ES2632170T3 - Microorganismo recombinante para la producción fermentativa de metionina - Google Patents

Microorganismo recombinante para la producción fermentativa de metionina Download PDF

Info

Publication number
ES2632170T3
ES2632170T3 ES12738603.5T ES12738603T ES2632170T3 ES 2632170 T3 ES2632170 T3 ES 2632170T3 ES 12738603 T ES12738603 T ES 12738603T ES 2632170 T3 ES2632170 T3 ES 2632170T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
methionine
gene
rbs01
microorganism
mete
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12738603.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Wanda Dischert
Rainer Figge
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2632170T3 publication Critical patent/ES2632170T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01014—5-Methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine S-methyltransferase (2.1.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Un microorganismo recombinante optimizado para la producción fermentativa de metionina, en el que la actividad de la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE se suprime y el gen metH se sobreexpresa en dicho microorganismo en comparación con un microorganismo no modificado.

Description

Microorganismo recombinante para la producción fermentativa de metionina
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a un microorganismo recombinante para la producción de metionina y a un método para producir metionina, al cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre. El microorganismo se modifica de modo que el rendimiento de metionina/fuente de carbono se incremente al atenuar la actividad de la metionina sintasa dependiente de cobalamina. En particular, el gen metE se elimina en el microorganismo recombinante.
Técnica anterior
Compuestos que contienen azufre tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para el metabolismo celular y se producen industrialmente para ser usados como aditivos de alimentos y piensos y productos farmacéuticos. En particular la metionina, un aminoácido esencial, que no puede ser sintetizada por los animales, representa un papel importante en muchas funciones corporales. Aparte de su papel en la biosíntesis de proteínas, la metionina está implicada en la transmetilación y en la biodisponibilidad de selenio y cinc. La metionina también se usa directamente para trastornos como alergia y fiebre reumática. No obstante, la mayoría de la metionina que se produce se añade a piensos.
Con la reducción del uso de proteínas derivadas de animales como resultado de BSE y la gripe aviar, se ha incrementado la demanda de metionina pura. Comúnmente, la D,L-metionina se produce químicamente a partir de acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, la mezcla racémica no se comporta tan bien como la L-metionina pura (Saunderson, 1985). Adicionalmente, aunque se puede producir L-metionina pura a partir de metionina racémica, por ejemplo, a través del tratamiento con acilasa de N-acetil-D,L-metionina, esto incrementa drásticamente los costes de producción. Según esto, la demanda creciente de L-metionina pura asociada a los problemas medioambientales hacen a la producción microbiana de metionina una perspectiva atractiva. Optimizar la producción de un producto químico procedente de un microorganismo implica típicamente sobreexpresar proteínas implicadas en la ruta biosintética, atenuar proteínas implicadas en la represión de la ruta biosintética o atenuar proteínas implicadas en la producción de subproductos no deseables. Todos estos enfoques para la optimización de la producción de L-metionina en microorganismos se han descrito previamente (véanse, por ejemplo, Kumar y cols., 2005 y las patentes o solicitudes de patente US 7.790.424, US 7.611.873, WO 2002/010209, WO 2005/059093, WO 2006/008097 y WO 2012/055798); sin embargo, la producción industrial de L-metionina a partir de microorganismos requiere mejoras adicionales.
En Escherichia coli y en otros microorganismos como Corynebacterium glutamicum, dos enzimas distintas catalizan la etapa final de la biosíntesis de novo de metionina (Foster y cols., 1961; González y cols., 1992). La metionina sintasa dependiente de cobalamina (MetH, EC 2.1.1.13) es codificada por el gen metH y contiene un grupo prostético que es requerido para la actividad. La metionina sintasa independiente de cobalamina (MetE, EC 2.1.1.14) es codificada por el gen metE y no tiene un requerimiento conocido de un grupo prostético derivado de vitamina. Numerosas solicitudes de patente están relacionadas con la sobreproducción de enzimas MetH y MetE para potenciar la última etapa de la biosíntesis de metionina, como por ejemplo:
Los documentos WO2007/012078 y WO2007/135188 de BASF describen alteraciones genéticas que conducen a la sobreexpresión de los genes metH y/o metE.
El documento WO2009/144270 de EVONIK describe un método para producir metionina con un microorganismo que presenta un incremento de la cantidad y/o actividad de un sistema de reactivación de MetH dependiente de cob(I)alamina.
La atenuación de la actividad enzimática de MetE también se ha descrito previamente. Chu y cols., 1985 y Hondorp y Matthews, 2009 describen alteraciones genéticas en cepas de E. coli que conducen a la atenuación. Sin embargo, Chu y cols. presenta solamente la clonación y la expresión del gen metE y un mutante del mismo, mientras que Hondorp y Matthews meramente evalúa los efectos de la atenuación sobre el crecimiento bacteriano es condiciones de estrés de disulfuro específicas.
Los inventores han encontrado, sorprendentemente e inesperadamente, que una atenuación de la cantidad y/o actividad de la metionina sintasa independiente de cobalamina (MetE) conduce a una mejora en la producción de metionina. Esta es la primera vez que la pérdida de actividad de una de las enzimas pertenecientes a la ruta de biosíntesis de metionina se propone como beneficiosa para la producción de metionina.
La divulgación se refiere a un microorganismo recombinante optimizado para la producción de metionina, en donde se atenúa la actividad de la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE. Preferiblemente, el gen metE que codifica la enzima MetE se elimina o se muta. El microorganismo recombinante también puede comprender otras modificaciones genéticas tales como:
5 un incremento en la expresión de al menos uno de los siguientes genes: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, thrA, alelo metA que codifica una enzima con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (metA*), thrA o un alelo thrA que codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina (thrA*) y/o
10 una expresión atenuada de uno de los siguientes genes: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL o yncA. En una realización particular, la presente invención se refiere a un microorganismo en el que: a) el gen metE se elimina, y b) la expresión de los genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA * y pyc se potencia; y c) la expresión de los genes metJ, pykA, pykF, pur U and yncA se atenúa.
15 La divulgación también se refiere a un método para la producción de metionina o derivados de metionina en un procedimiento fermentativo que comprende las etapas de: a) cultivar el microorganismo recombinante según la invención en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono fermentable que contiene glucosa y una fuente de azufre y b) recuperar metionina o derivados de metionina del medio de cultivo.
Sumario de la invención
20 La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 11.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir la presente invención con detalle, se debe entender que esta invención no se limita a métodos particularmente ejemplificados y, por supuesto, puede variar. También se debe entender que la terminología usada en la presente tiene el propósito de describir realizaciones particulares de la invención solamente, y no pretende ser
25 limitativa, que estarán limitadas solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Por otra parte, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas microbiológicas y de biología molecular dentro de la experiencia de la especialidad. Tales técnicas son muy conocidas por el trabajador experto y se explican a fondo en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Prescott y cols.
30 (1999) y Sambrook y cols. (1989) (2001).
Se debe apuntar que según se usa en la presente u y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, una referencia a "un microorganismo" incluye una pluralidad de estos microorganismos, y una referencia a "un gen
35 endógeno" es una referencia a uno o más genes endógenos, etc. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un experto normal en la especialidad a la que pertenece la invención. Los materiales y métodos preferidos se describen ahora.
40 En las reivindicaciones que siguen y en la descripción consecutiva de la invención, excepto cuando el contexto requiera otra cosa debido al lenguaje expresado o la implicación necesaria, la palabra "comprenden", "contienen", "implican" o "incluyen" o variaciones tales como "comprende", "que comprende", "que contiene", "implicado", "incluye", "que incluye" se usan en un sentido inclusivo, es decir para especificar la presencia de unas características indicadas pero no excluir la presencia o la adición de características adicionales en diversas
45 realización de la invención.
Definiciones
El término "metionina" indica el aminoácido esencial que contiene azufre con la fórmula química HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 y número CAS 59-51-8 o 63-68-3 para el isómero L específico.
50 "Derivados de metionina" se refiere a análogos moleculares de metionina que presentan el mismo esqueleto químico pero difieren de la metionina con al menos un grupo químico. Según se divulga en la presente, derivados de metionina preferidos son N-acetilmetionina (NAM), S-adenosilmetionina (SAM) e hidroximetionina.
El término "microorganismo", según se usa en la presente, se refiere a una bacteria, una levadura o un hongo que 55 no está modificado artificialmente. Preferentemente, el microorganismo se selecciona entre Enterobacteriaceae,
Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Más preferentemente, el microorganismo es una especie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Aún más preferentemente, el microorganismo es la especie bien Escherichia coli o bien Corynebacterium glutamicum.
El término "microorganismo recombinante" o "microorganismo modificado genéticamente", según se usa en la presente, se refiere a una bacteria, una levadura o un hongo que no se encuentre en la naturaleza y sea genéticamente diferente de su equivalente encontrado en la naturaleza. Significa que está modificado bien mediante la introducción o bien mediante la eliminación o bien mediante la modificación de elementos genéticos. También se puede transformar al forzar el desarrollo y la evolución de nuevas rutas metabólicas al combinar mutagénesis dirigida y evolución bajo una presión de selección específica (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/076659).
Un microorganismo se puede modificar para expresar genes exógenos si estos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permitan su expresión en el microorganismo hospedador. La modificación o "transformación" de microorganismos con ADN exógeno es una tarea habitual para los expertos en la especialidad.
Un microorganismo se puede modificar para modular el nivel de expresión de un gen endógeno.
El término "gen endógeno" significa que el gen estaba presentes en el microorganismo antes de cualquier modificación genética, en la cepa silvestre. Los genes endógenos se pueden sobreexpresar al introducir secuencias heterólogas además de, o para reemplazar, elementos reguladores endógenos, o al introducir una o más copias suplementarias del gene en el cromosoma o un plásmido. Los genes endógenos también se pueden modificar para modular su expresión y/o actividad. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en la secuencia codificante para modificar el producto génico o se pueden introducir secuencias heterólogas además de o para reemplazar elementos reguladores endógenos. La modulación de un gen endógeno puede dar como resultado la regulación al alza y/o la potenciación de la actividad del producto génico o, alternativamente, la regulación a la baja y/o la disminución de la actividad del producto génico endógeno.
Otro modo de modular su expresión es cambiar el promotor endógeno de un gen (p. ej., promotor silvestre) con un promotor más fuerte o más débil para regular al alza o a la baja la expresión del gen endógeno. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Está totalmente dentro de la capacidad del experto en la especialidad seleccionar los promotores apropiados.
El término "gen exógeno" significa que el gen se introducía en un microorganismo, por medios muy conocidos por el experto en la especialidad, aunque este gen no estuviera presente naturalmente en el microorganismo. Los genes exógenos pueden integrarse en el cromosoma hospedador, o expresarse extracromosómicamente por plásmidos o vectores. Es muy conocida en la especialidad una variedad de plásmidos, que difieren con respecto a su origen de replicación y su número de copias en la célula. Estos genes pueden ser heterólogos u homólogos.
El término "gen heterólogo" significa que el gen se deriva de una especie de microorganismo diferente del microorganismo receptor que lo expresa. Se refiere a un gen que no está presente naturalmente en el microorganismo.
En la presente solicitud, todos los genes se mencionan con sus nombres comunes a partir de E. coli. Sus secuencias nucleotídicas están disponibles en los cibersitios http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene o http://www.ebi.ac.uk/embl/.
Usando las referencias dadas en Genbank para genes conocidos, los expertos en la especialidad son capaces de determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo habitual se realiza ventajosamente usando secuencias de consenso que se pueden determinar al llevar a cabo alineamientos de secuencias con genes derivados de otros microorganismos y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos métodos habituales de biología molecular son muy conocidos por los expertos en la especialidad y se reivindican, por ejemplo, en Sambrook y cols., (1989) y (2001).
Los términos "producción de metionina mejorada", "mejorar la producción de metionina" y equivalentes gramaticales de los mismos, según se usan en la presente, se refieren a un rendimiento incrementado de metionina/fuente de carbono (relación de gramo/mol de metionina producido por gramo/mol de fuente de carbono consumida que se puede expresar en porcentaje). Métodos para determinar la cantidad de fuente de carbono consumida y de metionina producida son muy conocidos por los expertos en la especialidad. El rendimiento es superior en el microorganismo recombinante en comparación con el correspondiente microorganismo no modificado.
Los términos "microorganismo optimizado para la producción fermentativa de metionina" se refiere a microorganismos evolucionados y/o genéticamente modificados para presentar una producción de metionina mejorada en comparación con la producción endógena de los correspondientes microorganismos silvestres. Estos microorganismos "optimizados" para la producción de metionina son muy conocidos en la especialidad, y se han
divulgado en particular en Kumar y cols., 2005 y en las solicitudes de patente WO2005/111202, WO2007/077041, WO2009/043803 y WO2012/055798.
Según la invención, los términos "producción fermentativa", "cultivo" o "fermentación" se usan para indicar el crecimiento de bacterias. Este crecimiento se efectúa generalmente en fermentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado al microorganismo que se use y que contiene al menos una fuente de carbono simple, y si es necesario cosustratos.
Un "medio de cultivo apropiado" indica un medio (p. ej., un medio líquido estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o el crecimiento de la célula tal como fuentes de carbono o sustratos carbonados, fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato amónico, cloruro amónico, nitrato amónico y fosfato amónico; fuentes de fósforo, por ejemplo, fosfato monopotásico o fosfato dipotásico; elementos vestigiales (p. ej., sales metálicas), por ejemplo sales de magnesio, sales de cobalto y/o sales de manganeso; así como factores de crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas.
El término "fuente de carbono" o "sustrato carbonado", según la presente invención, indica cualquier fuente de carbono que pueda ser usada por los expertos en la especialidad para soportar el crecimiento normal de un microorganismo, incluyendo monosacáridos (tales como glucosa, galactosa, xilosa, fructosa o lactosa), oligosacáridos, disacáridos (tales como sacarosa, celobiosa o maltosa), melazas, almidón y sus derivados, hemicelulosas y combinaciones de los mismos. Una fuente de carbono simple especialmente preferida es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferida es la sacarosa. La fuente de carbono se puede derivar de material renovable. Un material renovable se define como una materia prima requerida para ciertos procedimientos industriales que se puede regenerar en un breve espacio y en una cantidad suficiente para permitir su transformación en el producto deseado. La biomasa vegetal, tratada o no, es una fuente de carbono renovable interesante.
El término "fuente de azufre" según la invención se refiere a sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, sulfuro de dimetilo y otros sulfuros terminados en metilo o una combinación de las diferentes fuentes. Más preferentemente, la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato o una mezcla de los mismos.
Los términos "fuente de nitrógeno" corresponde bien a una sal amónica o bien a amoníaco gaseoso. La fuente de nitrógeno se suministra en la forma de amonio o amoníaco.
Los términos "atenuación" o "expresión atenuada" significan en este contexto que la expresión de un gen o una enzima está reducida o suprimida en comparación con un microorganismo no modificado. La reducción o supresión de la expresión de una enzima se obtiene mediante la atenuación de la expresión del gen que codifica dicha enzima.
La atenuación de genes se puede conseguir por medios y métodos conocidos para el experto en la especialidad. Generalmente, la atenuación de la expresión génica que puede conseguir al:
Mutar la región codificante o la región promotora o
Eliminar la totalidad o parte de la región promotora necesaria para la expresión génica o
Eliminar la región codificante del gen mediante recombinación homóloga o
Insertar un elemento externo en la región codificante o en la región promotora o
Expresar el gen bajo el control de un promotor débil.
El experto en la especialidad conoce una variedad de promotores que exhiben diferente fuerza y un promotor que se usa para una expresión genética débil.
El término "actividad" de una enzima se usa intercambiablemente con el término "función" e indica, en el contexto de la invención, la reacción que es catalizada por la enzima. El experto en la especialidad sabe cómo medir la actividad enzimática de dicha enzima. En particular, para medir la actividad de la proteína MetE, véase el ejemplo 5.
Los términos "actividad atenuada" o "actividad reducida" de una enzima significan bien una actividad catalítica específica reducida de la proteína obtenida mediante mutación en la secuencia de aminoácidos y/o concentraciones disminuidas de la proteína en la célula obtenida mediante la mutación de la secuencia nucleotídica o mediante la eliminación de la región codificante del gen.
Los términos "actividad potenciada" o "actividad incrementada" de una enzima indica bien una actividad catalítica específica incrementada de la enzima y/o bien una cantidad/disponibilidad incrementada de la enzima en la célula, obtenida, por ejemplo, al sobreexpresar el gen que codifica la enzima.
Los términos "expresión incrementada", "expresión potenciada" o "sobreexpresión" y equivalentes gramaticales de los mismos se usan intercambiablemente en el texto y tienen un significado similar. Estos términos significan que la expresión de un gen o una enzima se incrementa en comparación con un microorganismo no modificado. La expresión increase de una enzima se obtiene al incrementar la expresión del gen que codifica dicha enzima.
Para incrementar la expresión de un gen, el experto en la especialidad conoce diferentes técnicas:
Incrementar el número de copias del gen en el microorganismo. El gen se codifica cromosómicamente o extracromosómicamente. Cuando el gen está situado sobre el cromosoma, varias copias del gen se pueden introducir en el cromosoma mediante métodos de recombinación, conocidos por el experto en el campo (incluyendo la sustitución de genes). Cuando el gen está situado extracromosómicamente, puede ser soportado por diferentes tipos de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación y así su número de copias en la célula. Estos plásmidos están presentes en el microorganismo en de 1 a 5 copias, o aproximadamente 20 copias, o hasta 500 copias, dependiendo de la naturaleza del plásmido: plásmidos de bajo número de copias con replicación estrecha (pSC101, RK2), plásmidos de bajo número de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de alto número de copias (pSK bluescript II).
Usar un promotor que induzca un alto nivel de expresión del gen. El experto en la especialidad sabe qué promotores son los más convenientes, por ejemplo se usan ampliamente los promotores Ptrc, Ptac, Plac, o el promotor lambda cI. Estos promotores pueden ser "inducibles" por un compuesto particular o por una condición externa específica como la temperatura o la luz. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos.
Atenuar la actividad o la expresión de un represor de la transcripción, especifico o no especifico del gen.
Usar elementos que estabilicen el correspondiente ARN mensajero (Carrier y Keasling, 1998) o elementos que estabilicen la proteína (p. ej., marcadores GST, GE Healthcare).
El término "codificación" se refiere al proceso por el que un polinucleótido, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos. El gen o los genes que codifican la enzima o las enzimas pueden ser exógenos o endógenos.
Los términos "sensibilidad de retroalimentación" o "inhibición de la retroalimentación" se refieren a un control del mecanismo celular en el que una o varias enzimas que catalizan la producción de una sustancia particular en la célula son inhibidas o menos activas cuando esa sustancia se ha acumulado hasta un cierto nivel. Así, los términos "sensibilidad de retroalimentación reducida" o "inhibición de retroalimentación reducida" significan que la actividad de tal mecanismo se disminuye o suprime en comparación con un microorganismo no modificado. El experto en la especialidad sabe cómo modificar la enzima para obtener este resultado. Estas modificaciones se han descrito en la solicitud de patente WO 2005/111202 o en la patente US 7.611.873.
La divulgación se refiere a un microorganismo recombinante optimizado para la producción fermentativa de metionina, en donde se atenúa la actividad de la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE.
El experto en la especialidad conoce mucho medios y métodos para atenuar la actividad enzimática como mutación proteínica, mutación génica o atenuación de la expresión génica. La mutación proteínica se puede conseguir al reemplazar aminoácidos específicos presentes en el sitio catalítico de la enzima, o introducir aminoácidos adicionales, o eliminar ciertos aminoácidos.
En un aspecto de la divulgación, se atenúa la expresión del gen metE, que codifica la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE. La secuencia nucleotídica del gen metE de E. coli se muestra en SEQ ID Nº 20.
La atenuación génica se puede conseguir al introducir ADN extraño en el gen para inactivarlo o al expresar el gen bajo el control de un promotor débil o un promotor inducible. El experto en la especialidad conoce una amplia variedad de promotores que exhiben diferente intensidad de expresión y/o diferentes parámetros de inducción y cómo modificar un promotor para disminuir su intensidad de expresión al modificar el promotor silvestre, a modo de ejemplo, en su secuencia de consenso, el sitio de unión al ribosoma o el codón de inicio... Así, el experto en la especialidad es capaz de elegir un promotor que conduce a una expresión atenuada de metE.
En una realización preferida de la invención, se elimina al menos una porción del gen metE. Preferiblemente, esta porción eliminada representa al menos 10% de la secuencia codificante, más preferiblemente al menos 20%, 30%, 40% o 50% de la secuencia codificante. Más preferiblemente, se elimina al menos 80% de la secuencia codificante.
En un ejemplo particular, el gen metE se elimina completamente. El experto en la especialidad conoce muchas técnicas para eliminar porciones génicas tales como recombinación homóloga.
En otro aspecto de la divulgación, el gen metE se muta a fin de codificar una proteína modificada que exhibe actividad atenuada. Por ejemplo, la mutación en el gen metE conduce a la traducción de una proteína MetE truncada que es inactiva. Más preferiblemente, la mutación es una eliminación de una porción de 13 pares de bases (pb): de la base 417ª a la 429ª del gen de E. coli cuya secuencia nucleotídica se muestra en la SEQ ID Nº 20, conduciendo a una mutación de variación del marco. Por consiguiente, se acorta la traducción de la proteína (un codón de terminación se introduce mediante la variación del marco) y da lugar a una proteína truncada de 152 aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N° 22) en lugar de 753 aminoácidos en la secuencia silvestre, según se muestra en la SEQ ID N° 21. Cualquier mutación equivalente que permita la introducción de un codón de TERMINACIÓN en un gen procedente de cualquier especie de microorganismo también es parte de la divulgación.
Optimización de la ruta de biosíntesis de metionina
El microorganismo recombinante según la invención se modifica para mejorar la producción de metionina. Genes implicados en la producción de metionina son muy conocidos en la especialidad, y comprenden genes implicados en la ruta de biosíntesis específica de metionina así como genes implicados en rutas que proporcionan precursores y genes implicados en rutas que consumen metionina.
La producción eficaz de metionina requiere la optimización de la ruta específica de metionina y varias rutas que proporcionan precursores. Ya se han descrito cepas productoras de metionina, en particular en Kumar y cols. 2005 y en las solicitudes de patente WO2005/111202, WO2007/077041, WO2009/043803 y WO2012/055798.
En una realización específica de la invención, el microorganismo recombinante se modifica como se describe posteriormente: la expresión de metH es como se reivindica en la reivindicación 1 y, opcionalmente, al menos uno de los siguientes genes se incrementa: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metA, el alelo thrA que codifica una enzima con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*), thrA y el alelo thrA que codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina (thrA*).
· ptsG codifica la enzima PTS IICBGlc según se describe en la solicitud de patente EP11305829.
· pyc codifica una piruvato carboxilasa según se describe en la solicitud de patente EP11305829. En una realización preferida, el gen pyc es heterólogos y se elige de los genes pyc de Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Pseudomonas fluoresceins o especies de Corynebacterium,
· pntAB codifican subunidades de una transhidrogenasa unida a membrana, tal como se describe en la solicitud de patente WO2012/055798,
· cysP codifica una proteína de unión a sulfato periplásmica, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysU codifica un componente de transportador ABC de sulfato, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysW codifica una proteína de transporte de sulfato unido a membrana, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysA codifica una sulfato permeasa, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysM codifica una O-acetil serina sulfhidralasa, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysI y cysJ codifican respectivamente las subunidades alfa y beta de una sulfito reductasa según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803. Preferiblemente, cysI y cysJ se sobreexpresan conjuntamente,
cysH codifica una adenililsulfato reductasa, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803.
Incrementar el metabolismo C1 también es una modificación que conduce a la producción de metionina mejorada. Se refiere al incremento de la actividad de al menos una enzima implicada en el metabolismo C1 elegida entre GcvTHP, Lpd, MetF o MetH. Por ejemplo, el metabolismo del carbono uno se incremental al potenciar la expresión y/o la actividad de al menos uno de los siguientes:
· gcvT, gcvH, gcvP y lpd, que codifican el complejo de escisión de glicina, según se describe en la solicitud de patente WO 2007/077041. El complejo de escisión de glicina (GCV) es un complejo multienzimático que cataliza la oxidación de glicina, dando dióxido de carbono, amoníaco, metilen-THF y un nucleótido de piridina reducido. El complejo de GCV consiste en cuatro componentes proteínicos, la glicina deshidrogenasa dicha proteína P (GcvP), la lipoil-GcvH-proteína dicha proteína H (GcvH), la aminometiltransferasa dicha proteína T (GcvT) y la dihidrolipoamida deshidrogenasa dicha proteína L (GcvL o Lpd). La proteína P cataliza la liberación dependiente de fosfato de piridoxal de CO2 de glicina, dejando un resto metilamina. El resto metilamina se transfiere al grupo ácido lipoico de la proteína H, que está unido a la proteína P antes de la descarboxilación de glicina. La proteína T cataliza la liberación de NH3 del grupo metilamina y transfiere la unidad C1 restante al THF, formando metilen-THF. A continuación, la proteína L oxida el componente de ácido lipoico de la proteína H y transfiere los electrones a NAD+, formando NADH;
· MetF que codifica una metilentetrahidrofolato reductasa, según se describe en la solicitud de patente WO 2007/077041;
· MetH (homocisteína-N5-metiltetrahidrofolato transmetilasa dependiente de B12) que codifica metiltransferasas.
La sobreexpresión de al menos uno de los siguientes genes implicados en la biosíntesis de serina también reduce la producción del subproducto isoleucina:
· serA que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
serB que codifica una fosfoserina fosfatasa, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
serC que codifica una fosfoserina aminotransferasa, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803.
Ya se ha mostrado que la sobreexpresión de los siguientes genes mejora la producción de metionina:
· cysE codifica una serina aciltransferasa; su sobreexpresión permite un incremento en la producción de metionina, según se describe en el documento WO 2007/077041;
· metA codifica una homoserina succiniltransferasa. El alelo MetA* codifica una enzima con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina. Preferentemente, se usa el alelo MetA* descrito en la solicitud de patente WO 2005/111202;
thrA codifica una aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa; el alelo thrA* codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina, según se describe en el documento WO 2005/111202.
En una realización específica de la invención, los genes pueden estar bajo el control de un promotor inducible. Por ejemplo, al menos uno de estos genes está bajo el control de un promotor inducible por la temperatura. Preferiblemente, la expresión de al menos uno de los genes: thrA, cysE, metA está bajo el control de un promotor inducible, directamente o indirectamente. Más preferiblemente, los genes thrA, cysE y metA están bajo el control de un promotor inducible, directamente o indirectamente. Como un primer ejemplo,, la expresión del gen thrA está bajo el control directo de un promotor inducible y la expresión del gen cysE está bajo el efecto polar de la expresión inducible del gen thrA. Como un segundo ejemplo, la expresión del gen thrA está bajo el control directo de un promotor inducible y las expresiones de los genes cysE y metA están bajo el efecto polar de la expresión inducible del gen thrA.
Como un ejemplo adicional, el promotor inducible por la temperatura pertenece a la familia de promotores PR. Una cepa productora de metionina que tiene genes bajo el control de promotores inducibles se describe en la solicitud de patente WO2011/073122.
En otra realización específica de la invención, el microorganismo se ha modificado adicionalmente, y la expresión de al menos uno de los siguientes genes se atenúa: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL o yncA.
· el gen metJ codifica la proteína represora MetJ (GenBank 1790373), responsable de la regulación a la baja del regulón de metionina según se sugería en la solicitud de patente JP 2000/157267,
5 · Los genes pykA y pykF codifican las enzimas 'piruvato cinasa'. La atenuación de la expresión de al menos una
o ambas de las piruvato cinasas disminuye el consumo de piruvato de fosfoenol (PEP). La disponibilidad incrementada de PEP puede incrementar la producción de oxaloacetato, un importante precursor de aspartato, que a su vez es un precursor de metionina, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
10 · purU codifica una formiltetrahidrofolato desformilasa, una enzima que cataliza la reacción de formil-THF desformilasa. La atenuación de la actividad de desformilasa incrementa la producción de metil-THF que se requiera para la metilación de homocisteína. La pérdida de metabolitos C1 por desformilación conduce a un incremento en la producción de homocisteína que no se puede transformar en metionina. A continuación, la homocisteína puede ser un sustrato para la enzima cistationa gamma sintasa (MetB) que puede catalizar la
15 reacción entre O-succinilhomoserina y homocisteína dando como resultado la producción de homolantionina, según se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
· ybdL codifica una aminotransferasa según se describe en la solicitud de patente PCT/FR2010/052937,
· yncA codifica una N-aciltransferasa, según se describe en la solicitud de patente WO 2010/020681.
Por ejemplo, la producción fermentativa de metionina por un microorganismo recombinante, en la que se atenúa
20 la actividad de la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE, a partir de glucosa como una fuente de carbono principal, se puede alcanzar a través de una combinación de las modificaciones analizadas anteriormente en dicho microorganismo, por ejemplo:
• la expresión del gen metJ se atenúa y la expresión de un alelo metA que codifica una enzima con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*) se potencia;
25 • la expresión del gen metJ se atenúa; la expresión de un alelo metA que codifica una enzima con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*) se potencia; y la expresión de un alelo thrA que codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina (thrA*) se potencia;
• la expresión del gen metJ se atenúa; la expresión de un alelo metA que codifica una enzima con
30 sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*) se potencia; la expresión de un alelo thrA que codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina (thA*) se potencia; y la expresión del gen cysE se potencia;
• la expresión del gen metJ se atenúa; la expresión de un alelo metA que codifica una enzima con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*) se potencia; la
35 expresión de un alelo thrA que codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina (thrA*) se potencia; la expresión del gen cysE se potencia; y la expresión de los genes metF y/o metH se potencia.
En un aspecto particular de la invención, el microorganismo recombinante comprende las siguientes modificaciones genéticas:
40 · el gen metE se elimina,
· la expresión de los genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA* y pyc se potencian, y
· los genes metJ, pykA, pykF, purU y yncA se atenúan.
En una realización particular de la invención, el microorganismo es de la familia bacteriana Enterobacteriaceae o 45 Corynebacteriaceae.
Preferentemente, el microorganismo es Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum.
Condiciones de cultivo
La invención también se refiere a un método de producción de metionina que comprende las siguientes etapas:
-
Cultivar un microorganismo recombinante en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono fermentable y una fuente de azufre, y
-
Recuperar metionina o sus derivados del medio de cultivo.
Los expertos en la especialidad son capaces de definir las condiciones de cultivo para los microorganismos según la invención. En particular, las bacterias se fermentan a una temperatura entre 20°C y 55°C, preferentemente entre 25°C y 40°C, y más específicamente aproximadamente 30°C para C. glutamicum y aproximadamente 37°C para E. coli.
Para E. coli, el medio de cultivo puede ser de composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946), un medio M63 (Miller, 1992); o un medio tal como el definido por Schaefer y cols., (1999).
Para C. glutamicum, el medio de cultivo puede ser de composición idéntica o similar a medio BMCG (Liebl y cols., 1989) o a un medio tal como el descrito por Riedel y cols., (2001).
En alguna realización de la invención, el cultivo se somete a una limitación o privación para uno o varios sustratos inorgánicos. Se refiere a una condición bajo la que el crecimiento de los microorganismos está gobernado por la cantidad de un producto químico inorgánico suministrado que todavía permita un crecimiento débil. Esta limitación en el crecimiento de microorganismos se ha descrito en la solicitud de patente WO 2009/043372. En una realización preferida de la invención, el cultivo se somete a limitación de fosfato.
La acción de "recuperar metionina o sus derivados del medio de cultivo" indica la acción de recuperar L-metionina y/o uno de sus derivados, en particular N-acetilmetionina (NAM) y S-adenosilmetionina (SAM) y todos los otros derivados que puedan ser útiles. Los métodos para la recuperación y la purificación de los compuestos producidos son muy conocidos por los expertos en la especialidad (véanse, en particular, WO 2005/007862, WO 2005/059155).
La cantidad de producto en el medio de fermentación se puede determinar usando un número de métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC) o cromatografía de gases (GC). Por ejemplo, la cantidad de metionina obtenida en el medio se mide mediante HPLC después de derivación con OPA/Fmoc usando L-metionina (Fluka, Ref 64319) como un patrón. La cantidad de NAM se determina usando HPLC refractométrica usando NAM (Sigma, Ref 01310) como un patrón.
Ejemplos
La presente divulgación se define adicionalmente en los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indiquen realizaciones preferidas de la invención, se dan solamente a modo de ilustración. A partir de la divulgación anterior y estos ejemplos, el experto en la especialidad puede hacer varios cambios de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones sin modificar los medios esenciales de la invención.
En particular, los ejemplos muestran cepas de Escherichia coli (E. coli) modificadas, pero estas modificaciones se pueden realizar fácilmente en otros microorganismos de la misma familia.
Escherichia coli pertenece a la familia Enterobacteriaceae, que comprende miembros que son gramnegativos, con conformación de bacilo, no formadores de esporas y típicamente tienen 1-5 µm de longitud. La mayoría de los miembros tienen flagelos usados para moverse, pero unos pocos géneros son inmóviles. Muchos miembros de esta familia son una parte normal de la flora intestinal de los intestinos de seres humanos y otros animales, mientras que otros se encuentran en el agua o el suelo, o son parásitos de una variedad de diferentes animales y plantas. E. coli es uno de los más importantes organismos modélicos, pero otros miembros importantes de la familia Enterobacteriaceae incluyen Klebsiella, en particular Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola o Klebsiella oxytoca, y Salmonella.
Por otra parte, varias solicitudes de patente apuntan a que la optimización para la producción de metionina se puede aplicar fácilmente en E. coli y en Corynebacterium glutamicum sin experimentación excesiva.
Ejemplo 1: Protocolos Se han usado varios protocolos para construir cepas productoras de metionina descritas en los siguientes ejemplos. Protocolo 1: Modificaciones cromosómicas mediante recombinación homóloga y selección de recombinantes (Datsenko, & Wanner, (2000)). La sustitución alélica o la inserción génica en un locus cromosómico especificado se llevó a cabo mediante recombinación homóloga según se describe por Datsenko & Wanner (2000). La resistencia a kanamicina (Km) kan, flanqueada por sitios de reconocimiento Flp, se amplificó mediante PCR al usar el plásmido pKD4 como plantilla. Los productos de PCR resultantes se usaron para transformar la cepa de E. coli receptora que aloja el plásmido pKD46 que expresa la recombinasa λ Red (γ, β, exo). A continuación, se seleccionaron transformantes resistentes a
antibiótico y la estructura cromosómica del locus modificado se verificó mediante análisis de PCR con los cebadores apropiados listados en la Tabla 3. El gen de resistencia kan se puede cortar usando el plásmido pCP20 que soporta el gen que codifica Flp
recombinasa según se describe por Datsenko & Wanner (2000). El plásmido pCP20 se introdujo en la cepa apropiada y los transformantes se extendieron sobre LB complementado con ampicilina a 30°C. A fin de expresar el gen flp y retirar el casete de kanamicina, los transformantes se cultivaron a 37°C. A continuación, después del aislamiento, los clones sensibles a antibiótico se verificaron mediante PCR usando los oligonucleótidos listados en la Tabla 3.
Protocolo 2: Transducción del fago P1 Las modificaciones cromosómicas se transfirieron a una cepa receptora de E. coli dada mediante transducción de
PI. El protocolo incluye 2 etapas: (i) preparación del lisado fágico en una cepa donante que contiene la modificación cromosómica asociada con la resistencia y (ii) infección de la cepa receptora mediante este lisado fágico. Preparación del lisado fágico -Inocúlense 100 µl de un cultivo nocturno de la cepa MG1655 con la modificación cromosómica de interés en 10
ml de Km 50 µg/ml + glucosa 0,2% + CaCl2 5 mM. -Incúbese 30 min a 37°C con agitación. -Añádanse 100 µl de lisado del fago PI preparado en la cepa donante MG1655 (aprox. 1 x 109 fagos/ml). -Agítese a 37°C durante 3 horas hasta la lisis completa de las células. -Añádanse 200 µl de cloroformo, y sométase a turbulencia -Centrifúguese 10 min a 4.500 g para eliminar residuos celulares. -Transfiérase el sobrenadante a un tubo estéril. -Almacénese el lisado a 4°C. Transducción -Centrifúguense 10 min a 1.500 g 5 ml de un cultivo nocturno de la cepa receptora de E. coli cultivada en medio
LB. -Suspéndase la pella celular en 2,5 ml de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM. -Inféctense 100 µl de células con 100 µl de fago PI de la cepa MG1655 con la modificación en el cromosoma
(tubo de ensayo) y como a tubos de control 100 µl de células sin fago PI y 100 µl de fago P1 sin células. -Incúbese 30 min a 30°C sin agitación.
-Añádanse 100 µl de citrato sódico 1 M en cada tubo y sométase a turbulencia. -Añádase 1 ml de LB. -Incúbese 1 hora a 37°C con agitación -Centrifúguese 3 min a 7.000 rpm. -Siémbrese en placa sobre LB + Km 50 µg/ml -Incúbese a 37°C durante la noche. Tabla 1: Cepas (número y genotipo) citadas o descritas en los siguientes ejemplos.
Tabla 2: Correspondencia ente la nomenclatura previa y la actual para el genotipo de la cepa 1 descrita en la solicitud de patente EP10306164.
Nomenclatura previa
Nomenclatura actual
MG1655 metA*11
MG1655 metA*11
Ptrc-metH
Ptrc01*2/RBS08*1-metH
PtrcF-cysPUWAM
Ptrc01-cysPUWAM
PtrcF-cysJIH
Ptrc01-cysJIH
Ptrc09-gcvTHP
Ptrc01/RBS01-gcvTHP
Ptrc36-ARNmst17-metF
Ptrc01/ARN01/RBS01-metF
Ptrc07-serB
Ptrc94-serB
ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA
ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA
ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE
ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4thA*1-cysE
ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11
ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11
ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11
ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
ΔtreBC::TT02-serA-serC
ΔtreBC::RN/serA-serC
Tabla 3: Oligonucleótidos usados en los siguientes ejemplos.
Nombre del oligonucleótido
SEQ ID N° Secuencia ¡5' → 3'
YjbIup-F
1 cgtaggcgccggtaccgagtgcagatcggctggaaggcg
YjbIup-R
2
YjbIdown-F
3
YjbIdown-R
4 cgtaggcgccggtacccagcataatcattcaccacacatccg
Km-F
5 tcccccggggtataccatatgaatatcctccttag
Km-R
6 gcccaagctttgtaggctggagctgcttcg
Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F
7 cgtaggcctgggcccgagctgttgacaattaatcatccg
GcvTHP-TT07-R
8
yjbI-gcvTHP-F
9 cagaccacccaactggcgacc
yjbI-gcvTHP-R
10 gccattggaatcgaccagcc
Ptrc30/RBS01-F
11
Ptrc30/RBS01-serC-R
12
Nombre del oligonucleótido
SEQ ID N° Secuencia ¡5' → 3'
serC-TT07*2-R
13
Ptrc30/RBS01-serA-F
14
serA-TTadcca-R
15
metE-Km-F
16
metE-Km-R
17
metE-F
18 cgtttgggactggatgtgctgg
metE-R
19 gcgtggtacggcaaactgac
Ejemplo 2: Construcción de la cepa 5, MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-C1857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA
5 metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01gcvTHP-TT07::Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01serA-TTadcca)
1. Cepas 1
10 La cepa productora de metionina 1 (genotipo en la tabla 1) se ha descrito en la solicitud de patente EP10306164.
2. Construcción de la Cepa 2
Para incrementar la acumulación de tetrahidrofolato de metileno en la célula, el complejo de escisión de glicina codificado por el operón gcvTHP se sobreprodujo al añadir una copia de este operón en el cromosoma en el locus yjbI. Esta copia adicional de gcvTHP se expresó usado un promotor trc inducible artificial y un sitio de unión al
15 ribosoma optimizado, dando la integración cromosómica ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km.
Para eliminar el gen yjbI y reemplazarlo por la región Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o a kanamicina pero también un ADN adicional, mientras que se eliminan la mayoría
20 de los genes implicados. Con este propósito, se construyó el siguiente plásmido, pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01gcvTHP-TT07::Km.
Este plásmido pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km se deriva del vector pUC18 (Norrander y cols., 1983) y aloja el casete de resistencia a kanamicina asociado con la región Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07, ambos
25 clonados entre las regiones aguas arriba y aguas abajo de yjbI.
Para la construcción de pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km, en primer lugar se construyó el plásmido pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC. Este plásmido soporta las regiones aguas arriba y aguas debajo de yjbI que están separadas por un terminador de la transcripción (T1 del gen rrnB de E. coli, llamado TT02) y un sitio de
30 clonación múltiple (compuesto por los sitios de restricción BstZ17I, HindIII, AvrII, ApaI y PacI, llamado SMC). Esta última región se amplificó por PCR a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos:
YjbIup-F (SEQ ID Nº 1)
CGTAGGCGCCGGTACCgagtgcagatcggctggaaggcg con -una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4247987-4248009) de la región yjbI (secuencia de referencia en
el cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas) para el sitio de restricción SfoI y KpnI y bases adicionales. YjbIup-R (SEQ ID Nº 2)
con
-una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4248931-4248980) de la región yjbI (secuencia de referencia en el cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas negrita) para el terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli (Orosz y cols,
1991),
una región (mayúsculas) para el sitio de restricción BstZ17I y parte del sitio de restricción HindIII del sitio de clonación múltiple. YjbIdown-F (SEQ ID Nº 3)
con
-
una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4250286-4250335) de la región yjbl (secuencia de referencia en el cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas negrita) para parte del terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli (Orosz y
cols., 1991), -una región (mayúsculas) para todo el sitio de clonación múltiple. YjbIdown-R (SEQ ID Nº 4) CGTAGGCGCCGGTACCcagcataatcattcaccacacatccg con -una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4251224-4251249) de la región yjbI (secuencia de referencia en
el cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas) para el sitio de restricción SfoI y KpnI y bases adicionales. En primer lugar, los fragmentos "upYjbI" y "downYjbI" se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico de
MG1655 usando los oligonucleótidos YjbIup-F / YjbIup-R y YjbIdown-F / YjbIdown-R, respectivamente. En segundo lugar, el fragmento "upYjbI-downYjbI" se amplificó a partir de los fragmentos de PCR "upYjbI" y "downYjbI" (que poseen una región solapada que incluye una parte del terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli y una parte del sitio de clonación múltiple) usando los oligonucleótidos YjbIup-F / YjbIdown-R. El fragmento de PCR
"upYjbI-downYjbI" se cortó con la enzima de restricción SfoI y se clonó en los sitios EcoRI / HindIII romos del vector
pUC18, dando el plásmido pUC1B-ΔyjbI::TT02-SMC. A continuación, el casete de resistencia a kanamicina se amplificó por PCR a partir del vector pKD4 usando los siguientes oligonucleótidos:
Km-F (SEQ ID Nº 5) TCCCCCGGGGTATACcatatgaatatcctccttag con -una región (minúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en
Datsenko & Wanner, 2000, -una región (mayúsculas) para los sitios de restricción SmaI y BstZ17I y bases adicionales. Km-R (SEQ ID Nº 6) GCCCAAGCTTtgtaggctggagctgcttcg con -una región (minúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en
Datsenko & Wanner, 2000 -una región (mayúsculas) para el sitio de restricción HindIII y bases adicionales. El fragmento de PCR se cortó con las enzimas de restricción BstZ17I y HindIII y se clonó en los sitios BstZ17I /
HindIII del plásmido pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC, dando el plásmido pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC::Km. Finalmente, el fragmento Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de la cepa 1 usando los oligonucleótidos Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F / GcvTHP-TT07-R (descritos posteriormente). El fragmento de PCR se cortó con las enzimas de restricción ApaI y PacI y se clonó en los sitios ApaI / PacI del plásmido pUC18ΔyjbI::TT07-SMC::Km, dando el plásmido pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km. Los plásmidos recombinantes se verificaron mediante secuenciación de ADN. Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F (SEQ ID Nº 7) CGTAGGCCTGGGCCCgagctgttgacaattaatcatccg con -una región (minúsculas) homóloga a una parte del promotor trc inducible artificial situado aguas arriba del operón gcvTHP en la cepa 1, -una región (mayúsculas) para los sitios de restricción StuI y ApaI y bases adicionales. GcvTHP-TT07-R (SEQ ID Nº 8)
con
-
una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (3044190-3044214) del gen gcvP (secuencia de referencia en el cibersitio http://www.ecogene.org/),
-
una región (mayúsculas negrita) para la secuencia del terminador de la transcripción T7te, llamada TT07 (Harrington y cols., 2001),
-
una región para los sitios de restricción PacI, StuI y bases adicionales.
Finalmente, el fragmento ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km se obtuvo al cortar el plásmido pUC18ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km con la enzima de restricción KpnI y a continuación se introdujo mediante electroporación, según el Protocolo 1, en una cepa MG1655 metA*11 pKD46. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a kanamicina y la inserción del fragmento ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01gcvTHP-TT07::Km se verificó mediante un análisis de PCR con los oligonucleótidos yjbI-gcvTHP-F y yjbI-gcvTHP-R. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP
TT07::Km.
yjbI-gcvTHP-F (SEQ ID Nº 9)
cagaccacccaactggcgacc
homóloga a la secuencia http://www.ecogene.org/)
(4247754-4247774) de la región yjbI (secuencia de referencia en el cibersitio
yjbI-gcvTHP-R (SEQ ID Nº 10)
gccattggaatcgaccagcc
homóloga a la secuencia http://www.ecogene.org/)
(4251489-4251508) de la región yjbI (secuencia de referencia en el cibersitio
A continuación, la modificación cromosómica ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km se transdujo en la cepa 1, según el Protocolo 2.
Se seleccionaron transductantes resistentes a kanamicina y la presencia de la modificación cromosómica ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km se verificó mediante PCR con los cebadores yjbI-gcvTHP-F y yjbIgcvTHP-R.
La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-CI857TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI:: RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHPTT07::Km se denominó cepa 2.
3. Construcción de la cepa 3
Para la construcción de la cepa 3, el casete de resistencia asociado con la integración cromosómica ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km de la cepa 2 se retiró según el Protocolo 1.
Se seleccionaron clones sensibles a kanamicina y la ausencia del casete de kanamicina se verificó mediante PCR con los cebadores yjbI-gcvTHP-F y yjbI-gcvTHP-R.
La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-CI857TTadcca-PR01/RBS01*4-thA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thRA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI:: RN/PtRc01/RBS01-gcvTHP-TT07 se denominó cepa 3.
4.
Construcción de la cepa 4
El plásmido pCL1920-PgapA-pycre-TT07, descrito en la solicitud de patente PCT/FR2010/052937, se introdujo en la cepa 2, dando la siguiente cepa MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01gcvTHP-TT07::Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07), denominada cepa 4.
5.
Construcción de la cepa 5
Para incrementar el aflujo en la ruta de la serina, los genes serC y serA se sobreexpresaron debido a promotores artificiales y un sitios de unión al ribosoma optimizado y usando el cromosoma artificial bacteriano pCC1BAC (Epicentre). Con este propósito, se construyó el siguiente plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca.
Para la construcción de pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca, las regiones "TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2" y "Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca" se amplificaron por PCR.
Para la región "TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2", en primer lugar se sintetizó un megacebador que alojaba el terminador de la transcripción (T1 de rrnB, indicado TT02), el promotor artificial (Ptrc30), el sitio de unión al ribosoma optimizado (RBS01) y el principio del gen serC mediante una PCR corta usando los oligonucleótidos Ptrc30/RBS01-F y Ptrc30/RBS01-serC-R (descritos posteriormente) sin añadir matriz. En segundo lugar, el fragmento "TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2" se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de E. coli MG1655 como matriz y el megacebador sintetizado y el oligonucleótido serC-TT07*2-R (descrito posteriormente).
Ptrc30/RBS01-F (SEQ ID Nº 11)
con
-una región (mayúsculas negrita) para el terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli (Orosz y cols., 1991), -una región (mayúscula subrayado) homóloga al promotor trc inducible artificial, -una región (mayúsculas cursiva) homóloga a un sitio de unión al ribosoma optimizado, una región (minúsculas) para los sitios de restricción NarI, PacI y bases adicionales. Ptrc30/RBS01-serC-R (SEQ ID Nº 12)
ccagaactaaaattgaagatttgagccatAATATACCTCCTTATTCCACACAGTATACGAGC
con
-
una región (mayúscula subrayado) homóloga al promotor trc inducible artificial,
-
una región (mayúsculas cursiva) homóloga a un sitio de unión al ribosoma optimizado,
-
una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (956876-956904) del gen serC (secuencia de referencia en el
cibersitio http://www.ecogegene.org/). serC-TT07*2-R (SEQ ID Nº 13)
con
-una región (mayúsculas negrita) para la secuencia del terminador de la transcripción T7te (Harrington y cols., 2001) que posee una eliminación de base en la posición 29ª (denominada TT07*2), -una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (957946-957964) del gen serC (secuencia de referencia en el
cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas) para los sitios de restricción HindIII, SphI, SacI y NheI y bases adicionales. Del mismo modo, el fragmento "Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca" se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de
E. coli MG1655 como matriz y los oligonucleótidos Ptrc30/RBS01-serA-F y serA-TTadcca-R (descritos posteriormente).
Ptrc30/RBS01-serA-F (SEQ ID Nº 14)
con -una región (mayúsculas subrayado) homóloga al promotor trc inducible artificial, -una región (mayúsculas cursiva) homóloga a un sitio de unión al ribosoma optimizado, -una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (3056408-3056432) del gen serA (secuencia de referencia en el
cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas) para el sitio de restricción NheI y bases adicionales. serA-TTadcca-R (SEQ ID Nº 15)
-
una región (mayúsculas negrita) para la secuencia del terminador de transcripción TTadc (terminador de la transcripción del gen adc procedente de Clostridium acetobutylicum, homólogo desde 179847 hasta 179807 del megaplásmido pSLO1),
-
una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (3055200-3055220) del gen serA (secuencia de referencia en el cibersitio http://www.ecogene.org/),
-
una región (mayúsculas) para los sitios de restricción AvrII, SphI, HindIII y bases adicionales.
Los fragmentos de PCR "TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2" y "Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca" se cortaron con las enzimas de restricción NarI / NheI y NheI / SphI, respectivamente, y ambos se clonaron en los sitios NarI / SphI del plásmido pCC1BAC, dando el plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca.
El plásmido recombinante se verificó mediante secuenciación de ADN.
Finalmente, el plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca se introdujo en la cepa 4, dando la siguiente cepa MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA
ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01gcvTHP-TT07::Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01
5 serA-TTadcca), denominada cepa 5.
6. Identificación de la mutación metE en la cepa 5
A medir la actividad de metionina sintasa (METE) de la cepa 5, se identificó que el gen metE no era funcional, debido a que algunas mutaciones dan una proteína MetE truncada.
10 La mutación es una eliminación de 13 pb (de la base 417ª a la 429ª del gen) del gen metE que conduce a una mutación por cambio de marco. Por consiguiente, la traducción de la proteína se acorta (codón de terminación introducido por el cambio de marco) y da lugar a una proteína truncada de 152 aminoácidos en lugar de 753.
Aquí está la secuencia de la proteína WT MetE (SEQ ID Nº 21):
Aquí está la secuencia de la proteína truncada MetE* (SEQ ID Nº 22):
Ejemplo 3: Construcción de la cepa 7, MG1655 metA*11 metE::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM
20 Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA
25 TTadcca)
1. Construcción de la cepa 6
Para estudiar si la restauración de una proteína MetE funcional podía modificar la producción de metionina de la cepa 5, se reemplazó el gen metE truncado por uno silvestre usando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000).
30 Con este propósito, el casete de kanamicina flanqueado con fragmentos homólogos a la región metE, el fragmento, "metE::Km", se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos metE-Km-F y metE-Km-R (descritos posteriormente).
El fragmento "metE::Km" se introdujo en una cepa MG1655 metA* 11 pKD46 que posee una versión funcional del gen metE.
metE-Km-F (SEQ ID Nº 16)
con
-
una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4013277-4013376) de la región metE (secuencia de referencia en el cibersitio http://www.ecogene.org/), -una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en
Datsenko & Wanner, 2000. metE-Km-R (SEQ ID Nº 17)
con
-
una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4013377-4013442) de la región metE (secuencia de referencia en el cibersitio http://www.ecogene.org/),
-
una región (mayúsculas negrita) para la secuencia del terminador de la transcripción T7te (Harrington y cols., 2001),
-
una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko & Wanner, 2000.
Se seleccionaron recombinantes resistentes a kanamicina y la presencia del casete Km aguas abajo del gen metE se verificó mediante PCR con los oligonucleótidos metE-F y metE-R (descritos posteriormente). La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 metE::Km.
metE-F (SEQ ID Nº 18)
cgtttgggactggatgtgctgg
homóloga a la secuencia http://www.ecogene.org/)
(4012495-4012516) de la región metE (secuencia de referencia en el cibersitio
metE-R (SEQ ID Nº 19)
gcgtggtacggcaaactgac
homóloga a la secuencia http://www.ecogene.org/)
(4013672-4013691) de la región metE (secuencia de referencia en el cibersitio
La modificación cromosómica metE::Km se transdujo a continuación en la cepa 3, según el Protocolo 2.
Se seleccionaron recombinantes resistentes a kanamicina y la presencia del casete Km aguas abajo del gen metE se verificó mediante PCR con los oligonucleótidos metE-F y metE-R (descritos anteriormente). La presencia del gen metE con la secuencia silvestre se verificó mediante secuenciación de ADN.
La cepa resultante MG1655 metA*11 metE::Km Ptrc01*2/RBS0*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 se denominó cepa 6.
2. Construcción de la cepa 7
El plásmido pCL1920-PgapA-pycre-TT07 (descrito en la solicitud de patente PCT/FR2010/052937) y el plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca (descrito anteriormente) se introdujeron en la cepa 6, dando la cepa MG1655 metA*11 metE::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thr4*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01lRBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca), denominada cepa 7.
La medida de la actividad de metionina sintasa independiente de cobalamina (MS, MetE) de la cepa 6 confirmaba que la proteína MetE es funcional.
EJEMPLO 4: PRODUCCIÓN DE L-METIONINA MEDIANTE FERMENTACIÓN EN BIORREACTOR
Cepas que producían cantidades sustanciales de metionina se probaron posteriormente bajo condiciones de producción en fermentadores de 0,5 l (GX, GPC) usando una estrategia de alimentación por lotes.
Brevemente, se usó un cultivo de 24 horas desarrollado en 10 ml de medio LB con 2,5 g.l-1 de glucosa para inocular un precultivo de 24 horas en medio mínimo (B1a). Estas incubaciones se llevaron a cabo en matraces tabicados de 500 ml que contenían 40 ml de medio mínimo (B1a) en un agitador giratorio (200 RPM). El primer precultivo se realizó a una temperatura de 30°C, el segundo a una temperatura de 34°C.
Una tercera etapa de precultivo se llevó a cabo en biorreactores (Sixfors) cargados con 200 ml de medio mínimo (B1b) inoculado hasta una concentración de biomasa de 1,2 g.l-1 con 5 ml de precultivo concentrado. La temperatura del precultivo se mantuvo constante a 34°C y el pH se ajustó automáticamente hasta un valor de 6,8 usando una solución de NH4OH al 10%. La concentración de oxígeno disuelto se ajustó continuamente hasta un valor de 30% de la saturación de presión de aire parcial con suministro de aire y/o agitación. Después del agotamiento de glucosa del medio del lote, se inició la alimentación por lotes con un caudal inicial de 0,7 ml.h-1 se incrementó exponencialmente durante 24 horas con una velocidad de crecimiento de 0,13 h-1 a fin de obtener una concentración celular final de aproximadamente 20 g.l-1 .
Tabla 4: Composición del medio mineral del lote de precultivo (B1a y B1b).
Compuesto
Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O
0,0130 0,0130
CuCl2.2H2O
0,0015 0,0015
MnCl2.4H2O
0,0150 0,0150
CoCl2.6H2O
0,0025 0,0025
H3BO3
0,0030 0,0030
Na2MoO4.2H2O
0,0025 0,0025
Citrato de Fe(III) H2O
0,1064 0,1064
EDTA
0,0084 0,0084
MgSO4.7H2O
1,00 1,00
CaCl2.2H2O
0,08 0,08
Ácido cítrico
1,70 1,70
KH2PO4
4,57 4,57
K2HPO4.3H2O
2,50 2,50
Compuesto
Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
(NH4)2HPO4
1,10 1,10
(NH4)2SO4
4,90 4,90
(NH4)2S2O3
1,00 1,00
Tiamina
0,01 0,01
Vitamina B12
0,01 0,01
Glucosa
30,00 5,00
MOPS
30,00 0,00
NH4OH 28%
Ajustado hasta pH 6,8 Ajustado hasta pH 6,8
Tabla 5: Composición del medio mineral de alimentación por lotes de precultivo (F1)
Compuesto
Concentración (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.H2O
0,0104
CuCl2.2H2O
0,0012
MnCl2.4H2O
0,0120
CoCl2.6H2O
0,0020
H3BO3
0,0024
Na2MoO4.2H2O
0,0020
Citrato de Fe(III) H2O
0,0424
EDTA
0,0067
MgSO4
5,00
(NH4)2SO4
8,30
Na2SO4
8,90
(NH4)2S2O3
24,80
Tiamina
0,01
Glucosa
500,00
Vitamina B 12
0,01
NH4OH 28%
Ajustado hasta pH 6,8
Tabla 6: Composición del medio mineral del lote de cultivo (B2).
Compuesto
Concentración (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O
0,0130
CuCl2.2H2O
0,0015
MnCl2.4H2O
0,0150
CoCl2.6H2O
0,0025
H3BO3
0,0030
Na2MoO4.2H2O
0,0025
Citrato de Fe(III) H2O
0,1064
EDTA
0,0084
MgSO4.7H2O
1,00
CaCl2.2H2O
0,08
Ácido cítrico
1,70
KH2PO4
2,97
Compuesto
Concentración (g.l-1)
K2HPO4.3H2O
1,65
(NH4)2HPO4
0,72
(NH4)2S2O3
3,74
Tiamina
0,01
Vitamina B 12
0,01
Biotina
0,10
Glucosa
10,00
NH4OH 28%
Ajustado hasta pH 6,8
Tabla 7: Composición del medio de alimentación por lotes de cultivo (F2).
Compuesto
Concentración (g.l-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O
0,0104
CuCl2.2H2O
0,0012
MnCl2.4H2O
0,0120
CoCl2.6H2O
0,0020
H3BO3
0,0024
Na2MoO4.2H2O
0,0020
Citrato de Fe(III) H2O
0,0524
EDTA
0,0067
MgSO4
5,00
(NH4)2S2O3
55,50
Tiamina
0,01
Vitamina B12
0,01
Biotina
0,10
Glucosa
500,00
Posteriormente, fermentadores de 0,5 l GX (GPC) se cargaron con 220 ml de medio mínimo (B2) y se inocularon 5 hasta una concentración de biomasa de 2,1 g.l-1 con un volumen de precultivo que variaba entre 20 y 30 ml.
La temperatura de cultivo se mantuvo constante a 37°C y el pH se en el valor de trabajo (6,8) mediante la adición automática de soluciones de NH4OH (NH4OH 10%). La agitación inicial se ajustó a 200 RPM durante la fase discontinua y se incrementó hasta 1000 RPM durante la fase de alimentación por lotes. El caudal de aire inicial se
10 ajustó a 0,3 l.min-1 durante la fase discontinua y se incrementó hasta 0,7 l.min-1 al principio de la fase de alimentación por lotes. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores entre 20 y 40%, preferentemente 30% de saturación al incrementar la agitación.
Cuando la masa celular alcanzaba una concentración cercana a 5 g.l-1, la alimentación por lotes se comenzó con un 15 caudal inicial de 1,9 ml.h-1. La solución de alimentación se inyectó con un perfil sigmoideo con un caudal creciente que alcanzaba 8,8 ml.h-1 después de 26 horas. Las condiciones de alimentación precisas se calcularon mediante la
donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml.h-1 para un volumen del lote de 600 ml con p1 = 0,66, p2 = 8,21, p3 = 20 0,27, p4 = 6,50.
Después de 26 horas de alimentación por lotes, la bomba de la solución de alimentación se detuvo y el cultivo se terminó después del agotamiento completo de glucosa.
Los aminoácidos extracelulares se cuantificaron mediante HPLC después de la derivación con OPA/Fmoc y otros metabolitos pertinentes se analizaron usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación.
Tabla 8: Rendimiento de metionina final (Ymet final) en % g de metionina por g de glucosa producida en un cultivo de alimentación por lotes por las diferentes cepas. Para la definición del rendimiento de metionina/glucosa, véase posteriormente. Cada cepa se evaluó una vez.
Cepa
Ymet final
Cepa 5
0.225
Cepa 7
0.186
Como se puede observar en la tabla 8 anteriormente, el rendimiento de producción de metionina se incrementaba significativamente con la mutación del gen metE. La cepa 5, que contenía el gen metE mutado, tiene un rendimiento superior de 4 puntos en comparación con la cepa 7 que contiene un proteína MetE funcional.
El volumen del fermentador se calculó al añadir al volumen inicial del reactor la cantidad de las soluciones añadidas para regular el pH para alimentar el cultivo y al sustraer el volumen usado para el muestreo y la pérdida por evaporación.
El volumen de la alimentación por lotes se siguió continuamente al pesar el material de alimentación. A continuación, la cantidad de glucosa inyectada se calculó basándose en el peso inyectado, la densidad de la solución y la concentración de glucosa determinada por el método de Brix ([Glucosa]). El rendimiento de metionina se expresó como sigue:
= ∗−∗100�
El rendimiento final obtenido durante el cultivó se presentó en la presente para cada cepa. Con Metionina0 y Metioninat, respectivamente, las concentraciones de metionina inicial y final y V0 y Vt los volúmenes inicial y final.
−=ó�
La glucosa consumida se calculó como sigue:
Glucosa Inyectadat = volumen alimentadot * [Glucosa] Glucosa consumidat = [Glucosa]0 * V0 + Glucosa Inyectada – [Glucosa]residual * Vt
Con [Glucosa]0, [Glucosa], [Glucosa]residual, respectivamente, las concentraciones de glucosa inicial, la alimentada y residual.
EJEMPLO 5: MEDIDA DE LA ACXIVITY DE METIONINA SINTASA INDEPENDIENTE DE COBALAMINA (METE).
Para la determinación in vitro de la actividad de metionina sintasa independiente de cobalamina (MS, MetE), las cepas 7 y 5 de E. coli que soportaban el gen metE silvestre o mutado se cultivaron en medio mínimo según se describe en el ejemplo 3 anteriormente y se recogieron al final de la fase logarítmica mediante centrifugación. Las pellas se resuspendieron en tampón de fosfato potásico 20 mM frío 7,2 que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa con EDTA. A continuación, las células se rompieron batiendo con cuentas con un sistema Precellys (Bertin
Technologies; 2x10s a 6500 rpm) seguido por centrifugación a
12000 g a 4°C durante 30 minutos. Los
sobrenadantes se desalaron y se usaron para análisis enzimáti
cos. Las co ncent raciones de proteínas se
determinaron usando el reactivo de ensayo Bradford (Bradford, 1976).
Para la determinación de la actividad de MS, se incubaron 40 µg de extractos celulares brutos durante 15 minutos a 37°C con 1 mM de DL-homocisteína y 0,25 mM triglutamato de metil-tetrahidropteroílo en 100 mM de tampón de fosfato potásico pH 7,2, 5 mM de MgSO4. La metionina producida por la enzima metionina sintasa independiente de cobalamina se cuantificó mediante y GC-MS después de la derivación con terc-butildimetilsililtrifluoroacetamida (TBDMSTFA). Se incluyeron aspartato y norleucina como patrones internos.
Los resultados de las actividades de metionina sintasa independiente de cobalamina se presentan en la tabla 9 posteriormente.
Tabla 9: Actividades de metionina sintasa independiente de cobalamina (en mUI/mg de proteínas) de cepas de E. coli que soportan enzimas silvestres o mutadas. Cada cepa se evaluó una vez.
Cepa
MS (mUI/mg de proteínas)
Cepa 5
0
Cepa 7
12,7
5 Como se puede observar en la tabla 9, la cepa 5 (ΔmetE) ha pedido completamente su actividad de MS mientras que la cepa 7 mantiene una significativa. Esta pérdida de actividad se correlacionaba con una mejora significativa de la producción de metionina.
EJEMPLO 6: EFECTO DE LA ELIMINACIÓN DEL GEN METE SOBRE LA PRODUCCIÓN DE L-METIONINA
10 Para evaluar el efecto de una eliminación completa del gen metE sobre la producción de L-metionina, se eliminó el gen metE mutado de la cepa 5. Se introdujo una eliminación limpia del gen metE en esa cepa usando la recombinación homóloga que se describe previamente y usando la estrategia proporcionada por Datsenko & Wanner (2000).
15 Después de la sustitución del gen metE mutado por el casete de kanamicina, los recombinantes resistentes a kanamicina se seleccionan y se verifican mediante secuenciación de ADN.
Uno de ellos se cultiva como se describe en el ejemplo 4 y la L-metionina producida se cuantifica mediante HPLC.
20 La cepa con la eliminación limpia de metE produce más metionina que la cepa 7 que posee una proteína MetE funcional: la eliminación de metE da como resultado un rendimiento incrementado de metionina de más de 15%.
REFERENCIAS
Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128.
Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254.
Carrier y Keasling, 19981999, Biotechnol. Prog. 15: 58-64.
5 Chu J, y cols., 1985, Arch Biochem Biophys. 239:467-474.
Datsenko y Wanner, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 6640-6645.
Foster y cols., 1961, Biochem. J. 80: 519-531.
González y cols., 1992, Biochemistry. 31: 6045-6056.
Harrington, Laughlin y Liang, 2001 Proc Natl Acad Sci U S A. Abr 24; 98(9):5019-24. 10 Hondorp y Matthews, 2009, J. Bacteriol. 191: 3407-3410.
Kumar y cols., 2005, Biotechnol. Adv. 23:41-61.
Liebl y cols., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210.
Miller, 1992; "A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and
Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 15 Norrander y cols., 1983. Gene. 26: 101-106.
Orosz y cols., 1991, Eur. J. Biochem. 201 : 653-659
Prescott y cols., 1999, "Microbiology" 4ª Edición, WCB McGraw-Hill.
Riedel y cols., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583.
Sambrook y cols., 1989 and 2001, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2ª y 3ª Ediciones, Cold Spring
20 Harbor Laboratory Press.
Saunderson, 1985 British Journal of Nutrition 54: 621-633.
Schaefer y cols. 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> METABOLIC EXPLORER DISCHERT, Wanda FIGGE, Rainer
<120> Microorganismo recombinante para la producción fermentativa de metionina
<130> 360894 D31034 5 <160> 22
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
< 211> 39
< 212> ADN 10 < 213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido
<400> 1
cgtaggcgcc ggtaccgagt gcagatcggc tggaaggcg 39 15 <210> 2
<
211> 115
<
212> ADN
<
213> Secuencia Artificial
<220> 20 < 223> Oligonucleótido
<400> 2
<210> 3
<
211> 108
<
212> ADN
<
213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 3
<210> 4
5
< 211> 42
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
10
<400> 4
cgtaggcgcc ggtacccagc ataatcattc accacacatc cg
42
<210> 5
< 211> 35
< 212> ADN
15
< 213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 5
tcccccgggg tataccatat gaatatcctc cttag 35
20
<210> 6
< 211> 30
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
25
< 223> Oligonucleótido
<400> 6
gcccaagctt tgtaggctgg agctgcttcg 30
<210> 7
< 211> 39
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
5
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 7
cgtaggcctg ggcccgagct gttgacaatt aatcatccg
39
<210> 8
10
< 211> 79
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
15
<400> 8
<210> 9
< 211> 21
< 212> ADN
20
< 213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 9
cagaccaccc aactggcgac c
21
25
<210> 10
< 211> 20
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 10
gccattggaa tcgaccagcc
20
5
<210> 11
< 211> 134
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
10
< 223> Oligonucleótido
<400> 11
<210> 12
<
211> 62
<
212> ADN
<
213> Secuencia Artificial
<220> 223> Oligonucleótido
<400> 12
<210> 13
<
211> 75
<
212> ADN
< 213> Secuencia Artificial 25 <220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 13
<210> 14
<
211> 94
<
212> ADN
<
213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 14
<210> 15
<
211> 85
<
212> ADN
< 213> Secuencia Artificial 15 <220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 15
<210> 16 20 < 211> 120
<
212> ADN
<
213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido 25 <400> 16
<210> 17
<
211> 120
<
212> ADN
<
213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 17
10
<210> 18
< 211> 22
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
15
< 223> Oligonucleótido
<400> 18
cgtttgggac tggatgtgct gg
22
<210> 19
< 211> 20
20
< 212> ADN
< 213> Secuencia Artificial
<220>
< 223> Oligonucleótido
<400> 19
25
gcgtggtacg gcaaactgac 20
<210> 20
< 211> 2262
<
212> ADN
<
213> Escherichia coli
<400> 20
<210> 21
<
211> 753
<
212> PRT
<
213> Escherichia coli
<400> 21
<210> 22
<
211> 152
<
212> PRT
<
213> Escherichia coli
<400> 22

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un microorganismo recombinante optimizado para la producción fermentativa de metionina, en el que la actividad de la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE se suprime y el gen metH se sobreexpresa en dicho microorganismo en comparación con un microorganismo no modificado.
  2. 2. El microorganismo según la reivindicación 1, en el que la metionina sintasa independiente de cobalamina MetE es codificada por el gen metE del que se elimina al menos una porción.
  3. 3. El microorganismo según la reivindicación 2, en el que la eliminación del gen metE es una eliminación de las 10 bases comprendidas entre las posiciones 417ª y 429ª.
  4. 4. El microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la expresión de al menos uno de los siguientes genes se está incrementada: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, thrA, un alelo metA que codifica una enzima con sensibilidad de
    15 retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina (metA*), thrA, o un alelo thrA que codifica una enzima con inhibición de retroalimentación reducida a treonina (thrA*).
  5. 5. El microorganismo según la reivindicación 4, en el que al menos un gen está bajo el control de un promotor
    inducible. 20
  6. 6.
    El microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la expresión de al menos uno d los siguientes genes está atenuada: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL o yncA.
  7. 7.
    El microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que:
    25 a. el gen metE se elimina;
    b.
    la expresión de los genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA* y pyc está potenciada; y
    c.
    la expresión de los genes metJ, pykA, pykF, purU y yncA está atenuada.
  8. 8. El microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho microorganismo es de la 30 familia bacteriana Enterobacteriaceae o Corynebacteriaceae.
  9. 9. El microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo es
    Escherichia coli.
    35 10. Un método para la producción fermentativa de metionina que comprende las etapas:
    a.
    cultivar un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono fermentable y una fuente de azufre, y
    b.
    recuperar metionina o sus derivados del medio de cultivo.
  10. 11. El método según la reivindicación 10, en el que el crecimiento del microorganismo recombinante se somete a 40 limitación o deficiencia en uno o varios sustratos inorgánicos, en particular fosfato y/o potasio, en el medio de cultivo.
ES12738603.5T 2012-06-18 2012-06-18 Microorganismo recombinante para la producción fermentativa de metionina Active ES2632170T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2012/001336 WO2013190343A1 (en) 2012-06-18 2012-06-18 Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2632170T3 true ES2632170T3 (es) 2017-09-11

Family

ID=46579255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12738603.5T Active ES2632170T3 (es) 2012-06-18 2012-06-18 Microorganismo recombinante para la producción fermentativa de metionina

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9506093B2 (es)
EP (1) EP2861726B1 (es)
JP (1) JP6100370B2 (es)
KR (1) KR101944150B1 (es)
CN (1) CN104411821B (es)
AU (1) AU2012383221A1 (es)
BR (1) BR112014031425B1 (es)
CA (1) CA2875139A1 (es)
ES (1) ES2632170T3 (es)
MX (1) MX355790B (es)
MY (1) MY168199A (es)
PL (1) PL2861726T3 (es)
RU (1) RU2629760C2 (es)
WO (1) WO2013190343A1 (es)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX374056B (es) 2013-08-30 2020-07-27 Evonik Operations Gmbh Microorganismo para la produccion de metionina con actividad de metionina sintasa y eflujo de metionina mejorados.
PL3039120T3 (pl) * 2013-08-30 2019-08-30 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganizm do wytwarzania metioniny o ulepszonym wypływie metioniny
CN103981206B (zh) * 2014-06-06 2016-03-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种筛选高产苏氨酸菌株的方法
EP3189150B1 (en) 2014-09-01 2026-03-18 Evonik Operations GmbH Method and microorganism for methionine production by fermentation with improved methionine efflux
EP3331998B1 (en) 2015-08-07 2020-06-24 Evonik Operations GmbH Protein thiocarboxylate-dependent l-methionine production by fermentation
US11034985B2 (en) 2015-11-27 2021-06-15 Evonik Operations Gmbh Method for producing L-methionine
RU2018128142A (ru) * 2016-01-08 2020-02-10 Эвоник Дегусса Гмбх Способ получения l-метионина по ферментативной технологии
CN105886449B (zh) * 2016-04-14 2019-07-26 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及其生产l-甲硫氨酸的应用
EP3296404A1 (en) 2016-09-15 2018-03-21 Evonik Degussa GmbH Modified microorganism for production of methionine
CN109963947B (zh) * 2016-10-26 2023-07-04 味之素株式会社 用于生产l-甲硫氨酸或需要s-腺苷甲硫氨酸进行合成的代谢物的方法
RU2020105358A (ru) * 2017-07-11 2021-08-11 Адиссео Франс С.А.С. Дрожжи, продуцирующие метионин
KR102016050B1 (ko) * 2018-03-20 2019-08-29 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 이의 용도
BR112020021859A2 (pt) 2018-05-04 2021-03-09 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir l-metionina ou um sal da mesma
EP3856918A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine using a bacterium
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
KR102147776B1 (ko) * 2019-09-20 2020-08-26 대상 주식회사 L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 라이신의 생산 방법
JP7655312B2 (ja) 2019-09-25 2025-04-02 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
CN110819605B (zh) * 2020-01-07 2020-04-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 甲硫氨酸合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用
CN114381417B (zh) * 2022-03-24 2022-06-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法
JPWO2024096123A1 (es) * 2022-11-04 2024-05-10

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19750493A1 (de) 1997-11-14 1999-06-02 Medos Medizintechnik Gmbh Implantat zur Stabilisierung einer Fraktur und Schraube zur Verwendung in der Chirurgie
JP4110641B2 (ja) 1998-11-17 2008-07-02 味の素株式会社 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法
JP2000157267A (ja) 1998-11-24 2000-06-13 Ajinomoto Co Inc 変異型ｍｅｔＪ遺伝子及びＬ−メチオニンの製造法
JP3614746B2 (ja) 2000-03-01 2005-01-26 松下電器産業株式会社 半導体レーザ装置および光ピックアップ装置
EP1307475A1 (en) 2000-08-02 2003-05-07 Degussa AG Nucleotide sequences which code for the meth gene
AU2002314169A1 (en) * 2001-07-06 2003-01-21 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
EP2348107A3 (fr) 2003-02-18 2012-07-11 Metabolic Explorer Procédé de préparation de microorganismes évolués permettant la création ou la modification de voies métaboliques
EP1656454A4 (en) 2003-07-08 2011-06-22 Novus Int Inc PROCESS FOR METHIONINAL RECOVERY
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
DE10359668A1 (de) 2003-12-18 2005-07-14 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Methionin
WO2005111202A1 (en) 2004-05-12 2005-11-24 Metabolic Explorer Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity
KR100651220B1 (ko) 2004-06-29 2006-11-29 씨제이 주식회사 Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법
DE102004035065A1 (de) 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag P-ET-TS-Expressionseinheiten
CA2611513A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-28 Microbia, Inc. Improved amino acid and metabolite biosynthesis
MX2008000480A (es) 2005-07-18 2008-03-07 Basf Ag Microorganismos recombinantes que producen metionina.
PL1969130T3 (pl) 2006-01-04 2014-08-29 Evonik Degussa Gmbh Sposób wytwarzania metioniny i jej prekursorów lub sukcynylo homoseryny przy zastosowaniu mikroorganizmów
WO2007119576A1 (en) * 2006-03-23 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
EP2019868A2 (en) 2006-05-24 2009-02-04 Evonik Degussa GmbH Process for the preparation of l-methionine
KR20080061801A (ko) * 2006-12-28 2008-07-03 씨제이제일제당 (주) L-메티오닌 생산능을 향상시키는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 과발현하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 l- 메티오닌 생산방법
US8252555B2 (en) * 2006-12-29 2012-08-28 Evonik Degussa Ag Nucleic acid encoding a cobalamin-dependent methionine synthase polypeptide
WO2009043372A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Metabolic Explorer Increasing methionine yield
US8163532B2 (en) 2008-05-28 2012-04-24 Evonik Degussa Gmbh Microorganisms with a reactivation system for cob(I)alamin-dependent methionine synthase
WO2010020290A1 (en) 2008-08-22 2010-02-25 Metabolic Explorer Producing methionine without n-acetyl methionine
WO2011073738A1 (en) 2009-12-14 2011-06-23 Metabolic Explorer Use of inducible promoters in the production of methionine
AR083468A1 (es) 2010-10-25 2013-02-27 Metabolic Explorer Sa Aumento de la disponibilidad de nadph para la produccion de metionina
WO2012090021A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Metabolic Explorer Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine
AR086790A1 (es) 2011-06-29 2014-01-22 Metabolic Explorer Sa Un microorganismo para la produccion de metionina con importacion de glucosa mejorada

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150033649A (ko) 2015-04-01
WO2013190343A1 (en) 2013-12-27
CN104411821A (zh) 2015-03-11
EP2861726A1 (en) 2015-04-22
MX355790B (es) 2018-04-27
CA2875139A1 (en) 2013-12-27
MY168199A (en) 2018-10-15
RU2014151747A (ru) 2016-08-10
JP6100370B2 (ja) 2017-03-22
CN104411821B (zh) 2017-08-08
BR112014031425B1 (pt) 2022-01-18
BR112014031425A2 (pt) 2017-08-01
AU2012383221A1 (en) 2015-01-15
US20150247175A1 (en) 2015-09-03
JP2015519917A (ja) 2015-07-16
US9506093B2 (en) 2016-11-29
PL2861726T3 (pl) 2017-11-30
EP2861726B1 (en) 2017-05-31
RU2629760C2 (ru) 2017-09-06
KR101944150B1 (ko) 2019-01-30
MX2014015768A (es) 2015-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2861726B1 (en) Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine
KR101636662B1 (ko) 메티오닌 수득량의 증가법
DK2314710T3 (en) A process for the production of methionine by culturing a microorganism modified to enhance the production of cysteine
EP2726626B1 (en) A microorganism for methionine production with enhanced glucose import
ES2634469T3 (es) Uso de promotores inducibles en la producción de metionina
JP2017169576A (ja) メチオニン生産のためのｎａｄｐｈの供給増加
ES2720803T3 (es) Un microorganismo para la producción de metionina con mayor eflujo de metionina
EP3039153B1 (en) Microorganism for methionine production with improved methionine synthase activity and methionine efflux
JP2008529485A (ja) 低いγ脱離活性を有する発現酵素を含む微生物
RU2723714C2 (ru) Способ и микроорганизм для ферментативного продуцирования метионина с улучшенным выходом метионина
CN108026516A (zh) 通过发酵的蛋白硫代羧化物依赖性l-甲硫氨酸生产