ES2631156T3 - Adyuvantes láser para aumentar la respuesta inmunitaria - Google Patents

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Abstract

Un antígeno para el uso de un método para mejorar la respuesta inmunitaria protectora al antígeno en un sujeto, donde método comprende: exponer la piel del sujeto a radiación de longitud de onda de entre 1050 nm y 1080 nm, donde la radiación es una dosis total de radiación infrarroja cercana de entre 25 J y 1200 J; y administrar al sujeto una dosis del antígeno, donde el antígeno está administrado intradérmicamente en o inmediatamente adyacente a la piel expuesta a la radiación, caracterizada por: la radiación es una radiación de onda continua.

Description

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DESCRIPCION
Adyuvantes laser para aumentar la respuesta inmunitaria Investigacion o desarrollo patrocinado federalmente
Esta invencion se ha realizado con patrocinio gubernamental segun la Subvencion N° N66001-10-1-2132 concedida por el Departamento de Defensa. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invencion.
Campo tecnico
Esta divulgacion se refiere a metodos para aumentar una respuesta inmunitaria a una vacuna, utilizando coadministracion de un laser.
Antecedentes
Las vacunas actuales son en general moleculas recombinantes muy espedficas, escasamente inmunogenicas, y requieren potenciacion con adyuvantes inmunologicos (Harandi AM, Davies G, Olesen OF. (2009) Expert Rev Vaccines 8(3): 293-8; Leroux-Roels G.(2010)Vaccine 28 Suppl 3: C25-36; Perrie Y, Mohammed AR, Kirby DJ, McNeil SE, BramVell VW. (2008) Int J Pharm 364(2): 272-80; Nichol KL. (2008) Vaccine 26 Suppl 4: D17-22; Reed SG, Bertholet S, Coler RN, Friede M. (2009) Trends Immunol 30(1): 23- 32). El desarrollo de adyuvantes inmunologicos seguros y potentes es esencial en la practica con las vacunas actuales, pero ha resultado frustrante por numerosas razones. A pesar de la proliferacion de posibles candidatos a adyuvantes, pocos son los que han demostrado suficiente eficacia y seguridad en su desarrollo. La FDA ha autorizado solo dos adyuvantes inmunologicos durante los ultimos 80 anos, principalmente debido a la preocupacion por los efectos secundarios (Leroux-Roels G. (2010);Reed et al. (2009);Aguilar JC, Rodriguez EG. (2007) Vaccine (19):3752-62; Coffman RL, Sher A, Seder RA. (2010) Immunity 33(4): 492-503). La naturaleza estimulante de las sustancias qrnmicas de los candidatos a adyuvantes convencionales contribuye a su capacidad para sobreactivar la respuesta inmunitaria, dando como resultado efectos secundarios no deseados y toxicidad para el sistema biologico (Leroux-Roels G. (2010); Perrie et al. (2008); Reed et al. (2009); Israeli E, Agmon-Levin N, Blank M, Shoenfeld Y. (2009) Lupus 18(13): 1217-25). Ademas, esta estimulacion incontrolable del sistema inmunitario conduce en general a una eficacia limitada. El adyuvante inmunologico mas prevalente, las sales del hidroxido de aluminio, provocan escasa respuesta inmunitaria mediada por celulas y son poco efectivas para determinadas vacunas (Leroux-Roels G. (2010); Reed et al. (2009). Esto constituye un problema comun entre los candidatos a adyuvantes potenciales, pero aun no clmicamente aceptables.
La piel es la primera lmea de defensa contra los patogenos, y la vigilancia por parte del sistema inmunitario de la integridad de esta estructura es esencial para el mantenimiento de la vida (Nestle FO, Di Meglio P, Qin JZ, Nickoloff BJ. (2009) Nat Rev Immunol 9(10): 679-91; Kaplan DH. (2010) Trends Immunol 31(12): 446-51; Abraham SN, St John AL. (2010) Nat Rev Immunol 10(6): 440-52). Por consiguiente, el sistema inmunitario basado en la piel puede ser potenciado de forma efectiva, y dispuesto a responder a los patogenos mediante la vacunacion en esa superficie (Wahl M, Hermodsson S. (1987) Scand J Infect Dis 19(6): 617-21; Vankerckhoven V, Van Damme P. (2010) Expert Opin Drug Deliv 7(9): 1109-25; Sticchi L, Alberti M, Alicino C, Crovari P. (2010) J Prev Med Hyg 51(1): 7-14; Nicolas jF, Guy B. (2008) Expert Rev Vaccines 7(8): 1201-14; Prausnitz MR, Mikszta JA, Cormier M, Andrianov AK. (2009) Curr Top Microbiol Immunol 333: 369-93; Lambert PH, Laurent PE. (2008)Vaccine 26(26): 3197-208). Recientemente se ha evaluado una via de vacunacion intradermica, y parece resultar mas efectiva que la via intramuscular convencional comun a muchas vacunaciones, incluyendo la gripe y la hepatitis B (Vankerckhoven et al. (2010); Nicolas JF, Guy B. (2008);Prausnitz et al. (2009); Lambert et al. (2008);Sangare L, Man hart L, Zehrung D, Wang CC. (2009) Vaccine 27(12): 1777-86). La combinacion de una vacunacion basada en la piel y un adyuvante puede potencialmente proporcionar la mayor eficacia
Resumen
La presente divulgacion se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que longitudes de onda espedficas (ej. casi infrarroja, ej. aproximadamente 1064 nm) de luz laser que no dane los tejidos (ej. menos de 1 V de potencia), aplicada continuamente durante periodos de tiempo cortos (ej. menos de unos 4 minutos, por ej. de 10 segundos a 2 minutos, ej. de 30 a 90 segundos) sobre una pequena zona de la piel (ej. menos de 0,5 cm ), pueden estimular la respuesta inmunitaria a las vacunas. Por tanto, los metodos que se describen aqrn incluyen el uso de tales adyuvantes laser en combinacion con la administracion de vacunas.
En un primer aspecto, la divulgacion proporciona metodos para aumentar una respuesta inmunitaria protectora a un antfgeno (ej. una vacuna) en un sujeto. El metodo incluye la exposicion de la piel del sujeto a una radiacion de onda continua con una longitud de onda de 1064 nm; y administrar al sujeto una dosis del antfgeno, que es administrado por via intradermica, en la piel expuesta a la irradiacion o inmediatamente adyacente.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para aumentar la respuesta inmunitaria protectora a un antfgeno en un sujeto. Los metodos incluyen la exposicion de la piel del sujeto a una radiacion de onda continua, con una longitud de onda de aproximadamente 1050 nm a 1080 nm, con una dosis total de radiacion casi infrarroja de entre 25 J y 1200 J; y administrar al sujeto una dosis del antfgeno, por via intradermica, en la piel expuesta a la
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irradiacion, o la inmediatamente adyacente. En algunas realizaciones, una longitud de onda central de la radiacion casi infrarroja es 1064 nm.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para aumentar la respuesta inmunitaria protectora a un antigeno en un sujeto. Los metodos incluyen la exposicion de la piel del sujeto a radiacion pulsada, a una longitud de onda de entre 1050 nm y 1080 nm, con una dosis total de radiacion casi infrarroja de entre 25 J y 1400 J; y administrar al sujeto una dosis del antigeno, por via intradermica, en la piel expuesta a la irradiacion o en la inmediatamente adyacente. En algunas realizaciones, una longitud de onda central de la radiacion casi infrarroja es 1064 nm.
En algunas realizaciones de los metodos descritos aqrn, el antigeno comprende acido nucleico o protemas. En algunas realizaciones de los metodos descritos aqrn, el antfgeno es un parasito viral, bacteriano, fungico, unicelular o multicelular, o una porcion del mismo.
En algunas realizaciones de los metodos que se describen aqrn, el antfgeno es un virus de la gripe o una porcion del mismo. En algunas realizaciones de los metodos descritos aqrn, el antfgeno es patogeno de polio, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, gripe, tuberculosis (Bacilo Calmette-Guerin (BCG)), sarampion, toxoide tetanico, encefalitis transmitida por garrapatas, fiebre amarilla, difteria-tetanos-tosferina, virus del papiloma humano, vacuna conjugada contra la meningitis multivalente, vacuna antineumococica conjugada o de la rabia.
En algunas realizaciones de los metodos que se describen aqrn, el tiempo total de exposicion del sujeto es de entre 10 a 300 segundos, ej. entre 10-90 segundos, ej. 30-60 segundos.
En algunas realizaciones de los metodos que se describen aqrn, un perfil de intensidad transversal de la radiacion tiene basicamente forma parabolica. En algunas realizaciones de los metodos que se describen aqrn, la radiacion media es de entre aproximadamente 1 V/cm y aproximadamente 5 V/cm. En algunas realizaciones de los metodos que se describen aqrn, la radiacion media es de aproximadamente 1 V/cm2.
En algunas realizaciones de los metodos descritos aqrn, la radiacion comprende radiacion laser, ej. de un laser granate de aluminio e itrio dopado con neodimio (Nd:YAG).
En algunas realizaciones de los metodos que se describen aqrn, la radiacion comprende radiacion producida por una fuente no de laser.
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aqrn tienen el mismo significado entendido habitualmente por un experto con conocimientos medios en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Se describen aqrn metodos y materiales para su uso en la presente divulgacion; tambien pueden utilizarse otros metodos y materiales adecuados conocidos en la tecnica. Los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
La invencion viene definida en las reivindicaciones. Otras realizaciones son simplemente a tftulo de ejemplo.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion resultaran evidentes con la siguiente descripcion detallada y las figuras, y con las reivindicaciones.
Descripcion de los dibujos
Las FIG. 1A-C son un conjunto de tres graficos e imagenes fotograficas que muestran el efecto del adyuvante laser sobre el tejido cutaneo. Las FIG. 1 A-C (columnas de la izquierda) muestran temperaturas de la superficie cutanea tras iluminacion laser de onda continua (CW) o pulsada de nanosegundo (PW) 1064 nm o PW 532 nm, sobre cuatro zonas de la piel afeitada y de pilada de la espalda durante hasta tres min.
Las barras de error muestran medias ± e.e.m.(error estandar de las medias). Las FIG. 1 A-C (columnas de la derecha) son imagenes fotograficas a las 0 y 24 horas tras la iluminacion laser cutanea. Cabezas de flecha, dano cutaneo visible, n =1-4 para cada grupo.
Las FIG. 2A-B son un conjunto de fotomicrograffas que muestran el dano microscopico por el parametro de no dano tisular del adyuvante laser. Se muestran imagenes representativas del curso temporal de histologfa cutanea de raton con iluminacion laser de 4 minutos PW 532 nm (200 mV) (FIG. 2A), y de 4 minutos CW 1064 nm (1000 mV) (FIG. 2B). El dano cutaneo fue evaluado a las 0, 6 y 24 horas tras la iluminacion laser por histologfa. Las 3 columnas de la izquierda muestran imagenes de tejido cutaneo tenido TUNEL. Se identificaron en rojo las celulas apoptoticas. Las columnas mas a la derecha muestran imagenes de tejido cutaneo tenido con hematoxilina-eosina. La barra indica 50 pm. (a-c) n = 2-4 para cada grupo.
La FIG. 3 es un grafico mostrando los tftulos IgG espedficos de ovoalbumina (OVA) sericos, a las 3, 6 y 12 semanas tras la vacunacion por inyeccion intradermica (i.d.) o intramuscular (i.m.) de OVA con o sin iluminacion laser o alumbre. Grupos experimentales y control: no vacunacion (n = 33), no adyuvante (solo inyeccion i.d. de OVA, n = 19), alumbre inyectado i.d.(inyeccion i.d. de OVA y alumbre, n = 15), alumbre inyectado i.m. (inyeccion i.m. de OVA y alumbre, n = 6), tratados con laser pulsado 1 min (PW) 532 nm (inyeccion i.d. de OVA y con el tratamiento de laser, n = 12), tratados con laser 4-min PW 532 nm (n = 11), tratados con laser 1 min PW 1064 nm (inyeccion i.d. de OVA y con el tratamiento de laser, n = 5), tratados con laser 4 min PW 1064 nm, n = 6), tratados con laser 1 min onda continua (CW) 1064 nm (inyeccion i.d. de OVA y con el tratamiento laser, n = 6), grupos tratados con laser 4-min CW
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1064 nm, n = 6). Las barras de error muestran medias ± e.e.m. *P < 0,05 comparados con los grupos de no adyuvante, ** P < 0,05 tratados con laser PW 532 nm (a tiempo de exposicion equivalente).
La FIG. 4 es un conjunto de graficos mostrando el efecto del adyuvante laser sobre la respuesta inmunitaria humoral a la vacunacion. Las FIG. 4a-c los tftulos subclase IgG en el estado pre-exposicion (4 semanas tras la vacunacion). Grupos experimentales y control: no vacunacion en estado pre-exposicion (a-c: n = 38), no adyuvante (inyeccion i.d. de vacuna de la gripe, a-c: n = 49), tratados con laser 4 min PW 532 nm (inyeccion i.d. de vacuna de la gripe con tratamiento de laser, a-c: n = 26), tratados con laser 1min CW 1064 nm (a-c: n = 52), alumbre inyectado i.d. (a-c: n =
12) , MPL inyectado i.d. (a-c: n = 12), grupos inyectados i.m. (inyeccion i.m. de vacuna de la gripe, a-c: n = 24).
La FIG. 5 es un conjunto de graficos mostrando el efecto del adyuvante laser sobre la respuesta inmunitaria humoral a la vacunacion. Las FIG. 5a-c muestran tftulos sericos de isotipo IgG espedficos de la gripe en estado post- exposicion (4 dfas tras la exposicion). Grupos experimentales y control: no vacunacion en post-exposicion (a-c: n = 25) a, no adyuvante (inyeccion i.d. de vacuna de la gripe, a-c: n = 31), tratados con laser 4 min PW 532 nm (inyeccion i.d. de vacuna de la gripe con el tratamiento de laser, a-c: n = 13), tratados con laser 1 min CW 1064 nm (a-c: n = 34), alumbre inyectado i.d. (a-c: n = 12), MPL (monofosforil ftpido) inyectado i.d. (a-c: n = 12), grupos inyectados i.m.- (inyeccion i.m. de vacuna de la gripe, a-c: n = 16), respectivamente.
La FIG. 6 es un grafico mostrando los tftulos HAI (hemaglutinacion indirecta) sericos tras la exposicion. Grupos experimentales y control: no vacunacion (n = 14), no adyuvante (n = 21), tratados con laser PW 532 nm (n = 13), tratados con laser CW 1064 nm (n = 24), alumbre inyectado i.d. (n = 12), MPL inyectado i.d. (n = 12), grupos inyectados i.m. (n = 16) en estado post-exposicion.
Las FIG. 7A-B son un conjunto de graficos mostrando el efecto del adyuvante laser en la proteccion contra la enfermedad. (A) Representaciones graficas Kaplan-Meier de supervivencia de ratones vacunados con la exposicion letal, grupos experimentales y control: no vacunacion (n = 16), no adyuvante (n = 20), tratados con laser pulsado 532 nm (n = 20), tratados con laser CW 1064 nm (n = 21), alumbre inyectado i.d. (n = 11), MPL inyectado i.d. (n = 12), grupos inyectados i.m. (n = 11). (B) La dosis infecciosa de huevo 50% (EID50) fue determinada por titulacion en serie de homogenado de pulmon en huevos, a los 4 dfas tras la exposicion. Grupos experimentales y control: no vacunacion (n = 6), no adyuvante (n = 7), tratados con laser PW 532 nm (n = 6), tratados con laser CW 1064 nm (n = 6), grupos inyectados i.m. (n = 6).
La FIG. 8 es un conjunto de graficos mostrando el efecto del adyuvante laser en la respuesta inmunitaria sistemica T helper tipo 1 (Th1) antigripe, (a) Las respuestas inmunitarias sistemicas T helper tipo 1 (Th1) tras exposicion fueron determinadas en cultivos de 5 h de esplenocitos, tras aislamiento de ratones vacunados y no vacunados 4 dfas tras la exposicion y reestimulacion con un peptido nucleoprotema (NP) MHC clase II espedfico de gripe.
Se muestra el porcentaje de celulas CD4+IFN-y+, (b) respuestas inmunitarias T helper tipo 2 (Th2). Se muestra el porcentaje de celulas CD4+IL-5+, (c) respuestas inmunitarias T helper tipo 17 (Th17). Se muestra el porcentaje de celulas CD4+IL-17+, (d) Se determino la respuesta inmunitaria sistemica de linfocitos T citotoxicos en cultivo de esplenocitos de 5 h, tras aislamiento de ratones vacunados y no vacunados, tras exposicion y reestimulacion con un peptido nucleoprotema (NP) MHC clase I espedfico de gripe. Se muestra el porcentaje de celulas CD8+IFN-y+. Grupos experimentales y control; no vacunacion (n = 16), no adyuvante (n = 18), tratados con laser PW 532 nm (n =
13) , tratados con laser Cw 1064 nm (n = 22), alumbre inyectado i.d. (n = 10), MPL inyectado i.d. (n = 12), grupos inyectados i.m. (n = 13) en estado post-exposicion. Las barras de error muestran medias ± e.e.m.
La FIG. 9 es un grafico mostrando los tftulos sericos IgE espedficos de gripe en estado post-exposicion. Grupos experimentales y control: no vacunacion (n = 8), no adyuvante (inyeccion i.d. de vacuna de la gripe, n = 8), tratados con laser 1 min CW 1064 nm (inyeccion i.d. de vacuna de la gripe con el tratamiento de laser, n = 11), alumbre inyectado i.d. (n = 12), MPL inyectado i.d. (n = 12), grupos inyectados i.m. (inyeccion i.m. de vacuna de la gripe, n = 8), respectivamente.
Descripcion detallada
La capacidad del tratamiento de la piel con luz laser visible no danina para aumentar las respuestas inmunitarias a la vacunacion intradermica ha sido descrita recientemente en la literatura (Onikienko SB, Zemlyanoy AB, Margulis BA, Guzhova IV, Varlashova MB, Gornostaev VS, Tikhonova NV, Baranov GA, Lesnichiy VV. (2007) Donosologiya (San Petersburgo) 2007; 1:32-54; Chen X, Kim P, Farinelli B, Doukas A, Yun SH, Gelfand jA, Anderson RR, Wu MX. (2010) PLoS One 5(10): el3776; WO 2009/044272). La iluminacion laser produjo un aumento significativo de la vacunacion modelo concomitante en ratones (Chen X.Kim P, Farinelli B, Doukas A, Yun SH, Gelfand JA, Anderson RR, Wu MX. (2010)PLoS One 5(10): el3776; WO 2009/044272). Se ha informado tambien de que el mismo parametro de laser, aplicado al punto de vacunacion, ha mejorado la respuesta a la vacunacion de la gripe, en pacientes sin respuesta a una vacuna de la gripe profilactica sin aplicacion de laser (Onikienko et al. (2007)). Tales tratamientos con laser parecen alterar la respuesta de las celulas cutaneas presentadoras de antfgeno, lo que resulta en un aumento de la respuesta serologica a la vacunacion en ratones, asf como la mejora observada en la respuesta inmunitaria a la vacuna de la gripe de pacientes sin respuesta (Onikienko et al. (2007); Chen et al. (2010)).
Los presentes inventores han seguido desarrollando este enfoque, y han demostrado que la iluminacion continua de un punto de vacunacion en la piel con un laser de potencia relativamente baja (ej. menos de aproximadamente 1 vatio) casi infrarrojo (ej. aproximadamente 1064 nm) de onda continua (CW) aumentaba la produccion de
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anticuerpos a la vacunacion en mayor medida que otros enfoques con laser; la iluminacion con un laser de 1064nm CW produjo un incremento 27 veces mayor (27,2 ± 11,4) en la produccion de anticuerpos a una vacuna de laboratorio (OVA a las 6 semanas) (esto puede compararse con un aumento de 8 veces (7,9 ± 27) provocado por un laser visible de 532 nm).
Como se demuestra aqrn, en un estudio de exposicion a la gripe (tamano de grupo experimental y control = 5-10) se observo que con un minuto de tratamiento con laser infrarrojo antes de la vacunacion de la gripe intradermica se reducfa la dosis de vacuna necesaria para proporcionar proteccion contra una exposicion letal a la gripe (solo se observo proteccion en el grupo de vacuna intradermica 1|jg + laser y el grupo de solo 10 |jg de vacuna intramuscular comparado con no proteccion en los grupos de solo 1 jg de vacuna intradermica y sin vacuna).
Los datos que se presentan aqrn indican ademas que a esas dosis la iluminacion no dano el tejido. Esto contrasta con metodos anteriores que (en algunos casos) provocaban expresamente dano tisular, en un intento por aumentar la absorcion (ej. como se describe en US2003/0078499, US2001/0050083, y US 2004/0236268).
Absorcion de energ^a dependiente de la longitud de onda de la luz en el tejido cutaneo
Como se describe aqrn, un laser casi infrarrojo de 1064 nm puede potenciar una vacuna de laboratorio en ratones de forma mucho mas eficiente comparada con luz laser de 532 nm. Los mecanismos concretos y las moleculas responsables del efecto adyuvante y la via de senalizacion para la estimulacion inmunitaria siguen siendo elusivos. Los procesos fotobiologicos, incluyendo la vision en animales y la fotosmtesis en las plantas, utilizan principalmente longitudes de onda que van de ultravioleta (UV, 300 nm) a casi infrarrojo (NIR, 900 nm), y las moleculas responsables de esas fotorrecepciones han sido bien estudiadas y caracterizadas durante decadas. De forma similar, los fotones del laser deben ser absorbidos por algunas moleculas para tener efectos biologicos.
Un cromoforo es una molecula que imparte algun color decidido al compuesto del que es ingrediente, y gobierna mecanismos de interacciones laser-tejido (Huang et al. (2009)). En la piel hay numerosos cromoforos posiblemente relacionados con el adyuvante laser. Es decir, cofactores tales como la flavina, el heme y los iones metalicos, representan tipicamente la absorcion en la region de longitud de onda azul del espectro visible; por ejemplo, la hemoglobina, la citocromooxidasa, los citocromos, las flavinas, las flavoprotemas y las porfirinas contienen esas fracciones. Esos cromoforos se presentan en la piel generalmente en una de dos formas: sistemas conjugados de electrones pi y complejos metalicos, dando como resultado la absorcion de un determinado espectro de luz (tfpicamente unos 450 nm) (Karu TI. (2008) Photochem Photobiol 84(5): 1091-9; Huang YY, Chen AC, Carroll JD, Hamblin MR. (2009) Dose Response 7(4): 358-83; Karu T. (1999) J Photochem Photobiol B 49(1): 1-17; Niemz MH. (2007) Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications (Biological and Medical Physics,Biomedical Engineering) 308). Otra clase de cromoforos cutaneos dominantes es la melanina, que presenta una amplia absorcion de la luz que va de 400 a 700 nm. Absorbe eficientemente la radiacion ultravioleta y transforma la energfa en calor para proteger el ADN en las celulas cutaneas (Meredith P, Riesz J. (2004) Photochem Photobiol 79(2): 2116). Finalmente, un componente omnipresente del sistema biologico, el agua, es tambien un cromoforo. El coeficiente de absorcion, una medida que muestra la fraccion de energfa absorbida de un haz de luz, del agua pura, oscila de
0. 03 a 0,06 cm-1 entre 760 - 1000 nm, y menos de 0,01 cm-1 a < 700 nm de haz de luz, indicando que el contenido casi infrarrojo e infrarrojo es fuertemente absorbido por el agua (Boulnois J. (1986) Lasers Med Sci 1(1): 47-66; Niemz MH.Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering) 308). Resumiendo, la absorcion de la luz en el tejido cutaneo viene determinada por los cromoforos, y por consiguiente depende de la longitud de onda de la luz que llega.
Las celulas dendnticas de la piel son un objetivo para la luz laser
Las celulas dendnticas (DCs) son las celulas presentadoras de antfgenos (APCs) mas potentes y versatiles y tienen un papel fundamental en la inmunidad adaptativa (Lanzavecchia A, Sallusto F. (2001)Curr Opin Immunol 13(3): 2918; Trombetta ES, Mellman I. (2005) Annu Rev Immunol 23: 975-1028;Mellman I, Steinman RM. (2001) Cell 106(3):255-8). Las DCs muestran una considerable heterogeneidad en su localizacion anatomica, su fenotipo de superficie y sus propiedades funcionales, pero las poblaciones de celulas dendnticas residentes en la piel, es decir celulas de Langerhans y celulas dendnticas dermicas, se posicionan en la piel y funcionan como centinelas inmunitarios. Las DCs residen en la piel, e incluyen celulas de Langerhans (LCs) y DCs dermicas, que son las APCs mas potentes en el sistema inmunitario (Nestle et al. (2009); Lanzavecchia A, Sallusto F. (2001) Curr Opin Immunol 13(3): 291-8;Trombetta ES, Mellman I. (2005) Annu Rev Immunol 23: 975-1028; Ruedl C, Koebel P, Bachmann M, Hess M, Karjalaincn K. (2000) J Immunol 165(9): 4910-6). Cuando encuentran un antfgeno extrano, emigran rapidamente a organos linfoides secundarios, en especial nodulos linfaticos de drenaje de la piel (skin-DLNs), para estimulara los linfocitos T naive o de memoria central, y provocar unas respuestas inmunologicas potentes y duraderas (Randolph GJ, Inaba K, Robbiani DF, Steinman RM, Muller WA. (1999) Immunity 11(6): 753-61). Cabe destacar que se ha considerado que la mayona de los actuales adyuvantes de vacunas y potenciales candidatos interactuan con las DCs en el punto de inyeccion de la vacuna, y colaboran en la absorcion del antfgeno y la migracion de DLNs. Esto provoca un aumento de la presentacion de antfgenos a los linfocitos T y una respuesta inmunitaria de larga duracion (Leroux-Roels G. (2010); Reed et al. (2009); Palucka K, Banchereau J, Mellman
1. (2010) Immunity 33(4): 464-78). Es interesante observar que se ha demostrado que la luz laser de baja potencia indujo la maduracion de DC cultivadas in vitro (Chen AC-H, Huang YY, Sharma SK,Hamblin MR. (2010) SPIE: 756504-7), y que un laser visible de potencia moderada aumentaba la migracion de DC en la piel, dando como
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resultado un incremento de la produccion de anticuerpos en ratones (Chen X, Kim P, Farinelli B, Doukas A, Yun SH, Gelfand JA, Anderson RR, Wu MX. (2010). Un nuevo adyuvante laser de vacuna aumenta la motilidad de las celulas presentadoras de antigeno. PLoS ONE 5(10): el3776). Por tanto, sin querer estar limitados por la teona, se postula que las DCs cutaneas son importantes objetivos para el laser adyuvante.
Vacunas y administracion de vacunas
Los metodos que se describen aqrn pueden ser utilizados con cualquier tipo de vacuna, contra un patogeno causante de enfermedad, incluyendo, entre otros, antigenos bacterianos, virales y parasitarios. Entre los ejemplos de vacunas se incluyen las vacunas de patogenos muertos contra la gripe, el colera, la peste bubonica, la polio, la hepatitis A y la rabia; las vacunas atenuadas, ej. contra la fiebre amarilla, el sarampion, la rubeola, las paperas, la viruela, el tifus y la tuberculosis micobacteriana; las vacunas toxoides, ej. contra el tetanos, la difteria (incluyendo la toxoide para las picaduras de la serpiente de cascabel); las vacunas subunit, ej. contra el virus de la hepatitis B, la vacuna de partfculas similares al virus (VLP) contra el virus del papiloma humano (HPV), y la peste; y vacunas conjugadas, ej. la vacuna de Haemophilus influenzae tipo B. En algunas realizaciones, las vacunas pueden incluir cualquier antigeno, ej. antfgeno de acido nucleico (ej. ARN o ADN) o protema (ej. polipeptido o peptido), y pueden ser intactas o desnaturalizadas.
En los metodos que se describen aqrn, la vacuna es administrada tras el tratamiento con laser, ej. en los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 30, 60, o 90 minutos siguientes al tratamiento con laser. De preferencia, la vacuna se administra inmediatamente despues del tratamiento con laser, ej. en los 5 minutos siguientes.
La vacuna se administra intradermica, en la piel que ha sido expuesta al tratamiento con laser o la inmediatamente adyacente. Las capas superiores de la piel contienen cantidades importantes de celulas dendnticas, lo que hace que esos tejidos sean los objetivos preferibles para la potenciacion por laser de la vacunacion. La vacunacion intradermica ha sido utilizada con exito en las campanas de vacunacion nacionales, incluyendo en Dinamarca, y ha demostrado producir una seroconversion equivalente en dos ensayos clmicos (Nirmal S, Cherian T, Samuel BU, Rajasingh J, Raghupathy P, John TJ. Vaccine 1998; 16(9):928-31; Mohammed AJ, AlAwaidy S, Bawikar S, Kurup PJ, Elamir E, Shaban MM, Sharif SM, van der Avoort Hg, Pallansch MA, Malankar P, Burton A, Sreevatsava M, Sutter RW. N Engl J Med 2010;362(25):2351-9).
Adyuvantes laser
En algunas realizaciones, los metodos descritos aqrn incluyen el uso de irradiacion basicamente no lesiva sin dolor o evidencia visible de inflamacion (ej. menos de aproximadamente 1 W) de una pequena zona (ej. menos de 0,5 cm) de la piel (ej. con luz laser), generalmente aplicada inmediatamente antes de la vacunacion en la misma zona de la piel. Un experto en la tecnica apreciara que los parametros de la radiacion aplicada pueden variar sin dejar de garantizar que la irradiacion (1) no produce un dano sustancial en la piel, y (2) aumenta efectivamente la respuesta inmunitaria de un paciente. De preferencia, la dosis aplicada no es dolorosa.
En los presentes metodos, la radiacion aplicada es de onda continua (CW) o pulsada correspondiendo sustancialmente a una longitud de onda optica unica. La longitud de onda central de la radiacion aplicada (ej. la longitud de onda a la que la radiacion aplicada es mas intensa) se selecciona generalmente para producir una variacion deseada en la respuesta inmunitaria de un paciente. En algunas realizaciones, la longitud de onda central es de aprox.1000-1200 nm, ej. aproximadamente 1040-1090, o 1050-1080 nm, o aprox.1060-1070 nm, ej. aproximadamente 1064 (ej. mas o menos aprox. 5, 10, 15, 20, o 25 nm, ej. 1064 +/- 15 nm). En algunas realizaciones, el lfmite inferior del posible rango de longitud de onda central de la radiacion aplicada es de 1064 nm o menos (ej. 1050 nm o menos, 1000 nm o menos, 950 nm o menos, 900 nm o menos, pero por lo menos 850 nm). En determinadas realizaciones, el lfmite superior del rango posible de la longitud de onda central de la radiacion aplicada es mas de 1064 nm (ej. 1100 nm o mas, 1150 nm o mas, pero no mas de 1200 nm).
En los metodos que se describen aqrn, la dosis total de irradiacion administrada al paciente es de 25 J/cm2 o mas
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(ej. 50 J/cm o mas, 75 J/cm o mas, 100 J/cm o mas, 200 J/cm o mas, 300 J/cm o mas, 400 J/cm o mas, 500 2 2 2 2 2 J/cm o mas, 600 J/cm o mas), hasta aproximadamente 1400 J/cm o menos (ej. 1200 J/cm o menos, 1000 J/cm ,
800 J/cm2o menos).
En algunas realizaciones, la potencia media, el tamano del haz y el tiempo de exposicion pueden seleccionarse para administrar una dosis total de radiacion determinada a un paciente, para mediar la respuesta inmunitaria del paciente a uno o mas antfgenos, evitando al mismo tiempo provocar danos importantes en la piel. Se pueden utilizar multiples combinaciones de potencia media, tamano de haz, y tiempo de exposicion para administrar la misma dosis total de irradiacion, y esos parametros pueden variar para alcanzar otros objetivos, tales como tiempos de tratamiento deseados, reducciones de los efectos secundarios fisiologicos de la radiacion aplicada (ej. apoptosis), y el grado de control sobre el lfmite entre tejido expuesto y no expuesto.
En algunas realizaciones, la energfa laser se puede administrar en una serie de pulsos donde la frecuencia del pulso optimiza el calentamiento de la piel. Dado que el tiempo de relajacion termica de la piel es de 700 (psec a 1 mseg y el tiempo de relajacion efectivo es unas 40 veces superior al tiempo de relajacion de un solo pulso (Choi B, Welch AJ. Analysis of thermal relaxation during laser irradiation of tissue. Lasers Surg Med 2001;29(4):351-9), el perfil termico en la piel puede ser optimizado cuando los pulsos son administrados a un maximo de cada 30-40 mseg y la
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duracion de los pulsos individuals es igual o inferior a esto. En un aspecto, el laser puede operar en duraciones de pulsos de 30-40 mseg en un ciclo de servicio del 50%.
En otra realizacion, las duraciones de los pulsos individuales pueden ser significativamente mas cortas que 30-40 mseg con el fin de controlar la difusion del calor y optimizar la administracion de la dosis, es decir, igual o por debajo del tiempo de relajacion termica de 700-1000 (psec). Al mismo tiempo, tales pulsos tendran una duracion significativamente superior que aquellos que pueden causar efectos fotoacusticos o fototermicos intensos, es decir, por encima de 1 pseg. En los metodos descritos aqm, las duraciones de los pulsos pueden ser 1-1000 psec con por lo menos 30-40 mseg entre pulsos.
Los expertos en la tecnica estan familiarizados con las estrategias de combinar duraciones de pulsos y repeticion de pulsos en formas que optimicen la administracion de energfa laser en la piel minimizando al tiempo la posibilidad de provocar danos o molestias. Tal combinacion de las duraciones de pulsos y frecuencias de pulso se utilizaran de una forma que acorte el tiempo requerido para administrar una dosis efectiva de luz (es decir, 25-1400 J/cm2) en el periodo de tiempo mas corto posible manteniendo al mismo tiempo la piel expuesta a una temperatura por debajo del umbral de dolor tfpico (es decir, unos 42-43°C).
Como un experto en la tecnica apreciara, el tiempo de exposicion total de la piel a la radiacion aplicada puede seleccionarse para garantizar que una dosis clmicamente efectiva de radiacion sea administrada, mientras que al mismo tiempo se asegure que se no produce un dano significativo en la piel. Por ejemplo, el tiempo de exposicion total puede ser de 10 segundos o mas (por ej. 30 segundos o mas, 60 segundos o mas, 120 segundos o mas, 180 segundos o mas, 240 segundos o mas), con un lfmite maximo de aprox. 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, o 4 minutos. Son preferentes exposiciones mas breves, por ej. 10-60 segundos.
La potencia media de la radiacion aplicada tambien puede seleccionarse para garantizar que se administre una dosis clmicamente efectiva sin apoptosis significativa. En algunas realizaciones, la potencia media de la radiacion aplicada es de 0,5 V o mas (por ej. 0,8 V o mas, 1,0 V o mas) y/o 5,0 V o menos (por ej. 4,0 V o menos, 2,0 V o menos).
La radiacion aplicada se administra tfpicamente en un haz con un area trans-seccional de 0,5 cm2 o menos (por ej. 0,3 cm2 o menos, por ej. aprox. 0,2 cm2, o aprox. 0,1 cm2) de forma que la densidad de potencia de la radiacion aplicada (radiacion) sea de 1,0 V/cm2 o mas (por ej. 0.1,0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 V/cm2 o mas), con un lfmite maximo de 25 V/cm2 o menos (por ej. 20 V/cm2 o menos, 10 V/cm2 o menos). En algunas realizaciones, la radiacion media es aprox. 1-7 V/cm2, por ej. aprox. 1-5 V/cm2, por ej. aprox. 2-6 V/cm2, por ej. aprox. 5 V/cm2.
En algunas realizaciones, el perfil de intensidad trans-seccional del haz de radiacion aplicado se puede ajustar, por ejemplo, para asegurar que las celulas expuestas reciban dosis similares de radiacion. En determinadas realizaciones, por ejemplo, el perfil de intensidad trans-seccional del haz aplicado puede ser sustancialmente en forma parabolica. Usando un haz parabolico de radiacion se puede reducir simultaneamente la sobreexposicion de determinadas celulas (por ej. cerca del centro del haz) y la infra-exposicion de otras celulas (por ej. cerca de los bordes del haz) que puede ocurrir con otras formas de haz (por ej. algunos haces Gaussian). Para garantizar que las celulas expuestas reciban dosis similares de radiacion aplicada, el perfil de intensidad trans-seccional del haz aplicado se puede ajustar mas de forma que las variaciones en la intensidad a lo largo del diametro del haz se reduzcan aun mas. Por ejemplo, el perfil de intensidad trans-seccional del haz puede ser ajustado (por ej. usando elementos opticos de filtrado espacial) para coincidir, lo mas exactamente posible, a un perfil cuadrado o 'plano'.
Se pueden usar diferentes dispositivos para administrar la radiacion aplicada a un paciente.
Esta divulgacion, a efectos de claridad y brevedad, describe el uso de diferentes fuentes de laser para administrar radiacion. Por ejemplo, existen sistemas laser portatiles de bajo coste que administran potencias apropiadas para mejorar la respuesta a las vacunas. La exposicion basada en laser tambien se puede combinar con tecnologfas de vacunas intradermicas de inyeccion con microaguja o inyector para aumentar la uniformidad de la vacunacion intradermica e identificar el impacto del tratamiento laser en la reduccion de la dosis de antfgenos en estos sistemas.
Se pueden usar distintas fuentes de laser para producir radiacion a los fines de esta divulgacion. En algunas realizaciones, por ejemplo, se pueden usar laseres basados en Nd (por ej. laseres Nd:YAG y/o Nd:YVO4) para producir radiacion. En determinadas realizaciones, se pueden usar laseres semiconductores (por ej. laseres basados en materiales semicondutores por capas incluyendo multiples laseres quantum well) para producir radiacion. Pueden seleccionarse laseres semiconductores, a traves de la eleccion sensata de materiales, para producir radiacion laser en una o mas longitudes de onda deseadas.
Aunque estas tecnologfas laser clmicamente seguras y bien reconocidas se han empleado en diversas aplicaciones medicas como laser in situ en queratomielosis (LASIK), lipolisis, depilacion, y terapia fotodinamica (PDT) durante decadas (ver por ej. Aronoff BL. (1997) J Surg Oncol 64(1):84-92; Krauss JM, Puliafito CA. (1995) Lasers Surg Med 17(2):102-59; Houk LD, Humphreys T. (2007) Clin Dermatol 25(5):434-42.;Niemz MH. (2007) Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering) p.308), su uso como adyuvante inmunologico no ha sido explorado hasta ahora. Los laseres infrarrojos pueden ser facilmente integrados en un dispositivo adecuado para el desarrollo comercial de forma bastante sencilla.
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Otros tipos de fuentes tambien se pueden utilizar para producir la radiacion adecuada. En particular, la radiacion que se administra a un paciente no necesita ser una radiacion uniforme. Por tanto, otras fuentes, incluyendo fuentes de LED, fuentes laser de diodo, fuentes fluorescentes, fuentes incandescentes, y fuentes de descarga, pueden producir radiacion adecuada para mediar la inmunidad. En algunas realizaciones, la longitud de onda central de la radiacion producida por estas fuentes se puede ajustar como se desee. Por ejemplo, la emision de las longitudes de onda de las fuentes de LED y de las fuentes de laser de diodo se puede controlar eligiendo los materiales usados en la fabricacion de las fuentes. Ademas, multiples elementos de fuentes diferentes (por ej. multiples LEDs, multiples diodos laser) se pueden combinar para producir fuentes de banda ancha que se pueden filtrar selectivamente segun se desee para producir radiacion en una longitud de onda central particular para administrar a un paciente. De forma similar, las fuentes incandescentes de banda ancha, fluorescentes, y de descarga pueden ser filtradas para producir radiacion en una longitud de onda central particular usando diversos elementos de filtrado optico perfectamente reconocidos.
EJEMPLOS
La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion descrita en las reivindicaciones.
Salvo que se indique otra cosa a continuacion, se usaron los siguientes metodos en los siguientes ejemplos.
Animales. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6J de siete semanas en Jackson Laboratory. Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones barrera espedficas libres de patogenos. Todas las mediciones se realizaron de forma ciega, (para grupos de control o experimentales), y todos los procedimientos se realizaron siguiendo la Polttica del servicio de salud publica sobre el cuidado humano de animales de laboratorio y aprobada por el Comite institucional de uso y cuidado animal del Hospital General de Massachusetts.
Laseres. Los laseres usados en estos experimentos fueron laser de ortovanadato de itrio dopado con neodimio en estado solido activado por diodo conmutado-Q (Nd:YV04) que emite luz a 532 nm (UP6G, RMI Laser LLC, Lafayette, CO); un laser Nd:YV04 emitiendo luz a 1064 nm (UPloG, RMI Laser LLC, Lafayette, CO); o un laser de fosfuro de indio que emite luz a 1470 nm (SemiNex Laser Co, Peabody, MA). Los parametros de los laseres se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Parametros de los laseres
Parametros laseres
Pulso verde Pulse Pulso NIR* NIR* CW Pulso MIR**
Tipo de laser
Laser Nd:YVO< (Laser UP6G, RMI) Laser Nd:YVO< (Laser UP10G, RMI) Laser Nd:YVO< (Laser UP10G, RMI) Fosfuro de indio (Laser SemiNex)
Longitud de onda
532 nm 1064 nm 1064 nm 1470 nm
Potencia media
0,2V 1,0V 1,0V 1,0V
Tamano del haz
5 mm (circular) 5 mm (circular) 5 mm (circular) 5 mm (cuadrado)
Area del haz
0,2 cm2 0,2 cm2 0,2 cm2 0,25 cm2
Perfil del haz
Parabolico+ Parabolico+ Parabolico+ Plano
Densidad de potencia
1,0 V/cm2 5,0 V/cm2 5,0 V/cm2 4,0 V/cm2
Duracion de pulso
10 nseg 10 nseg N.A. 5 o 15 mseg
Frecuencia
10 kHz 10 kHz CW 6 r 20 Hz
Tiempos exposicion (seg)
60, 120, 240 60, 120, 240 60, 120, 240 300
Dosis (J/cm2)
60, 120, 240 300, 600, 1200 300, 600, 1200 120
*NIR: infrarrojo cercano **MIR: infrarrojo medio
+El haz parabolico es 50-100% mas intenso en el centro que en el borde
Como muestra la Tabla 1, estos laseres producen pulsos laser con duracion de 10 nanosegundos (ns) - 15 milisegundos (ms) con una periodicidad de 1-10 kHz. La potencia media es de 200 - 1000 mV. El area de exposicion sobre la piel es aprox. de 0,2 cm2. Los tiempos de exposicion para el raton fueron de unos 1-4 minutos. Durante la exposicion al laser, la temperatura de la piel superficial fue controlada con un termometro infrarrojo o un captador de imagenes termicas para supervisar el dano en la piel relacionado con el calor.
Iluminacion laser. Los experimentos fueron realizados usando un laser de ortovanadato de itrio dopado con neodimio (Nd:YVO4) que emitfa luz a 1064 o 532 o nm. A 1064 nm, el laser produce ya sea en onda continua (CW) o corta, pulsos de laser de una duracion de nanosegundos (PW) con una periodicidad de 10 kHz, mientras que a 532 nm produce solo PW. La potencia de salida media se determino mediante un medidor de potencia para cada iluminacion (S302C, Thorlabs). El perfil del haz fue conformado para que fuera relativamente plano, con menos de
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un 50% de variacion en la intensidad del haz desde el centro hasta el borde. El tamano del punto de laser en la piel era de aprox. 5 mm, resultando un area expuesta de aprox. 0,2 cm. Una semana despues de la importacion, se retiro el pelo del raton de la iluminacion/vacunacion. Se anestesiaron los ratones mediante inyeccion intramuscular con un coctel de 90 mg de quetamina (Parke-Davis) y 9 mg de xilacina (Fermenta) por kg de peso corporal. Se rasuraron los lomos de los ratones y se retiro el pelo restante usando un depilatorio habitual del comercio (Nair, Church & Dwight Co.). Al dfa siguiente, se anestesiaron los ratones, se colocaron en una platina y se ilumino la piel rasurada con el laser. La piel del lomo fue dividida en cuatro areas en cada raton. Se utilizo un punto de inyeccion para la vacuna de la gripe. La temperatura de la piel fue controlada y medida durante el proceso usando un captador de imagenes termicas por infrarrojos (FLIR Systems). El campo iluminado sobre la piel fue demarcado con un marcador permanente inmediatamente despues de cada iluminacion laser para asegurar una inyeccion reproducible de la solucion de la vacuna en cada punto iluminado.
Estudio de danos en la piel mediante inspeccion visual e histologia. Para determinar una dosis no danina en el tejido de cada parametro laser, la piel tratada con laser se evaluo en una forma dependiente del tiempo mediante inspeccion visual e histologfa. Los ratones recibieron iluminacion laser CW o PW 1064 nm o PW 532nm en la piel del lomo durante tres minutos. La temperatura de la piel superficial fue controlada con un captador de imagenes termicas por infrarrojos (FLIR Systems). Se evaluaron los danos en la piel a los 0, 1,2, y 4 dfas despues de la iluminacion mediante inspeccion visual e histologfa. Se considero que las radiaciones maximas seguras eran aquellas en las que la temperatura de la piel no supero los 42° C durante la exposicion y para las cuales no se observaron danos aparentes visibles o microscopicos en la piel en ningun momento de la evaluacion post- exposicion. En cuanto a la histologfa de la piel, los ratones fueron fijados por perfusion con un 4% (p/v) de paraformaldehndo a las (antes de la iluminacion laser), 3, 6, 24, 48, y 96 horas despues de la iluminacion laser. La piel iluminada fue extirpada e introducida en parafina. Las secciones (5 pm de espesor) fueron tenidas con H & E y examinadas por el Dr. Roderick Bronson de la Harvard Medical School para buscar danos tisulares microscopicos y respuestas inflamatorias.
Tincion de TUNEL. Se realizo una tincion de TUNEL sobre secciones de piel de 5 pm de espesor preparadas segun se ha descrito en la seccion anterior usando el Kit In situ Cell Death Detection TMR Rojo (Roche Applied Science). Se visualizaron los portaobjetos con microscopia confocal (Carl Zeiss LSM5 Pascal, Carl Zeiss Norteamerica).
Administracion de ovoalbumina. Se administro a los ratones una inyeccion intradermica de ovoalbumina purificada cromatograficamente (OVA, 10 pg en 10 pl de solucion salina, 4 puntos, 40 pg en total, Worthington Biochemicals), que se determino que contema menos de 1,75 EUmg-1 de endotoxina usando un kit de ensayo de lisado de amebocito limulus (Cambrex Bio Science). Los ratones de control recibieron una inyeccion intradermica de OVA sola sin iluminacion laser precedente. Los ratones de control no vacunados se trataron simuladamente pero no recibieron inyeccion de OVA ni iluminacion laser. El adyuvante estandar, alumbre (Imject® Alum, Thermo- Fisher) se uso como control positivo. Las muestras de sangre y suero fueron extrafdas de los ratones a las 3, 6 y 12 semanas post-vacunacion para la evaluacion de la inmunidad humoral frente a OVA. Se recogieron las muestras via sangrado retro-orbital bajo anestesia con quetamina y xilacina. Se sometio a los animales de control a un procedimiento simulado en el cual fueron anestesiados y rasurados como antes, pero sin aplicar laser.
Administracion del virus de la gripe. Los ratones recibieron una dosis de laser en un solo punto de vacunacion y fueron despues inyectados intradermicamente con 1 pg del virus de la gripe inactivado completo A/PR/8/34 (H1N1) (1 pg en 10 pl de solucion salina, Charles River Avian Vaccine Services) con o sin 10 pg de ftpido monofosforil A (VacciGrade™, un preparado de grado preclrnico de MPL, InvivoGen) o alumbre (Imject® Alum, preparado de forma que el ratio de volumen final de Imject Alum para immunogenicidad es 1:1, Thermo-Fisher). Los controles negativos y positivos incluyeron la inyeccion del vehfculo de la vacuna y la vacunacion intradermica o intramuscular con una dosis de 1 pg, respectivamente. Las muestras de sangre se extrajeron a las 4 semanas post-vacunacion o a los 4 dfas post-exposicion con aplicacion intranasal del virus de la gripe 4 semanas despues de la vacunacion para determinar la produccion de anticuerpos espedficos del virus de la gripe.
Ensayos ELISA para la cuantificacion de anticuerpos anti-OVA y anti-virus de la gripe. Se cubrieron durante la noche 2 placas de fondo plano HB Immulon™ (Thermo-Fisher) con 1 pg de OVA a una concentracion de 5 pgml1 o 0,2 pg del virus de la gripe inactivado a 1 pgm. Las muestras sericas de raton diluidas serialmente se anadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora en las placas cubiertas y cerradas. Las inmunoglobulinas unidas fueron detectadas con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante apropiado (anticuerpo de cabra a IgG de raton [1:10,000, Sigma-Aldrich]; anticuerpo de rata a IgGI de raton [1:4,000, SouthemBiotech]; anticuerpo de rata a IgG2b de raton [1:500, SouthemBiotech]; anticuerpo de cabra a IgG2c de raton [1:4,000, SouthemBiotech]; anticuerpo de cabra a IgA de raton [1:1,000, Sigma-Aldrich]). Al final de la primera hora de incubacion, se anadio el sustrato TMB (Thermo Scientific Pierce 1-Step Ultra TMB, Thermo-Fisher) y se paro la reaccion con acido sulfurico 2 N.
La reproducibilidad del ensayo de determino mediante la aplicacion de IgG anti-ovoalbumina de raton (Sigma- Aldrich) o suero de raton hiperinmune al virus de la gripe en cada placa, medimos la absorcion a 450 nm usando un lector ELISA (lector de placas TECAN Sunrise™, TECAN). Para tftulos de anticuerpos a OVA, se determino un tftulo de anticuerpos de punto final definido estadfsticamente tal como se ha descrito previamente. Para tftulos de anticuerpos para el virus de la gripe, se designo un tftulo como dilucion serica correspondiendo a una mitad de la actividad maxima.
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Ensayo ELISA para la cuantificacion de anticuerpos IgEs anti-virus de la gripe. Se cubrieron durante la noche 2 placas de fondo plano HB Immulon™ (Thermo-Fisher) con 2 jg del virus de la gripe inactivado en 10 |jgml1. Las muestras de suero de raton diluidas serialmente se anadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora en las placas cubiertas y cerradas. Se detectaron inmunoglobulinas unidas con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante apropiado (anticuerpo de rata a IgE de raton [1:1,000, SouthemBiotech] seguido por el uso de un Sistema de amplificacion ELAST ELISA (Perkin Elmer). Despues se anadio el sustrato TMB (Thermo Scientific Pierce 1-Step Ultra TMB, Thermo-Fisher) y se paro la reaccion con 2 N de acido sulfurico. La reproducibilidad del ensayo fue evaluada mediante la aplicacion de un suero de raton inmunizado con virus de la gripe inactivado con adyuvante de alumbre en cada placa, medimos la absorcion a 450 nm usando un lector ELISA (lector de placas TECAN Sunrise™, TECAN). Para los tttulos de anticuerpos para el virus de la gripe, se determino un tftulo de anticuerpos de punto final definido estadfsticamente tal como se ha descrito previamente (Frey, A., et. al., A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. JImmunol Methods 221,35-41 (1998).
Titulacion de la inhibicion por hemoaglutinacion (HAI) para cuantificar los anticuerpos neutralizantes antivirus de la gripe. Se analizaron sueros de raton para un tftulo HAI por Charles River Avian Vaccine Services como se ha descrito previamente (Matsuoka, Y., et al., Curr Protoc Microbiol Chapter 15, Unit 15G 13 (2009); Szretter,
K.J., et al., Curr Protoc Microbiol Chapter 15, Unit 15G 11 (2006)). Todos los ensayos fueron realizados de forma ciega para el operador.
Estudio de la exposicion al virus de la gripe. El virus de la gripe A A/PR/8/34 (H1N1) usado en este estudio fue adquirido en Charles River Avian Vaccine Services. Se anestesiaron los ratones con quetamina/xilacina, y se expusieron intranasalmente con A/PR/8/34 a una dosis infecciosa de huevo 50% (EID50) de 1,5 x 106 que equivale a 3 x 103 (MLD50) 50% de dosis letal de raton en 30 jl de solucion salina. Se monitorizo la supervivencia y el peso corporal durante los dfas posteriores a la exposicion. Se considero que los ratones que mostraban una postura encorvada, pelaje rugoso, una perdida de peso corporal superior al 20%, o que no habfan comido o bebido habfan alcanzado el punto final experimental y fueron sometidos a eutanasia. Los tttulos MLD50 fueron determinados por la inoculacion de los grupos de ratones intranasalmente con diluciones en serie del virus usando la formula Reed- Muench como se ha descrito anteriormente (Matsuoka, Y., et al., Curr Protoc Microbiol Chapter 15, Unit 15G 13 (2009); Szretter, K.J., et al., Curr Protoc Microbiol Chapter 15, Unit 15G 11 (2006)).
Titulacion del virus en homogenado pulmonar.
Cuatro semanas despues de la inmunizacion inicial, los ratones fueron sometidos a A/PR/8/34 como se ha descrito anteriormente. Cuatro dfas despues de la exposicion, los ratones se sometieron a eutanasia con dioxido de carbono, y se aislaron y pesaron los pulmones. Despues de anadir PBS para una suspension al 10% (p/v), el pulmon aislado fue homogenado usando un sistema de mortero desechable (Fisher Scientific). La dosis infecciosa de huevo 50% (EID50) se determino mediante titulacion serial del homogenado pulmonar en los huevos por Charles River Avian Vaccine Services. En resumen, las diluciones seriales de los homogenados tisulares fueron inoculadas en los huevos, y los valores EIDscml'1 fueron calculados segun el metodo de Reed and Muench. Todos los ensayos se realizaron de forma ciega para el operador.
Estimulacion de esplenocitos y tincion de citoquinas intracelular para respuesta anti-OVA y virus de la gripe.
Cuatro dfas despues de la exposicion tal como se ha descrito anteriormente (cuatro semanas despues de la inmunizacion inicial), se cultivaron los esplenocitos de un raton individual, y los eritrocitos fueron lisados usando un tampon ACK. Los leucocitos se resuspendieron en un medio RPMI 1640 y se incubaron durante 5 horas en presencia de un inhibidor de la funcion de Golgi (Golgi plug, BD Biosciences), y 1 jgml-1 de OVA o virus de la gripe MHCI Clase I (OVA [257 - 264] SIINFEKL (ID SEC NO. 1) o virus de la gripe A NP [366 - 374] ASNENMETM (ID SEC NO. 2)), y peptidos II (OVA [323-339] ISQAVHAAHAEINEAGR (ID SEC NO. 3) o virus de la gripe A NP [311 - 325] QVYsLiRPnENPAHK (ID Sec NO. 4)) para la estimulacion de los linfocitos T. Se realizo una tincion de superficie multi-parametros para CD3s, CD4, y CD8a, (CD3e: clon 145-2C11; CD4: clon RM4-5; CD8a: clon 53-6.7, bD Biosciences), seguida de la fijacion, permeabilizacion en solucion BD Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences) segun las instrucciones del fabricante y tincion celular para IFN-y o IL-17A o IL-5 (IFN-y: clon XMG1.2; IL-17A: TCI 1- 18H10 o IL-5: TRFK5, BD Biosciences). Se estimulo el control positivo con PMA/Ionomicina. Se realizo una citometna de flujo en un Laser BD 4 LSRII (BD Biosciences). Las subpoblaciones celulares, incluyendo OVA- o virus de la gripe espedfico IFN-y o IL-17A o IL-5 que producen celulas auxiliares T CD3+CD4+ y celulas citotoxicas T CD3+CD8+ se cuantificaron como porcentaje en celulas viables totales por citometna de flujo. El analisis se completo usando el software BD FACSDiva™ 6.0 (BD Biosciences) y el gating se completo usando un metodo de 'fluorescencia menos uno' (FMO).
Analisis estadistico. Los tests estadfsticos se realizaron bajo la supervision de una bioestadfstica, la Dra. Musie Ghebremichael del Ragon Institute en Massachusetts General Hospital. Se determinaron los tamanos de las pruebas apropiados y los metodos estadfsticos. El U-test Mann Whitney para la comparacion de los valores numericos entre dos grupos. El test Kruskal- Wallis se uso para las comparaciones de mas de tres grupos. La comparacion de supervivencia se hizo usando el test Gehan-Breslow-Wilcoxon. Los datos fueron agrupados a partir de al menos dos experimentos independientes, salvo indicacion contraria a lo mencionado.
Ejemplo 1. Parametros del laser no danino para los tejidos
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Se establecio una dosis no danina para los tejidos para los laseres visibles previamente usados e infrarrojos cercanos (“NIR”). A lo largo de este estudio se uso un laser de ortovanadato de itrio dopado con neodimio (Nd:YV04). A 1064 nm, el laser produce ya sea pulsos de onda continua (CW) o de duracion de nanosegundos (PW) con una periodicidad de 10 kHz, mientras que a 532 nm solo produce PW. Se conformo el perfil del haz para que fuera relativamente plano, con menos de una variacion del 50% en la intensidad del haz del centro al borde. El tamano del punto de laser sobre la piel fue de aprox. 5 mm, resultando en un area de exposicion de aprox. 0,2 cm2. Se evaluaron los danos en el tejido por inspeccion visual e histologfa tras la iluminacion del laser. Los ratones recibieron iluminacion laser de onda continua (CW) o pulsada en nanosegundos (PW) 1064 nm o PW 532nm en cuatro areas de la piel rasurada y depilada durante tres minutos. La temperatura de la superficie de la piel se controlo con un termometro de infrarrojos. (FIG. 1 A-C, columnas de la izquierda) Interacciones de dosis-temperatura del laser PW 532 nm, laser PW 1064 nm, y laser CW 1064 nm en la piel del raton. 200mV (1 V/cm-2) para los laseres PW 532 nm y 1000 mV (5 Vcm-2) para los PW y CW 1064 nm son las dosis maximas que no alcanzan el umbral de danos en la parte inferior de la espalda (42°C), n = 1-4 para cada grupo. 5,0 Vcm-2 se identifico como la radiacion maxima segura tanto para el laser 1064 nm PW como CW, y 1,0 Vcm-2 para el laser PW 532 nm (FIG. lac) Imagenes (FIG. 1A-C, columnas de la derecha) del lomo del raton para inspeccion visual a las 0 y 24 horas despues de la iluminacion laser cutanea. No se observaron danos visibles como se evidenciana por eritema, edema tisular o moratones, detectados si la potencia es inferior a 200mV para los laseres PW 532 nm y 1000 mV para PW y CW 1064 nm. Las cabezas de flecha demuestran el dano visible en la piel, n =1-4 para cada grupo. Se presentan las imagenes representativas de cada grupo.
Con el laser pulsado 532 nm (ancho de pulso 10 ns, 10 kHz), no se observo dano o inflamacion significativos, ni apoptosis (FIG. 2A), hasta los 200 mV (1000 mV/cm2). Con el laser de onda continua de1064 nm (CW) o pulsado (ancho de pulso 10 ns, 10 kHz), no se observo dano, apoptosis (FIG. 2B), ni inflamacion a 1000 mV (5000 mV/cm2). Las FIG. 2A y 2B son un conjunto de fotomicrograffas que muestran los danos microscopicos mediante los parametros no daninos para los tejidos del adyuvante del laser. Se evaluo el dano en la piel a las 0, 6, 24 horas despues de la iluminacion laser mediante histologfa. Se muestran las imagenes del transcurso de tiempo de la histologfa de la piel del raton con 4 min de PW 532 nm (200 mV) y 4 min de CW 1064 nm (1000 mV). Se evaluaron los danos en la piel a las 0, 6, 24 horas despues de la iluminacion laser mediante histologfa. Las 3 columnas de la izquierda muestran imagenes del tejido de la piel tenido con TUNEL. Se tineron secciones del bloque de parafina de cinco micras de espesor usando el Kit Cell Death Detection TMR Rojo (Roche). Las celulas apoptopicas se tineron de rojo, los nucleos se identificaron mediante tincion de contraste usando tinteTo-Pro-3 (azul). No se observaron danos en ningun momento temporal determinado. La barra indica 50 pm. Las columnas mas a la derecha de las FIG. 2A-B muestran imagenes del tejido de la piel tenido con hematoxilina-eosina. No se observo respuesta de danos o inflamatoria tal como se evidenciana por infiltracion celular leucocitaria y mononuclear en ningun momento temporal determinado usando esta metodologfa. La barra indica 50 pm (a-c) n = 2-4 para cada grupo. Se presentan las imagenes representativas de cada grupo.
Ejemplo 2. Evaluacion del adyuvante laser usando un modelo de vacuna de laboratorio OVA
Para determinar si el tratamiento con laser podna mejorar las respuestas inmunes en ratones, los ratones recibieron primero exposiciones de 1- o 4-min al laser CW o PW 1064 nm o PW 532 nm en el punto de vacunacion subsiguiente. Despues de la exposicion, los ratones recibieron una inyeccion intradermica (i.d.) de 40 pg de ovoalbumina (OVA). (OVA, Worthington Biochemicals, 10 pg en 10pl solucion salina en 4 puntos, 40 pg en total). Se uso alumbre (Imject, Fisher-Thermo) como adyuvante de control positivo.
Los grupos experimentales fueron los siguientes:
4 min laser + OVA (40 ug) i.d.
1 min laser + OVA (40 ug) i.d.
OVA (40 ug) + alumbre i.d.
OVA (40 ug) + alumbre i.m.
OVA (40 ug) i.d. solo
Los tftulos de anticuerpos para OVA fueron medidos mediante ELISA para IgG espedfica OVA a las 3, 6, y 12 semanas despues de la vacunacion. Una co-inyeccion de alumbre con OVA sirvio como controles positivos. El tttulo de anticuerpos del grupo de laser de 4-min PW 532 nm fue significativamente mayor que el de los controles sin adyuvante a las 6 semanas (Fig. 3). Sin embargo, su efecto adyuvante fue significantemente menor comparado con los controles de adyuvante de alumbre. Ambas dosis de laser PW 1064 nm con parametros comparables a los grupos del laser PW 532 nm mostraron un numero significativamente mas elevado de tftulos de anticuerpos que los controles sin adyuvante a las 6 semanas. Notablemente, el tratamiento laser de 1-min CW 1064 nm indujo al tttulo de anticuerpos mas alto que fue equivalente al de los controles con adyuvante de alumbre, y significativamente mas alto que los controles sin adyuvante y el grupo de laser PW 532 nm en todos los momentos temporales.
Ejemplo 3. Efecto del adyuvante laser en el modelo de vacunacion de la gripe murina
Para determinar si un laser infrarrojo puede mejorar una respuesta inmunitaria a las vacunas y si puede conferir una proteccion adecuada contra los patogenos, se uso un modelo de raton de infeccion con gripe para demostrar la
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capacidad del adyuvante laser infrarrojo para proporcionar inmunidad protectora frente a un patogeno. Los ratones fueron preparados y expuestos al laser tal como se ha descrito anteriormente, usando los laseres Nd:YVO4 a 532 nm (pulsado) y l064 nm (onda continua), y 1460 nm (pulsado). Los ratones C57BL/6J recibieron una dosis de laser en un solo punto de vacunacion y se les inyecto i.d. con 1 |jg del virus de la gripe totalmente inactivado A/PR/8/34 (Charles River Avian Vaccine Services, 1 jg en 10 jl solucion salina) con o sin iluminacion laser, ftpido monofosforil A (MPL) o alumbre. La vacunacion intramuscular (i.m.) con 1 jg de dosis de la vacuna sirvio como control positivo. Se analizo la produccion de anticuerpos espedficos de la gripe mediante medicion de los tftulos de IgG total y sus subclases con ELISA y el ensayo de inhibicion de hemoaglutinacion del virus de la gripe (HAI). Se tomaron muestras despues del dfa 28 tras la inmunizacion y a los 4 dfas post-exposicion con una aplicacion intranasal del virus de la gripe (1,5 x 106 dosis infecciosa de huevo 50% por raton) 4 semanas despues de la vacunacion.
La FIG. 5A-C demuestra los tftulos de isotipo IgG espedficos de la gripe en suero en estado post-exposicion (4 dfas despues de la exposicion). La FIG. 4A-C tftulos subclase IgG en estado pre-exposicion (4 semanas despues de la vacunacion). (FIG. 4A y 5 A) tftulos IgG, (FIG. 4B y 5B) tftulos IgG1, (FIG. 4C y 5c) tftulos IgG2c. Grupos de control y experimentales: sin vacunacion en estado post-exposicion (FIG. 5A-C: n = 25) y pre-exposicion (FIG. 4A-C: n = 38), no-adyuvante (inyeccion i.d.de vacuna de la gripe, FIG. 5A-C: n = 31; FIG. 4A-C: n = 49), tratados con laser 4min PW 532 nm (inyeccion i.d. de la vacuna de la gripe con tratamiento laser, FIG. 5A-C: n = 13; FIG. 4A-C: n = 26), tratado con laser 1-min CW 1064 nm (FIG. 5A-C: n = 34; FIG. 4A-C: n = 52), inyectado con alumbre i.d. (FIG. 5A-C: n = 12; FIG. 4A-C: n = 12), inyectado i.d.-MPL (FIG. 5A-C: n = 12; FIG. 4A-C: n = 12), grupos inyectados i.m (inyeccion i.m. de vacuna de la gripe, FIG. 5 A-C: n = 16; FIG. 4A-C: n = 24), respectivamente. Todos los procedimientos se realizaron siguiendo la Polftica del servicio de salud publica sobre cuidado humano de animales de laboratorio y aprobada por el Comite institucional de uso y cuidado de animales del Massachusetts General Hospital.
En la post-exposicion, el laser CW 1064 nm aumento significativamente los tftulos de IgG, IgG1 e IgG2c comparado con el grupo sin adyuvante. Estos datos respaldan la opinion de que el tratamiento de laser CW 1064 nm aumenta el mix de respuesta inmunitaria de Th1 y Th2. El grupo de laser PW 532 nm mostro elevaciones mas pronunciadas en los tftulos de IgG2c que los controles sin adyuvante, lo que sugiere que este parametro de laser aumenta la respuesta inmunitaria de Th1-sesgada. Como muestra la literatura, el alumbre indujo la respuesta inmunitaria de Th2-sesgada con subclase de anticuerpos celulo-dependientes Th2 (IgG1). Los tftulos de IgG y IgG2c inducidos por el adyuvante laser fueron superiores a los dos adyuvantes autorizados (alumbre y MPL). La eficacia del adyuvante alumbre es mas alta que la del adyuvante laser en los tftulos de IgGl, pero la respuesta inmunitaria de Th2-sesgada por este adyuvante esta conectada a la hipersensibilidad mediada por IgE (ver FIG. 9). En la pre-exposicion, el grupo de laser CW 1064 nm mostro aumento significativo de los tftulos de IgG, IgG1 e IgG2c con respecto a los controles sin adyuvantes, pero todos los demas diferenciales que vimos en el estado post-exposicion no estaban claros en este punto de tiempo particular. En conjunto, el adyuvante laser es apto para inducir una respuesta inmunitaria comparable a los adyuvantes autorizados.
Los tftulos HAI sericos, como medicion estandar de anticuerpos neutralizantes a la vacunacion con virus de la gripe, tienden a ser superiores en los grupos de laser CW 1064 nm y PW 532 nm que en los grupos de control sin adyuvante e inyectados i.d. MPL, y tambien comparables a aquellos grupos con inyeccion i.d de alumbre e inyectados i.m. Los resultados demostrados en la FIG. 6 sugieren que el adyuvante laser es apto para inducir una respuesta inmunitaria de anticuerpos comparable al adyuvante autorizado y a la via convencional de vacunacion de la vacuna de la gripe.
Ejemplo 4. Efecto del adyuvante laser en las respuestas inmunitarias celulares sistemicas
La inmunidad mediada por celulas es crftica para la proteccion del virus de la gripe. Para determinar si el laser provoca respuestas inmunitarias celulares sistemicas, se aislaron esplenocitos y reestimularon a partir de la exposicion al virus de la gripe a los ratones ex vivo con peptidos del virus gripal, y despues se evaluo la expresion de citoquinas en las subpoblaciones de linfocitos T por citometna de flujo.
Se determinaron las respuestas inmunitarias celulares sistemicas del cultivo de 5 h-de esplenocitos despues del aislamiento de los ratones vacunados y no vacunados a los 4 dfas despues de la exposicion y reestimulacion a la nucleoprotema de un peptido espedfico del virus gripal (NP) MHC clase I (NP 366- 374). Las celulas CD4+IFN-y+ T- espedficas del virus gripal asf como las subpoblaciones CD4+IL-5+ inducidas con un peptido clase II MHC fueron significativamente superiores en el grupo tratado con laser 1064 nm (FIG. 8a, b). Estos datos son coherentes con el punto de vista de que el tratamiento con laser CW 1064 nm aumenta el mix de respuesta inmunitaria de Thl y Th2, revelado por el analisis de subclase de IgG (FIG. 4 y 5). Como muestra la literatura, MPL indujo la respuesta inmunitaria Thl-sesgada como CD4+IFN-y+ espedfica del virus gripal, pero no de CD4+IL-5+, la subpoblacion de linfocitos T estaba significativamente aumentada. Ni la respuesta celular de CD4+IL-17+ ni CD8+ IFN-y+ T era significativamente mas alta en cualquiera de los grupos experimentales determinados (FIG. 8c, d). Estos datos demuestran que el laser CW 1064 nm aumenta la respuesta inmunitaria de Thl y Th2, pero no de Thl7 o linfocitos T citotoxicos en la vacunacion con el virus de la gripe. Estos datos demuestran que el tratamiento con laser indujo una solida respuesta inmunitaria celular sistemica a la vacunacion con el virus de la gripe inactivado sin usar ningun adyuvante adicional.
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La FIG. 9A demuestra los graficos de supervivencia de Kaplan-Meier de los ratones vacunados tras la exposicion letal. La supervivencia del grupo tratado con laser CW 1064 nm fue significativamente mejor que en los grupos no vacunados sin adyuvante y tratados con laser PW 532 nm.
El tratamiento con laser 10 CW 1064 nm conferina uniformemente una inmunidad protectora mejor frente a la exposicion viral que el laser PW 532 nm, con vacuna i.d. sola, y sin vacuna, determinado por la medicion del tiempo de supervivencia despues de la exposicion viral. (FIG. 9A).
La FIG. 9B demuestra el efecto del adyuvante laser en la eliminacion viral. La dosis infecciosa de huevo 50% (EID50) fue determinada por titulacion serial del homogenado pulmonar en los huevos a los 4 dfas despues de la exposicion. El grupo del laser CW 1064 nm mostro un descenso marcado en los tttulos virales en pulmon de un factor de 1024, 10r7 y 1020 comparado con los grupos tratados con laser PW 532 nm, control sin vacunacion, control sin adyuvante, respectivamente, el dfa despues de la exposicion (FIG. 9B).
Ejemplo 5. Efecto del adyuvante laser en el modelo de vacunacion del virus de la gripe murina (IgE)
Tttulos sericos de IgE espedficos del virus de la gripe en estado post-exposicion (4 dfas despues de la exposicion). Los ratones fueron vacunados via inyeccion i.d. o i.m. con el virus de la gripe inactivado (A/PR/8/34) con o sin iluminacion laser, lfpidos monofosforil A (MPL) o alumbre. Grupos experimentales y de control: sin vacunacion (n = 8), sin adyuvante (inyeccion i.d. de vacuna gripal, n = 8), tratados 1-min con laser CW 1064 nm (inyeccion i.d. de vacuna gripal con tratamiento laser, n = 11), inyeccion i.d.- de alumbre (n = 12), inyeccion i.d de MPL (n = 12), grupos inyectados i.m.(inyeccion de vacuna gripal, n = 8), respectivamente. (FIG. 9) El adyuvante alumbre esta conectado con la produccion de IgE y posiblemente con hipersensibilidad, pero no con el adyuvante laser.
Ejemplo 6. Adyuvante laser para mejorar la respuesta inmunitaria a la vacuna de la polio
Aunque se han realizado progresos significativos en virtud de la iniciativa para la Erradicacion mundial de la polio liderada por la Organizacion Mundial de la Salud, la poliomielitis sigue siendo endemica en el Sur de Asia y Nigeria y es una enfermedad infantil temida en estas zonas. La vacuna de la polio oral (OPV) y la vacuna de la polio inactivada (IPV) han reducido drasticamente la incidencia de la poliomielitis durante los ultimos 50 anos, pero ambas vacunas presentan claras limitaciones en la completacion de la tarea de inmunizacion. La IPV requiere cuatro vacunaciones e induce solo una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos frente al virus y no un efecto protector contra la infeccion viral a traves de la superficie mucosal. El requisito de las cuatro vacunas dificulta mas completar el protocolo de vacunacion y el resultado es la erradicacion incompleta de la enfermedad en la comunidad. La OPV induce inmunidad mucosal y confiere una buena proteccion. Sin embargo, la posibilidad de persistencia viral y la reversion a un tipo salvaje virulento plantea preocupaciones de seguridad con respecto a la OPV.
Se utilizo laser de onda continua Nd:YV04 emitiendo luz a 1064 nm. El laser
ilumina una pequena area de la piel (unos 0,2 cm2) y genera un maximo de 2 vatios. Se uso una vacuna de la polio inactivada en un modelo de raton establecido TgPVR21 o en un modelo de raton ICR, la cepa de origen de los ratones transgenicos TgPVR21 usados en los estudios de proteccion de la vacuna de la polio (Nagata N et al., Virology 2004;321(1):87-100).
Se establecio que la potencia de laser maxima que, durante la exposicion de un minuto en la piel del lomo rasurado de un raton ICR, no eleva la temperatura de la superficie de la piel por encima de los 43°C (temperatura umbral para sensacion de dolor en humanos). Como se ha descrito antes, este nivel de dosis es no danina para la piel del raton basado en la inspeccion histologica y visual exhaustiva. Los grupos de ratones fueron tratados con una serie de exposiciones de hasta un minuto a la potencia del laser con reduccion gradual (por ej. 1.0 Vatios, 0,8 V, 0,6 V, 0,4 V) a lo que despues siguio inmediatamente la vacunacion intradermica con poliovirus inactivados (1 |jg en 10 jl de solucion salina). Se obtuvieron las muestras de sangre a las 0, 3, 6, y 12 semanas post-vacunacion y se cuantificaron los anticuerpos espedficos de la polio (IgG) con ELISA. Se relaciono la curva de respuesta a la dosis y se identifico la dosis de laser optima para la inmunizacion IPV del raton ICR. Despues se compararon los tttulos de la media entre un curso de dos dosis de laser optimo + IPV intradermica (0 y 3 semanas) y un curso de tres dosis de IPV intramuscular sola (0, y 6 semanas) donde la dosis de antfgenos de cada vacuna es la misma (lp,g). Se muestreo la sangre a las 0, 3, 6, y 12 semanas post-vacunacion para la cuantificacion de anticuerpos espedficos de la polio (IgG).
Se uso el modelo de raton establecido TgPVR21 para demostrar la capacidad del regimen de laser + vacuna para proporcionar inmunidad protectora frente a la infeccion de la polio (Nagata N et al., Virology 2004;321(1):87-100). Se midio la capacidad del laser para inducir respuesta inmunitaria mucosal a IPV.
Se espera que la dosis adecuada de luz laser infrarroja, a los niveles de dosis y potencia no daninos e indoloros en humanos, mejoren de forma similar la respuesta inmunitaria humoral en la inmunizacion intradermica con IPV a un grado que lleve a reducir el numero de vacunas de refuerzo, facilitando asf conseguir una vacunacion con IPV protectora.
Ejemplo 7 Adyuvante laser y Captacion, maduracion y migracion de celulas dendriticas
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El tratamiento adecuado y oportuno de las celulas dendnticas (DCs) de la piel en los nodos linfaticos (LNs), donde las DCs interactuan con los linfocitos T y B y median la presentacion de antigenos a traves de los vasos linfaticos en la piel, es crucial para la ejecucion de sus funciones (Randolph GJ, Angeli V, Swartz MA. (2005) Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol 5(8): 617-28). La migracion directa de DC esta mediada por la expresion selectiva de receptores de quimioquinas y por la generacion de quimioquinas espedficas en organos inmunes (Trombetta ES, Mellman I. (2005) Annu Rev Immunol 23: 975-1028; Randolph GJ, Angeli V, Swartz MA. (2005) Nat Rev Immunol 5(8): 617-28;Sallusto F, Palermo B, Lenig D, Miettinen M, Matikainen S, Julkunen I, Forster R, Burgstahler R, Lipp M, Lanzavecchia A. (1999) Eur J Immunol 29(5): 1617-25; Vecchi A, Massimiliano L, Ramponi S, Luini W, Bemasconi S, Bonecchi R, Allavena P, Parmentier M, Mantovani A, Sozzani S. (1999) J Leukoc Biol 66(3): 489-94). En la piel no estimulada, las LCs y DCs dermicas son moviles para adquirir y procesar antfgenos extranos. Estas expresan los receptores de quimioquinas CCR1, CCR2, CCR5, y CCR6, asf como CXCR3 y CXCR4 (Trombetta ES, Mellman I. (2005) Annu Rev Immunol 23: 975-1028; Vecchi A, Massimiliano
L, Ramponi S, Luini W, Bemasconi S, Bonecchi R, Allavena P, Parmentier M, Mantovani A, Sozzani S. (1999) J Leukoc Biol 66(3): 489-94). Las DCs regulan a la baja la mayona de receptores de quimioquinas durante su proceso de maduracion, con la excepcion de CXCR4 y CCR7, tras la exposicion a senales inflamatorias como quimioquinas o citoquinas (por ej. IL-8 o TNF-alfa) (Luster AD, Weinshank RL, Feinman R, Ravetch JV. (1988) J Biol Chem 263(24): 12036-43; Proudfoot AE. (2002) Nat Rev Immunol 2(2): 106-15) y antfgenos extranos (por ej. ligandos LPS o tLr) (De Smedt T, Pajak B, Muraille E, Lespagnard L, Heinen E, De Baetselier P, Urbain J, Leo O, Moser M. (1996) J Exp Med 184(4): 1413-24; Stockwin LH, McGonagle D, Martin IG, Blair GE. (2000) Immunol Cell Biol 78(2): 91-102). CXCR4 esta altamente expresado en las DCs de la piel migradas en vivo (Kabashima K, Shiraishi N, Sugita K, Mori T, Onoue A, Kobayashi M, Sakabe J, Yoshiki R, Tamamura H, Fujii N, Inaba K, Tokura Y. (2007) Am J Pathol 171(4): 1249-57) y media la migracion direccional (Kabashima K, Shiraishi N, Sugita K, Mori T, Onoue A, Kobayashi
M, Sakabe J, Yoshiki R, Tamamura H, Fujii N, Inaba K, Tokura Y. (2007) Am J Pathol 171(4): 1249-57; Humrich JY, Humrich JH, Averbeck M, Thumann P, Termeer C, Kampgen E, Schuler G, Jenne L. (2006) Immunology 117(2): 23847; Ouwehand K, Santegoets SJ, Bruynzeel DP, Scheper RJ, de Gruijl TD, Gibbs S. Eur J Immunol 38(11): 3050-9).
Para identificar las citoquinas inducidas por iluminacion laser, se realizo un analisis qPCR sobre el tejido de piel expuesto al laser. La interleucina-6 (IL-6) y CCR7, que son cnticas para la maduracion y migracion de las celulas dendnticas residentes en la piel, fueron altamente reguladas al alza despues del tratamiento con laser entre +160 citoquinas y sus receptores examinados (IL- 6: 6,1 veces; CCR7: 4,4 veces comparado con el tejido dermico no iluminado, n = 3 para cada gen). Sorprendentemente, la iluminacion laser no regula al alza las citoquinas inflamatorias clasicas tales como TNFa, ILlb, o IFN-gamma. IL6 se expresa en capa media de la epidermis (presumiblemente queranocitos), mas sustancialmente a las 6 horas de la post-iluminacion.
El analisis inmunofluorescente se realizo para determinar la distribucion espacial y temporal de IL-6. La piel del lomo del raton iluminada con el laser indujo la expresion IL-6 en la capa media epidermal, adyacente a las celulas de Langerhans (celulas dendnticas residentes en la piel). El nivel de expresion maximo se alcanzo a las 6 horas tras la aplicacion del laser.
Dado que la magnitud a la respuesta inmunitaria depende de la cantidad de DCs que migran a los organos linfoides secundarios (Leroux-Roels G. (2010) Reed et al. (2009); Palucka K, Banchereau J, Mellman I. (2010) Immunity 33(4): 464-78), las citoquinas inducidas por la iluminacion laser en la piel pueden jugar un papel cntico en el inicio de la respuesta inmunitaria de la piel.
El analisis de transcriptoma por PCR cuantitativo en tiempo real en la piel del raton tratado con laser demostro que la iluminacion laser (tanto PW 532 como CW 1064nm) regula al alza selectivamente una serie uniforme de genes que son conocidos por asociarse con la captacion y activacion de celulas dendnticas, incluyendo cc12, ccl17, ccl20, cxcl1, cxcl13, ccr7, ptgs2 (COX- 2), e IL6 (datos no mostrados). La iluminacion laser CW1064 nm no regula al alza las citoquinas inflamatorias clasicas como TNF-alfa, ILl-beta, IFN-gamma, pero PW 532 sf lo hace. Adicionalmente, la histologfa revelo la acumulacion de celulas dendnticas CD1 lc+, que son el antfgeno mas versatil que presentan las celulas en la piel, en el punto donde se aplico el laser CW 1064 nm sin inducir ningun dano tisular. Sin pretender estar limitado por la teona, actualmente se cree que la expresion de un coctel de citoquinas inducidas por el adyuvante laser puede ser asociada a la capcion, migracion y activacion de celulas dendnticas y el efecto adyuvante.
Otras realizaciones
Debe entenderse que, aunque la invencion se ha descrito junto con su descripcion detallada en el presente documento, la descripcion anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invencion, que esta definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> La General Hospital Corporation
<120> Adyuvantes laser para mejorar la respuesta inmunitaria
<130> 29539-0044W01
<150> US 61/530,296 <151> 2011-09-01
<160> 4
<170> SEC rapida para Windows Version 4.0
<210> 1 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> peptido nucleoprotema OVA espedfico MHC clase I <400> 1
Ser lie lie Asn Phe Glu Lys Leu 1 5
<210>2
<211>9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> peptido nucleoprotema virus de la gripe espedfico MHC clase I <400> 2
Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met 1 5
<210>3 <211> 17 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> peptido nucleoprotema OVA espedfico MHC clase II
<400> 3
lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly 15 10 15
Arg
<210>4 <211> 15 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> peptido nucleoprotema virus de la gripe espedfico MHC clase II
10
<400> 4
Gin Val Tyr Ser Leu lie Arg Pro Asn Glu Asn Pro Ala His Lys 15 10 15

Claims (12)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un antfgeno para el uso de un metodo para mejorar la respuesta inmunitaria protectora al antigeno en un sujeto, donde metodo comprende:
    exponer la piel del sujeto a radiacion de longitud de onda de entre 1050 nm y 1080 nm, donde la radiacion es una dosis total de radiacion infrarroja cercana de entre 25 J y 1200 J; y
    administrar al sujeto una dosis del antigeno, donde el antigeno esta administrado intradermicamente en o inmediatamente adyacente a la piel expuesta a la radiacion, caracterizada por:
    la radiacion es una radiacion de onda continua.
  2. 2. El antfgeno para el uso de la reivindicacion 1, donde la radiacion de onda continua tiene una longitud de onda de 1064 nm
  3. 3. El antigeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la radiacion comprende radiacion laser, preferiblemente el laser que sea un laser granate de aluminio de itrio dopado con neodimio (Nd:YAG).
  4. 4. El antigeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el antigeno comprende acido nucleico o protemas.
  5. 5. El antigeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el antigeno es viral, bacteriano, fungico, parasito unicelular o multicelular o una parte de ellos.
  6. 6. El antigeno para el uso de la reivindicacion 5, donde el antigeno es un virus de la gripe o una parte del mismo.
  7. 7. El antigeno para el uso de la reivindicacion 5, donde el antigeno proviene de la polio, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, virus de la gripe, tuberculosis (Bacillus Calmette-Guerin (BCG)), sarampion, toxina del tetanos, encefalitis transmitida por garrapatas, fiebre amarilla, difteria-tetanos-pertussis, virus del papiloma humano, vacuna conjugada de meningitis multivalente, vacuna antineumococica conjugada o patogeno de la rabia.
  8. 8. El antfgeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el tiempo total de exposicion esta entre 10 s y 300 s.
  9. 9. El antfgeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el perfil de intensidad trans- seccional de la radiacion es sustancialmente de forma parabolica.
  10. 10. El antfgeno para el uso de las reivindicaciones 1-2 o 4-9, donde la radiacion consta de la radiacion producida por una fuente no laser.
  11. 11. El antfgeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la radiacion media es V/cm2.
  12. 12. El antfgeno para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la radiacion media esta entre 1 V/cm2 y 5 V/cm2.
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