ES2633471T3

ES2633471T3 - Composiciones de vacuna contra la gripe estables a temperatura de refrigerador

Info

Publication number: ES2633471T3
Application number: ES14157639.7T
Authority: ES
Inventors: George Kemble; George Trager; Richard M Schwartz
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2004-10-06
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2017-09-21
Anticipated expiration: 2025-10-04
Also published as: KR20070083964A; AU2005294528A1; HK1201720A1; CN102302773B; HK1102047A1; KR20120123729A; EP2769735B1; JP2013035861A; CN101060859B; ES2531734T3; EP2769735A1; JP2008515894A; KR101230187B1; CN102302773A; AU2005294528B2; CA2583698A1; WO2006041819A1; EP1796719B1; KR101346989B1; KR101376889B1

Abstract

Una composición de virus de la gripe vivo estable a refrigerador que comprende al menos una cepa del virus de la gripe y comprende además un estabilizante, que consiste en: (a) sacarosa del 2 % al 8 % en peso/volumen (p/v); arginina del 0,75 % al 2 % p/v; glutamato del 0,02 % al 0,15 % p/v e hidrolizado de gelatina del 0,5 % al 2 % y un tampón; o (b) sacarosa del 2 % al 8 % p/v; arginina del 0,75 % al 2 % p/v, hidrolizado de gelatina del 0,5 % al 2 % y un tampón; en la que cada cantidad de cada uno de los componentes del estabilizante es la cantidad final en la composición del virus y la composición de virus exhibe una pérdida de potencia de menos de 1,0 log cuando se almacena durante un periodo de 3 meses a de 4 ºC a 8 ºC.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones de vacuna contra la gripe estables a temperatura de refrigerador Antecedentes de la invencion

Las vacunas contra diversas cepas de gripe que evolucionan son importantes no solamente desde un punto de vista sanitario de una comunidad, sino tambien comercialmente, ya que cada ano numerosos individuos estan infectados con diferentes cepas y tipos de virus de la gripe. Los ninos, los ancianos, aquellos sin un cuidado de la salud adecuado y las personas inmunocomprometidas estan en riesgo especial de muerte por tales infecciones. Componiendo el problema de las infecciones de virus es que las cepas nuevas de virus evolucionan facilmente, por lo tanto se necesita la produccion continua de nuevas vacunas.

Se han producido numerosas vacunas capaces de producir una respuesta inmune protectora especlfica para tales virus de la gripe diferentes durante mas de 50 anos e incluyen, por ejemplo, vacunas de virus entero, vacunas de virus divididos, vacunas de antlgenos de superficie y vacunas de virus vivos atenuados. Sin embargo, mientras que las formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacuna son capaces de producir una respuesta inmune sistemica, las vacunas de virus vivos atenuados tienen la ventaja de ser capaces tambien de estimular la inmunidad mucosa local en el tracto respiratorio. Una vacuna que comprenda un virus atenuado vivo que sea capaz de producirse rapida y economicamente y que tenga la capacidad de facil almacenamiento/transporte es por lo tanto bastante deseable. Incluso mas deseable serla una vacuna tal que tuviera la capacidad de almacenamiento/transporte a temperaturas de refrigerador (por ejemplo, aproximadamente 2-8 °C).

Hasta la fecha, todas las vacunas de la gripe disponibles en el mercado en EE.UU. se han propagado en huevos de gallina embrionados. Aunque el virus de la gripe crece bien en huevos de gallina, la produccion de la vacuna depende de la disponibilidad de tales huevos. Debido a que el suministro de los huevos debe organizarse y las cepas para la produccion de vacunas se seleccionan meses antes de la siguiente estacion de gripe, la flexibilidad de esta aproximacion puede estar limitada y normalmente resulta en retrasos y recortes en la produccion y la distribucion. Por lo tanto, los metodos para aumentar la estabilidad (por ejemplo, a temperaturas de refrigerador) de la vacuna producida son muy deseables ya que pueden prevenir el deterioro del almacen de la vacuna, que de otra manera necesitarla nueva produccion, etc.

Los sistemas para producir virus de la gripe en cultivo celular tambien se han desarrollado en los anos recientes (Vease, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151); por lo tanto, cualquier metodo para aumentar la estabilidad de la composicion de vacuna (por ejemplo, almacenamiento/transporte a temperatura de refrigerador) en estos sistemas son asimismo tambien muy deseables.

Se ha realizado un trabajo considerable en la produccion del virus de la gripe para vacunas por los presentes inventores y los co-trabajadores; vease por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE.UU. n.° 60/375.675 enviada el 26 de abril, 2002, PCT/US03/12728 enviada el 25 de abril, 2003,10/423.828 enviada el 25 de abril, 2003 y PCT/US05/017734 enviada el 20 de mayo, 2005.

La presente invencion proporciona composiciones de vacuna que tienen estabilidad, por ejemplo, a temperaturas de refrigerador (por ejemplo, 4 °C) y metodos para producir la misma. Los aspectos de la presente invencion son aplicables a metodos de produccion de vacunas de huevos de gallina y nuevos cultivos celulares (y tambien sistemas combinados) y comprenden otros numerosos beneficios que seran evidentes tras la revision de lo siguiente.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para fabricar una composicion de virus adaptada al frlo viva estable en el refrigerador como se define por la reivindicacion 1 y las reivindicaciones dependientes de la misma.

La presente invencion proporciona formulaciones de vacuna llquidas que son sustancialmente estables a temperaturas que varlan de 4 °C a 8 °C. Estas y otras formulaciones llquidas, que son realizaciones especlficas de la invencion se hacen referencia en el presente documento, por ejemplo, como “formulaciones de vacuna de la presente invencion”, formulaciones de vacuna estables al refrigerador”, “formulaciones llquidas de la invencion”, “formulaciones de la invencion”, “formulaciones estables a temperatura del refrigerador (RTS, por sus siglas en ingles) de la invencion” o simplemente “composiciones de la invencion” o “composiciones vlricas de la invencion”.

La presente invencion ensena formulaciones de vacuna llquida que son sustancialmente estables a temperaturas que varlan de 4 °C a 8 °C. En una realizacion especlfica de la invencion, las formulaciones de vacuna llquidas de la invencion son sustancialmente estables a temperaturas que varlan de 4 °C a 8 ° o a 4 °C durante un periodo de 3 meses, o 4 meses, o 5 meses, o 6 meses, o 9 meses, o 18 meses, o 24 meses, o 36 meses, o 48 meses, en que

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hay una perdida de potencia aceptable (por ejemplo, perdida de potencia del virus de la gripe), por ejemplo, una perdida de potencia de entre 0,5-1,0 logs, o menos de 0,5 logs, o menos de 1,0 logs de potencia, al final de tal tiempo.

En una realizacion, se proporcionan formulaciones de vacuna estables a refrigerador de la invencion que comprenden los virus de la gripe. Por ejemplo, las formulaciones de la invencion pueden comprender uno o mas de los siguientes: un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frlo, un virus de la gripe sensible a temperatura, un virus de la gripe sensible a temperatura adaptado al frlo, un virus de la gripe A y un virus de la gripe B. En una realizacion, las formulaciones de vacuna llquidas de la invencion comprenden dos cepas del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B.

La presente invencion ensena ademas composiciones inmunogenicas que comprenden formulaciones de la invencion. La presente invencion ensena ademas vacunas (por ejemplo, vacunas de la gripe) que comprenden formulaciones y composiciones inmunogenicas de la invencion.

La presente invencion ensena ademas metodos para producir tales formulaciones de vacuna llquidas. Por ejemplo, en una realizacion especlfica, se proporcionan en el presente documento metodos para producir formulaciones llquidas que comprenden uno o mas virus de la gripe. En una realizacion especlfica, los metodos para producir una formulacion llquida de la invencion incluyen una o mas de las siguientes etapas: 1) introducir una pluralidad de vectores [uno o mas de los que incorpora (o codifica) una porcion de un genoma del virus de la gripe] en una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras es capaz de soportar la replication de un virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) adicion de un estabilizante (por ejemplo, soluciones que contienen glutamato y sacarosa descritas en el presente documento); 5) clarificar la cosecha vlrica (por ejemplo, por filtration de profundidad o de membrana) produciendo de esta manera una cosecha vlrica clarificada; 6) someter la cosecha vlrica a una etapa de centrifugation (por ejemplo, centrifugation zonal continua, centrifugation de flujo continuo); 7) una etapa de filtracion esteril (por ejemplo, uso de un filtro de 0,2 o 0,2-0,5 micrometres (con o sin calentamiento durante la filtracion)); y 8) almacenamiento a -60 grados C.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una formulacion llquida de la invencion incluye una o mas de las siguientes etapas: 1) infection de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) adicion de un estabilizante; 5) clarificar la cosecha vlrica (por ejemplo, por filtracion profunda y/o pasando a traves de uno o mas filtros que varlan de 0,2-0,8 micrometres; o 0,8 o 1,5 micrometres seguido de 0,2 micrometres), produciendo por lo tanto una cosecha vlrica; 6) someter la cosecha vlrica a una etapa de centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal continua, centrifugacion de flujo continuo); 7) una etapa de filtracion esteril (por ejemplo, uso de un filtro de 0,2 o 0,2-0,5 micrometres (con o sin calentamiento durante la filtracion)); y 8) almacenamiento a -60 grados C.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composition de virus de la gripe de la invencion comprende una o mas de las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica por filtracion, produciendo por lo tanto una cosecha vlrica; 5) someter la cosecha vlrica a una etapa de centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal continua, centrifugacion de flujo continuo) ;6) adicion de estabilizantes (por ejemplo, sacarosa al 2-8 %; monoclorhidrato de arginina al 0,75 % - 2 %; opcionalmente acido glutamico al 0,02-0,15 %; e hidrolizado de gelatina al 0,5-2 %) y 6) esterilizar dicha cosecha vlrica clarificada ademas por filtracion.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composicion de virus de la gripe de la invencion comprenden todas las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica por filtracion, produciendo por lo tanto una cosecha vlrica; 5) someter la cosecha vlrica clarificada a centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion de flujo continuo) produciendo de esta manera una cosecha vlrica clarificada adicional; y 6) esterilizar dicha cosecha vlrica clarificada ademas por filtracion.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composicion de virus de la gripe de la invencion comprenden todas las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica por filtracion; 5) someter la cosecha vlrica clarificada a centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion de flujo continuo) produciendo de esta manera una cosecha vlrica clarificada adicional; y 6) esterilizar dicha cosecha vlrica clarificada ademas por filtracion.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composicion de virus de la gripe de la invencion

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comprenden todas las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica; 5) someter la cosecha vlrica clarificada a centrifugacion; y 6) adicion de estabilizantes (por ejemplo, sacarosa al 2-8 %; monoclorhidrato de arginina al 0,75 % - 2 %; opcionalmente acido glutamico al 0,02-0,15 %; e hidrolizado de gelatina al 0,5-2 %).

Estos y otros objetivos y caracterlsticas de la invencion se volveran mas completamente evidentes cuando la siguiente descripcion detallada se lee en conjuncion con el apendice de las figuras que acompanan.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Muestra un diagrama de flujo que ilustra un Flujo de Proceso de CTM.

Figura 2: Muestra un diagrama de flujo que ilustra un Flujo de Proceso de CTM.

Figura 3: Muestra una tabla que ilustra Estudios de Carga Centrlfuga y Temperatura.

Figura 4: Muestra una tabla que ilustra un Resumen de datos del ensayo qT.

Figura 5: Muestra una tabla que ilustra rendimientos promedio para un numero de cepas de gripe.

Figura 6: Muestra una tabla con un resumen de los datos del ensayo QT para resultados de la prueba de

liberacion de lote monovalente.

Descripcion detallada

La presente invencion proporciona formulaciones de vacuna que son sustancialmente estables a temperaturas que varlan de 4 °C a 8 °C. En una realizacion especlfica de la invencion, las formulaciones de vacuna de la invencion son sustancialmente estables a una temperatura que varla de 4-8 °C o 4 °C durante un periodo de al menos 3

meses, o al menos 4 meses, o al menos 5 meses, o al menos 6 meses, o al menos 9 meses, o al menos 18 meses,

o al menos 24 meses, o al menos 36 meses, o al menos 48 meses, en que hay una perdida de potencia aceptable (por ejemplo, perdida de potencia del virus de la gripe) al final de tal tiempo, por ejemplo, una perdida de potencia de menos de 1,0 log (como se mide, por ejemplo, por TCID50 o Ensayo de Enfoque Fluorescente (FFA)).

La presente invencion proporciona ademas composiciones que comprenden formulaciones de la invencion. La presente invencion proporciona ademas vacunas (por ejemplo, vacunas de la gripe) que comprenden formulaciones y/o composiciones inmunogenicas de la invencion.

De acuerdo con la invencion, se proporcionan formulaciones de vacuna llquidas de la invencion que comprenden virus de la gripe vivos. Por ejemplo, las formulaciones de la invencion pueden comprender uno o mas de los siguientes: un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frlo, un virus de la gripe sensible a temperatura, un virus de la gripe sensible a temperatura adaptado al frlo, un virus de la gripe A y un virus de la gripe B. En una realizacion, las formulaciones de vacuna llquidas de la invencion comprenden dos cepas del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B.

La presente invencion ensena ademas metodos para producir tales formulaciones de vacuna llquidas. Por ejemplo, en una realizacion especlfica, se proporcionan en el presente documento metodos para producir formulaciones llquidas que comprenden uno o mas virus de la gripe. En una realizacion especlfica, los metodos para producir una formulacion llquida de la invencion incluyen una o mas de las siguientes etapas: 1) introducir una pluralidad de vectores [uno o mas de los que incorpora (o codifica) una porcion de un genoma del virus de la gripe] en una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras, cuya poblacion de huevos hospedadores o celulas hospedadoras es capaz de soportar la replicacion de un virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) adicion de un estabilizante (por ejemplo, soluciones que contienen glutamato y sacarosa descritas en el presente documento); 5) clarificar la cosecha vlrica (por ejemplo, por filtracion de profundidad o de membrana) produciendo de esta manera una cosecha vlrica clarificada; 6) someter la cosecha vlrica a una etapa de centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal continua, centrifugacion de flujo continuo); 7) una etapa de filtracion esteril (por ejemplo, uso de un filtro de 0,2 o 0,2-0,5 micrometros (con o sin calentamiento durante la filtracion)); y 8) almacenamiento a -60 grados C.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una formulacion llquida de la invencion incluye una o mas de las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) adicion de un estabilizante; 5) clarificar la cosecha vlrica (por ejemplo, por filtracion profunda y/o pasando a traves de uno o mas filtros que varlan de 0,2-0,8 micrometros; o 0,8 o 1,5 micrometros seguido de 0,2 micrometros), produciendo por lo tanto una cosecha vlrica; 6) someter la cosecha vlrica a una etapa de centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal continua, centrifugacion de flujo continuo); 7) una etapa de filtracion esteril (por ejemplo, uso de un filtro de 0,2 o 0,2-0,5 micrometros (con o sin calentamiento durante la filtracion)); y 8) almacenamiento a -60 grados C.

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En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composicion de virus de la gripe de la invencion comprende una o mas de las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica por filtracion, produciendo por lo tanto una cosecha vlrica; 5) someter la cosecha vlrica a una etapa de centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal continua, centrifugacion de flujo continuo); 6) adicion de estabilizantes (por ejemplo, sacarosa al 2-8 %; monoclorhidrato de arginina al 0,75 % - 2 %; opcionalmente acido glutamico al 0,02-0,15 %; e hidrolizado de gelatina al 0,5-2 %) y 6) esterilizar dicha cosecha vlrica clarificada ademas por filtracion.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composicion de virus de la gripe de la invencion comprende una o mas de las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica; y 5) someter la cosecha vlrica clarificada a centrifugacion.

En otra ensenanza especlfica, los metodos para producir una composicion de virus de la gripe de la invencion comprenden todas las siguientes etapas: 1) infeccion de una poblacion de huevos hospedadores o en una poblacion de celulas hospedadoras con virus de la gripe; 2) cultivar la poblacion de huevos hospedadores o la poblacion de celulas hospedadoras a una temperatura apropiada; 3) recuperar virus de la gripe en una cosecha vlrica; 4) clarificar la cosecha vlrica; 5) someter la cosecha vlrica clarificada a centrifugacion; y 6) adicion de estabilizantes (por ejemplo, sacarosa al 2-8 %; monoclorhidrato de arginina al 0,75 % - 2 %; opcionalmente acido glutamico al 0,02-0,15 %; e hidrolizado de gelatina al 0,5-2 %).

En una ensenanza, los metodos para producir una formulacion llquida de la invencion pueden incluir la etapa de congelar tales formulaciones. La etapa de congelado puede realizarse, por ejemplo, antes del ensayo de estabilidad final y la distribucion y/o antes de almacenar a temperaturas de refrigerador (por ejemplo, 4-8 grados Celsius). Congelar las formulaciones de vacuna antes del almacenaje a temperaturas de refrigerador puede aumentar la estabilidad de las formulaciones de vacuna de la invencion al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 80 %.

La invencion ensena ademas metodos para producir una o mas composiciones del virus de la gripe filtrado una cosecha de virus de la gripe, por lo que la cosecha del virus se calienta durante el filtrado. Incluido en estas realizaciones especlficas, el filtrado comprende el pasaje de la composicion a traves de un microfiltro de un tamano de poro que varla de 0,2 micrometros a aproximadamente 0,45 micrometros. Adicionalmente, en diversas realizaciones, la temperatura de calentamiento en tales realizaciones opcionalmente comprende de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 40 °C o mas, mientras que en algunas realizaciones, la temperatura comprende 31 °C o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 32 °C. El calentamiento en tales realizaciones ocurre opcionalmente antes o durante o antes y durante la filtracion y opcionalmente comprende de aproximadamente 50 minutos a aproximadamente 100 minutos, de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 60 minutos. La invencion tambien proporciona una composicion del virus de la gripe producida por tales metodos (incluyendo en el que la composicion es una composicion de vacuna).

Estabilizantes y tampones

Los estabilizantes de la invencion incluyen, arginina al 0,75-2 %; sacarosa (por ejemplo, 2-8 %); gelatina hidrolizada al 0,5-2 %; y glutamato (por ejemplo, 0,02-0,15 %).

Los tampones de la invencion incluyen, por ejemplo, uno o mas de los siguientes: tampon fosfato (mono o dibasico o

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Rendimiento del proceso

En una ensenanza, los metodos para producir una formulacion llquida de los resultados de la invencion resultan en un rendimiento de proceso real o promedio (de Cosecha Vlrica (VH) a formulacion final) de menos del 10 %, de menos del 16 %, de menos del 20 %, de menos del 30 %, de menos del 40 %, de menos del 50 %, de menos del 60 %, de menos del 70 %, de menos del 80 %, de menos del 90 %, o menos del 93 %, de menos del 95 %.

Se apreciara por aquellos expertos en la materia que las diversas etapas de los metodos descritos en el presente documento no requieren realizarse o requieren existir en la misma serie de produccion. De esta manera, aunque en algunas ensenanzas preferidas, todas las etapas y/o las composiciones en el presente documento se realizan o existen, en otras realizaciones, una o mas etapas se cambian, omiten, por ejemplo, opcionalmente (en alcance, orden, lugar, etc.) o similares.

Tambien se apreciara por aquellos expertos en la materia que las ensenanzas tlpicas comprenden etapas/metodos/composiciones que se conocen en la tecnica, por ejemplo, velado de los huevos que contienen virus, inoculacion de huevos con virus, etc. Por lo tanto, aquellos expertos en la materia son facilmente capaces de determinar condiciones, sub-etapas, detalles de etapas, etc., apropiadas para tales etapas conocidas para producir los virus, soluciones de virus, composiciones, etc. apropiados esencialmente estables a 2-8 °C. Las etapas individuales se describen con mayor detalle a continuacion.

Ademas, la presente invencion ensena metodos para usar tales formulaciones de vacuna llquidas. Por ejemplo, las formulaciones de vacuna pueden administrarse a un humano para prevenir o reducir los efectos de una infeccion vlrica, por ejemplo, infeccion de la gripe. En un ejemplo, las formulaciones de la invencion se administran como una composicion inmunogenica para prevenir o reducir los efectos de una infeccion del virus de la gripe.

Formulaciones CAIV estables al refrigerador

El trabajo anterior por el inventor y los co-trabajadores han resultado en el desarrollo de una vacuna de la gripe trivalente, viva, adaptada al frlo (CAIV-T, FluMist®, que se hace referencia a traves de todo como FluMist, pero debe asumirse ser FluMist®) administrado por pulverizador nasal. La presente invencion implica el desarrollo de una formulacion de CAIV-T, que tiene un perfil de estabilidad mejorado a temperaturas refrigeradas. Los metodos para producir tales formulaciones mejoradas se proporcionan en el presente documento y pueden incluir una o mas de las siguientes etapas: una etapa de filtracion esteril para reducir el riesgo de contaminacion, ultracentrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal de velocidad) y diafiltracion. Ademas, se incluye en el presente documento un numero de metodos para producir FluMist llquido y otras formulaciones estables a temperaturas de refrigerador de la invencion.

El desarrollo de las cepas CAIV se asistio por el Dr. John Maassab de la Universidad de Michigan en los 90 quien paso en serie cepas de gripe A y B en celulas PKC a temperaturas en disminucion hasta que las cepas resultantes mostraron de forma reproducible las propiedades fenotlpicas de la adaptacion al frlo (el virus crece bien a temperaturas reducidas en comparacion con el virus de tipo silvestre), sensibilidad a temperatura (el virus no crece bien a temperaturas elevadas in vitro) y atenuacion (la replicacion del virus se restringe en hurones). A traves del desarrollo por ejemplo, por el inventor y los cotrabajadores, estas propiedades se usaron como la base para el desarrollo de una vacuna trivalente anual que refleja las cepas de vacunas designadas de CDC para un ano particular, a traves de los procesos de reorganizacion genetica 6:2. Por ejemplo, una cepa CAIV 6:2 se produce por co-infeccion in vitro de la cepa relevante A o B del Virus Donante Maestro (MDV, por sus siglas en ingles) con la cepa de gripe circulante de interes y la seleccion mediada por anticuerpo de la reorganizacion apropiada. La reorganizacion diana 6:2 contiene genes HA y NA de la cepa circulante y los genes restantes del Virus Donante Maestro (MDV). La reorganizacion retiene las propiedades fenotlpicas adaptadas al frlo descritas anteriormente. El desarrollo adicional de CAIV se ha llevado a cabo por los presentes inventores y los cotrabajadores. FluMist ha demostrado un perfil seguro y muestra una eficiencia contra el desaflo vlrico y esta aprobado para el uso farmaceutico comercial en muchas situaciones.

La formulacion original de FluMist contenla cosecha de virus (VH) producida infectando huevos de gallina libres de patogeno especlfico con la Semilla del Virus del Trabajador del Fabricante (MWVS, por sus siglas en ingles) de la cepa seleccionada, seguido de incubacion durante dos a tres dlas y cosechar fluido alantoico infectado. El VH se estabilizo por la adicion a un volumen 1/10 de una solucion de glutamato fosfato de sacarosa (SPG) 10X. El FluMist trivalente se produjo combinando VH de cada una de las tres cepas en las vacunas durante un ano dado con fluido alantoico normal estabilizado (NAF) a una concentration diana de 7,3 log10TCID50/ml de cada cepa. La mezcla resultante despues se lleno en pulverizadores ajustados con una punta de pulverizador para permitir el trasporte intranasal de la vacuna FluMist. Este formato de producto se uso como “FluMist congelado”, que se almaceno en una forma congelada. Se apreciara que el virus MWVS tambien podrla fabricarse opcionalmente por ejemplo por reorganizacion de plasmido. Vease, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 60/375.675 enviada el 26

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de abril, 2002, PCT/US03/12728 enviada el 25 de abril, 2003, 10/423,828 enviada el 25 de abril, 2003, PCT/US05/017734 enviada el 20 de mayo, 2005 y US20050186563.

Aunque FluMist congelado puede servir como una vacuna marcada cuando se congela despues de la fabricacion y mantenerla congelada hasta el momento de uso, es bastante deseable una forma de FluMist que sea estable para el transporte/almacenaje a temperaturas de refrigerador. Tales formas “estables a temperatura de refrigerador” (o RTS) se caracterizan por una o mas (pero no necesariamente todas en cada realizacion) de las siguientes: retencion de estabilidad cuando se distribuyen como un llquido refrigerado; se pasan a traves de filtros esterilizantes (por ejemplo, 0,2 micrometros) para asegurar la garantla de un producto esteril (por ejemplo, sustancialmente libre de NAF); han eliminado la necesidad de la fabricacion del diluyente de NAF; tener un volumen de una dosis reducido; y comprende uno o ambos de arginina y gelatina como excipientes (por ejemplo, como estabilizantes). En ciertos aspectos en el presente documento, las formulaciones que tienen una o mas de tales caracterlsticas se denominan “FluMist llquido” o RTS o diversos terminos similares, para distinguirlas de otras versiones de la vacuna CAIV-T, tales como congeladas. La presente invencion presenta estos y otros aspectos.

Al producir/ensayar una composicion de virus RTS llquida de la presente invencion, se llevaron a cabo numerosos lotes de desarrollo. Los lotes de desarrollo variaron de 2000 a 20.000 huevos por lote, mientras que los lotes de GMP fueron aproximadamente 10.000 huevos cada uno. Se apreciara que mientras que los diversos ejemplos y protocolos se dan en el presente documento para la produccion de virus MWVS (por ejemplo, reordenamientos), los virus se producen opcionalmente a traves de diferentes medios en diferentes realizaciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los virus en el presente documento se fabrican a traves de los protocolos mostrados en el presente documento, mientras que en otras realizaciones, los virus MWVS se fabrican opcionalmente a traves de, por ejemplo, reorganizacion de plasmido o tecnologlas de “rescate de plasmidos”. Vease, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 60/375.675 enviada el 26 de abril, 2002, PCT/US03/12728 enviada el 25 de abril, 2003, USSN 10/423.828 enviada el 25 de abril, 2003, PCT/US05/017734 enviada el 20 de mayo, 2005 y US20050186563. En consecuencia, como se usa en el presente documento “infeccion de una poblacion de celulas hospedadoras” abarca celulas hospedadoras infectadas por virus creados por o durante reorganizamiento de plasmido.

En diversas realizaciones, la invencion comprende composiciones de virus y vacunas que son sustancialmente estables, por ejemplo, no muestran perdidas inaceptables en la potencia, por ejemplo, perdida de potencia de menos de 1,0 log, durante periodos de tiempo seleccionados (normalmente durante al menos 3 meses, durante al menos 4 meses, durante al menos 5 meses, durante al menos 6 meses, durante al menos 7 meses, durante al menos 8 meses, durante al menos 9 meses, durante al menos 10 meses, durante al menos 11 meses, durante al menos 12

meses, durante al menos 13 meses, durante al menos 14 meses, durante al menos 15 meses, durante al menos 16

meses, durante al menos 17 meses, durante al menos 18 meses, durante al menos 19 meses, durante al menos 20

meses, durante al menos 21 meses, durante al menos 22 meses, durante al menos 23 meses, durante al menos 24

meses o durante mas de 24 meses, etc.) a temperaturas deseadas (por ejemplo normalmente 4 °C, 5 °C, 8 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 8 °C).

Aunque un numero de realizaciones de la invencion en el presente documento se ejemplifican o se ilustran con FluMist, los principios realizados por la invencion son aplicables a otras composiciones de virus/vacunas as! como no deben necesariamente limitarse a cepas/virus particulares del presente documento. De esta manera otros virus de la gripe atenuados vivos y vacunas y composiciones tambien estan dentro de la vision de la invencion, por ejemplo, unas creadas a traves de medios racionales, por intervencion humana, etc. Tambien, otros virus de otras cepas de la gripe, por ejemplo, tales como cepas de la gripe A, cepas de la gripe B, cepas de la gripe atenuadas y no atenuadas, cepas de la gripe adaptadas al frlo y no adaptadas al frlo, cepas de la gripe sensibles a temperatura y no sensibles a temperatura, etc. estan todas opcionalmente dentro de las realizaciones de la presente invencion. Pueden usarse tales otros virus y vacunas, por ejemplo, como nuevas vacunas y/o como controles para ensayar otra vacuna bien en humanos o animales, etc. Ademas, otras composiciones de vacuna vlrica oral particularmente aquellas que comprenden virus vivos crecidos en celulas o huevos de gallina (por ejemplo, el virus del sarampion) son realizaciones de la invencion. Adicionalmente, los principios realizados por la invencion tambien son ampliamente aplicables a composiciones de virus y vacuna que comprenden virus vivos crecidos en celulas de mamlfero. Vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.244.354; 6.146.873; y 6.656.720.

Produccion de cosecha de virus en lote

La purificacion del virus de la gripe adaptado a frlo (u otros virus similares) y la formulacion real de las composiciones son caracterlsticas de RTS, o composiciones de virus, llquidas. La separacion del virus de la gripe del fluido alantoico se ha practicado como una parte de los procesos comerciales para la fabricacion de vacunas inactivadas. El metodo de eleccion para tal vacuna inactivada ha sido la ultracentrifugacion. La ultracentrlfuga de flujo continuo a escala comercial se volvio disponible en 1969 y se aplico rapidamente a la preparacion de vacunas de la gripe inactivadas. Aunque la purificacion cromatografica de virus de la gripe vivos serla una alternativa atractiva, los procesos robustos a gran escala que retengan la actividad vlrica todavla no estan disponibles. Esto se cree que se debe al recubrimiento de membrana y la naturaleza pleiomorfica de la partlcula del virus de la gripe.

La recuperacion del virus vivo (en oposicion al virus inactivado) purificado por ultra-centrifugacion se logro por los

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inventores y los cotrabajadores y es una realizacion de la presente invencion. El trabajo adicional demostro la capacidad de la filtracion en profundidad como una alternativa comercialmente viable a la centrifugacion en cubo oscilante antes de la ultra-centrifugacion y las recuperaciones aceptables de virus vivos despues de la filtracion a traves de un filtro de 0,2 micrometros y de nuevo tal es una realizacion de la presente invencion.

En una realizacion especlfica, el rendimiento del proceso medio para la etapa de clarificacion de VH de los metodos de la invencion es al menos el 30 %, o al menos el 40 %, o al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 % o al menos el 90 %.

En otra realizacion especlfica, el rendimiento del proceso medio para la etapa de ultracentrifugacion (por ejemplo, centrifugacion zonal) de los metodos de la invencion es al menos el 30 %, o al menos el 40 %, o al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 % o al menos el 90 %.

En otra realizacion especlfica, el rendimiento medio del proceso para la dilucion pico y la etapa de filtracion esteril de los metodos de la invencion es al menos el 30 %, o al menos el 40 %, o al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 % o al menos el 90 %.

La etapa de ultra-centrifugacion proporciona el beneficio de concentrar el CAIV. Esto soporta el uso de un volumen enviado mas pequeno (0,1 ml por fosa nasal en lugar de 0,25 ml por fosa nasal, por ejemplo, como puede usarse para FluMist congelado). Tal volumen reducido es mas tlpico de productos administrados nasalmente y puede aumentar la aceptacion del consumidor y reducir las perdidas de producto debidas al tragado o el goteo de la vacuna fuera de la nariz. Los tltulos de cosecha del fluido alantoico infectado para CAIV han estado normalmente entre 8,3 y 9,5 log10TCID50/ml, que es mas que una orden de magnitud por encima de la concentracion del producto diana para FluMist congelado (7,3 log10 TCID50/ml o 7,0 log10 TCID50 por dosis). En el caso en el que se incluya una cepa de muy baja titulacion en la recomendacion de vacuna anual, un FluMist llquido o RTS mejora las probabilidades de producir una vacuna trivalente de fuerza completa a pesar de la concentracion de virus aumentada en el producto final en comparacion con FluMist congelado. FluMist llquido o RTS se formula opcionalmente a una concentracion fila de 7,7 log10 TCID50/ml, que envla la misma cantidad de virus vivo por dosis como FluMist congelado.

En una realizacion especlfica, se proporciona una composicion de vacuna de la gripe de baja titulacion en la que la titulacion es menos de 7,3 log10 TCID50/ml, o menos de 7,0 log10 TCID50/ml, o menos de 6,0 log10 TCID50/ml, o menos de 5,0 log10 TCID50/ml, o menos de 4,0 log10 TCID50/ml, o menos de 3,0 log10 TCID50/ml, o menos de 2,0 log10 TCID50/ml. Tales composiciones de vacuna de la gripe de baja titulacion pueden comprender ademas un adyuvante farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, toxina termolabil de E. coli (o fragmentos de la misma), toxina pertusis, aluminio. Otros adyuvantes incluyen, pero no se limitan a fosfato de aluminio, hidroxido de aluminio, MPL.TM. (monofosforil llpido A 3-O-desacetilado); RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont., ahora Corixa), analogos del llpido A sinteticos tales como 529 (Corixa), Stimulon.TM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, Mass.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.), polinucleotidos sinteticos tales como oligonucleotidos que contienen un motivo CpG (Pat. de EE.UU. N.° 6.207.646 (28)) y toxina colerica (bien en una forma tipo silvestre o bien mutante, por ejemplo, donde el acido glutamico en la posicion de aminoacido 29 se reemplaza por otro aminoacido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la solicitud de patente internacional publicada numero WO 00/18434).

En una realizacion especlfica, la diafiltracion puede usarse en la preparacion de composiciones de virus de la invencion. Por ejemplo, la diafiltracion puede usarse para concentrar el virus antes de la formulacion. La diafiltracion puede usarse ademas de o en lugar de la ultracentrifugacion.

Despues de una fase inicial descrita mas adelante en el presente documento, la produccion de cGMP se inicio en la escala de 10.000 huCAIV monovalentes purificados A/Beijig/262/95 (H1N1), A/Sldney/05/97 (H3N2) y B/Ann Arbor/1/94 (tipo B/harbin/7/94) se fabricaron para soportar posteriores pruebas cllnicas. La cepa B/Ann Arbor se denomina en lo sucesivo en el presente documento tipo B/Harbin/7/94. Por conveniencia, las designaciones de las cepas normalmente se abrevian (por ejemplo, A/Beijing). La presente solicitud describe mas fuertemente etapas de proceso unicas al FluMist llquido, sin embargo, las etapas implicadas en ambas o comunes tanto a FluMist llquido como congelado tambien se describen en el presente documento.

Los metodos para el manejo de los huevos y la preparacion de cosecha de virus reciente fueron esencialmente los mismos en diversas realizaciones de la presente invencion (con la excepcion de inoculacion y cosecha automatizadas) para FluMist congelado como para FluMist llquido y aquellos expertos en la materia estaran advertidos de etapas similares o equivalentes que son capaces de usarse con la presente invencion. En la presente invencion, la ultra-centrifugacion se realizo usando una centrlfuga zonal Hitachi CP40Y y un rotor de flujo continuo RP40CT Tipo D (volumen de rotor = 3,2 l). La cosecha de virus primero se puso en conjunto, se estabilizo con glutamato de fosfato sacarosa (SPG) para facilitar la filtracion, despues se paso a traves de un filtro de polipropileno de 5 micrometros. El filtrado despues se cargo sobre un gradiente de sacarosa del 10 % al 60 %, se bandeo durante una hora a 40.000 rpm y se eluyo en fracciones de 100 ml.

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Las fracciones que contienen altos niveles de hemaglutinina (HA) se pusieron en conjunto, se diluyeron a concentracion de sacarosa 0,2 M y despues se filtraron esteriles usando un filtro de 0,2 micrometros de fluoruro de polivinilideno (PVDF). El CAIV monovalente purificado en lote resultante se congelo en botellas de 1 l por debajo de - 60 grados C y se mantuvo para procesamiento adicional.

Formulacion y carga

El barrido de la formulacion inicial determino que la estabilidad de la fase llquida de CAIV purificado a temperaturas refrigeradas era adecuada para la vacuna anual. Se anadio gelatina de animal hidrolizada al estabilizante SPG de FluMist congelado y proporciono los mejores resultados de estabilidad, con una cepa menos estable y un lote de la campana de CTM-1 mostro una perdida de un log durante 6,9 meses. Estudios de desarrollo de la formulacion adicionales mostraron que la estabilidad del FluMist llquido podrla mejorarse adicionalmente almacenando congelado justo despues de la fabricacion y descongelando antes de la distribucion final. La estabilidad de la cepa del peor caso tambien se mejoro mediante la adicion de arginina. Mientras las gelatinas animales pueden elevar la conciencia con respecto a las encefalopatlas espongiformes transmisibles (TSE), las formulaciones disponibles que carecen de gelatina no lograron la estabilidad requerida en todas las realizaciones. De esta manera, se eligio gelatina porcina para las algunas realizaciones de formulacion de FluMist llquido debido a sus propiedades estabilizantes y el hecho de que no se han informado apariciones de TSE en cerdos. Las etapas de procesamiento qulmico rigurosas usadas en la hidrolisis del colageno tambien se cree que causan inactivacion de protelnas de tamano prion.

Se envio CAIV en lote monovalente purificado congelado y se produjo una vacuna trivalente bajo cGMP para soportar el ensayo cllnico de FluMist llquido. Se realizaron un total de seis cargas. La combination se realizo a pequena escala usando un matraz aspirador de vidrio de 4 litros y se cargaron pulverizadores de vidrio de 0,5 ml Becton Dickinson (BD) Hypack SCF (esteril, limpio, listo para cargar) usando un cargador/parador INOVA automatizado y equipo asociado. La fabricacion de FluMist llquido trivalente cargado se describe con mas detalle a continuation.

Realizaciones de formulacion especfficas de la invencion

De acuerdo con la invencion, las formulaciones de vacuna de la invencion comprenden en las formulaciones finales: sacarosa: 2-8 % peso/volumen (p/v); arginina (tal como monoclorhidrato) 0,75 % - 2 % p/v; opcionalmente monohidrato monosodico de acido glutamico, 0,02-0,15 % p/v; hidrolizado de gelatina, tal como porcina Tipo A (u otras fuentes) 0,5-2 % p/v; opcionalmente fosfato potasico dibasico 1-2 %; y fosfato potasico monobasico 0,25-1 % p/v.

En una realization especlfica, las formulaciones de vacuna comprenden lo siguiente: sacarosa: 6,84 % (p/v); monoclorhidrato de arginina 1,21 % (p/v); acido glutamico, monohidrato monosodico 0,094 p/v; hidrolizado de gelatina, porcina Tipo A (u otras fuentes) 1 % (p/v); fosfato potasico dibasico 1,13 % y fosfato potasico monobasico 0,48 % p/v. En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna comprenden todos de los siguientes: sacarosa: 6,84 % peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1,21 % (p/v); acido glutamico, monohidrato monosodico 1 p/v; hidrolizado de gelatina, porcina Tipo A (u otras fuentes) 1 % (p/v); fosfato potasico dibasico 1,13 % y fosfato potasico monobasico 0,48 % p/v.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna comprenden todos los siguientes (con un 10 % de variation de uno o mas componentes): sacarosa: 6,84 % peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1,21 % (p/v); acido glutamico, monohidrato monosodico 0,094 p/v; hidrolizado de gelatina, porcina Tipo A (u otras fuentes) 1 % (p/v); fosfato potasico dibasico 1,13 % y fosfato potasico monobasico 0,48 % p/v.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna comprenden todos los siguientes (con un 10 % de variacion de uno o mas componentes): sacarosa: 6,84 % peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1,21 % (p/v); hidrolizado de gelatina porcina Tipo A (u otras fuentes) 1 % (p/v). En tales realizaciones, las formulaciones estan en tampon (por ejemplo, un tampon fosfato potasico (pH 7,0-7,2).

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna comprenden todos los siguientes (con un 1 % de variacion de uno o mas componentes): sacarosa: 6,84 % peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1,21 % (p/v); acido glutamico, monohidrato monosodico 0,094 p/v; hidrolizado de gelatina, porcina Tipo A (u otras fuentes) 1 % (p/v); fosfato potasico dibasico 1,13 % y fosfato potasico monobasico 0,48 % p/v.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna comprenden todos los siguientes (con un 3 % de variacion de uno o mas componentes): sacarosa: 6,84 % peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1,21 % (p/v); acido glutamico, monohidrato monosodico 0,094 p/v; hidrolizado de gelatina, porcina Tipo A (u otras fuentes) 1 % (p/v); fosfato potasico dibasico 1,13 % y fosfato potasico monobasico 0,48 % p/v.

En una realizacion especlfica, las formulaciones de la invencion pueden contener, por ejemplo, fosfato potasico (por ejemplo, al menos 50 mM, o al menos 100 mM, o al menos 200 mM, o al menos 250 mM) como un tampon fosfato, o

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alternativamente, histidina (por ejemplo, al menos 50 mM, o al menos 100 mM, o al menos 200 mM, o al menos 250 mM).

Otras realizaciones especfficas de la invention, por ejemplo, dosificacion, potencia

En otra realizacion especlfica, se incluyen metodos para administrar las formulaciones de vacuna de la invencion intranasalmente. Por ejemplo, las formulaciones de vacuna de la invencion pueden administrarse intranasalmente en dosis finales de 0,5 ml/dosis; 0,75 ml/dosis; 0,1 ml/dosis; 0,15 ml/dosis; 0,2 ml/dosis; 0,25 ml/dosis; 0,5-0,1 ml/dosis; 0,5 ml-2 ml/dosis; o 0,5-2,5 ml/dosis.

En una realizacion, las formulaciones de vacuna de la invencion comprenden aproximadamente 107 unidades de enfoque fluorescentes (FFU) o 107 TCID50 de cada una de tres cepas de reorganization diferentes de la gripe. En otra realizacion especlfica de la invencion, las formulaciones de vacuna de la invencion comprenden una potencia de 7,0 (+/- 0,5) log10 FFU/dosis (o TCID50/dosis) para cada cepa del virus de la gripe. En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen una potencia de 7,0 (+/- 0,5) log10 FFU/dosis (o TCID50/dosis) para al menos una cepa del virus de la gripe. En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen una potencia de al menos (o igual a) 6,0 log10 FFU/dosis, 6,5 log10 FFU/dosis, 6,7 log10 FFU/dosis 6,7 log10 FFU/dosis, 6,8 log10 FFU/dosis, 6,9 log10 FFU/dosis, 7,0 log10 FFU/dosis, 7,1 log10 FFU/dosis, 7,2 log10 FFU/dosis, 7,3 log10 FFU/dosis, 7,4 log10 FFU/dosis, 7,5 log10 FFU/dosis, 7,6 log10 FFU/dosis, 7,7 log10 FFU/dosis, 7,8 log10 FFU/dosis, 7,9 log10 FFU/dosis, 8,1 log10 FFU/dosis, 8,5 log10 FFU/dosis u 8,8 log10 FFU/dosis.

La potencia puede medirse por TCID50 en lugar de FFU en cada realizacion de la invencion. Un Ensayo de enfoque fluorescente (FFA) es una medida directa de la capacidad de infection en la vacuna mientras que TCID50 es una medida indirecta que mide la capacidad de la replication productiva en MDCK u otras celulas.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen una potencia de entre 6,5-7,5 log 10 FFU por dosis (por ejemplo, por 0,2 ml de dosis).

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen una potencia de al menos (o igual a) 7,0 log10 TCID50 por dosis, o al menos 6-8 TCID50 por dosis, o al menos 6,4 TCID50 por dosis, o al menos 6,6 log10 TCID50 por dosis.

En una realizacion, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen pH de 6,7-7,7, o 6,6, o 6,7, o 6,8, o 6,9, o 7,0, o 7,1, o 7,2, o 7,3, o 7,4, o 7,5, o 7,6, o 7,7.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion no tienen mas de 60 EU/ml de endotoxina, o no tienen mas de 200 EU/ml de endotoxina. Por ejemplo, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen menos de o igual a 5 EU/ml de endotoxina. En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion tienen menos de o igual a 1,0 EU/7,0 log10 FFU.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion estan libres de uno o mas (o todos) de los siguientes; micoplasma, retrovirus, virus de la leucosis aviar y micobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis). Los metodos para producir tales formulaciones de la invencion pueden comprender la etapa o etapas de ensayar para tales impurezas.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion pueden contener virus de la gripe que tienen genes HA y NA de tres virus diferentes como en FluMist.

En una realizacion especlfica, las formulaciones e la invencion comprenden todos de los siguientes por dosis (por ejemplo, por 0,2 ml de dosis): sacarosa (13,68 mg), fosfato potasico dibasico (2,26 mg), fosfato potasico monobasico (0,96 mg), hidrolizado de gelatina (2,0 mg), clorhidrato de arginina (2,42 mg) y glutamato monosodico (0,188 mg).

En una realizacion especlfica, las formulaciones de la invencion comprenden todos de los siguientes por dosis (por ejemplo, por 0,2 ml de dosis): sacarosa (13,68 mg), fosfato potasico (100 mM), hidrolizado de gelatina (2,0 mg), clorhidrato de arginina (2,42 mg) y glutamato monosodico (0,188 mg).

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de la invencion comprenden un virus de la gripe que comprende el esqueleto genetico de uno o mas de los siguientes virus de la gripe: virus A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) B/Ann Arbor/1/66, el FluMist MDV-A (ca A/Ann Arbor/6/60), el FluMist MDV-B (ca B/Ann Arbor/1/66), esqueleto de cepa donante A/Leningrado/17 y PR8.

En otra realizacion especlfica, las formulaciones de vacuna de la invencion comprenden un virus de la gripe que comprende una secuencia polipeptldica HA y una NA (o al menos un 90 % identicas o al menos un 95 % identicas a tales secuencias) de uno o mas de los siguientes: B/Yamanashi; A/Nueva Caledonia; A/SIdney; A/Panama; B/Johannesburgo; B/Victoria; B/Hong Kong; A/Shandong/ 9/93; A/Johannesburgo/33/94; A/Wuhan/395/95;

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A/Sldney/05/97; A/Panama/2007/99; A/Wyoming/ 03/2003; A/Texas/36/91; A/Shenzhen/227/95; A/Beijing/262/95; A/Nueva Caledonia/20/99; B/Ann Arbor/1/94; B/Yamanashi/166/98; B_Johannesburgo_5_99; B/Victoria/504/2000; B/Hong Kong/330/01; B_Brisbane_32_2002; B/Jilin/20/03; un virus de la gripe A H1N1, un virus de la gripe A H3N2, un virus de la gripe A H9N2 y una cepa de gripe pandemica (bien designada por WHO o que no circula en la poblacion humana). Vease, por ejemplo, el documento US 20050042229.

En otro ejemplo especlfico, las formulaciones de vacuna de la invencion son esteriles.

Description de etapas representativas en la production de vacunas

Para la facilidad en el analisis y la descripcion, las diversas etapas de la production de vacunas en general pueden ensenarse comprendiendo o cayendo en los presentes cuatro grupos amplios (a groso modo similar a la presentation indicada previamente antes). El primer grupo comprende tales aspectos como co-infection, reagrupacion, selection de reordenaciones y donation de reordenaciones. El segundo grupo comprende tales aspectos como purification y expansion de reordenaciones. El tercer grupo comprende expansion adicional de las reordenaciones en los huevos, junto con la cosecha y la purificacion de tales soluciones de virus cosechadas. El cuarto grupo comprende la estabilizacion de las soluciones de virus cosechadas y pruebas de potencia/esterilidad de las soluciones vlricas. Ha de entenderse, sin embargo, que la division de los aspectos de la invencion en las anteriores cuatro categorlas generales es solamente para fines explicativos/de organization y no debe hacerse interferencia o interdependencia de etapas, etc. De nuevo, se apreciara que otras etapas (tanto similares como diferentes) se usan opcionalmente con los metodos y las composiciones e la invencion (por ejemplo, los metodos y las composiciones para las composiciones de vacuna de RTS).

Como se menciona anteriormente, para la facilidad del analisis y la descripcion, las diversas etapas de la produccion de vacunas puede pensarse como comprendiendo cuatro grupos amplios. El primer grupo comprende tales aspectos como co-infeccion, reagrupacion, seleccion de reordenaciones y clonacion de reordenaciones.

Grupo 1

Los aspectos de la produccion de composition de vacunas que se clasifican ampliamente en el presente documento que pertenecen al Grupo 1, comprenden metodos y composiciones relacionadas con la optimization de la co- infeccion de llneas de cultivo celular, por ejemplo, con un virus donante maestro y uno o mas virus de tipo silvestre para producir virus reordenados especlficamente deseados; y la clonacion de los virus reorganizados seleccionados. La reordenacion de las cepas de virus de la gripe se conoce bien por los expertos en la materia. La reordenacion tanto de virus de la gripe A como de virus de la gripe B se ha usado tanto en cultivo celular como en huevos para producir cepas de virus reordenados. Vease, por ejemplo, Tannock et al., Preparation and characterisation of attenuated coldadapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/ 134/17/57 donor strain, Vaccine (2002) 20:2082-2090. La reordenacion de las cepas de la gripe tambien se ha mostrado con construcciones de plasmidos. Vease, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 60/375.675 enviada el 26 de abril, 2002, PCT/US03/12728 enviada el 25 de abril, 2003 y las solicitudes de EE.UU. n.° 10/423.828 enviada el 25 de abril, 2003 y PCT/US05/017734 enviada el 20 de mayo, 2005; y el documento US2005018563.

La reordenacion, en breve, generalmente comprende mezclar (por ejemplo, en huevos o en cultivo celular) segmentos genicos de diferentes virus. Por ejemplo, 8 segmentos tlpicos de cepas de virus de la gripe B pueden mezclarse entre, por ejemplo, una cepa tipo silvestre que tenga un epltopo de interes y una cepa “donante”, por ejemplo que comprenda una cepa adaptada al frlo. La reordenacion entre los dos tipos de virus puede producir, entre otros, virus que comprenden la cepa del epltopo de tipo silvestre para un segmento, y la cepa adaptada a frlo para otro segmento. Desafortunadamente, para crear las reordenaciones deseadas, a veces es necesario realizar un gran numero de reordenaciones. Despues de reordenarse, los virus tambien pueden seleccionarse (por ejemplo, para encontrar los reordenamientos deseados). Los reordenamientos deseados pueden clonarse despues (por ejemplo, expandirse en numero).

La optimizacion, seleccion y clonacion tradicionales de los reordenamientos deseados para el virus de la gripe B, normalmente se da por co-infeccion de cepas del virus en un cultivo celular (por ejemplo, celulas CEK) seguido de seleccion con anticuerpos apropiados, por ejemplo, frente a material de uno de los virus parentales (habitualmente realizado en huevos) y la clonacion o la expansion del virus, etc. que se realiza normalmente en cultivo celular. Sin embargo, tal reordenacion tradicional presenta desventajas en que se necesitan cientos de reordenaciones para crear la mezcla de segmentos deseada. Cuando se realizan tales reordenaciones, es evidente que las reordenaciones realmente aleatorias no son el resultado final. En otras palabras, presiones que predisponen que el proceso exista en los sistemas. Para las cepas de la gripe A, sin embargo, tales procesos no aparecen tener tal predisposition. Para cepas A, la co-infeccion de cepas (normalmente en cultivo celular tal como celulas CEK) se sigue de seleccion y clonacion al mismo tiempo, de nuevo, normalmente en cultivo celular.

Optimization de reordenacion

Diversas realizaciones que utilizan las etapas del Grupo 1 pueden optimizar el proceso de reordenacion para reducir

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el numero de reordenaciones necesarias (y de esta manera aumentar la salida/estabilidad del proceso de produccion de vacunas), etc. Las etapas que utilizan tales tecnicas de optimizacion se realizan normalmente con reordenacion de las cepas de gripe B y se realizan normalmente en cultivo celular, por ejemplo, celulas CEK. Vease, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004.

Otros metodos para la reordenacion de virus de la gripe puede opcionalmente mezclar diluciones de un virus donante maestro (MDV) y un virus tipo silvestre, por ejemplo, una dilucion 1:5 de cada uno sin importar la concentracion de las soluciones respectivas, que despues se incuban durante 24 y 48 horas a 25 °C y 33 °C. Aunque un enfoque tal es normalmente aceptable para las cepas de gripe A, las cepas de gripe B no dan normalmente resultados positivos con tal protocolo. Por ejemplo, para lograr la reordenacion apropiada 6:2 (es decir, 6 genes del MDV y 2 genes, NA y NH del virus tipo silvestre) deben realizarse normalmente cientos de reordenaciones.

Seleccion y clonacion de reordenaciones

Las etapas en el Grupo 1 tambien comprenden la seleccion de virus de la gripe reordenados. Las cepas del virus de la gripe A reordenadas son capaces de seleccionarse bien en cultivo celular (por ejemplo celulas CEK) o bien en huevos. Sin embargo, las cepas de gripe reordenadas presentan problemas cuando se reordenan en cultivo celular (por ejemplo, cuando se seleccionan para celulas CEK). SE cree que las celulas CEK interfieren con el gen M de las cepas de gripe B, reduciendo de esta manera el rendimiento global. Diversos metodos de produccion de composicion de vacunas, vease por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004, utilizan diferentes etapas para la reordenacion de virus, por ejemplo, seleccion, tales etapas pueden usarse opcionalmente para crear virus para las composiciones de vacuna.

Caracterizacion de Reordenamientos

Todavla otros metodos de produccion de virus/vacunas utilizan aplicaciones de una alta salida de una prueba de electroforesis de polimorfismo de conformacion de hebra sencilla/electroforesis capilar (SS/CP/CE) para determinar la constelacion genica de los virus de la gripe usados en el presente documento. Los virus de la gripe contienen 8 segmentos genicos y, como se describe anteriormente, la co-infeccion de una unica celula con dos cepas de gripe diferentes puede producir virus reordenados con nuevas constelaciones genicas distintas de cada parental. De esta manera, algunos metodos pueden usar una prueba SSCP/CE para determinar rapidamente la constelacion del segmento genico de un gran numero de muestras de virus de la gripe. Los segmentos genicos vlricos de la gripe se amplifican opcionalmente por RT-PCR usando cebadores marcados fluorescentes especlficos para cada uno de los ocho segmentos. Vease tambien, Irvin et al. (2000) Crin. Micro. J38(2):839-845.

Prevencion de contaminacion bacteriana

Algunos metodos de la produccion de virus/vacunas puede comprender etapas para detectar y/o prevenir/detectar la contaminacion microbiana de huevos en los que se produce el virus de la gripe. Las estrategias de deteccion microbiana de la invention son utiles para deteccion microbiana rapida/alta y, de esta manera, como muchas otras etapas, son utiles para aumentar el rendimiento y opcionalmente la estabilidad en la produccion de virus/vacunas.

Muchas estrategias de produccion de vacunas de la gripe actuales, que pueden usarse opcionalmente con la invencion en el presente documento, usan como un componente el metodo tradicional para la expansion del virus de la gripe en huevos de gallina fertiles libres de patogenos especlficos. Puede ocurrir una posible contaminacion microbiana en varios puntos en la produccion del virus en huevos. Desafortunadamente, los huevos de gallina pueden tener algunos microorganismos fuera de sus cascaras como parte de su flora natural. Tambien es posible tener microorganismos encerrados dentro de la cascara del huevo durante el desarrollo del embrion de pollo. Los huevos de pollo se incuban a 37 °C en alta humedad para desarrollar el embrion, que constituye condiciones de incubation primarias para muchos tipos de contaminantes microbianos. Otro posible momento de contaminacion microbiana ocurre cuando la cascara se punza para inocular el huevo. Incluso antes de la inoculation del huevo, los huevos normalmente se pulverizan con alcohol, todavla hay oportunidad de que los microorganismos entren al huevo.

Despues de la expansion de los virus durante 2 o 3 dlas en los huevos, la parte de arriba de la cascara del huevo se retira normalmente para la cosecha manual del fluido alantoico que contiene virus dentro del huevo. Vease, anteriormente. Esta cosecha es otro puto donde puede originarse la contaminacion microbiana. Desafortunadamente los huevos con tal carga biologica pueden escapar a la deteccion, necesitando ponerlo en multiples botellas para minimizar el rechazo del lote entero debido a un ensayo MPA fallido. Ya que se usan tres cepas de gripe normalmente en la produccion de vacunas, se requiere la mezcla de estas tres cepas para el lote final. Se realiza MPA en el proceso (prueba de pureza biologica), por ejemplo, en la cosecha de virus antes del mezclado y la carga para asegurar le producto libre de microbios.

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Despues de la incubacion, el metodo “tradicional” para velar se usa para identificar huevos infertiles y muertos que esten posiblemente muertos debidos a causas naturales o a contaminacion microbiana (es decir, los huevos muertos pueden darse debido a la infectividad del virus y/o la expansion de microorganismos, pero ambas de las cuales requieren deteccion y retirada de tales huevos). El velado comprende, por ejemplo, el proceso de mantener un huevo en frente de una fuente de luz en una habitacion oscurecida para permitir la visualizacion del embrion en desarrollo. Los huevos muertos se excluyen de la inoculacion del virus.

Como puede verse a partir de los puntos anteriores, la deteccion de contaminacion microbiana puede necesitarse en multiples etapas durante la fabricacion de la vacuna de la gripe. Existe una necesidad de eliminar o reducir microbios aviarios y ambientales y una necesidad de eliminar o reducir la introduction de microbios ambientales y humanos. Los metodos actuales para la deteccion de microorganismos contaminantes incluyen, por ejemplo, metodos se compendio (MPA y Carga biologica). Los metodos actuales pueden incluir, por ejemplo, velado de huevo durante pre/post inoculacion del huevo (que se realiza manualmente de forma tlpica a una velocidad de aproximadamente 500 huevos/hora/persona); los ensayos de MPA y carga biologica que son normalmente manuales toman aproximadamente 14 dlas para MPA y aproximadamente 3 dlas para la carga biologica (que se realizan durante la cosecha del virus); ensayo de micoplasma; que se realiza normalmente de forma manual y toma aproximadamente 28 dlas (realizado durante la cosecha del virus); y ensayo de micobacteria que es normalmente manual y toma aproximadamente 56 dlas (realizado durante la cosecha del virus). De nuevo, vease por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004, para descripciones de diversas tecnicas capaces de usarse con la presente invention.

Grupo 2

Los aspectos de la production de virus/vacunas que caen en el Grupo 2 incluyen purification adicional y expansion del virus, etc. Despues del proceso de la reordenacion correcta y la donation de los reordenamientos (es der, los virus 6:2), tales partlculas vlricas reordenadas se purifican adicionalmente en huevos de gallina embrionados y los clones correctos se expanden en cantidad (de nuevo a traves de crecimiento en huevos de gallinas) para generar una cepa vlrica maestra (MSV) o semilla vlrica maestra, que, a su vez, se expande adicionalmente para generar una cepa de virus de trabajo maestra (MWVS) o la semilla de virus de trabajo del fabricante. Muchos aspectos de la purificacion de partlculas de virus a partir de huevos y el uso de tales virus purificados para inocular mas huevos para expandir la cantidad de partlculas de virus se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Muchas tales tecnicas son comunes en la produccion actual de partlculas de virus y se han usado durante al menos 40 anos. Vease, por ejemplo, Reimer, et al. Influenza virus purification with the zonal ultracentrifuge, Science 1966, 152:137981. Los protocolos de purificacion pueden implicar, por ejemplo, ultra-centrifugacion en gradientes de sacarosa (por ejemplo, sacarosa al 10-40 %) etc. Ademas, como se indica en el presente documento, otros procedimientos, etc. listados en otros Grupos tambien estan opcionalmente presentes dentro del grupo 2, por ejemplo, prevention de contaminacion microbiana, etc.

Grupo 3

Los aspectos de la produccion de virus/vacuna que caen bajo el encabezado el Grupo 3 incluyen, por ejemplo, acondicionamiento de los huevos embrionados (por ejemplo, manejo especlfico y condiciones ambientales implicadas en la incubacion de huevos infectados con virus) y cosechar y clarificar el virus de la gripe del fluido alantoico de los huevos.

Por ejemplo, acondicionar, lavar, velar e incubar huevos que contienen el virus reordenado para usarse en una vacuna; inocular, sellar, etc. de tales huevos; manejo de tales huevos; cosecha de la solution vlrica (por ejemplo, el fluido alantoico o la Cosecha Vlrica (VH)) de los huevos; y la clarification de la solucion vlrica puede caer dentro de tal categorla. De nuevo, notese que varias tecnicas aplicables a las etapas en el Grupo 2 son igualmente aplicables a las etapas en el Grupo 3 (por ejemplo, velado, etc.). Varios aspectos de la produccion de virus/vacunas que comprenden el Grupo 3 se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Diversos aspectos de manejo de huevos en la produccion de virus, as! como la inoculacion de huevos con los virus y lavar, incubar, etc. tales huevos se conocen normalmente en la produccion de virus/vacunas en huevos. Por supuesto, se apreciara que tales tecnicas bien conocidas se usan junto con los unicos e innovadores aspectos de la presente invencion. Vease, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004, dan etapas adicionales tales como balanceo etc., que pueden usarse tambien con los metodos y las composiciones de la presente invencion. Otras etapas similares pueden incluir filtrado especlfico y calentamiento de las composiciones, de nuevo, vease lo mismo.

Filtracion y calentamiento

La presente invencion implica aspectos de ultracentrifugacion, vease anteriormente, que pueden caer dentro de la agrupacion actual. Ademas, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y pCt/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004 tambien dan otras etapas de filtrado y calentamiento que pueden usarse opcionalmente con los metodos y composiciones de la presente invencion. Como se describe, el proceso de fabricacion de FluMist™ puede usar huevos de pollo embrionados para generar semillas de virus maestras (MVS),

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semillas de virus de trabajo del fabricante y cosechas vlricas (VH). Las semillas y la cosecha vlrica pueden contener carga biologica (normalmente contamination bacteriana) que podrla provocar que los lotes de producto de semillas o de virus se rechazaran en el proceso de production de vacunas. Por supuesto, se apreciara que el listado especlfico o la description de tipos de productos particulares usados, tamanos, etc., no ha de considerarse limitante en la presente invention salvo que se cite especlficamente que sea asl.

Grupo 4

El Grupo 4 de los aspectos de la produccion de formulacion/composicion de vacuna comprende, por ejemplo, etapas principalmente referidas a la estabilizacion (por ejemplo, a traves de la adicion de componentes, alteraciones en relaciones tampon/NAF, etc.) y los ensayos de potencia/esterilidad soluciones que contienen virus. La descripcion de la presente invencion anterior, da diversos aspectos que pueden agruparse opcionalmente dentro de la presente categorla. Vease, anteriormente.

En algunas realizaciones, las soluciones/vacunas vlricas finales que comprenden virus vivos son estables en una forma llquida durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el almacenamiento “en el campo” (por ejemplo, en la venta y la comercializacion cuando se refrigera a 4-8 °C, 4 °C, 5 °C, etc.) a traves de una estacion de vacunacion de gripe (por ejemplo, normalmente de aproximadamente septiembre hasta marzo en el hemisferio norte). De esta manera, las composiciones de virus/vacuna se desea que retengan su potencia o que pierdan su potencia a una tasa aceptable durante el periodo de almacenamiento. En otras realizaciones, tales soluciones/vacunas son estables en forma llquida de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 8 °C, por ejemplo, a temperatura de refrigerador. Por ejemplo, si fuera aceptable una perdida de potencia de 0,3 log y el periodo de almacenamiento fueran 9 meses, entonces serla aceptable una disminucion en la potencia de 0,05 log/mes. Como otro ejemplo, si se permitiera una perdida de hasta 0,75 log, una velocidad de menos de o igual a 0,09 log/mes serla suficiente para permitir la estabilidad de los materiales almacenados continuamente a temperatura del refrigerador (por ejemplo, 4 °C). En otras realizaciones, tales soluciones/vacunas son estables en forma llquida cuando se almacenan de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 8 °C. La estabilidad de la composition puede comprender entre aproximadamente 3 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 4 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 5 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 6 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 7 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 8 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 9 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 10 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 11 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 12 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 13 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 14 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 15 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 16 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 17 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 18 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 19 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 20 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 21 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 22 meses y aproximadamente 2 anos, entre aproximadamente 23 meses y aproximadamente 2 anos, o mas de aproximadamente 2 anos.

Uno puede ensayar la estabilidad de una formulation de la invencion por un numero de metodos. Por ejemplo, uno puede incubar primero una formulacion a temperaturas de congelation (por ejemplo, -25 o -70°C (+/- 10, 20, 30, o 40 °C) y despues almacenar (o “incubar”) la formulacion a 4-8 °C durante una longitud de tiempo. La potencia podrla medirse por un numero de metodos como se describe en el presente documento se conoce de otra manera.

Concentracion/diafiltracion de cosechas vfricas

En algunos metodos de la produccion de composicion de vacunas, las cosechas de virus se concentran opcionalmente usando una columna apropiada. Vease, las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004.

Estabilizantes/Tampones

La produccion de composiciones de vacuna tambien puede incluir opcionalmente diversas diluciones de NAF (normalmente NAF sin fraccionar) que comprenden el virus de interes y combinaciones de, por ejemplo, sacarosa, arginina, gelatina, EDTA, etc. Vease por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.Uu. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697, para ejemplos y diversas combinaciones posibles en diferentes formulaciones de vacuna. Tales metodos y composiciones son preferentemente estables, por ejemplo, no muestran perdidas inaceptables en potencia, por ejemplo, una perdida de potencia de menos de 1,0 log, durante los periodos de tiempo seleccionados (normalmente al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 15 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses, etc.) a temperaturas deseadas (por ejemplo, normalmente 4 °C, 5 °C, 8 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 8 °C).

Las formulaciones, o composiciones comprenden un estabilizante que comprende arginina (de pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2) en combination con hidrolizado de gelatina) Vease, por ejemplo, las

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solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697. Ademas, en muchas soluciones viricas/soluciones vacuna se utiliza opcionalmente una solucion base de SPG (sacarosa, fosfato potasico y glutamato monosodico).

Las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 10/788.236 y PCT/US04/05697 enviadas ambas el 25 de febrero, 2004 dan otros metodos adicionales de estabilizacion de composition de virus/vacuna, por ejemplo, manipulation del nivel de NAF, etc.

Definiciones

Salvo que se defina lo contrario, todos los terminos cientlficos y tecnicos se entienden tener el mismo significado que se usa comunmente en la tecnica a la que pertenecen. Para los fines de la presente invention los siguientes terminos se definen a continuation.

Los terminos “acido nucleico”, “polinucleotido”, “secuencia de polinucleotidos” y “secuencia de acidos nucleicos” se refiere a pollmeros de desoxirribonucleotido o ribonucleotido de cadena sencilla o de doble cadena, o quimeras o analogos de los mismos. Como se usa en el presente documento, el termino incluye opcionalmente pollmeros de analogos de nucleotidos de origen natural que tienen la naturaleza esencial de los nucleotidos naturales en que se hibridan a acidos nucleicos de hebra sencilla de forma similar a nucleotidos de origen natural (por ejemplo, acidos nucleicos peptldicos). Salvo que se indique de otra manera, una secuencia de acido nucleico particular opcionalmente abarca secuencias complementarias , ademas de la secuencia expllcitamente indicada.

El termino “gen” se usa ampliamente para referirse a cualquier acido nucleico asociado a una funcion biologica. De esta manera, los genes incluyen secuencias de codification y/o las secuencias de codification y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresion. El termino “gen” se aplica a una secuencia del genoma especlfica, as! como a un ADNc ARNm codificado por esa secuencia genomica.

Los genes tambien incluyen segmentos de acido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras protelnas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen “promotores” y “potenciadores” para lo que se unen protelnas reguladoras tales como factores de transcription, resultando en la trascripcion de secuencias adyacentes o cercanas. Un promotor “especlfico de tejido” es uno que regula la transcripcion en un tipo de tejido especlfico o un tipo celular, o ambas.

El termino “vector” se refiere a los medios por los que un acido nucleico puede propagarse y/o transferirse entre organismos, celulas o componentes celulares. Los vectores incluyen plasmidos, virus, bacteriofagos, pro-virus, fagemidos, transposomas, y cromosomas artificiales y similares, que se replican de forma autonoma o pueden integrarse en un cromosoma de una celula hospedadora. Un vector tambien puede ser un polinucleotido de ARN virgen, que se replica de forma autonoma o puede integrarse en un cromosoma de una celula hospedadora. Un vector tambien puede ser un polinucleotido de ARN desnudo, un polinucleotido compuesto tanto por ADN como ARN dentro de la misma cepa, un conjugado de poli lisina o de ARN, un peptido conjugado de ADN o ARN, un liposoma conjugado de ARN o ADN, un conjugado de liposoma de ADN, o similares, que no se replican autonomamente pero no necesariamente de forma exclusiva, los vectores del presente documento se refieren a plasmidos.

Un “vector de expresion” es un vector, tal como un plasmido que es capaz de promover la expresion, as! como la replication de un acido nucleico incorporado en el mismo. Topicamente, el acido nucleico a expresarse esta “unido de forma funcional” a un promotor y/o un potenciador, y se somete a control regulatorio por el promotor y/o el potenciador.

Un “vector de expresion bi-direccional” se caracteriza por dos promotores alternativos orientados en la direction opuesta con respecto a un acido nucleico situado entre los dos promotores, de tal manera que la expresion pueda iniciarse en ambas orientaciones dando como resultado, por ejemplo, la transcripcion de ambas hebras positiva (+) o hebra sentido y negativa (-) o antisentido de ARN.

En el contexto en el presente documento, el termino “aislado” se refiere a un material biologico, tal como un acido nucleico o una protelna, que esta sustancialmente libre de componentes que normalmente acompanan o interactuan con el en su ambiente de origen natural. El material aislado comprende opcionalmente material no encontrado con el material en su amiente natural, por ejemplo, una celula. Por ejemplo, si el material esta en su ambiente natural, tal como una celula, el material se ha colocado en una localization en la celula (por ejemplo, genoma o elemento genetico) no nativo para un material encontrado en el medio. Por ejemplo, un acido nucleico de origen natural (por ejemplo, una secuencia codificante, un promotor, un potenciador, etc.) se vuelve aislado si se introduce por un medio de origen no natural al locus del genoma (por ejemplo, un vector tal como un plasmido o un vector vlrico, o un amplicon) no nativo para ese acido nucleico. Tales acidos nucleicos tambien se denominan acidos nucleicos “heterologos”.

El termino “recombinante” indica que el material (por ejemplo, un acido nucleico o protelna) se ha alterado artificial o sinteticamente (no naturalmente). La alteration puede realizarse en el material dentro, o retirarse de su medio o

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estado natural. Especlficamente, cuando se refiere a un virus, por ejemplo, el virus de la gripe, es recombinante cuando se produce por la expresion de un acido nucleico recombinante.

El termino “reordenacion”, cuando se refiere a un virus, indica que el virus incluye componentes geneticos y/o polipeptldicos derivados de mas de una cepa o fuente vlrica parental. Por ejemplo, una reordenacion 7:1 indica 7 segmentos genomicos vlricos (o segmentos genicos) derivados de un primer virus parental, y un unico segmento genomico vlrico complementario, por ejemplo, que codifica hemaglutinina o neuraminidasa, a partir de un segundo virus parental. Una reordenacion 6:2 incluye 6 segmentos genomicos, mas comunmente los 6 genes internos de un primer virus parental y dos segmentos complementarios, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa, de un virus parental diferente.

El termino “introducido” cuando se refiere a un acido nucleico heterologo o aislado se refiere a la incorporacion de un acido nucleico en una celula eucariota o procariota donde el acido nucleico puede incorporarse en el genoma de la celula (por ejemplo, cromosoma, plasmido, plastido o ADN mitocondrial), convertido en un replicon autonomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado). El termino incluye tales metodos como “infeccion”, “transfeccion”, “transformacion” y “transduccion”. En el contexto de la invencion, puede emplearse diversos metodos para introducir acidos nucleicos en celulas procariotas, incluyendo electroporacion, precipitacion de fosfato calcico, transfeccion mediada por llpidos (lipofeccion), etc.

La frase “celula hospedadora” significa una celula que contiene un acido nucleico heterologo, tal como un vector y soporta la replicacion y/o la expresion del acido nucleico. Las celulas hospedadoras pueden ser celulas procariotas tales como E. coli o celulas eucariotas tales como celulas de levadura, de insecto, de anfibio, de ave o de mamlfero, incluyendo celulas humanas. Las celulas hospedadores a modo de ejemplo en el contexto de la invencion incluyen celulas Vero (rinon de mono africano verde), celulas BHK (rinon de hamster bebe), celulas de rinon de polluelo primario (PKC), celulas de Rinon Canino de Madin Darby (MDCK), celulas de rinon bovino de Madin-Darby (MDBK), celulas 293 (por ejemplo, celulas 293T) y celulas COS (por ejemplo, celulas COS1, COS7).

Virus de la gripe

Las composiciones y los metodos del presente documento se refieren principalmente a la produccion de virus de la gripe para vacunas. Los virus de la gripe estan hechos de un nucleo de ribonucleoprotelna interno que contiene un genoma de ARN de cadena sencilla segmentado y una envuelta de lipoprotelna externa revestida por una protelna de matriz. Los virus de la gripe A y de la gripe B contienen cada uno ocho segmentos de ARN de sentido negativo de cadena sencilla. El genoma de la gripe A codifica once polipeptidos. Los segmentos 1-3 codifican tres polipeptidos, haciendo una ARN polimerasa dependiente de ARN. El segmento 1 codifica la protelna del complejo de la polimerasa PB2. El resto de protelnas de la polimerasa PB1 y PA se codifican por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Ademas, el segmento 1 de algunas cepas de gripe codifica una protelna pequena, PB1-F2, producida a partir de un marco de lectura alternativo dentro de la region que codifica PB1. El segmento 4 codifica la glucoprotelna de superficie hemaglutinina (HA) implicada en la fijacion celular y la entrada durante la infeccion. El segmento 5 codifica el polipeptido de la nucleoprotelna (NP) de la capside, el componente estructural principal asociado al ARN vlrico. El segmento 6 codifica una glucoprotelna de envuelta neuraminidasa (NA). El segmento 7 codifica dos protelnas de la matriz, designadas M1 y M2, que se traducen desde ARNm con corte y empalme diferenciales. El segmento 8 codifica NS1 y NS2, dos protelnas no estructurales que se traducen de variantes alternativamente cortadas y empalmadas de ARNm.

Los ocho segmentos del genoma de la gripe B codifican 11 protelnas. Los tres genes mas largos codifican componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica la protelna HA. El segmento 5 codifica NP. El segmento 6 codifica la protelna NA y la protelna NB. Ambas protelnas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura que solapan de un ARNm biscistronico. El segmento 7 de la gripe B codifica tambien dos protelnas: M1 y M2. El segmento mas pequeno codifica dos productos, NS1 que se traduce a partir del ARN de longitud completa y NS2 que se traduce a partir de una variante de ARNm de corte y empalme.

Vacuna del virus de la gripe

Historicamente, las vacunas del virus de la gripe se han producido principalmente en huevos de gallina embrionados usando cepas de virus seleccionadas basandose en predicciones emplricas de cepas relevantes. Mas recientemente, los virus reordenados se han producido que incorporan antlgenos de hemaglutinina y neuraminidasa seleccionados en el contexto de una cepa maestra sensible a temperatura atenuada aprobada. Siguiendo el cultivo del virus a traves de multiples pasajes en huevos de gallina, los virus de la gripe se recuperan y, opcionalmente, se inactivan, por ejemplo usando formaldehldo y/o p-propiolactona (o alternativamente usados en vacunas atenuadas vivas).

Sin embargo, la produccion de la vacuna de la gripe de esta manera tiene varias preocupaciones importantes. Por ejemplo, los contaminantes que quedan de los huevos de gallina pueden ser altamente antigenicos y/o pirogenos, y pueden resultar frecuentemente en efectos secundarios significativos tras la administracion. De esta manera, otro metodo implica el reemplazamiento de algun porcentaje de los componentes del huevo con medio libre animal. Mas

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importante, las cepas de virus disenadas para la produccion de vacunas deben seleccionarse y distribuirse, normalmente meses antes de la siguiente estacion de gripe para permitir tiempo para la produccion y la inactivacion de la vacuna de la gripe. De nuevo, cualquier mejora en la estabilidad en el tiempo de almacenamiento y/o el almacenamiento a una temperatura mas conveniente (por ejemplo, temperatura de refrigerador de aproximadamente 2-8 °C, por ejemplo, como uso a traves de metodos y composiciones de la presente invencion), son de esta manera bastante deseables.

Los intentos para producir vacunas recombinantes y reordenadas en cultivo celular se han obstaculizado por la incapacidad de alguna de las cepas aprobadas para la produccion de vacunas de crecer eficazmente en condiciones de cultivo celular convencionales. De esta manera, el trabajo anterior por el inventor y sus colaboradores proporciono un sistema vector y metodos para producir virus recombinantes y reordenados en cultivo, haciendo de esta manera posible producir rapidamente vacunas que corresponden a una o muchas cepas antigenicas seleccionadas de virus. Vease, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE.UU. n.° 60/375.675 enviada el 26 de abril, 2002, PCT/US03/12728 enviada el 25 de abril, 2003 y USSN 10/423.828 enviada el 25 de abril, 2003 y PCT/US05/017734 enviada el 20 de mayo, 2005. Por supuesto tales reordenamientos se amplifican ademas opcionalmente en huevos de gallina. Normalmente, los cultivos se mantienen en un sistema, tal como una incubadora de cultivo celular, en humedad y CO2 controlados, a temperatura constante usando un regulador de temperatura, tal como un termostato para asegurar que la temperatura no excede 35 °C. Tal trabajo pionero, as! como la produccion de vacunas distintas, puede optimizarse adicionalmente a traves del uso de la presente invencion completa o en parte.

Los virus de la gripe reordenados pueden obtenerse facilmente introduciendo un subconjunto de vectores que corresponden a segmentos genomicos de un virus de la gripe maestro, en combination con segmentos complementarios derivados de cepas de interes (por ejemplo, variantes antigenicas de interes). Normalmente, las cepas maestras se seleccionan basandose en propiedades deseables relevantes para la administration de vacunas. Por ejemplo, para la produccion de vacunas, por ejemplo, para la produccion de una vacuna atenuada viva, la cepa de virus donante maestro debe seleccionarse para un fenotipo atenuado, adaptation al frlo y/o sensibilidad a la temperatura.

FluMist®

Como se ha mencionado previamente, existen numerosos ejemplos y tipos de virus de la gripe. Una vacuna de la gripe a modo de ejemplo es FluMist que es una vacuna viva, atenuada que protege a ninos y adultos de la enfermedad de la gripe (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. Engl. J. Med. 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). En realizaciones tlpicas, los metodos y las composiciones de la presente invencion se adaptan preferentemente a, o se usan con, la produccion de la vacuna FluMist. Sin embargo se apreciara por aquellos expertos en la materia que las etapas/composiciones en el presente documento tambien son adaptables a la produccion de vacunas vlricas similares o incluso diferentes y sus composiciones.

Las cepas de la vacuna FluMist contienen, por ejemplo, segmentos genicos HA y NA derivados de las cepas de tipo silvestre a las que la vacuna se dirige junto con seis segmentos genicos, PB1, PB2, PA, NP, M y NS, a partir de un virus donante maestro comun (MDV). El MDV para las cepas de gripe A de FluMist (MDV-A) se creo por el pasaje en serie de la cepa de tipo silvestre A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) en cultivo de tejido de rinon de pollo primario a temperaturas sucesivamente mas bajas (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4). El MDV-A se replica eficazmente a 25 °C (ca, adaptado al frlo) pero su crecimiento se restringe a 38 y 39 °C (ts, sensible a temperatura. Adicionalmente, este virus no se replica en los pulmones de hurones infectados (att., atenuacion). Este fenotipo ts se cree que contribuye a la atenuacion de la vacuna en humanos restringiendo su replication en todas pero en las regiones mas frlas del tracto respiratorio. La estabilidad de esta propiedad se ha demostrado en modelos animales y estudios cllnicos. Por el contrario al fenotipo ts de las cepas de la gripe creadas por mutagenesis qulmica, la propiedad ts del MDV-A no revierte despues del paso a traves de hamsteres infectados o en cobertizos aislados de ninos (para una revision reciente, vease Murphy & Coelingh (2002) Principles underling the development and use of live attenuated cold adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol. 15:295-323).

Los estudios cllnicos en mas de 20.000 adultos y ninos que implican 12 cepas separadas 6:2 cepas reordenadas han demostrado que estas vacunas estan atenuadas, seguras y eficientes (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. Engl. J. Med. 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J. Infect. Dis. 169:68-76 ; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). Los reordenados que llevan a cabo los seis genes internos del MDV-A y los dos segmentos genicos HA y NA de un virus tipo silvestre (es decir, un reordenado 6:2) mantiene consistentemente los fenotipos ca, ts y att (Maassab et al. (1982) Evaluation of a coldrecombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect. Dis.

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146:780-900). La production de tales virus reordenados que usan cepas B de la gripe enteramente de virus de la gripe B de ADNc clonado y los metodos para la produccion de virus de la gripe A y B vivos atenuados son adecuados para formulaciones de vacuna, tales como formulaciones de vacuna vivas utiles para administration intranasal.

Para trabajo reciente, vease, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE.UU. n.° 60/375.675 enviada el 26 de abril, 2002, PCT/US03/12728 enviada el 25 de abril, 2003 y USSN 10/423.828 enviada el 25 de abril, 2003 y PCT/US05/017734 enviada el 20 de mayo, 2005 han demostrado un sistema de ocho plasmidos para la generation del virus de la gripe B enteramente a partir de ADNc clonado y metodos para la produccion de virus de la gripe A y B adecuados para formulaciones de vacuna, tales como formulaciones de vacuna de virus vivos utiles para administracion intranasal.

El sistema y los metodos descritos previamente son utiles para la rapida produccion en cultivo celular de virus de la gripe A y B recombinantes y reordenados, incluyendo virus adecuados para su uso como vacunas, incluyendo vacunas atenuadas vivas, tales como vacunas adecuadas para administracion intranasal tales como FluMist®. Los metodos de la presente invention en el presente documento, se usan opcionalmente junto con o en combination con tal implication de trabajo previa, por ejemplo, virus de la gripe reordenados para la produccion de vacunas para producir virus para vacunas de una manera mas estable, consistente y productiva.

Cultivo celular

Como se ha citado previamente, el virus de la gripe puede crecerse opcionalmente en cultivo. Normalmente, la propagation del virus se logra en las composiciones del medio en los que la celula hospedadora se cultiva comunmente. Las celulas hospedadoras adecuadas para la replication del virus de la gripe incluyen, por ejemplo, celulas Vero, celulas BHK, celulas MDCK, celulas 293 y celulas COS, celulas incluyendo 293T, celulas COS7. Comunmente, los co-cultivos incluyendo dos de las anteriores llneas celulares, por ejemplo, celulas MDCK y bien celulas 293T o bien COS se emplean en una relation por ejemplo de 1:1, para mejorar la eficiencia de replicacion. Normalmente, las celulas se cultivan en un medio de cultivo comercial convencional, tal como medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero (por ejemplo, suero bovino fetal al 10 %), o en medio libre de suero, con humedad controlada y concentration de CO2 adecuada para mantener pH tamponado neutro (por ejemplo, a pH entre 7,0 y 7,2). Opcionalmente, el medio contiene antibioticos para prevenir el crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, etc. y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato sodico, aminoacidos no esenciales, suplementos adicionales para promover caracterlsticas de crecimiento favorables, por ejemplo, tripsina, p-mercaptoetanol y similares.

Los procedimientos para mantener celulas de mamlferos en cultivo se han informado extensivamente, y se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Los protocolos generales se proporcionan, por ejemplo, en Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyCell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam. Los detalles adicionales con respecto a los procedimientos de cultivo celular de interes particular en la produccion de virus de la gripe in vitro incluyen, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation in Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Adicionalmente, las variaciones en tales procedimientos adaptados a la presente invencion se determinan facilmente a traves de experimentation rutinaria y seran familiares para aquellos expertos en la materia.

En una realization especlfica de la invencion, las celulas hospedadoras de la invencion se cultivan y/o se infectan en condiciones libres de suero, en presencia o ausencia de tripsina, y se cultivan y/o infectan a temperaturas que varlan de 30 grados Celsius to 39 grados Celsius; o 30 grados Celsius, o 31 grados Celsius, 32 grados Celsius, 33 grados Celsius, 34 grados Celsius, 35 grados Celsius, 36 grados Celsius, 37 grados Celsius, 38 grados Celsius, o 39 grados Celsius.

Las celulas para la produccion del virus de la gripe pueden cultivarse en medio que contiene suero o medio libre de suero. En algunos casos, por ejemplo, para la preparation de virus purificados, es normalmente deseable crecer las celulas hospedadoras en condiciones libres de suero. Las celulas pueden cultivarse a pequena escala, por ejemplo, menos de 25 ml de medio, en tubos de cultivo o matraces o en grandes matraces con agitation, en botellas rotatorias o en perlas de microvehlculo (por ejemplo, perlas de microvehlculo DEAE-Dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; perlas de copollmero de estireno y trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en cultivos en botellas, matraces o reactores. Las perlas de microvehlculo son pequenas esferas (en el intervalo de 100-200 micrometres de diametro) que proporcionan una gran area superficial para el crecimiento de celulas adherentes por volumen de cultivo celular. Por ejemplo un lecho unico de medio puede incluir mas de 20 millones de perlas de microvehlculo proporcionando mas de 8000 centimetres cuadrados de superficie de crecimiento. Para la produccion comercial de virus, por ejemplo para la produccion de vacunas, es normalmente deseable cultivar las celulas en un biorreactor o un fermentador. Los bioreactores estan disponibles en volumenes de por debajo de 1 litro a un exceso de 100 litros, por ejemplo, Biorreactor Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); bioreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); biorreactores a escala de laboratorio y comercial

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de B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania).

Independientemente del volumen del cultivo, en muchos aspectos deseados de la presente invencion, es importante que los cultivos se mantengan a una temperatura apropiada, para asegurar la recuperacion eficaz del virus de la gripe recombinante y/o reordenado usando sistemas multi plasmidos dependientes de temperatura (vease, por ejemplo, Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus, citado anteriormente), calentamiento de soluciones vlricas para filtracion, etc. Normalmente, un regulador, por ejemplo, un termostato, u otro dispositivo para sentir y mantener la temperatura del sistema de cultivo celular y/u otra solucion se emplea para asegurar que la temperatura esta al nivel correcto durante el periodo apropiado (por ejemplo, replicacion del virus, etc.).

En algunos metodos (por ejemplo, en los que los virus reordenados han de producirse a partir de segmentos en vectores) los vectores que comprenden segmentos del genoma de la gripe se introducen en celulas hospedadoras de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica para introducir acidos nucleicos heterologos en celulas eucariotas, incluyendo, por ejemplo, co-precipitacion de fosfato calcico, electroporacion, microinyeccion, lipofeccion y transfeccion empleando reactivos de transfeccion de poliamina. Por ejemplo, los vectores, por ejemplo, plasmidos, pueden transfectarse en celulas hospedadoras, tales como celulas COS, celulas 293T o combinaciones de COS o 293T y celulas MDCK, usando el reactivo de transfeccion de poliamina TransIT-LTI (Mirus) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para producir virus reordenados, etc. Aproximadamente 1 pg de cada vector a introducirse en la poblacion de celulas hospedadoras con aproximadamente 2 pl de TransIT-LT1 diluido en 160 pl de medio, preferentemente medio libre de suero, en un volumen total de 200 pl. Las mezclas de reactivo de transfeccion de ADN se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos seguido de la adicion de 800 pl de medio. La mezcla de transfeccion se anade a las celulas hospedadoras y las celulas se cultivan como se describe anteriormente o a traves de otros metodos bien conocidos por aquellos expertos en la materia. En consecuencia, para la production de virus recombinantes o reorganizados en cultivo celular, los vectores que incorporan cada uno de los 8 segmentos de genoma (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) se mezclan con aproximadamente 20 pl de TransIT-LT1 y se transfectan en celulas hospedadoras. Opcionalmente, el medio que contiene suero se reemplaza antes de la transfeccion con medio libre de suero, por ejemplo, Opta-MEM I y se incuba durante 4-6 horas.

Alternativamente, la electroporacion puede emplearse para introducir tales vectores que incorporan segmentos del genoma de la gripe en celulas hospedadoras. Por ejemplo, los vectores plasmldicos que incorporan un virus de la gripe A o de la gripe B se introducen favorablemente en las celulas Vero usando electroporacion de acuerdo con el siguiente procedimiento. En breve aproximadamente 5 x 106 celulas Vero, por ejemplo, crecidas en medio de Eagle modificado (MEM) suplementado con Suero bobino fetal (FBS) al 10 % se resuspenden en 0,4 ml de OptiMEM y se coloca en una cubeta de electroporacion. Se anaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 pl, que despues se mezcla despacio tapando. La electroporacion se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, BioRad Gene Pulser II con Capacitance Extender Plus conectado) a 300 voltios, 950 microFaradios con un tiempo constante de entre 28-33 ms. Las celulas se remezclan agitando suavemente y aproximadamente 1-2 minutos despues de la electroporacion, se anade directamente a la cubeta 0,7 ml de MEM con FBS al 10 %. Las celulas se transfieren despues a dos pocillos de un cultivo tisular convencional de 6 pocillos que contienen 2 ml MEM, 10 % FBS. La cubeta se lava para recuperar cualquier celula que quede y la suspension de lavado se divide entre los dos pocillos. El volumen final es aproximadamente 3,5 ml. Las celulas se incuban despues en condiciones permisivas para el crecimiento vlrico, por ejemplo a aproximadamente 33 °C para cepas adaptadas al frlo. Vease, por ejemplo, el documento US20050158342.

Kits

Para facilitar el uso de los metodos y las composiciones de la invencion, cualquiera de los componentes y/o composiciones de vacuna, por ejemplo, virus en diversas formulaciones etc., y componentes adicionales tales como tampon, celulas, medio de cultivo, utiles para envasar e infectar los virus de la gripe para fines de vacuna experimental o terapeutica, pueden envasarse en forma de un kit. Normalmente el kit contiene, ademas de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para realizar los metodos de la invencion, envasado del material y un recipiente.

Ejemplo 1

Desarrollo de FluMist liquido

Un total de 19 lotes monovalentes de virus se iniciaron bajo protocolo, incluyendo cuatro lotes de desarrollo (CB0006H, CB0008H, CG0017H, CB0018H y CB0019H). Los lotes CB0018H y CB0019H se dirigieron a suministrar material para diversos estudios y no se analizan adicionalmente en la presente solicitud. Dos lotes (CB00180H y CB0012H) se combinaron despues de la etapa de ultra-centrlfuga para producir un lote monovalente A/SIdney CB0020H. Cada lote se inicio con aproximadamente 2000 huevos.

Las condiciones de manejo de incubation de los huevos se establecieron similares al proceso usado para la produccion de FluMist congelado, sin embargo, la inoculation manual y la cosecha se usaron debido a la escala mas pequena, etc. El proceso de ultracentrlfuga se escalo a un equipo mas pequeno fabricado por el mismo fabricante

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(Discorvery 90, fabricado por Hitachi y comercializado por Sorvall/heraus) con un rotor modelo P32CT que tiene aproximadamente 470 ml de capacidad total. La cosecha de virus estabilizada clarificada se cargo sobre un gradiente de sacarosa del 20 % al 60 %, se bandeo durante una hora a 32.000 rpm y eluyo en fracciones de 20 ml. Las fracciones que contenlan niveles pico de HA se hicieron conjunto, se diluyeron a una concentracion de sacarosa de 0,2 M, se filtraron a traves de un filtro de 0,2 micrometros y despues se transfirio a bolsas de pollmero flexibles de 250 ml (Stedim) que se congelaron y se mantuvieron por debajo de -60 °C para fabricacion adicional.

Despues de una corta serie de ejecuciones de ensayo, se inicio la fabricacion de cGMP para soportar el ensayo cllnico adicional de FluMist llquido. Se fabricaron de nuevo A/Beijing/262/95 (H1N1) y A/Sldney/05/97 (H3N2) y la cepa B se cambio a B/Yamanashi/166/98. Los lotes monovalentes producidos se congelaron y se enviaron para mezclar, cargar y envasar. Por supuesto, se apreciara en este punto y a lo largo de todo, que el uso de cepas particulares (por ejemplo, Beijing, etc.) no debe tomarse necesariamente como limitante salvo que se indique especlficamente que lo sea. De esta manera, por ejemplo, los metodos y formulaciones en el presente documento pueden usar opcionalmente diferentes cepas cada estacion de gripe para producir diferentes composiciones de RTS, etc.

Desarrollo y Ensayos cifnicos

El proceso para las composiciones llquidas se desarrollo e incluyo lotes monovalentes CAZ001-024 y CAZ035-043. La materia cllnica de ensayo (CTM) incluyo lotes monovalentes de CAZ025-CAZ034.

El proceso de fabricacion de FluMist llquido desarrollado y usado para CTM-1 se divide en seis fases de proceso a continuacion. Las fases de proceso 1 a 5 se definieron para conectar las etapas mayores de proceso ya que se llevaron a cabo usando documentos de instruccion de fabricacion separados. La fase 6 incluye la mezcla el proceso entero de mezcla y carga. Se apreciara que tales fases pueden compararse a groso modo en con las etapas generalizadas indicadas a continuacion para la fabricacion/produccion de composiciones de vacuna en general.

Fases

Fase 1: recepcion y saneado de los huevos SPF; Fase 2: produccion de cosecha de virus; Fase 3: concentracion de virus por centrifugacion zonal; Fase 4: agrupacion y dilucion de fracciones pico; Fase 5: filtracion esteril y almacenamiento de lote monovalente; y Fase 6: mezcla y carga

Un diagrama de flujo de proceso para la produccion de lote monovalente de CTM-1 se muestra en la Figura 1. El flujo de proceso de mezcla y carga se muestra en la Figura 2.

Recepcion y saneado de huevos SPF

Se obtuvieron huevos embrionados libres de patogenos especlficos (SPF) se obtuvieron de SPAFAS, Inc. que utiliza el manejo de floculacion programas de supervivencia disenados para proporcionar aseguracion adecuada de huevos libres de enfermedades. Los huevos se usaron en los Estados Unidos y se sanearon usando pulverizadores Clorwash y Quat 800. Los huevos se transportaron despues por aire y carretera usando envase suficiente para mantener limpieza y evitar el congelamiento o el sobrecalentamiento. Tras la recepcion, los huevos fertiles frlos se inspeccionaron y se almacenaron en una unidad de incubacion SPF a 14 °C +/- 2 °C con un 60-80 % de humedad relativa (HR) durante un maximo de 7 dlas. Los huevos se transfirieron a bandejas dese los cartones suministrados por el vendedor y un numero de lote asignado. Los huevos se colocaron en bandejas Jamesway de 36 huevos y las superficies de la cascara de huevo se sanearon con Clorwash y Quat 800 en un sistema de saneado de huevos automatizados para minimizar la carga biologica antes de clocarlos en la incubadora. Se preparo clorwash a un intervalo de 43-44 °C y 48-49 °C y se preparo Quat 800 a un intervalo de 48-49 °C y se preparo Quat 800 a un intervalo de 48-49 °C. Despues del saneamiento, los huevos se colocaron en maletas y se secaron al aire a temperatura ambiente durante no menos de 2 horas. Los huevos se colocaron despues en una Incubadora Buckeye y se incubaron a 37,5 °C +/- 1 °C con un 60-80 % de HR durante 264 horas +/- 12 horas. Despues de la incubacion, los huevos SPF se transfirieron desde la unidad de huevos SPF a un area de velado. Usando una lampara de fibra optica, la posicion del saco de aire se localizo en cada huevo. Los huevos muertos o infertiles se descartaron, y los huevos fertiles se marcaron para inoculacion.

Produccion de cosechas viricas

La superficie de los huevos fertiles se saneo con esplritus metilados industriales (IMS) al 70 % antes de la inoculacion y despues se transfirio para inoculacion de masa. En la preparacion de la semilla vlrica de trabajo del fabricante (MWVS), las semillas viricas maestras se usaron para producir la MWVS para las pruebas cllnicas de fase 1 se produjeron usando el metodo de reordenacion clasico. El MWVS se transfirio en el AVU y se prepararon diluciones en serie del MWVS descongelado en solucion salina tamponada con fosfato 0,01 M esteril, pH 7,7 dentro de una cabina de seguridad microbiologica usando una pipeta desechable esteril para cada transferencia. La inoculacion ocurrio en flujo laminar en una habitacion de clase 10.000 usando una maquina de inoculacion Bibby semi-automatica, que penetra e inocula 36 huevos por bandeja. El tltulo diana para el inoculo fue log10 2,1 TCID50

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por 0,1 ml y la dilucion se calculo a partir de la titulacion predeterminada de MWVS. La preparacion de cada inoculo de virus se completo en 2 horas de la retirada del vial del congelador. Las alicuotas del inoculo se almacenaron a 5 +/- 3 °C hasta el uso. El inoculo se uso en 8 horas de la preparacion.

Inoculacion de huevos SPF

Cada bandeja de huevos se suministro a mano en la maquina de inoculacion Bibby automatizada. Se uso un punzo para perforar la cascara y penetrar en el huevo a una profundidad ajustable preestablecida. Las agujas de inoculacion se extendieron hacia el huevo y la bomba de dosificacion envio 0,1 ml del inoculo de MWVS en cada huevo despues de lo que se extrajo el punzon. Siguiendo la inoculacion, la bandeja de huevos se retiro por un operador y el proceso se repitio con una nueva bandeja de huevos. Los huevos inoculados con CAIV se incubaron a 33 +/- 1 °C durante un tiempo determinado por la curva de crecimiento de la cepa de virus. Despues de la incubacion, los huevos embrionados SPF se enfriaron a 28 °C durante 18+/- 6 horas. Al final del enfriado, los huevos se transfirieron para la etapa de cosecha.

Concentracion de virus por centrifugacion zonal

Cosecha de virus (VH)

Los huevos se cosecharon con una maquina de cosecha automatica (Bibby). Las bandejas se suministraron a mano a una estacion de decapitacion donde la seccion superior de la cascara de huevo se retiro para crear un agujero de acceso para la entrada de la aguja de cosecha. Los huevos se inspeccionaron visualmente antes de la cosecha y los huevos inadecuados (por ejemplo, descolorados) se rechazaron. Los huevos aceptables avanzaron a una solucion de cosecha, donde se extrajo fluido alantoico usando agujas y succion proporcionada por un sistema de vacio. La cosecha se recogio mezclada en un recipiente de acero inoxidable con camisa de 100 l con una temperatura de camisa de 2-8 °C. Las muestras de los virus cosechadas se recogieron del conjunto VH y se ensayaron para: potencia (TCID50), seguridad, leucosis aviar, M. tuberculosis, micoplasma, virus extrano, identidad, ensayo de la transcriptasa reversa, genotipo del virus, fenotipo del virus y atenuacion.

Estabilizacion y clarification

La cosecha de virus conjunta (VH) se estabilizo inmediatamente a 2-8 °C a una concentracion final de sacarosa 0,2 M, fosfato 0,01 M, glutamato 0,005 M (SPG), con SPG 10X (9 partes VH por 1 parte SPG 10X). Las muestras se recogieron para potencia y carga biologica antes de la clarificacion. La cosecha de virus estabilizada se clarifico por una filtration de profundidad 5 pm para retirar particulas antes de la purification por centrifugacion de flujo continuo de alta velocidad. La cosecha de virus clarificada se muestreo para la potencia.

Centrifugacion zonal, recogida y ensayo HA de fracciones pico

Antes de su uso, el rotor de centrifuga se saneo con una dilucion 1:20 de solucion de formaldehido concentrada. El VH clarificado se cargo sobre un gradiente de sacarosa (sacarosa al 10-60 % en tampon fosfato, pH 7,2) para centrifugacion continua de alta velocidad usando una centrifuga zonal Hitachi CP40Y. El gradiente se formo por adicion a la centrifuga de una solucion de sacarosa al 60 % seguido de una solucion de sacarosa al 10 % en tampon fosfato. La velocidad de la centrifuga se ajusto a 4.000 rpm durante 20 minutos para permitir que las soluciones de sacarosa formen un gradiente de densidad. La temperatura de la centrifuga se ajusto a 2-8 °C durante la formation del gradiente. Despues de la formacion del gradiente, se inicio el flujo de tampon y la velocidad del rotor se aumento a 40.000 rpm, antes de que la VH clarificada se cargara sobre el gradiente a una velocidad de 20 l por hora a 40.000 rpm. Para un lote tipico de CTM-1 con 10.000 huevos cosechados y 6 ml/huevo, la duration de la etapa de carga fue aproximadamente tres horas. Siguiendo la carga de la VH clarificada, la centrifugacion se continuo a 40.000 rpm durante una hora adicional para permitir al virus bandear. Las particulas del virus migraron a la portion de sacarosa del 38-45 % del gradiente y se concentro en una “banda”. Al final de esta etapa, la centrifuga se ralentizo gradualmente y despues se paro para permitir la coleccion de los picos de virus. Se recogieron 100 ml de fracciones en flujo laminar en 125 ml de botellas de policarbonato esteriles. Las fracciones se mantuvieron a 2-8 °C durante aproximadamente 1 hora mientras que las fracciones se ensayaron para actividad HA. Las fracciones pico se encontraron normalmente entre 38-45 % del gradiente de sacarosa.

Conjunto y dilucion de fracciones pico

Las fracciones pico de centrifuga, como se identifica por el ensayo HA, se juntaron bajo una capucha de flujo laminar vertiendo asepticamente las fracciones en una botella de vidrio esteril y se mezcla por remolino. El indice refractario (RI) se leyo para determinar la concentracion de sacarosa y el conjunto se muestreo para la potencia. El conjunto de fraction pico de centrifuga (CP) se diluyo anadiendo asepticamente un volumen calculado de tampon fosfato- glutamato (2-8 °C) frio esteril, pH 7,2 (tampon PBG) a una concentracion final de 0,2 M de sacarosa, 0,1 M de fosfato y 0,005 M de glutamato. Esto fue normalmente una dilucion 1:6. El conjunto de fraccion pico de centrifuga diluido (DCP) se muestreo para potencia y carga biologica.

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Filtration esteril y almacenaje de lote monovalente

El DCP se bombeo a traves del tubo esteril a una habitacion de carga de Clase 100 para la filtracion esteril. El DCP se filtro esteril con un filtro de 0,22 pm en una botella de vidrio esteril de 5 l en una capucha de flujo de aire laminar. El lote monovalente filtrado se mezclo y se muestreo para potencia, identidad y ensayo de esterilidad. El filtro de 0,22 pm se ensayo para integridad antes y despues del proceso de filtracion. El MB se alicuoto despues en botellas de policarbonato de un lecho. El MB se recogio en allcuotas de 500 ml con un volumen total de tres a cuatro litros. Las botellas esteriles de un lecho de PC se almacenaron a -60 °C o por debajo. El tltulo de los virus de lote se determino por ensayo TCID50. El lote monovalente despues se envio a <-60 °C para mezclar y ensayar.

Mezcla y carga

Las etapas principales para el proceso de mezcla y carga de la preparation de la mezcla trivalente fueron: Descongelado, preparacion del diluyente, mezcla, carga y envasado.

Descongelacion y mezcla

La 1 botella apropiada de lote monovalente se retiro del almacenamiento congelado (<60 °C para MB) y se transfirio a una habitacion de descongelado. Las cantidades requeridas de los tres lotes monovalentes individuales y el diluyente SPG se calcularon basandose en la titulacion de infectividad y la resistencia a la formulation requerida. Las botellas de MB se cargaron en un bano de agua de 33 ± 3 °C y se agito manualmente cada cinco minutos. El descongelado se monitorizo visualmente para asegurar que todas las botellas se hablan descongelado antes de dejar el bano de agua y que todas las botellas descongeladas se retiraron cada 15 minutos. Una vez descongeladas, las botellas de MB se movieron a un refrigerador a 5 ± 3 °C y se mantuvo hasta que todas las botellas requeridas se hablan descongelado.

El diluyente glutamato fosfato de sacarosa esteril (SPG) se fabrico por BioWhittaker (Walkersville, MD). Justo antes de la fabrication del llquido FluMist mezclado, aproximadamente un tercio de la cantidad de diluyente SPG requerida para la mezcla se anadio a una botella de 2 l esteril. La botella se calento a temperatura ambiente, despues se anadio gelatina de porcino hidrolizada (polvo) en la cantidad necesaria para alcanzar un nivel de 10 mg/ml en la mezcla final. El diluyente SPG se paso despues a traves del filtro (lavando a traves de cualquier gelatina residual) para alcanzar el volumen diana especificado en el calculo de la mezcla y almacenado a 5 ± 3 °C hasta el uso.

Las botellas descongeladas se movieron a una habitacion de mezcla y se transfirieron asepticamente los virus a un recipiente de proceso de vidrio de 5 l. El recipiente se mantuvo a 5 ± 3 °C a traves de todo el proceso de mezcla y el posterior proceso de carga usando envases frlos refrigerados. El diluyente SPG-gelatina se anadio despues de que se hubieran anadido las tres cepas de virus y, si fuera necesario, el pH se ajusto con HCl a 7,2 ± 0,3. Las tres cepas de virus y el diluyente se mezclaron por mezcla continua con una barra de agitation magnetica y una placa de agitation.

Carga y envasado

Siguiendo al ajuste de pH, el recipiente de mezcla de reaction trivalente en lote se movio a una habitacion de carga y se conecto a un cargador INOVA. La maquina de carga INOVA cargo un volumen preajustado de volumen de producto en una fila de ocho pulverizadores desechables BD HYPAK y despues se taparon los pulverizadores. Las funciones de carga y tapado de los pulverizadores y las comprobaciones de verification del peso continuaron como se dirigio. Un nuevo tubo de pulverizadores se coloco manualmente en las estaciones de suministro tras completarse cada ciclo de carga y el tubo de los pulverizadores cargados se retiro a la estacion de descarga. El recipiente de mezcla se mantuvo a 5 ± 3 °C con envases frlos durante el proceso de carga.

Siguiendo la carga de los pulverizadores nasales, las vacunas trivalentes cargadas se cargaron en tubos e inmediatamente se transportaron a traves de un carro a un area de envasado para el empaquetado y el etiquetado finales. Los pulverizadores empaquetados y etiquetados se almacenaron a 5 ± 3 °C.

Optimization de parametros de funcionamiento aguas arriba

Clarification de cosecha por filtracion (5 pm)

Filtracion frente a centrifugation a baja velocidad: las perdidas de potencia de clarificacion usando la centrifugation a baja velocidad convencional para FluMist congelado se estiman normalmente a 0,2 a 0,3 log1o TCID50/ml. Una perdida de centrifugacion estimada para dos cepas fue: la perdida de titulacion fue despreciable para una cepa y 0,3 logs (59 % de etapa de rendimiento) para una segunda cepa usando las condiciones convencionales de 3400 g durante 20 minutos. Cuando se uso un filtro de profundidad de 5 micrometres se uso como una alternativa a la centrifugacion durante las ejecuciones de desarrollo pre-CTM, el rendimiento se estimo al 41 %. Cuando el ensayo de variabilidad TCID50 se tomo en consideration, se concluyo que bien el metodo de clarificacion proporciono mejores resultados que anadirlos despues de la clarificacion. La filtracion se eligio como el metodo de clarificacion

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basado en la facilidad de operacion y escalabilidad.

Comparacion de tamanos de poro del filtro de profundidad: Los lotes de desarrollo CAZ015 - CAZ017 mas los lotes CTM-1 CAZ025 a CAZ034 se usaron para estimar las perdidas de filtracion de profundidad usando el proceso CTM- 1. A/Beijing, A/SIdney y B/Harbin tienen rendimientos de etapa del 147 %, 78 % y 73 % respectivamente para la etapa de clarificacion de 5 pm.

El filtro de 5 pm (Pall PRofile II) se comparo con un filtro de profundidad de 20 pm (Pall Profile Star), que se uso para los lotes CAZ035 (A/SIdney), CAZ036 (A/Beijing) y CAZ037 (B/Harbin). A/Beijing, A/SIdney y B/Harbin tuvieron rendimientos de etapa de clarificacion del 65 %, 35 % y 209 % respectivamente para la etapa de clarificacion de 20 pm. Estos rendimientos fueron comparables a los resultados de clarificacion de 5 pm, sin embargo, un cambio en el proceso del filtro de 20 pm no se recomendo para todas las realizaciones debido a la contaminacion significativa de las cosechas clarificadas por las celulas sangulneas rojas cuando se uso un tamano de poro mas grande.

Optimizacion de parametros de funcionamiento aguas abajo:

Escala de centrifuga

La carga de centrifuga y los estudios de temperatura se realizaron usando la centrifuga CP40Y a gran escala y un rotor de flujo continuo RP40CT tipo D; estos compararon diversos tamanos de lotes de huevo y los puntos de ajuste de temperaturas (vease la Figura 3). CA0Z15 (B/Harbin), CAZ018 (A/Sidney), CAZ020 (A/Beijing) y CAZ022 (A/Sidney) tuvo tamanos de lote de 10K huevos y una temperatura de ajuste de centrifuga de 4 °C. CAZ 016 (B/Harbin), CAZ019 (A/Sidney), y CAZ021 (A/Beijing) tuvieron tamanos de lote de 20K huevos y una temperatura de ajuste de centrifuga de 14 °C. Se uso una tasa de flujo de carga de 20 l/h para todos los estudios. El porcentaje de recuperacion en el conjunto de fraccion pico diluida (rendimiento de etapa) se baso en el titulo de cosecha clarificado en la figura. Como puede verse, los lotes con lotes de 10k huevos tuvieron un intervalo de recuperacion de 40 - 184 % mientras que los lotes de 20K huevos tuvieron recuperaciones promedias de 46 %. Un tamano de lote de 10.000 huevos por funcionamiento se selecciono para la fabricacion de CTM como limite conservador en una etapa del proceso de desarrollo.

Temperatura

El desarrollo de las ejecuciones CAZ015 a CAZ022 se realizaron usando temperaturas de punto de ajuste de rotor de ultracentrifuga de bien 4 °C o 14 °C. Con una excepcion, el desarrollo funciona a 14 °C tambien funcionaron a escala mas grande que al tipica (20.000 huevos por lote). En general los lotes tuvieron menores recuperaciones del virus vivo, sin embargo esto podria deberse a carga de centrifuga en lugar de los efectos de temperatura. En vista de los mejores resultados a 4 °C y la posibilidad de tasas de crecimiento microbiano aumentado a mayores temperaturas, se selecciono una temperatura de 4 °C como el punto de ajuste de la temperatura de ultracentrifuga en este punto en el desarrollo del proceso.

Prueba clinica 1 (CTM-1)

Los lotes de virus monovalente para CTM-1 se produjeron y se incluyeron lotes monovalentes de CAZ025 a CAZ034. El ensayo en el proceso QC para los lotes monovalentes CTM-1 se presentan en la Figura 3 y en el presente documento. Los rendimientos de etapa promedio por cepa se presentan en la Figura 3 y en el presente documento. Los resultados se resumen a continuacion.

Potencia: Las potencias (log1o TCID50ml) de los virus B/Harbin y A/Beijing de los lotes de cosecha fueron iguales o mayores de 8,1. A/Sidney vario de 7,5 a 8,8 excepto para CAZ030, que mostro un titulo muy bajo (6,0) debido a la contaminacion de la yema en la cosecha. La titulacion del lote monovalente para A/Beijing fue 9,3 o superior, para B/Harbin el titulo vario de 8,4 a 9,85 y para A/Sidney vario de 7,9 a 8,6 (excluyendo CAZ030). Para CAZ030 el titulo estuvo por debajo del nivel aceptable para mezclar como se analiza a continuacion.

Rendimiento del proceso: los rendimientos de proceso para cada lote se hacen referencia en las Figuras y se analizan ademas en el presente documento. Los rendimientos del proceso no se corrigieron para perdidas de muestra. A/Beijing tuvo un rendimiento de proceso global promedio del 16 % (163 dosis/huevo), A/Sidney tuvo un rendimiento promedio del 13 % (6 dosis/huevo) y B/Harbin tuvo un rendimiento promedio del 93 % (86 dosis/huevo). Vease las figuras. El rendimiento erratico estima una variabilidad de ensayo de reflejo asi como el rendimiento de proceso real. En particular, los resultados de B/Harbin fueron hacia arriba por un estimado muy alto de lote CAZ028 de titulacion de lote monovalente (resultando en un rendimiento de proceso estimado del 252 % y 246 dosis/huevo. La titulacion pico de conjunto diluida en este caso se determino a 0,95 logaritmos mayor que el pico de centrifuga conjunto, aunque se esperaria una disminucion debido a la dilucion. Igualmente la titulacion del lote monovalente filtrado fue mayor que el material prefiltrado, que puede contar para la variabilidad de ensayo. Los otros dos lotes de B/Harbin (CAZ026 y CAZ027) tuvieron rendimientos de proceso del 20 % y el 8 % respectivamente y un rendimiento de huevo de 7 dosis/huevo para ambos lotes. Las mezclas trivalentes que incluyeron el lote CAZ028 (CBF1004 y CBF1007) resultaron en potencias B/Harbin en pulverizadores de producto final que fueron 0,6 y 0,4 log10 TCID50

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por dosis. Esto sugiere ademas que la titulacion del lote monovalente CAZ028 se sobreestimo.

Carga biologica y endotoxina: la cosecha vlrica, la cosecha estabilizada y las fracciones pico de centrlfuga diluidas se ensayaron para la carga biologica. Los resultados de ensayo de la carga biologica no dan una imagen clara de cargas de organismo a traves del proceso: los resultados de ensayo en la cosecha vlrica y las muestras de las fracciones pico de centrlfuga diluidas consistlan principalmente en “ninguno detectado” (ocho lecturas); o “>100 ufc/ml” (diez lecturas) con solamente dos valores intermedios. Los valores de endotoxinas para los lotes monovalentes variaron de <5 EU/ml a 587 EU/ml.

Concentracion de sacarosa. Las fracciones pico de centrlfuga diluidas tenlan concentraciones de sacarosa que varlan del 39 al 43,5 % (CAZ030 no se incluyo en el intervalo). Los lotes monovalentes tenlan una concentracion de sacarosa promedio del 7,6 %.

Los resultados de la prueba de liberacion de lote monovalente se presentan en las figuras. Todos los lotes CTM-1 excepto CAZ030 (que no se ensayo) pasaron los ensayos de liberacion de lote.

Analisis SDS-PAGE: los lotes monovalentes se caracterizaron ademas por geles SDS-PAGE al 10 % con Gel Code Blue. Basado en los pesos moleculares proteicos calculados y el numero de copias por partlcula para las cepas de gripe A y B, las bandas de gel en la region de 50-60 kDa (protelna HA1), 56 kDa (protelna NP) y 27 kDa (protelna (M1) se esperarla ser geles prominentes del virus de la gripe purificados. Tambien podrla estar presente la protelna Ha2 (23 a 30 kDa).

Se compararon los geles SDS-PAGE para A/Beijing/262/95 CAZ031, y 33 y A/Sldney/05/97 CAZ029, 30, y 34. El intervalo de resolucion para los geles al 10 % fue nominalmente 200-31 kDa. Debido a esta limitacion, la interpretacion de las bandas de la protelna HA1 (23-30 kDa) y de protelna M (21-27 kDa) debe realizarse con precaucion.

Para los lotes monovalentes (MB) A/Beijing y A/SIdney, se observo una banda oscura en la region esperada de la protelna NP (justo por encima del marcador de 55 kDa) para las muestras de A/Beijing, y se vio justo por encima una banda de 116 kDa para ambas cepas. Ambas cepas contenlan una banda cerca del frente del gel (por debajo de 31 kDa) coherente con la protelna M. La banda HA1 esperada en o justo por encima del marcador de 66 kDa fue menos fuerte, posiblemente debido a la heterogeneidad en el peso molecular de glucoprotelna resultando en un patron de bandas mas dispersado. La tincion de la protelna NP1 putativa tambien parece disminuirse. Ara las muestras de A/SIdney se observo una variedad de bandas mayor, consistente con una mayor proporcion de protelna de huevo en el lote monovalente.

Dosis por lote y huevo: el calculo de dosis para las tres cepas se baso en un volumen de carga promedio de 0,24 ml que contiene 1,2E+07 TCID50 partlculas. Basandose en los calculos anteriores, los lotes monovalentes A/Beijing tuvieron un promedio de 1.576.022 dosis totales por lote. Las dosis totales promedio por lote para B/Harbin y A/SIdney fueron 601.446 y 50825 dosis por lote respectivamente, o un 38 % y un 3,2 % de la media de dosis totales de A/Beijing por lote respectivamente. Estos resultados se traducen en los siguientes valores para dosis monovalentes por huevo: 163 dosis/huevo para 86 dosis/huevo para tipo B/Harbin y 6 dosis/huevo para A/SIdney. El calculo para las dosis/huevo se baso en el numero total de huevos recolectados para fabricar el lote.

Resumen de los rendimientos de huevos: A/SIdney tuvo el volumen de cosecha promedio mas alto por rendimiento de huevo, seguido de A/Beijing y B/Harbin. El rendimiento por huevo promedio 5,6 ml/huevo para B/Harbin, 6,5 ml/huevo para A/Beijing y 6,8 ml/hubo para A/SIdney. El rendimiento global de los huevos viables para la produccion promedio un 82 %. Los rendimientos de huevos se basaron en el numero total de huevos cosechados en comparacion con el numero total de huevos para la produccion. El porcentaje de huevos rechazados pre-inoculacion promedio un 10 %. El porcentaje de rechazo post-incubacion promedio un 5 %, con la excepcion de CAZ028, que tuvo una tasa de rechazo del 29 %.

Resumen de rendimiento de purificacion (TCID50): los valores de potencia de cosecha clarificada fueron mayores que el material de partida para alguno de los lotes, resultando en etapas de rendimiento mayores del 100 %. Los estimados de rendimiento de etapa se afectan por la variabilidad del ensayo TCID50, que tuvo una desviacion estandar por encima de 0,3 log10 TCID50/ml como se realiza en el tiempo de producir las funciones. Ademas, el rendimiento de la etapa en el Conjunto de fraccion de pack de centrlfuga diluida varla ampliamente para las tres cepas y es mayor del 100 % para todos los diez lotes cTm. Esto parece ser debido a una tendencia sistematica de las titulaciones para los conjuntos de fraccion pico de centrlfuga (como se sugiere por el rendimiento >100 de la siguiente etapa), se cree que esta relacionado con los altos niveles de sacarosa en estas muestras.

Comentarios de los lotes CTM-1

En las diversas realizaciones y el ejemplo en el presente documento es preferible que no tenga lugar contaminacion de la yema de los fluidos de cosecha que podrlan ocurrir, por ejemplo con ajustes de la maquina de cosecha impropios.

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Etapa de filtracion de 0,2 micrometros: el record del lote en efecto especifico un filtro desechable Pall Kleenpak, sin embargo no se uso para ningun lote CTM. Los lotes CAZ025 - 030 usaron un filtro de cartucho (AB1DFL7PH4 - Filtro Pall hidrofilo PVDF Fluorodina II) con alojamiento en lugar del Kleenpak. Los filtros tenlan materiales de construccion similares (PVDF hidrofilo), sin embargo, las areas de filtro fueron 5100 cm2 para el cartucho Fluorodina II frente a 1500 cm2 para el filtro Kleenpax Fluorodina II. Para los lotes CAZ031/032/033/034 se uso un ensamblaje de filtro Pall NovaSip C3DFLP1 desechable en lugar del Kleenpak. El area superficial de membrana para el filtro C3DFLP1 fue el mismo que el filtro Kleenpak (1500 cm2).

Excursiones de temperatura: Durante la segunda etapa de incubacion para CAZ031, la temperatura se elevo a 34,4 °C durante 13 horas y para CAZ032 la temperatura cayo a 31,5 °C durante 4 horas. Estos lotes alcanzaron titulaciones de cosecha normales por encima de 9,0 log10 TCID50/ml, por lo que las excursiones no importaron como habiendo impactado al producto.

Sumario

Basado en dos Campanas de Fabricacion de prueba cllnica (CTM-1 y CTM-2), el desarrollo del proceso FluMist llquido y el trabajo de fabricacion indica que el proceso es adecuado para producir suministros cllnicos que pasan las especificaciones de liberacion. Los datos agregados de ambas ejecuciones de CTM y diversos estudios e desarrollo dan lugar a los siguientes estimados del rendimiento de proceso promedio:

Clarificacion: rendimiento del 50 %

Purification de ultracentrlfuga: rendimiento del 50 %

Dilution pico y filtracion esteril: 20 al 50 % de rendimiento

Ejemplo 2 ensayo de estabilidad

Se preparo una formulation de vacuna trivalente que comprende tres virus de la gripe reorganizados diferentes (7,0 +/- 0,5 log 10 FFU/dosis [aproximadamente 7,0 +/- 0,5 log 10 TCID50/dosis]) y que comprende sacarosa 200 mM; hidrolizado de gelatina porcina al 1 % (p/v); monoclorhidrato de arginina al 1,21 % (p/v) [equivalente a base de arginina al 1 % (p/v)]; y glutamato monosodico 5 mM en tampon fosfato potasico 100 mM, (pH 7,2). La estabilidad de la formulacion se almaceno a -25 grados C +/- 5,0 grados para mas que o igual a 24 horas, pero menos de o igual a dos horas y despues almacenado a 2-8 grados C durante diversos periodos de tiempo. Esta formulacion (por ejemplo, lote 0141500003) se determino ser estable durante al menos 12 semanas a 4-8 grados C. En particular, la potencia para cada cepa de virus se mantuvo dentro de 0,5 log1o del principio de la potencia antes del almacenaje a 4-8 grados C.

Otros estudios han demostrado que las formulaciones equivalentes (que comprenden tres virus de la gripe reorganizados diferentes) (7,0 +/- 0,5 log 10 FFU/dosis [aproximadamente 7,0 +/- 0,5 log 10 TCID50/dosis]) y que comprende sacarosa 200 mM; hidrolizado de gelatina porcina al 1 % (p/v); monoclorhidrato de arginina al 1,21 % (p/v) [equivalente a base de arginina al 1 % (p/v)]; y glutamato monosodico 5 mM en tampon fosfato potasico 100 mM, pH 7,2) de diferentes lotes cllnicos (por ejemplo, “Campana 3” son estables durante aproximadamente 12-25 meses a 5,0 (+/- 3,0) grados C.

Los estudios posteriores han demostrado que las formulaciones que comprenden solamente sacarosa 200 mM; hidrolizado de gelatina al 1 % (p/v); monoclorhidrato de arginina al 1,21 % (p/v) [equivalente a base de arginina al 1 % (p/v)] en tampon fosfato potasico 100 mM, pH 7,2 pero sin glutamato, tuvo estabilidad equivalente como las formulaciones anteriores con glutamato.

Aunque la realization anterior se ha descrito en algun detalle para fines de claridad y entendimiento, sera evidente para un experto en la materia al leer la presente divulgation que pueden realizarse diversos cambios en la forma y el detalle sin salir del alcance verdadero de la invention. Por ejemplo, todas las tecnicas y aparatos descritos anteriormente pueden usarse en diversas combinaciones.

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REIVINDICACIONES

1. Una composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador que comprende al menos una cepa del virus de la gripe y comprende ademas un estabilizante, que consiste en:

(a) sacarosa del 2 % al 8 % en peso/volumen (p/v); arginina del 0,75 % al 2 % p/v; glutamato del 0,02 % al 0,15 % p/v e hidrolizado de gelatina del 0,5 % al 2 % y un tampon; o

(b) sacarosa del 2 % al 8 % p/v; arginina del 0,75 % al 2 % p/v, hidrolizado de gelatina del 0,5 % al 2 % y un tampon;

en la que cada cantidad de cada uno de los componentes del estabilizante es la cantidad final en la composicion del virus y la composicion de virus exhibe una perdida de potencia de menos de 1,0 log cuando se almacena durante un periodo de 3 meses a de 4 °C a 8 °C.
2. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de la reivindicacion 1, en la que el estabilizante consiste en sacarosa al 6,84 % p/v, arginina al 1,21 % p/v, glutamato al 0,094 % p/v, hidrolizado de gelatina al 1 % p/v y un tampon.
3. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de la reivindicacion 1, en la que el estabilizante consiste en sacarosa al 6,84 % p/v, arginina al 1,21 % p/v, hidrolizado de gelatina al 1 % p/v y un tampon.
4. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en la que al menos una cepa de virus de la gripe se selecciona de: un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frlo, un virus de la gripe sensible a temperatura, un virus de la gripe adaptado al frlo atenuado, un virus de la gripe sensible a temperatura adaptado al frlo, un virus de la gripe sensible a temperatura atenuado y un virus de la gripe sensible a temperatura adaptado al frlo atenuado.
5. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que al menos una cepa del virus de la gripe comprende un esqueleto genetico de ca A/Ann Arbor/6/60 o ca B/Ann Arbor/1/66.
6. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el tampon es un tampon de fosfato potasico.
7. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de la reivindicacion 6, en la que el tampon fosfato potasico comprende un 1,13 % (p/v) de fosfato potasico dibasico y un 0,48 % (p/v) de fosfato potasico monobasico.
8. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la arginina es monoclorhidrato de arginina y el glutamato es monohidrato monosodico de acido glutamico.
9. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que una formulacion de vacuna de la composicion comprende entre 6,5 y 7,5 log10 de unidades focales fluorescentes (FFU) de cada cepa de virus de la gripe por dosis de 0,2 ml.
10. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composicion comprende al menos dos cepas del virus de la gripe.
11. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de la reivindicacion 10, en donde la composicion comprende tres cepas del virus de la gripe.
12. La composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la composicion de virus exhibe una perdida de potencia de menos de 1,0 log almacenada durante un periodo de 12 meses a de 4 °C a 8 °C.
13. Una composicion inmunogenica que comprende la composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una vacuna que comprende la composicion inmunogenica de la reivindicacion 13
15. Una formulacion de vacuna de la composicion de virus de la gripe vivo estable a refrigerador de la reivindicacion 1 que comprende:

a) al menos dos cepas del virus de la gripe, en donde:

i) Al menos una cepa del virus de la gripe comprende un esqueleto genetico de ca A/Ann Arbor/ 6/60 y al menos una cepa del virus de la gripe comprende un esqueleto genetico de ca B/Ann Arbor/1/66 y

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ii) la formulacion de vacuna comprende entre 6,5 y 7,5 log10 de unidades focales fluorescentes (FFU) de cada cepa de virus de la gripe por dosis de 0,2 ml; y

b) un estabilizante que consiste en sacarosa al 6,84 % p/v, monoclorhidrato de arginina al 1,21 % p/v, monohidrato monosodico de acido glutamico al 0,094 % p/v, hidrolizado de gelatina al 1 % p/v y un tampon de fosfato potasico, tampon que comprende un 1,13 % (p/v) de fosfato potasico dibasico y un 0,48 % (p/v) de fosfato potasico monobasico.

en donde cada cantidad de cada uno de los componentes del estabilizante es la cantidad final en la formulacion de vacuna y la formulacion de vacuna exhibe una perdida de potencia de menos de 1,0 log cuando se almacena durante un periodo de 3 meses a de 4 °C a 8 °C.
16. La formulacion de vacuna de la reivindicacion 15, en donde la formulacion comprende tres cepas de virus de la gripe.
17. La formulacion de vacuna de las reivindicaciones 15 o 16, en donde la formulacion exhibe una perdida de potencia de menos de 1,0 log almacenada durante un periodo de 12 meses a de 4 °C a 8 °C.
18. Un kit que comprende la formulacion de vacuna de las reivindicaciones 15, 16 o 17.