ES2631455T3 - Alteraciones génicas de EGFR y PTEN predicen la supervivencia en pacientes con tumores cerebrales - Google Patents

Alteraciones génicas de EGFR y PTEN predicen la supervivencia en pacientes con tumores cerebrales Download PDF

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Abstract

Método para predecir el desenlace clínico de un sujeto que padece glioblastoma multiforme (GBM) que comprende: a) determinar el nivel de expresión o el nivel de polisomía/amplificación del gen de EGFR y la pérdida de nivel de heterocigosidad (LOH) del gen de PTEN en una muestra del mismo sujeto, y b) comparar dicho nivel de expresión o el nivel de polisomía/amplificación del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN con valores de referencia convencionales, en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridación, mediante tecnología de secuenciación o mediante un análisis de SNP; y en el que un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dicho valor de referencia convencional y un alto nivel de expresión y/o alto nivel de polisomía/amplificación del gen de EGFR con respecto a dichos valores de referencia convencionales son indicativos de un buen desenlace clínico del sujeto.

Description

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DESCRIPCION
Alteraciones genicas de EGFR y PTEN predicen la supervivencia en pacientes con tumores cerebrales Campo de la invencion
La invencion se refiere a los campos de diagnostico y terapeutica, en particular a un metodo de proporcionar atencion personalizada a pacientes con cancer de cerebro basandose en la expresion de determinados genes en una muestra a partir de dichos pacientes, algunos de los cuales sirven como dianas de tratamiento.
Antecedentes de la invencion
Gliomas: Diagnostico y clasificacion de la enfermedad
Un glioma es un tipo de cancer que comienza en el cerebro o columna vertebral. Se denomina glioma porque surge de celulas gliales y/o sus precursores. El sitio mas comun de gliomas es el cerebro. Los gliomas se clasifican por tipo de celula, grado y localizacion. Los gliomas se nombran segun el tipo espedfico de celula a la que mas se asemejan. Los tipos principales de gliomas son:
- Ependimomas, gliomas derivados de celulas ependimarias.
- Astrocitomas, gliomas derivados de astrocitos; el glioblastoma multiforme (GBM) es el astrocitoma mas comun.
- Oligodendrogliomas, gliomas derivados de oligodendrocitos.
- Gliomas mixtos, tales como oligoastrocitomas, que contienen celulas de diferentes tipos de glfa.
Los gliomas se clasifican ademas segun su grado, que se determina mediante la evaluacion patologica del tumor. Por tanto se puede distinguir entre gliomas de bajo grado que estan bien diferenciados (no anaplasicos), benignos y presagian un mejor pronostico para el paciente; y gliomas de alto grado, que no estan diferenciados o anaplasicos, malignos y llevan a un peor pronostico.
De los numerosos sistemas de calificacion en uso, el mas comun es la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) sistema de calificacion para astrocitoma.
Tratamiento de gliomas cerebrales
El tratamiento para gliomas cerebrales depende de la localizacion, el tipo de celula y el grado de malignidad. A menudo, el tratamiento es un enfoque combinado, que usa cirugfa, radioterapia y quimioterapia. La radioterapia es en forma de radiacion con rayos externa o el enfoque estereotactico usando radiocirugfa. Los tumores de medula espinal pueden tratarse mediante cirugfa y radiacion. La temozolomida es un farmaco quimioterapico que puede cruzar la barrera hematoencefalica eficazmente y esta usandose en terapia. A pesar de estos enfoques, la mayona de los pacientes de glioma de alto grado sucumben a su enfermedad. Se necesitan nuevas intervenciones terapeuticas para dianas cnticas para mejorar el desenlace en esta poblacion de pacientes.
Glioblastoma multiforme (GBM)
El glioblastoma multiforme (GBM, grado IV de OMS) es un tumor cerebral altamente agresivo que se presenta como uno de los dos subtipos con perfiles moleculares y anamnesis distintos. El GBM primario se presenta completamente como una enfermedad de alto grado y el subtipo GBM secundario evoluciona desde la evolucion lenta de una enfermedad de bajo grado.
Brown et al. (J Clin Oncology. 2008, 5603-5609) describen un ensayo de fase I/II de erlotinib combinado con temozolomida en pacientes que padecen GBM. Estos autores intentaron relacionar la respuesta de los pacientes con varios marcadores moleculares como EGFR, PTEN, P53, etc., pero dejaron de observar cualquier correlacion entre supervivencia y niveles de expresion de dichos genes.
Mirimanoff et al. (J Clin Oncology. 2006, 2563-2569) describen un ensayo de fase III EORTC completado, en el que la metilacion de promotor MGMt fue el factor pronostico mas fuerte para el desenlace y respuesta positiva a temozolomida.
Van den Bent et al. (J Clin Oncology. 2009, 27:1268-1274) describen un ensayo de fase II EORTC aleatorio reciente. Los pacientes con GBM progresiva tras asignarse aleatoriamente radioterapia anterior a o bien erlotinib o bien un brazo de control que recibio tratamiento con o bien temozolomida o bien carmustina (BCNU). El principal punto final fue supervivencia libre de progresion a los 6 meses (PFS). Se investigaron muestras de tumor obtenidas en la primera cirugfa para la expresion de EGFR; mutantes de EGFRvIII; amplificacion de EGFR; mutaciones de EGFR en exones 18, 19, y 21; y pAkt. No se identifico un marcador biologico claro asociado con desenlace mejorado a erlotinib.
Smith et al. (J. National Cancer Institute. 2001, 1246-1256) describen metodos para predecir la supervivencia de
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pacientes con astrocitoma anaplasico y GBM. Estos autores identifican que la mutacion de PTEN y amplificacion de EGFR son marcadores de pronostico independientes para pacientes con astrocitoma anaplasico y la amplificacion de EGFR es un marcador de supervivencia para pacientes de mayor edad con GBM.
Umesh et al. (Clinical Neuropathology. Vol. 28 - No. 5/2009 (362-372)) describen un metodo para predecir el desenlace del paciente de glioma que comprende la deteccion de amplificacion de EGFR y PTEN LOH mediante inmunohistoqmmica. La conclusion descrita en dicho documento es que la amplificacion de EGFR asociada a LOH del gen de PTEN tiende a una escasa supervivencia.
Prados et al. (J Clin Oncology. 2009, 27(4):579-84) describen un ensayo de fase II que evaluo erlotinib mas temozolomida durante y despues de la radiacion, los pacientes tratados con terapia de combinacion (es decir, erlotinib y temozolomida) tuvieron mejor supervivencia. Ademas, el estudio tambien evaluo varios marcadores biologicos y hallaron que la metilacion del promotor MGMT junto con expresion de PTEN se asociaba a una supervivencia mejorada.
Sin embargo, existe todavfa la necesidad de marcadores y combinaciones de marcadores adicionales utiles para predecir el desenlace clmico de los pacientes con glioma. Un area especial para el diagnostico y pronostico es el estudio de la muestra de biopsia. Un enfoque integrado que puede definir mejor el desenlace del paciente basandose en el tratamiento mas apropiado usando perfiles tumorales sera cntico, ofreciendo ademas al paciente con glioma una mejor calidad de vida.
Sumario de la invencion
En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioma que comprende determinar el nivel de expresion del gen de EGFR o los niveles de polisoirna/amplificacion del locus de EGFr en el cromosoma 7 y la perdida de los niveles de heterocigosidad (LOH) del gen de PTEn en una muestra del mismo sujeto, y comparar dicho nivel de expresion o los niveles de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN con valores de referencia convencionales, en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante analisis de SNP; y en el que un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dicho valor de referencia convencional y un alto nivel de expresion y/o altos niveles de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a dichos valores de referencia convencionales son indicativos de un buen desenlace clmico del sujeto.
En otro aspecto se da conocer tambien un metodo para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioma que comprende determinar el nivel LOH del gen de PTEN en una muestra del sujeto, y comparar dicho nivel LOH de gen de PTEN con un valor de referencia convencional, en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante analisis de SNP ; y en el que un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dicho valor de referencia convencional, es indicativo de un mal desenlace clmico del sujeto.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un kit que comprende agentes que pueden detectar espedficamente el nivel de expresion y/o la polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y el LOH del gen de PTEN y, opcionalmente, un reactivo para detectar un gen constitutivo o la protema codificada por dicho gen constitutivo y/o un reactivo para detectar los cromosomas 7 y 10, para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioblastoma multiforme, en el que el conjunto de agentes que pueden determinar espedficamente el nivel LOH del gen de PTEN comprende un par de cebadores de oligonucleotidos adecuados para amplificar un fragmento espedfico del gen de PTEN o una sonda de oligonucleotido marcada opcionalmente que se une selectivamente a una secuencia diana de polinucleotido sobre la region del cromosoma del gen de PTEN o reactivos adecuados para realizar una reaccion de secuenciacion o reactivos para realizar un analisis de SNP, y en el que si dichos agentes detectan altos niveles de expresion o un alto nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y un alto nivel LOH del gen de PTEN, con respecto a valores de referencia, entonces el desenlace clfnico del sujeto es bueno.
En otro aspecto, se da conocer tambien el uso de erlotinib y/o temozolomida en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un glioma en un sujeto que padece un glioma, en el que el medicamento es para un sujeto que tiene un alto nivel LOH del gen de PTEN, que se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante un analisis de SNP, con respecto a un valor de referencia convencional y altos niveles de expresion y/o alta polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a valores de referencia convencionales.
Se da a conocer tambien el uso de radioterapia en un regimen para el tratamiento de un glioma en un sujeto que padece un glioma, en el que dicho sujeto tiene un alto nivel LOH del gen de PTEN, que se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante una tecnologfa de secuenciacion, o mediante una analisis de SNP, con respecto a un valor de referencia convencional y altos niveles de expresion y/o alta polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a valores de referencia convencionales.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que ilustra el tiempo desde la primera cirugfa hasta la muerte /
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final del seguimiento de solo pacientes GMB (puro), pacientes con astrocitoma y pacientes con oligodendrogliomas.
Figura 2. Curva de Kaplan-Meier que estima la supervivencia desde la primera cirug^a hasta la muerte / reca^da / progresion o final del seguimiento de solo pacientes GMB (puro), pacientes con astrocitoma y pacientes con oligodendrogliomas.
Figura 3. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la estratificacion de pacientes en el glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma anaplasico y grupo mixto con PTEN LOH (p=0,04).
Figura 4. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la estratificacion de pacientes en el glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma anaplasico y grupo mixto como que ambos tiene EGFR AMP/HP (amplificacion - alta polisoirna) y PTEN LOH (p=0,034).
Figura 5. Imagenes representativas de muestras de glioblastoma multiforme (GBM) tenidas con H&E (Hematoxilina y Eosina) (A). Ejemplos de experimentos FISH donde se ilustran AMP/HP EGFR DNA FISH (B) y monosomfa PTeN (C).
Descripcion detallada de la invencion
Con el fin de facilitar el entendimiento de la invencion descrito en esta solicitud de patente, se explican a continuacion el significado de algunos terminos y expresiones en el contexto de la invencion.
El termino “sujeto” se refiere a un miembro de una especie animal mamffera, e incluye, pero no esta limitado al mismo, animales domesticos, primates y seres humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, macho o hembra, de cualquier edad o raza. Alternativamente, el termino “individuo” tambien se usa algunas veces en esta descripcion para referirse a seres humanos.
El termino “protema” se refiere a una cadena molecular de aminoacidos, unida mediante enlaces covalentes o no covalentes. El termino incluye todas las formas de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glicosilacion, fosforilacion o acetilacion.
El termino “anticuerpo” se refiere a una protema con la capacidad de unirse espedficamente a un antfgeno. El termino anticuerpo comprende anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de los mismos que mantienen la capacidad de unirse al antfgeno, combicuerpos, etc., tanto de origen humano o humanizado como de origen no humano.
El termino “oligonucleotido cebador”, tal como se usa en la presente invencion, se refiere a una secuencia de nucleotidos, que es complementaria a una secuencia de nucleotidos de un gen seleccionado. Cada oligonucleotido cebador hibrida con su secuencia diana de nucleotidos y actua como un punto de inicio para polimerizacion de ADN.
Los inventores de la presente invencion han hallado que el desenlace clmico de pacientes que padecen cancer de glioma se correlaciona con niveles de expresion y/o los niveles de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y con el nivel LOH del gen de PTEN.
Por tanto, en un aspecto, la invencion se refiere a un metodo para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioma, a continuacion en el presente documento se denomina metodo [1] de la invencion, que comprende:
a) determinar el nivel de expresion o el nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN en una muestra del mismo sujeto, y
b) comparar dicho nivel de expresion o el nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN con valores de referencia convencionales, en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante una analisis de SNP; y en el que un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dicho valor de referencia convencional y un alto nivel de expresion y/o alto nivel de polisomfa / amplificacion del gen de EGFR con respecto a dichos valores de referencia convencionales son indicativos de un buen desenlace clmico del sujeto.
En la presente invencion un “glioma” es un tipo de cancer que comienza en el cerebro o columna vertebral. Se denomina glioma porque surge de celulas gliales y/o sus precursores. El sitio mas comun de gliomas es el cerebro. Los gliomas se clasifican por tipo de celula, grado, y localizacion. Los gliomas se nombran segun el tipo espedfico de celula a la que mas se asemejan. Los tipos principales de gliomas son:
- Ependimomas, gliomas derivados de celulas ependimarias.
- Astrocitomas, gliomas derivados de astrocitos; el glioblastoma multiforme (GBM) es el astrocitoma mas comun.
- Oligodendrogliomas, gliomas derivados de oligodendrocitos.
- Gliomas mixtos, tales como oligoastrocitomas, que contienen celulas de diferentes tipos de glfa.
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Los gliomas se clasifican ademas segun su grado, que se determina mediante evaluacion patologica del tumor. Por tanto, se puede distinguir entre (i) gliomas de bajo grado que estan bien diferenciados (no anaplasicos), benignos y presagian un mejor pronostico para el paciente; y (ii) gliomas de alto grado, que no estan diferenciados o anaplasicos, malignos y llevan a un peor pronostico.
En una realizacion preferida, el glioma es un gliobastoma multiforme (GBM) y mas preferiblemente el gliobastoma es un gliobastoma temprano.
El gliobastoma multiforme (GBM) es la forma mas comun y maligna de tumores gliales y se compone de una mezcla heterogenea de malignos astrocitos y celulas endoteliales displasicas diferenciados escasamente. Afecta principalmente a adultos, implica los hemisferios cerebrales y tiene un desarrollo de la enfermedad rapido lo que a menudo conduce hasta la muerte.
En la presente invencion “desenlace clmico” se entiende como el desarrollo esperado de una enfermedad. Denota el pronostico del doctor de como una enfermedad del sujeto progresara, y si hay posibilidades de recuperacion o recafda. El pronostico del desenlace clmico puede realizarse usando cualquier medicion de punto final en oncologfa y que conoce el medico. Los parametros de punto final utiles para describir la progresion de una enfermedad incluyen:
- progresion libre de enfermedad que, tal como se usa en el presente documento, describe la proporcion de pacientes en de pacientes en remision que no han tenido recafda de la enfermedad durante el periodo de tiempo en estudio;
- respuesta objetiva, que, tal como se usa en el presente documento, describe la proporcion de personas tratadas en las cuales se observa una respuesta completa o parcial;
- control de tumor, que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la proporcion de personas tratadas en las que se observa una respuesta completa, respuesta parcial, respuesta menor o enfermedad estable en igual a o mas de (>) 6 meses;
- supervivencia libre de progresion que, tal como se usa en el presente documento, se define como el tiempo desde el inicio de tratamiento hasta la primera medicion de crecimiento de cancer;
- tasa de supervivencia libre de progresion a los 6 meses o “PFS6” que, tal como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de personas en el que estan libres de progresion en los primeros seis meses tras el inicio del terapia; y
- supervivencia mediana que, tal como se usa en el presente documento, se refiere al tiempo en el que la mitad de los pacientes inscritos en el estudio estan todavfa vivos.
Un buen desenlace clmico se entiende como una situacion en la que al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o incluso mas de los pacientes tienen un resultado positivo con respecto a los parametros de punto final descritos anteriormente.
El termino “muestra” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra que puede obtenerse del paciente. El metodo presente puede aplicarse a cualquier tipo de muestra biologica de un paciente, tal como una muestra de biopsia, tejido, celula o lfquido (sangre completa, suero, saliva, semen, expectoracion, orina, lfquido cefalorraqrndeo (LCR), lagrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares). En una realizacion particular, dicha muestra es una parte o muestra de tejido tumoral del mismo. En una realizacion mas particular, dicha muestra de tejido de tumor es una muestra de tejido cerebral tumoral de un paciente que padece cancer de cerebro. Dicha muestra puede obtenerse mediante metodos convencionales, por ejemplo, biopsia, usando metodos que conocen bien los expertos en la tecnica en la tecnica medica relacionada. Los metodos para obtener la muestra de la biopsia incluyen reparto bruto de una masa, o microdiseccion u otros metodos de separacion de celulas conocidos en la tecnica. Las celulas tumorales pueden obtenerse adicionalmente a partir de una citologfa de aspiracion de aguja fina. Con el fin de simplificar la conservacion y manejo de las muestras, estas pueden fijarse en formalina e incrustarse en parafina o congelarse en primer lugar y se incrusto entonces en un medio con capacidad de criosolidificacion, tal como compuesto OCT, a traves de la inmersion en un medio altamente criogenico que permite una rapida congelacion. En una realizacion particular, la muestra es una muestra de tumor que contiene un numero sustancial de celulas tumorales.
Las muestras pueden obtenerse de sujetos diagnosticados previamente de glioma (pacientes), o de sujetos que no han sido diagnosticados previamente de glioma, o de pacientes diagnosticados de glioma Que se someten a tratamiento, o de pacientes diagnosticados de glioma que se han tratado previamente.
PTEN es la protema homologa de fosfatasa y tensina tambien conocida como BZS; MHAM; TEP1; MMAC1; PTEN1; 10q23del o MGC11227. PTEN es una protema, que en seres humanos se codifica mediante el gen de PTEN (RefSEq ID NM_000314 SEQ ID NO: 1, protema de referencia NP_000305.3 SEQ ID NO: 2) (Steck PA, et al. 1997 Nat. Genet. 15 (4): 356-62 2). PTEN actua como un gen supresor tumoral a traves de la accion de su producto de
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protema fosfatasa. Esta fosfatasa esta implicada en la regulacion del ciclo celular, evitando el crecimiento y division demasiado rapidamente de las celulas. Las mutaciones de este gen contribuye al desarrollo de determinados canceres (Chu EC, et al. 2004 Med. Sci. Monit. 10 (10): RA235-41 3). Existe como homologos otras especies, tales como ratones (NM_008960.2, SEQ ID NO: 3), rata (NM_031606.1, SEQ ID NO: 4), perro (NM_001003192, SEQ ID NO: 5), etc.
La protema codificada por el gen de PTEN es una fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato-3-fosfatasa. Contiene una tensina como dominio asf como un dominio catalttico similar al de las protemas tirosina fosfatasas de especificidad dual. A diferencia de mayona de las protemas tirosina fosfatasas, esta protema desfosforila preferencialmente sustratos de fosfoinositida. Regula negativamente niveles intracelulares de fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato en celulas y funciona como supresor tumoral mediante la ruta de senalizacion de Akt/PKB de regulacion negativamente (Hamada K, et al 2005 Genes Dev 19 (17): 2054-65).
El receptor de factor de crecimiento epidermico (EGFR; ErbB-1; HER1 en seres humanos) es el receptor de superficie celular para miembros de la familia de factor de crecimiento epidermico (EGF-familia) de ligandos de protema extracelulares (Herbst RS (2004). Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59 (2 Suppl): 21-6. 1) El EGFR es un miembro de la familia ErbB de receptores. El EGFR es una protema que en seres humanos es codificada por diferentes isoformas: EGFR variante de transcripcion 1 (NM_005228.3, SEQ ID NO: 6), variante de transcripcion 2 (NM_201282.1, SEQ ID NO: 7), variante de transcripcion 3 (NM_201283.1, SEQ ID NO: 8) y variante de transcripcion 4 (NM_201284.1, SEQ ID NO: 9). Existe como homologos otras especies, tales como raton (NM_207655.2, SEQ ID NO: 10 y NM_007912.4, SEQ ID NO: 11), rata (NM_031507.1, SEQ ID NO: 12), perro (XM_533073.2, SEQ ID NO: 13), etc.
El metodo [1] de la invencion comprende determinar el nivel de expresion del gen de EGFR. Como el experto en la tecnica comprende, puede determinarse el nivel de expresion de un gen midiendo los niveles de ARNm codificados por dichos genes, midiendo ambos niveles de protemas codificados por dichos genes y los niveles de variantes de los mismos, mediante el uso de sustitutos (numero de copia de ADN) para asociar nivel de gen con ARNm y producto de protema de dicho gen, etc.
Una variante de una protema, por ejemplo, EGFR o PTEN, tal como se usa en el presente documento puede ser (i) una protema en la que uno o mas de los residuos de aminoacido se sustituye/n con un residuo de aminoacido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoacido conservado) y tal residuo sustituido de aminoacido puede estar codificado o no por el codigo genetico, (ii) una protema que tiene uno o mas residuos de aminoacido modificados, por ejemplo, residuos que se modifican mediante la union de grupos sustituyentes, (iii) una protema modificada siendo dicha protema el resultado de un empalme alternativo del ARNm que codifica el EGFR o protema PTEN, y/o (iv) un fragmento de la protema. El termino “fragmento” incluye tambien un peptido o protema generada por medio de por medio de escision proteolttica (incluyendo proteolisis multietapa) de una protema original. Las variantes se consideran que estan dentro del alcance de los expertos en la tecnica de las ensenanzas en el presente documento.
Como se conoce en la tecnica la “similitud” entre dos protemas se determina comparando la secuencia de aminoacidos y sus sustitutos de aminoacidos conservados de una protema con respecto a una secuencia de una segunda protema. Las variantes segun la presente invencion incluyen peptidos o protemas que tienen secuencias de aminoacidos que son al menos el 60%, el 65%, el 70%, el 72%, el 74%, el 76%, el 78%, el 80%, el 82%, el 84%, el 86%, el 88%, el 90%, el 95%, o incluso mas, similar o identica a la secuencia de aminoacidos original. El grado de identidad entre dos protemas puede determinarse usando algoritmos de ordenador y metodos que los expertos en la tecnica conocen ampliamente. La identidad entre las dos secuencias de aminoacidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Betesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)).
Las protemas pueden modificarse postraduccionalmente. Por ejemplo, modificaciones postraduccionales que se encuentran dentro del alcance de la presente invencion incluyen escision del peptido senal, glicosilacion, acetilacion, isoprenilacion, proteolisis, miristoilacion, plegamiento de protemas y procesamiento proteolftico, etc. Adicionalmente, las protemas pueden incluir aminoacidos no naturales formados mediante modificacion postraduccional o introduciendo aminoacidos no naturales durante traduccion.
En una realizacion preferida, la determinacion de los niveles de expresion del gen de EGFR puede llevarse a cabo midiendo el nivel de expresion del ARNm codificado por el gen de EGFR, respectivamente. Para este fin, la muestra biologica puede tratarse para alterar ffsicamente o mecanicamente la estructura celular o tejido, para liberar componentes intracelulares en una disolucion acuosa u organica para preparar acidos nucleicos para analisis adicional. Los acidos nucleicos se extraen de la muestra mediante procedimientos que conocen los expertos de la tecnica y disponibles comercialmente. Entonces se extrae ARN de muestras congeladas o frescas mediante cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, Sambrook, Fischer y Maniatis, Molecular Cloning, un manual de laboratorio, (2a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, (1989). Preferiblemente, se tiene cuidado para evitar la degradacion del ARN durante el procedimiento de extraccion.
En una realizacion particular, el nivel de expresion se determina usando ARNm obtenido de una muestra de tejido
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fijado con parafina, incrustado en parafina. El ARNm puede aislarse de una muestra patologica o muestra de biopsia de archivo que se desparafina en primer lugar. Un metodo de desparafinacion a modo de ejemplo implica lavado de la muestra parafinizada con un disolvente organico, tal comoxileno, por ejemplo.
Las muestras desparafinizadas pueden rehidratarse con una disolucion acuosa de un alcohol inferior. Los alcoholes inferiores adecuados, por ejemplo incluyen, metanol, etanol, propanoles y butanoles. Muestras desparafinizadas puede rehidratarse con lavados sucesivos con disoluciones de alcoholes inferiores de disminucion de la concentracion, por ejemplo. Alternativamente, la muestra se desparafina y se rehidrata simultaneamente. La muestra se lisa entonces y se extrae ARN de la muestra.
Mientras que todas las tecnicas de elaboracion de perfiles de expresion genica (RT-PCR, SAGE, o TaqMan) son adecuadas para su uso en la realizacion de los aspectos anteriores de la invencion, los niveles de expresion del ARNm que codifica para EGFR o para PTEN se determinan a menudo mediante reaccion de cadena de polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR). La deteccion puede llevarse a cabo en muestras individuales o en microalineamientos de tejido.
Con el fin de normalizar los valores de la expresion de ARNm entre las diferentes muestras, es posible comparar los niveles de expresion del ARNm de interes en las muestras de prueba con la expresion de un ARN de control. Un “ARN de control” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un aRn cuyos niveles de expresion no cambian o cambian solo en cantidades limitadas en celulas tumorales con respecto a celulas no tumorigenicas. Preferiblemente, un ARN de control es un ARNm derivado a partir de un gen constitutivo y que codifica para una protema que se expresa constitutivamente y lleva a cabo funciones celulares esenciales. Genes constitutivos preferidos para su uso en la presente invencion incluyen p-2-microglobulina, ubiquitina, protema ribosomal 18-S, ciclofilina, GAPDH y actina. En una realizacion preferida, el ARN de control es ARNm de p-actina. En una realizacion, la cuantificacion de la expresion genica relativa se calcula segun el metodo Ct comparativo usando p- actina como un control endogeno y controles de ARN comercial como calibradores. Los resultados finales se determinan segun la formula 2-(ACt de muestra-ACt de calibrador), en el que los valores de ACT del calibrador y muestra se determinan restando el valor CT del gen diana del valor del gen de p-actina.
La determinacion del nivel de expresion del gen de EGFR necesita correlacionarse con los valores de referencia convencionales. Los valores de referencia convencionales corresponden al valor de la mediana de los niveles de expresion del gen de EGFR medidos en una coleccion de muestras de pacientes sanos. Una vez que se establece este valor de la mediana, el nivel de este marcador expresado en tejidos tumorales de pacientes puede compararse con este valor de la mediana, y por tanto asignarse a un nivel de “bajo”, “normal” o “alto”. La coleccion de muestras de cuyo nivel de referencia se deriva se constituira preferiblemente de personas sanas de la misma edad como los pacientes. En cualquier caso puede contener un numero diferente de muestras. En una realizacion mas preferida, las muestras son muestras de cerebro de biopsia. Preferiblemente la coleccion debe ser suficiente para proporcionar un valor de referencia convencional preciso. Normalmente, el numero de muestras usado para determinar un valor de referencia convencional es al menos 10, preferiblemente mas de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o incluso mas muestras. El patron puede incluir tambien celulas 'normales' presentes dentro del tejido enfermo y/o canceroso. Esto es particularmente cierto para extirpacion de tumor cerebral y ocasionalmente muestras de biopsia que normalmente contienen un borde de tejido normal o tienen celulas inflamatorias, etc., que no contienen cambios de genes. Ademas, puede usarse un sistema de cultivo celular para evaluar contenido genico, como una manera de determinar la presencia o perdida de genes individuales.
En una realizacion particular, un aumento en la expresion del gen de EGFR, como se determino en la muestra anterior el valor de referencia convencional de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso mas en comparacion con el valor de referencia se considera como un nivel de expresion “alto” del gen de EGFR, En otra realizacion particular, una disminucion en la expresion del gen de EGFR, como se determinara en la muestra siguiente el valor de referencia convencional de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menor en comparacion con el valor de referencia convencional se considera como un nivel de expresion “bajo” del gen de EGFR.
Alternativamente, en otra realizacion particular, el nivel de expresion del gen de EGFR puede determinarse midiendo tanto el nivel del protema codificado por dichos genes, es decir protema EGFR, como los niveles de una variante de la misma . Aunque sena posible determinar el nivel de expresion del gen de PTEN midiendo tanto el nivel de la protema codificada por dichos genes, es decir protema PTEN, y los niveles de una variante de la misma, en la practica, dicha opcion no es adecuada para la realizacion de ensenanzas de la presente invencion tal como tratara a continuacion. El experto en la tecnica conoce que la perdida de expresion de protema tambien puede ser el resultado de metilacion del promotor de gen y no una perdida del gen por sf mismo que afecta a otros genes asociados.
La determinacion del nivel de expresion de una protema, por ejemplo, protema EGFR, o una variante de la misma puede llevarse a cabo mediante cualquier tecnica convencional que conoce el experto en la tecnica. En una realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de dicha protema, por ejemplo, protema EGFR, o una variante de la misma , se lleva a cabo mediante tecnicas inmunologicas tales como por ejemplo, ELISA (Ensayo
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por inmunoabsorcion ligado a enzimas), inmunotransferencia de tipo Western, inmunofluorescencia (SI), analisis de inmunohistoqmmica (IHC), etc. ELISA se basa en el uso de antigenos o anticuerpos marcados (por ejemplo, con enzimas) de modo que los conjugados formados entre el antfgeno diana y el anticuerpo marcado da como resultado la formacion de, por ejemplo, complejos enzimaticamente activos. Puesto que uno de los componentes (el antigeno o el anticuerpo marcado) se inmoviliza sobre un soporte, los complejos anticuerpo-antfgeno se inmovilizan sobre el soporte y por tanto, puede detectarse mediante la adicion de un sustrato que se convierte mediante la enzima en un producto que puede detectarse mediante, por ejemplo espectrofotometna, fluorometna, etc. Esta tecnica no permite la localizacion exacta la protema diana o la determinacion de su peso molecular sin embargo permite una deteccion muy espedfica y altamente sensible de la protema diana en una variedad de muestras biologicas (suero, plasma, homogeneizados de tejido, sobrenadantes posnucleares, ascitos y similares). La inmunotransferencia de tipo Western se basa en la deteccion de una protema que se vuelve a disolver previamente mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes e inmovilizada sobre una membrana, generalmente nitrocelulosa, mediante incubacion con un anticuerpo espedfico para dicha protema y un sistema de desarrollo (por ejemplo quimioluminiscencia, etc.). El analisis mediante inmunofluorescencia (Si) requiere el uso de un anticuerpo espedfico para la protema diana para el analisis de la expresion y localizacion subcelular mediante microscopio. Generalmente, las celulas en estudio se fijan previamente con paraformaldetndo y permeabilizan con un detergente no ionico. En una realizacion preferida, la protema EGFR se detecta mediante un analisis inmunohistoqmmica (IHC) usando secciones delgadas de muestra biologica inmovilizada sobre portaobjetos recubiertos. Las secciones se desparafinan entonces, si se derivaron de muestra de tejido parafinado, y se tratan de modo que se recupere el antigeno. La deteccion puede llevarse a cabo en muestras individuales o en microalineamientos de tejido. En otra realizacion el metodo usado para determinar el nivel de expresion de una protema, por ejemplo, protema EGFR, o una variante de la misma es un alineamiento proteomico.
Puede usarse practicamente cualquier anticuerpo o reactivo conocido por unirse con alta afinidad a la protema diana para detectar la cantidad de dicha protema diana. Se prefiere no obstante el uso de un anticuerpo, por ejemplo sueros policlonales, sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, ScFv, dicuerpos, tricuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.
En aun otra realizacion, la determinacion del nivel de expresion de una protema, por ejemplo, EGFR, etc., puede llevarse a cabo construyendo una microalineacion de tejido (TMA) que contiene las muestras de paciente ensambladas, y determinar los niveles de expresion de dicha protema mediante tecnicas IHC. La intensidad de inmunotincion puede evaluarse mediante dos bioqmmicos clmicos diferentes y puntuarse usando criterios de punto de corte uniformes y claros, con el fin de mantener la reproducibilidad del metodo. Las discrepancias pueden resolverse mediante reevaluacion simultanea. Brevemente, puede registrarse el resultado de inmunotincion como expresion negativa (0) frente a expresion positiva, como expresion baja (1+) expresion frente a moderada (2+) y como expresion alta (3+), teniendo en cuenta la expresion en celulas tumorales y el punto de corte espedfico para cada marcador. Como criterio general, se seleccionaron los puntos de corte con el fin de facilitar la reproducibilidad, y cuando sea posible, traducir acontecimientos biologicos.
La determinacion del nivel de expresion del gen de EGFR necesita correlacionarse con los valores de referencia convencionales que corresponden al valor de la mediana de niveles de expresion del gen de EGFR medidos en una coleccion de muestras de tejido de cerebro de pacientes sanos. Preferiblemente la coleccion debe ser suficiente para proporcionar un nivel de referencia preciso. Normalmente el numero de muestras usado para determinar los valores de referencia convencionales es al menos 10 muestras, preferiblemente mas de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, o incluso mas.
En una realizacion preferida la muestra es una biopsia. Una vez que se establece este valor de la mediana, el nivel de este marcador expresado en tejidos tumorales de pacientes puede compararse con este valor de la mediana, y por tanto asignarse a nivel de “bajo”, “normal” o “alto” tal como se definio anteriormente.
“Polisoirna” / “amplificacion” del locus de EGFR en el cromosoma 7 tal como se usa en la presente invencion se entiende como la presencia de mas de una copia del locus de EGFR en el cromosoma 7.
Ademas, tal como se usa en el presente documento, el termino “LOH” dentro del contexto de la presente invencion se refiere una “perdida de heterocigosidad”. LOH en una celula representa la perdida de la funcion normal de un alelo de un gen en el que ya se inactivo el otro alelo. Este termino se usa principalmente en el contexto de la oncogenesis; tras una mutacion de inactivacion en un alelo de un gen supresor tumoral que se produce en la celula germinal original, se transmite al cigoto que da como resultado un descendiente que es heterocigoto para este alelo. En oncologfa, la perdida de heterocigosidad (LOH) se produce cuando el alelo funcional restante en una celula somatica del descendiente llega a inactivarse mediante mutacion. En el caso de PTEN LOH, esto da como resultado que no se produzca un supresor tumoral normal.
En una realizacion particular, pueden medirse la determinacion del polisom^a/amplificaciOn nivel del gen de EGFR y la determinacion de los niveles LOH del gen de PTEN, por ejemplo, en el ADN obtenido de las celulas tumorales segun procedimientos convencionales tales como, por ejemplo, pCr cuantitativa, hibridacion genomica comparativa (CGH) para tecnologfas de microalineamientos, etc.; o en las celulas tumorales a partir la seccion incrustada en parafina o de la preparacion de citologfa mediante FISH usando sondas moleculares apropiadas, etc.
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En una realizacion particular, la deteccion del polisoirna/amplificacion nivel del gen de EGFR y la determinacion de los niveles LOH del gen de PTEN se lleva a cabo mediante a reaccion en cadena de polimerasa (PCR).
En una realizacion particular, la deteccion del polisomna/amplificacion nivel del gen de EGFR y la determinacion de los niveles LOH del gen de PTEN se lleva a cabo mediante un ensayo basado en hibridacion. En una realizacion particular, la etapa de deteccion del metodo [1] de la invencion comprende poner en contacto la muestra de acido nucleico con una o mas sondas de acido nucleico cada una de ellas se une selectivamente a una secuencia diana de polinucleotido sobre la region del cromosoma del loci de EGFR o PTEN, en condiciones en las que la sonda forma una complejo de hibridacion estable con la secuencia diana de polinucleotido; y detectar el complejo de hibridacion. En una realizacion particular, las sondas de acido nucleico usadas en el metodo [1] de la invencion se marcan con un fluoroforo. Alternativamente, en otra realizacion particular, la etapa de deteccion del complejo de hibridacion comprende determinar el numero de copia de la secuencia diana de polinucleotido, determinando de este modo la presencia de polisomfa o LOH del gen diana.
En una realizacion preferida, dicho ensayo basado en hibridacion se selecciona del grupo que consiste en transferencia Southern, hibridacion in situ (ISH), fluorescencia ISH (FISH) e hibridacion genomica comparativa (CGH). La transferencia Southern es un metodo usado rutinariamente en biologfa molecular par la deteccion de una secuencia de ADN espedfica en muestras de ADN; la transferencia Southern generalmente combina la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a una membrana de filtracion y deteccion de fragmento posterior mediante hibridacion de sonda. La hibridacion in situ (ISH) es un tipo de hibridacion que usa una hebra de ADN o ARN complementaria marcada (es decir, sonda) para localizar una secuencia de ADN o ARN espedfica en una porcion o seccion de tejido (in situ), o, si el tejido es suficientemente pequeno, en el tejido completo; puede usarse ISH de ADN para determinar la estructura de los cromosomas. La hibridacion in situ (FISH) con fluorescencia es una tecnica citogenetica usada para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias de ADN espedfico en los cromosomas. FISH usa sondas fluorescentes que unen a solo algunas partes del cromosoma con los cuales muestran un alto grado de similitud de secuencia. La microscopfa fluorescente puede usarse para averiguar donde se unio la sonda fluorescente a los cromosomas. FISH se usa a menudo para hallar caractensticas espedficas en ADN para su uso en asesoramiento genetico, medicina (por ejemplo, en diagnostico medico para evaluar la integridad cromosomica), y identificacion de especies; FISH tambien puede usarse para detectar y localizar ARNm espedficos y otros transcritos en las secciones de tejido o cantidades completas (asf, puede ayudar a definir los patrones espacio-temporales de expresion genica en celulas y tejidos). La hibridacion genomica comparativa (CGH) o analisis de microalineamientos cromosomicos (CMA) es un metodo molecular-citogenetico para el analisis de cambios de numero de copias (ganancias/perdidas) en el Contenido de ADN de un ADN de sujeto dado y a menudo en celulas tumorales; CGH detecta solo cambios cromosomicos desequilibrados. En una realizacion particularmente preferida, dicho ensayo basado en hibridacion es un ensayo CGH.
En una realizacion particular, dicho ensayo basado en hibridacion es un ensayo basado en alineamiento. En una realizacion particular, una vez que la muestra se ha obtenido y el ADN total se ha extrafdo, se lleva a cabo analisis de todo el genoma de cambios de numero de copia de ADN mediante CGH. En general, para una medicion de CGH tfpica, se afsla ADN genomico total de las poblaciones celulares de referencia y prueba, se marcaron diferencialmente y se hibridaron a una representacion del genoma que permite la union de secuencias en diferentes localizaciones genomicas para que se distingan. Las reacciones de hibridacion pueden realizarse en condiciones de rigurosidad diferentes. La rigurosidad de una reaccion de hibridacion incluye la dificultad con que dos moleculas de acido nucleico cualquiera hibridaran entre sf. Preferiblemente, cada polinucleotido de hibridacion se hibrida a su polinucleotido correspondiente en condiciones de rigurosidad reducida, mas preferiblemente condiciones rigurosas, y lo mas preferiblemente condiciones altamente rigurosas.
La cantidad de ADN de muestra es frecuentemente una restriccion en medidas de CGH. Los procedimientos de CGH de alineamiento tfpico usan de desde 300 ng hasta 3 mg de ADN de muestra en la reaccion de marcaje, equivalente a aproximadamente de 50.000 a 500.000 celulas de mamffero. Habitualmente, se emplean protocolos que marcan cebadores aleatorios, que amplifican tambien el ADN, de modo que se usan varios microgramos (|jg) en la hibridacion.
Se ha implementado alineamiento CGH usando una amplia variedad de tecnicas. En una realizacion particular, se lleva a cabo alineamiento CGH usando alineamientos de clones genomicos de gran insercion tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Los principios y condiciones generales para la deteccion de acidos nucleicos, tales como el uso de alineamiento CGH a microalineamientos BAC los conoce tambien el experto en la tecnica. Esta tecnica permite examinar el genoma completo para cambios de numero de copia de ADN permitiendo por tanto la deteccion cuantitativa de la variacion del numero de copia de ADN en genomas tumorales con alta resolucion (Pinkel D, et al. Nat Genet 1998; 20(2):207-11; Hodgson G, et al. Nat Genet 2001;29(4):459-64). Como ejemplo no limitativo ilustrativo, en el alineamiento CGH llevado a cabo por el metodo [1] de la invencion pueden marcarse mediante tumores de prueba y ADN de referencia genomicos mediante cebado aleatorio usando fluoroforos Cy3 y Cy5. Entonces, pueden analizarse las imagenes de los alineamientos usando, por ejemplo, una camara con dispositivo acoplado de carga (CCD) y software apropiado.
El principal reto tecnico de alineamiento CGH es la generacion de senales de hibridacion que sean suficientemente intensas y espedficas de modo que puedan detectarse cambios de numero de copias. La intensidad de senal en un
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elemento de alineamiento esta afectada por varios factores incluyendo la composicion de base, la proporcion de contenido de secuencia repetitiva, y la cantidad de ADN en el elemento de alineamiento disponible para hibridacion.
Los elementos de alineamiento elaborados a partir de clones BAC genomicos proporcionan normalmente senales mas intensas que los elementos que emplean secuencias mas cortas tales como ADNc, productos de PCR, y oligonucleotidos. Las senales mas altas de los elementos de alineamiento mas complejos dan como resultado mejor precision de medicion, permitiendo la deteccion de lfmites de transicion de copia simple incluso en muestras con una alta proporcion de celulas normales.
En otra realizacion preferida, dicho ensayo basado en hibridacion es una hibridacion in situ fluorescente (FISH) o FISH mas carotipo de espectro (SKY) (Liehr T. et al 2008 Fluorescence In situ Hybridization (FISH) - Application Guide, Springer Berlin Heidelberg).
FISH permite detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias de ADN espedfico en los cromosomas, por ejemplo, FISH permite localizar la senal a un tipo de celula (tumoral) espedfica. FISH usa sondas fluorescentes que se unen solo a aquellas partes del cromosoma con las que muestran un alto grado de similitud de secuencia. La microscopfa fluorescente puede usarse para averiguar donde se une la sonda fluorescente a los cromosomas.
El termino “sonda” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier ribopolinucleotido o desoxirribosecuencia de polinucleotido que se une espedficamente a solo aquellas partes del cromosoma con que muestran un alto grado de similitud de secuencia. La sonda debe ser suficientemente grande para hibridar espedficamente con su diana pero no tan larga como para impedir el proceso de hibridacion. Existen muchas sondas de FISH diferentes que pueden usarse en la presente invencion; los ejemplos ilustrativos, no limitativos de los mismos incluyen cromosomas artificiales bacterianos (BAC), sondas de oligonucleotidos de tipo mosaico (TOP), etc. El diseno de sondas para FISH lo conoce bien el experto en la tecnica (por favor veanse Bayani J, Squire JA. Curr Protoc Cell Biol. 2004 Sep; capftulo 22: unidad 22.4; Bayani J, Squire J.Curr Protoc Cell Biol. 2004 Oct; capttulo 22: unidad 22.5; Navin, N. et al. Bioinformatics, volumen 22, numero 19, 1 de octubre de 2006, pags. 2437-2438(2)) editorial: Oxford University Press). La sonda puede etiquetarse directamente con fluoroforos, con dianas para anticuerpos, con biotina, etc. El etiquetado puede realizarse de varias maneras, tales como mediante traslado de mella, mediante PCR usando nucleotidos etiquetados, etc.
La muestra puede fijarse e incrustarse en parafina, asf puede realizarse una etapa adicionalmente de desparafinacion.
Para la hibridacion, se produce una preparacion de cromosoma de interfase o metafase. Los cromosomas se adhieren firmemente a un sustrato, habitualmente, un vidrio. Las secuencias de ADN repetitivas deben bloquearse anadiendo fragmentos cortos de ADN a la muestra. La sonda se aplica entonces a el ADN de cromosoma y se incuba durante aproximadamente 12 horas mientras se hibrida. Las varias etapas de lavado retiran todas las sondas sin hibridar o parcialmente hibridadas. Tras lavados de poshibridacion convencionales los portaobjetos se tinen con la sonda de tincion de ADN tal como DAPI y se monta con un agente de montaje tal como Antifade.
Los resultados se visualizan y se cuantifican entonces usando, por ejemplo, un microscopio que puede excitar el colorante y registrar imagenes. Si la senal fluorescente es debil, la amplificacion de la senal puede ser necesaria con el fin de exceder el umbral de deteccion del microscopio. La fuerza de senal fluorescente depende de muchos factores tales como eficacia de marcado de sonda, el tipo de sonda, y el tipo de colorante. Anticuerpos etiquetados fluorescentemente o estreptavidina se unen a la molecula de colorante. Estos componentes secundarios se seleccionan de modo que tengan una senal fuerte. En una realizacion preferida, antes de la obtencion de imagenes el bioqmmico clmico evaluo todos los portaobjetos y se identificaron regiones de interes basandose en criterios histopatologicos y calidad incluyendo, sin excluir otros, contenido tumoral, fijacion apropiada, necrosis y vascularidad.
Los experimentos FISH disenados para detectar o localizar expresion genica en celulas y tejidos se basan en el uso de un gen indicador, tal como uno que expresa protema verde fluorescente (GFP) y similares, para proporcionar la senal fluorescente.
En una tecnica alternativa para preparaciones de interfase o metafase, FISH de fibra, se adhieren cromosomas de interfase a un portaobjetos de tal modo que se estiran en una lmea recta, en vez de enrollarse finamente, como en FISH convencional, o adoptar una conformacion aleatoria, como en la interfase FISH. Esto se lleva a cabo aplicando accionamiento mecanico junto con la longitud del portaobjetos, o bien a celulas que se han fijado al portaobjetos y entonces se lisaron, o bien a una disolucion de ADN purificado. La conformacion de los cromosomas ampliada permite resolucion drasticamente mas alta - incluso bajando hasta unas pocas kilobases (kb).
En una realizacion particular aun mas preferida, en paralelo a la deteccion de la polisoirna/amplificacion del locus de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN, se usan sondas de control FISH para cromosomas 10 y 7. Las “sondas de control FISH” son sondas que se unen espedficamente para los cromosomas individuales, permitiendo asf la determinacion del numero de cromosoma. En una realizacion preferida, las sondas de control FISH se refieren a secuencias satelite alfa. Secuencias satelite alfa, cuando son altamente repetitivas, son espedficas de cada cromosoma individual. Estas secuencias flanquean los centromeros y pueden presentar una diana medida en
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megabases. En una realizacion preferida, estas sondas de control FISH se marcanan con colores diferentes que las sondas EGFR y PTEN.
En una realizacion preferida, la sonda FISH para PTEN es una sonda que se hibrida a la region 10q23 en el cromosoma 10 y contiene secuencias que flanquean tanto los extremos 5' y 3' del gen de PTEN; en una realizacion mas preferida la sonda tiene entre 300 y 400 kb. En una realizacion mas preferida, la sonda FISH para PTEN y la sonda de control FISH para el cromosoma 10 son la sonda de color dual LSI PTEN (10q23) / CEP 10 para PTEN (Vysis, Abbot Molecular) (Goberdhan, D., et al. Human Molecular Genetics 12 (2) (2003): 239-248; Eng, C., et al. Human Mutation 22 (2003): 183-198; Sasaki, H., et al. Am. J. de Pathology 159 (1) (2001): 359-367). Se describen otras sondas por Cairns et al. (Cairns et al. 1997. Cancer Res 57; 4997-5000) y por Hermans et al. (Hermans et al. 2004 Genes Chrom Cancer, 39; 171-184). El LSI PTEN (10q23) se marca con SpectrumOrange. La sonda SpectrumGreen CEP 10 se hibrida a secuencias satelite alfa espedficas para cromosoma 10.
En una realizacion particular, la sonda FISH para EGFR es una sonda que se hibrida a la region 7p12 del cromosoma 7 y contiene el gen de EGFR completo. En una realizacion mas preferida, la sonda FISH para el gen de EGFR y la sonda de control para el cromosoma 10 son la sonda de color dual LSI EGFR/CEP 7 (Vysis, Abbot Molecular). En una realizacion particular la sonda EGFR se marca con SpectrumOrange y se cubre una region de aproximadamente 300 kb de la region 7p12 del cromosoma 7 (Bredel, M., et al. 1999. Clin Cancer Res 5, 1786-92 ; Harris, A., et al. 1989. J Steroid Biochem 34, 123-31; Kitagawa, Y., et al. 1996. Clin Cancer Res 2, 909-14; Neal, D.E., et al. 1990. Cancer 65, 1619-25; Osaki, A., et al. 1992. Am J de Surg 164, 323-6; Pavelic, K., et al. 1993. Anticancer Res 13, 1133-7; Sauter, G., et al. 1996. Am J Pathol 148, 1047-53 ; Torregrosa, D., et al. 1997. Clin Chim Acta 262, 99-119). La sonda CEP 7, marcada con SpectrumGreen, se hibrida al ADN satelite alfa localizado en el centromero del cromosoma 7 (7p11.1-q11.1).
Pueden usarse otros metodos conocidos en la tecnica para determinar aberraciones en el numero de copias; ejemplos ilustrativos, no limitativos de los mismos incluyen microalineamientos basados en oligonucleotidos (Lucito, et al. 2003. Genoma Res. 13:2291-2305; Bignell et al. 2004. Genoma Res. 14:287-295; Zhao, et al. 2004. Cancer Research, 64(9):3060-71).
En otra realizacion particular, el nivel de polisoirna/amplificacion del gen de EGFR y/o el nivel LOH del gen de PTEN se mide usando polimorfismos de longitud de secuencia simple (o microsatelites) (Virmani A.K. et al. Genes cromosomas Cancer 1998, 21 (4) 308-319) o los SNP como marcadores geneticos (Lindblad-toh K et al. Nat. Biotechnol. 2000, 18(9)1001-1005); en una realizacion particular, el nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y/o el nivel LOH del gen de PTEN se mide usando un alineamiento SNP.
En otra realizacion particular, el nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y/o el nivel LOH del gen de PTEN se miden mediante secuenciacion de polinucleotidos, es decir, un metodo para determinar el orden de las bases de nucleotidos en una molecula de un polinucleotido. En una realizacion particular, la secuenciacion de polinucleotidos se realiza usando una tecnologfa de secuenciacion profunda. En una realizacion mas particular, la tecnologfa de secuenciacion usa un sistema de pirosecuenciacion paralela a gran escala que puede secuenciar mas o menos 400600 megabases de ADN por serie con longitudes lefdas de 400-500 pares de bases en un secuenciador adecuado (por ejemplo, secuenciador de genoma FLX con series de reactivos GS FLX Titanium). El sistema se base en fijar fragmentos de ADN nebulizados y ligados a adaptador a perlas de captura de ADN pequenas en una emulsion de agua en aceite. El ADN fijado a estas perlas se amplifica entonces mediante PCR. Cada perla unida a ADN se coloca en un pocillo en una placa picotituladora, un chip optico de fibra. Tambien se empaquetan una mezcla de enzimas tales como ADN polimerasa, ATP sulfurilasa y luciferasa en el pocillo. Entonces se coloca la placa picotituladora en el sistema GS FLX para secuenciacion. Esta tecnologfa de secuenciacion puede secuenciar cualquier ADN de doble cadena y permitir una variedad de aplicaciones incluyendo secuenciacion de genoma completo de novo, resecuenciacion de genomas completos y regiones diana de ADN, metagenomica y analisis de ARN. En otra realizacion, la tecnologfa de secuenciacion es la tecnologfa de secuenciacion de amplicon, es decir, una secuenciacion ultra profunda disenada para permitir mutaciones que van a detectarse a niveles extremadamente bajos, y PCR amplifica regiones espedficas, diana de ADN. Este metodo se usa para identificar mutaciones somaticas de baja frecuencia en muestras de cancer o descubrir de las variantes raras en individuos infectados VIH.
La determinacion del nivel del polisom^a/amplificaciOn de EGFR y el nivel de LOH de PTEN, necesita correlacionarse con un valor de referencia convencional. Dichos valores de referencia convencionales los genera el experto en la tecnica en forma de una tabla que divide al paciente en numero ascendente de copias del gen de EGFR o con respecto al nivel de LOH y numero ascendente de copias del gen de PTEN.
Para EGFR, pueden generarse los valores de referencia, sin limitacion, usando por ejemplo, la clasificacion de Capuzzo et al. (Cappuzzo et al. JNCI 2005;4:643-55). En esta clasificacion, se clasifican los pacientes en seis estratos con numero ascendente de copias del gen de EGFR por celula segun la frecuencia de celulas tumorales con numero espedfico de copias del gen de EGFR por cromosoma 7. Tal como se menciono anteriormente, estan disponibles comercialmente sondas de control que detectan el cromosoma 7 para obtener un numero de razon de copias de gen de EGFR/cromosoma 7. Por ejemplo, puede usarse la sonda SpectrumGreen CEP 7 (Vysis) que se hibrida a secuencias satelite alfa espedficas para cromosoma 7.
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Un ejemplo no limitativo de una tabla para clasificar un paciente que es responsable de la polisorna del gen de EGFR es:
1) disorna (D): < 2 copias en > 90% de las celulas de la muestra;
2) baja trisorna (LT): < 2 copias en > 40% de las celulas de la muestra o 3 copias en el 10% - 40% de las celulas de la muestra o > 4 copias en <10% de las celulas de la muestra;
3) alta trisorna (HT): < 2 copias en > 40% de las celulas de la muestra o 3 copias en > 40% de las celulas de la muestra o > 4 copias en <10% de las celulas de la muestra;
4) baja polisomfa (LP): > 4 copias en el 10% - 40% de las celulas de la muestra; y
5) alta polisorna (HP): > 4 copias en > 40% de las celulas de la muestra o la presencia de amplificacion (presencia de agrupaciones de gen de EGFR ajustadas y una razon de gen de EGFR con respecto a cromosoma de > 2 o > 15 copias de EGFR por celula en > 10% de celulas analizadas de la muestra).
Como entendera el experto en la tecnica, el metodo [1] de la invencion puede realizarse usando mas de una muestra de un paciente. En tal caso, se considera que existe una “alto nivel de polisorna del gen de EGFR” cuando al menos el 50%, preferiblemente mas del 50%, mas del 60%, mas del 70%, mas del 80%, mas del 90%, mas del 95%, o incluso mas, de las muestras del paciente se clasifican como “alta polisorna” (HP) segun los criterios de clasificacion descritos anteriormente.
Para la generacion de una tabla para la clasificacion de los pacientes que es responsable del nivel del LOH y numero de copias del gen de PTEN, el experto en la tecnica podna clasificar, por ejemplo, el pacientes en 4 estratos con numero ascendente de copias del gen de PTEN por celula segun la frecuencia de celulas tumorales con numero espedfico de copias del gen de PTEN por cromosoma 10. Tal como se menciono anteriormente, estan disponibles comercialmente sondas de control que detectan el cromosoma 10 para obtener un numero de razon de copias de gen de PTEN/cromosoma 10. Por ejemplo, puede usarse la sonda SpectrumGreen CEP 10 (Vysis) que se hibrida a secuencias satelite alfa espedficas para cromosoma 10.
Un ejemplo no limitativo de una tabla para clasificar un paciente que es responsable de la polisorna / nivel de LOH del gen de PTEN es:
1) disorna (D): 2 copias de cada sonda en >90% de celulas;
2) LOH: <2 copias de PTEN sonda en >10% de celulas (incluye monosorna o disorna de cromosoma 10 con PTEN LOH, siempre en >10% de celulas);
3) polisorna (P): > 3 copias de cada sonda (PTEN+ CEP 10) en >10% de celulas (no discrimina entre polisorna alta y baja, o trisorna de cromosoma 10); y
4) amplificado (AMP): definido por una razon del gen de PTEN con respecto a cromosoma 10 de > 2 por celula en > 10% de celulas analizadas.
Como entendera un experto en la tecnica, el metodo [1] de la invencion puede realizarse usando mas de una muestra de un paciente. En tal caso, se considera que existe un “nivel LOH alto del gen de PTEN” cuando al menos el 50%, preferiblemente mas del 50%, mas del 60%, mas del 70%, mas del 80%, mas del 90%, mas del 95%, o incluso mas, de las muestras del paciente se clasifican como “LOH” segun los criterios de clasificacion descritos anteriormente.
En la ultima etapa del metodo [1] de la invencion, un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dichos valores de referencia convencionales y altos niveles de expresion y/o alta polisorna/amplificacion del gen de EGFR son indicativos de un buen desenlace clmico del sujeto.
Como entendera un experto en la tecnica, las muestras pueden tambien considerarse no apropiadas para incluirse en cualquiera de los estratos de clasificacion. Por tanto, en una realizacion preferida, adicionalmente, se tinen secciones de muestras de tejido del paciente con colorantes como hematoxilina y eosina (H&E) y las revisan dos o mas expertos en la tecnica (es decir, bioqmmicos clmicos) para evaluar contenido tumoral general, necrosis y calidad general (por ejemplo, efecto de cauterizacion termica, fijacion con morfologfa, etc.). En una realizacion preferida las muestras usadas para determinar los niveles de expresion y/o los niveles de polisorna del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN tienen al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% de tumor tejido en la muestra, y tienen una fijacion apropiada con morfologfa aceptable.
Las ensenanzas de la presente invencion no estan de acuerdo con las conclusiones alcanzadas por Umesh et al. (Clinical Neuropathology. Vol. 28 - No. 5/2009 (362-372)), quien describe un metodo para predecir el desenlace del paciente de glioma que comprende la deteccion de amplificacion de EGFR y lOh de PTEN mediante inmunohistoqmmica (IHC) en el que se afirma que el gen de EGFR amplificacion asociada a LOH del gen de PTEN
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tiende una escasa supervivencia.
Efectivamente, como se muestra en el ejemplo, las ensenanzas de la presente invencion, que comprende combinar polisoirna/amplificacion de EGFR (es decir, expresion de EGFR) con LOH del gen de PTEN en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, un ensayo basado en hibridacion, secuenciacion o alineamientos SNP [el nivel de polisoirna/amplificacion del gen de EGFR puede determinarse a nivel de protema o, alternativamente, a nivel de acido nucleico] muestran que una amplificacion de EGFR asociada a LOH del gen de PTEN tiende a buena supervivencia.
Los ensayos realizados por los inventores han mostrado que, aparentemente, el uso de IHC para determinar el nivel del LOH del gen de PTEN no es adecuado para evaluar de manera precisa su perfil de expresion relevante que es especialmente importante en expresion baja pero sin perdida de protema PTEN, los tumores en los que una diferencia cntica de este tipo permitira la evaluacion verdadera de expresion de protema en esta configuracion. Ademas, pueden atribuirse diferentes resultados en un ensayo IHC a anticuerpos espedficos y su sensibilidad para evaluar PTEN; existe bibliograffa documentada para respaldar los retos de usar IHC para evaluar PTEN cuando se compara con FISH (por ejemplo, Reid et al., British Journal of Cancer 2010, 102:678-684). Metodos FISH para ADN generalmente tiene impacto sobre la preparacion de la muestra analttica previa, por el contrario, tales diferencias en fijacion y manejo de muestras tienen impacto sobre el antfgeno de PTEN en tejido. Una manera de abordar esto es usar modelado matematico con IF cuantitativa para evaluar expresion verdadera frente a union no espedfica y 'ruido' en el sistema.
Por tanto, la invencion proporciona un metodo para predecir de una manera mas precisa el desenlace clmico de un sujeto que padece glioma.
Los hallazgos de los inventores permiten la determinacion del desenlace clmico de un paciente que padece glioma midiendo el nivel LOH del gen de PTEN. Por tanto, se da conocer tambien un metodo para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioma, a continuacion en el presente documento se denomina el metodo [2], comprendiendo dicho metodo:
a) determinar el nivel LOH del gen de PTEN en una muestra del sujeto, y
b) comparar dicho nivel LOH del gen de PTEN con un valor de referencia convencional,
en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, o mediante un ensayo basado en hibridacion, o mediante secuenciacion o mediante una analisis de SNP; y
en el que un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dicho valor de referencia convencional, es indicativo de un mal desenlace clmico del sujeto.
El termino glioma se ha definido previamente. En una realizacion preferida, el glioma es un gliobastoma multiforme (GMB) y mas preferiblemente el gliobastoma es un gliobastoma temprano.
En una realizacion preferida, el desenlace clmico se mide como supervivencia.
El termino “muestra” se ha definido previamente en relacion con el metodo [1] de la invencion y puede aplicarse a cualquier tipo de muestra biologica de un paciente, tal como una muestra de biopsia, tejido, celula o fluido (sangre completa, suero, saliva, semen, expectoracion, lfquido cefalorraqrndeo (LCR), orina, lagrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares). En una realizacion particular, dicha muestra es una parte o muestra de tejido tumoral del mismo En una realizacion mas particular, dicha muestra de tejido de tumor es una muestra de tejido cerebral tumoral de un paciente que padece glioma o una muestra de tejido de cerebro incrustado en formalina.
Los metodos para determinar el nivel LOH del gen de PTEN se han descrito anteriormente asf como los valores de referencia convencionales usados. En una realizacion preferida, el nivel LOH del gen de PTEN se determina mediante un ensayo basado en hibridacion, por ejemplo, mediante FISH.
La invencion tambien se refiere al uso de un kit util en la implementacion la metodologfa descrita en el presente documento. Por tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un kit que comprende un conjunto de agentes que pueden determinar espedficamente los niveles de expresion y/o la polisoirna/amplificacion de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN y, opcionalmente, un reactivo para detectar un gen constitutivo o la protema codificada por dicho gen constitutivo y/o un reactivo para detectar los cromosomas 7 y 10, para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioblastoma multiforme, en el que el conjunto de agentes que pueden determinar espedficamente el nivel LOH del gen de PTEN comprende un par de cebadores de oligonucleotidos adecuados para amplificar un fragmento espedfico del gen de PTEN y/o una sonda de oligonucleotido marcada opcionalmente que se une selectivamente a una secuencia diana de polinucleotido sobre la region del cromosoma del gen de PTEN y/o reactivos adecuados para realizar una reaccion de secuenciacion y/o reactivos para realizar un analisis de SNP.
En una realizacion particular del uso del kit de la invencion, los agentes del kit pueden detectar espedficamente los
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niveles de ARNm de genes de EGFR y/o de PTEN o los niveles de las protemas EGFR y/o PTEN, preferiblemente, los niveles del protema EGFR.
Los acidos nucleicos que pueden hibridarse espedficamente con los genes EGFR y/o de PTEN pueden ser uno o mas pares de cebadores de oligonucleotidos para la amplificacion espedfica de fragmentos de los ARNm (o sus correspondientes ADNc) de dichos genes y/o uno o mas sondas para la identificacion de uno o mas genes seleccionados de dichos genes. Acidos nucleicos que pueden hibridarse espedficamente con los genes de EGFR y/o PTEN pueden ser tambien sondas para FISH.
Anticuerpos, o un fragmento del mismo, que pueden detectar un antigeno, que pueden unirse espedficamente a protemas EGFR y/o PTEN o a variantes de los mismos son, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos de anticuerpo, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, ScFv, dicuerpos, tricuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.
Dichos reactivos, espedficamente, las sondas y los anticuerpos, pueden fijarse sobre un soporte solido, tal como una membrana, un plastico o un vidrio, tratado opcionalmente con el fin de facilitar la fijacion de dichas sondas o anticuerpos sobre el soporte. Dicho soporte solido, que comprende, al menos, un conjunto de anticuerpos que puede unirse espedficamente a protemas EGFR y/o PTEN o a variantes de los mismos, y/o sondas espedficamente hibridadas con los genes de EGFR y/o PTEn, pueden usarse para la deteccion de los niveles de expresion por medio de tecnologfa de alineamiento.
Los kits para el uso de la invencion comprenden opcionalmente reactivos adicionales para detectar un polipeptido codificado por un gen constitutivo o el ARNm codificado por dichos genes constitutivos. La disponibilidad de dicho reactivo adicional permite la normalizacion de mediciones tomadas en diferentes muestras (por ejemplo la muestra de prueba y la muestra de control) para excluir que las diferencias en la expresion de los diferentes marcadores biologicos son debidos a cantidades diferentes de protema total en la muestra en vez de en diferencias reales en niveles de expresion relativos. Genes constitutivos, tal como se usa en el presente documento, se refieren a genes que codifican protemas que se expresan constitutivamente y llevan a cabo funciones celulares esenciales. Los genes constitutivos preferidos para su uso en la presente invencion incluyen p-2-microglobulina, ubiquitina, protema ribosomal 18-S, ciclofilina, GAPDH y actina.
En una realizacion, el kit para su uso de la invencion puede contener reactivos adecuados para realizar una reaccion de secuenciacion y/o reactivos para realizar un alineamiento SNP, por ejemplo, enzimas, nucleotidos, etc.
En otra realizacion, la invencion se refiere al uso de un kit de la invencion para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece gliobastoma multiforme, en el que si dichos agentes detectan un alto nivel de expresion y/o alto nivel de polisomfa / amplificacion del gen de EGFR y un alto nivel LOH del gen de PTEN, con respecto a valores de referencia convencionales, en una muestra a partir de dicho sujeto, entonces el desenlace clmico del sujeto es bueno.
Previamente se han descrito metodos para detectar los niveles de expresion de EGFR y los metodos para determinar la polisoirna del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN asf como los valores de referencia convencionales (vease, por ejemplo, metodo [1] de la invencion).
En otra realizacion, se da conocer tambien el uso de los niveles de expresion EGFR y/o niveles de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN como marcador predictivo del desenlace clmico de un paciente con glioma. En una realizacion particular, el glioma es un gliobastoma multiforme (GMB). En otra realizacion particular, el desenlace clmico se mide como supervivencia.
En otra realizacion particular, se da a conocer tambien el uso de erlotinib y/o temozolomida en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un glioma en un sujeto que padece un glioma, en el que el medicamento es para un sujeto que tiene un alto nivel LOH del gen de PTEN, que se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante una analisis de SNP, con respecto a un valor de referencia convencional y altos niveles de expresion y/o alta polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a valores de referencia convencionales. Alternativamente, se da conocer tambien erlotinib y/o temozolomida para su uso en el tratamiento de un glioma en un sujeto que padece un glioma, en el que el medicamento es para un sujeto que tiene un alto nivel LOH del gen de PTEN, que se mide mediante pCr, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante un alineamiento SNP, con respecto a un valor de referencia convencional y altos niveles de expresion y/o alta polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a valores de referencia convencionales. El glioma puede ser un gliobastoma multiforme (GMB). El desenlace clmico puede medirse como supervivencia.
En otra realizacion, se da a conocer tambien el uso de radioterapia en un regimen para el tratamiento de un glioma en un sujeto que padece un glioma, en el que dicho sujeto tiene un alto nivel LOH del gen de PTEN, que se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante secuenciacion o mediante una analisis de SNP, con respecto a un valor de referencia convencional y altos niveles de expresion y/o alta polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a valores de referencia convencionales. El glioma puede ser un gliobastoma multiforme (GMB). El desenlace clmico puede medirse como supervivencia.
EJEMPLOS
I. MATERIAL Y METODOS
Pacientes y muestras
Se obtuvieron multiples bloques incrustados en parafina fijados en formalina de cincuenta y seis (56) muestras de 5 tumor cerebral primario del Hospital Universitari de Belvitge. Estos pacientes formaban parte de una cohorte longitudinal y se seleccionaron utilizando criterios de inclusion predeterminados que inclman un diagnostico primario de uno cualquiera de los siguientes criterios: tumor astrocftico, oligodendrodtico y glial, con seguimiento continuo durante una mediana de 3 anos y material tisular disponible. Se extrajeron datos clmicos de la historia clmica del paciente utilizando un conjunto de campos de datos predeterminados clmico-patologicos y de desenlace (vease la 10 tabla 1). El desglose histologico de las muestras de tumor era como sigue:
I. Grupo astrocitoma, total 44 pacientes: pilodtico (1), difuso (13), anaplasicos (16), y glioblastoma multiforme (14);
II. Grupo oligodendroglioma, total 6 pacientes: oligodendroglioma (6); y
III. Mixto, total 4 pacientes: oligoastrocitoma (3), y oligoastrocitomas anaplasicos (1).
Se realizo una revision completa de los archivos de datos clmicos disponibles en todos los pacientes en que estaban 15 disponibles bloques/muestras incrustados en parafina (FFPE) fijados en formalina para analisis adicional.
Se obtuvieron secciones de 5 pm de todos los bloques, se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) y las revisaron dos bioqmmicos clmicos para evaluar el contenido tumoral global (> 50% tumor en al menos un campo 200X), la necrosis y la calidad global (por ejemplo, efecto de cauterizacion termica, fijacion apropiada con aceptable morfologfa, etc). Entonces se obtuvieron secciones posteriores para ensayos FISH de ADN e inmunofluorescencia 20 cuantitativa (SI) tal como se explica resumidamente a continuacion. Se mantuvieron todos los bloques para estudios posteriores incluyendo RT-PCR.
Tabla 1. Campos de datos clmicos
Glioblastoma
para la cohorte entera con
desglose
segun grupo de N=15
diagnostico
Masculino 8
Genero
del
Femenino 7
paciente
No disponible 0
Raza
del Caucasica 15
paciente
No disponible 0
Si 4
Convulsiones
Mn No 1 1 11
sintomaticas
No disponible 0
Si 7
Presion
intracraneal
alta No 8
sintomatica
No disponible 0
Imagen 1 12
Numero
de Imagen 2 1
lesiones
en
pretratamiento
Multiples 2
No disponible 0
1 ubicacion
de Lobulo frontal 10
lesiones
en
imagen
de Lobulo temporal 3
pretratamiento
Lobulo parietal 1
Astrocitoma
Mixto / otros No disponible
N=26
N=5 N=10
17
4 5
9
1 3
0
0
2
25
5 8
1
0 2
13
2 5
13
2 3
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21
3 7
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1
3
2
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2
2
1
7
2
1
Operculo
0 1 0
Tronco encefalico
1 2 1
Medula espinal
0 1 0
Nervio optico
0 0 0
Cisura interhemisferica
0 1 0
Cerebelo
0 0 0
0 1 0
No disponible
0 1 0
Lobulo temporal
1 1 0
Lobulo parietal
3 1 0
Lobulo occipital
2 1 0
Cuerpo calloso
0 1 0
Ganglios basales
2 0 0
Tronco encefalico
0 1 0
Talamo
0 0 0
No disponible
7 21 5
Derecho
9 12 2
Izquierdo
4 11 3
Desconocido
0 1 0
No disponible
2 2 0
Izquierdo
1 1 0
No disponible
14 25 5
Biopsia
1 6 0
Biopsia estereotaxica
2 4 0
Reseccion
12 16 5
No disponible
0 0 0
Completa
4 11 1
Incompleta
10 12 4
No disponible
1 3 0
Si
7 12 3
No
8 12 2
No disponible
0 2 0
Focal
5 8 0
radiacion Dosis total de radiacion (**)
No disponible 10 18 5 9
(datos disponibles: n=20)
60,0 (60,0-60,0) 60,0 (40,0-60,0) 51,0 (48,0-54,0) 60,0 (60,0-60,
Si 2 9 1 1
Quimioterapia
No 13 15 4 7
No disponible 0 2 0 2
BCNU 0 7 0 0
Tipo de primera
TMZ 2 1 0 0
quimioterapia
PCV 0 1 0 1
No disponible 13 17 5 9
Si 4 13 4 6
Reca^da o progresion
No 9 10 1 1
No disponible 2 3 0 3
Focal 3 8 4 6
Tipo de primera
Difusa 1 1 0 0
recafda
Multiple 0 2 0 0
No disponible 11 15 1 4
Si 3 10 4 5
Tratamiento de primera recafda
No 1 1 0 1
No disponible 11 15 1 4
Radiacion 0 2 1 1
1 tipo de
Quimioterapia 2 3 1 0
tratamiento de primera recafda
Cirugfa 1 4 2 4
Radiocio^a
0 1 0 0
No disponible 12 16 1 5
2 tipo de
Radiacion 0 2 0 4
tratamiento de primera recafda
Quimioterapia 0 1 0 0
No disponible
15 23 5 6
3 tipo de tratamiento de
Quimioterapia 0 1 0 1
primera recafda Valor de pretratamiento
No disponible 15 25 5 9
Karnovsky (**) (datos disponibles: n=49)
70,0(40,0-100) 90,0 (20,0-100) 95,0 (90,0-100) 100(60,0 100)
Valor de pretratamiento
60,0(30,0-90,0) 80,0(10,0-100) 95,0 (80,0-100) 100(30,0 100)
5
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Karnovsky (datos disponibles: n=49)
Muerte paciente
del Si 15 15 1 1
No 0 7 3 5
No disponible 0 4 1 4
ADN EGFR y PTEN FISH
Usando la sonda de color dual LSI EGFR/CEP 7 (Vysis, Abbot Molecular) para EGFR y la sonda de color dual LSI PTEN (10q23)/CEP 10 para PTEN (Vysis, Abbot Molecular), se realizo ADN FISH incluyendo hibridacion, lavado y deteccion de fluorescencia en todas las muestras en la cohorte segun protocolos estandar (Smith et al., 2001. JNCI; 93:1246-1256). Brevemente, se desparafinaron secciones parafina en xilenos, se sometieron a microondas en disolucion de citrato de sodio 10 mmol/l (pH 6.0) durante 5-10 minutos, enfriados hasta temperatura ambiente, se enjuagaron, y se trataron entonces con HCl pepsina durante 5 minutos a 37°C antes de enjuagarse y se deshidrataron. Se aplico la mezcla de sonda precalentada a los portaobjetos y cubreobjetos sellados en el sitio con adhesivo de caucho. Los portaobjetos se desnaturalizaron entonces a 85°C durante de 4 a 6 minutos usando una camara de hibridacion automatizada y entonces se incubaron durante la noche a 37°C. Despues de los lavados poshibridacion convencionales, se tineron los portaobjetos con la tincion de ADN DAPI y se montaron con Antifade (Vectashield). Antes de la obtencion de imagenes, un patologo evaluo todos los portaobjetos H&E y se identificaron regiones de interes basandose en criterios histopatologicos y calidad incluyendo contenido tumoral, fijacion apropiada, necrosis y vascularidad. Una imagen H&E de casos de GBM individuales se ilustra en la figura 5A. Un cientffico formado ciego para el desenlace sometio a obtencion de imagenes todos los portaobjetos usando un microscopio inmunofluorescente Nikon. Se definieron criterios para anomalfas FISH mediante el uso de muestras de cerebro histologicamente normales. Una ganancia simple requirio el 10% o mas de nucleos con tres o mas senales de sonda espedficas para locus. La perdida del brazo q del cromosoma 10 requirio que la razon PTEN/CEP10 media global fuese menos de 0.90. Se aplico amplificacion tanto para EGFR como para PTEN y requirio que la razon fuese de 2 o mas y que el 10% o mas de nucleos tuviera mas de tres senales EGFR y/o PTEN. Se adquirieron regiones de interes representativas para documentacion de senal en todas las muestras (ejemplos de imagenes representativas de FISH AMP/HP de EGFR y monosoirna de PTEN se muestran en las figuras 5B y C, respectivamente). Para EGFR FISH se siguio el esquema de clasificacion de Capuzzo et al. (Cappuzzo F, et al., JNCI 2005;4: 643-55) y se identificaron 6 categonas para categona EGFR en todas las muestras de tumor. Estas categonas individuales inclman: D=disoirna, HT= alta trisoirna, LT= baja trisoirna, HP=alta polisoirna, LP=baja polisoirna, y AMP=amplificacion. En este esquema tanto HP como AMP se consideran amplificacion. Se caracterizo la categona PTEN como D=disoirna, LOH=>10%, P=polisoirna, AMP=amplificado y NE=no evaluable. Un unico observador reviso todos los casos y los registro de manera anonima con respecto a tipo de tumor o desenlace.
Inmunofluorescencia cuantitativa (SI)
Utilizando metodos establecidos previamente (Cordon Cardo et al., 2007 JCI 2007; 117; 1876-83; Donovan et al., 2008 JCO;26:3923-3929) se construyo el ensayo multiplex-1 (mplex1) que incorpora anticuerpos a: GFAP (protema acida fibrilar glial), PTEN (fosfatasa y homologo de tensina), pAKT y Ki67 combinados con la tincion nuclear DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindol) - vease la tabla 2 para una revision completa de anticuerpos usados dentro del ensayo mplex1. Se evaluaron los anticuerpos individuales en ensayos IF simplex usando tejidos de control y lmeas celulares para confirmar la sensibilidad a la expresion y la especificidad antes de la inclusion en el ensayo multiplex-1.
Tabla 2. Lista de reactivos
Anticuerpo
Proveedor n.° de catalogo Dilucion
1:30
PTEN
Neomarkers
Ki67
Dako 1:100
pAKT
CST n.° 3787 1:25
GFAP
Dako 1:200
Brevemente, se desparafinizaron las muestras FFPE, se
Isotipo
Marcadores Muestras
M IgG1
2X M 488 Casos GBM, LNCaP cerebral NL
Tonsil
M IgG1
2X M 555 Igual
R IgG
2X R 594 Igual
M IgG1
2X M 647 Igual
rehidrataron y se
sometieron a un procedimiento de
recuperacion de antigeno con el sistema de tampon de recuperacion (Biocare Medical). Se combino una serie de cuatro anticuerpos con DAPI en un ensayo de inmunofluorescencia multiplex. Se marcaron diferencialmente los reactivos enumerados en la tabla 2 y con los fluorocromos identificados y entonces se aplicaron de manera secuencial a secciones individuales usando un dispositivo de inmunotincion Nemesis 7200 (BioCare Medical). Un 5 patologo (ciego para el desenlace) adquirio un mmimo de tres imagenes o regiones de interes (ROI) usando un microscopio inmunofluorescente Nikon 90i equipado con un sistema de obtencion de imagenes espectrales CRI (CRI). Utilizando bibliotecas sin mezclar desarrolladas previamente y el software CRI, se generaron imagenes en escale de grises individuales que representan el anticuerpo - combinacion de filtro en investigacion. Se evaluaron las imagenes individuales para determinar la razon senal:ruido, distribucion celular y distribucion conjunta con otros 10 reactivos marcados con fluorocromos-anticuerpos. Usando el manual del softWare CRI existente, se crearon umbrales para que las combinaciones anticuerpo-fluorocromo individual se maximizaran la senal:ruido y conservaran la distribucion. Se generaron metricas cuantitativas usando el software para identificar porcentajes de poblaciones celulares individuales que presentan una senal positiva (basandose en el umbral), normalizada con respecto a la region tumoral en evaluacion. Se obtuvieron una serie de lmeas celulares cancer de prostata incluyendo LNCaP, 15 PC3 y DU145 (ATCC), se hicieron crecer hasta confluencia, se cultivaron como aglomerados de celulas agar, se fijaron e incrustaron en parafina y entonces se colocaron las tres lmeas celulares en un alineamiento celular para control de calidad durante tanto el desarrollo del ensayo como la investigacion de casos de tumor cerebral.
Resultados y discusion
Pacientes y muestras
20 Habfa 54 pacientes con historias clmicas disponibles y muestras de tejido FFPE apropiadas para evaluacion. El desglose de pacientes se enumera en la tabla 3 con la mayona de pacientes en la categona de diagnostico de astrocitoma. Las caractensticas demograficas individuales incluyendo datos de sexo, localizacion de masa, tratamiento y desenlace se explica en detalle en la tabla 1.
Tabla 3. Categona de diagnostico de los pacientes
Codigos originales GBM puro Astrocitoma Oligodendroglio Mixto / otro
ma
001: astrocitoma grado II
0 10 0 0
002: astrocitoma grado III
0 16 0 0
003: glioblastoma
15 0 0 0
004: oligoastrocitoma grado II
0 0 0 3
005: oligoastrocitoma grado III
0 0 0 2
006: oligodendroglioma grado II
0 0 4 0
007: oligodendroglioma grado III
0 0 1 0
008: astrocitoma pilodtico
0 2 0 0
009: gliomatosis cerebri
0 0 0 1
999: No disponible
0 0 0 2
25 Con el fin de entender las tendencias de supervivencia general dentro de la cohorte y en particular el grupo de glioblastoma frente a otros, se realizaron analisis de funcion de supervivencia Kaplan-Meier para estimar la supervivencia entre los tres grupos. La figura 1 es la curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra una supervivencia reducida en el grupo glioblastoma frente al astrocitoma anaplasico y categonas mixtas (prueba de log- rango P=0,001). La figura 2 es una segunda curva de funcion de supervivencia Kaplan-Meier que evalua un punto 30 final mas compuesto que incluye supervivencia libre de progresion y global en las tres mismas categonas de diagnostico (prueba log-rango P<0,001). Segun la bibliograffa, el grupo glioblastoma tiene una supervivencia global y libre de progresion reducida y en comparacion con el astrocitoma y grupo oligodendroglioma puro que tiene el mayor tiempo de supervivencia de las tres categonas de diagnostico. Como resulta evidente a partir de las curvas, parece que un subconjunto del grupo astrocitoma anaplasico se comporta como la categona de glioblastoma.
35 EGFR y PTEN FISH
Dada la frecuencia de amplificacion de EGFR (aproximadamente el 40%) y el papel notificado que desempena EGFR en el desarrollo de glioblastoma, el primer estudio ADN FISH realizado fue sobre la caracterizacion de EGFR. Usando los metodos de puntuacion de tanto Cappuzzo et al. (Capuzzo et al., 2005 JNCI; 4:643-55) como Smith et al. (Smith et al., 2001 JNCI; 93:1246-1256), se investigaron los perfiles EGFR en todos los casos de tumor cerebral en
5
10
15
20
25
el grupo. Dado el tamano global de la cohorte, se opto por clasificar adicionalmente a los pacientes como positivos si presentaban cualquier polisoirna y/o amplificacion del locus de EGFR o cromosoma 7. Esto es contraste con algunos estudios notificados que caracterizan independientemente EGFR ADN FISH o bien como polisoirna o bien como amplificacion. En el estudio, el 71% de los pacientes GBM tema polisoirna/amplificacion EGFr en comparacion con el 45% en el grupo astrocitoma anaplasico. No se encontro amplificacion de EGFR o polisoirna asociada a la supervivencia cuando se examino la cohorte entera o subgrupos individuales (todos los pacientes de la prueba log- rango P=0,8; pacientes de solo glioblastoma P=0,1). Tambien se realizo FISH con sondas de color dual para PTEN que utilizan un sistema de puntuacion similar a EGFR; sin embargo ademas de disoirna y polisoirna, se incluyo la perdida de PTEN como mayor del 10% en nucleos epiteliales tumorales. En los estudios, el 61% de muestras GBM tema PTEN LOH en comparacion con el 25% en el grupo astrocitoma anaplasico. Existe escasa bibliograffa sobre la evaluacion de PTEN mediante ADN FISH en muestras de tumor cerebral usando la mayona de los estudios mas tecnicas moleculares tales como secuenciacion, RT-PCR e inmunohistoqmmica (IHC). De manera resenable en la cohorte, PTEN LOH se asocio de manera invariable y estadfstica a una supervivencia reducida en el glioblastoma multiforme combinado, astrocitoma y grupos de paciente mixtos (n=25 sin lOh, supervivencia mediana 913D frente a n=10 con LOH, supervivencia mediana 174D; prueba log-rango p=0,04) [vease la figura 3].
Ni la polisoirna/amplificacion EGFR ni la perdida de PTEN fueron factores pronostico independientes, significativos para la supervivencia en el glioblastoma de solo el grupo (P=0,1); sin embargo, cuando se combinaron, se observo una tendencia a significativo con un aumento en la supervivencia global (n=6 con tanto EGFR/PTEN, supervivencia mediana 242D frente a n=6 sin, supervivencia mediana 71D; prueba log-rango P=0,034) (Figura 4). La hipotesis es que la combinacion de PTEN LOH y amplificacion de EGFR en glioblastoma puede representar un subconjunto de pacientes con un fenotipo tumoral mas susceptible a radiacion y/o tratamiento con temozolomida.
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Informacion de variables de la tabla 4: gender = “genero de los pacientes” age = “edad de los pacientes” sympseiz = “convulsiones sintomaticas”

Claims (11)

10
2.
3.
15
4.
5.
20
6.
7.
8.
25
30
9. 35
10.
11.
40
REIVINDICACIONES
Metodo para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioblastoma multiforme (GBM) que comprende:
a) determinar el nivel de expresion o el nivel de polisoirna/amplificacion del gen de EGFR y la perdida de nivel de heterocigosidad (LOH) del gen de PTEN en una muestra del mismo sujeto, y
b) comparar dicho nivel de expresion o el nivel de polisoiTHa/amplificacion del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN con valores de referencia convencionales,
en el que el nivel LOH del gen de PTEN se mide mediante PCR, mediante un ensayo basado en hibridacion, mediante tecnologfa de secuenciacion o mediante un analisis de SNP; y
en el que un alto nivel LOH del gen de PTEN con respecto a dicho valor de referencia convencional y un alto nivel de expresion y/o alto nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR con respecto a dichos valores de referencia convencionales son indicativos de un buen desenlace clmico del sujeto.
Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el desenlace clmico se mide como supervivencia.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra es una muestra celular o tisular, preferiblemente una muestra de tejido tumoral.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el nivel de expresion del gen de EGFR se mide determinando el ARNm y/o el nivel de expresion de protema de dicho gen.
Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho ensayo basado en hibridacion comprende una transferencia de tipo Southern, hibridacion in situ (ISH), hibridacion in situ fluorescente (ISH), o un ensayo de hibridacion genomica comparativa (CGH).
Metodo segun la reivindicacion 1 y 5, en el que el nivel LOH del gen de PTEN se determina mediante FISH.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el glioblastoma es glioblastoma precoz.
Uso de un kit que comprende un conjunto de agentes que pueden determinar espedficamente el nivel de expresion o el nivel de polisom^a/amplificaciOn del gen de EGFR y el nivel LOH del gen de PTEN para predecir el desenlace clmico de un sujeto que padece glioblastoma multiforme, en el que el conjunto de agentes que pueden determinar espedficamente el nivel LOH del gen de PTEN comprende un par de cebadores de oligonucleotido para amplificar un fragmento espedfico del gen de PTEN, o una sonda de oligonucleotido marcada opcionalmente que se une selectivamente a una secuencia de polinucleotido diana sobre la region del cromosoma del gen de PTEN, o reactivos adecuados para realizar una reaccion de secuenciacion, o reactivos para realizar un analisis de SNP, y en el que si dichos agentes detectan altos niveles de expresion o un alto nivel de polisomna/ amplificacion del gen de EGFR y un alto nivel LOH del gen de PTEN, con respecto a valores de referencia, entonces el desenlace clfnico del sujeto es bueno.
Uso segun la reivindicacion 8, en el que el kit comprende ademas un reactivo para detectar un gen constitutivo o la protema codificada por dicho gen constitutivo.
Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que el conjunto de agentes para determinar espedficamente el nivel de expresion y/o el nivel de polisom^a/amplificaciOn del EGFR comprende un reactivo para detectar el nivel de ARNm del gen de EGFR o el nivel de la protema EGFR.
Uso segun la reivindicacion 10, en el que el reactivo para detectar el nivel de ARNm del gen de EGFR o el nivel de la protema EGFR comprende una sonda que se hibrida espedficamente con el gen de EGFR, o un anticuerpo que se une a la protema EGFR.
imagen1
imagen2
Supervivencia
Categorias de PTEN 2
Pacientes G.MB/AA/Mixto§
imagen3
Figura 3
imagen4
Pacientes..GMB
Mo (n=6; rmed»ana-7l tilas)
Si (n=S; fnediana=242 dias}
valor p log-rango: 0,034
: i"i
200
300
Dias hasta recaida/muerte
Figura 4
r" -.v:' ■ 2 -v“‘:,L' 52
GFR FISH AMP
PTEN FISH I.OH
Figura 5
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