ES2635872T3 - Nuevas composiciones para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica - Google Patents

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de la Esclerosis Lateral Amiotrófica ("ELA") o un trastorno relacionado seleccionado de Esclerosis Lateral Primaria (ELP), Atrofia Muscular Progresiva (AMP), Parálisis Pseudobulbar y Parálisis Bulbar Progresiva (PBP) y Demencia Fronto Temporal (DFT), que comprende (i) acamprosato, o una sal del mismo, o una formulación de liberación sostenida del mismo, y (ii) baclofeno, o una sal del mismo, o una formulación de liberación sostenida del mismo.

Description

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Medicamento

Números CAS Clase o índice de similitud de Tanimoto

taurina

107-35-7 0,5

baclofeno y compuestos relacionados

baclofeno

1134-47-0; 66514 -99 -6; 69308-37-8; 70206 -22 -3; 63701-56-4; 63701-55-3 N/A

ácido 3-(p-clorofenil)-4hidroxibutírico

/ Metabolito

arbaclofen placarbil

847353-30-4 Profármaco

mexiletina y compuestos relacionados

mexiletina

31828-71-4; 5370-01-4

6-hidroximetilmexiletina

53566-98-6 Metabolito

4-hidroximexiletina

53566-99-7 Metabolito

3-hidroximexiletina (MHM)

129417-37-4 Metabolito

N-hidroximexiletina glucuronida

151636-18-9 Metabolito

sulfisoxazol y compuestos relacionados

sulfisoxazol

127-69-5; 4299-60-9

N(4)-acetilsulfisoxazol

4206-74-0 Metabolito

sulfisoxazol acetilo

80-74-0 Profármaco

sulfametoxazol

723-46-6 0,52

cinacalcet y compuestos relacionados

cinacalcet

226256-56-0; 364782-34-3

ácido hidrocinnámico

501-52-0 Metabolito

torasemida y compuestos relacionados

torasemida

56211-40-6; 72810-59-4

hidroxitorasemida

99300-68-2; 99300-67-1 Metabolitos

carboxitorasemida

Metabolito

tolbutamida

64-77-7 0,55

Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden 2, 3, 4 ó 5 fármacos distintos, incluso más preferiblemente 2, 3 ó 4 fármacos distintos para el tratamiento combinado de ELA o un trastorno relacionado en un sujeto que lo necesite.

5 En una realización particular, la invención describe una composición en sí que comprende baclofeno y cinacalcet, o acamprosato y cinacalcet o sal(es) o profármaco(s) o derivado(s) de cualquier pureza o formulaciones de liberación sostenida.

En otro ejemplo, la invención describe una composición que comprende acamprosato y cinaclacet o sal(es) o profármaco(s) o derivado(s) de cualquier pureza o formulaciones de liberación sostenida para su uso en el

10 tratamiento de la ELA o un trastorno relacionado, en el que la dosificación diaria de acamprosato es igual o inferior a 10 mg.

Además, en otro ejemplo particular, las composiciones y métodos de la presente descripción utilizan además Riluzol,

o una sal, profármaco, derivado de cualquier pureza, o formulación de liberación sostenida del mismo. Los

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Los fármacos o las composiciones de la invención pueden administrarse repetidamente al sujeto.

Las composiciones de la invención típicamente comprenden uno o varios vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Un objeto adicional de esta invención se refiere al uso de al menos dos fármacos seleccionados del grupo que

consiste en acamprosato, baclofeno, cinacalcet, mexiletina, sulfisoxazol y torasemida para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la ELA o un trastorno relacionado por administración combinada, separada o secuencial a un sujeto que lo necesite.

Un objeto adicional de esta invención se refiere al uso de al menos una de las siguientes combinaciones de fármacos: -baclofeno y cinacalcet, -cinacalcet y acamprosato, -baclofeno y acamprosato, -baclofeno y acamprosato y torasemida, -mexiletina y cinacalcet, -torasemida y baclofeno, o

-torasemida y sulfisoxazol, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la ELA o un trastorno relacionado mediante la administración combinada, separada o secuencial a un sujeto que lo necesite.

En una realización particular, la invención se refiere también al uso de al menos un fármaco seleccionado del grupo que consiste en acamprosato, baclofeno, cinacalcet, mexiletina, sulfisoxazol y torasemida en una combinación con el riluzol para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de ELA o un trastorno relacionado mediante la administración combinada, separada o secuencial a un sujeto que lo necesite.

Otra realización se refiere al uso de al menos dos fármacos seleccionados del grupo que consiste en acamprosato, baclofeno, cinacalcet, mexiletina, sulfisoxazol y torasemida en una combinación con el riluzol para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la ELA o un trastorno relacionado por la administración combinada, separada

o secuencial a un sujeto que lo necesite.

En una realización más particular, esta invención se refiere al uso de al menos una de las siguientes combinaciones de fármacos: -baclofeno y cinacalcet, -cinacalcet y acamprosato, -baclofeno y acamprosato, -baclofeno y acamprosato y torasemida, -mexiletina y cinacalcet, -torasemida y baclofeno, o -torasemida y sulfisoxazol, en una combinación con riluzol, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la ELA o un trastorno

relacionado mediante la administración combinada, separada o secuencial a un sujeto que lo necesite.

Un objeto adicional es un método para preparar una composición farmacéutica, comprendiendo el método mezclar los compuestos anteriores en un excipiente o vehículo apropiado. La terapia de acuerdo con la invención puede proporcionarse en el hogar, en el consultorio del médico, en una

clínica, en un departamento de hospitalización del hospital o en un hospital, para que el médico pueda observar los

efectos de la terapia de cerca y hacer los ajustes necesarios. La duración de la terapia depende de la etapa de la enfermedad, la edad y condición del paciente, y cómo el paciente responde al tratamiento.

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plasmática que conduce a un efecto terapéutico es pequeña, en general, el índice terapéutico, TI, se define como la relación de la dosis letal media (LD50) respecto a la mediana de la dosis efectiva (ED50)); (ii) una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal; o (iii) una semivida biológica muy corta, de modo que se requiere una dosificación frecuente durante un día para mantener el nivel en plasma a un nivel terapéutico.

Cualquiera de una serie de estrategias puede ser perseguida con el fin de obtener una liberación controlada en la que la tasa de liberación supera la tasa de metabolismo de la droga en cuestión. La liberación controlada puede obtenerse mediante la selección apropiada de diversos parámetros e ingredientes de formulación, incluyendo, por ejemplo, diversos tipos de composiciones de liberación controlada y revestimientos. De este modo, el fármaco se formula con excipientes apropiados en una composición farmacéutica que, después de su administración, libera el fármaco de una manera controlada (comprimidos o composiciones de cápsulas individuales o múltiples, soluciones oleosas, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, y liposomas).

Formas de dosificación sólidas para uso oral

La vía de administración preferida para el cilostazol y para el riluzol es la vía oral. Las formulaciones para uso oral incluyen tabletas que contienen el ingrediente(s) activo(s) en una mezcla con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, excipientes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa, celulosa microcristalina, almidones incluyendo almidón de patata, carbonato de calcio, cloruro sódico, fosfato cálcico, sulfato cálcico o fosfato sódico); agentes de granulación y desintegración (por ejemplo, derivados de celulosa incluyendo celulosa microcristalina, almidones que incluyen almidón de patata, croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico); agentes aglutinantes (por ejemplo, acacia, ácido algínico, alginato de sodio, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona o polietilenglicol); y agentes lubricantes, deslizantes y antiadhesivos (por ejemplo, ácido esteárico, sílices o talco). Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes tamponantes y similares.

Los comprimidos pueden estar sin revestimiento o pueden recubrirse por técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y, de este modo, proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. El revestimiento puede estar adaptado para liberar la sustancia farmacéutica activa en un patrón predeterminado (por ejemplo, para conseguir una formulación de liberación controlada) o puede adaptarse para no liberar la sustancia farmacológica activa hasta después del paso del estómago (revestimiento entérico). El revestimiento puede ser un revestimiento de azúcar, un revestimiento de película (por ejemplo, a base de hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona), o un revestimiento entérico (por ejemplo, un copolímero a base de ácido metacrílico, acetato ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo, goma laca y/o etilcelulosa). Se puede emplear un material de retardo de tiempo tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las composiciones de comprimidos sólidos pueden incluir un revestimiento adaptado para proteger la composición de cambios químicos no deseados (por ejemplo, la degradación química antes de la liberación de la sustancia farmacológica activa). El revestimiento puede aplicarse sobre la forma de dosificación sólida de una manera similar a la descrita en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.

Los fármacos se pueden mezclar juntos en el comprimido, o pueden dividirse. Por ejemplo, un primer fármaco está contenido en el interior del comprimido, y un segundo fármaco está en el exterior, de manera que una porción sustancial del segundo fármaco se libera antes de la liberación del primer fármaco.

Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como comprimidos masticables o como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un excipiente sólido inerte (por ejemplo, almidón de patata, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín) o como cápsulas de gelatina blandas en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, parafina líquida o aceite de oliva. Los polvos y granulados se pueden preparar usando los ingredientes mencionados anteriormente en comprimidos y cápsulas de una manera convencional.

Las composiciones de liberación controlada para su uso oral pueden, por ejemplo, ser construidas para liberar el fármaco activo controlando la disolución y/o la difusión de la sustancia farmacológica activa.

La disolución o liberación controlada por difusión puede conseguirse mediante un revestimiento apropiado de una formulación de comprimidos, cápsulas, gránulos o granulados de fármacos, o incorporando el fármaco en una matriz apropiada. Un revestimiento de liberación controlada puede incluir una o más de las sustancias de revestimiento mencionadas anteriormente y/o, por ejemplo, goma laca, cera de abejas, glicol, cera de ricino, cera de carnauba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, dl-ácido poliláctico, butirato de acetato de celulosa, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, vinil pirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metilo, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1,3butilenglicol, metacrilato de etilenglicol y/o polietilenglicoles. En una formulación de matriz de liberación controlada,

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el material de matriz también puede incluir, por ejemplo, metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, cloruro de polivinilo, polietileno y/o fluorocarbono halogenado.

Una composición de liberación controlada que contiene uno o más de los fármacos de las combinaciones reivindicadas también puede estar en forma de un comprimido o cápsula flotante (es decir, un comprimido o cápsula que, tras la administración oral, flota sobre el contenido gástrico durante cierto tiempo período de tiempo). Se puede preparar una formulación en comprimido flotante del fármaco o fármacos mediante la granulación de una mezcla del fármaco o fármacos con excipientes y un 20 -75% p/p de hidrocoloides, tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa. Los gránulos obtenidos se pueden comprimir a continuación en comprimidos. En contacto con el jugo gástrico, el comprimido forma una barrera de gel sustancialmente impermeable al agua alrededor de su superficie. Esta barrera de gel toma parte en el mantenimiento de una densidad de menos de uno, permitiendo de este modo que el comprimido permanezca flotante en el jugo gástrico.

Líquidos para la administración oral

Los polvos, polvos dispersables o gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por adición de agua son formas de dosificación convenientes para la administración oral. La formulación como suspensión proporciona el ingrediente activo en una mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato sódico y similares.

Composiciones parenterales

Aunque se prefiere menos, la composición farmacéutica también puede administrarse parenteralmente mediante inyección, infusión o implantación (intravenosa, intramuscular, subcutánea o similar) en formas de dosificación, formulaciones o mediante dispositivos de liberación adecuados o implantes que contengan vehículos y adyuvantes convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables. La formulación y preparación de tales composiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica de la formulación farmacéutica.

Las composiciones para uso parenteral pueden proporcionarse en formas de dosificación unitarias (por ejemplo, en ampollas de dosis única), o en viales que contienen varias dosis y en las que se puede añadir un conservante adecuado (véase más adelante). La composición puede estar en forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión o un dispositivo de administración para su implantación o puede presentarse como un polvo seco a reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Aparte de los fármacos activos, la composición puede incluir vehículos y/o excipientes adecuados parenteralmente aceptables. El(los) fármaco(s) activo(s) se pueden incorporar en microesferas, microcápsulas, nanopartículas, liposomas o similares para su liberación controlada. La composición puede incluir agentes de suspensión, solubilización, estabilización, ajuste del pH y/o agentes dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar en la forma adecuada para la inyección estéril. Para preparar dicha composición, el fármaco o los fármacos activos adecuados se disuelven o suspenden en un vehículo líquido parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, agua ajustada a un pH adecuado por adición de una cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o un tampón adecuado, 1,3-butanodiol, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. La formulación acuosa puede contener también uno o más conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo). En los casos en que uno de los fármacos es sólo escasamente o ligeramente soluble en agua, se puede añadir un agente potenciador de la disolución o solubilizante, o el disolvente puede incluir 10 -60% p/p de propilenglicol o similar.

Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluciones de aceite, suspensiones oleosas o emulsiones. Alternativamente, el(los) fármaco(s) activo(s) se pueden incorporar en vehículos biocompatibles, liposomas, nanopartículas, implantes o dispositivos de infusión. Los materiales para usar en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, por ejemplo, polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalactina, poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(2-hidroxietil-L-glutamina). Los vehículos biocompatibles que pueden usarse cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada son carbohidratos (por ejemplo, dextranos), proteínas (por ejemplo, albúmina), lipoproteínas o anticuerpos. Los materiales para uso en implantes pueden ser no biodegradables (por ejemplo, polidimetilsiloxano) o biodegradables (por ejemplo, poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) o poli(ortoésteres)).

Rutas alternativas

Aunque menos preferidas y menos convenientes, pueden contemplarse otras vías de administración, y por lo tanto otra formulación. A este respecto, para la aplicación rectal, las formas de dosificación adecuadas para una composición incluyen supositorios (tipo emulsión o suspensión) y cápsulas de gelatina rectal (soluciones o suspensiones). En una formulación de supositorio típica, el(los) fármaco(s) activo(s) se combinan con una base de supositorio farmacéuticamente aceptable apropiada tal como manteca de cacao, ácidos grasos esterificados,

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medio de cultivo definido que consistía en Neurobasal suplementado con B27 (2%), L-glutamina (0,2 mM), 2% de solución PS y 10 ng/ml de BDNF. Las células viables se contaron en un citómetro de Neubauer usando la prueba de exclusión de azul de tripano. Las células se sembraron a una densidad de 30.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos (los pocillos se pre-recubrieron con poli-L-lisina (10 μg/ml)) y se cultivaron a + 37ºC en una atmósfera de aire humidificado (95%)/CO2 (5%).

Ensayos de toxicidad del glutamato

El efecto neuroprotector de los compuestos se evaluó mediante la cuantificación de la red de neuritas (inmunoticción de neurofilamentos (NF)) que revela específicamente las neuronas glutamatérgicas.

Después de 12 días de cultivo neuronal, los fármacos de las combinaciones candidatas se resolvieron en medio de cultivo (+ 0,1% de DMSO). Las combinaciones candidatas se preincubaron entonces con las neuronas durante 1 hora antes de la lesión por glutamato. Una hora después de la incubación, se añadió glutamato durante 20 min, a una concentración final de 40 m, en presencia de combinaciones candidatas, con el fin de evitar diluciones de fármaco adicionales. Al final de la incubación, el medio se cambió con el medio con la combinación candidata pero sin glutamato. El cultivo se fijó 24 horas después de la lesión con glutamato. MK801 (maleato de dizocilpinehidrógeno, 77086-22-7 -20 μΜ) se utilizó como un control positivo.

Después de la permeabilización con saponina (Sigma), las células se bloquearon durante 2 horas con PBS que contenía suero de cabra al 10%, después se incubaron las células con anticuerpo primario monoclonal de ratón contra anticuerpo Neurofilament (NF, Sigma). Este anticuerpo se reveló con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488.

Los núcleos de las células se marcaron mediante un marcador fluorescente (Hoechst solución, SIGMA), y red de neurita cuantificada. Se utilizaron seis pozos por condición para evaluar la supervivencia neuronal en 3 cultivos diferentes.

Resultados

Todas las combinaciones de fármacos probadas dan un efecto protector frente a la toxicidad del glutamato para las células neuronales corticales. Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Como se ejemplifica en las figuras 1, 3 y 4, las combinaciones de la invención protegen fuertemente a las neuronas de la toxicidad del glutamato bajo las condiciones experimentales descritas anteriormente. Es de notar que se observa una protección eficaz usando concentraciones de fármaco en las que los fármacos usados solos no tienen un efecto protector significativo o tienen uno menor.

De hecho, como se ejemplifica en la figura 3, la combinación de mexiletina -cinacalcet protege eficazmente las células neuronales de la toxicidad del glutamato, mientras que no se proporciona protección por los fármacos individuales. La combinación de baclofeno -acamprosato (figura 1) da un efecto protector contra la toxicidad del glutamato para las células neuronales corticales. La combinación de baclofeno y acamprosato induce una mejora de más del 200% en comparación con el acamprosato solo y más del 47% en comparación con el baclofeno usado solo.

Tabla 2

Combinación de fármacos

Efecto neuroprotector frente a la toxicidad del glutamato

baclofeno y torasemida

+

baclofeno-acamprosato-torasemida

+

mexiletina y cinacalcet

+

sulfisoxazol y torasemida

+

baclofeno y acamprosato

+

acamprosato y cinacalcet

+

baclofeno y cinacalcet

+

2. Efecto protector frente a la toxicidad del glutamato en cultivos primarios de co-cultivo de músculo-nervio Cocultivos primarios de células nerviosas y musculares

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El músculo humano se prepara de acuerdo con un método previamente descrito a partir de porciones de biopsia de un sujeto sano (39). Las células musculares se establecen a partir de células disociadas (20.000 células por pocillo), se recubren en placas revestidas con gelatina al 0,1% en placas de 48 pocillos y se cultivan en un medio proliferante que consiste en una mezcla de 75% de medio MEM con 25% de medio M199 suplementado con Glutamina 2 mM, insulina bovina 10 μg/ml, factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 10 ng/ml, factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano básico 2 ng/ml, suero de ternera fetal 10% (FCS) y penicilina al 2% 10.000 U/ml y estreptomicina (10 mg/ml).

Inmediatamente después de la fusión de células satelitales, se colocan en la monocapa muscular (un explante por pocillo, en el área central) cortes transversales enteros de médulas espinales de embriones de ratas Wistar de 13 días de edad con 4 ganglios de raíz dorsal (DRG). Los DRG son necesarios para lograr una buena relación de innervaciones. Los cultivos innervados se mantienen en un medio mixto (75% de MEM con 25% de M199), suplementado con glutamina 2 mM, FCS al 5%, insulina bovina 5 μg/ml y 2% de penicilina 10.000 U/ml y estreptomicina (10 mg/ml).

Después de 24h de co-cultivo, se observan neuritas que crecen fuera de los explantes de la médula espinal. Hacen contactos con los miotubos e inducen las primeras contracciones después de unos 8 días. Rápidamente después de esto, las fibras musculares innervadas localizadas en la proximidad de los explantes de la médula espinal se contraen virtualmente continuamente. Las fibras innervadas son morfológicamente y espacialmente distintas de las no inervadas y se pueden distinguir fácilmente de ellas.

Lesión por glutamato

El día 27, los co-cultivos se incuban con compuestos candidatos, combinación de los mismos o riluzol una hora antes de la intoxicación con glutamato (60 μΜ) durante 20 min. A continuación, se lavan los co-cultivos y se añaden los compuestos candidatos, la combinación de los mismos y/o el riluzol durante 48 horas adicionales. Después de este tiempo de incubación, los cocultivos no fijados se incuban con -bungarotoxina acoplada con Alexa 488 a una concentración de 500 nmol/l durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los cocultivos se fijan por PFA durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la permeabilización con 0,1% de saponina, los cocultivos se incuban con un anticuerpo monoclonal anti-neurofilamento de ratón (NF, dilución 1/400).

Estos anticuerpos se detectan con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 568 (Molecular Probes, dilución 1/400), los núcleos de las neuronas se marcan con un marcador fluorescente (solución Hoechst, 1 μg/ml en la misma solución).

Los puntos finales son (1) la longitud total de la neurita, (2) el número de unidades motoras, (3) el área total de la unidad motora, que son indicativos de la supervivencia y funcionalidad de la neurona motora.

Para cada condición, se toman 2 x 10 imágenes por pocillo usando InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) con una ampliación de 20x. Todas las imágenes se toman en las mismas condiciones.

Lesión por glutamato con pre-tratamiento de riluzol

El día 23 (es decir, 4 días de pretratamiento), los co-cultivos se incuban con riluzol. Después de 4 días (es decir, el día 27), las combinaciones de fármacos se añaden una hora antes de la adición de glutamato y luego se añade glutamato (60 μΜ) durante 20 min. Los cocultivos se tratan a continuación para el análisis de inmunofluorescencia como se ha indicado anteriormente.

Resultados

Se observa una protección significativa para los tres puntos finales cuando los fármacos se usan en combinación, en concentraciones donde, cuando se usan solos, no se observa ningún efecto. Las combinaciones de fármacos probados se enumeran en la Tabla 3 y se ejemplifican en la Figura 2. Este efecto sinérgico inesperado permite el uso de fármacos a dosis tan bajas que se deben superar los efectos secundarios potenciales.

Tabla 3

Combinación de fármacos

Efecto protector frente a la intoxicación por glutamato en los co-cultivos musculares y nerviosos

baclofeno y cinacalcet

+

cinacalcet y acamprosato

+

baclofeno-torasemida

+

baclofeno-acamprosatotorasemida

+

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Tanto el riluzol como las combinaciones de fármacos se administran per os. La ciclodextrina se utiliza como vehículo a la concentración final del 5%, diluida en agua a temperatura ambiente a partir de la solución madre (ciclodextrina al 20%). El tratamiento con combinaciones de fármacos (10 ml/kg) y vehículo comienza a la edad de 60 días y continúa hasta que los ratones alcanzan los 150 días de edad. Las combinaciones de fármacos se administraron p.o. BID entre 8-11 am y 4-7 pm.

Configuración experimental de ratones

Al establecer grupos para el estudio (es decir, elemento de ensayo o de control tratados), los ratones transgénicos se distribuyen al azar en grupos de manera que camadas completas de ratones no terminan en un solo grupo de ensayo, evitando así los efectos de camada en los resultados globales. Además, los grupos están igualmente equilibrados en la relación machos/hembras.

Los ratones hembra se alojan en grupos de 5 ratones máximos y los machos son alojados individualmente. Se deja que los ratones se aclimaten a la sala experimental durante al menos una hora antes del comienzo de cualquier experimento. Los ratones son transportados de la sala de la colonia a los cuartos experimentales en sus jaulas habituales.

Peso corporal

La pérdida de peso ha demostrado correlacionarse bien con el desarrollo de la enfermedad y se califica fácilmente conjuntamente con las etapas de la enfermedad. Los ratones serán pesados una vez a la semana el mismo día de cada semana (lunes) a la edad de 60-91 días y tres veces a la semana (de lunes a miércoles) después de que lleguen a la edad de 91 días (13 semanas).

Puntuación clínica

El elemento original (40) que describe la generación de los ratones SOD1-G93A informa de un inicio temprano de la enfermedad (~100 días) y una disminución rápida con los ratones afectados llegando a la etapa final en promedio en 40 días (supervivencia típica 130-150 días). Por lo tanto, los ratones se examinan cuidadosamente usando la puntuación clínica como se describe a continuación una vez por semana (lunes) hasta la edad de 91 días y tres veces a la semana (de lunes a miércoles) después de que lleguen a la edad de 91 días.

Los signos clínicos más tempranos son temblores y sacudidas de sus extremidades cuando los ratones son suspendidos brevemente en el aire por sus colas. El sistema de puntuación clínica está en una escala de 1 a 5; con 1 como punto final para la eutanasia y 5 como saludable con pocos o ningún signo de aparición de la enfermedad. Los animales se puntúan levantándolos suavemente por la base de sus colas y observándolos según los temblores, rigidez y su capacidad para extender sus extremidades.

Sistema de puntuación: 5 = saludable

•

4-5 = mayormente sanos, temblores menores, muy activos, extensión de todos los miembros

•

4 = temblores menores visibles, extensión de todos los miembros, muy activos

•

3-4 = temblores, con alguna rigidez menor, muy activos

•

3 = temblores, rigidez de los miembros, tal vez alguna parálisis menor, activos

•

2-3 = temblores, parálisis parcial, rigidez, la extensión de los miembros es forzada, activos

•

2 = parálisis, algo activos

•

1-2 = parálisis de las extremidades posteriores, sin extensión de las extremidades posteriores, se puede realizar la eutanasia dependiendo de la actividad del animal y su capacidad de enderezarse a los 30 segundos.

1 = punto final, animal incapaz de enderezarse.

El inicio de la enfermedad se registra cuando la puntuación llega a una etapa de la enfermedad de 4.

Pruebas conductuales

Todas las pruebas de comportamiento se detienen a la edad de 20 semanas cuando aproximadamente el 70% de los ratones TG del grupo vehículo se pierden. Después de esta edad los ratones restantes son demasiado frágiles para la prueba motora y sólo se someten a la medición del peso corporal, la etapa de la enfermedad y la puntuación de supervivencia.

Prueba de campo abierto

Se realizan mediciones de pruebas de campo abierto antes de comenzar la dosificación (línea de base) y alrededor del día 90 (13ª semana de edad) y el día 110 (16ª semana de edad). Los ratones nacidos a los 2-4 días se agrupan para pruebas en campo abierto. Las cámaras de actividad (Med Associates Inc, St Albans, VT, 27 x 27 x 20,3 cm) están equipadas con haces IR. Los ratones se colocan en el centro de la cámara y su comportamiento se registra

5 durante 10 min. Se registran la distancia movida, el número de levantamientos verticales y la velocidad promedio.

Rotarod

La prueba de Rotarod se realiza antes de comenzar la dosificación (línea de base) y alrededor del día 90 (13ª semana de edad) y día 110 (16ª semana de edad): Los ratones nacidos a los 2-4 días se agrupan para las pruebas de campo abierto. Una sesión de un día incluye un ensayo de entrenamiento de 5 min a 4 RPM en el aparato rotarod

10 (AccuScan Instruments, Columbus, EE.UU.). Una hora más tarde, los animales se ensayan durante 3 ensayos de aceleración consecutivos de 6 minutos con la velocidad cambiando de 0 a 40 RPM durante 360 segundos y un intervalo entre ensayos de al menos 30 minutos. Se registra la latencia a caer de la varilla. Los ratones que permanecen en la varilla durante más de 360 segundos se retiran y su tiempo se anota como 360 segundos.

Resultados

15 Las terapias de combinación son eficientes en el modelo de ELA in vivo.

Se observa una mejora de la enfermedad para los animales enfermos tratados con las combinaciones de fármacos de la invención. En particular, las combinaciones de fármacos de la invención mejoran eficazmente la puntuación clínica de estos animales durante las diferentes etapas de la enfermedad (Tabla 5) y también los resultados en las pruebas de comportamiento anteriores (Tabla 6).

20 Tabla 5

Combinación de fármacos

Mejora de la puntuación clínica global

baclofeno y cinacalcet

+

cinacalcet y acamprosato

+

baclofeno-torasemida

+

baclofen-acamprosato-torasemida

+

mexiletina y cinacalcet

+

sulfisoxazol y torasemida

+

baclofeno y acamprosato

+

Tabla 6 5

Combinación de fármacos

Pruebas conductuales Mejora de los resultados

prueba de rotarod

prueba de campo abierto

baclofeno y cinacalcet

+ +

cinacalcet y acamprosato

+ +

baclofeno-torasemida

+ +

baclofeno-acamprosato-torasemida

+ +

mexiletina y cinacalcet

+ +

sulfisoxazol y torasemida

+ +

baclofeno y acamprosato

+ +

10

15

20

25

30

35

Las composiciones de la invención son también eficientes para mejorar la puntuación clínica y el curso de la enfermedad en animales tratados con riluzol (Tabla 7).

Tabla 7

Combinación de fármacos

Mejora de la puntuación clínica global en animales tratados con riluzol

baclofeno y cinacalcet

+

cinacalcet y acamprosato

+

baclofeno-torasemida

+

baclofen-acamprosato-torasemida

+

mexiletina y cinacalcet

+

sulfisoxazol y torasemida

+

baclofeno y acamprosato

+

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5

10

15

20

25

30

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Claims (1)

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