las condiciones de amplificacion fueron las mismas de la ronda inicial de amplificacion, con solo 25 rondas de ciclo.

Ejemplo 4

20 Secuenciacion de los genes de la polimerasa/envoltura del ADN del VHB

Los productos amplificados fueron purificados mediante gel usando Geneclean II (BIO 101 Inc., La Jolla, California) y fueron secuenciados directamente usando el ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit segun las especificaciones del fabricante (Perkin Elmer, Cetus Norwalk, Connecticut). Como cebadores de secuenciacion se usaron cebadores de PCR, asf como varios cebadores adicionales (5'-AAA TTC GCA GTC CCC 25 AAC-3 [N° ID SEC:4]', 5'-TCT CTG ACA TAC TTT CCA AT-3' [N° ID SEC:5] y 5'-GAT TCC CTC CTG TTG CTG T-3' [N° ID SEC:6]) requeridos para secuenciar las regiones internas de los productos de la PCR. Se usaron MacVector y Assembly LIGn (MacVector version 6.0 y Assembly LIGN, Oxford Molecular, Reino Unido) para analizar todos los datos automaticos de secuencias. Las secuencias de aminoacidos deducidas fueron comparadas con el aislado individual previo al tratamiento usando el subprograma ClustalW y con la secuencia publicada de consenso de la 30 VHB polimerasa y las secuencias de HBsAg (38-40).

Ejemplo 5

Mutaciones de la VHB polimerasa

En este estudio, las variantes dominantes del VHB seleccionadas despues del BMT y del tratamiento con FCV fueron examinadas mediante secuenciacion de la region analftica del gen de la polimerasa y el determinante “a” del 35 HBsAg. Se detectaron varios de los cambios deducidos de aminoacidos en la region catalftica del gen que codifica la VHB polimerasa; sin embargo, la mayorfa de estos cambios eran coherentes con los cambios normalmente encontrados dentro de los genotipos del VHB. En la Tabla 1 estan enumeradas las mutaciones unicas del VHB detectadas durante el tratamiento. En seis de ocho pacientes, se detecto una mutacion en la polimerasa en el aminoacido 584, en la que se detecto (Tabla 1) una tirosina, o alanina, o serina/isoleucina (poblacion mixta). En 40 cuatro de ocho pacientes, esta mutacion fue detectada durante el tratamiento con FAM y, en los dos pacientes restantes, la mutacion fue detectada antes del tratamiento. Este cambio de aminoacidos ocurrio despues del codon de terminacion del HBsAg en el marco de lectura con solapamiento. Los otros cambios deducidos de aminoacidos que fueron detectados en aislados de multiples pacientes incluyeron cambios en los aminoacidos 471, 474, 485 y 499. Estos cambios estaban ubicados en la region entre los dominios A y B y se solapaban con el determinante “a” 45 del HBsAg. Se detecto un cambio en el dominio B de la polimerasa en F524F/L. En el dominio C no se detecto ninguna mutacion unica que contuviera el motivo “YMDD”. Los cambios que no afectan al HBsAg y afectan unicamente a la polimerasa incluyen Q471K, T474A, L478L/M, F524F/L e I533I/V (Tabla 1).

En dos de los dos pacientes de trasplante de hfgado, se detecto una mutacion en el codon 548. La mutacion S548G ocurrio concurrentemente con las mutaciones L526M, M550V e Y472Q, detectadas mediante secuenciacion de 50 clones derivados del producto amplificado por PCR. En un VHB aislado de un paciente tratado con LAM se detecto una mutacion adicional: la G548S/C.

Ejemplo 6

Mutaciones del HBsAg

Se detectaron varios de los cambios en el gen que codifica el HBsAg; sin embargo, la mayorfa de estos cambios eran coherentes con los cambios en el genotipo del VHB. En la Tabla 1 estan enumeradas las mutaciones unicas que alteran tanto el HBsAg como la polimerasa, y en la Tabla 2 estan enumeradas otras mutaciones que alteran el HBsAg solamente. Los cambios del HBsAg detectados en 133, 139, 145 y 182 son variantes que no se detectan en 5 otros genotipos (39,40). En dos pacientes, se detecto una mutacion G145R despues de un BMT y de tratamiento con FAM. En uno de estos pacientes, fue detectada como una poblacion mixta que contenfa el virus del tipo natural y el virus con un HBsAg truncado debido a un codon de terminacion. En otros dos pacientes se detectaron dos mutaciones resultantes en un HBsAg truncado. Estos codones de terminacion se encontraron en los aminoacidos 182 y 216 (Tablas 1 y 2).

10 Ejemplo 7

Clonacion de productos de PCR

Los productos de PCR provenientes de la amplificacion por PCR ya fuera de la primera ronda o de la segunda fueron purificados usando Geneclean (Bio 101 Inc., La Jolla, California) y clonados en pPCR-Script (Stratagene) segun las especificaciones del fabricante.

15 TABLA 1 Mutaciones y cambios de la VHB polimerasa en el marco solapado de lectura del HBsAg

Mutacion de la VHB polimerasa

Aislado Cambio AA en el HBsAg

Q471K Q471N

A-3, 4,5; D-1,2,3; F-3 sin cambio

Y472Q

SS T1184

T474A

C-2; D-1,2; E-5 sin cambio

L478L/M

E-6 sin cambio

N485H

A-3,4,5; B-1,2; D-4 N131T

Y487Y/PARADA

C-6 M133K/M

V/G/E488L

B1,2 M133I*

L493L/W

A-4 C139C/G*

F524F/L

E-6 sin cambio

I533I/V

E-5 sin cambio

V537I

E-9 W182/PARADA

S548G

SS sin cambio

S548S/C

MS sin cambio

N/S/H584T N/S/H584A H584I

A-2; B-3; E-4; H-1,2,3,4,5,6 C-1,3,4,5,6 D-5 despues de la PARADA del HBsAg

R588R/S

B-4 despues de la PARADA del HBsAg

I599A

F-10 despues de la PARADA del HBsAg

* Cambios que no son detectados como variantes comunes en otros genotipos de VHB.

TABLA 2 Cambios en el HBsAg que no alteran la protefna de la VHB polimerasa

HBsAg

Aislado

Y225F

A3,4,5; D-4; F-3

Q181E

C-1

Q181G

C-2,3,4,5

Q181Q/G

C-6

S210K

C1,3,4,5

L216/PARADA

C1, C6

L216L/PARADA

C,3,4,5

S117T

E-9

L175L/S

E-6

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Melbourne Health The University of Hong Kong The Austin and Repatriation Medical Centre University of Sydney

<120> VARIANTES VIRALES Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LAS MISMAS

<130> 2422733/EJH

<150> AU PQ8109

<151> 2000-06-09

<160> 6

<170> PatentIn version 3.0

<210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> cebador

<400> 1

gcctcatttt gtgggtcacc ata 23

<210>2 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 2

tctctgacat actttccaat 20

<210>3 <211> 19 <212> ADN <213> cebador

<400> 3

cacaacaatc caccaagct 19

<210>4 <211> 18 <212> ADN <213> cebador

<400> 4

aaattcgcag tccccaac 18

<210>5 <211> 20 <212> ADN <213> cebador

<400> 5

tctctgacat actttccaat 20

<210>6 <211> 19 <212> ADN <213> cebador

<400> 6

gattccctcc tgttgctgt 19

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de determinacion del potencial para que un VHB presente sensibilidad reducida a un analogo nucleosido, comprendiendo dicho procedimiento el aislamiento de ADN o del correspondiente ARNm de dicho VHB y la busqueda de una mutacion en la secuencia de nucleotidos que codifica la ADN polimerasa del VHB, lo que da 5 como resultado que se seleccione al menos la mutacion de un aminoacido de una o mas de N/S/H584T, N/S/H584A y H584I, siendo la presencia de tal mutacion una indicacion de la probabilidad de resistencia a dicho analogo nucleosido.