ES2634457T3 - Producción de una línea de células beta humanas a partir de un páncreas postnatal temprano - Google Patents

Abstract

Un método para preparar células beta pancreáticas humanas o tumores de células beta humanas, que comprende las etapas de: a) disociar con colagenasa in vitro, el tejido pancreático humano neonatal de un individuo de menos de 5 años de edad, para obtener células pancreáticas humanas neonatales; b) transducir y co-transducir las células pancreáticas humanas neonatales obtenidas en la etapa a) con i) un vector lentiviral que expresa el antígeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina, o ii) con un vector lentiviral que expresa el antígeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina y un vector lentiviral que expresa hTERT bajo el control del promotor de insulina, o iii) un vector lentiviral que expresa tanto el antígeno T SV40 Grande como hTERT; c) introducir las células pancreáticas neonatales transducidas obtenidas en b) dentro de la cápsula del riñón de un animal no humano con inmunodeficiencia comprometida severa (scid); d) permitir a las células del páncreas transducidas desarrollar estructuras similares al insulinoma, en donde las células del páncreas humanas neonatales en las estructuras similares al insulinoma tienen diferenciadas las células beta pancreáticas que producen insulina; e) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa de, disociar las células de las mismas; f) sub-transplantar las células obtenidas en la etapa e) dentro de la cápsula del riñón de un nuevo animal no humano con scid; g) permitir a las células sub-transplantadas en la etapa f) desarrollar y regenerar las estructuras similares al insulinoma, en donde dichas estructuras similares al insulinoma desarrolladas nuevamente están enriquecidas en células beta pancreáticas que producen insulina; h) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa g), y disociar y recoger las células de las mismas; i) opcionalmente, sub-transplantar las células obtenidas en la etapa g) dentro de la cápsula del riñón de un nuevo animal no humano con scid, permitiendo además por lo tanto el enriquecimiento y la amplificación de células beta pancreáticas que producen insulina; y, j) opcionalmente repetir las etapas f), g) y h) hasta obtener la cantidad apropiada de células beta pancreáticas que producen insulina.

Description

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DESCRIPCION

Produccion de una linea de celulas beta humanas a partir de un pancreas postnatal temprano

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar celulas beta humanas in vitro a partir de tejido pancreatico. Particularmente se preocupar de obtener celulas que secretan insulina a partir de un pancreas obtenido durante un periodo postnatal temprano. Tambien se refiere a metodos de diagnostico de la diabetes empleando tumores de celulas beta o celulas derivadas de los mismos.

Antecedentes de la invencion

La diabetes es una enfermedad cronica que afecta a 200 millones de personas en el mundo. La diabetes tipo 1 resulta de la destruccion autoinmune de celulas beta, mientras que la diabetes tipo 2 se causa por una combinacion de resistencia a la insulina, y una inadecuada secrecion de insulina. Por tanto, tanto en la diabetes tipo 1 como en la de tipo 2, la masa celular beta funcional no es suficiente para controlar la glucemia.

El pancreas maduro contiene dos tipos de tejido: tejido exocrino, compuesto de celulas acinares que producen enzimas (por ejemplo, carboxipeptidasa-A) secretadas a traves de los conductos pancreaticos en el intestino, y de islotes endocrinos compuestos de celulas que producen hormonas, tales como, insulina (celulas beta), glucagon (celulas alfa), somatostatina (celulas delta) y polipeptido pancreatico (celulas PP). Durante las ultimas decadas la investigacion en el campo de celulas beta se ha beneficiado de la creacion de lineas de celulas que secretan insulina, tales como, celulas RIN y INS1, derivadas de un insulinoma de rata inducido por rayos x (Asfari et al., 1992; Gazdar et al., 1980) celulas HIT generadas por transformacion de celulas islote de hamster mediante celulas SV40 (Santerre et al., 1981) y celulas beta TC y celulas Min6 derivadas de ratones transgenicos que expresan el antigeno T SV40 bajo el control del promotor de insulina (Efrat et al., 1995; Efrat et al., 1993; Efrat et al., 1988; Hanahan, 1985; Knaack et al., 1994; Miyazaki et al., 1990). Tales lineas celulares fueron utiles para un mejor entendimiento de la biologia de celulas beta y se podrian utilizar para el cribado del farmaco.

La generacion de celulas beta pancreaticas en gran cantidad representa un importante objetivo, porque tales celulas beta se podrian emplear para la terapia celular de la diabetes. Ademas, tales celulas beta pancreaticas serian tambien utiles para el cribado de nuevos farmacos que pudieran modular la funcion de celulas beta. Con este fin, se han desarrollado anteriormente diferentes planteamientos para generar celulas beta pancreaticas en gran cantidad.

El primero consistia en emplear como material de inicio celulas madre embrionarias inmaduras (celulas ES) para producir celulas beta humanas o de raton. La principal ventaja es que las celulas ES se auto-renuevan indefinidamente en cultivo, y tienen la capacidad de diferenciarse a multiples tipos de celulas, y por tanto, a celulas beta pancreaticas. Aunque han aparecido una gran cantidad de publicaciones en los ultimos anos sobre la produccion de celulas beta a partir de celulas ES (Assady et al., 2001; Blyszczuk et al., 2003; Brolen et al., 2005; Hori et al., 2002; Lumelsky et al., 2001; Soria et al., 2000), otras publicaciones describieron inconvenientes en tales trabajos, cuestionaron las interpretaciones y demostraron que los protocolos reproducibles no eran disponibles aun para producir celulas beta a partir de celulas ES (Hansson et al., 2004; Rajagopal et al., 2003).

Por lo tanto, en este punto no se han generado aun celulas beta funcionales en grandes cantidades a partir de celulas ES, con la excepcion de una publicacion reciente donde se desarrollaron celulas beta a partir de celulas hES (D’Amour et al., 2006). Sin embargo, tales celulas no secretaban insulina tras la estimulacion de glucosa.

Un segundo planteamiento era derivar lineas celulares beta a partir de tumores de celulas beta derivadas de ratones transgenicos que expresan el antigeno T SV40 bajo el control del promotor de insulina (Efrat et al., 1995; Efrat et al., 1993; Efrat et al., 1988; Hanahan, 1985; Knaack et al., 1994; Miyazaki et al., 1990). Estas lineas celulares han sido extremadamente utiles para el estudio detallado de celulas beta de roedores. Sin embargo, como existen muchas diferencias entre las celulas beta humanas y de roedores, estas celulas beta no se pueden emplear para el diagnostico o terapia en el ser humano. Tambien, ya que estas lineas celulares beta se obtuvieron mediante transferencia genetica en ovulos fertilizados, tal metodo es restrictivo para modelos animales, sin ninguna transferencia posible al ser humano.

Un tercer planteamiento ha sido llevado a cabo por Ravassard et al. (2011). Estos autores describieron la obtencion de una linea de celulas beta humana funcional estable, disenaron EndoC-pH1, con secrecion de insulina inducible por glucosa mediante el empleo de celulas pancreaticas fetales humanas transducidas con vectores lentivirales que expresan SV40LT bajo el control del promotor de insulina. En este planteamiento las celulas pancreaticas transducidas se injertaron en ratones con SCID (sindrome de inmunodeficiencia combinada severa) para que pudieran desarrollarse dentro del tejido pancreatico. Las celulas beta humanas diferenciadas, expresaron SV40LT simultaneamente con insulina, proliferaron, y formaron insulinomas. Estos insulinomas se transdujeron a continuacion con un vector lentiviral que expreso hTERT (telomerasa transcriptasa inversa), y las celulas de insulinomas que transdujeron hTERT se reinjertaron dentro de otros ratones con SCID para amplificar ademas la proliferacion de celulas beta. Despues de eliminar el tejido transplantado de estos ratones con SCID, las celulas se disociaron y se expandieron entonces en un cultivo como lineas celulares. Las celulas EndoC- pH1 resultantes contenian 0,48 gig de insulina por millon de celulas, eran estables al menos durante 80 etapas, y expresaron muchos marcadores celulares beta especificos, sin ninguna expresion sustancial de los marcadores de otros tipos de celulas

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pancreaticas. Las celulas EndoC-pH1 secretan insulina en respuesta a la estimulacion de glucosa, y la secrecion de insulina se mejora mediante secretagogos conocidos tales como exendina-4, glibenclamida, y leucina. Finalmente, el transplante de celulas EndoC-pH1 en ratones con DM inducida quimicamente normaliza su glucemia.

Sin embargo es de interes obtener celulas beta generadas a partir de un pancreas post-natal mas maduro. En particular, solo se pueden obtener celulas pancreaticas embrionarias despues de la finalizacion de la gestacion, lo cual puede plantear cuestiones eticas o legales en un gran numero de paises. Por tanto, seria preferible emplear material no embrionario para generar lineas de celulas beta pancreaticas humanas.

Se han realizado varios intentos para generar lineas de celulas beta humanas a partir de muchas fuentes pancreaticas humanas, tales como, islotes o insulinomas de adultos. Sin embargo, la produccion de insulina mediante estas celulas era extremadamente baja o estas celulas eran capaces de producir insulina solo durante unas pocas etapas (de la Tour et al., 2001; Demeterco et al., 2002; Gueli et al., 1987; Ju et al., 1998; Levine et al., 1995; Soldevila et al., 1991). En 2005, Narushima et al (Narushima et al., 2005) presentaron que establecieron con exito una linea de celulas beta humanas funcionales (NAKT-15) a partir de celulas del islote pancreatico adulto aisladas en fresco transducidas con un retrovirus Moloney que expresa el antigeno T SV40 Grande. Sin embargo, se han planteado serias dudas respecto a este trabajo. En particular, la transferencia genetica mediante tales vectores retrovirales ocurre unicamente en celulas que se replican activamente al tiempo de la infeccion (Miller DG et al., 1990), mientras que las celulas pancreaticas adultas son muy pobres mitoticamente (vease Chen et al., 2011 y Kohler et al., 2010). Por lo tanto, es probable que la linea celular NAKT-15 no sea una linea de celulas beta humanas funcionales, como se reivindica, y que el metodo descrito en Narushima et al., no permita al experto en la tecnica obtener tal linea de celulas beta funcionales humanas. De hecho, el trabajo de Narushima et al., no se ha reproducido, bien por los autores o por otros laboratorios, desde la publicacion original.

Meier JJ. et al., (2008) mostraron que el incremento de la masa de celulas beta post-natales humanas se debe a la replicacion activa de celulas beta diferenciadas, y que no permanecen en las celulas del progenitor. Con todo, esta proliferacion de celulas diferenciadas son incompetentes para producir lineas de celulas beta funcionales. Ravassard et al., (2011) intento generar una linea de celulas beta funcionales a partir de islotes humanos adultos transducidos por vectores lentivirales. Las celulas transducidas sobrevivieron despues de su transplante en ratones inmunodeprimidos, pero no se desarrollaron despues dentro de insulinomas. Estas observaciones eran consistentes con aquellas que se obtuvieron en otro informe de que celulas beta adultas eran reacias a la transformacion empleando multiples mutantes oncogenicos (Gidekel Friedlander et al., 2009).

Por esto, nunca se ha observado la formacion del insulinoma a partir de celulas humanas no fetales, y se ha considerado imposible obtener lineas de celulas beta humanas a partir de material pancreatico no fetal (Ravassard et al., 2011).

Por tanto, aun existe una necesidad de un metodo fiable y reproducible para desarrollar una linea de celulas beta humanas funcionales a partir de material pancreatico no fetal.

Descripcion

A menos que se defina de otra manera en la presente memoria, los terminos cientificos y tecnicos empleados en relacion con la presente invencion, deberan tener los significados que se entienden normalmente por los expertos habituales en la tecnica. Ademas, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los terminos particulares podran incluir pluralidades y terminos plurales podran incluir terminos particulares. Generalmente, las denominaciones y las tecnicas que se emplean en relacion con, el cultivo de celulas y tejidos, biologia molecular, inmunologia, microbiologia, quimica e hibridacion genetica, proteica y de acido nucleico, descritos en la presente memoria, son bien conocidas, y se emplean normalmente en la tecnica. La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique de otra manera, tecnicas convencionales de biologia molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquimica, e inmunologia, que estan dentro del alcance de la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliografia, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periodicas); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizaron, segun las especificaciones de los fabricantes, como se realizan normalmente en la tecnica, o como se describe en la presente memoria.

Por tanto, es un objetivo de la presente invencion proporcionar un metodo alternativo para producir lineas de celulas beta pancreaticas humanas. En particular, la invencion se dirige a un metodo para producir lineas de celulas beta humanas a partir de un pancreas humano no fetal. Como se emplea en la presente memoria, una “celula beta” es una celula de los islotes de Langerhans del pancreas del pancreas que secreta la hormona insulina en respuesta a glucosa y otros secretagogos. Una “celula beta pancreatica humana” o “celula beta humana” (estos terminos son sinonimos en el contexto de la presente solicitud y debera interpretarse, por tanto, para expresar el mismo significado) es una celula beta de origen humano.

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Los presentes inventores han disenado en la actualidad una nueva estrategia para generar lineas de celulas beta humanas a partir de materiales de tejido no fetal. Han descubierto que, sorprendentemente, mediante el uso de un metodo sub-injerto con tejidos pancreaticos neonatales, las celulas pancreaticas eran capaces de formar estructuras de insulinoma, bajo condiciones especificas. Estas estructuras de insulinomas contienen celulas beta funcionales humanas, cuyos sub-injertos dan como resultado un enriquecimiento especifico en celulas beta, conduciendo finalmente a la produccion de lineas de celulas beta humanas homogeneas, que se pueden ademas, amplificar a escala clinica y comercial. Mediante la repeticion de las etapas de enriquecimiento y amplificacion, los inventores fueron capaces de obtener repetidamente lineas de celulas que se pueden amplificar para ensayo, diagnostico o uso terapeutico.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un metodo para establecer y amplificar especificamente celulas beta humanas a partir de tejidos pancreaticos no fetales.

Se generaron, por tanto, varias lineas de celulas beta humanas. Tales lineas expresan insulina y tienen un perfil de expresion genetico que se asemeja a las celulas beta adultas. Ademas, cuando se transplantaron bajo la capsula del rinon de los ratones diabeticos, eran capaces de normalizar la glucosa en sangre. Ademas, las lineas de celulas beta humanas son capaces de normalizar la glucemia de ratones diabeticos. Realizando la carga de glucosa de manera intraperitoneal, estos animales utilizan normalmente la carga de glucosa, demostrando sus capacidades de secrecion de insulina. Por otra parte, su linea celular es capaz de responder a la estimulacion de glucosa, y es ademas completamente funcional.

Esto abre una perspectiva hacia el uso clinico de las celulas beta en el tratamiento de la diabetes. El nuevo proceso para obtener celulas que secretan insulina mediante este metodo proporciona una fuente abundante de celulas beta.

Las lineas de celulas beta humanas obtenidas con este metodo se pueden emplear eficientemente para detectar la presencia de auto-anticuerpos que se encuentran en la sangre de pacientes diabeticos, y por consiguiente, tienen un gran potencial para el diagnostico de la diabetes tipo 1. Estas celulas beta se estan usando tambien para generar y amplificar lineas celulares beta humanas indefinidamente, las cuales forman lotes de celulas maestras para terapia celular.

En una primera realizacion, un metodo para preparar celulas beta pancreaticas humanas o tumores de celulas beta humanas comprende las etapas de:

a) disociar el tejido pancreatico humano neonatal con colagenasa para obtener celulas del pancreas humano neonatal;

b) transducir y co-transducir las celulas del pancreas humano neonatal obtenido en la etapa a) con i) un vector lentiviral que expresa el antigeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina, o ii) con un vector lentiviral que expresa el antigeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina, y un vector lentiviral que expresa hTERT bajo el control del promotor de insulina, o iii) un vector lentiviral que expresa tanto el antigeno T SV40 Grande como el hTERT;

c) introducir el pancreas neonatal transducido obtenido en b) dentro de la capsula del rinon de un animal no humano afectado con inmunodeficiencia comprometida severa (scid);

d) permitir a las celulas del pancreas transducidas desarrollar estructuras similares a un insulinoma, en donde las celulas pancreaticas humanas neonatales en las estructuras similares al insulinoma tienen celulas beta pancreaticas diferenciadas que producen insulina;

e) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa d), disociar las celulas de las mismas, y opcionalmente transducir dichas celulas con un vector lentiviral que expresa un gen de resistencia a antibiotico bajo el control del promotor de insulina;

f) sub-transplantar las celulas obtenidas en la etapa e) dentro de la capsula del rinon dentro de un nuevo animal no humano con scid;

g) permitir que las celulas sub-plantadas en la etapa f) desarrollen y regeneren estructuras similares al insulinoma, donde dichas estructuras similares a insulinoma desarrolladas nuevamente estan enriquecidas en celulas beta pancreaticas que producen insulina;

h) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa g), disociar y recoger las celulas de las mismas;

i) opcionalmente, sub-transplantar las celulas obtenidas en la etapa g) dentro de la capsula del rinon de un nuevo animal no humano con scid, permitiendo, por lo tanto, el enriquecimiento y la amplificacion de las celulas beta pancreaticas que producen insulina;

j) repetir opcionalmente las etapas f), g) y h) hasta obtener la cantidad apropiada de celulas beta pancreaticas que producen insulina.

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El termino “tejido pancreatico” como se emplea en la presente memoria, se refiere a un tejido obtenido derivado del pancreas; asimismo, el termino “celulas pancreaticas” se refiere en la presente memoria a las celulas obtenidas o derivadas del pancreas. Como se emplea en la presente memoria, el termino “celulas pancreaticas inmaduras” se refiere a las celulas que se pueden obtener a partir del pancreas fetal o de celulas madre que provienen de la primera diferenciacion de celulas endodermicas.

Un “tejido pancreatico humano neonatal” como se emplea en la presente memoria, es un tejido de un pancreas obtenido a partir de un individuo que ya ha nacido. Por tanto, estan comprendidos por el presente metodo los tejidos obtenidos a partir de individuos de todas las edades. Por otro lado, la presente invencion no se refiere al uso de material embrionario para obtener lineas de celulas beta. Preferiblemente, dichos individuos tienen menos de 5 anos de edad; mas preferiblemente, dichos individuos tienen menos de 1 ano de edad; incluso mas preferiblemente, dichos individuos tienen menos de 6 meses de edad; aun mas preferible, dichos individuos tienen menos de 3 meses de edad; lo mas preferible, dichos individuos tienen menos de 1 mes de edad.

La invencion se refiere a un metodo para preparar celulas beta pancreaticas humanas o tumores de celulas beta humanas, que comprende las etapas de:

a) disociar el tejido pancreatico humano neonatal a partir de un individuo de menos de 5 anos de edad con colagenasa in vitro para obtener celulas del pancreas humano neonatal;

b) transducir y co-transducir las celulas del pancreas humano neonatal obtenidas en la etapa a) con i) un vector lentiviral que expresa el antigeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina, o ii) con un vector lentiviral que expresa el antigeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina y un vector lentiviral que expresa hTERT bajo el control del promotor de insulina, o iii) un vector lentiviral que expresa tanto el antigeno T SV40 Grande, como el hTERT;

c) introducir el pancreas neonatal transducido obtenido en b) dentro de la capsula del rinon de un animal no humano con inmunodeficiencia comprometida severa (scid);

d) permitir que las celulas del pancreas transducidas desarrollen estructuras similares al insulinoma, en donde las celulas del pancreas humanas neonatales en las estructuras similares al insulinoma tienen celulas beta pancreaticas diferenciadas que producen insulina;

e) micro-diseccionar las estructuras similares a un insulinoma obtenidas en la etapa d), disociar las celulas de las mismas;

f) sub-transplantar las celulas obtenidas en la etapa e) dentro de la capsula del rinon de un nuevo animal no humano con scid,

g) permitir que las celulas sub-transplantadas en la etapa f) desarrollen y regeneren estructuras similares a un insulinoma, donde dichas estructuras similares a insulinoma desarrolladas nuevamente estan enriquecidas en celulas beta pancreaticas que producen insulina;

h) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa g), disociar y recoger las celulas de las mismas,

i) opcionalmente, sub-transplantar las celulas obtenidas en la etapa g) dentro de la capsula del rinon de un nuevo animal no humano con scid, permitiendo ademas, por lo tanto, el enriquecimiento y la amplificacion de las celulas beta pancreaticas que producen insulina; y

j) repetir opcionalmente las etapas f), g) y h) hasta obtener la cantidad apropiada de celulas beta pancreaticas que producen insulina.

Como se emplea en la presente memoria, se puede recuperar mediante cirugia a partir de un individuo el tejido pancreatico. El tejido pancreatico como se emplea en la presente memoria, puede consistir del pancreas entero de dicho individuo, o solo de una porcion de dicho pancreas. En una realizacion, el tejido pancreatico se ha congelado despues de ser recogido. En otra realizacion, el tejido pancreatico que se emplea en el metodo de la invencion, es fresco. Por tanto, segun esta realizacion especifica, el presente metodo comprende una etapa de recoger el tejido pancreatico antes de la etapa a).

Por “colagenasa”, se refiere en la presente memoria a una enzima que pertenece a la familia metaloproteinasas de matriz (MMP) que es capaz de romper los enlaces peptidicos en el colageno. Una colagenasa como se emplea en la presente memoria, puede ser bien de origen bacteriano o animal. Las colagenasas bacterianas se diferencian de las colagenas de vertebrados en que muestran una especificidad al sustrato mas amplia. A diferencia de las colagenasas animales, la colagenasa bacteriana puede atacar casi todos los tipos de colagenos, y es capaz de realizar multiples escisiones en las regiones de la triple helice. Preferiblemente, la colagenasa es una enzima bacteriana; mas preferiblemente, es una enzima secretada por la bacteria anaerobica Clostridium histolyticum. En una realizacion preferida, la colagenasa empleada en el presente metodo se selecciona del grupo que consiste en

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colagenasas Tipo I-S, Tipo IA, Tipo IA-S, Tipo II, Tipo II-S, Tipo IV, Tipo IV-S, Tipo V, Tipo V-S, Tipo VIII, Tipo XI y Tipo XI-S. En la realizacion mas preferida, la colagenasa de la invencion es la colagenasa XI.

La concentracion de la colagenasa empleada en la etapa a) del metodo, es preferiblemente inferior o igual a 5 mg/mL; mas preferiblemente, de 4 mg/mL; incluso mas preferiblemente de 3 mg/mL; aun mas preferiblemente, de 2 mg/mL; incluso aun mas preferiblemente, de 1 mg/mL. En la realizacion mas preferida, dicha colagenasa se usa a 1 mg/mL. El tejido pancreatico humano neonatal se disocia con la colagenasa durante al menos 10 minutos; preferiblemente durante al menos 15 minutos; mas preferiblemente al menos 20 minutos; incluso mas preferiblemente al menos 25 minutos; aun mas preferiblemente al menos 30 minutos; lo mas preferiblemente durante 30 minutos a aproximadamente a 37°C. Para que ocurra la disociacion, los tejidos pancreaticos mencionados anteriormente, se suspenden preferiblemente en un medio apropiado que comprende PBS + 20% FCS.

La transduccion de las celulas pancreaticas humanas neonatales obtenidas a partir de la disociacion de los tejidos pancreaticos con vectores lentivirales se lleva a cabo segun los metodos conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ravassard et al., 2011 y referencias del mismo). Los vectores lentivirales son vectores derivados a partir de un lentivirus, tal como HIV1. Estos son capaces de transducir sin dividirse, asi como dividir celulas y mantener la expresion de secuencias de acido nucleico heterologo en varios tejidos diana in vivo, incluyendo celulas del cerebro, higado, musculo y sistema hematopoyetico. Se conoce un gran numero de vectores lentivirales por los expertos en la tecnica; se pueden emplear cualquiera de estos vectores en el contexto de la presente invencion, proporcionando que expresen al menos el antigeno T SV40 Grande y/o hTERT, bajo el control del promotor de insulina. Los expertos en la tecnica se dirigen por Ravassard et al. (2011) y WO 20088/102000, donde se han descrito ejemplos de tales vectores lentivirales.

Puede ser ventajoso recuperar las celulas beta humanas en determinadas condiciones. Por ejemplo, si se contempla la administracion de dichas celulas a un paciente, es mas seguro eliminar los oncogenes transportados por los vectores. Los vectores lentivirales pueden, por tanto, construirse para permitir una inmortalidad reversible o condicionada, para que se pueda introducir al menos un sitio Lox P. Mas preferiblemente, los vectores se construyen para que los transgenes del antigeno T SV40 Grande y/o hTERT se localicen dentro de dos sitios Lox P. Dichos transgenes se eliminan mediante expresion de la recombinasa Cre en las celulas beta. Por ejemplo, las celulas obtenibles mediante el metodo anterior, se transducen mediante un vector o plasmido que expresa una recombinasa Cre y aparece reversion. Por supuesto, el experto en la tecnica puede elegir emplear el sistema FRT/FLP, para eliminar dichos transgenes. Los metodos para la reversion de las celulas inmortalizadas son descritas en WO 01/38548.

En una realizacion particular, el vector lentiviral que expresa T SV40 Grande y el vector lentiviral que expresa hTERT comprende ademas, un sitio LoxP o FRT, proporciono que los sitios de recombinacion especificos del sitio sean diferentes en ambos vectores.

La etapa de seleccion negativa se puede realizar tambien despues de la accion de la recombinasa Cre o FLP. Esta etapa permite, ademas, seleccionar solo las celulas en las que se ha eliminado la inmortalizacion de los genes T SV40 Grande y hTERT, asi como el gen resistente a antibiotico. Estas celulas se pueden congelar, almacenar y opcionalmente encapsular, hasta que se transplanten en pacientes diabeticos.

El gen marcador de seleccion negativa puede ser, por ejemplo, el gen HSV-TK (Timidina Kinasa del virus del herpes simple) y el agente selectivo aciclovir-ganciclovir. O los marcadores de seleccion negativa son el gen hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) y el gen guanina fosforribosil transferasa (Gpt), y el agente selectivo es la 6- tioguanina. O el marcador de seleccion negativa es el gen deaminasa de citosina y el agente selectivo es la 5-fluoro- citosina. Por tanto, en una realizacion preferida, dicho gen marcador negativo se selecciona del grupo constituido por el gen HSV-TK, el gen hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), el gen guanina fosforribosil transferasa (Gpt), y el gen deaminasa de citosina. Otros ejemplos de proteinas marcadoras de seleccion negativa son las toxinas virales y bacterianas, tales como, la toxina A difterica (DTA). Estos genes y agentes de seleccion negativa y su uso, son bien conocidos por los expertos en la tecnica, y no necesitan mas detalle en la presente memoria.

Las celulas transducidas se introducen despues en al menos una capsula del rinon de animales afectados con inmunodeficiencia comprometida severa (scid). Un animal con scid es un animal con falta de linfocitos T y B y con fallo para generar bien inmunidad humoral o bien inmunidad celular. El animal no-humano con scid como se refiere en la presente memoria, se puede seleccionar entre bovinos, porcinos, caballos, ovejas, cabras, primates excepto seres humanos, roedores, tales como ratones, ratas, hamsters. Dicho animal no-humano con scid puede llevar al menos uno de los otros tipos de mutacion que conduce a la inmunodeficiencia. Dicho animal no-humano con scid puede ser un animal diabetico no obeso/con sindrome de inmunodeficiencia combinada severa (NOD/scid). Un animal NOD/scid es un animal con falta de linfocitos T y B, los cuales por tanto, fallan para generar bien la inmunidad humoral o bien la inmunidad celular.

En una realizacion preferida, el animal NOD/scid empleado en el metodo de la invencion, es un raton. Los ratones NOD/scid se conocen en la bibliografia y estan disponibles comercialmente a partir de proveedores, tales como, Charles River o Jackson Laboratory. Preferiblemente el raton NOD/scid empleado en el presente metodo es de

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cualquier edad de desarrollo, preferiblemente lo suficientemente mayor para que se pueda realizar un injerto dentro de la capsula del rinon. Preferiblemente, los ratones NOD/scid tienen aproximadamente de 2 a 15 semanas de desarrollo, mas preferiblemente de 6 a 8 semanas de desarrollo.

Opcionalmente, las celulas se transducen ademas en la etapa c) con otro vector lentiviral que expresa un gen de resistencia a antibiotico bajo el control del promotor de insulina. El gen resistente a antibiotico se selecciona del grupo que consiste en gen resistente a higromicina, gen resistente a neominica, gen resistente a tetraciclina, gen resistente a ampicilina, gen resistente a kanamicina, gen resistente a fleomicina, gen resistente a bleomicina, gen resistente a geneticina, gen resistente a carbenicilina, gen resistente a cloranfenicol, gen resistente a puromicina, gen resistente a blasticidina-S-deaminasa. En una realizacion preferida, dicho gen resistente a antibiotico es un gen resistente a neomicina. En este caso, el agente selectivo es G418.

El metodo definido anteriormente incluye la recoleccion de las celulas beta pancreaticas funcionales humanas obtenidas en la etapa g) las cuales forman una poblacion celular homogenea. La poblacion celular se puede cultivar ademas in vitro para establecer una linea de celulas funcionales humanas. En esta etapa, las celulas derivadas de los sucesivos sub-injertos contenian la T SV40 Grande y/o hTERT y los transgenes de resistencia a antibiotico. Por tanto, las lineas de celulas obtenibles mediante el metodo anterior se inmortalizan y, dependiendo del punto final, pueden revertirse o no (recuperarse). En particular, la recuperacion puede ser util cuando se contempla, por tanto, un uso terapeutico de las celulas obtenidas.

El metodo anterior para preparar celulas Beta pancreaticas funcionales humanas, es particularmente util para ensayar y cribar un medicamento candidato para tratar la diabetes in vivo o in vitro, despues del injerto en animales no humanos, tales como ratones o ratas.

A este respecto, y en una realizacion especifica, se puede practicar el metodo anterior para preparar una gran cantidad de celulas Beta pancreaticas funcionales humanas con propositos de ensayar y cribar, asi como para el diagnostico in vitro que permite la clasificacion de los pacientes con diabetes tipo 1 o 2. Aqui, las celulas se pueden revivir. Por el contrario, con el metodo anterior, las etapas f), g) y h) se pueden repetir tantas veces como sea necesario para obtener una gran cantidad de insulinoma o celulas beta humanas aisladas del mismo, y estas celulas se pueden amplificar ademas, en cultivo in vitro indefinidamente. Se pueden unir o adsorber a un soporte solido (por ejemplo, placas revestidas de polilisina), celulas beta tumorales de la seccion transversal, celulas derivadas de la misma o un extracto proteico de esas celulas, y hacerles reaccionar con el suero plasmatico de los individuos. Despues de la incubacion, el suero se lava, y se revela la presencia o ausencia de autoanticuerpos frente a diferentes antigenos de superficie especificos a una autoinmunidad asociada con la diabetes (por ejemplo, por medio de Ig anti-humana marcada).

Por lo tanto, en un segundo aspecto, se divulga en la presente memoria tumores de celulas beta humanas o insulinomas, o celulas beta pancreaticas humanas obtenibles mediante el metodo descrito anteriormente. Estos tumores de celulas beta humanas o celulas beta pancreaticas humanas muestran al menos una de las siguientes caracteristicas:

- Carboxipeptidasa-A negativa

- Factor transcripcional Pdx1 positivo

- Factor de transcripcion MafA positivo

- Proconvertasa Pcsk1 positiva

- Expresion del transportador de Glucosa Glut2

- Expresion de Kcnj11 y Abcc8 que codifican para las subunidades del canal de potasio

- Expresion del transportador de zinc Znt8 (Slc30a8), o

- Expresion de insulina

Los tumores de celulas beta humanas o las celulas beta pancreaticas humanas, como se definen anteriormente, son tambien positivas a la reaccion con anti-insulina, anti-GAD y/o anticuerpos anti-IA2 y se pueden mantener y crecer en cultivo en un medio libre de suero y en Matrigel y celulas recubiertas con fibronectina. Por tanto, un cultivo celular que comprende las celulas beta pancreaticas humanas descritas anteriormente en cultivo en un medio libre de suero que comprende Matrigel y fibronectina, tambien se divulga en la presente memoria. Este cultivo celular permite expandir y establecer lineas de celulas beta pancreaticas humanas inmortalizadas.

Por otra parte, las lineas celulares obtenibles mediante el metodo descrito anteriormente se pueden recuperar, para que se puedan emplear, por ejemplo, con objetivos de ensayar y cribar, asi como para el diagnostico in vitro permitiendo la clasificacion de pacientes con diabetes tipo 1 o 2.

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El metodo descrito anteriormente para preparar celulas beta pancreaticas funcionales para el ser humano, es particularmente util para ensayar y cribar medicamentos candidatos para tratar la diabetes in vivo o in vitro, tras el injerto en animales no humanos, tales como ratones o ratas. Especificamente, se divulga en la presente memoria, un metodo para ensayar y cribar medicamentos candidatos para tratar la diabetes, comprendiendo dicho metodo la etapa de administrar un medicamento candidato a un animal no humano injertado con celulas pancreaticas humanas de la invencion. En una realizacion mas especifica un metodo comprende las etapas anteriores para obtener dichas celulas beta segun los metodos descritos anteriormente, e injertar dichas celulas en dicho animal no humano. Dicho animal no-humano es preferiblemente un animal no humano con scid, como se describe anteriormente.

Tambien se divulga en la presente memoria un metodo de diagnostico in vitro de la diabetes. Los tumores de celulas beta de la seccion transversal, celulas derivadas de los mismos o extracto de proteina de estas celulas se pueden unir o adsorber a un soporte solido (por ejemplo, placas recubiertas de polilisina) celulas beta tumorales de la seccion transversal, celulas derivadas de la misma o un extracto proteico de esas celulas, y hacerles reaccionar con el suero plasmatico de los individuos. Despues de la incubacion, el suero se lava, y se revela la presencia o ausencia de autoanticuerpos frente a diferentes antigenos de superficie especificos a una autoinmunidad asociada con la diabetes (por ejemplo, por medio de Ig anti-humana marcada).

Por tanto, se divulga en la presente memoria un metodo de diagnostico in vitro para la diabetes, comprendiendo dicho metodo la union o adsorcion de tumores de celulas beta humanas o celulas beta pancreaticas humanas como se describe anteriormente, o un extracto proteico de dichas celulas, a un soporte solido, y hacerles reaccionar con el suero plasmatico de los individuos, detectar la presencia o ausencia de autoanticuerpos frente a diferentes antigenos de superficie especificos para la diabetes tipo 1 o tipo 2, tales como los Anticuerpos de las Celulas del Islote (ICA), seleccionadas, por ejemplo, a partir de autoanticuerpos de Insulina (IAA) y anticuerpos del acido glutamico decarboxilasa (GADA).

Preferiblemente, el suero del paciente y el control se anaden en dichas secciones del tejido de dichos tumores de celulas beta humanas o celulas beta humanas, y se incuban con una IgG anti-humana marcada, tal como una IgG anti-humana conjugada marcada fluorescente, para revelar la presencia o ausencia de auto-anticuerpos asociados con la diabetes en el suero de dicho paciente. En esta realizacion, la presencia de auto-anticuerpos es indicativa de diabetes.

La presencia o ausencia de auto-anticuerpos asociados con diabetes en el suero de dicho paciente, se puede detectar tambien mediante un western blot de un extracto proteico de dichos tumores de celulas beta humanas o dichas celulas beta pancreaticas humanas. En este caso, la presencia o ausencia de auto-anticuerpos asociados con diabetes en el suero de dicho paciente, se revela con IgG antihumana marcada, tal como IgG antihumana conjugada con peroxidasa de rabano picante (HRP). Alternativamente, la presencia o ausencia de auto-anticuerpos asociados con diabetes en el suero de dicho paciente, se detecta mediante un test ELISA, en las que las placas de los pocillos se recubren con un extracto proteico de dichos tumores de celulas beta humanas o dichas celulas beta pancreaticas humanas. Segun esta realizacion, dicho extracto proteico se incuba con el suero del paciente y el control, y la presencia o ausencia de auto-anticuerpos asociados con diabetes en el suero de dicho paciente, se revela con IgG antihumana marcada, tal como IgG antihumana conjugada con HRP.

En otro aspecto, un metodo de diagnostico in vitro de la diabetes comprende hacer reaccionar la seccion de los tumores de celulas beta, las celulas derivadas de los mismos o el extracto proteico de estas celulas obtenible mediante el metodo descrito anteriormente, con el suero plasmatico de los individuos, detectar la presencia o ausencia de autoanticuerpos frente a diferentes antigenos de superficie especificos para la diabetes tipo 1 o tipo 2, tales como, los Anticuerpos de las Celulas del Islote (ICA), o mas recientemente anticuerpos especificos identificados como anticuerpos autoanticuerpos antiinsulinicos (IAA) y anticuerpos del acido glutamico decarboxilasa (GADA) o anticuerpos IA-2 (IA2A) o anticuerpos especificos no conocidos. La identificacion de anticuerpos nuevos o conocidos, se puede realizar, por ejemplo, mediante inmunoblot o dot-blot.

Tambien se proporciona en la presente memoria un kit para la clasificacion de la diabetes, en donde dicho kit se puede preparar en una escala comercial. Mas particularmente, los autoanticuerpos especificos son Anticuerpos de las Celulas del Islote (ICA), seleccionados de Autoanticuerpos antiinsulinicos (IAA) y anticuerpos del acido glutamico decarboxilasa (GADA). De hecho, estos antigenos se expresan en la superficie de los tumores de celulas beta o celulas derivadas de los mismos obtenibles segun el metodo anterior. Por tanto, en la presente memoria se abarca un kit de diagnostico para la diabetes, comprendiendo dicho kit tumores de celulas beta o celulas beta pancreaticas funcionales humanas obtenibles mediante el metodo anterior, o extractos proteicos de los mismos, que se unen o adsorben opcionalmente a un soporte solido.

En otra realizacion, las celulas como se describen anteriormente, se cultivan in vitro y se establecen lineas celulares beta pancreaticas humanas para el cribado de compuestos capaces de modular la secrecion de insulina. Tambien se proporciona en la presente memoria un metodo para cribar compuestos capaces de modular la secrecion de insulina, comprendiendo dicho metodo las etapas de: a) poner en contacto las celulas beta pancreaticas humanas obtenidas mediante el metodo de la invencion con un compuesto de ensayo, y b) detectar la secrecion de insulina y medir el nivel de secrecion de insulina. La secrecion de insulina se puede detectar mediante cualquiera de los medios conocidos por los expertos en la tecnica, como se detalla en, por ejemplo, los ejemplos experimentales de a

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continuacion, en Ravassard et al., y en WO 2008/102000. Segun una realizacion preferida, el metodo anterior comprende una etapa de comparacion del nivel de insulina secretada obtenida en la etapa b) con al menos un nivel de control. Dicho nivel de control corresponde al nivel de insulina producido por una linea celular que es conocida para secretar insulina, tal como, la linea celular EndoC-pH1 de Ravassard. Alternativamente, dicho nivel de control corresponde al nivel de insulina producido por una linea celular que es conocida por producir cualquier insulina. En otra realizacion preferida, el nivel de insulina secretado de la etapa b) se compara con dos niveles control, uno que corresponde al nivel de insulina producido por una linea celular que es conocida por secretar insulina, y el otro corresponde al nivel de insulina producido por una linea celular que se conoce por secretar insulina. En otra realizacion preferida, el metodo anterior comprende una etapa anterior para obtener la linea celular beta pancreatica humana segun el metodo descrito anteriormente.

En otra realizacion, el metodo anterior se dirige al establecimiento de bancos de celulas maestras para la terapia celular de la diabetes. Aqui, el metodo incluye ademas la recuperacion de las celulas. Dicha recuperacion de las celulas incluye una etapa de eliminar el transgen T SV40 Grande y el hTERT a partir de los vectores lentivirales. Preferiblemente el transgen se escinde mediante la recombinacion especifica del sitio con una recombinasa especifica del sitio, tal como Cre o FLP, como se describe anteriormente.

En otra realizacion, la invencion se refiere a tumores de celulas beta y celulas aisladas de los mismos, obtenibles mediante el metodo anterior. Como se explica, se abarca en la presente memoria tanto celulas inmortalizadas como recuperadas.

La presente divulgacion se refiere tambien al empleo de dichas celulas para ensayar o cribar medicamentos candidatos para el tratamiento en la diabetes, para el diagnostico in vitro como se explica anteriormente, y para la terapia celular de la diabetes.

La presente divulgacion proporciona tambien un metodo regenerador de la funcion del pancreas en un individuo afectado con diabetes, comprendiendo el metodo una etapa de administrar una cantidad eficaz de celulas pancreaticas funcionales humanas como se describe anteriormente, siendo dichas celulas revertidas a un fenotipo celular beta primario, en dicho individuo. En una realizacion preferida, dichas celulas se transplantan dentro de dicho individuo. En otra realizacion preferida, dicho metodo regenerador de la funcion del pancreas comprende una etapa anterior para obtener dichas celulas beta pancreaticas humanas mediante el metodo descrito anteriormente.

La presente divulgacion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende un vehiculo farmaceutico aceptable y una cantidad eficaz de las celulas pancreaticas funcionales humanas como se define anteriormente, siendo dichas celulas encapsuladas opcionalmente.

Una “cantidad eficaz” es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o clinicos deseados. Una cantidad eficaz, por ejemplo, de 105 a 109 celulas, se puede administrar en una o mas aplicaciones, aunque es preferible que sea suficiente una administracion. Para los objetivos de la presente divulgacion, una cantidad eficaz de precursores de celulas madre de celulas beta pancreaticas, es una cantidad que es suficiente para producir celulas pancreaticas diferenciadas que son capaces de restablecer una o mas de las funciones del pancreas. Se contempla que pueda ocurrir rapidamente un restablecimiento mediante la introduccion de cantidades relativamente grandes de celulas del pancreas, como por ejemplo, superior a 109 celulas. Ademas, se contempla tambien que cuando se introducen menos celulas pancreaticas, la funcion se restablecera cuando a la celula o celulas pancreaticas se le permita proliferar in vivo. Por tanto, se puede obtener “una cantidad eficaz” de celulas pancreaticas, permitiendo que en el tiempo suficiente, desde solo una hasta unas pocas celulas del pancreas regeneren todo o parte del pancreas. Preferiblemente, una cantidad eficaz administrada al individuo es mayor de aproximadamente 101 celulas pancreaticas, preferiblemente entre aproximadamente 102 y aproximadamente 1015 celulas pancreaticas, e incluso mas preferiblemente, entre aproximadamente 103 y aproximadamente 1012 celulas pancreaticas. En terminos de tratamiento, una “cantidad eficaz” de celulas pancreaticas es la cantidad que es capaz de mejorar, paliar, estabilizar, revertir, enlentecer o retrasar la progresion de la enfermedad pancreatica, tal como la diabetes.

Como se emplea en la presente memoria, “vehiculo aceptable farmaceuticamente” incluye todos los disolventes, tampones, disoluciones salinas, medio de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes retardantes isotonicos y de adsorcion, y similares, que son compatibles fisiologicamente. El tipo de vehiculo se puede seleccionar en base a la ruta de administracion destinada. En varias realizaciones, el vehiculo es adecuado para la administracion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, topica, transdermica u oral. Vehiculos aceptables farmaceuticamente incluyen disoluciones acuosas o dispersiones esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso del medio y de los agentes para sustancias activas farmaceuticamente, es bien conocido en la tecnica. Una composicion farmaceutica tipica para infusion intravenosa podria fabricarse para contener hasta 250 ml de disolucion esteril de Ringer, y 100 mg de la combinacion. Los metodos actuales para preparar compuestos administrables parenteralmente se conoceran o seran evidentes para los expertos en la tecnica y se describen con mas detalle, en, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Science, 17s ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa, (1985), y las ediciones 18s y 19s del mismo, que se incorporan en la presente memoria por referencia.

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Los metodos para introducir celulas dentro de individuos se conocen bien por los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, inyeccion, administracion intravenosa o parenteral. Se puede efectuar una administracion continua o intermitente, unica, o multiple. Las celulas beta humanas de la invencion, se pueden introducir, por tanto, dentro de cualquiera de los diferentes sitios, incluyendo pero no limitado a el pancreas, la cavidad abdominal, el rinon, el higado, el tronco celiaco, la vena portal o el bazo. Preferiblemente, dichas celulas beta se depositan en el pancreas del individuo.

Las celulas beta pancreaticas humanas de la invencion pueden ser utiles para regenerar funciones pancreaticas. Dichas celulas se pueden administrar tambien a un paciente que padece de un trastorno pancreatico para tratar dicho trastorno. Por tanto, la presente divulgacion contempla tambien un metodo para tratar un trastorno pancreatico con celulas beta pancreaticas humanas obtenidas mediante el metodo de la invencion, que comprende la administracion de dichas celulas beta pancreaticas humanas a un paciente que necesita de las mismas. Segun una realizacion preferida, el presente metodo comprende una etapa anterior de obtencion de dichas celulas beta pancreaticas humanas a partir de un tejido pancreatico humano. En una realizacion preferida, el tejido pancreatico humano se obtiene a partir de dicho paciente que necesita de un tratamiento.

Es por tanto, otro aspecto de la presente divulgacion, proporcionar celulas pancreaticas obtenidas mediante el metodo de la invencion, como un medicamento. De manera mas precisa, la presente divulgacion se refiere al uso de celulas beta pancreaticas humanas obtenidas mediante el metodo de la invencion, para preparar un medicamento para tratar un trastorno pancreatico humano. Otro aspecto de la divulgacion se refiere a celulas beta pancreaticas humanas obtenidas mediante el metodo de la invencion para usar en el tratamiento de un trastorno pancreatico humano.

Uno de los trastornos pancreaticos humanos descritos en la presente memoria, son la diabetes, hipoglucemia, o cualquier patologia asociada con una disfuncion de las enzimas digestivas. Preferiblemente, el trastorno pancreatico humano es la diabetes dependiente de insulina (T1D).

Leyendas de las figuras

La Figura 1 divulga la tincion de un tejido pancreatico neonatal humano que fue transducido con lentivirus que expresan T SV40 bajo el control del promotor de insulina de rata, transplantado a ratones con SCID y extraidos 12 dias mas tarde. Una gran cantidad de celulas positivas a insulina se tinen positivamente para T SV40.

La Figura 2 divulga la tincion de un tejido pancreatico neonatal humano empleando anti-insulina, anticuerpos anti-T SV40 y anti-Ki67 que se transdujeron con lentivirus que expresan T SV40 bajo el control del promotor de insulina de rata, transplantado a ratones con SCID y extraidos siete meses mas tarde. La masa de celulas beta (celulas positivas a insulina) se expandieron con una proliferacion principal de celulas positivas a insulina.

La Figura 3 muestra la tincion empleando anticuerpos anti-insulina, anti-T SV40 y anti-PDX1 del insulinoma humano derivado del raton SCID sub-injertado.

Los ejemplos de a continuacion son simplemente ejemplos del alcance de la invencion y del contenido de esta divulgacion. Un experto en la tecnica puede disenar y construir numerosas modificaciones a los ejemplos citados mas abajo sin alejarse del alcance de esta invencion.

Ejemplos

Construcciones de ADN y producciones del vector lentiviral

Se construyeron los vectores lentivirales, pTRIP -U3.RIP405-SV40LT loxP y pTRIP -U3.RIP405-hTERT loxP, mediante adicion de un sitio loxP en la region 3’LTR del pTRIP-U3.RIP405-SV40LT/hTERT descritos anteriormente (Ravassard et al., 2009). Ambos vectores pTRIP -U3 se digirieron mediante Kpnl y Pacl para eliminar la region 3’LTR. La region 3’LTRloxP del SIN-RP-LTcADN-WHV-U3loxP (proporcionado por Bernard Thorens) se amplifico mediante PCR y se digirieron a continuacion mediante Kpnl y Pacl y se ligaron despues dentro de dos vectores pTRIP lineares. Las reservas de los vectores lentivirales se produjeron mediante transfeccion transitoria de celulas 293T mediante encapsulacion del plasmido p8.9 (AVprAVifAVpuANef) (Zufferey et al., 1997) pHCMV-G que codifica la glicoproteina-G VSV) (Zufferey et al., 1997) y el vector recombinante pTRIP AU3, como se describio anteriormente (Zufferey et al., 1997). Los sobrenadantes se trataron con ADNasa I (Roche Diagnostic) antes de su ultracentrifugacion, y los granulos resultantes se re-suspendieron en PBS, se hicieron alicuotas, y despues se congelaron a -80°C hasta su uso. La cantidad de proteina de la capsida p24 se cuantifico mediante ELISA del antigeno HIV-1 p24 (Beckman Coulter). Todas las transducciones se normalizaron en relacion a la cuantificacion de la proteina de la capsida p24.

Tejidos humanos

Se obtuvieron trozos pancreaticos neonatales humanos a partir del tallo del pancreas, tras la cirugia de ninos menores de un ano de edad en conformidad segun la legislacion bioetica francesa.

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Transferencia genetica

El tejido pancreatico se corto en trozos cuadrados de 1 mm en suero bovino fetal, se trato con colagenasa XI (1 mg/ml RPMI) (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 37°C y a continuacion se lavo dos veces en PBS que contiene 20% de suero bovino fetal. Las pancreasas recien nacidas se transdujeron con pTRIP AU3.RIP405-SV40LT lox P como se describio anteriormente (Castaing 2005, Scharfmann 2008). En resumen, los tejidos se transdujeron con una cantidad total de vectores lentivirales que corresponden a 2 gg de proteina de la capsida p24 durante dos horas a 37°C en 200 gl de DMEM que contiene 5,6 mM de glucosa, 2% de albumina fraccion V de suero bovino (BSA, Roche diagnostics), 50 gM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de nicotinamida (Calbiochem), 5,5 gg/ml de transferrina (Sigma-Aldrich), 6,7 ng/ml de selenito (Sigma-Aldrich), 100 U/ml de penicilina, y 100 gg/ml de estreptomicina y 10 gg/ml de DEAE-dextrano. Los tejidos se lavaron despues dos veces con medio de cultivo y se mantuvieron en cultivo durante la noche hasta su transplante en los ratones con scid.

Animales y transplante en ratones SCID

Ratones macho (Harlan) con SCID se mantuvieron aislados. Empleando un microscopio de diseccion, las pancreasas o islotes se implantaron debajo de la capsula del rinon, como se describio anteriormente (17, 33). Despues del transplante en diferentes puntos de tiempo, se sacrificaron los ratones, se elimino el rinon, y se disecciono el injerto. Todos los estudios y protocolos animales fueron aprobados por la Oficina de Inspeccion Veterinaria segun la legislacion Francesa bajo el acuerdo numero B75-13-03.

Inmunotincion de los explantes y lineas celulares pancreaticas

Los tejidos se fijaron en 3,7% de formaldehido antes de embeberlos en parafina. Se prepararon y procesaron para inmunohistoquimica, secciones (4gm de espesor), como se describe anteriormente (Attali et al., 2007). Los siguientes anticuerpos se emplearon para inmunotincion: anticuerpo anti-insulina de cerdo de Guinea (1/500, DakoCytomation); anti-glucagon de conejo (1/1000, Euromedex); anticuerpo anti-somatostatina de conejo (1/500, DakoCytomation); anticuerpo PDX1 anti-humano de conejo (1/2000) (45); anticuerpo anti-SOX9 de conejo (1/500, Millipore); anticuerpo anti-carboxipeptidasa A de conejo (1/600, AbD Serotec); antigeno anti-SV40LT de raton (1/50, Calbiochem Merck Biosciences) y antigeno anti-humano Ki67 de raton (1/50 DakoCytomation). Los anticuerpos secundarios, fueron anticuerpo anti-raton conjugados con fluoresceina (1/200; Jackson Immunoresearch Laboratories, Beckman Coulter); anticuerpo de anti-cerdo de Guinea rojo-Texas (1/200; Jackson Immunoresearch Laboratories).

Se capturaron imagenes digitales empleando una camara acoplada a un dispositivo de carga de tres-chips refrigerados (Hamamatsu C5810; Hamamatsu) que estaba unido a un microscopio fluorescente (Leika; Leitz).

Resultados

Se transdujeron pequenos trozos de rudimentos pancreaticos neonatales con un vector lentiviral que expresa SV40LT bajo el control de un fragmento largo de 405 nucleotidos del promotor II de insulina de rata. Los tejidos transducidos resultantes se transplantaron a continuacion bajo la capsula del rinon de ratones con SCID. El tejido pancreatico se transplanto en el dia 12 y a los siete meses. En el dia 12, el analisis inmunohistoquimico empleando anticuerpos anti-insulina y anti-SV40T indicaron que cerca del 50% de las celulas positivas a insulina se tineron positivamente para SV40T, demostrando una transduccion y supervivencia eficaces (Fig. 1). Despues de 7 meses, el analisis inmunohistoquimico empleando el anticuerpo anti-insulina, anti-SV40T y anti-Ki67, demostro una proliferacion principal de celulas beta (Fig. 2). Como se esperaba, la proliferacion de celulas beta se tino positivamente para el factor de transcripcion PDX1 y negativamente para glucagon y somatostatina (datos no mostrados). En esta etapa, algunas de las celulas se sub-transplantaron a nuevos ratones con SCID como se describio (Ravassard et al., 2011). Un mes mas tarde, la glucemia descendio en tales ratones transplantados, un signo de formacion rapida de insulinoma.

Se derivo una linea celular a partir de tal insulinoma. Estas celulas se tineron para inmunocitoquimica. Como se muestra en la Fig. 3, la tincion es muy rica para insulina y PDX1 y esta presente para el antigeno T Grande.

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25 Soria, B., Roche, E., Berna, G., Leon-Quinto, T., Reig, J A., and Martin, F. (2000). Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalise glycaemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49, 157-162.

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Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para preparar celulas beta pancreaticas humanas o tumores de celulas beta humanas, que comprende las etapas de:

   a) disociar con colagenasa in vitro, el tejido pancreatico humano neonatal de un individuo de menos de 5 anos de edad, para obtener celulas pancreaticas humanas neonatales;

   b) transducir y co-transducir las celulas pancreaticas humanas neonatales obtenidas en la etapa a) con i) un vector lentiviral que expresa el antigeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina, o ii) con un vector lentiviral que expresa el antigeno T SV40 Grande bajo el control del promotor de insulina y un vector lentiviral que expresa hTERT bajo el control del promotor de insulina, o iii) un vector lentiviral que expresa tanto el antigeno T SV40 Grande como hTERT;

   c) introducir las celulas pancreaticas neonatales transducidas obtenidas en b) dentro de la capsula del rinon de un animal no humano con inmunodeficiencia comprometida severa (scid);

   d) permitir a las celulas del pancreas transducidas desarrollar estructuras similares al insulinoma, en donde las celulas del pancreas humanas neonatales en las estructuras similares al insulinoma tienen diferenciadas las celulas beta pancreaticas que producen insulina;

   e) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa de, disociar las celulas de las mismas;

   f) sub-transplantar las celulas obtenidas en la etapa e) dentro de la capsula del rinon de un nuevo animal no humano con scid;

   g) permitir a las celulas sub-transplantadas en la etapa f) desarrollar y regenerar las estructuras similares al insulinoma, en donde dichas estructuras similares al insulinoma desarrolladas nuevamente estan enriquecidas en celulas beta pancreaticas que producen insulina;

   h) micro-diseccionar las estructuras similares al insulinoma obtenidas en la etapa g), y disociar y recoger las celulas de las mismas;

   i) opcionalmente, sub-transplantar las celulas obtenidas en la etapa g) dentro de la capsula del rinon de un nuevo animal no humano con scid, permitiendo ademas por lo tanto el enriquecimiento y la amplificacion de celulas beta pancreaticas que producen insulina; y,

   j) opcionalmente repetir las etapas f), g) y h) hasta obtener la cantidad apropiada de celulas beta pancreaticas que producen insulina.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la construccion de los vectores lentivirales permite la inmortalizacion reversible o condicionada.
3. 
   3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde los vectores lentivirales comprenden al

   
   menos un sitio Lox P y se eliminan los genes T SV40 Grande y/o hTERT mediante la accion de la

   recombinasa Cre.
4. 
   4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde los vectores lentivirales comprenden al

   
   menos un sitio FRT y se eliminan los genes T SV40 Grande y/o hTERT mediante la accion de la

   recombinasa FLP.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el vector lentiviral que expresa T SV40 Grande y el vector lentiviral que expresa hTERT comprenden ademas un sitio LoxP o FLP, siempre y cuando los sitios de recombinacion especificos del sitio sean diferentes en dichos vectores.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde se realiza una etapa de seleccion negativa despues de la accion recombinasa Cre o FLP, para seleccionar solo las celulas en las que se ha eliminado la inmortalizacion de los genes T SV40 Grande y/o hTERT.
7. 7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde dichos vectores lentivirales incluyen al menos un gen marcador de seleccion negativa.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde el gen marcador negativo se selecciona del grupo constituido por el gen HSV-TK, el gen hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), el gen guanina-fosforribosil-transferasa (Gpt), y el gen deaminasa de citosina.

   10
9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho animal no-humano con scid es un raton con scid.
10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende ademas transducir las celulas de la etapa e) con un vector lentiviral que expresa un gen de resistencia a antibiotico bajo el control del promotor de insulina.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en donde el gen de resistencia a antibiotico es un gen de resistencia a neomicina.
12. 12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende ademas recoger las celulas beta pancreaticas humanas obtenidas en la etapa j) para formar una poblacion de celulas homogeneas y opcionalmente, cultivar in vitro dicha poblacion para establecer una linea celular beta funcional humana.
13. 13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha colagenasa es la colagenasa XI.
14. 14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende ademas una o mas etapas de recuperacion incluyendo la eliminacion del T SV40 Grande, el hTERT y/o los transgenes de resistencia a antibiotico.

    15