ES2632957T3 - Moléculas pequeñas de ARN que median en la interferencia de ARN - Google Patents

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Winfried Lendeckel
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Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Abstract

Molécula de ARN de doble hebra aislada, en la que cada hebra de ARN tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde una hebra tiene un saliente 3' de 1-3 nucleótidos y una hebra es de extremos romos, en donde dicha molécula de ARN es capaz de interferencia de ARN específica de una diana.

Description

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DESCRIPCION
Moleculas pequenas de ARN que median en la interferencia de ARN
La presente invencion se refiere a la secuencia y las caractensticas estructurales de moleculas de ARN de doble hebra (ds) requeridas para mediante en la interferencia de ARN espedfica para una diana.
El termino "interferencia de ARN " (iARN) se acuno despues del descubrimiento de la inyeccion de ARNds en el nematodo C. elegans conduce a una inactivacion espedfica de genes altamente homologos en secuencia con el ARNds aportado (Fire y cols., 1998). La iARN tambien se observo posteriormente en insectos, ranas (Oelgeschlager y cols., 2000) y otros animales incluyendo ratones (Svoboda y cols., 2000; Wianny y Zemicka-Goetz, 2000) y es probable que tambien exista en el ser humano. La iARN esta muy relacionada con el mecanismo de inactivacion genica postranscripcional (PTGS) de cosupresion en plantas y represion en hongos (Catalanotto y cols., 2000; Cogoni y Macino, 1999; Dalmay y cols., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Mourrain y cols., 2000; Smardon y cols., 2000) y algunos componentes de la maquinaria de la iARN tambien son necesarios para la inactivacion postranscripcional mediante cosupresion (Catalanotto y cols., 2000; Dernburg y cols., 2000; Ketting y Plasterk, 2000). El asunto tambien se ha revisado recientemente (Bass, 2000; Bosher y Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk y Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen y Kooter, 2000), vease ademas toda la edicion de Plant Molecular Biology, vol. 43, edicion 2/3, (2000).
En las plantas, ademas de PTGS, los transgenes introducidos tambien pueden conducir a inactivacion genica transcripcional a traves de metilacion de ADN dirigida por ARN de citosinas (veanse las referencias del Wassenegger, 2000). Dianas genomicas tan cortas como 30 pb se metilan en plantas de un modo dirigido por ARN (Pelissier, 2000). La metilacion de ADN tambien esta presente en mairnferos.
La funcion natural de la iARN y la cosupresion parece ser la proteccion del genoma contra la invasion por elementos geneticos moviles tales como retrotransposones y virus que producen ARN o ARNds aberrantes en la celula hospedadora cuando se hacen activos (Jensen y cols, 1999; Ketting y cols., 1999; Ratcliff y cols., 1999; Tabara y cols., 1999). La degradacion espedfica de ARNm evitar la replicacion de transposones y virus aunque algunos virus son capaces de vencer o evitar este proceso al expresar protemas que suprimen PTGS (Lucy y cols., 2000; Voinnet y cols., 2000).
El ARNds desencadena la degradacion espedfica de ARN homologos solo dentro de la region de identidad con el ARNds (Zamore y cols., 2000). El ARNds es procesado hasta fragmentos de ARN de 21-23 nt y los sitios de escision del ARN diana estan separados regularmente 21-23 nt. Por lo tanto, se ha sugerido que los fragmentos de 21-23 nt son los ARN grna para el reconocimiento de la diana (Zamore y cols., 2000). Estos ARN cortos tambien se detectaron en extractos preparados a partir de celulas se Schneider 2 de D. melanogaster que se transfectaron con ARNds antes de la lisis celular (Hammond y cols., 2000), sin embargo, las fracciones que desplegaban actividad de nucleasa espedfica de la secuencia tambien conteman una fraccion grande de ARNds residual. El papel de los fragmentos de 21-23 nt en la escision de ARNm grna esta apoyado adicionalmente por la observacion de que los fragmentos de 21-23 nt aislados de ARNds procesado son capaces, hasta algun grado, de mediar en la degradacion espedfica de ARNm (Zamore y cols., 2000). Moleculas de ARN de tamano similar tambien se acumulan en tejido vegetal que exhibe PTGS (Hamilton y Baulcombe, 1999).
Bass (Cell 2000, 101 (3):235-238) revisa el mecanismo implicado en la iARN y postula posibles mecanismos implicados en la iARN.
En la presente, se usa el sistema in vitro de Drosophila establecido (Tuschl y cols., 1999; Zamore y cols., 2000) para explorar adicionalmente el mecanismo de iARN. Se demuestra que los ARN cortos de 21 y 22 nt, cuando se someten a apareamiento de bases con extremos salientes 3', actuan como los ARN grna para la degradacion de ARNm espedfica para la secuencia. Los ARNds cortos de 30 pb son incapaces de mediar en la iARN en este sistema debido a que ya no son procesados hasta ARN de 21 y 22 nt. Por otra parte, se definieron los sitios de escision de ARN diana con relacion a ARN interferentes cortos (ARNsi) de 21 y 22 nt y se proporciona una evidencia de que la direccion del procesamiento de ARNds determina si un ARN diana de sentido o antisentido puede ser escindido por el complejo de endonucleasa siRNP producido. Ademas, los ARNsi tambien pueden ser herramientas importantes para la modulacion transcripcional, p. ej. la inactivacion de genes de mamffero al guiar la metilacion de ADN.
Experimentos adicionales en sistemas de cultivo celular in vivo humanos (celulas HeLa) muestran que las moleculas de ARN de doble hebra que tienen una longitud preferiblemente de 19-25 nucleotidos tienen actividad de iARN. Asf, en contraste con los resultados de Drosophila, tambien las moleculas de ARN de doble hebra de 24 y 25 nt de longitud son eficaces para la iARN.
El objetivo subyacente a la presente invencion es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar en la interferencia de ARN espedfica para una diana, teniendo dichos agentes una eficacia y una seguridad mejoradas en comparacion con agentes de la tecnica anterior.
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La solucion de este problema se proporciona mediante una molecula de ARN de doble hebra aislada, en donde cada hebra de ARN tiene una longitud de 19-23 nucleotidos, en donde dicha molecula de ARN es capaz de mediar en la interferencia de ARN espedfica para una diana. Una hebra tiene un saliente 3' de 1-3 nucleotidos, preferiblemente 2 nucleotidos. La otra hebra es de extremo romo.
La molecula de ARN es preferiblemente una molecula de ARN sintetica que esta sustancialmente libre de contaminantes que se presentan en extractos celulares, p. ej. de embriones de Drosophila. Ademas, la molecula de ARN preferiblemente esta sustancialmente libre de cualesquiera contaminantes no espedficos para una diana, particularmente moleculas de ARN no espedficas para una diana, p. ej. de contaminantes que se presentan en extractos celulares.
Ademas, la divulgacion se refiere al uso de moleculas de ARN de doble hebra aisladas, en las que cada hebra de ARN tiene una longitud de 19-25 nucleotidos, para mediar en modificaciones de acidos nucleicos no espedficas para una diana, particularmente iARN, en celulas de mamffero, particularmente en celulas humanas.
Sorprendentemente, se encontro que las moleculas de ARN de doble hebra cortas sinteticas, particularmente con extremos 3' salientes, son mediadores espedficos para una secuencia de iARN y median en la escision eficaz de ARN diana, en donde el sitio de escision esta situado en el centro de la region abarcada por el ARN corto de grna.
Preferiblemente, cada hebra de la molecula de ARN tiene una longitud de 20-22 nucleotidos (o 20-25 nucleotidos en celulas de mairnfero), en donde la longitud de cada hebra puede ser igual o diferente. Preferiblemente, la longitud del saliente 3' alcanza de 1-3 nucleotidos, en donde la longitud del saliente puede ser igual o diferente para cada hebra. Las hebras de ARN tienen preferiblemente grupos hidroxilo 3'. El extremo 5' comprende preferiblemente un grupo fosfato, difosfato, trifosfato o hidroxilo. Los ARNds mas eficaces estan compuestos por dos hebras de 21 que estan apareadas de modo que esten presentes salientes 3' de 1-3, particularmente 2 nt, en ambos extremos del ARNds.
La reaccion de escision de ARN diana guiada por ARNsi es altamente espedfico para una secuencia. Sin embargo, no todas las posiciones de un ARNsi contribuyen igualmente al reconocimiento de la diana. Los desemparejamientos en el centro del duplex de ARNsi son los mas cnticos y suprimen esencialmente la escision del ARN diana. En contraste, el nucleotido 3' de la hebra de ARNsi (p. ej. la posicion 21), que es complementaria al ARN diana de una sola hebra, no contribuye a la especificidad del reconocimiento de la diana. Ademas, la secuencia del saliente 3' de dos 2 nt desapareado de la hebra de ARNsi con la misma polaridad que el ARN diana no es cntica para la escision del ARN diana ya que solamente la hebra de ARNsi antisentido grna el reconocimiento de la diana. Asf, a partir de los nucleotidos salientes de una sola hebra, solo la penultima posicion del ARNsi antisentido (p. ej. la posicion 20) necesita emparejarse al ARNm de sentido elegido como diana.
Sorprendentemente, las moleculas de ARN de doble hebra de la presente invencion exhiben una alta estabilidad in vivo en suero o en medio de crecimiento para cultivos celulares. A fin de potenciar mas la estabilidad, los salientes 3' se pueden estabilizar contra la degradacion, p. ej. se pueden seleccionar de modo que consistan en nucleotidos de purina, particularmente nucleotidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, la substitucion de nucleotidos de pirimidina por analogos modificados, p. ej. la substitucion de salientes 3' de 2 nt de uridina por 2'-desoxitimidina es tolerada y no afecta a la eficacia de la interferencia de ARN. La ausencia de un hidroxilo 2' potencia significativamente la resistencia a nucleasa del saliente en medio de cultivo tisular.
En una realizacion especialmente preferida de la presente invencion, la molecula de ARN puede contener al menos un analogo nucleotfdico modificado. Los analogos nucleotfdicos pueden estar situados en posiciones en las que la actividad espedfica para una diana, p. ej. la actividad mediadora de iARN, no se ve sustancialmente afectada, p. ej. en una region en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la molecula de ARN de doble hebra. Particularmente, los salientes se pueden estabilizar al incorporar analogos nucleotfdicos modificados.
Analogos nucleotfdicos preferidos se seleccionan de ribonucleotidos modificados en el azucar o el esqueleto. Sin embargo, se debe apuntar que tambien son adecuados ribonucleotidos modificados en la nucleobase, es decir ribonucleotidos, que contienen una nucleobase no presente en la naturaleza en lugar de una nucleobase presente en la naturaleza tal como uridinas o citidinas modificadas en la posicion 5, p. ej. 5-(2-amino)propiluridina, 5- bromouridina; adenosinas y guanosinas modificadas en la posicion 8, p. ej. 8-bromoguanosina; desazanucleotidos, p. ej. 7-desaza-adenosina; nucleotidos alquilados en O y N, p. ej. N6-metiladenosina. En ribonucleotidos modificados en al azucar preferidos, el grupo 2’ OH se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es alquilo C1-C6, alquenilo o alquinilo y halo es F, Cl, Br o I.
En ribonucleotidos modificados en el esqueleto preferidos, el grupo fosfoester que conecta con ribonucleotidos adyacentes se reemplaza por un grupo modificado, p. ej. de un grupo fosfotioato. Se debe apuntar que las modificaciones anteriores se pueden combinar.
La secuencia de la molecula de ARN de doble hebra de la presente invencion tiene que tener una identidad suficiente con una molecula diana de acido nucleico a fin de mediar en la iARN espedfica para una diana. Preferiblemente, la secuencia tiene una identidad de al menos 70% con la molecula diana deseada en la porcion de doble hebra de la molecula de ARN. Mas preferiblemente, la identidad es al menos 85% y lo mas preferiblemente 5 100% en la porcion de doble hebra de la molecula de ARN. La identidad de una molecula de ARN de doble hebra
con una molecula diana de acido nucleico predeterminada, p. ej. una molecula diana de ARNm, se puede determinar como sigue: n
1 = — x100 L
en donde I es la identidad en porcentaje, n es el numero de nucleotidos identicos en la porcion de doble hebra del
10 ARNds y la diana y L es la longitud del saliente de secuencias de la porcion de doble hebra del ARNds y la diana.
Alternativamente, la identidad de la molecula de ARN de doble hebra con la secuencia diana tambien se puede definir incluyendo el saliente 3', particularmente un saliente que tiene una longitud de 1-3 nucleotidos. En este caso, la identidad de secuencia es preferiblemente al menos 50%, mas preferiblemente al menos 70% y lo mas
15 preferiblemente al menos 85% con la secuencia diana. Por ejemplo, los nucleotidos desde el saliente 3' y hasta 2
nucleotidos desde el extremo 5' y/o 3' de la doble hebra se pueden modificar sin una perdida de actividad significativa.
La molecula de ARN de doble hebra de la invencion se puede preparar mediante un metodo que comprende las 20 etapas:
(a) sintetizar dos hebras de ARN que tienen cada una una longitud de 19-23 nucleotidos, en donde dichas hebras de ARN son capaces de formar una molecula de ARN de doble hebra, en donde una hebra tiene un saliente 3' de 1-3 nucleotidos y una hebra es de extremo romo.
(b) combinar las hebras de ARN sintetizadas bajo condiciones en las que se forma una molecula de ARN de 25 doble hebra, que es capaz de mediar en la interferencia de ARN espedfica para una diana.
Se conocen en la tecnica metodos para sintetizar moleculas de ARN. En este contexto, se refiere particularmente a metodos de smtesis qrnmica como los descritos en Verma y Eckstein (1998).
Los ARN de una sola hebra tambien se pueden preparar mediante la transcripcion enzimatica a partir de plantillas de 30 ADN sinteticas o a partir de plasmidos de ADN aislados de bacterias recombinantes. Tfpicamente, se usan ARN polimerasas fagicas tales como ARN polimerasa de T7, T3 o SP6 (Milligan y Uhlenbeck (1989)).
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para mediar en la interferencia de ARN espedfica para una diana en una celula, que comprende las etapas:
35 (a) poner en contacto la celula con la molecula de ARN de doble hebra de la invencion bajo condiciones en las
que se pueda producir interferencia de ARN espedfica para una diana y
(b) mediar en una interferencia de ARN espedfica para una diana efectuada por el ARN de doble hebra hacia un acido nucleico diana que tiene una porcion de secuencia sustancialmente correspondiente al ARN de doble hebra.
40 Preferiblemente, la etapa de contacto (a) comprende introducir la molecula de ARN de doble hebra en una celula diana, p. ej. una celula diana aislada, p. ej. en cultivo celular, un microorganismo unicelular o una celula diana o una pluralidad de celulas diana. Mas preferiblemente, la etapa de introduccion comprende un aporte mediado por portador, p. ej. por portadores liposomicos o por inyeccion.
45 El metodo de la invencion se puede usar para determinar la funcion de un gen en una celula o un organismo o incluso para modular la funcion de un gen en una celula o un organismo, siendo capaz de mediar en la interferencia de ARN. Preferiblemente, la celula es una celula o una lmea celular eucariotica, p. ej. una celula vegetal o una celula animal, tal como una celula de mamffero, p. ej. una celula embrionaria, un citoblasto pluripotente, una celula tumoral, p. ej. una celula de teratocarcinoma o una celula infectada con virus. El organismo es preferiblemente un organismo 50 eucariotico, p. ej. una planta o un animal, tal como un mairnfero, particularmente un ser humano.
El gen diana al que se dirige la molecula de ARN de la invencion puede estar asociado con una afeccion patologica. Por ejemplo, el gen puede ser un gen asociado a patogenos, p. ej. un gen viral, un gen asociado a tumores o un gen asociado a enfermedades autoinmunitarias. El gen diana tambien puede ser un gen heterologo expresado en una 55 celula recombinante o un organismo geneticamente alterado. Al determinar o modular, particularmente inhibir, la
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funcion de este gen, se pueden obtener una informacion valiosa y beneficios terapeuticos en el campo agncola o en el campo de la medicina o la medicina veterinaria.
El ARNds se administra habitualmente como una composicion farmaceutica. La administracion se puede llevar a cabo mediante metodos conocidos, en los que un acido nucleico se introduce en una celula diana deseada in vitro o in vivo. Tecnicas de transferencia genica comunmente usadas incluyen fosfato calcico, DEAE-dextrano, electroporacion y microinyeccion y metodos virales (Graham, F.L. y van der Eb, A.J. (1973) Virol. 52, 456; McCutchan, J.H. y Pagano, J.S. (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41, 351; Chu, G. y cols (1987), Nucl. Acids Res. 15, 1311; Fraley, R. y cols. (1980), J. Biol. Chem. 255, 10431; Capecchi, M.R. (1980), Cell 22, 479). Una adicion reciente a este conjunto de tecnicas para la introduccion de ADN en celulas es el uso de liposomas cationicos (Felgner, P.L. y cols. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7413). Formulaciones lipfdicas cationicas disponibles comercialmente son, p. ej., Tfx 50 (Promega) o Lipofectamin2000 (Life Technologies).
Asf, la invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que contiene como un agente activo al menos una molecula de ARN de doble hebra como la descrita anteriormente y un portador farmaceutico. La composicion se puede usar para aplicaciones diagnosticas y terapeuticas en medicina humana o en medicina veterinaria.
Para aplicaciones diagnosticas o terapeuticas, la composicion puede estar en la forma de una solucion, p. ej. una solucion inyectable, una crema, una pomada, un comprimido, una suspension o similares. La composicion se puede administrar de cualquier modo adecuado, p. ej. mediante inyeccion, mediante aplicacion oral, topica, nasal, rectal, etc. El portador puede ser cualquier portador farmaceutico adecuado. Preferiblemente, se usa un portador que sea capaz de incrementar la eficacia de las moleculas de ARN para entrar en las celulas diana. Ejemplos adecuados de estos portadores son liposomas, particularmente liposomas cationicos. Un metodo de administracion mas preferido es la inyeccion.
Una aplicacion preferida adicional del metodo de iARN es un analisis funcional de celulas eucarioticas, u organismos eucarioticos no humanos, preferiblemente celulas u organismos mairnferos y lo mas preferiblemente celulas humanas, p. ej. lmeas celulares tales como HeLa o 293 o roedores, p. ej. ratas y ratones. Mediante transfeccion con moleculas de ARN de doble hebra adecuadas que son homologas a un gen diana predeterminado o moleculas de ADN que codifican una molecula de ARN de doble hebra adecuada, se puede obtener un fenotipo de desactivacion espedfico en una celula diana, p. ej. en un cultivo celular o en un organismo diana. Sorprendentemente, se encontro que la presencia de moleculas de ARN de doble hebra cortas no da como resultado una respuesta de interferones desde la celula hospedadora o el organismo hospedador.
Asf, se divulga en la presente ademas una celula eucariotica o un organismo eucariotico no humano que exhibe un fenotipo de desactivacion espedfico para un gen diana que comprende una expresion al menos parcialmente deficiente de al menos un gen diana endogeno en donde dicha celula u organismo es transfectado con al menos una molecula de ARN de doble hebra capaz de inhibir la expresion de al menos un gen diana endogeno o con un ADN que codifica al menos una molecula de ARN de doble hebra capaz de inhibir la expresion de al menos un gen diana endogeno. Se debe apuntar que la presente divulgacion permite la desactivacion espedfica para la diana de varios genes endogenos diferentes debido a la especificidad de iARN.
Fenotipos de desactivacion espedficos de un gen de celulas u organismos no humanos, particularmente de celulas humanas o mamfferos no humanos se pueden usar en procedimientos analfticos, p. ej. en el analisis funcional y/o fenotfpico de procesos fisiologicos complejos tales como el analisis de perfiles de expresion genica y/o proteomas. Por ejemplo, se pueden preparar los fenotipos de desactivacion de genes humanos en celulas cultivadas que se supone que son reguladores de procesos de empalme alternativos. Entre estos genes estan particularmente los miembros de la familia de factores de empalme SR, p. ej. ASF/SF2, SC35, SRp20, SRp40 o SRp55. Ademas, se puede analizar el efecto de protemas SR sobre los perfiles de ARNm de genes alternativamente sometidos a empalme predeterminados tales como CD44. Preferiblemente, el analisis se lleva a cabo mediante metodos de alto rendimiento usando chips basados en oligonucleotidos.
Usando tecnologfa de desactivacion basadas en iARN, la expresion de un gen diana endogeno se puede inhibir en una celula diana o un organismo diana. El gen endogeno se puede complementar mediante un acido nucleico diana exogeno que codifica la protema diana o una variante o forma mutada de la protema diana, p. ej. un gen o un ADNc, que opcionalmente se puede fusionar a una secuencia de acido nucleico adicional que codifica un peptido o polipeptido detectable, p. ej. un marcador de afinidad, particularmente un marcador de afinidad multiple. Las variantes o formas mutadas del gen diana difieren del gen diana endogeno en que codifican un producto genico que difiere del producto genico endogeno a nivel de los aminoacidos por sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoacidos individuales o multiples. Las variantes o las formas mutadas pueden tener la misma actividad biologica que el gen diana endogeno. Por otra parte, el gen diana variante o mutado tambien puede tener una actividad biologica, que difiere de la actividad biologica del gen diana endogeno, p. ej. una actividad parcialmente eliminada, una actividad completamente eliminada, una actividad potenciada, etc.
La complementacion se puede efectuar al coexpresar el polipeptido codificado por el acido nucleico exogeno, p. ej. una protema de fusion que comprende la protema diana y el marcador de afinidad y la molecula de ARN de doble
hebra para desactivar el gen endogeno en la celula diana. Esta coexpresion se puede efectuar al usar un vector de expresion adecuado que expresa tanto el polipeptido codificado por el acido nucleico exogeno, p. ej. la protema diana modificada con marcador, como la molecula de ARN de doble hebra o alternativamente al usar una combinacion de vectores de expresion. Las protemas y los complejos protemicos que se sintetizan de novo en la 5 celula diana contendran el producto genico exogeno, p. ej. la protema de fusion modificada. A fin de evitar la supresion de la expresion del producto genico endogeno por la molecula de duplex de iARN, la secuencia nucleotfdica que codifica el acido nucleico exogeno se puede alterar a nivel del ADN (con o sin provocar mutaciones a nivel de los aminoacidos) en la parte de la secuencia que es homologa a la molecula de ARN de doble hebra. Alternativamente, el gen diana endogeno puede estar complementado por las correspondientes secuencias 10 nucleotidicas de otras especies, p. ej. de raton.
Aplicaciones preferidas para la celula o el organismo de la divulgacion son el analisis de perfiles de expresion genica y/o proteomas. En una realizacion especialmente preferida, se lleva a cabo un analisis de una forma variante o mutante de una o varias protemas diana, en donde dichas formas variantes o mutantes se reintroducen en la celula 15 o el organismo mediante un acido nucleico diana exogeno segun se describe anteriormente. La combinacion de la desactivacion de un gen endogeno y el rescate al usar una diana exogena mutada, p. ej. parcialmente eliminada, tiene ventajas en comparacion con el uso de una celula desactivada. Ademas, este metodo es particularmente adecuado para identificar dominios funcionales de la protema diana. En una realizacion preferida adicional, se lleva a cabo una comparacion, p. ej. de perfiles de expresion genica y/o proteomas y/o caractensticas fenotfpicas de al 20 menos dos celulas u organismos. Estos organismos se seleccionan de:
(i) una celula de control o un organismo de control sin inhibicion del gen diana,
(ii) una celula o un organismo con inhibicion del gen diana y
(iii) una celula o un organismo con inhibicion del gen diana mas complementacion del gen diana por un acido nucleico diana exogeno.
25 El metodo y la celula de la invencion tambien son adecuados en un procedimiento para identificar y/o caracterizar agentes farmacologicos, p. ej. identificar nuevos agente farmacologicos de una coleccion de sustancias de prueba y/o caracterizar mecanismos de accion y/o efectos secundarios de agente farmacologicos conocidos.
Asf, tambien se divulga un sistema para identificar y/o caracterizar agentes farmacologicos que actuan sobre al 30 menos una protema diana, que comprende:
(a) una celula eucariotica o un organismo eucariotico no humano capaz de expresar al menos un gen diana endogeno que codifica dicha protema diana,
(b) al menos una molecula de ARN de doble hebra capaz de inhibir la expresion de dicho al menos un gen diana endogeno, y
35 (c) una sustancia de prueba o una coleccion de sustancias de prueba en donde se han de identificar y/o
caracterizar las propiedades farmacologicas de dicha sustancia de prueba o dicha coleccion.
Ademas, el sistema que se describe anteriormente comprende preferiblemente:
(d) al menos un acido nucleico diana exogeno que codifica la protema diana o una forma variante o mutada de la protema diana en donde dicho acido nucleico diana exogeno difiere del gen diana endogeno a nivel del acido 40 nucleico de modo que la expresion del acido nucleico diana exogeno sea sustancialmente menos inhibida por la molecula de ARN de doble hebra que la expresion del gen diana endogeno.
Por otra parte, el metodo de complementacion por desactivacion de ARN se puede usar con propositos preparativos, p. ej. para la purificacion por afinidad de protemas o complejos protemicos a partir de celulas eucarioticas, particularmente celulas de mairnfero y mas particularmente celulas humanas. En esta realizacion de la divulgacion, 45 el acido nucleico diana exogeno codifica preferiblemente una protema diana que esta fusionada a un marcador de afinidad.
El metodo preparativo se puede emplear para la purificacion de complejos protemicos de alto peso molecular que preferiblemente tienen una masa de > 150 kD y mas preferiblemente de > 500 kD y que opcionalmente pueden 50 contener acidos nucleicos tales como ARN. Ejemplos espedficos son el complejo protemico heterotnmero que consiste en las protemas de 20 kD, 60 kD y 90 kD de la partmula U4/U6 snRNP, el factor de empalme SF3b procedente de la 17S U2 snRNP que consiste en 5 protemas que tienen pesos moleculares de 14, 49, 120, 145 y
155 kD y la pardcula 25S U4/U6/U5 tri-snRNP que contiene las moleculas de ARN sn U4, U5 y U6 y aproximadamente 30 protemas, que tiene un peso molecular de aproximadamente 1,7 MD.
Este metodo es adecuado para el analisis de proteomas funcionales en celulas de mairnfero, particularmente celulas 5 humanas.
Ademas, la presente invencion se explica con mas detalle en las siguientes figuras y ejemplos.
Leyendas de las figuras
Figura 1: ARN de doble hebra tan corto como 38 pb puede mediar en la iARN.
10 (A) Representacion grafica de ARNds usados para dirigirse a ARNm de Pp-luc. Se prepararon tres series de ARNds
de extremos romos que cubnan un intervalo de 29 a 504 pb. La posicion del primer nucleotido de la hebra de sentido del ARNds se indica con relacion al codon de inicio de ARNm de Pp-luc (p1). (B) Ensayo de interferencia de ARN (Tuschl y cols., 1999). Las relaciones de actividad de Pp-luc diana a Rr-luc de control se normalizaron hasta un control de tampon (barra negra). Se preincubaron ARNds (5 nM) en lisado de Drosophila durante 15 min a 25°C 15 antes de la adicion de ARNm de Pp-luc y Rr-luc con caperuza de 7-metil-guanosina (-50 pM). La incubacion se continuo durante otra hora y a continuacion se analizo mediante el ensayo de luciferasa doble (Promega). Los datos son el promedio de al menos cuatro experimentos independientes ± desviacion estandar.
Figura 2: Un ARNds de 29 pb ya no se procesa hasta fragmentos de 21-23 nt.
Transcurso del tiempo de la formacion de 21-23 meros a partir del procesamiento de ARNds marcados con 32P 20 internamente (5 nM) en el lisado de Drosophila. Se indican la longitud y la fuente del ARNds. Un marcador del tamano de ARN (M) se ha cargado en el carril izquierdo y se indican los tamanos de los fragmentos. Las bandas dobles en el tiempo cero se deben a ARNds desnaturalizado incompletamente.
Figura 3: Los ARNds cortos escinden la diana de ARNm una sola vez.
(A) Electroforesis en gel desnaturalizantes de los productos de escision 5' estables producidos mediante la 25 incubacion de 1 h de ARN de sentido o antisentido 10 nM marcado con 32P en la caperuza con ARNds 10 nM de la serie p133 en lisado de Drosophila. Se generaron marcadores de longitud mediante digestion parcial con nucleasa T1 e hidrolisis alcalina parcial (OH) del ARN diana marcado en la caperuza. Las regiones elegidas como diana por los ARNds se indican como barras negras en ambos lados. Se muestra el espacio de 20-23 nt entre los sitios de escision predominantes para el ARNds de 111 pb de largo. La flecha horizontal indica escision inespedfica no 30 debida a iARN. (B) Posicion de los sitios de escision en ARN diana de sentido y antisentido. Las secuencias de los ARN diana de sentido de 177 nt y antisentido de 180 nt con caperuza se representan en orientacion antiparalela de modo que las secuencia complementaria sean opuestas entre sf. La region elegida como diana por los diferentes ARNds se indican mediante barras de diferentes colores situadas entre las secuencia diana de sentido y antisentido. Los sitios de escision se indican mediante drculos: drculo grande para escision intensa, drculo pequeno para 35 escision debil. El grupo fosfato radiomarcado por 32P se senala mediante un asterisco.
Figura 4: Fragmentos de ARN de 21 y 22 nt se generan mediante un mecanismo similar a RNasa III.
(A) Secuencias de ARN de D21 nt despues del procesamiento de ARNds. Los fragmentos de ARN de D21 nt generados por el procesamiento de ARNds se clonaron y secuenciaron direccionalmente. Los oligorribonucleotidos que se originan a partir de la hebra se sentido del ARNds se indican como lmeas azules, los que se originan a partir 40 de la hebra antisentido como lmeas rojas. Se usan barras gruesas si estaba presente la misma secuencia en multiples clones, indicando la frecuencia el numero de la derecha. Los sitios de escision de ARN diana mediados por el ARNds estan indicados como drculos naranjas, drculo grande para escision intensa, drculo pequeno para escision debil (vease la Figura 3B). Los drculos en la parte superior de la hebra de sentido indicaban sitios de escision dentro de la diana de sentido y los drculos en la parte inferior del ARNds indican un sitio de escision en la 45 diana antisentido. Se identificaron hasta cinco nucleotidos adicionales en fragmentos de D21 nt derivados de los extremos 3' del ARNds. Estos nucleotidos son combinaciones aleatorias de residuos predominantemente de C, G o A y se anadieron lo mas probablemente de un modo desprovisto de plantilla durante la transcripcion por T7 de las hebras constitutivas de ARNds. (B) Analisis bidimensional por TLC de la composicion de nucleotidos de ARN de D21 nt. Los ARN de D21 nt se generaron mediante la incubacion de ARNds de Pp-luc de 504 pb internamente 50 radiomarcado en lisado de Drosophila, se purificaron en gel y a continuacion se digirieron hasta mononucleotidos con la nucleasa P1 (fila superior) o la ribonucleasa T2 (fila inferior). El ARNds se radiomarco internamente mediante transcripcion en presencia de uno de los trifosfatos de nucleosido a-32P indicados. La radiactividad se detecto mediante obtencion de imagenes en placa de fosforo. Los 5'-monofosfatos de nucleosido, 3'-monofosfatos de
nucleosido, 5',3'-difosfatos de nucleosido y el fosfato inorganico se indican como pN, Np, pNp y pi, respectivamente. Los drculos negros indican puntos de absorcion UV procedentes de nucleotidos portadores no radiactivos. Los 3',5'- bisfosfatos (drculos rojos) se identificaron mediante comigracion con patrones radiomarcados preparados mediante la 5'-fosforilacion de 3'-monofosfatos de nucleosido con polinucleotido cinasa de T4 y y-32P-ATP.
5 Figura 5: ARN de 21 y 22 nt sintetico median en la escision de ARN diana.
(A) Representacion grafica de ARNds de 52 pb de control y ARNds de 21 y 22 nt sinteticos. La hebra de sentido de ARN interferentes cortos (ARNsi) de 21 y 22 nt se muestra en azul, la hebra antisentido en rojo. Las secuencias de los ARNsi se derivaban de los fragmentos clonados de ARNds de 52 y 111 pb (Figura 4A), excepto para la hebra antisentido de 22 nt del duplex 5. Los ARNsi en el duplex 6 y 7 eran unicos para la reaccion de procesamiento del 10 ARNds de 111 pb. Los dos nucleotidos salientes 3' indicados en verde estan presentes en la secuencia de la hebra antisentido sintetica de los duplex 1 y 3. Ambas hebras de los ARNds de 52 pb de control se prepararon mediante transcripcion in vitro y una fraccion de transcritos puede contener adicion de nucleotidos 3' sin plantilla. Los sitios de escision de ARN diana dirigidos por los duplex de ARNsi se indican como drculos naranjas (vease la leyenda de la Figura 4A) y se determinaron como se muestra en la Figura 5B. (B) Posicion de los sitios de escision en ARN diana 15 de sentido y antisentido. Las secuencias de ARN diana son como se describen en la Figura 3B. Se incubaron ARNds de 52 pb de control (10 nM) o duplex de ARN de 21 y 22 nt 1-7 (100 nM) con ARN diana durante 2,5 h a 25°C en lisado de Drosophila. Los productos de escision 5' estables se resolvieron sobre el gel. Los sitios de escision se indican en la Figura 5A. La region elegida como diana por el ARNds de 52 pb o las hebras de sentido (s) o antisentido (as) se indican por las barras negras en el lado del gel. Los sitios de escision estan todos situados 20 dentro de la region de identidad de los ARNds. Para la determinacion precisa de los sitios de escision de la hebra antisentido, se uso un porcentaje inferior de gel.
Figura 6: Los salientes 3' largos en ARNds cortos inhiben iARN.
(A) Representacion grafica de construccion de ARNds de 52 pb. Las extensiones 3' de la hebra se sentido y antisentido se indican en azul y rojo, respectivamente. Los sitios de escision observados en los ARN diana se
25 representan como drculo naranja analogamente a la Figura 4A y se determinaron como se muestra en la Figura 6B.
(B) Posicion de los sitios de escision en ARN diana de sentido y antisentido. Las secuencias de ARN diana son como se describen en la Figura 3B. Se incubo ARNds (10 nM) con ARN diana durante 2,5 h a 25°C en lisado de Drosophila. Los productos de escision 5' estables se resolvieron sobre el gel. Los sitios de escision principales se indican con una flecha horizontal y tambien se representan en la Figura 6A. La region elegida como diana por el
30 ARNds de 52 pb se representa como una barra negra a ambos lados del gel.
Figura 7: Modelo propuesto para iARN.
Se predice que la iARN comienza con el procesamiento de ARNds (hebra de sentido en negro, hebra antisentido en rojo) hasta ARN interferentes cortos (ARNsi) predominantemente de 21 y 22 nt. Los nucleotidos 3' salientes cortos, si estan presentes en el ARNds, pueden ser beneficiosos para el procesamiento de ARNds cortos. Las protemas 35 que procesan ARNds, que siguen sin caracterizarse, se representan como ovalos verdes y azules, y se ensamblan en el ARNds de modo asimetrico. En el presente modelo, esto se ilustra mediante la union de una protema o dominio protemico azul hipotetico con la hebra de ARNsi en la direccion 3' a 5' mientras que la protema o el domino protemico verde hipotetico siempre esta unido a la hebra de ARNsi opuesta. Estas protemas o un subgrupo permanecen asociados con el duplex de ARNsi y conservan su orientacion segun se determina por la direccion de la 40 reaccion de procesamiento de ARNds. Solamente la secuencia de ARNsi asociada con la protema azul es capas de guiar la escision del ARN diana. El complejo con endonucleasa se denomina un complejo ribonucleoprotemico interferente pequeno o siRNP. Se supone en la presente que la endonucleasa que escinde el ARNds tambien puede escindir el ArN diana, probablemente al desplazar temporalmente la hebra de ARNsi pasiva no usada para el reconocimiento de la diana. A continuacion, el ARN diana se escinde en el centro de la region reconocida por el 45 ARNsi de grna de secuencia complementaria.
Figura 8: Construcciones indicadoras y duplex de ARNsi.
(a) Se ilustran las regiones de genes indicadores de luciferasa de luciernaga (Pp-luc) y pensamiento de mar (Rr-luc) procedentes de los plasmidos pGL2-Control, pGL-3-Control y pRL-TK (Promega). Se indican elementos reguladores de SV40, el promotor de timidina cinasa de HSV y dos intrones (lmeas). La secuencia de luciferasa GL3 es 95% 50 identico a gL2, pero RL es completamente ajena a ambos. La expresion de luciferasa pGL2 es aprox. 10 veces inferior que la de pGL3 en celulas de mairnfero transfectadas. La region elegida como diana por los duplex de ARNsi esta indicada como una barra negra por debajo de la region codificante de los genes de luciferasa. (b) Se muestran las secuencias de sentido (superior) y antisentido (inferior) de los duplex del ARNsi que eligen como diana luciferasa GL2, GL3 y RL. Los duplex de ARNsi de GL2 y GL3 difieren solamente en 3 sustituciones de nucleotidos simples 55 (encerrado en gris). Como control no espedfico, se sintetizo un duplex con la secuencia de GL2 invertida, invGL2. El
saliente 3' de 2 nt de 2'-desoxitimidina se indica como TT; uGL2 es similar a ARNsi de GL2 pero contiene salientes 3' de ribouridina.
Figura 9: Interferencia de ARN por duplex de ARNsi.
Las relaciones de luciferasa diana-de control se normalizaron a un control de tampon (bu, barras negras); las barras 5 grises indican relaciones de luciferasa GL2 o GL3 de Photinus pyralis (Pp-luc) a luciferasa RL de Renilla reniformis (Rr-luc) (eje izquierdo), mientras que las barras blancas indican relaciones de RL a GL2 o GL3 (eje derecho). Los paneles a, c, e, g e i describen experimented realizados con la combinacion de plasmidos pGL2-Control y senalizador pRL-TK, los paneles b, d, f, h y j con plasmidos pGL3-Control y senalizador pRL-TK. La lmea celular usada para el experimento de interferencia se indica en la parte superior de cada grafica. Las relaciones de Pp- 10 luc/Rr-luc para el control de tampon (bu) variaban entre 0,5 y 10 para pGL2/pRL y entre 0,03 y 1 para pGL3/pRL, respectivamente, antes de la normalizacion y entre las diversas lmeas celulares probadas. Los datos representados se promediaron a partir de tres experimentos independientes ± D.E.
Figura 10: Efectos de ARNsi de 21 nt, ARNds de 50 pb y 500 pb sobre la expresion de luciferasa en celulas HeLa.
La longitud exacta de los ARNds largos se indica debajo de las barras. Los paneles a, c y e describen experimentos 15 realizados con los plasmidos pGL2-Control y senalizador pRL-TK, los paneles b, d y f con los plasmidos pGL3- Control y senalizador pRL-TK. Los datos se promediaron a partir de dos experimentos independientes ± D.E. (a), (b) Expresion absoluta de Pp-luc, representada en unidades de luminiscencia arbitrarias. (c), (d) expresion de Rr-luc, representada en unidades de luminiscencia arbitrarias. (e), (f) Relaciones de luciferasa diana a control normalizada. Las relaciones de actividad de luciferasa para duplex de ARNsi se normalizaron hasta un control de tampon (bu, 20 barras negras); las relaciones de luminiscencia para ARNds de 50 o 500 pb se normalizaron hasta las relaciones respectivas observadas para ARNds de 50 y 500 pb a partir de GFP humanizada (hG, barras negras). Se debe apuntar que las diferencias globales en las secuencias entre los ARNds de 49 y 484 pb que eligen como diana GL2 y GL3 no son suficientes para conferir especificidad entre las dianas GL2 y GL3 (identidad ininterrumpida de 43 nt en el segmento de 49 pb, la identidad ininterrumpida mas larga de 239 nt en el segmento de 484 pb).
25 Figura 11: Variacion del saliente 3' de duplex de ARNsi de 21 nt.
(A) Esbozo de la estrategia experimental. Se representa el ARNm diana de sentido con caperuza y poliadenilado y se muestran las posiciones relativas de ARNsi de sentido y antisentido. Se prepararon ocho series de duplex, segun las ochos hebras antisentido diferentes. Las secuencias de ARNsi y el numero de nucleotidos salientes se cambiaron en etapas de 1 nt. (B) Luminiscencia relativa normalizada de luciferasa diana (Photinus pyralis, Pp-luc) a 30 luciferasa de control (Renilla reniformis, Rr-luc) en lisado de embriones de D. melanogaster en presencia de 5 nM de ARN de extremos romos. Las relaciones de luminiscencia determinadas en presencia de ARNds se normalizaron hasta la relacion obtenida para un control de tampon (bu, barra negra). Relaciones normalizadas menores de 1 indican interferencia espedfica. (C-J) Relaciones de interferencia normalizadas para ocho series de duplex de ARNsi de 21 nt. Las secuencias de duplex de ARNsi se representan encima de los graficos de barras. Cada panel muestra 35 la relacion de interferencia para un grupo de duplex formados con un ARNsi de grna antisentido y 5 ARNsi de sentido diferentes. El numero de nucleotidos salientes (saliente 3', numeros positivos; salientes 5', numeros negativos) esta indicado en el eje x. Los puntos de datos se promediaron a partir de al menos 3 experimentos independientes, las barras de error representan desviaciones estandar.
Figura 12: Variacion de la longitud de la hebra de sentido de duplex de ARNsi.
40 (A) Representacion grafica del experimento. Las tres hebras antisentido de 21 nt se aparearon con ocho ARNsi de
sentido. Los ARNsi se cambiaron de longitud en su extremo 3'. El saliente 3' del ARNsi antisentido era 1 nt (B), 2 nt
(C) o 3 nt (D) mientras que el saliente del ARNsi de sentido se variaba para cada serie. Se indican las secuencias de los duplex de ARNsi y las correspondientes relaciones de interferencia.
Figura 13: Variacion de la longitud de duplex de ARNsi con salientes 3' de 2 nt conservados.
45 (A) Representacion grafica del experimento. El duplex de ARNsi de 21 nt es identico en secuencia al mostrado en la
Figura 11 H o 12C. Los duplex de ARNsi se extendieron hasta el lado 3' del ARNsi de sentido (B) o el lado 5' del ARNsi de sentido (C). Se indican las secuencias de los duplex de ARNsi y las correspondientes relaciones de interferencia.
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Figura 14: Sustitucion de los grupos hidroxilo 2' de los residuos de ribosa de ARNsi.
Los grupos 2'hidroxilo (OH) en las hebras de duplex de ARNsi se reemplazaron por 2'-desoxi (d) o 2'-O-metilo (Me). Las sustituciones de 2'-desoxi de 2 nt y 4 nt en los extremos 3' se indican como 2 nt d y 4 nt d, respectivamente. Los residuos de uridina se reemplazaron por 2'-desoxitimidina.
Figura 15: Cartograffa de la escision de ARN diana de sentido y antisentido por duplex de ARNsi de 21 nt con salientes 3' de 2 nt.
(A) Representacion grafica de ARN diana de sentido y antisentido y duplex de ARNsi marcados en la caperuza (asterisco) de 32P. La posicion de la escision de los ARN diana de sentido y antisentido se indica mediante triangulos por encima y por debajo de los duplex de ARNsi, respectivamente. (B) Cartograffa de sitios de escision de ARN diana. Despues de 2 h de incubacion de 10 nM de diana con 100 nM de duplex de ARNsi en lisado de embriones de D. melanogaster, el sustrato marcado en la caperuza en 5' y los productos de escision 5' se resolvieron sobre geles de secuenciacion. Los marcadores de longitud se generaron mediante digestion parcial con RNasa (T1) e hidrolisis alcalina parcial (OH-) de los ARN diana. Las ffneas en negrita a la izquierda de las imagenes indican la region cubierta por las hebras de ARNsi 1 y 5 de la misma orientacion que la diana.
Figura 16: El extremo 5' de un ARNsi de grna define la posicion de la escision de ARN diana.
(A, B) Representacion grafica de la estrategia experimental. El ARNsi antisentido era el mismo en todos los duplex de ARNsi, pero la hebra de sentido se variaba entre 18 y 25 nt al cambiar el extremo 3' (A) o de 18 a 23 nt al cambiar el extremo 5' (B). La posicion de la escision de ARN diana de sentido y antisentido esta indicada por triangulos por encima y por debajo de los duplex de ARNsi, respectivamente. (C, D) Analisis de la escision de ARN diana usando ARN diana de sentido (panel superior) o antisentido (panel inferior) marcados en la caperuza. Solamente se muestran los productos de escision 5' marcados en la caperuza. Se indican las secuencias de los duplex de ARNsi, y la longitud de las hebras de ARNsi de sentido se marca en la parte superior del panel. El carril de control marcado con un guion en el panel (C) muestra ARN diana incubado en ausencia de ARNsi. Los marcadores eran como se describe en la Figura 15. Las flechas en (D), panel inferior, indican los sitios de escision del ARN diana que difieren en 1 nt.
Figura 17: Variacion se secuencia del saliente 3' de duplex de ARNsi.
El saliente 3' de 2 nt (NN, en gris) se cambio en secuencia y composicion como se indica (T, 2'-desoxitimidina, dG, 2'-desoxiguanosina; asterisco, duplex de ARNsi silvestre). Las relaciones de interferencia normalizadas se determinaron como se describe en la Figura 11. La secuencia silvestre es la misma que la representada en la Figura 14.
Figura 18: Especificidad de secuencia de reconocimiento de diana.
Se muestran las secuencias de los duplex de ARNsi desemparejados, los segmentos de secuencia modificados o los nucleotidos simples estan realzados en gris. El duplex de referencia (ref) y los duplex de ARNsi 1 a 7 contienen salientes de 2 nt de 2'-desoxitimidina. La eficacia de desactivacion del duplex de referencia modificado con timidina era comparable con la secuencia silvestre (Figura 17). Las relaciones de interferencia normalizadas se determinaron como se describe en la Figura 11.
Figura 19: Variacion de la longitud de duplex de ARNsi con salientes 3' de 2 nt conservados.
Los duplex de ARNsi se extendieron hacia el lado 3' del ARNsi de sentido (A) o el lado 5' del ARNsi de sentido (B). Se indican las secuencias de los duplex de ARNsi y las relaciones de interferencia respectivas. Para celulas HeLa SS6, los duplex de ARNsi (0,84 |jg) que eligen como diana luciferasa GL2 se transfectaron junto con los plasmidos pGL2-Control y pRL-TK. Para comparacion, se indican las actividades de iARN in vitro de los duplex probados en lisado de D. melanogaster.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Interferencia de ARN mediada por ARN sinteticos pequenos 1.1. Procedimientos experimental
1.1.1 iARN in vitro
Se realizaron preparaciones de iARN y lisado in vitro como se describe previamente (Tuschl y cols., 1999; Zamore y cols., 2000). Es cntico usar creatina cinasa (Roche) disuelta recientemente para la regeneracion optima de ATP. Los ensayos de traduccion de iARN (Fig. 1) se realizaron con concentraciones de ARNds de 5 nM y un penodo de preincubacion prolongado de 15 min a 25°C antes de la adicion de ARNm indicadores de Pp-luc y Rr-luc transcritos in vitro, con caperuza y poliadenilados. La incubacion se continuo durante 1 h y la cantidad relativa de protema de Pp-luc y Rr-luc se analizo usando el ensayo de luciferasa doble (Promega) y un luminometro Monolight 3010C (PharMingen).
1.1.2 Smtesis de ARN
Se usaron procedimientos estandar para la transcripcion in vitro de ARN procedente de plantillas de PCR que soportan secuencias promotoras de T7 o SP6, vease, por ejemplo (Tuschl y cols., 1998). Se preparo ARN sintetico usando fosforamiditas de ARN Expedite (Proligo). El oligonucleotido adaptador 3' se sintetizo usando dimetoxitritil- 1,4-bencenodimetanol-succinil-aminopropil-CPG. Los oligorribonucleotidos se desprotegieron en 3 ml de amomaco al 32%/etanol (3/1) durante 4 h a 55°C (ARN Expedite) o 16 h a 55°C (oligonucleotidos quimericos de ADN/ARN adaptadores 3' y 5') y a continuacion se desililaron y se purificaron en gel como se describe previamente (Tuschl y cols., 1993). Los transcritos de ARN para la preparacion de ARNds que incluyen salientes 3' largos se generaron a partir de plantillas de PCR que contema un promotor de T7 en direccion de sentido y un promotor SP6 en direccion antisentido. La plantilla de transcripcion para ARN diana de sentido y antisentido se amplifico por PCR con GCGTAATACGACTCACTATAGAACAATTGCTTTTACAG (subrayado, promotor de T7) como cebador 5' y ATTTAGGTGACACTATAGGCATAAAGAATTGAAGA (subrayado, promotor SP6) como cebador 3' y el plasmido Pp- luc linealizado (secuencia de pGEM-luc) (Tuschl y cols., 1999) como plantilla; el ARN de sentido transcrito con T7 tema 177 nt de longitud y la secuencia Pp-luc entre las pos. 113-273 con relacion al codon de inicio y seguido por 17 nt del complemento de la secuencia promotora SP6 en el extremo 3'. Los transcritos para la formacion de ARNds de extremos romos se prepararon mediante la transcripcion a partir de dos productos de PCR diferentes que solo conteman una unica secuencia promotora.
La renaturalizacion de ARNds se llevo a cabo usando una extraccion con fenol/cloroformo. Una concentracion equimolar de ARN de sentido y antisentido (de 50 nM a 10 pM, dependiendo de la longitud y la cantidad disponible) en 0,3 M de NaOAc (pH 6) se incubo durante 30 s a 90°C y a continuacion se extrajo a temperatura ambiente con un volumen igual de fenol/cloroformo, y seguido por una extraccion con cloroformo para retirar el fenol residual. El ARNds resultante se precipito mediante la adicion de 2,5-3 volumenes de etanol. La pella se disolvio en tampon de lisis (100 mM de KCI, 30 mM de HEPES-KOH, pH 7,4, 2 mM de Mg(OAc)2) y la calidad del ARNds se verifico mediante electroforesis en gel de agarosa estandar 1 x tampon de TAE. Los ARNds de 52 pb con los salientes 3' de 17 nt y 20 nt (Figura 6) se renaturalizaron al incubar durante 1 min a 95 °C, a continuacion se enfriaron rapidamente hasta 70°C y seguido por enfriamiento lento hasta temperatura ambiente a lo largo de un penodo de 3 h (50 pl de reaccion de renaturalizacion, 1 pM de concentracion de hebra, 300 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5). A continuacion, los ARNds se extrajeron con fenol/cloroformo, se precipitaron con etanol y se disolved en tampon de lisis.
La transcripcion de ARN radiomarcado con 32P internamente usada para la preparacion de ARNds (Figuras 2 y 4) se realizo usando 1 mM de ATP, CTP, GTP, 0,1 o 0,2 mM de UTP y 0,2-0,3 pM de 32P-UTP (3000 Ci/mmol), o la relacion respectiva para trifosfatos de nucleosido radiomarcados distintos de UTP. El marcaje de la caperuza de los ARN diana se realizo como se describe previamente. Los ARN diana se purificaron en gel despues del marcaje de la caperuza.
1.1.3 Cartograffa de sitios de escision
Se realizaron reacciones de iARN estandar al preincubar 10 nM de ARNds durante 15 min seguido por la adicion de 10 nM de ARN diana marcado en la caperuza. La reaccion se detuvo despues de 2 h mas (Figura 2A) o 2,5 h de incubacion (Figura 5B y 6B) mediante tratamiento con proteinasa K (Tuschl y cols., 1999). A continuacion, las muestras se analizaron sobre geles de secuenciacion al 8 o 10%. Los duplex de ARN sinteticos de 21 y 22 nt se usaron en una concentracion final de 100 nM (Fig 5B).
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1.1.4 Clonacion de ARN de D21 nt
Los ARN de 21 nt se produjeron mediante la incubacion de ARNds radiomarcado en lisado de Drosophila en ausencia de ARN diana (200 jl de reaccion, 1 h de incubacion, 50 nM de dsP111 o 100 nM de dsP52 o dsP39). La mezcla de reaccion se trato posteriormente con proteinasa K (Tuschl y cols., 1999) y los productos de procesamiento de ARNds se separaron sobre un gel de poliacrilamida al 15% desnaturalizante. Una banda, que inclma un intervalo de tamanos de al menos 18 a 24 nt, se corto, se eluyo en 0,3 M de NaCl durante la noche a 4°C y en tubos siliconizados. El ARN se recupero mediante precipitacion con etanol y se desfosforilo (30 jl de reaccion, 30 min, 50°C, 10 U de fosfatasa alcalina, Roche). La reaccion se detuvo mediante extraccion con fenol/cloroformo y el ARN se precipito con etanol. El oligonucleotido adaptador 3' (pUUUaaccgcatccttctcx: mayusculas, ARN; minusculas, ADN; p, fosfato; x, 4-hidroximetilbencilo) se ligo a continuacion al ARN de D21 nt desfosforilado (20 jl de reaccion, 30 min, 37°C, 5 jM de adaptador 3', 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de MgCh, 0,2 mM de ATP, 0,1 mg/ml de BSA acetilada, 15% de dMsO, 25 U de RNA ligasa de T4, Amersham-Pharmacia) (Pan y Uhlenbeck, 1992). La reaccion se detuvo mediante la adicion de un volumen igual de mezcla de terminacion de 8 M de urea/50 mM de EDTA y se cargo directamente sobre un gel al 15%. La ligacion da mas de 50%. El producto de ligacion se recupero del gel y se fosforilo en 5' (20 jl de reaccion, 30 min, 37°C, 2 mM de ATP, 5 U de polinucleotido cinasa de T4, NEB). La reaccion de fosforilacion se detuvo mediante extraccion con fenol/cloroformo y el ARN se recupero mediante precipitacion con etanol. A continuacion, el adaptador 5' (tactaatacgactcactAAA: mayusculas, ARN; minusculas, ADN) se ligo al producto de ligacion fosforilado segun se describe anteriormente. El nuevo producto de ligacion se purifico en gel y se eluyo del gel de sflice en presencia de cebador de transcripcion inversa (GACTAGCTGGAATTCAAGGATGCGGTTAAA: negrita, sitio Eco RI) usado como portador. La transcripcion inversa (15 jl de reaccion, 30 min, 42°C, 150 U de tanscriptasa inversa Superscript II, Life Technologies) fue seguida por PCR usando como cebador 5' CAGCCAACGGAATTCATACGACTCACTAAA (negrita, sitio Eco RI) y el cebador de RT 3'. El producto de PCR se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y se precipito con etanol. A continuacion, el producto de PCR se digirio con Eco RI (NEB) y se concatamerizo usando ADN ligasa de T4 (alta conc., NEB). Los concatameros de un intervalo de tamano de 200 a 800 pb se separaron sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusion, se recuperaron del gel mediante una fusion estandar u un procedimiento de extraccion con fenol, y se precipitaron con etanol. Los extremos desapareados se rellenaron mediante incubacion con polimerasa de Taq bajo condiciones estandar durante 15 min a 72°C y el producto de ADN se ligo directamente en el vector pCR2.1-TOPO usando el estuche de clonacion TOPO TA (Invitrogen). Las colonias se cribaron usando PCR y cebadores de secuenciacion inversa M13-20 y M13. Los productos de PCR se sometieron directamente a secuenciacion personalizada (Sequence Laboratories Gottingen GmbH, Alemania). De media, se obteman de cuatro a cinco secuencias 21meras por clon.
1.1.5 Analisis de 2D-TLC
La digestion con nucleasa P1 de ARNsi purificados en gel radiomarcados y 2D-TLC se llevo a cabo como se describe (Zamore y cols., 2000). La digestion con nucleasa T2 se realizo en reacciones de 10 jl durante 3 h a 50°C en 10 mM de acetato amonico (pH 4,5) usando 2 jg/jl de ARNt portador y 30 U de ribonucleasa T2 (Life Technologies). La migracion de patrones no radiactivos se determino mediante ensombrecimiento UV. La identidad de 3',5'-difosfatos de nucleosido se confirmo mediante la comigracion de los productos de digestion de T2 con patrones preparados mediante fosforilacion con 32P en 5' de 3'-monofosfatos de nucleosido comerciales usando y- 32P-ATP y polinucleotido cinasa de T4 (datos no mostrados).
1.2 Resultados y analisis
1.2.1 Requisitos de longitud para el procesamiento de ARNds hasta fragmentos de ARN de 21 y 22 nt
El lisado preparado a partir de embriones sincitiales de D. melanogaster recapitula iARN in vitro proporcionando una nueva herramienta para el analisis bioqmmico del mecanismo de iARN (Tuschl y cols., 1999; Zamore y cols., 2000). El analisis in vitro e in vivo de los requisitos de longitud de ARNds para iARN ha revelado que los ARNds cortos (<150 bp) son menos eficaces que los ARNds mas largos para degradas ARNm diana (Caplen y cols., 2000; Hammond y cols., 2000; Ngo y cols., 1998); Tuschl y cols., 1999). Las razones de la reduccion en la eficacia de degradacion de ARNm no se entienden. Por lo tanto, se examino el requisito de longitud preciso de ARNds para la degradacion de ARN diana bajo condiciones optimizadas de en el lisado de Drosophila (Zamore y cols., 2000). Se sintetizaron varias series de ARNds y se dirigieron contra ARN indicador de luciferasa de luciernaga (Pp-luc). La supresion espedfica de la expresion de ARN diana se verifico mediante el ensayo de luciferasa doble (Tuschl y cols., 1999) (Figuras 1A and 1B). Se detecto la inhibicion espedfica de la expresion de ARN diana para ARNds tan cortos como 38 pb, pero los ARNds de 29 a 36 pb no eran eficaces en este procedimiento. El efecto era independiente de la posicion de la diana y el grado de inhibicion de la expresion de ARNm de Pp-luc se correlacionaba con la longitud del ARNds, es decir, los ARNds largos eran mas eficaces que los ARNds cortos.
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Se ha sugerido que los fragmentos de ARN de 21-23 nt generados mediante el procesamiento de ARNds son los mediadores de la interferencia y la cosupresion de ARN (Hamilton y Baulcombe, 1999; Hammond y cols., 2000; Zamore y cols., 2000). Por lo tanto, se analizo la velocidad de formacion de fragmentos de 21-23 para un subgrupo de ARNds que vanan de tamano entre 501 y 29 pb. La formacion de fragmentos de 21-23 nt en lisado de Drosophila (Figura 2) era facilmente detectable para ARNds de 39 a 501 pb de largo pero se retrasaba significativamente para el ARNds de 29 pb. Esta observacion es coherente con un papel de los fragmentos de 21-23 nt en la escision de ARNm de gma y proporciona una explicacion de la falta de iARN por ARNds de 30 pb. Es probable que la dependencia con la longitud de la formacion de 21-23 meros refleje un mecanismo de control biologicamente importante para prevenir la activacion no deseada de iARN por estructuras con bases apareadas intramoleculares cortas de ARN celulares regulares.
1.2.2 El ARNds de 39 pb media en la escision de ARN diana en un solo sitio
La adicion de ARNds y ARN diana con caperuza en 5' al lisado de Drosophila da como resultado una degradacion espedfica de una secuencia del ARN diana (Tuschl y cols., 1999). El ARNm diana solo se escinde dentro de la region de identidad con el ARNds y muchos de los sitios de escision de la diana estaban separados por 21-23 nt (Zamore y cols., 2000). Asf, se esperaba que un numero de sitios de escision para un ARNds dado correspondiera aproximadamente a la longitud del ARNds dividida por 21. Se cartografiaron los sitios de escision de la diana en un ARN diana de sentido y antisentido que se radiomarco en 5' en la caperuza (Zamore y cols., 2000) (Figuras 3A y 3B). Los productos de escision 5' estables se separaron sobre un gel de secuenciacion y la posicion de escision se determino mediante la comparacion con una RNasa T1 parcial y una escalera de hidrolisis alcalina procedente del ARN diana.
De acuerdo con la observacion previa (Zamore y cols., 2000), todos los sitios de escision del ARN diana se situaron dentro de la region de identidad con el ARNds. La diana de sentido o antisentido solo era escindida una vez por ARNds de 39 pb. Cada sitio de escision estaba situado a 10 nt del extremo 5' de la region cubierta por el ARNds (Figura 3B). El ARNds de 52 pb, que comparte el mismo extremo 5' con el ARNds de 39 pb, produce el mismo sitio de escision en la diana de sentido, situado a 10 nt del extremo 5' de la region de identidad con el ARNds, ademas de dos sitios de escision mas debiles 23 y 24 nt aguas abajo del primer sitio. La diana antisentido solo se escindfa una vez, de nuevo a 10 nt desde el extremo 5' de la region cubierta por su respectivo ARNds. La cartograffa de los sitios de escision para los ARNds de 38 a 49 pb mostrada en la Figura 1 mostraba que el sitio de escision primero y predominante siempre estaba situado de 7 a 10 nt agua debajo de la region cubierta por el ARNds (datos no mostrados). Esto sugiere que el punto de escision de ARN diana esta determinado por el extremo del ARNds y podna implicar que el procesamiento hasta 21-23 meros se iniciara desde los extremos del duplex.
Los sitios de escision en la diana de sentido y antisentido para el ARNds de 111 pb mas largo eran mucho mas frecuentes que lo anticipado y la mayona de ellos aparecen en aglomerados separados por de 20 a 23 nt (Figuras 3A y 3B). Como para los ARNds mas cortos, el primer sitio de escision en la diana de sentido esta a 10 nt desde el extremo 5' de la region abarcada por el ARNds, y el primer sitio de escision en la diana antisentido esta situado a 9 nt desde el extremo 5' de la region cubierta por el ARNds. No esta claro que provoca esta escision desordenada, pero una posibilidad podna ser que los ARNds mas largos pudieran no solo ser procesados desde los extremos sino tambien internamente, o haya algunos determinantes de la especificidad para el procesamiento de ARNds que todavfa no se entienden. Algunas irregularidades para el espacio de 21-23 nt tambien se apuntaron previamente (Zamore y cols., 2000). Para entender mejor la base molecular del procesamiento de ARNds y el reconocimiento de ARN diana, se decidio analizar las secuencias de los fragmentos de 21-23 nt generados por el procesamiento de ARNds de 39, 52 y 111 pb en el lisado de Drosophila.
1.2.3 ARNds es procesado hasta ARN de 21 y 22 nt mediante un mecanismo similar a RNasa III
A fin de caracterizar los fragmentos de ARN de 21-23 nt, se examinaron los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ARN. La oxidacion con peryodato de ARN de 21-23 nt purificados en gel seguida por 13-eliminacion indicaba la presencia de grupos hidroxilo 2' y 3' terminales. Los 21-23 meros tambien eran sensibles al tratamiento con fosfatasa alcalina, indicando la presencia de un grupo fosfato 5' terminal. La presencia de extremos fosfato 5' e hidroxilo 3' sugiere que el ARNds podna ser procesado por una actividad enzimatica similar a RNasa III de E. coli (para las revisiones, veanse (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982)).
La clonacion direccional de fragmentos de ARN de 21-23 nt se realizo mediante la ligacion de un oligonucleotido adaptador 3' y 5' a los 21-23 meros purificados usando una ARN ligasa de T4. Los productos de ligacion se transcribieron inversamente, se amplificaron por PCR, se concatamerizaron, se clonaron y se secuenciaron. Se secuenciaban mas de 220 RNA cortos a partir de reacciones de procesamiento de ARNds de los ARNds de 39, 52 y 111 pb (Figura 4A). Se encontro la siguiente distribucion de longitudes: 1% de 18 nt, 5% de 19 nt, 12% de 20 nt, 45% de 21 nt, 28% de 22 nt, 6% de 23 nt y 2% de 24 nt. El analisis de secuencia del nucleotido 5' terminal de los fragmentos procesados indicaba que los oligonucleotidos con una guanosina 5' estaban subrepresentados. Esta desviacion era introducida lo mas probablemente por ARN ligasa de T4 que discrimina frente a guanosina fosforilada
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5' como oligonucleotido donante; no se observo una desviacion de secuencia significativa en el extremo 3'. Muchos de los fragmentos de Q21 nt derivados de los extremos 3' de la hebra de sentido o antisentido de los duplex incluyen nucleotidos 3' que se derivan de la adicion sin plantilla de nucleotidos durante la smtesis de ARN usando ARN polimerasa de T7. De forma interesante, tambien se clono un numero significativo de ARN de Q21 nt de Drosophila endogenos, algunos de ellos a partir de retrotransposones de LTR y no de LTR (datos no mostrados). Esto es coherente con un posible papel de iARN en la desactivacion de transposones.
Los ARN de Q21 nt aparecen en grupos aglomerados (Figura 4A) que cubren todas las secuencias de ARNds. Aparentemente, la reaccion de procesamiento corta el ARNds al dejar extremos 3' escalonados, otra caractenstica de la escision con RNasa III. Para el ARNds de 39 pb, se encontraron dos aglomerados de ARN de Q21 nt procedentes de cada hebra constitutiva de ARNds incluyendo los extremos 3' salientes, sin embargo solo se detectaba un sitio de escision en la diana de sentido y antisentido (Figuras 3A y 3B). Si los fragmentos de Q21 estaban presentes como ARN de grna de una sola hebra en un complejo de media en la degradacion de mRNA, se podfa suponer que existen al menos dos sitios de escision de la diana, pero este no era el caso. Esto sugiere que los ARN de Q21 nt pueden estar presentes en forma de doble hebra en el complejo de endonucleasa pero que solo una de las hebras se puede usar para el reconocimiento y la escision de ARN diana. El uso de solo una de las hebras de □21 nt para la escision de la diana puede estar determinado simplemente por la orientacion en la que el duplex de □21 nt se une al complejo de nucleasa. Esta orientacion esta definida por la direccion en la que se procesaba el ARNds original.
Los aglomerados Q21 meros para los ARNds de 52 pb y 111 pb estan peor definidos en comparacion con el ARNds de 39 pb. Los aglomerados se extienden sobre regiones de 25 a 30 nt que representan lo mas probablemente varias subpoblaciones distintas de duplex de Q21 nt y por lo tanto que grnan la escision de la diana en varios sitios proximos. Estas regiones de escision todavfa estan separadas predominantemente por intervalos de 20 a 23 nt. Las reglas que determinan como se puede procesar ARNds regular hasta fragmentos de Q21 nt no se entienden todavfa, pero previamente se observo que el espacio de aprox. 21-23 nt de los sitios de escision se podfa alterar por una marcha de uridinas (Zamore y cols., 2000). La especificidad de la escision de ARNds por RNasa III de E. coli parece estar principalmente controlada por antideterminantes, es decir, excluyendo algunos pares de bases espedficos en posiciones dadas con relacion al sitio de escision (Zhang y Nicholson, 1997).
Para probar si estaba presente una modificacion con azucar, base caperuza en fragmentos de ARN de Q21 nt procesados, se incubo Pp-luc ARNds de 505 pb radiomarcado en lisado durante 1 h, se aislaron los productos de □21 nt, y se digirio con nucleasa P1 o T2 hasta mononucleotidos. A continuacion, la mezcla de nucleotidos se analizo mediante cromatograffa en capa fina bidimensional (Figura 4B). Ninguno de los cuatro ribonucleotidos naturales se modificaban segun se indica por la digestion de P1 o T2. Previamente, se ha analizado la conversion de adenosina en inosina en los fragmentos de Q21 nt (despues de un penodo de incubacion de 2 h) y se ha detectado un pequeno grado (<0,7%) de desaminacion (Zamore y cols., 2000); la incubacion mas corta en lisado (1 h) reduda la fraccion de inosina hasta niveles diffcilmente detectables. La RNasa T2, que escinde 3' del enlace fosfodiester, produda 3'-fosfato de nucleosido y 3',5'-difosfato de nucleosido, indicando de ese modo la presencia de un monofosfato 5'-terminal. Se detectaron los cuatro 3',5'-difosfatos de nucleosido y sugieren que el enlace internucleotfdico se escindfa con poca o ninguna especificidad para una secuencia. En resumen, los fragmentos de □21 nt no estan modificados y se generaron a partir de ARNds de modo que estuvieran presentes 5'-monofosfatos y 3'-hidroxilos en el extremo 5'.
1.2.4 ARN de 21 y 22 nt sinteticos median en la escision de ARN diana
El analisis de los productos de procesamiento de ARNds indicaba que los fragmentos de Q21 nt se generan mediante una reaccion con todas las caractensticas de una reaccion de escision con RNasa III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982). La RNasa III hace dos cortes escalonados en ambas hebras del ARNds, dejando un saliente 3' de aproximadamente 2 nt. Se sintetizaron qmmicamente RNA de 21 y 22 nt, identicos en secuencia a algunos de los fragmentos de Q21 nt clonados, y los probaron con respecto a su capacidad para mediar en la degradacion de ARN diana (Figuras 5A y 5B). Los duplex de ARN de 21 y 22 nt se incubaron a concentraciones de 100 nM en el lisado, a concentraciones 10 veces superiores que el ARNds de control de 52 pb. Bajo estas condiciones, la escision de ARN diana es facilmente detectable. Reducir la concentracion de duplex de 21 y 22 nt desde 100 hasta 10 nM todavfa provoca la escision de ARN diana. Sin embargo, incrementar la concentracion del duplex desde 100 nM hasta 1.000 nM no incrementaba adicionalmente la escision de la diana, probablemente debido a un factor protemico limitante dentro del lisado.
En contraste con ARNds de 29 o 30 pb que no mediaban en la iARN, los ARNds de 21 y 22 nt con extremos 3' salientes de 2 a 4 nt mediaban en la degradacion eficaz de ARN diana (duplex 1, 3, 4, 6, Figuras 5A y 5B). Los ARNds de 21 o 22 nt de extremos romos (duplex 2, 5 y 7, Figuras 5A y 5B) se redudan en su capacidad para degradar la diana e indican que los extremos 3' salientes son cnticos para la reconstitucion del complejo de ARN- protema nucleasa. Los salientes de una sola hebra se pueden requerir para la union de alta afinidad del duplex de □
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21 nt a los componentes protemicos. Un fosfato 5' terminal, aunque presente despues del procesamiento de ARNds, no se requena para mediar en la escision de ARN diana y estaba ausente de los ARN sinteticos cortos.
Los duplex de 21 y 22 nt sinteticos guiaban la escision de dianas de sentido asf como antisentido dentro de la region cubierta por el duplex corto. Este es un resultado importante considerando que un ARNds de 39 pb, que forma dos pares de agregados de fragmentos de D21 nt (Fig. 2), escinde la diana de sentido o antisentido solamente una vez y no dos veces. Se interpreta este resultado al sugerir que solo una de las dos hebras presentes en el duplex de D21 nt es capaz de guiar la escision del ARN diana y que la orientacion del duplex de D21 nt en el complejo de nucleasa esta determinada por la direccion inicial del procesamiento de ARNds. Sin embargo, la presentacion de un duplex de □21 nt ya perfectamente procesado al sistema in vitro no permite la formacion del complejo de nucleasa espedfico para una secuencia activo con dos posibles orientaciones del duplex de ARN simetrico. Esto da como resultado la escision de la diana de sentido asf como antisentido dentro de la region de identidad con el duplex de ARN de 21 nt.
El sitio de escision de la diana esta situado 11 o 12 nt aguas abajo del primer nucleotido que es complementario a la secuencia de grna de 21 o 22, es decir el sitio de escision esta cerca del centro de la region cubierta por los ARN de 21 o 22 nt (Figuras 4A y 4B). Desplazar la hebra de sentido de un duplex de 22 nt en dos nucleotidos (comparense los duplex 1 y 3 en la Figura 5A) desplazaba es sitio de escision solo de la diana antisentido en dos nucleotidos. Desplazar la hebra tanto de sentido como antisentido en dos nucleotidos cambiaba ambos sitios de escision en dos nucleotidos (comparense los duplex 1 y 4). Se predijo que era posible disenar un par de ARN de 21 o 22 nt para escindir un ARN diana casi en cualquier posicion dada.
La especificidad de la escision de ARN diana guiada por ARN de 21 y 22 nt parecer exquisita en cuanto a que no se detectan sitios de escision aberrantes (Figura 5B). Sin embargo, se debe apuntar que los nucleotidos presentes en el saliente 3' del duplex de ARN de 21 y 22 nt puede contribuir menos al reconocimiento del sustrato que los nucleotidos cercanos al sitio de escision. Esto se basa en la observacion de que el nucleotido mas 3' en el saliente 3' de los duplex activos 1 o 3 (Figura 5A) no es complementario a la diana. Un analisis detallado de la especificidad de iARN se puede efectuar facilmente ahora usando ARN de 21 y 22 nt simetricos.
Basandose en la evidencia de que los ARN de 21 y 22 nt sinteticos con extremos 3' salientes median en la interferencia de ARN, se propuso llamar a los ARN de D21 nt "ARN interferentes cortos" o ARNsi y al complejo ARN- protema respectivo una "partfcula ribonucleoprotemica interferente pequena" o siRNP.
1.2.5 Los salientes 3' de 20 nt en ARNds cortos inhiben iARN
Se ha observado que los ARNds cortos de extremos romos parecen ser procesados desde los extremos del ARNds. Durante el presente estudio de la dependencia con la longitud de ARNds en iARN, tambien se han analizado ARNds con extremos 3' salientes de 17 a 20 nt y se encontro con sorpresa que eran menos potentes que ARNds de extremos romos. El efecto inhibidor de extremos 3' largos era particularmente pronunciado para ARNds hasta 100 pb pero era menos drastico para ARNds mas largos. El efecto no se debfa a la formacion de ARNds imperfecto basandose en el analisis en gel natural (datos no mostrados). Se probo si el efecto inhibidor de extremos 3' salientes largos se podfa usar como una herramienta para dirigir el procesamiento de ARNds solamente hacia uno de los dos extremos de un duplex de ARN corto.
Se sintetizaron cuatro combinaciones del ARNds modelico de 52 pb, formacion de extremos romos, extension 3' solo en la hebra de sentido, extension 3' solo en la hebra antisentido y extension 3' doble en ambas hebras, y cartograffa de los sitios de escision de ARN diana despues de la incubacion en lisado (Figuras 6A y 6B). El sitio de escision primero y predominante de la diana de sentido no se perdfa cuando se extendfa el extremo 3' de la hebra antisentido del duplex, y viceversa, el sitio de escision fuerte de la hebra antisentido no se perdfa cuando se extendfa el extremo 3' de la hebra de sentido del duplex. Las extensiones 3' en ambas hebras hadan al ARNds de 52 pb virtualmente inactivo. Una explicacion de la inactivacion de ARNds por extensiones 3' de -20 nt podna ser la asociacion de protemas que se unen a ARN de una sola hebra que podna interferir con la asociacion de uno de los factores de procesamiento de ARNds en este extremo. Este resultado tambien es coherente con el presente modelo en que solo una de las hebras del duplex de ARNsi en el siRNP ensamblado es capaz de guiar la escision de ARN diana. La orientacion de la hebra que grna la escision de ARN esta definida por la direccion de la reaccion de procesamiento de ARNds. Es probable que la presencia de extremos escalonados 3' pueda facilitar el ensamblaje del complejo de procesamiento. Un bloque en el extremo 3' de la hebra de sentido solo permitira el procesamiento de ARNds desde el extremo 3' opuesto de la hebra antisentido. Esto genera a su vez complejos de siRNP en los que solo la hebra antisentido del duplex de ARNsi es capaz de guiar la escision de ARN diana de sentido. Lo mismo es cierto para la situacion inversa.
El efecto inhibidor menos pronunciado de las extensiones 3' largas en el caso de ARNds mas largos (>500 pb, datos no mostrados) sugiere que los ARNds largos tambien pueden contener senales de procesamiento de ARNds internas o se pueden procesar cooperativamente debido a la asociacion de multiples factores de escision.
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1.2.6 Un modelo para la escision de ARNm dirigida por ARNds
Los nuevos datos bioqmmicos actualizan el modelo para como el ARNds elige como diana ARNm para la destruccion (Figura 7). El ARN de doble hebra se procesa en primer lugar para acortar duplex de ARN predominantemente de 21 y 22 nt de longitud y con extremos 3' escalonados de forma similar a una reaccion similar a RNasa III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1982). Basandose en la longitud de 21-23 nt de los fragmentos de ARN procesados, se ha especulado que una actividad similar a RNasa III puede estar implicada en iARN (Bass, 2000). Esta hipotesis es apoyada ademas por la presencia de fosfatos 5' e hidroxilos 3' en los extremos de los ARNsi segun se observa en productos de reaccion de RNasa III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999). Se ha observado que la RNasa III bacteriana y los homologos eucarioticos Rnt1p en S. cerevisiae y Pac1p en S. pombe funcionan en el procesamiento de ARN ribosomico asf como ARNsn y ARNsno (vease, por ejemplo, Chanfreau y cols., 2000).
Poco se sabe acerca de la bioqmmica de homologos de RNasa III de plantas, animales o seres humanos. Se han identificado dos familias de enzimas RNasa III predominantemente por analisis de secuencias guiados por bases de datos o clonacion de ADNc. La primera familia de RNasa III esta representada por la protema de D. melanogaster de 1.327 aminoacidos de largo drosha (Reg. AF116572). El extremo C esta compuesto por dos RNasa III y un dominio de union a ARNds y el extremo N es de funcion desconocida. Tambien se encuentran homologos cercanos en C. elegans (Reg. AF160248) y ser humano (Reg. AF189011) (Filippov y cols., 2000; Wu y cols., 2000). La RNasa III humana similar a drosha se clono y caracterizo recientemente (Wu y cols., 2000). El gen se expresa ubicuamente en tejidos humanos y lmeas celulares, y la protema se localiza en el nucleo y el nucleolo de la celula. Basandose en resultados inferiros de estudios de inhibicion antisentido, se sugirio un papel de esta protema para el procesamiento de rRNA. La segunda clase esta representada por el gen de C. elegans K12H4.8 (Reg. S44849) que codifica una protema de 1.822 aminoacidos de largo. Esta protema tiene un motivo de ARN helicasa N-terminal que esta seguido por 2 dominios catalfticos de 2 RNasa III y un motivo que se une a ARNds, similar a la familia de RNasa III drosha. Hay homologos cercanos en S. pombe (Reg. Q09884), A. thaliana (Reg. AF187317), D. melanogaster (Reg. AE003740) y ser humano (Reg. aB028449) (Filippov y cols., 2000; Jacobsen y cols., 1999; Matsuda y cols., 2000). Posiblemente, la RNasa III/helicasa K12H4.8 es el candidato probable para estar implicado en la iARN.
Los cribados geneticos en C. elegans identificaron rde-1 y rde-4 como esenciales para la activacion de iARN sin un efecto sobre la movilizacion o cosupresion de transposones (Dernburg y cols., 2000; Grishok y cols., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Tabara y cols., 1999). Esto condujo a la hipotesis de que estos genes son importantes para el procesamiento de ARNds pero no estan implicados en la degradacion de la diana de ARNm. La funcion de ambos genes es todavfa desconocida, el producto genico rde-1 es un miembro de una familia de protemas similares a la protema de conejo eIF2C (Tabara y cols., 1999), y la secuencia de rde-4 no se ha descrito todavfa. La caracterizacion bioqmmica futura de estas protemas debe revelar su funcion molecular.
El procesamiento hasta los duplex de ARNsi parece comenzar desde los extremos de ARNds de extremos romos o ARNds con salientes 3' cortos (1-5 nt), y avanza en etapas de aproximadamente 21-23 nt. Los extremos escalonados 3' largos (-20 nt) en ARNds cortos suprimen la iARN, posiblemente a traves de la interaccion con protemas de union a ARN de una sola hebra. La supresion de iARN por regiones de una sola hebra que flanquean ARNds corto y la falta de formacion de ARNsi a partir de ARNds cortos de 30 pb pueden explicar por que las regiones estructuradas encontradas frecuentemente en ARNm no conducen a la activacion de iARN.
Sin querer limitarse por una teona, se supone que las protemas de procesamiento de ARNds o un subgrupo de estas permanecen asociadas con el duplex de ARNsi despues de la reaccion de procesamiento. La orientacion del duplex de ARNsi con relacion a estas protemas determina cual de las dos hebras complementarias funciona en el guiado de la degradacion del ARN diana. Los duplex de ARNsi qmmicamente sintetizados gman la escision del ARN de sentido asf como antisentido ya que son capaces de asociarse con los componentes protemicos en cualquiera de las dos orientacion posible.
El hallazgo notable de que los duplex de ARNsi de 21 y 22 nt sinteticos se pueden usar para la degradacion eficaz de ARNm proporciona nuevas herramientas para la regulacion espedfica para una secuencia de la expresion genica en estudios de genomica funcional asf como bioqmmicos. Los ARNsi pueden ser eficaces en sistemas mairnferos en los que no se pueden usar ARNds largos debido a la activacion de la respuesta de PKR (Clemens, 1997). Como tales, los duplex de ARNsi representan una nueva alternativa a la terapeutica de antisentido o ribozimas.
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Ejemplo 2
Interferencia de ARN en cultivos tisulares humanos
2.1 Metodos
2.1.1 Preparacion de ARN
Se sintetizaron qmmicamente ARN de 21 nt usando fosforamiditas de ARN Expedite y fosforamidita de timidina (Proligo, Alemania). Los oligonucleotidos sinteticos se desprotegieron y se purificaron en gel (Ejemplo 1), seguido por purificacion en un cartucho Sep-Pak C18 (Waters, Milford, MA, EE. Uu. de A.) (Tuschl, 1993). Las secuencias de ARNsi que eligen como diana gL2 (Reg. X65324) y luciferasa GL3 (Reg. U47296) correspondfan a las regiones codificantes 153-173 con relacion al primer nucleotido del codon de inicio. Los ARNsi que eligen como diana RL (Reg. AF025846) correspondfan a la region 119-129 despues del codon de inicio. Los ARN mas largos se transcribieron con ARN polimerasa a partir de productos de PCR, seguido por purificacion en Sep-Pak. Los ARNds de GL2 o GL3 de 49 y 484 pb correspondfan a la posicion 113-161 y 113-596, respectivamente, con relacion al inicio de la traduccion; los ARNds de 50 y 501 pb correspondfan a la posicion 118-167 y 118-618, respectivamente. Las plantillas de PCR para la smtesis de ARNds que elige como diana GFP humanizada (hG) se amplificaron a partir de pAD3 (Kehlenbach, 1998), con lo que el ARNds de hG de 50 y 501 pb correspondfan a la posicion 118-167 y 118618, respectivamente, con respecto al codon de inicio.
Para la renaturalizacion de ARNsi, 20 pM de hebras simples se incubaron en tampon de renaturalizacion (100 mM de acetato potasico, 30 mM de HEPES-KOH a pH 7,4, 2 mM de acetato magnesico) durante 1 min a 90°C seguido por 1 h a 37°C. La etapa de incubacion a 37°C se prolongo durante la noche para los ARNds de 50 y 500 pb y estas reacciones de renaturalizacion se realizaron a concentraciones de hebra de 8,4 pM y 0,84 pM, respectivamente.
2.1.2 Cultivo celular
Se propagaron celulas S2 en medio de Drosophila de Schneider (Life Technologies) complementado con 10% de FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 25°C. Se hicieron crecer celulas 293, NIH/3T3, HeLa S3, COS-7 a 37°C en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con 10% de FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Las celulas se sometieron a pases regularmente para mantener el crecimiento exponencial. 24 h antes de la transfeccion a aprox. 80% de confluencia, las celulas de mairnfero se tripsinizaron y se diluyeron 1:5 con medio reciente sin antibioticos (1-3 x 105 celulas/ml) y se transfirieron a placas de 24 pocillos (500 pl/pocillo). Las celulas S2 no se tripsinizaron antes de la separacion. La transfeccion se llevo a cabo con reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies) segun se describe por el fabricante para lmeas celulares adherentes. Por pocillo, se aplicaron 1,0 pg de pGL2-Control (Promega) o pGL3-Control (Promega), 0,1 pg de pRL-TK (Promega) y 0,28 pg de duplex de ARNsi o ARNds, formulados en liposomas; el volumen final era 600 pl por pocillo. Las celulas se incubaron 20 h despues de la transfeccion y paredan sanas posteriormente. La expresion de luciferasa se verifico posteriormente con el ensayo de luciferasa doble (Promega). Las eficacias de transfeccion se determinaron mediante microscopfa de fluorescencia para lmeas celulares de mai^ero despues de la cotransfeccion de 1,1 pg de pAD3 que codifica hGFP y 0,28 pg de ARNsi de invGL2 inGL2 y eran 70-90%. Los plasmidos indicadores se amplificaron en XL-1 Blue (Stratagene) y se purificaron usando el Qiagen EndoFree Maxi Plasmid Kit.
2.2 Resultados y analisis
Para probar si los ARNsi tambien son capaces de mediar en iARN en cultivo tisular, se sintetizaron duplex de ARNsi de 21 nt con salientes 3' de 2 nt simetricos dirigidos contra genes indicadores que codifican luciferasa de pensamiento de mar (Renilla reniformis) y dos variantes de secuencia de luciferasas de luciernaga (Photinus pyralis, GL2 y GL3) (Fig. 8a, b). Los duplex de ARNsi se cotransfectaron con las combinaciones de plasmidos indicadores pGL2/pRL o pGL3/pRL en celulas S2 de Schneider de D. melanogaster o celulas de mamffero usando liposomas cationicos. Las actividades de luciferasa se determinaron 20 h despues de la transfeccion. En todas las lmeas celulares probadas, se observo una reduccion espedfica de la expresion de los genes indicadores en presencia de duplex de ARNsi cognados (Fig. 9a-j). Notablemente, los niveles absolutos de expresion de luciferasa no se vefan afectados por ARNsi no cognados, indicando la ausencia de efectos secundarios por duplex de ARN de 21 nt (p. ej. Fig. 10a-d para celulas HeLa). En celulas S2 de D. melanogaster (Fig. 9a, b), la inhibicion espedfica de luciferasas era completa. En celulas de marnffero, en las que los genes indicadores se expresaban de 50 a 100 veces mas fuertemente, la supresion espedfica era menos completa (Fig. 9c-j). La expresion de GL2 se reduda de 3 a 12 veces, la expresion de GL3 de 9 a 25 veces y la expresion de Rl de 1 a 3 veces, en respuesta a los ARNsi cognados. Para celulas 293, la eleccion como diana de luciferasa RL por ARNsi de RL era ineficaz, aunque las dianas GL2 y GL3 respondfan espedficamente (Fig. 9i, j). La falta de reduccion de expresion de RL en celulas 293 se puede deber a su expresion de 5 a 20 veces superior en comparacion con cualquier otra lmea celular de
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mairnfero probada y/o a la accesibilidad limitada de la secuencia diana debido a la estructura secundaria del ARN o las protemas asociadas. No obstante, la eleccion como diana espedfica de luciferasa GL2 y GL3 por los duplex de ARNsi cognados indicaba que la iARN tambien esta funcionando en celulas 293.
El saliente 3' de 2 nt en todos los duplex de ARNsi, excepto para uGL2, estaba compuesto por (2'-desoxi)timidina. La sustitucion de uridina por timidina en el saliente 3' era bien tolerada en el sistema in vitro de D. melanogaster y la secuencia del saliente no era cntica para el reconocimiento de la diana. Se eligio el saliente de timidina, debido a que se supone que potencia la resistencia a nucleasa de los ARNsi en el medio de cultivo celular y dentro de celulas transfectadas. En efecto, el ARNsi de GL2 modificado con timidina era ligeramente mas potente que el ARNsi de uGL2 no modificado en todas las lmeas celulares probadas (Fig. 9a, c, e, g, i). Es concebible que modificaciones adicionales de los nucleotidos salientes 3' puedan proporcionar beneficios adicionales al aporte y la estabilidad de duplex de ARNsi.
En experimentos de cotransfeccion, se usaron 25 nM de duplex de ARNsi con respecto al volumen final de medio de cultivo tisular (Fig. 9, 10). Incrementar la concentracion de ARNsi hasta 100 nM no potenciaba los efectos de desactivacion espedficos, pero empezaba a afectar a las eficacias de transfeccion debido a una competicion por la encapsulacion liposomica entre ADN plasmfdico y ARNsi (datos no mostrados). Disminuir la concentracion de ARNsi hasta 1,5 nM no reduda el efecto de desactivacion espedfico (datos no mostrados), aunque los ARNsi solo estuvieran ahora de 2 a 20 veces mas concentrados de los plasmidos de ADN. Esto indica que los ARNsi son reactivos extraordinariamente potentes para mediar en la desactivacion genica y que los ARNsi son eficaces a concentraciones que son varios ordenes de magnitud menores que las concentraciones aplicadas en experimentos de eleccion como diana de genes antisentido o de ribozimas convencionales.
A fin de verificar el efecto de ARNds mas largos sobre celulas de mamffero, se prepararon ARNds de 50 y 500 pb cognados a los genes indicadores. Como control no espedfico, se usaron ARNds procedentes de GFP humanizada (hG) (Kehlenbach, 1998). Cuando los ARNds se cotransfectaban, en cantidades identicas (no concentraciones) a los duplex de ARNsi, la expresion del gen indicador se reduda fuertemente e inespedficamente. Este efecto se ilustra para celulas HeLa como un ejemplo representativo (Fig. 10a-d). Las actividades absolutas de luciferasa se disminuyeron inespedficamente de 10 a 20 veces mediante la cotransfeccion de ARNds de 50 pb y de 20 a 200 veces por ARNds de 500 pb, respectivamente. Se observaron efectos inespedficos similares para celulas COS-7 y NIH/3T3. Para celulas 293, se observo una reduccion inespedfica de 10 a 20 veces solamente para ARNds de 500 pb. La reduccion inespedfica en la expresion del gen indicador por ARNds > 30 pb se esperaba como parte de la respuesta a interferones.
Sorprendentemente, a pesar de la fuerte disminucion inespedfica en la expresion del gen indicador, se detecto reproduciblemente una desactivacion adicional mediada por ARNds espedfica para una secuencia. Sin embargo, los efectos espedficos de la desactivacion solo eran evidentes cuando las actividades relativas del gen indicador se normalizaban hasta los controles de ARNds de hG (Fig. 10e, f). Ademas, se observo una reduccion espedfica de 2 a 10 veces en respuesta a ARNds cognado, en las otras tres lmeas celulares de mamffero probadas (datos no mostrados). Se presentaron previamente efectos de desactivacion espedficos con ARNds (356-1662 pb) en celulas CHO-K1, pero las cantidades de ARNds requeridas para detectar una reduccion espedfica de 2 a 4 veces eran aproximadamente 20 veces superiores que en los presentes experimentos (Ui-Tei, 2000). Ademas, las celulas CHO- K1 paredan ser deficientes en la respuesta a interferones. En otro informe, se probaron celulas 293, NIH/3T3 y BHK-21 con respecto a iARN usando combinaciones de luciferasa/indicador lacZ y ARNds de LacZ de 829 pb o de GFP inespedfico de 717 pb (Caplen, 2000). El fallo para detectar iARN en este caso se puede deber al ensayo menos sensible de luciferasa/indicador lacZ y las diferencias de longitud de ARNds diana y de control. Tomados conjuntamente, los presente resultados indican que la iARN es activa en celulas de mam^era, pero que el efecto de desactivacion es diffcil de detectar, si el sistema de interferones es activado por ARNds > 30 bp.
En resumen, se ha demostrado por primera vez la desactivacion genica mediada por ARNsi en celulas de mamffero. El uso de ARNsi cortos es muy prometedor para la inactivacion de la funcion genica en el cultivo tisular humano y el desarrollo de una terapeutica espedfica de un gen.
Ejemplo 3
Inhibicion espedfica de la expresion genica mediante interferencia de ARN
3.1 Materiales y metodos
3.1.1 Preparacion de ARN y ensayo de iARN
Los ensayos de smtesis qmmica de ARN, renaturalizacion e iARN basado en luciferasa se realizaron como se describe en los Ejemplos 1 o 2 o en publicaciones previas (Tuschl y cols., 1999; Zamore y cols., 2000). Todos los duplex de ARNsi se dirigieron contra luciferasa de luciernaga, y la secuencia de ARN de luciferasa se derivo de
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pGEM-luc (reg. GenBank. X65316) segun se describe (Tuschl y cols., 1999). Los duplex de ARNsi se incubaron en reaccion de iARN/traduccion de D. melanogaster durante 15 min antes de la adicion de ARNm. Los ensayos de iARN basados en traduccion se realizaron al menos por triplicado.
Para la cartograffa de la escision de ARN diana de sentido, se genero un transcrito de 177 nt, correspondiente a la secuencia de luciferasa de luciernaga entre las posiciones 113-273 con relacion al codon de inicio, seguido por el complemento de 17 nt de la secuencia promotora de SP6. Para la cartograffa de la escision de ARN antisentido, se produjo un transcrito de 166 nt a partir de una plantilla, que se amplifico a partir de la secuencia plasirffdica mediante PCR usando el cebador 5' TAATACGACTCACTA-TAGAGCCCATATCGTTTCATA (promotor de T7 subrayado) y el cebador 3' AGAGGATGGAACCGCTGG. La secuencia diana corresponde al complemento de la secuencia de luciferasa de luciernaga entre las posiciones 50-215 con relacion al codon de inicio. Se realizo un marcaje con guanilil transferasa segun se describe previamente (Zamore y cols., 2000). Para la cartograffa de la escision de ARN diana, se incubaron 100 nM de duplex de ARNsi con de 5 a 10 nM de ARN diana en lisado de embriones de D. melanogaster bajo condiciones estandar (Zamore y cols., 2000) durante 2 h a 25°C. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 8 volumenes de tampon de proteinasa K (200 mM de Tris-HCl pH 7,5, 25 mM de EDTA, 300 mM de NaCl, 2% p/v de dodecilsulfato sodico). Se anadio proteinasa (E.M. Merck, disuelta en agua) hasta una concentracion final de 0,6 mg/ml. A continuacion, las reacciones se incubaron durante 15 min a 65°C, se extrajeron con fenol/cloroformo/alcohol isoamflico (25:24:1) y se precipitaron con 3 volumenes de etanol. Las muestras se situaron sobre geles de secuenciacion al 6%. Se generaron patrones de longitud con digestion parcial con RNasa T1 e hidrolisis basica parcial de los ARN diana de sentido o antisentido marcados en la caperuza.
3.2 Resultados
3.2.1 Variacion del saliente 3' en duplex de ARNsi de 21 nt
Segun se describe anteriormente, 2 o 3 nucleotidos desapareados en el extremo 3' de los duplex de ARNsi eran mas eficaces en la degradacion del ARN diana que los respectivos duplex de extremos romos. Para realizar un analisis mas exhaustivo de la funcion de los nucleotidos terminales, se sintetizaron cinco ARNsi de 21 nt, cada uno presentado por un nucleotido con relacion al ARN diana, y ochos ARNsi antisentido de 21 nt, cada uno desplazado un nucleotido con relacion a la diana (Figura 11A). Al combinar los ARNsi de sentido y antisentido, se generaron ocho series de duplex de ARNsi con extremos salientes sinteticos que cubnan un intervalo de saliente 3' de 7 nt a saliente 5' de 4 nt. La interferencia de los duplex de ARNsi se midio usando el sistema de ensayo de luciferasa doble (Tuschl y cols., 1999; Zamore y cols., 2000). Los duplex de ARNsi se dirigieron contra ARNm de luciferasa de luciernaga, y se uso ARNm de luciferasa de pensamiento de mar como control interno. La relacion de luminiscencia de la actividad de luciferasa diana a control se determino en presencia de un duplex de ARNsi y se normalizo a la relacion observada en ausencia de ARNds. Para comparacion, las relaciones de interferencia de ARNds largos (de 39 a 504 pb) se muestran en la Figura 11 B. Las relaciones de interferencia se determinaron a concentraciones de 5 nM para ARNds largos (Figura 11A) y a 100 nM para duplex de ARNsi (Figura 11C-J). Se eligieron las concentraciones de 100 nM de ARNsi, debido a que el procesamiento completo de 5 nM de ARNds de 504 pb dana como resultado 120 nM de duplex de ARNsi totales.
La capacidad de duplex de ARNsi de 21 nt para mediar en la iARN depende del numero de nucleotidos salientes o pares de bases formados. Los duplex con de cuatro a seis nucleotidos salientes 3' eran incapaces de mediar en la iARN (Figura 11C-F), ya que eran duplex con dos o mas nucleotidos salientes 5' (Figura 11 G-J). Los duplex con salientes 3' de 2 nt seran los mas eficaces para mediar en la interferencia de ARN, aunque la eficacia de la desactivacion tambien dependfa de la secuencia, y se observaron interferencias de hasta 12 veces para diferentes duplex de ARNsi con salientes 3' de 2 nt (comparese la Figura 11D-H). Los duplex con extremos romos, saliente 5' de 1 nt o salientes 3' de 1 a 3 nt, eran a veces funcionales. El pequeno efecto de desactivacion observado para el duplex de ARNsi con saliente 3' de 7 nt (Figura 11C) se puede deber a un efecto antisentido del saliente 3' largo en vez de deberse a iARN. La comparacion de la eficacia de iARN entre ARNds largos (Fig. 11 B) y los duplex de ARNsi de 21 nt mas eficaces (Fig. 11E, G, H) indica que un solo duplex de ARNsi en una concentracion de 100 nM puede ser tan eficaz con 5 nM de ARNds de 504 pb.
3.2.2 Variacion de longitud del ARNsi de sentido apareado a un ARNsi antisentido de 21 nt invariante
A fin de investigar el efecto de la longitud del ARNsi sobre la iARN, se prepararon 3 series de duplex de ARNsi, combinando tres hebras antisentido de 21 nt con ocho hebras de sentido de 18 a 25 nt. El saliente 3' del ARNsi antisentido se fijo hasta 1, 2 o 3 nt en cada serie de duplex de ARNsi, mientras que el ARNsi de sentido se vario en su extremo 3' (Figura 12A). Independientemente de la longitud del ARNsi de sentido, se encontro que los duplex con saliente 3' de 2 nt de ARNsi antisentido (Figura 12C) eran mas activos que aquellos con saliente 3' de 1 o 3 nt (Figura 12B, D). En la primera serie, con un saliente 3' de 1 nt de ARNsi antisentido, los duplex con ARNsi de sentido de 21 y 22 nt, que soportaban un saliente 3' de 1 y 2 nt de ARNsi de sentido, respectivamente, eran los mas activos. Los duplex con ARNsi de sentido de 19 a 25 nt tambien eran capaces de mediar en el ARN, pero hasta un grado menor. De forma similar, en la segunda serie, con un saliente de 2 nt del ARNsi antisentido, el duplex de
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ARNsi de 21 nt con saliente 3' de 2 nt era el mas activo, y cualquier combinacion con los ARNsi de sentido de 18 a 25 nt era activa hasta un grado significativo. En la ultima serie, con saliente 3' de ARNsi de 3 nt, solamente el duplex con un ARNsi de sentido de 20 nt y el saliente 3' de sentido de 2 nt era capaz de reducir la expresion del ARN diana. Conjuntamente, estos resultados indican que la longitud del ARNsi asf como la longitud del saliente 3' son importantes, y que los duplex de ARNsi de 21 nt con saliente 3' de 2 nt son optimos para la iARN.
3.2.3 Variacion de la longitud de duplex de ARNsi con un saliente 3' de 2 nt constante
A continuacion, se examino el efecto de cambiar simultaneamente la longitud de ambas hebras de ARNsi al mantener salientes 3' de 2 nt simetricos (Figura 13A). Se prepararon dos series de duplex de ARNsi incluyendo el duplex de ARNsi de 21 nt de la Figura 11 H como referencia. La longitud de los duplex se vario entre 20 y 25 pb al extender el segmento de bases apareadas en el extremo 3' del ARNsi de sentido (Figura 13B) o en el extremo 3' del ARNsi antisentido (Figura 13C). Los duplex de 20 a 23 pb provocaban una represion espedfica de la actividad de luciferasa diana, pero el duplex de ARNsi de 21 nt era al menos 8 veces mas eficaz que cualquiera de los otros duplex. Los duplex de ARNsi de 24 y 25 nt no daban como resultado una interferencia detectable. Los efectos espedficos para una secuencia eran menores ya que las variaciones en ambos extremos del duplex produdan efectos similares.
3.2.4 Duplex de ARNsi modificados con 2'-desoxi y 2'-O-metilo
Para determinar la importancia de los residuos de ribosa de ARNsi para la iARN, se examinaron duplex con ARNsi de 21 nt y salientes 3' de 2 nt con hebras modificadas con 2'-desoxi o 2'-O-metilo (Figura 14). La sustitucion de los salientes 3' de 2 nt por 2-desoxinucleotidos no tema efecto, e incluso reemplazar dos ribonucleotidos adicionales adyacentes a los salientes en la region apareada produda ARNsi significativamente activos. Asf, 8 de 42 nt de un duplex de ARNsi se reemplazaban por residuos de ADN sin perdida de actividad. Sin embargo, la sustitucion completa de una o ambas hebras de ARNsi por residuos 2'-desoxi supriirna la iARN, como lo hada la sustitucion por residuos 2'-O-metilo.
3.2.5 Definicion de sitios de escision del ARN diana
Las posiciones de escision del ARN diana se determinaron previamente para duplex de ARNsi de 22 nt y para un duplex de 21 nt/22 nt. Se encontro que la posicion de la escision del ARN diana estaba situada en el centro de la region cubierta por el duplex de ARNsi, 11 o 12 nt aguas abajo del primer nucleotido que era complementario a la secuencia de grna de ARNsi de 21 o 22 nt. Cinco duplex de ARNsi de 21 nt distintos con saliente 3' de 2 nt (Figura 15A) se incubaron con ARN diana de sentido o antisentido marcado en la caperuza 5' en lisado de D. melanogaster (Tuschl y cols., 1999; Zamore y cols., 2000). Los productos de escision 5' se resolvieron sobre geles de secuenciacion (Figura 15B). La cantidad de ARN diana de sentido escindido se correlaciona con la eficacia de los duplex de ARNsi determinada en el ensayo basado en traduccion, y los duplex de ARNsi 1, 2 y 4 (Figura 15B y 11 H, G, E) escinden el ARN diana mas rapidamente que los duplex 3 y 5 (Figura 15B y 11 F, D). Notablemente, la suma de radiactividad del producto de escision 5' y el ARN diana de entrada no era constante a lo largo del tiempo, y los productos de escision 5' no se acumulaban. Presumiblemente, los productos de escision, una vez liberados del complejo ARNsi-endonucleasa, son rapidamente degradados debido a la falta de cualquier cola de poli(A) de la caperuza 5'.
Los sitios de escision para ambos ARN de sentido y antisentido se situaron en el medio de la region abarcada por los duplex de ARNsi. Los sitios de escision para cada diana producidos por los 5 duplex diferentes variaban en 1 nt segun el desplazamiento de 1 nt de los duplex a lo largo de las secuencias diana. Las dianas se escindieron precisamente 11 nt aguas debajo de la posicion diana complementaria al nucleotido mas 3' del ARNsi de grna complementario a la secuencia (Figura 15A, B).
A fin de determinar si el extremo 5' o el 3' del ARNsi de grna establece la regla para la escision de ARN diana, se ideo la estrategia experimental esbozada en la Figura 16A y B. Un ARNsi antisentido de 21 nt, que se mantuvo invariante para este estudio, se apareo con ARNsi de sentido que estaban modificados en cualquiera de sus extremos 5' o 3'. La posicion de la escision del ARN diana antisentido se determino como se describe anteriormente. Los cambios en el extremo 3' del ARNsi de sentido, verificados para el saliente 5' de 1 nt hasta el saliente 3' de 6 nt, no afectaban a la posicion de escision del ARN diana de sentido ni antisentido (Figura 16C). Los cambios en el extremo 5' del ARNsi de sentido no afectaban a la escision del ARN diana de sentido (Figura 16D, panel superior), lo que se esperaba debido a que el ARNsi antisentido estaba inalterado. Sin embargo, la escision del aRn diana antisentido se vefa afectada y era fuertemente dependiente del extremo 5' del ARNsi de sentido (Figura 16D, panel inferior). La diana antisentido solo se escindfa cuando el ARNsi de sentido tema un tamano de 20 o 21 nt, y la posicion de escision diferente en 1 nt, sugiriendo que el extremo 5' de ARNsi que reconoce la diana establece la regla para la escision de ARN. La posicion esta situada entre el nucleotido 10 y 11 cuando se cuenta en direccion aguas arriba desde el nucleotido diana apareado al nucleotido mas 5' del ARNsi de grna (vease ademas la Figura 15A).
3.2.6 Efectos en la secuencia y sustituciones 2'-desoxi en el saliente 3'
Se prefiere un saliente 3' de 2 nt para la funcion del ARNsi. Se deseaba saber si la secuencia de los nucleotidos salientes contribuye al reconocimiento de la diana o si solo es una caractenstica requerida para la reconstitucion del complejo de endonucleasa (RISC o siRNP). Se sintetizaron ARNsi de sentido y antisentido con salientes 3' de AA, 5 CC, gG, UU y UG e inclrnan las modificaciones 2'-desoxi TdG y TT. Los ARNsi silvestres conteman AA en el saliente 3' de sentido y UG en el saliente 3' antisentido (AA/UG). Todos los duplex de ARNsi eran funcionales en el ensayo de interferencia y redudan la expresion de la diana al menos 5 veces (Figura 17). Los duplex de ARNsi mas eficaces que redudan la expresion de la diana mas de 10 veces eran del tipo de secuencia NN/uG, NN/UU, NN/TdG y NN/TT (N, cualquier nucleotido). Los duplex de ARNsi con un saliente 3' de ARNsi antisentido de AA, CC o GG 10 eran menos activos en un factor de 2 a 4 cuando se comparaban con la secuencia silvestre UG o la UU mutante. Esta reduccion en la eficacia de iARN se debe probablemente a la contribucion del penultimo nucleotido 3' con respecto al reconocimiento de la diana espedfico de una secuencia, ya que el nucleotido 3' terminal se cambiaba de G a U sin efecto.
15 Los cambios en la secuencia del saliente 3' del ARNsi de sentido no revelaban efectos dependientes de la secuencia, lo que se esperaba debido a que el ARNsi de sentido no debe contribuir al reconocimiento del mRNA diana de sentido.
3.2.7 Especificidad de secuencia del reconocimiento de la diana
A fin de examinar la especificidad de secuencia del reconocimiento de la diana, se introdujeron cambios de 20 secuencia en los segmentos apareados de duplex de ARNsi y se determino la eficacia de la desactivacion. Los cambios en la secuencia se introdujeron al invertir segmentos cortos de 3 o 4 nt de longitud o como mutaciones puntuales (Figura 18). Los cambios de secuencia en una hebra de ARNsi se compensaron en la hebra de ARNsi complementaria para evitar perturbar la estructura del duplex de ARNsi con bases apareadas. La secuencia de todos los salientes 3' de 2 nt era TT (T, 2'-desoxitimidina) para reducir los costes de smtesis. El duplex de ARNsi de 25 referencia TT/TT era comparable en iARN al duplex de ARNsi silvestre AA/UG (Figura 17). La capacidad para mediar en la destruccion del ARNm indicador se cuantifico usando el ensayo de luminiscencia basado en la traduccion. Los duplex de ARNsi con segmentos de secuencia invertidos mostraban una capacidad drasticamente reducida para elegir como diana el indicador de luciferasa de luciernaga (Figura 18). Los cambios de secuencia situados entre el extremo 3' y el medio del ARNsi antisentido supriirnan completamente el reconocimiento del ARN 30 diana, pero las mutaciones cerca del extremo 5' del ARNsi antisentido exhiben un pequeno grado de desactivacion. La transversion del par de bases A/U situado directamente opuesto al sitio de escision de ARN diana predicho, o un nucleotido alejado del sitio predicho, prevema la escision de ARN diana, indicando por lo tanto que una mutacion simple dentro del centro de un duplex de ARNsi discriminan entre dianas desemparejadas.
3.3 Analisis
35 Los ARNsi son reactivos valiosos para la inactivacion de la expresion genica, no solo en celulas de insecto, sino tambien en celulas de mairnfero, con un gran potencial de aplicacion terapeutica. Se han analizado sistematicamente los determinantes estructurales de duplex de ARNsi requeridos para promover la degradacion eficaz de ARN diana en lisado de embriones de D. melanogaster, proporcionando asf reglas para el diseno de los duplex de ARNsi mas potentes. Un duplex de ARNsi perfecto es capaz de desactivar la expresion genica con una 40 eficacia comparable a un ARNds de 500 pb, dado que se usan cantidades comparable de ARN total.
3.4 Grna del usuario de ARNsi
Los duplex de ARNsi eficazmente desactivadores estan compuestos preferiblemente por ARNsi antisentido de 21 nt, y se deben seleccionar para formar una doble helice de 19 pb con extremos salientes 3' de 2 nt. Las sustituciones 2'- desoxi de los ribonucleotidos salientes 3' de 2 nt no afectan a la iARN, pero ayudan a reducir los costes de la 45 smtesis de ARN y pueden potenciar la resistencia a ARNsa de los duplex de ARNsi. Sin embargo, las
modificaciones 2'-desoxi o 2'-O-metilo mas intensivas, reducen la capacidad de los ARNsi para mediar en la iARN, probablemente al interferir con la asociacion de protemas para el ensamblaje de ARNsiP.
El reconocimiento de la diana es un proceso muy espedfico de la secuencia, mediado por el ARNsi complementario 50 a la diana. El nucleotido mas 3' del ARNsi grna no contribuye a la especificidad de reconocimiento de la diana, mientras que el penultimo nucleotido del saliente 3' afecta a la escision del ARN diana, y un desemparejamiento reduce la iARN de 2 a 4 veces. El extremo 5' de un ARNsi grna tambien parece mas permisivo para el reconocimiento de ARN diana desemparejado cuando se compara con el extremo 3'. Los nucleotidos en el centro del ARNsi, situados opuestos al sitio de escision del ARN diana, son determinantes de especificidad importantes e 55 incluso cambios de un solo nucleotido reducen la iARN hasta un nivel indetectable. Esto sugiere que los duplex de
ARNsi pueden ser capaces de discriminar alelos mutantes o polimorfos en experimentos de eleccion como diana de genes, lo que se puede convertir en una caractenstica importante para futuros desarrollos terapeuticos.
Se sugiere que los ARNsi de sentido y antisentido, cuando se asocian con los componentes protemicos del complejo 5 de endonucleasa o su complejo de compromiso, representan distintos papeles; la orientacion relativa del duplex de ARNsi en este complejo define que hebra se puede usar para el reconocimiento de la diana. Los duplex de ARNsi sinteticos tienen simetna de diadas con respecto a la estructura de doble helice, pero no con respecto a la secuencia. La asociacion de duplex de ARNsi con las protemas de iARN en el lisado de D. melanogaster conducira a la formacion de dos complejos asimetricos. En estos complejos hipoteticos, el ambiente quiral es distinto para 10 ARNsi de sentido y antisentido, de ah su funcion. La prediccion obviamente no se aplica a secuencias de ARNsi palindromicas, o a protemas de iARN que se podnan asociar como homodfmeros. Para minimizar los efectos de la secuencia, que pueden afectar a la relacion de siRNP que eligen como diana sentido o antisentido, se sugiere el uso de secuencias de ARNsi con secuencias salientes 3' identicas. Se recomendaba ajustar la secuencia del saliente del ARNsi de sentido a la del saliente 3' antisentido, debido a que el ARNsi de sentido no tiene una diana en 15 experimentos de inactivacion tfpicos. La asimetna en la reconstitucion siRNP de escision de sentido y antisentido podna ser (parcialmente) responsable de la variacion en la eficacia de iARN observada para diversos duplex de ARNsi de 21 nt con salientes 3' de 2 nt usado en este estudio (Figura 14).
Alternativamente, la secuencia nucleotfdica en el sitio diana y/o la accesibilidad de la estructura del ARN diana 20 puede ser responsable de la variacion en la eficacia para estos duplex de ARNsi.
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Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Molecula de ARN de doble hebra aislada, en la que cada hebra de ARN tiene una longitud de 19-23 nucleotidos, en donde una hebra tiene un saliente 3' de 1-3 nucleotidos y una hebra es de extremos romos, en donde dicha molecula de ARN es capaz de interferencia de ARN espedfica de una diana.
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  2. 2. La molecula de ARN segun la reivindicacion 1, en la que el saliente 3' esta estabilizado contra la degradacion.
  3. 3. La molecula de ARN segun la reivindicacion 1 o 2, que contiene al menos un analogo nucleotfdico modificado, particularmente seleccionado de ribonucleotidos modificados en el azucar o en el esqueleto.
    10
  4. 4. La molecula de ARN segun la reivindicacion 3, en la que el analogo nucleotfdico es (i) un ribonucleotido modificado en el azucar, en donde el grupo 2'-OH se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es alquilo C1-C6, alquenilo o alquinilo y el halo es F, Cl, Br o I o (ii) un ribonucleotido modificado en el esqueleto que contiene un grupo fosfotioato.
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  5. 5. La molecula de ARN segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos 70 por ciento con una molecula diana de ARNm predeterminada.
  6. 6. Un metodo para preparar una molecula de ARN de doble hebra segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 20 que comprende las etapas:
    (a) sintetizar qmmicamente o enzimaticamente dos hebras de ARN que tienen una longitud de 19-23 nucleotidos, en donde dichas hebras de ARN son capaces de formar una molecula de ARN de doble hebra,
    (b) combinar las hebras de ARN sintetizadas bajo condiciones en las que se forma una molecula de ARN de doble hebra, que es capaz de interferencia de ARN espedfica para una diana.
    25 7. Un metodo in vitro para mediar en la interferencia de ARN espedfica para una diana en una celula, que
    comprende las etapas:
    (a) poner en contacto dicha celula con la molecula de ARN de doble hebra segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 bajo condiciones en las que se pueda producir interferencia de ARN espedfica para una diana y
    (b) mediar en una interferencia de ARN espedfica para una diana efectuada por el ARN de doble hebra hacia 30 un acido nucleico diana que tiene una porcion de secuencia sustancialmente correspondiente al ARN de doble
    hebra.
  7. 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en el que dicho contacto comprende introducir dicha molecula de ARN de doble hebra en una celula diana en la que se puede producir la interferencia de ARN espedfica para una diana, en donde la introduccion comprende preferiblemente un aporte o una inyeccion mediados por portador.
    35
  8. 9. Uso del metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para (i) determinar la funcion de un gen en una celula, o (ii) para modular la funcion de un gen en una celula.
  9. 10. Composicion farmaceutica que contiene como un agente activo al menos una molecula de ARN de doble hebra 40 segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un portador farmaceutico.
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