ES2636741T3 - Composición de insulina de acción prolongada - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de insulina en una concentración de al menos 10 mg/ml, caracterizada por tener un perfil farmacocinético in vivo sustancialmente sin aumento brusco del compuesto de insulina, y en donde el compuesto de insulina está completamente contenido en un depósito, y en donde el compuesto de insulina está unido covalentemente en el depósito, en donde el compuesto de insulina es un profármaco o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, que es un conjugado de insulina-conector D-L, en donde D representa el resto de insulina; y -L es un resto conector biológicamente no activo -L1 representado por la fórmula (I), **(Ver fórmula)** en donde la línea de trazos indica la unión a uno de los grupos amino de la insulina por formación de un enlace amida; X es C(R3R3a); o N(R3); R1a, R3a se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, NH(R2b), N(R2b)C(O)R4 y alquilo C1-4; R1, R2 R2a, R2b, R3, R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-4, en donde L1 está sustituido con un L2-Z y opcionalmente sustituido adicionalmente, con la condición de que el hidrógeno marcado con un asterisco en la fórmula (I) no se sustituya por ningún sustituyente, y en donde L2 es un enlace simple químico o un espaciador; y Z es un hidrogel.
Description
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DESCRIPCION
Composicion de insulina de accion prolongada.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de insulina, al uso de la composicion, un metodo de tratamiento, un kit de piezas, asf como al tratamiento de combinacion con un compuesto GLP-1, tal como un agonista de GLP-1. La composicion farmaceutica se puede administrar con menos frecuencia que las insulinas de actuacion prolongada actuales y se caracteriza por la liberacion de insulina estructuralmente intacta a lo largo del periodo de tiempo completo entre administraciones, sin sustancialmente aumento brusco del compuesto de insulina. Este tratamiento puede ayudar a los pacientes a reducir la frecuencia de las inyecciones, mientras que puede mantener el control optimo de los niveles plasmaticos de insulina y por consiguiente de la glucosa en la sangre.
Antecedentes
El tratamiento de insulina se caracteriza por una alta necesidad para mantener la liberacion del farmaco de insulina dentro de niveles muy estrictos ya que la ventana terapeutica es estrecha, y los efectos adversos de hiperinsulinemia pueden ser potencialmente mortales. Se han comercializado numerosas preparaciones de insulina, con diferentes perfiles de accion para adecuarse a las necesidades espedficas de la poblacion diabetica. Los analogos de insulina de accion rapida se administran justo antes de comidas, con el fin de controlar el pico de glucosa plasmatica despues de ingestion de alimento, mientras que los analogos de insulina de accion prolongada se dan tfpicamente una o dos veces al dfa para proporcionar un nivel de insulina basal estable.
Desarrollos recientes tambien han incluido la insulina oral e insulina inhalada. Sin embargo, debido a que la insulina es una protema, cuando se toma por via oral es digerida facilmente por el estomago y el sistema gastrointestinal. Alternativamente, la insulina inhalable suministrada a traves de un inhalador a los pulmones estuvo disponible en el mercado durante un periodo limitado (Exubera®, Pfizer interrumpido en 2007). Esta formulacion proporcionaba insulina durante un periodo de horas, pero requena que los pacientes continuaran inyectandose una insulina basal de accion prolongada. Desventajas adicionales de la insulina inhalable inclrnan las dificultades de fabricacion que daban como resultado un sistema de suministro prohibitivamente caro. Como resultado, todas las formulaciones de insulina disponibles en el mercado deben administrarse bien por inyeccion subcutanea o intravenosa.
El perfil plasmatico de las diferentes insulinas disponibles se caracteriza por tener diferentes perfiles plasmaticos. Dichos perfiles plasmaticos se pueden describir como que tienen una concentracion plasmatica maxima y una minima que depende de la formulacion y el tipo de insulina usada. Es muy importante obtener un perfil plasmatico que sea tanto reproducible de un paciente a otro como en el mismo paciente con el fin de poder predecir el efecto de disminucion de la glucosa plasmatica de la insulina administrada. Ademas, en el caso de administraciones multiples de insulina basal, es deseable tener tan poca diferencia como sea posible entre la concentracion plasmatica maxima y la concentracion plasmatica minima. Esto conducira a una concentracion plasmatica mas constante de insulina, y por lo tanto un efecto de disminucion de la glucosa mas uniforme a lo largo del intervalo de dosificacion entero.
Los tratamientos de insulina basal estandar actuales consisten en administraciones diarias o dos veces al dfa de insulinas basales de accion prolongada tal como insulina NPH, insulina glargina o insulina detemir. Aunque el desarrollo de analogos de insulina mas nuevos se ha dirigido a reducir la variabilidad de los efectos insulinotropicos, el efecto de disminucion de la glucosa de estas formulaciones de accion prolongada se caracteriza todavfa por variaciones grandes entre sujetos e intrasujetos, como describen Heise et al. (Diabetes, 2004 (53), 1614-1620). En este estudio la insulina detemir presentaba la menor variacion farmacocinetica, con un coeficiente de variacion de 15 comparado con el CV de insulina NPH e insulina glargina de 26 y 34, respectivamente. Esta variabilidad bastante grande es un obstaculo principal para obtener el control optimo de la glucosa, ya que es diffcil predecir la exposicion a las moleculas de insulina.
El mismo estudio investigaba la variacion farmacodinamica evaluada por las tasas de infusion de glucosa (GIR). Esta evaluacion tambien demostraba que la insulina detemir tema menor variabilidad dentro de un sujeto que tanto la insulina NPH como la insulina glargina, con respecto al marcador farmacodinamico GIR. Ademas, este estudio demostraba que el efecto de la insulina en las tasas de infusion de glucosa no duraba todo el periodo de dosificacion completo de 24 horas, demostrando claramente la necesidad de una insulina de accion prolongada, que ofrezca accion de disminucion de la glucosa completa para toda la duracion entre dosis. Para superar este problema de las insulinas basales diarias que no duran un periodo de 24 horas entero, algunos pacientes dividen su dosis de insulina basal en dos inyecciones diarias, con el fin de obtener mejor control de la glucosa a lo largo del dfa.
Por lo tanto, hay una clara necesidad de nuevas preparaciones de accion prolongada de insulina, que liberen continuamente insulina a lo largo del periodo entero entre administraciones.
Ademas, incluso si los pacientes pueden gestionar su glucosa en la sangre con las inyecciones diarias de insulina basal, el inicio del tratamiento de insulina encuentra resistencia debido al regimen de inyeccion diario. Esto no es deseable, ya que la Asociacion de Diabetes Americana (ADA) y la Asociacion Europea para el Estudio de la
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Diabetes (EASD) reconocen que la insulina como el tratamiento de primera lmea despues de la metformina oral, ofrece el mejor resultado de tratamiento (DM Nathan et al., Diabetologica (2008) 51:8-11).
Si se pudiera reducir la frecuencia de inyeccion del tratamiento de insulina, es probable que la barrera psicologica de inicio de tratamiento de insulina se redujera, permitiendo asf que los pacientes iniciaran el tratamiento de insulina en una etapa anterior, mejorando mucho su estado de salud.
Un reto en el desarrollo de formulaciones de insulina basales de accion prolongada esta en el estrecho intervalo terapeutico para la insulina, y deben evitarse en cualquier circunstancia grandes variaciones de pico a valle en la farmacocinetica de la insulina asf como efectos de aumento brusco.
Se han propuesto varios procedimientos para reducir la frecuencia de administracion, mientras que todavfa se retiene la liberacion de insulina dentro de lfmites estrechos, pero no han conseguido prolongar la duracion de los efectos de disminucion de la glucosa mas alla de un par de dfas, aunque todavfa se caracterizan por tener una relacion pequena entre la concentracion plasmatica maxima y la concentracion plasmatica minima.
El documento WO 06003014 describe un hidrogel capaz de liberar insulina con la posibilidad de menor frecuencia de administracion comparado con las inyecciones de insulina basal diarias estandar. Sin embargo, la insulina es liberada a una velocidad demasiado rapida para asegurar el control insulinotropico estricto para periodos que se prolongan 2 dfas. De hecho, la insulina es liberada con una semivida de aproximadamente 30 horas, lo que significa que el profarmaco debe administrarse al menos cada 30 horas con el fin de que la relacion de pico a valle sea inferior a 2 en el estado estacionario.
El concepto de preparar un conjugado polimerico reversible de insulina ha sido explorado por Shechter et al. y se ha descrito en artfculos cientfficos y solicitudes de patente (p. ej. (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008(70), 19-28) y WO 2004/089280). La insulina se conjuga con un polfmero de PEG de 40 kDa a traves de una molecula espaciadora de 9-hidroximetil-7-(amino-3-maleimidopropionato)-fluoreno-N- hidroxisucinimida. La hidrolisis de dicha molecula espaciadora libera insulina con una semivida de 30 horas, lo que significa que el profarmaco debe administrarse al menos cada 30 horas con el fin de que la relacion de pico a valle sea inferior a 2 en el estado estacionario.
Se han hecho otros intentos de reducir la frecuencia de administracion de insulina. Hinds et al (Journal of Controlled Release, 2005 (104), 447-460) describen un metodo de produccion de una insulina una vez a la semana, primero por PEGilacion permanente de la molecula de insulina y despues posteriormente microencapsulacion de la insulina PEGilada en micropartfculas de PLGA. La encapsulacion en PLGA de protemas se ha mostrado que causa reacciones secundarias de los esteres de polfmero con grupos amino de peptido o protema. Se han observado productos de acilacion de acido lactico despues de exposicion de las formulaciones a disoluciones tamponadas a pH neutro. (Nat. Biotechnol. 18 (2000) 52-57; Pharm. Res. 11 (1994) 865-868; Pharm. Res. 19 (2002) 175-181).
Espedficamente para la insulina, se han demostrado efectos perjudiciales de las formulaciones de polfmero (Pharm. Dev. Technol. 4 (1999) 633-642; Pharm. Dev. Technol. 5 (2000) 1-9).
En el caso mencionado antes, la insulina ha sufrido una modificacion estructural sustancial a traves de la modificacion permanente por una entidad de polfmero de alto peso molecular, ya que la PEGilacion de insulina aparentemente sirve para proteger el peptido frente al deterioro en la formulacion de polfmero de PLGA.
Desgraciadamente, dichas insulinas modificadas de alto peso molecular pueden presentar menor eficacia por menor union al receptor y tambien pueden presentar reacciones en el sitio de inyeccion tales como lipodistrofia debida a la presencia prolongada de concentraciones altas de insulina de alto peso molecular en el tejido subcutaneo. Ademas, dichas insulinas PEGiladas presentaran un menor volumen de distribucion, que es una desventaja particular en el tratamiento de la diabetes.
Ademas, el perfil farmacocinetico del conjugado de insulina liberado se caracteriza por una liberacion de tipo aumento brusco inicial inmediatamente despues de la administracion, al que le sigue una disminucion de la concentracion plasmatica del conjugado de insulina, seguido de un aumento de la concentracion plasmatica del conjugado de insulina a lo largo de los siguientes dfas. Este perfil farmacocinetico es tfpico de formulaciones de farmacos microencapsuladas y puede conducir a una respuesta de glucosa impredecible en sujetos tratados con dicha formulacion.
Por lo tanto, el reto sigue siendo desarrollar insulina de accion prolongada sin comprometer los efectos farmacodinamicos de la insulina por union permanente a una entidad de alto peso molecular.
La situacion se complica ademas por el hecho de que se sabe que la insulina sufre rapidamente reacciones secundarias que estan relacionadas con la presencia de tres puentes disulfuro en la molecula. Por ejemplo, la insulina se puede dividir en cadenas A y B por escision de enlace disulfuro o se pueden formar dfmeros y oligomeros debido a las reacciones de intercambio de disulfuro. Dicha reorganizacion de disulfuros es particularmente probable, si las moleculas de insulina son forzadas a estar en contacto proximo de una forma aleatoria ("Stability of insulin: studies on the physical and chemical stability of insulin in pharmaceutical formulation", Jens Brange, Springer, 1994).
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Esta labilidad intrmseca de la molecula de insulina ha dificultado significativamente el progreso del desarrollo de depositos de accion prolongada y ha prevenido el uso de otras formulaciones de polfmero donde la insulina es encapsulada de una forma similar a un precipitado amorfo, que se sabe que da lugar a varios productos de degradacion que provienen del intercambio de disulfuro extenso.
En la tasa de reacciones secundarias influye ademas la concentracion de insulina, siendo la tasa mayor cuando la insulina esta presente en concentracion alta. Por lo tanto es un reto formular formulaciones de insulina de accion prolongada de concentracion alta, en las que la insulina no sufre reacciones secundarias indeseables.
Por lo tanto, hay una clara necesidad de nuevas preparaciones de insulina de accion prolongada que liberen continuamente insulina estructuralmente intacta a lo largo de todo el periodo entre administraciones, que al mismo tiempo retengan una relacion pequena entre la concentracion plasmatica de insulina mas alta y la mas baja con el fin de evitar concentraciones de insulina demasiado altas o demasiado bajas, que puedan ser potencialmente daninas para un paciente.
El requisito de insulina para los diabeticos es en gran medida individual, dependiendo la dosis de varios factores fisiologicos, que incluyen la funcion de las celulas beta pancreaticas, sensibilidad a la insulina, peso corporal e ingesta dietetica. No es infrecuente que los pacientes requieran 40 UI de insulina o mas al dfa. Esto es equivalente a 280 Ul/semana que corresponde a 12,6 mg de insulina humana por semana. Con el fin de minimizar la incomodidad para los pacientes, esta debena formularse en un volumen pequeno, por ejemplo, un mililitro. Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es proporcionar una formulacion de insulina en la que la concentracion de insulina sea al menos 10 mg/ml, mientras que todavfa libere insulina estructuralmente intacta y presente un perfil farmacocinetico sustancialmente sin aumentos bruscos. Ademas, como consecuencia, un objeto de la presente invencion es que se pueda administrar una sola dosis de la insulina de accion prolongada como una sola inyeccion de la formulacion, que contenga 10 mg de compuesto de insulina.
El documento US2007/0207210 A1 describe un metodo de preparacion de micropartmulas amorfas de protemas de alto peso molecular, y en particular anticuerpos. La insulina se menciona en un ejemplo como que se formula en hasta 400 mg/ml de acuerdo con la descripcion. Sin embargo, el objeto de la invencion es proporcionar una formulacion con perfil farmacocinetico similar a la protema natural, por lo tanto, no proporcionar una liberacion sostenida. El documento US2007/0207210 A1, por lo tanto, no ofrece una solucion a la reduccion de la frecuencia de la dosis de insulina.
Definiciones
Algunas definiciones relevantes para entender la presente invencion se explican a continuacion en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “no hay sustancialmente aumento brusco” o “sustancialmente sin aumento brusco” (ambas expresiones se usan de forma intercambiable en la presente descripcion) se pretende indicar que tras la administracion de un compuesto de insulina, que puede ser un profarmaco o un compuesto de insulina activo, la relacion de la concentracion maxima de un compuesto de insulina detectable en el plasma sangumeo durante las primeras 48 horas despues de la administracion, tal como subcutanea o intramuscular, a la concentracion mas baja de un compuesto de insulina detectable en el plasma sangumeo despues de la concentracion maxima durante las primeras 48 horas despues de la administracion es menor de 2 (sustancialmente no hay aumento brusco detectable), preferido menor de 1,5 (no hay aumento brusco detectable).
Como se usa en la presente memoria, la expresion “aumento brusco” se pretende que indique que tras la administracion de un compuesto de insulina, que puede ser un profarmaco o un compuesto de insulina activo, la relacion de la concentracion maxima de un compuesto de insulina detectable en el plasma sangumeo durante las primeras 48 horas despues de la administracion, tal como subcutanea o intramuscular, a la concentracion mas baja de un compuesto de insulina detectable en el plasma sangumeo despues de la concentracion maxima durante las primeras 48 horas despues de la administracion es 2 o mayor.
Con respecto a la deteccion de un compuesto de insulina en el plasma sangumeo, dicho compuesto de insulina puede ser la forma estructural intacta del compuesto de insulina administrado o en el caso de que el compuesto de insulina sea un profarmaco, el compuesto de insulina detectable sera el compuesto de insulina intacto liberado del profarmaco, tal como insulina humana, analogos de insulina, derivados de insulina, y fragmentos de los mismos.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “un compuesto GLP-1” se pretende que indique cualquier compuesto GLP-1, tal como GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2, un analogo de GLP-1, incluyendo un agonista de GLP- 1. Los ejemplos de agonistas de GLP-1 usados en la presente memoria son agonistas de GLP-1, exendina-3 o exendina-4, incluyendo, pero no limitado a:
(i) analogos de exendina-4 y analogos de exendina-4 amidados, en los que se han sustituido secuencias de uno o mas restos de aminoacidos por restos de aminoacidos diferentes, incluyendo modificaciones N-terminales,
(ii) exendina-4 truncada y formas truncadas que estan amidadas,
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(iii) exendina-4 truncada y formas truncadas que estan amidadas, en las que se han sustituido secuencias de uno o mas restos de aminoacidos por restos de aminoacidos diferentes,
(iv) GLP-1 y GLP-1 amidado,
(v) analogos de GLP-1 y analogos de GLP-1 amidados, en los que se han sustituido secuencias de uno o mas restos de aminoacidos por restos de aminoacidos diferentes, incluyendo modificaciones N-terminales,
(vi) GLP-1 truncado y formas truncadas que estan amidadas,
(vii) GLP-1 truncado y formas truncadas que estan amidadas, en los que se han sustituido secuencias de uno o mas restos de aminoacidos por restos de aminoacidos diferentes,
(viii) las sustancias ya conocidas AVE-0010 (ZP-10) (Sanofi-Aventis Zealand Pharma), BAY-73-7977 (Bayer), TH- 0318, BIM-51077 (Ipsen, Tejin, Roche), NN-2211 (Novo Nordisk), LY315902.
Los agonistas de GLP-1 imitan las actividades del GLP-1 natural uniendose al o a los receptores en los que GLP-1 ejerce sus acciones que son beneficiosas como insulinotropico y en el tratamiento de la diabetes mellitus, o imitando los efectos de la exendina en el flujo de orina, ralentizando el vaciado gastrico, induciendo saciedad, aumentando la excrecion de sodio en la orina y/o disminuyendo la concentracion de potasio en la orina, uniendose al o a los receptores donde la exendina causa estos efectos.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “relacion de pico a valle” se pretende que indique la relacion entre la concentracion plasmatica mas alta y la concentracion plasmatica mas baja de un compuesto de insulina, tal como insulina humana, dentro de un periodo dado entre administraciones.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “compuesto de insulina estructuralmente intacto” se pretende que indique insulina intacta que consiste en dos peptidos llamados cadena A y cadena B que estan conectados por dos puentes disulfuro. Ademas, la cadena A contiene un puente disulfuro intramolecular. La perdida de los puentes disulfuro intra o intermoleculares o reorganizaciones de las dos cadenas, como homodfmeros A-A o B-B producen la inactivacion de la insulina. La integridad estructural se mide por digestion de la insulina con una endoproteasa adecuada, como, por ejemplo, endo-gluC, y analizando los fragmentos resultantes por espectrometna de masas. La ausencia de senales resultantes de las cadenas de insulina individuales indica insulina intacta. Como se usa en la presente memoria, el termino “profarmaco” se pretende que indique un compuesto de insulina que sufre biotransformacion antes de presentar sus efectos farmacologicos. Los profarmacos pueden verse, por lo tanto, como restos biologicamente activos que contienen grupos protectores no toxicos especializados, usados de una forma transitoria para alterar o eliminar propiedades indeseables en la molecula original. Por ejemplo, el profarmaco puede ser una amida biohidrolizable y ester biohidrolizable y tambien abarca a) compuestos en los que esta abarcada en el compuesto la funcionalidad biohidrolizable en dicho profarmaco, y b) compuestos que se pueden oxidar o reducir biologicamente en un grupo funcional dado. Los profarmacos tfpicos pueden ser un profarmaco unido a vehfculo que contiene una union temporal de una sustancia activa con un grupo vehfculo transitorio que produce mejores propiedades fisicoqmmicas o farmacocineticas y que puede ser eliminado in vivo facilmente, normalmente por escision hidrolttica; un profarmaco de cascada en el que la escision del grupo vehfculo se hace efectiva solo despues de desenmascarar un grupo activante.
Para potenciar las propiedades fisicoqmmicas o farmacocineticas de un farmaco, tal como insulina, in vivo, dicho farmaco se puede conjugar con un vehfculo. Si el farmaco esta transitoriamente unido a un vehfculo y/o un conector, dichos sistemas se asignan habitualmente como profarmacos unidos a vetnculo. De acuerdo con las definiciones proporcionadas por la IUPAC (dadas en
http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem, accedido el 22 de julio, 2009), un profarmaco unido a vetnculo es un profarmaco que contiene una union temporal de una sustancia activa dada con un grupo vetnculo transitorio que produce mejores propiedades fisicoqmmicas o farmacocineticas y que se puede separar facilmente in vivo, normalmente por escision hidrolttica.
http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem, accedido el 22 de julio, 2009), un profarmaco unido a vetnculo es un profarmaco que contiene una union temporal de una sustancia activa dada con un grupo vetnculo transitorio que produce mejores propiedades fisicoqmmicas o farmacocineticas y que se puede separar facilmente in vivo, normalmente por escision hidrolttica.
Los conectores usados en dichos profarmacos unidos a vetnculo son transitorios, lo que significa que son degradables por hidrolisis no enzimatica (escindibles) en condiciones fisiologicas (tampon acuoso a pH 7,4, 37°C) con semividas en el intervalo, por ejemplo, de una hora a 3 meses.
Los vetnculos adecuados son polfmeros y se pueden conjugar directamente al conector o por un espaciador no escindible. El “profarmaco de insulina-hidrogel” se refiere a un profarmaco, en el que la insulina esta unida transitoriamente a un vetnculo de hidrogel. Las expresiones “profarmaco de hidrogel” y “profarmaco unido a hidrogel” se refieren a profarmacos de agentes biologicamente activos transitoriamente unidos a un hidrogel y se usan de forma sinonima.
Los terminos “farmaco”, “molecula biologicamente activa”, “resto biologicamente activo”, “agente biologicamente activo”, “agente activo”, y similares, significa cualquier sustancia que puede afectar a cualquier propiedad ffsica o bioqmmica de un organismo biologico, incluyendo, pero no limitado a virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, como se usa en la presente memoria, las moleculas biologicamente activas incluyen cualquier sustancia dirigida al diagnostico, cura, mitigado, tratamiento o prevencion de enfermedad en seres
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humanos u otros animales, o de otra forma a potenciar el bienestar ffsico o mental de seres humanos o animales.
Una “cantidad terapeuticamente eficaz” de insulina como se usa en la presente memoria, significa una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones qmmicas de una enfermedad dada y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como “cantidad terapeuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para dicho fin dependeran de la gravedad de la enfermedad o lesion, asf como del peso y estado general del sujeto. Se entendera que la determinacion de una dosis adecuada se puede lograr usando experimentacion rutinaria, construyendo una matriz de valores y ensayando diferentes puntos de la matriz, que esta dentro de las habilidades ordinarias del medico experto.
“Estable” y “estabilidad” significa que dentro del tiempo de almacenamiento indicado, los conjugados de hidrogel permanecen conjugados y no se hidrolizan en una extension sustancial y presentan un perfil de impurezas aceptable en relacion con la insulina. Para que se considere estable, la composicion contiene menos de 5% del farmaco en su forma libre.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “ester biohidrolizable” es un ester de un compuesto que a) no interfiere con la actividad biologica de la sustancia original pero confiere a esa sustancia propiedades ventajosas in vivo tales como duracion de la accion, inicio de la accion, y similares, o b) es biologicamente inactiva, pero es convertida facilmente in vivo por el sujeto en el principio biologicamente activo.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “amida biohidrolizable” es una amida de un compuesto que a) no interfiere con la actividad biologica de la sustancia original pero confiere a esa sustancia propiedades ventajosas in vivo tales como duracion de la accion, inicio de la accion, y similares, o b) es biologicamente inactiva, pero es convertida facilmente in vivo por el sujeto en el principio biologicamente activo.
Como se usa en la presente memoria, el termino “un hidrogel” se pretende que indica una red polimerica hidrofila o anfifflica, tridimensional, capaz de absorber cantidades grandes de agua. Las redes estan compuestas de homopolfmeros o copolfmeros, son insolubles debido a la presencia de reticulaciones ffsicas o qmmicas covalentes (ionicas, interacciones hidrofobas, enredados). Las reticulaciones proporcionan la estructura de red y la integridad ffsica. Los hidrogeles presentan una compatibilidad termodinamica con el agua que les permite hincharse en medio acuoso. Las cadenas de la red estan conectadas de modo que existen poros y que una fraccion sustancial de estos poros es de dimensiones entre 1 nm y 1000 nm.
El termino “gel” se refiere a una solucion de polfmero de tipo jalea, no reticulada.
Como se usa en la presente memoria, el termino “un deposito” se pretende que indique un sistema de liberacion de farmaco, tipicamente inyectado como una inyeccion subcutanea o intramuscular, de un compuesto de insulina, capaz de liberar de manera uniforme el compuesto activo a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “una concentracion maxima” se pretende que indique la concentracion mas alta obtenida despues de administracion de un compuesto de insulina.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “un compuesto de insulina” se pretende que indique cualquier insulina de origen de mairnfero, tal como insulina humana, insulina porcina o insulina bovina con puentes disulfuro entre las CysA7 y CysB7 y entre las CysA20 y CysB19 y un puente disulfuro interno entre las CysA6 y CysA11, insulina de mamffero recombinante, tal como insulina humana recombinante, analogos de insulina, derivados de insulina y fragmentos de los mismos, son ejemplos tfpicos la insulina rh, insulina glargina, insulina detemir, insulina glulisina, insulina aspart, insulina lispro, insulina conjugada con PEG de bajo peso molecular, en donde el PEG de bajo peso molecular tiene un peso molecular menor de 10 kDa. El compuesto de insulina puede estar en forma de un profarmaco, en cuyo caso el compuesto que se va a liberar en el plasma es la insulina activa que se forma despues de administracion del profarmaco.
Por “analogo de insulina” como se usa en la presente memoria, se entiende un polipeptido que tiene una estructura molecular que formalmente puede derivar de la estructura de una insulina que se encuentra de forma natural, por ejemplo, la de la insulina humana, eliminando y/o intercambiando al menos un resto de aminoacido que se encuentra en la insulina natural y/o anadiendo al menos un resto de aminoacido. Los restos de aminoacidos anadidos y/o intercambiados pueden ser restos de aminoacidos codificables u otros restos que se encuentran de forma natural o restos de aminoacidos puramente sinteticos.
Los analogos de insulina pueden ser aquellos en los que la posicion 28 de la cadena B se puede modificar del resto de Pro natural a uno de Asp, Lys o lie. En otro aspecto, la Lys en la posicion B29 se modifica a Pro. Tambien, la Asn en la posicion A21 se puede modificar a Ala, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular a Gly, Ala, Ser o Thr y preferiblemente a Gly. Ademas, la Asn en la posicion B3 se puede modificar a Lys o Asp. Ejemplos adicionales de analogos de insulina son insulina humana des(B30); des(B30); analogos de insulina humana des(B30); analogos de insulina en donde se ha eliminado PheB1; analogos de insulina en donde la cadena A y/o la cadena B tienen una extension N-terminal y analogos de insulina en donde la cadena A y/o la cadena B tienen una extension C-terminal. Por lo tanto, se pueden anadir una o dos Arg en la posicion B1.
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Por “insulina desB30” o “insulina humana desB30” se entiende una insulina natural o un analogo de la misma que carece del resto de aminoacido B30. De forma similar, “insulina desB29desB30” o “insulina humana desB29desB30” significa una insulina natural o un analogo de la misma que carece de los restos de aminoacidos B29 y B30.
Por “B1”, “A1” etc., se entiende el resto de aminoacido en la posicion 1 en la cadena B de la insulina (contado desde el extremo N-terminal”) y el resto de aminoacido en la posicion 1 en la cadena A de la insulina (contado desde el extremo N-terminal), respectivamente. El resto de aminoacido en una posicion espedfica tambien se puede indicar, p. ej., como PheBI que significa que el resto de aminoacido en la posicion B1 es un resto de fenilalanina.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “conector no activo” significa un conector que no muestra los efectos farmacologicos del farmaco derivado del agente biologicamente activo.
Como se usa en la presente memoria, el termino “alquilo” significa una cadena de carbonos lineal o ramificada. Cada hidrogeno de un carbono del alquilo se puede sustituir por un sustituyente.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “alquilo C1-4” significa una cadena de alquilo que tiene 1-4 atomos de carbono, p. ej., si esta presente en el extremo de una molecula: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo; terc-butilo, o p. ej. -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CHa)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH^Ha)-, -C(CHa)2-, cuando dos restos de una molecula estan unidos por el grupo alquilo. Cada hidrogeno de un carbono del alquilo C1-4 se puede sustituir por un sustituyente.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “alquilo CW significa una cadena de alquilo que tiene 1-6 atomos de carbono, p. ej., si esta presente en el extremo de una molecula: alquilo C1-4, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo; terc-butilo, n-pentilo; n-hexilo, o p. ej. -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CHa)-, -CH2- CH2-CH2-, -CH(C2Ha)-, -C(CH3)2-, cuando dos restos de una molecula estan unidos por el grupo alquilo. Cada hidrogeno de un carbono del alquilo C1-6 se puede sustituir por un sustituyente.
Por consiguiente, “alquilo C1-18” significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 18 atomos de carbono, y “alquilo C8-18” significa una cadena de alquilo que tiene de 8 a 18 atomos de carbono. Por consiguiente, “alquilo C1-50” significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 50 atomos de carbono.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “alquenilo C2-50” significa una cadena de alquenilo ramificada o no ramificada que tiene de 2 a 50 atomos de carbono, p. ej., si esta presente en el extremo de una molecula: -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CH-CH2-CH3, -CH=CH-CH=CH2, o p. ej. -CH=CH-, cuando dos restos de una molecula estan unidos por el grupo alquenilo. Cada hidrogeno de un carbono del alquenilo C2-50 se puede sustituir por un sustituyente como se especifica adicionalmente. Por consiguiente, el termino “alquenilo” se refiere a una cadena de carbonos con al menos un doble enlace carbono-carbono. Opcionalmente, puede haber uno o mas triples enlaces.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “alquinilo C2-50” significa una cadena de alquinilo ramificada o no ramificada que tiene de 2 a 50 atomos de carbono, p. ej., si esta presente en el extremo de una molecula: -CeCH, -CH2-CECH, CH2-CH2-CECH, CH2-CEC-CH3, o p. ej. -CeC- cuando dos restos de una molecula estan unidos por el grupo alquinilo. Cada hidrogeno de un carbono del alquinilo C2-50 se puede sustituir por un sustituyente como se especifica adicionalmente. Por consiguiente, el termino “alquinilo” se refiere a una cadena de carbonos con al menos un triple enlace carbono-carbono. Opcionalmente, puede haber uno o mas dobles enlaces.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “cicloalquilo C3-7” o “anillo de cicloalquilo C3-7” significa una cadena de alquilo dclica que tiene de 3 a 7 atomos de carbono, que puede tener dobles enlaces carbono-carbono que estan al menos parcialmente saturados, p. ej. ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo. Cada hidrogeno de un carbono del cicloalquilo se puede sustituir por un sustituyente. La expresion “cicloalquilo C3-7” o “anillo de cicloalquilo C3-7” tambien incluye biciclos con puente tales como norbornano o norborneno. Por consiguiente, “cicloalquilo C3-5” significa un cicloalquilo que tiene de 3 a 5 atomos de carbono.
Por consiguiente, “cicloalquilo C3-10” significa un alquilo dclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, p. ej., cicloalquilo C3-7, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo. El termino “cicloalquilo C3-10” tambien incluye carbamono y biciclos parcialmente saturados.
Como se usa en la presente memoria, el termino “halogeno” significa fluoro, cloro, bromo o yodo. Se prefiere en general que el halogeno sea fluoro o cloro.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “heterociclilo de 4 a 7 miembros” o “heterociclo de 4 a 7 miembros” significa un anillo con 4, 5, 6 o 7 atomos en el anillo, que puede contener hasta el numero maximo de dobles enlaces (anillo aromatico o no aromatico que esta totalmente, parcialmente o no saturado) en donde al menos un atomo del anillo hasta 4 atomos del anillo se sustituyen por un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en azufre (que incluye -S(O)-, -S(O)2-), oxfgeno y nitrogeno (que incluye =N(O)-) y en donde el anillo esta unido al resto de la molecula por un atomo de carbono o nitrogeno. Los ejemplos para un heterociclo de 4 a 7 miembros son azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetrahidrofurano,
tetrahidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, dihidropirano, tetrahidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepane, azepina o homopiperazina.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “heterobiciclilo de 9 a 11 miembros” o “heterobiciclo de 9 a 11 5 miembros” significa un sistema heterodclico de dos anillos con 9 a 11 atomos en el anillo, en donde al menos un atomo del anillo es compartido por ambos anillos y que puede contener hasta el numero maximo de dobles enlaces (anillo aromatico o no aromatico que esta totalmente, parcialmente o no saturado) en donde al menos un atomo del anillo hasta 6 atomos del anillo se sustituyen por un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en azufre (que incluye -S(O)-, -S(O)2-), oxfgeno y nitrogeno (que incluye =N(O)-) y en donde el anillo esta unido al resto de la 10 molecula por un atomo de carbono o nitrogeno. Los ejemplos para un heterobiciclo de 9 a 11 miembros son indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, bencisoxazol, benzotiazol, bencisotiazol, bencimidazol, bencimidazolina, quinolina, quinazolina, dihidroquinazolina, quinolina, dihidroquinolina, tetrahidroquinolina, decahidroquinolina, isoquinolina, decahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidroisoquinolina, benzazepina, purina o pteridina. La expresion heterobiciclo de 9 a 11 miembros tambien incluye estructuras espiranicas de dos 15 anillos como 1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]decano o heterobiciclos con puente como 8-aza-biciclo[3.2.1]octano.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora tal como la EMEA (Europa) y/o la FDA (EE.UU.) y/o cualquier otra agencia reguladora nacional para uso en animales, preferiblemente en seres humanos.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “composicion farmaceutica” o “composicion” significa uno o mas 20 ingredientes activos, y uno o mas ingredientes inertes, asf como cualquier producto que sea resultado, directa o indirectamente, de la combinacion, complejacion o agregacion de cualesquiera dos o mas de los ingredientes o de la disociacion de uno o mas de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o mas de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion abarcan cualquier composicion hecha mezclando un compuesto de la presente invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable 25 (vehfculo farmaceuticamente aceptable).
La “forma libre” de un farmaco se refiere al farmaco en su forma farmacologicamente activa, no modificada, tal como despues de ser liberado de un conjugado de polfmero.
“Composicion seca” significa que la composicion de profarmaco de hidrogel de insulina se proporciona en una forma seca en un recipiente. Metodos adecuados para el secado son el secado por atomizacion y la liofilizacion 30 (congelacion-secado). Dicha composicion seca de profarmaco de hidrogel de insulina tiene un contenido de agua residual de un maximo de 10%, preferiblemente menos de 5% y mas preferiblemente menos de 2% (determinado de acuerdo con Karl Fischer). El metodo preferido de secado es la liofilizacion. “Composicion liofilizada” significa que la composicion de profarmaco de polfmero de hidrogel de insulina primero se ha congelado y posteriormente se ha sometido a reduccion de agua por medio de presion reducida. Esta terminologfa no excluye etapas de secado 35 adicionales que ocurren en el procedimiento de fabricacion antes de cargar la composicion en el recipiente final.
La “liofilizacion” (congelacion-secado) es un procedimiento de deshidratacion caracterizado por la congelacion de una composicion y despues reduccion de la presion que la rodea y, opcionalmente adicion de calor para permitir que el agua congelada en la composicion sublime directamente de la fase solida a la gaseosa. Tfpicamente, el agua sublimada se recoge por desublimacion.
40 “Reconstitucion” significa la adicion de un lfquido para devolver la forma original de la composicion.
“Solucion de reconstitucion” se refiere al lfquido usado para reconstituir la composicion seca de un profarmaco de hidrogel de insulina antes de la administracion a un paciente que lo necesite.
“Recipiente” significa cualquier recipiente en el que esta comprendida la composicion de profarmaco de hidrogel de insulina y se puede almacenar hasta la reconstitucion.
45 Una “cantidad terapeuticamente eficaz” de un compuesto de insulina como se usa en la presente memoria, significa una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clmicas de una enfermedad dada y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como la “cantidad terapeuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para cada proposito dependeran de la gravedad de la enfermedad o lesion asf como del peso y estado general del sujeto. Se entendera que determinar una dosis adecuada se puede lograr usando 50 experimentacion rutinaria, construyendo una matriz de valores y probando diferentes puntos de la matriz, lo cual esta dentro de las habilidades ordinarias del medico o veterinario experto.
“Tampon” o “agente de tamponamiento” se refiere a compuestos qmmicos que mantienen el pH en un intervalo deseado. Los tampones fisiologicamente tolerados son, por ejemplo, fosfato sodico, succinato, histidina, bicarbonato, citrato y acetato, sulfato, nitrato, cloruro, piruvato. Tambien se pueden usar antiacidos tales como 55 Mg(OH)2 o ZnCO3. La capacidad de tamponamiento se puede ajustar para que se corresponda con las condiciones
mas sensibles a la estabilidad del pH.
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“Excipientes” se refieren a compuestos administrados junto con el agente terapeutico, por ejemplo, agentes de tamponamiento, modificadores de la isotonicidad, conservantes, estabilizantes, agentes antiadsorcion, agentes protectores de la oxidacion u otros agentes auxiliares. Sin embargo, en algunos casos, un excipiente puede tener funcion doble o triple.
Un “lioprotector” es una molecula que cuando se combina con una protema de interes, previene o reduce significativamente la inestabilidad qrnmica y/o ffsica de la protema tras secado en general y en especial durante la liofilizacion y posterior almacenamiento. Los ejemplos de lioprotectores incluyen azucares, tales como sacarosa o trehalosa; aminoacidos tales como glutamato monosodico o histidina; metilaminas tales como betama; sales liotropicas tales como sulfato magnesico; polioles tales como alcoholes de azucar trilmdrico o superiores; p. ej. glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; etilenglicol; propilenglicol; polietilenglicol; pluronicos; hidroxialquil-almidones, p. ej. hidroxietil-almidon (HES), y combinaciones de los mismos.
“Tensioactivo” se refiere a agentes humectantes que disminuyen la tension superficial de un lfquido.
“Modificadores de la isotonicidad” se refieren a compuestos que minimizan el dolor que puede producirse por el dano a la celula debido a diferencias de presion osmotica en el deposito de inyeccion.
El termino “estabilizantes” se refiere a compuestos usados para estabilizar el profarmaco polimerico. La estabilizacion se logra fortaleciendo las fuerzas estabilizadoras de la protema, desestabilizando el estado desnaturalizado o por union directa de excipientes a la protema.
“Agentes antiadsorcion” se refiere a tensioactivos principalmente ionicos o no ionicos u otras protemas o polfmeros solubles usados para recubrir o adsorberse de forma competitiva en la superficie interior del recipiente de la composicion. La concentracion y tipo de excipiente elegido depende del efecto que se va a evitar, pero tfpicamente se forma una monocapa de tensioactivo en la interfase justo por encima del valor de CMC.
“Agentes de proteccion frente a la oxidacion” se refiere a antioxidantes tales como acido ascorbico, ectoma, metionina, glutation, monotioglicerol, morina, polietilenimina (PEI), galato de propilo, vitamina E, agentes quelantes tales como acido cftrico, EDTA, hexafosfato, acido tioglicolico.
“Antimicrobiano” se refiere a una sustancia qrnmica que mata o inhibe el crecimiento de microorganismos, tales como bacterias, hongos, levaduras, protozoos y/o destruye virus.
“Sellado de un recipiente” se refiere a que el recipiente se cierra de forma que es estanco al aire, no permitiendo el intercambio de gases entre el exterior y el interior y manteniendo el contenido esteril.
“Farmaceuticamente aceptable” se entiende que abarca cualquier excipiente y/o aditivo, que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica del ingrediente activo y que no es toxico para el hospedante al que se le administra.
El termino “reactivo” se refiere a un material intermedio o de partida usado en el proceso de ensamblado que conduce a un profarmaco de la presente invencion.
La expresion “grupo funcional qrnmico” se refiere a acido carboxflico y derivados activados, amino, maleimida, tiol y derivados, acido sulfonico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, hidroxilo, aldehfdo, cetona, hidrazina, isocianato, isotiocianato, acido fosforico y derivados, acidos fosfonico y derivados halogenoacetilo, haluros de alquilo, acriloilo y otros aceptores de Michael alfa,beta-insaturados, agentes de arilacion como fluoruros de arilo, hidroxilamina, disulfuros, como disulfuro de piridilo, vinilsulfona, vinilcetona, diazolalcanos, compuestos de diazoacetilo, oxirano y aziridina.
Si un grupo funcional qrnmico se acopla a otro grupo funcional qrnmico, la estructura qrnmica resultante se denomina un “enlace”. Por ejemplo, la reaccion de un grupo amina con un grupo carboxilo da como resultado un enlace amida.
“Grupos funcionales reactivos” son grupos funcionales qrnmicos del resto de cadena principal, que estan conectados al resto hiper-ramificado.
“Grupo funcional” es el termino colectivo usado para “grupo funcional reactivo”, “grupo funcional interconectado degradable” o “grupo funcional conjugado”.
Un “grupo funcional interconectado degradable” es una union que comprende un enlace biodegradable que en un lado esta conectado a un resto espaciador conectado a un resto de cadena principal y en el otro lado esta conectado al resto de reticulacion. Las expresiones “grupo funcional interconectado degradable”, “grupo funcional interconectado biodegradable”, “grupo funcional biodegradable interconectado” y “grupo funcional interconectado” se usan de forma sinonima.
Las expresiones “grupo bloqueante” o “grupo de remate” se usan de forma sinonima y se refieren a restos que estan conectados de forma irreversible a grupos funcionales reactivos para hacerlos incapaces de reaccionar con, por ejemplo, grupos funcionales qrnmicos.
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Las expresiones “grupo de proteccion” o “grupo protector” se refiere a un resto que esta conectado de forma reversible a grupos funcionales reactivos para hacerlos incapaces de reaccionar con, por ejemplo, grupos funcionales qmmicos.
La expresion “grupo funcional interconectable” se refiere a grupos funcionales qmmicos, que participan en una reaccion de polimerizacion por radicales y son parte del reactivo de reticulacion o del reactivo de la cadena principal.
La expresion “grupo funcional polimerizable” se refiere a grupos funcionales qmmicos que participan en una reaccion de polimerizacion de tipo ligado y son parte del reactivo de reticulacion y del reactivo de la cadena principal.
Para los grupos funcionales interconectados, la expresion “degradable por hidrolisis” se refiere en el contexto de la presente invencion a uniones que son degradables por hidrolisis de forma no enzimatica en condiciones fisiologicas (tampon acuoso de pH 7,4, 37°C) con semividas en el intervalo de una hora a tres meses, e incluyen, pero no se limitan a aconitilos, acetales, anhfdridos carboxflicos, esteres, iminas, hidrazonas, amidas del acido maleamico, ortoesteres, fosfamidas, fosfoesteres, esteres de fosfosililo, esteres de sililo, esteres sulfonicos, carbamatos aromaticos, combinaciones de los mismos, y similares. Las uniones biodegradables preferidas son esteres carboxflicos, carbonatos, fosfoesteres y esteres de acido sulfonico y las mas preferidas son esteres carboxflicos o carbonatos. Se entiende que para condiciones aceleradas de estudios in vitro, como por ejemplo pH 9, 37°C, se puede usar tampon acuoso para fines practicos.
Un resto de cadena principal puede comprender un resto espaciador que en un extremo esta conectado al resto de la cadena principal y en el otro lado al resto de reticulacion.
El termino “derivados” se refiere a grupos funcionales qmmicos adecuadamente sustituidos con grupos protectores y/o activantes, o a formas activadas de un grupo funcional qmmico correspondiente, que son conocidos para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las formas activadas de los grupos carboxilo incluyen, pero no se limitan a esteres activos, tales como ester de succinimidilo, ester de benzotriazilo, ester de nitrofenilo, ester de pentafluorofenilo, ester de azabenzotriazilo, halogenuros de acilo, antndridos mixtos o simetricos, acil-imidazoles.
La expresion “conector escindible de forma no enzimatica” se refiere a conectores que son degradables por hidrolisis en condiciones fisiologicas sin actividad enzimatica.
“Conector no activo biologicamente” significa un conector que no muestra los efectos farmacologicos del farmaco (D- H) derivado del resto biologicamente activo.
Los terminos “espaciador”, “grupo espaciador”, “molecula espaciadora” y “resto espaciador” se usan de forma intercambiable y si se usan para describir un resto presente en el vetnculo de hidrogel de la invencion, se refieren a cualquier resto adecuado para conector dos restos, tales como alquilo C1-50, alquenilo C2-50 o alquinilo C2-50, cuyo fragmento esta opcionalmente interrumpido por uno o mas grupos seleccionados de -NH-, -N(alquilo C1-4)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(alquilo C1.4)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, heterociclilo de 4 a 7, fenilo o naftilo.
Los terminos “terminal”, “extremo” o “extremo distal” se refieren a la posicion de un grupo funcional o union dentro de una molecula o resto, de modo que dicho grupo funcional puede ser un grupo funcional qmmico y la union puede ser una union degradable o permanente, caracterizado por estar situado adyacente a o en una union entre dos restos o en el extremo de una cadena oligomera o polfmera.
Las frases “en forma unida” o “resto” se refieren a subestructuras que son parte de una molecula mas grande. La frase “en forma unida” se usa para simplificar la referencia a restos nombrando o citando reactivos, materiales de partida o materiales de partida hipoteticos bien conocidos en la tecnica, y de esta forma “en forma unida” significa, por ejemplo, que uno o mas radicales hidrogeno (-H), o uno o mas grupos activantes o protectores presentes en los reactivos o materiales de partida no estan presentes en el resto.
Se entiende que todos los reactivos y restos que comprenden los restos polimericos se refieren a entidades macromoleculares que se sabe que presentan variabilidades con respecto al peso molecular, longitudes de cadena o grado de polimerizacion, o el numero de grupos funcionales. Las estructuras mostradas para los reactivos de cadena principal, restos de cadena principal, reactivos de reticulacion y restos de reticulacion son, por lo tanto, solo ejemplos representativos.
Un reactivo o resto puede ser lineal o ramificado. Si el reactivo o resto tiene dos grupos terminales, se refiere a un reactivo o resto lineal. Si el reactivo o resto tiene mas de dos grupos terminales, se considera que es un reactivo o resto ramificado o multifuncional.
La expresion “cadena polimerica basada en polietilenglicol” o “cadena basada en PEG” se refiere a una cadena molecular oligomerica o polimerica.
Preferiblemente, dicha cadena polimerica basada en polietilenglicol esta conectada a un centro que se ramifica, es una cadena de polietilenglicol lineal, de la cual uno de los extremos esta conectado al centro que se ramifica y el otro a un resto dendntico hiper-ramificado. Se entiende que una cadena basada en PEG puede terminar o estar
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interrumpida por grupos alquilo o arilo opcionalmente sustituidos con heteroatomos y grupos funcionales qmmicos.
Si la expresion “cadena polimerica basada en polietilenglicol” se usa en referencia a un reactivo de reticulacion, se refiere a un resto o cadena de reticulacion que comprende al menos 20% en peso de restos de etilenglicol.
Como se usa en la presente memoria, los terminos “un”, “una” y “el” y “la” y referencias similares deben considerarse que cubren tanto el singular como el plural salvo que se indique otra cosa en la presente memoria o el contexto lo contradiga claramente.
Descripcion
La presente invencion se refiere a una preparacion de insulina de accion prolongada para cubrir la insulina basal. Las insulinas basales son formulaciones de accion prolongada de insulina o analogos de insulina disenadas para imitar el resultado de la insulina basal de las celulas beta pancreaticas. De forma optima la glucosa en la sangre es controlada asf eficazmente de una forma sostenida durante todo el intervalo de administracion.
Los autores de la presente invencion han descubierto que un compuesto de insulina puede ser liberado de un deposito inyectable, tal como por via subcutanea, continuamente de forma estructuralmente intacta entre administraciones sin verse ningun efecto de aumento brusco. La integridad estructural del compuesto de insulina liberado se proporciona mediante una matriz de polfmero bien hidratada que minimiza el contacto intermolecular de moleculas de insulina. Ademas, evitando un aumento brusco de insulina se reduce el riesgo de efectos secundarios daninos en un paciente.
La presente invencion reduce el riesgo de hipoglucemia despues de administracion debido a que carece de liberacion de insulina de tipo aumento brusco, reduce el riesgo de hiperglucemia al final del periodo de dosificacion, reduce la frecuencia de inyeccion y proporciona niveles de insulina predecibles en el plasma sangumeo en un paciente.
Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar una nueva insulina basal que requiere menor frecuencia de inyeccion que los regfmenes de insulina basales diarios actuales y proporciona un nivel alto de seguridad liberando insulina estructuralmente intacta a lo largo del intervalo de tiempo completo entre inyecciones, y tfpicamente con una relacion de pico a valle menor de 2.
Las ventajas adicionales seran evidentes con la lectura de la presente descripcion.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de insulina en una concentracion de al menos 10 mg/ml, caracterizada por tener un perfil farmacocinetico in vivo sustancialmente sin aumento brusco del compuesto de insulina, y en donde el compuesto de insulina esta completamente contenido en un deposito, y en donde el compuesto de insulina esta unido covalentemente en el deposito,
en donde el compuesto de insulina es un profarmaco o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable, que es un conjugado de insulina-conector D-L, en donde
D representa el resto de insulina; y
-L es un resto conector biologicamente no activo -L1 representado por la formula (I),
en donde la lmea de trazos indica la union a uno de los grupos amino de la insulina por formacion de un enlace amida;
X es C(R3R3a); o N(R3);
R1a, R3a se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, NH(R2b), N(R2b)C(O)R4 y alquilo C1-4;
R1, R2 R2a, R2b, R3, R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-4, en donde L1 esta sustituido con un L2-Z y opcionalmente sustituido adicionalmente, con la condicion de que el hidrogeno marcado con un asterisco en la formula (I) no se sustituya por ningun sustituyente, y en donde
L2 es un enlace qrnmico simple o un espaciador; y
Z es un hidrogel.
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En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de insulina en una concentracion de al menos 11 mg/ml para administrar en una sola dosis de al menos 10 mg de compuesto de insulina.
Como se usa en la presente memoria, una sola dosis de compuesto de insulina se da en mg y la concentracion de un compuesto de insulina en una composicion farmaceutica se da en mg/ml. Si el compuesto de insulina es un profarmaco, la concentracion se basa en la liberacion cuantitativa de insulina libre del profarmaco. Mediante metodos bien conocidos en la tecnica, partes almuotas de una composicion se someten a condiciones de liberacion de insulina (tampon acuoso a pH 7,4, 37°C, o condiciones aceleradas a pH elevado) hasta que no se observa un aumento significativo de la concentracion de insulina y se determina la cantidad total de insulina liberada. Se entiende que en el caso de vehmulos solubles, la liberacion cuantitativa es sinonima de hidrolisis cuantitativa.
En una realizacion de la presente invencion, la concentracion del compuesto de insulina es al menos 11 mg/ml, tal como de 11 mg/ml a 35 mg/ml, mas preferido de 15 mg/ml a 25 mg/ml, incluso mas preferido aproximadamente 20 mg/ml, e incluso mas preferido aproximadamente 24 mg/ml.
El volumen que se va a administrar con el fin de administrar una dosis eficaz, por ejemplo, mediante una jeringa, a un sujeto, tal como un sujeto humano, es preferiblemente menor de 1,5 ml, tfpicamente 1,0 ml o menos.
En una realizacion adicional la dosis unica del compuesto de insulina es al menos 5 mg, tal como de 5 mg a 100 mg, mas preferido de 5 mg a 50 mg, y mas preferido de 5 mg a 25 mg.
En una realizacion adicional, la relacion de la concentracion maxima de un compuesto de insulina en el plasma sangumeo durante las primeras 48 horas despues de la administracion, tal como subcutanea o intramuscular, a la concentracion mas baja de un compuesto de insulina en el plasma sangumeo despues de la concentracion maxima durante las primeras 48 horas despues de la administracion es menor de 2, tfpicamente menor de 1,5.
Las realizaciones anteriores, asf como las realizaciones descritas en lo sucesivo, deben verse como que se refieren a uno cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, asf como tambien a una cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, salvo que se especifique que una realizacion se refiere a un determinado aspecto o aspectos de la presente invencion.
La composicion farmaceutica tfpicamente es un sistema de suministro controlado que comprende un compuesto de insulina y se caracteriza por el suministro del compuesto de insulina en el plasma sangumeo de un mairnfero, de una forma que esencialmente no experimente aumento brusco.
En una realizacion adicional mas, se mide el perfil farmacocinetico en el plasma sangumeo de un mamffero, tal como el plasma sangumeo humano. Las concentraciones de insulina en el plasma se pueden medir con kits de ELISA disponibles en el mercado, relacionando los resultados de una curva de calibracion obtenida a partir de un patron de insulina. Para la significacion estadfstica, el experimento se lleva a cabo con un numero adecuado de repeticiones biologicas y tecnicas, y se calculan los valores medios y medianas para el ajuste por la variabilidad biologica y tecnica.
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza porque presenta una relacion de pico a valle menor de 2, tfpicamente menor de 1,75, preferiblemente menor de 1,5, o incluso menor de 1,25.
En una realizacion adicional mas, la composicion se caracteriza por una liberacion continua de un compuesto de insulina estructuralmente intacto a lo largo del periodo de tiempo completo entre administraciones.
“Liberacion continua” se refiere a una liberacion de insulina no interrumpida.
En una realizacion adicional, el periodo de tiempo completo entre administraciones es al menos aproximadamente 80 horas, tal como aproximadamente 110 horas, tfpicamente al menos una semana, tal como 1-2 semanas o incluso mas prolongado.
En una realizacion adicional mas, el compuesto de insulina es un profarmaco.
En una realizacion adicional, el compuesto de insulina es un profarmaco unido a vehmulo.
En una realizacion adicional mas, el compuesto de insulina es un profarmaco de cascada.
El profarmaco se puede administrar como un lfquido, tal como una solucion o gel, o puede estar contenido en un deposito, o incluso integrado en un deposito, de modo que el deposito funciona como un profarmaco.
En una realizacion adicional, el compuesto de insulina esta totalmente contenido en un deposito.
La expresion “totalmente contenido” se refiere a un deposito, en el que menos de 10% del farmaco, es decir, insulina, esta presente en la fraccion de agua despues de anadir 1 ml de agua a 1 ml de deposito, mezclar y separar el deposito del agua.
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En una realizacion adicional mas, el deposito es un gel polimerico, tal como un hidrogel.
En una realizacion adicional, el deposito es una matriz de poKmero bien hidratada.
El compuesto de insulina puede estar contenido en el deposito de varias formas, por ejemplo, el compuesto de insulina puede estar unido de una forma no covalente o el compuesto de insulina puede estar unido de forma covalente al deposito, cuyo deposito se selecciona, sin limitacion, de un gel de polfmero, un hidrogel o una matriz de polfmero bien hidratada. Los ejemplos no limitantes de polfmeros adecuados son polfmeros que son capaces de formar redes moleculares bien hidratadas tridimensionales casi infinitas. Dichos hidrogeles son polfmeros basados en polialquiloxi funcionalizados o no funcionalizados, qmmica o ffsicamente reticulados como poli(propilenglicol) o poli(etilenglicol), dextrano, chitosan, acido hialuronico y derivados, alginato, xilano, manano, carragenano, agarosa, celulosa, almidon, hidroxietil-almidon (HES) y otros polfmeros basados en hidratos de carbono, poli(alcoholes vimlicos), poli(oxazolinas), poli(anhndridos), poli(ortoesteres), poli(carbonatos), poli(uretanos), poli(acidos acnlicos), poli(acrilamidas) tales como poli(hidroxipropilmetacrilamida) (HMPA), poli(acrilatos), poli(metacrilatos) como poli(hidroxietilmetacrilato), poli(organofosfazenos), poli(siloxanos), poli(vinilpirrolidona), poli(cianoacrilatos), poli(esteres) tales como poli(acido lactico) o poli(acidos glicolicos), poli(iminocarbonatos), poli(aminoacidos) tales como poli(acido glutamico) o polilisina, colageno, gelatina, copolfmeros, copoKmeros de injerto, poUmeros reticulados, hidrogeles y copolfmeros de bloques de los polfmeros citados antes. Estos poUmeros pueden servir como restos de cadena principal o restos de reticulacion y son posibles combinaciones de diferentes polfmeros como copolfmeros, que proporcionen un alto nivel de hidratacion de la red molecular. Ademas de los restos de reticulacion oligomericos o polimericos de los tipos de polfmeros citados antes, se pueden usar restos de reticulacion de bajo peso molecular, en especial cuando se usan restos de cadena principal de alto peso molecular hidrofilos para la formacion de los vehnculos de los profarmacos de hidrogel.
Una forma de minimizar el contacto entre insulinas a nivel molecular es mediante el espaciado de las moleculas de insulina homogeneamente en la matriz de polfmero bien hidratada. El espaciado homogeneo se puede lograr mediante la union covalente de la insulina al polfmero y usando conectores que se escinden en un entorno acuoso a pH neutro, y se asegura una liberacion lenta de la insulina estructuralmente intacta.
Se prefiere un profarmaco de insulina unida a polfmero que no tenga esencialmente bioactividad, haciendo esta propiedad que toda la actividad insulinotropica sea atribuible a la insulina liberada. Por lo tanto, mediante el diseno de las propiedades de liberacion del profarmaco, se pude lograr un grado alto de control sobre los niveles plasmaticos de insulina.
La insulina se puede unir por cualquier grupo funcional relevante proporcionado por la molecula, y dichos grupos funcionales preferidos proporcionados por aminoacidos biogenicos, se seleccionan tfpicamente de guanidino, imidazol, indol, carboxi, carboxamida, hidroxilo primario y secundario, fenol, y amino primario. Por ejemplo, la insulina humana tiene los siguientes grupos funcionales relevantes: carboxi, carboxiamida, hidroxi primario y secundario, fenol, imidazol, y amino primario.
En una realizacion adicional, el compuesto de insulina esta unido a un profarmaco vehfculo sea por union covalente a cualquiera de los restos de lisina sea/o al extremo N de cualquiera/o de la cadena A o la cadena B del compuesto de insulina.
En el caso de que los compuestos de acuerdo con la formula (I) contengan uno o mas grupos acidos o basicos, la invencion tambien comprende sus correspondientes sales farmaceutica o toxicologicamente aceptables, en particular sus sales farmaceuticamente utilizables. Por lo tanto, los compuestos de formula (I) que contienen grupos acido se pueden usar de acuerdo con la invencion, por ejemplo, como sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinoterreos o como sales de amonio. Los ejemplos mas precisos de dichas sales incluyen sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio o sales con amoniaco o aminas organicas tales como, por ejemplo, etilamina, etanolamina, trietanolamina o aminoacidos. Los compuestos de formula (I) que contiene uno o mas grupos basicos, es decir, grupos que se pueden protonar, pueden estar presentes y se pueden usar de acuerdo con la invencion, en forma de sus sales de adicion con acidos inorganicos u organicos. Los ejemplos de acidos adecuados incluyen cloruro de hidrogeno, bromuro de hidrogeno, acido fosforico, acido sulfurico, acido mtrico, acido metanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acidos naftalenosulfonicos, acido oxalico, acido acetico, acido tartarico, acido lactico, acido salidlico, acido benzoico, acido formico, acido propionico, acido pivalico, acido dietilacetico, acido malonico, acido sucdnico, acido pimelico, acido fumarico, acido maleico, acido malico, acido sulfammico, acido fenilpropionico, acido gluconico, acido ascorbico, acido isonicotmico, acido cftrico, acido adfpico y otros acidos conocidos para el experto en la tecnica. Si los compuestos de formula (I) contienen simultaneamente grupos acidos y basicos en la molecula, la invencion tambien incluye, ademas de las formas de sales mencionadas, sales internas o betamas (iones hfbridos). Las respectivas sales de acuerdo con la formula (I) se pueden obtener por metodos habituales que son conocidos para el experto en la tecnica como, por ejemplo, poniendo en contacto estos con un acido o base organico o inorganico en un disolvente o dispersante, o por intercambio anionico o intercambio cationico con otras sales. La presente invencion tambien incluye todas las sales de los compuestos de formula (I) que, debido a su baja compatibilidad fisiologica, no son directamente adecuadas para usar en productos farmaceuticos, pero que se pueden usar, por ejemplo, como compuestos intermedios para reacciones qrnmicas o para la preparacion de sales farmaceuticamente aceptables.
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Preferiblemente, en la formula (I) R2 se sustituye por L2-Z. Preferiblemente, en la formula (I) R1 se sustituye por L2-Z. Preferiblemente, en la formula (I) X es N(R3).
Preferiblemente, en la formula (I) X es C(R3R3a) y R3a es N(R2b)C(O)R4. Preferiblemente, X es C(R3R3a), R3a es N(R2b)-L2-Z.
Los profarmacos preferidos de la presente invencion comprenden un conjugado de insulina y conector D-L, en donde L1 de la formula (I) se representa por las formulas (Ia), (Ib), (Ic) o (Id):
R1a, R2,
R2a, R2b, R3, R4, L2, Z tienen el significado indicado en la presente memoria y en donde L1 esta
en donde R
opcionalmente sustituido adicionalmente, con la condicion de que el hidrogeno marcado con el asterisco en las formulas (Ia) a (Id) no se sustituya por un sustituyente.
Preferiblemente, L1 no esta sustituido adicionalmente (aparte del sustituyente obligatorio L2-Z).
Como se muestra, p. ej., en las formulas (Ia) a (Id) un hidrogeno se sustituye por el grupo L2-Z.
En general, L2 puede estar unido a L1 en cualquier posicion aparte de la sustitucion del hidrogeno marcado con un asterisco en la formula (I). Preferiblemente, uno de los hidrogenos dado por R1, R1a, R2, R2a, R2b, R3, R3a, R4 directamente o como hidrogeno del alquilo C1-4 o grupos adicionales, se sustituye por L2-Z.
Ademas, L1 puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente. En general, se puede usar cualquier sustituyente siempre que no se afecte el principio de escision. Sin embargo, se prefiere que L1 no este adicionalmente sustituido.
consiste en halogeno; CN; COOR9 N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a);
9
Preferiblemente, uno o mas sustituyentes opcionales adicionales se seleccionan independientemente del grupo que
OR9;
NO2
T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50; o alquinilo C2-50, en donde T; C1-50 alquilo alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan opcionalmente sustituidos con uno o mas R10, que son iguales o diferentes y en donde el alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan opcionalmente interrumpidos con uno o mas grupos
C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a), S(O)N(R9R9a), OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a
S(O)2R9; S(O)R ; N(R9)C(O)OR9a:
seleccionados del grupo que consiste en T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-:
-S(O)N(R11)-; -S(O)2-;
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-S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R1l)C(O)N(R11a)-; y -OC(O)N(R11R1la);
R9, R9a, R9b se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H; T; y alquilo C1-50; alquenilo C2-50; o alquinilo C2-50, en donde T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan opcionalmente sustituidos con uno o mas R10, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan opcionalmente interrumpidos con uno o mas grupos seleccionados del grupo que consiste en T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R1Y)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; - N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; y -OC(O)N(R11R11a);
T se selecciona del grupo que consiste en fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclo de 9 a 11 miembros, en donde T esta opcionalmente sustituido con uno o mas R10, que son iguales o diferentes;
R10 es halogeno, CN; oxo (=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); o alquilo C1-6, en donde el alquilo C1-6 esta opcionalmente sustituido con uno o mas halogenos, que son iguales o diferentes;
R11, R11a, R12, R12a, R12b se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H; o alquilo C1-6, en donde el alquilo C1-6 esta opcionalmente sustituido con uno o mas halogenos, que son iguales o diferentes.
El termino “interrumpido” significa que entre dos carbonos se inserta un grupo o al final de la cadena de carbonos entre el carbono y el hidrogeno.
L2 es un enlace simple qrnmico o un espaciador. En el caso de que L2 sea un espaciador, preferiblemente se define como el uno o mas sustituyentes opcionales definidos antes, con la condicion de que L2 este sustituido con Z.
Por consiguiente
9a
cuando L2 es distinto de un enlace simple qrnmico,
S(O)N(R9R9a
9a 9 9a
S(O)2R9; S(O)R
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L2-Z es COOR9
9
OR9; C(O)R9
S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); OC(O)R9 N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50 o alquinilo C2-50, en donde T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan opcionalmente sustituidos con uno o mas R10, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan
C(O)N(R9R9a)
N(R9)C(O)R9a
opcionalmente interrumpidos con uno o mas grupos seleccionados del grupo que consiste en -T-, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(Rr1)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R1r)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; y-OC(O)N(R11R11a);
R9, R9a, R9b se seleccionan independientemente del grupo de H; Z; T; y alquilo C1-50; alquenilo C2-50 en donde T; alquilo C1-50; alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, son iguales o diferentes, y en donde el alquilo C1-50; interrumpidos con uno o mas grupos seleccionados del grupo que consiste en T, -C(O)O-; -O-; -C(O)- -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R1Y)S(O)2N(R11a)-; -S-; -MR/1)-; -OC(O)R11; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; - N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; y-OC(O)N(R11R11a);
o alquinilo C2-50,
estan opcionalmente sustituidos con uno o mas R10, que alquenilo C2-50; y alquinilo C2-50, estan opcionalmente
-C(O)N(R11)-; -N(R11)C(O)-;
T se selecciona del grupo que consiste en fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo C3-10; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclo de 9 a 11 miembros, en donde t esta opcionalmente sustituido con uno o mas R10, que pueden ser iguales o diferentes;
R10 es Z; halogeno; CN. oxo (=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); 312 S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; ^N(R12R12a); NO2; 1PC|O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a;
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-,12a
12
->12^r-»12b
S(O)2R
N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); o alquilo C1-6, en donde el alquilo C1-6 esta opcionalmente sustituido con uno o mas halogenos, que son iguales o diferentes;
R11, R11a, R12, R12a, R12b se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H; Z; o alquilo C1-6, en donde el alquilo C1-6 esta opcionalmente sustituido con uno o mas halogenos, que son iguales o diferentes;
con la condicion de que uno de R9, R9a, R9b, R10, R11
R11a, R12, R12a, R12b es Z.
Mas preferiblemente, L2 es una cadena de alquilo C1-20, que esta opcionalmente interrumpida con uno o mas grupos independientemente seleccionados de -O-; y C(O)N(R3aa); opcionalmente sustituido con uno o mas grupos independientemente seleccionados de OH; y C(O)N(R3aaR3aaa); y en donde R3aa, R3aaa se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H; y alquilo C1-4.
Preferiblemente, L2 tiene un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol a 750 g/mol.
Preferiblemente, L2 esta unido a Z por un grupo terminal seleccionado de
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En el caso de que L2 tenga dicho grupo terminal, se prefiere ademas que L2 tenga un peso molecular en el intervalo de 14 g/mol a 500 g/mol, calculado sin dicho grupo terminal.
Preferiblemente, la union covalente formada entre el conector y el hidrogel Z es un enlace permanente.
Preferiblemente, el hidrogel Z es hidrogel insoluble en agua basado en polietilenglicol (PEG) biodegradable. La expresion “basado en PEG” como se entiende en la presente memoria, significa que la proporcion en masa de las cadenas de PEG en el hidrogel es al menos 10% en peso, preferiblemente al menos 25%, basado en el peso total del hidrogel. El resto puede estar compuesto de espaciadores y/u oligomeros o polfmeros, tales como oligo o polilisinas.
Ademas, la expresion “insoluble en agua” se refiere a una red molecular reticulada tridimensionalmente que forma el hidrogel. El hidrogel si suspende en un gran exceso de agua, o tampon acuoso de osmolalidad fisiologica, puede absorber una cantidad sustancial de agua, p. ej., hasta 10 veces en una base en peso, y por lo tanto se puede hinchar, pero despues de retirar el exceso de agua retiene todavfa la estabilidad ffsica de un gel y la forma. Dicha forma puede ser de cualquier geometna, y se entiende que dicho objeto de hidrogel individual se debe considerar como una sola molecula que consiste en componentes en donde cada componente esta conectado a otro componente por enlaces qmmicos.
De acuerdo con esta invencion, el hidrogel puede estar compuesto de restos de cadena principal interconectados por enlaces degradables por hidrolisis.
Preferiblemente, el resto de cadena principal tiene un peso molecular en el intervalo de 1 kDa a 20 kDa, mas preferiblemente de 1 kDa a 15 kDa e incluso mas preferiblemente de 1 kDa a 10 kDa. Los restos de cadena principal principalmente tambien se basan en PEG, comprendiendo una o mas cadenas de PEG.
En un hidrogel que lleva conjugados de farmaco-conector de acuerdo con la invencion, un resto de cadena principal se caracteriza por una serie de grupos funcionales, que comprenden grupos funcionales biodegradables interconectados y conjugados de farmaco-conector conectados a hidrogel, y opcionalmente grupos de rematado. Esto significa que un resto de cadena principal se caracteriza por una serie de conjugados de farmaco-conector conectados a hidrogel; grupos funcionales que comprenden grupos funcionales interconectados biodegradables; y opcionalmente grupos de rematado. Preferiblemente, la suma de los grupos funcionales interconectados biodegradables y conjugados de farmaco-conector es 16-128, preferido 20-100, mas preferido 24-80 y lo mas preferido 30-60.
Preferiblemente, la suma de grupos funcionales interconectados y conjugados de farmaco-conector conectados a hidrogel y grupos de rematado de un resto de cadena principal se divide de forma igualitaria entre el numero de cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro de ramificacion. Por ejemplo, si hay 32 grupos funcionales interconectados y conjugados de farmaco-conector conectados a hidrogel y grupos de rematado, 8 grupos los pueden proporcionar cada uno de las cuatro cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro, preferiblemente mediante restos dendnticos unidos al extremo de cada cadena polimerica basada en PEG. Alternativamente, cuatro grupos los pueden proporcionar cada una de las ocho cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro, o dos grupos cada una de las dieciseis cadenas polimericas basadas en PEG. Si el numero de cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro no permite una distribucion igualitaria, se prefiere que el numero medio de la suma de los grupos funcionales interconectados y conjugados de farmaco-conector conectados a hidrogel y grupos de rematado por cadena polimerica basada en PEG, se mantenga en un mmimo.
En dichos profarmacos unidos a vehfculo de acuerdo con la invencion, es conveniente que practicamente toda la liberacion de farmaco (>90%) haya ocurrido antes de que tenga lugar un aumento significativo de liberacion de los restos de cadena principal (<10%). Esto se puede lograr ajustando la semivida del profarmaco unido a vehfculo frente a la cinetica de degradacion del hidrogel de acuerdo con la invencion.
Preferiblemente, un resto de cadena principal se caracteriza por tener un centro que se ramifica, a partir del cual se extienden al menos tres cadenas polimericas basadas en PEG. Por consiguiente, en un aspecto preferido de la presente invencion, el reactivo de cadena principal comprende un centro que se ramifica, a partir del cual se extienden al menos tres cadenas polimericas basadas en PEG. Dichos centros que se ramifican pueden estar compuestos de poli u oligoalcoholes en forma unida, preferiblemente pentaeritritol, tripentaeritritol, hexaglicerina, sacarosa, sorbitol, fructosa, manitol, glucosa, celulosa, amilosas, almidones, hidroxialquil-almidones, poli(alcoholes vimlicos), dextranos, hialuronanos, o los centros que se ramifican pueden estar compuestos de oligoaminas tales
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como ornitina, acido diaminobutmco, trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, octalisina, nonalisina, decalisina, undecalisina, dodecalisina, tridecalisina, tetradecalisina, pentadecalisina u oligolisinas, polietileneiminas, polivinilaminas en forma unida.
Preferiblemente, del centro que se ramifica se extienden de 3 a 16 cadenas polimericas basadas en PEG, mas preferiblemente de 4 a 8. Los centros que se ramifican preferidos pueden estar compuestos de pentaeritritol, ornitina, acido diaminobutmco, trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina u oligolisina, PEI de bajo peso molecular, hexaglicerina, tripentaeritritol en forma unida. Preferiblemente, del centro que se ramifica se extienden de 3 a 16 cadenas polimericas basadas en PEG, mas preferiblemente de 4 a 8. Preferiblemente, la cadena polimerica basada en PEG es una cadena de polietilenglicol lineal, de la cual un extremo esta conectado al centro que se ramifica y el otro a un resto dendntico hiper-ramificado. Se entiende que una cadena polimerica basada en PEG puede estar terminada o interrumpida por grupos alquilo o arilo opcionalmente sustituidos con heteroatomos y grupos funcionales qmmicos.
Preferiblemente, una cadena polimerica basada en PEG es un derivado de polietilenglicol adecuadamente sustituido (basado en PEG).
Las estructuras preferidas para las correspondientes cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde un centro de ramificacion contenido en un resto de cadena principal, son derivados de PEG de multiples brazos como, por ejemplo, se detalle en la lista de productos de of JenKem Technology, EE.UU. (accedido por
www.jenkemusa.com el 28 de julio, 2009), derivados 4brazos-PEG (centro de pentaeritritol), derivados de 8brazos- PEG (centro de hexaglicerina) y derivados de 8brazos-PEG (centro de tripentaeritritol). Los mas preferidos son los 4brazos-PEG-Amina (centro de pentaeritritol) y 4brazos-PEG-Carboxilo (centro de pentaeritritol), 8brazos-PEG- Amina (centro de hexaglicerina), 8brazos-PEG-Carboxilo (centro de hexaglicerina), 8brazos-PEG-Amina (centro de tripentaeritritol) y 8brazos-PEG-Carboxilo (centro de tripentaeritritol). Los pesos moleculares preferidos para dichos derivados de pEg de multiples brazos en un resto de cadena principal son de 1 kDa a 20 kDa, mas preferiblemente de 1 kDa a 15 kDa e incluso mas preferiblemente de 1 kDa a 10 kDa.
www.jenkemusa.com el 28 de julio, 2009), derivados 4brazos-PEG (centro de pentaeritritol), derivados de 8brazos- PEG (centro de hexaglicerina) y derivados de 8brazos-PEG (centro de tripentaeritritol). Los mas preferidos son los 4brazos-PEG-Amina (centro de pentaeritritol) y 4brazos-PEG-Carboxilo (centro de pentaeritritol), 8brazos-PEG- Amina (centro de hexaglicerina), 8brazos-PEG-Carboxilo (centro de hexaglicerina), 8brazos-PEG-Amina (centro de tripentaeritritol) y 8brazos-PEG-Carboxilo (centro de tripentaeritritol). Los pesos moleculares preferidos para dichos derivados de pEg de multiples brazos en un resto de cadena principal son de 1 kDa a 20 kDa, mas preferiblemente de 1 kDa a 15 kDa e incluso mas preferiblemente de 1 kDa a 10 kDa.
Se entiende que los grupos amina terminales de las moleculas de multiples brazos mencionadas antes, estan presentes en forma unida en el resto de cadena principal para proporcionar grupos funcionales interconectados adicionales y grupos funcionales reactivos de un resto de cadena principal.
Se prefiere que la suma de los grupos funcionales interconectados y los grupos funcionales reactivos de un resto de cadena principal se divida de forma igualitaria entre el numero de cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro que se ramifica. Si el numero de cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro que se ramifica no permite una distribucion igualitaria, se prefiere que la desviacion del numero medio de la suma de los grupos funcionales interconectados y reactivos por cadena polimerica basada en PEG se mantenga en el mmimo.
Mas preferiblemente, la suma de grupos funcionales interconectados y reactivos por un resto de cadena principal se divide de forma igualitaria entre el numero de cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro que se ramifica. Por ejemplo, si hay 32 grupos funcionales interconectados y grupos funcionales reactivos, pueden proporcionar ocho grupos cada una de las cuatro cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro que se ramifica, preferiblemente mediante restos dendnticos unidos al extremo de cada cadena polimerica basada en PEG. Alternativamente, pueden proporcionar cuatro grupos cada una de las ocho cadenas polimericas basadas en PEG que se extienden desde el centro que se ramifica o dos grupos cada una de las dieciseis cadenas polimericas basadas en PEG.
Dichos grupos funcionales adicionales los pueden proporcionar los restos dendnticos. Preferiblemente, cada resto dendntico tiene un peso molecular en el intervalo de 0,4 kDa a 4 kDa, mas preferiblemente de 0,4 kDa a 2 kDa. Preferiblemente, cada resto dendntico tiene al menos 3 ramificaciones y al menos 4 grupos funcionales reactivos, y como mucho 63 ramificaciones y 64 grupos funcionales reactivos, se prefiere al menos 7 ramificaciones y al menos 8 grupos funcionales reactivos, y como mucho 31 ramificaciones y 32 grupos funcionales reactivos.
Los ejemplos de dichos restos dendnticos estan compuestos de trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, octalisina, nonalisina, decalisina, undecalisina, dodecalisina, tridecalisina, tetradecalisina, pentadecalisina, hexadecalisina, heptadecalisina, octadecalisina, nonadecalisina en forma unida. Los ejemplos de dichos restos dendnticos preferidos estan compuestos de trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina en forma unida, lo mas preferido de trilisina, pentalisina o heptalisina, ornitina, acido diaminobutmco en forma unida.
Lo mas preferiblemente, el vehmulo de hidrogel de la presente invencion se caracteriza porque el resto de cadena principal tiene un carbono cuaternario de formula C(A-Hyp)4, en donde cada A es independientemente una cadena polimerica basada en polietilenglicol unida terminalmente al carbono cuaternario por un enlace covalente y el extremo distal de la cadena polimerica basada en PEG esta unido covalentemente a un resto dendntico Hyp, teniendo cada resto dendntico Hyp al menos cuatro grupos funcionales que representan grupos funcionales interconectados y grupos funcionales reactivos.
Preferiblemente, cada A se selecciona independientemente de la formula -(CH2)n1(OCH2CH2)nX-, en donde n1 es 1 o
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2; n es un numero entero en el intervalo de 5 a 50; y X es un grupo funcional qmmico que une covalentemente A e Hyp.
Preferiblemente, A e Hyp estan unidos covalentemente por un enlace amida.
Preferiblemente, el resto dendntico Hyp es un polipeptido hiper-ramificado. Preferiblemente, el polipeptido hiper- ramificado comprende lisina en forma unida. Preferiblemente, cada resto dendntico Hyp tiene un peso molecular en el intervalo de 0,4 kDa a 4 kDa. Se entiende que un resto de cadena principal C(A-Hyp)4 puede consistir en los mismos o diferentes restos dendnticos Hyp y que cada Hyp se puede seleccionar independientemente. Cada resto Hyp consiste en entre 5 y 32 lisinas, preferiblemente al menos 7 lisinas, es decir, cada resto Hyp esta compuesto de entre 5 y 32 lisinas en forma unida, preferiblemente al menos 7 lisinas en forma unida. Lo mas preferiblemente Hyp esta compuesto de heptalisinilo.
La reaccion de los grupos funcionales polimerizables de un reactivo de cadena principal, mas espedficamente de Hyp con los grupos funcionales polimerizables de reactivos de reticulacion basados en polietilenglicol, da como resultado un enlace amida permanente.
Preferiblemente C(A-Hyp)4 tiene un peso molecular en el intervalo de 1 kDa a 20 kDa, mas preferiblemente de 1 kDa o 15 kDa e incluso mas preferiblemente de 1 kDa a 10 kDa.
Se muestra a continuacion un resto de cadena principal preferido, las lmeas de trazos indican las uniones biodegradables de interconexion a restos reticuladores y n es un numero entero de 5 a 50:
La biodegradabilidad de los hidrogeles de acuerdo con la presente invencion se logra por la introduccion de enlaces degradables por hidrolisis.
Las expresiones “degradable por hidrolisis”, “biodegradable” o “escindible por hidrolisis”, “autoescindible” o “autoescision”, “que se autoescinde”, “transitorio” o “temporal”, se refieren dentro del contexto de la presente invencion, a enlaces y uniones que se pueden degradar o escindir por hidrolisis de forma no enzimatica en condiciones fisiologicas (tampon acuoso a pH 7,4, 37°C) con semividas en el intervalo de una hora a tres meses, e incluye, pero no se limita a aconitilos, acetales, amidas, anddridos carboxflicos, esteres, iminas, hidrazonas, amidas del acido maleamico, ortoesteres, fosfamidas, fosfoesteres, esteres de fosfosililo, esteres de sililo, esteres
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sulfonicos, carbamates aromaticos, combinaciones de los mismos, y similares.
Si esta presente en un hidrogel de acuerdo con la invencion como grupo funcional interconectado degradable, las uniones biodegradables preferidas son esteres, carbonatos, fosfoesteres y esteres de acido sulfonico, y las mas preferidas son esteres o carbonatos.
Las uniones permanentes son degradables por hidrolisis de forma no enzimatica en condiciones fisiologicas (tampon acuoso a pH 7,4, 37°C) con semividas de 6 meses o mas prolongadas, tales como, por ejemplo, amidas.
Para introducir los enlaces escindibles por hidrolisis en el vehteulo de hidrogel de la invencion, los restos de cadena principal pueden estar unidos directamente entre sf mediante enlaces biodegradables.
En una realizacion, los restos de cadena principal del vehteulo de hidrogel biodegradable pueden estar unidos directamente entre sf, es decir, sin restos reticuladores. Los restos dendnticos hiper-ramificados de dos restos de cadena principal de dicho hidrogel biodegradable pueden estar unidos directamente por un grupo funcional interconectado de dicho hidrogel biodegradable que conecta los dos restos dendnticos hiper-ramificados. Alternativamente, los dos restos dendnticos hiper-ramificados de dos restos de cadena principal diferentes pueden estar interconectados por dos restos espaciadores conectados a un resto de cadena principal y en el otro lado conectados a un resto de reticulacion separado por grupos funcionales interconectados.
Alternativamente, los restos de cadena principal pueden estar unidos entre sf por restos reticuladores, cada resto reticulador esta terminado por al menos dos enlaces degradables por hidrolisis. Ademas de los enlaces degradables de terminacion, los restos reticuladores pueden contener ademas enlaces biodegradables. Por lo tanto, cada extremo del resto reticulador unido a un resto de cadena principal comprende un enlace degradable por hidrolisis, y pueden estar presentes enlaces biodegradables adicionales en el resto reticulador.
Preferiblemente, el vehteulo de hidrogel biodegradable esta compuesto de restos de cadena principal interconectados por enlaces degradables por hidrolisis y los restos de cadena principal estan unidos entre sf por restos reticuladores.
El vehteulo de hidrogel biodegradable puede contener uno o mas tipos diferentes de restos reticuladores, preferiblemente uno. El resto reticulador puede ser una molecula lineal o ramificada y preferiblemente es una molecula lineal. En una realizacion preferida de la invencion, el resto reticulador esta conectado a restos de cadena principal por al menos dos enlaces biodegradables.
Preferiblemente, los restos reticuladores tienen un peso molecular en el intervalo de 60 Da a 5 kDa, mas preferiblemente, de 0,5 kDa a 4 kDa, incluso mas preferiblemente de 1 kDa a 4 kDa, incluso mas preferiblemente de 1 kDa a 3 kDa. En una realizacion, un resto reticulador consiste en un polfmero.
Ademas de los restos de reticulacion oligomericos o polimericos, se pueden usar restos de reticulacion de bajo peso molecular, en especial cuando se usan restos de cadena principal de alto peso molecular hidrofilos para la formacion de un hidrogel biodegradable de acuerdo con la invencion.
Preferiblemente, los restos reticuladores basados en polietilenglicol son cadenas hidrocarbonadas que comprenden unidades de etilenglicol, opcionalmente comprenden grupos funcionales qmmicos adicionales, en donde los restos reticuladores basados en polietilenglicol comprenden al menos cada uno m unidades de etilenglicol, en donde m es un numero entero en el intervalo de 3 a 100, preferiblemente de 10 a 70. Preferiblemente, los restos reticuladores basados en polietilenglicol tienen un peso molecular en el intervalo de 0,5 kDa a 5 kDa.
Si se usa en referencia a un resto reticulador o a una cadena polimerica basada en PEG conectada a un centro que se ramifica, el termino “basado en PEG” se refiere a un resto reticulador o cadena polimerica basada en PEG que comprende al menos 20% en peso de restos de etilenglicol.
En una realizacion, los monomeros que constituyen los restos reticuladores polimericos estan conectados por enlaces biodegradables. Dichos restos reticuladores polimericos pueden contener hasta 100 enlaces biodegradables o mas, dependiendo del peso molecular del resto reticulador y el peso molecular de las unidades de monomero. Los ejemplos de dichos restos reticuladores son polfmeros basados en poli(acido lactico) o poli(acido glicolico). Se entiende que dicha cadena de poli(acido lactico) o poli(acido glicolico) puede estar terminada o interrumpida por grupos alquilo o arilo y que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroatomos y grupos funcionales qmmicos.
Preferiblemente, los restos reticuladores estan basados en PEG, preferiblemente representados por solo una cadena molecular basada en PEG. Preferiblemente, los restos reticuladores basados en polietilenglicol son cadenas de hidrocarburo que comprenden unidades de etilenglicol, que comprenden opcionalmente grupos funcionales qmmicos adicionales, en donde los restos reticuladores basados en polietilenglicol comprenden al menos cada uno m unidades de etilenglicol, en donde m es un numero entero en el intervalo de 3 a 100, preferiblemente de 10 a 70. Preferiblemente, los restos reticuladores basados en polietilenglicol tienen un peso molecular en el intervalo de 0,5 kDa a 5 kDa.
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En una realizacion preferida de la presente invencion, el resto reticulador consiste en PEG, que esta conectado simetricamente por enlaces ester a dos espaciadores alfa,omega-dicarbox^licos alifaticos proporcionados por restos de cadena principal conectados al resto dendrftico hiper-ramificado por enlaces amida permanentes.
Los acidos dicarboxflicos de los restos espaciadores conectados a un resto de cadena principal y en el otro lado conectados a un resto de reticulacion, consisten en 3 a 12 atomos de carbono, mas preferiblemente entre 5 y 8 atomos de carbono y pueden estar sustituidos en uno o mas atomos de carbono. Los sustituyentes preferidos son grupos alquilo, grupos hidroxilo o grupos amido o grupos amino sustituidos. Uno o mas de los grupos metileno del acido dicarboxflico alifatico puede estar opcionalmente sustituido por O o NH o N sustituido con alquilo. El alquilo preferido es alquilo lineal o ramificado con de 1 a 6 atomos de carbono.
Preferiblemente, hay un enlace amida permanente entre el resto dendrftico hiper-ramificado y el resto espaciador conectado a un resto de cadena principal y en el otro lado esta conectado a un resto reticulador.
Se muestra a continuacion un resto reticulador preferido; las lmeas de trazos indican las uniones biodegradables de interconexion a los restos de cadena principal:
en donde n es un numero entero de 5 a 50.
Preferiblemente, el vehfculo de hidrogel esta compuesto de restos de cadena principal interconectados por enlaces degradables por hidrolisis.
Mas preferiblemente, los restos de cadena principal comprenden un centro que se ramifica de la siguiente formula:
en donde la lrnea de trazos indica la union al resto de cadena principal restante:
Mas preferiblemente, los restos de cadena principal comprenden una estructura de la siguiente formula:
en donde n es un numero entero de 5 a 50 y la lrnea de trazos indica la union al resto de cadena principal restante. Preferiblemente, el resto de cadena principal comprende un resto hiper-ramificado Hyp.
Mas preferiblemente, el resto de cadena principal comprende un resto hiper-ramificado Hyp de la siguiente formula:
en donde la lmea de trazos indica la union al resto de la molecula y los atomos de carbono marcados con asteriscos indican configuracion S.
Preferiblemente, los restos de cadena principal estan unidos a al menos un espaciador de la siguiente formula:
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en donde la lmea de trazos marcada con un asterisco indica el enlace entre el hidrogel y el N del grupo tiosuccinimida,
en donde la otra lmea de trazos indica la union a Hyp, y en donde p es un numero entero de 0 a 10.
10 Preferiblemente, los restos de cadena principal estan unidos a al menos un espaciador de la siguiente formula:
O O
en donde una de las lmeas de trazos indica la union al resto hiper-ramificado Hyp y la segunda lmea de trazos indica la union al resto de la molecula; y
en donde m es un numero entero de 2 a 4.
15 Preferiblemente, los restos de cadena principal estan unidos entre sf por restos reticuladores que tienen la siguiente estructura
en donde
q es un numero entero de 3 a 100;
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en la velocidad de hidrolisis de los enlaces biodegradables entre los restos de cadena principal y los restos reticuladores influye, o esta determinada por el numero y tipo de atomos conectados adyacentes al grupo PEG-ester de carboxi. Por ejemplo, seleccionando el acido succmico, adfpico o glutarico para la formacion del ester de PEG, se pueden variar las semividas de degradacion del vetnculo de hidrogel biodegradable de acuerdo con la invencion.
La cantidad total de restos de cadena principal se puede medir en solucion despues de degradacion completa del hidrogel de acuerdo con la invencion, y durante la degradacion se pueden separar fracciones de productos de degradacion de la cadena principal del hidrogel insoluble de acuerdo con la invencion, y se pueden cuantificar sin interferencia de otros productos de degradacion solubles liberados del hidrogel de acuerdo con la invencion. Un hidrogel objeto de acuerdo con la invencion se puede separar del exceso de agua de tampon de osmolalidad fisiologica por sedimentacion o centrifugacion. La centrifugacion se puede llevar a cabo de modo que el lfquido sobrenadante proporciona al menos 10% del volumen del hidrogel que se hincha de acuerdo con la invencion. Los productos de degradacion del hidrogel solubles permanecen en el lfquido sobrenadante acuoso despues de dicha etapa de sedimentacion o centrifugacion, y los productos de degradacion solubles en agua que comprenden uno o mas restos de cadena principal son detectables sometiendo partes alfcuota de dicho lfquido sobrenadante a metodos de separacion y/o analfticos adecuados.
Preferiblemente, los productos de degradacion solubles en agua se pueden separar de los productos de degradacion insolubles en agua por filtracion a traves de filtros de 0,45 pm, despues de lo cual los productos de degradacion se pueden encontrar en el flujo que pasa. Los productos de degradacion solubles en agua tambien se pueden separar de los productos de degradacion insolubles en agua por una combinacion de una etapa de centrifugacion y una filtracion.
Por ejemplo, los restos de cadena principal pueden llevar grupos que presentan absorcion UV a longitudes de onda donde otros productos de degradacion no presentan absorcion UV. Dichos grupos que absorben UV selectivamente pueden ser componentes estructurales del resto de cadena principal tales como enlaces amida o se pueden introducir en la cadena principal por union a sus grupos funcionales reactivos mediante sistemas de anillos aromaticos tales como grupos indolilo.
En dichos profarmacos de insulina unida a hidrogel de acuerdo con la invencion, es deseable que practicamente toda la liberacion de insulina (>90%) haya ocurrido antes de que tenga lugar un aumento significativo de la liberacion de los productos de degradacion de la cadena principal (<1o%). Esto se puede lograr ajustando la semivida del profarmaco de insulina unida a hidrogel frente a la cinetica de degradacion del hidrogel.
El profarmaco de insulina unida a hidrogel de la presente invencion se puede preparar partiendo del hidrogel de la presente invencion por metodos convenientes conocidos en la tecnica. Esta claro para un experto en la tecnica que existen varias rutas. Por ejemplo, el conector del profarmaco mencionado antes al que esta unido coavalentemente el resto biologicamente activo, es decir, la insulina, se puede hacer reaccionar con los grupos funcionales reactivos del hidrogel de la presente invencion que llevan ya o no el resto activo, es decir, la insulina, en parte, o completo.
En un metodo preferido de preparacion, el hidrogel se genera por reacciones qmmicas de ligacion. El hidrogel se puede formar a partir de dos eductos macromoleculares con grupos funcionales complementarios que dan una reaccion tal como una condensacion o adicion. Uno de estos materiales de partida es un reactivo reticulador con al menos dos grupos funcionales identicos y el otro material de partida es un reactivo de cadena funcional homomultifuncional. Los grupos funcionales adecuados presentes en el reactivo de reticulacion incluyen amino, acido carboxflico y derivados, maleimida y otros aceptores de Michael alfa,beta-insaturados como grupos vinilsulfona, tiol, hidroxilo. Los grupos funcionales adecuados presentes en el reactivo de la cadena principal incluyen, pero no se limitan a amino, acido carboxflico y derivados, maleimida y otros aceptores de Michael alfa,beta-insaturados como grupos vinilsulfona, tiol, hidroxilo.
Si los grupos polimerizables del reactivo reticulador se usan de forma subestequiometrica con respecto a los grupos polimerizables de la cadena principal, el hidrogel resultante sera un hidrogel reactivo con grupos funcionales reactivos libres unidos a la estructura de la cadena principal.
Opcionalmente, el conector del profarmaco se puede conjugar primero con la insulina y el conjugado de insulina- conector del profarmaco se puede hacer reaccionar despues con los grupos funcionales reactivos del hidrogel. Alternativamente, despues de activacion de uno de los grupos funcionales del conector del profarmaco, el conjugado de conector-hidrogel se puede conectar con la insulina en la segunda etapa de reaccion y el exceso de insulina se puede eliminar por filtracion despues de conjugacion de la insulina al conector del profarmaco unido al hidrogel.
Un procedimiento preferido para la preparacion de un profarmaco de acuerdo con la presente invencion es como sigue:
Un material de partida preferido para la smtesis del reactivo de la cadena principal es un PEG de 4 brazos- tetraamina o PEG de 8 brazos-octaamina, teniendo el reactivo de PEG un peso molecular en el intervalo de 2000 a 10000 Dalton, lo mas preferiblemente de 2000 a 5000 Da. A dichos derivados de PEG de multiples brazos se acoplan restos de lisina secuencialmente para formar un reactivo de cadena principal hiper-ramificado. Se entiende que las lisinas se pueden proteger parcial o totalmente con grupos protectores durante las etapas de acoplamiento y
que tambien el reactivo de la cadena principal final puede contener grupos protectores. Una unidad estructural preferida es una bis-Boc-lisina. Alternativamente, en lugar de adiciones secuenciales de restos de lisina, se puede ensamblar un resto de poli-lisina dendntico primero y posteriormente acoplarlo con la PEG de 4 brazos-tetraamina o PEG de 8 brazos-octaamina. Es conveniente obtener el reactivo de la cadena principal que lleva 32 grupos amino, 5 por consiguiente, se uninan siete lisinas a cada brazo de un PEG de 4 brazos, o se uninan cinco lisinas a cada brazo de un PEG de 8 brazos. En otra realizacion, el derivado de PEG de multiples brazos es un tetra- u octa- carboxi. En este caso, los restos dendnticos se pueden generar a partir del acido glutarico o aspartico, y el reactivo de la cadena principal resultante llevana 32 grupos carboxi. Se entiende que toda o una parte de los grupos funcionales del reactivo de la cadena principal pueden estar presentes en una forma libre, como sales o conjugados 10 a grupos protectores. Se entiende que debido a razones practicas el numero de lisinas del reactivo de la cadena principal por brazo de PEG sera entre seis y siete, mas preferiblemente aproximadamente siete.
Un reactivo de la cadena principal preferido se muestra a continuacion:
La smtesis del reactivo reticulador empieza a partir de una cadena de PEG lineal con un peso molecular en el 15 intervalo de 0,2 a 5 kDa, mas preferiblemente de 0,6 a 2 kDa, que se esterifica con un semiester de un acido dicarboxflico, lo mas preferido acido adfpico o acido glutarico. El grupo protector preferido para la formacion del semiester es el grupo bendlico. Los semiesteres de bis-acido dicarboxflico-PEG se convierten en compuestos carboxi mas reactivos tales como cloruros de acilo o esteres activos, p. ej., esteres de pentafluorofenilo o N- hidroxisuccinimida, lo mas preferido esteres de N-hidroxisuccinimida, de los cuales la estructura seleccionada 20 preferida se muestra a continuacion.
en donde cada m es independientemente un numero entero en el intervalo de 2 a 4, y q es un numero entero de 3 a 100.
Es mas preferida la siguiente estructura:
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Alternativamente, los semiesteres de bis-acido dicarboxflico-PEG se pueden activar en presencia de un agente de acoplamiento tal como DCC o HOBt o PyBOP.
En una realizacion alternativa, el reactivo de la cadena principal lleva grupos carboxilo y el correspondiente reactivo reticulador se seleccionana de cadenas de PEG terminadas en amino que contiene ester.
El reactivo de la cadena principal y el reactivo reticulador se pueden polimerizar para formar el hidrogel de acuerdo con la invencion usando polimerizacion en emulsion inversa. Despues de seleccionar la estequiometna deseada entre la cadena principal y los grupos polimerizables del reticulador, la cadena principal y el reticulador se disuelven en DMSO y se usa un emulsionante adecuado con un valor de HLB adecuado, preferiblemente Arlacel P135, para formar una emulsion inversa usando un agitador mecanico y controlando la velocidad de agitacion. La polimerizacion se inicia por la adicion de una base adecuada, preferiblemente por N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina. Despues de agitacion durante una cantidad de tiempo adecuada, la reaccion se inactiva por la adicion de un acido, tal como acido acetico y agua. Las perlas se recogen, se lavan y se fraccionan de acuerdo con el tamano de partfculas por tamizado mecanico. Opcionalmente, los grupos protectores se pueden retirar en esta etapa.
En una realizacion alternativa de esta invencion, se acoplan restos multifuncionales a los grupos funcionales reactivos del hidrogel reactivo polimerizado para aumentar el numero de grupos funcionales, lo que permite aumentar la carga de farmaco del hidrogel. Dichos restos multifuncionales se pueden proporcionar mediante derivados adecuadamente sustituidos de lisina, dilisina, trilisina, tetralisina, pentalisina, hexalisina, heptalisina, u oligolisina, PEI de bajo peso molecular. Preferiblemente, el resto multifuncional es lisina.
Ademas, dicho hidrogel de acuerdo con la invencion se puede funcionalizar con un espaciador que lleva el mismo grupo funcional, por ejemplo, se pueden introducir grupos amino en el hidrogel por acoplamiento de un espaciador heterobifuncional, tal como COOH-(EG)6-NH-fmoc (EG=etilenglicol), y eliminando el grupo protector fmoc.
Despues de cargar el conjugado de insulina-conector en el hidrogel que contiene grupo maleimido funcionalizado, todos los grupos funcionales que quedan se rematan con un reactivo de bloqueo adecuado, tal como mercaptoetanol, para prevenir reacciones secundarias indeseadas.
En una realizacion preferida de la invencion, un conjugado de insulina-conector que lleva un grupo tiol libre conectado al resto conector, se hace reaccionar con un hidrogel funcionalizado con maleimida a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C, mas preferido a temperatura ambiente, en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5, preferiblemente pH 2,5-4,5, mas preferiblemente pH 3,0-4,0. Posteriormente, el conjugado de insulina-conector- hidrogel resultante correspondiente se trata con mercaptoetanol a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C, mas preferido a temperatura ambiente, en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5, preferiblemente pH 2,5-4,0, mas preferiblemente pH 2,5-3,5.
En otra realizacion preferida de la invencion, un conjugado de insulina-conector que lleva un grupo maleimida conectado al resto conector, se hace reaccionar con un hidrogel funcionalizado con tiol a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C, mas preferido a temperatura ambiente, en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5, preferiblemente pH 2,5-4,5, mas preferiblemente pH 3,0-4,0. Posteriormente, el conjugado de insulina-conector- hidrogel resultante correspondiente se trata con un compuesto de bajo peso molecular que comprende un grupo maleimida, preferiblemente un compuesto que contiene maleimida de 100 a 300 Da, p. ej., N-etil-maleimida, a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C, mas preferido a temperatura ambiente, en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5, preferiblemente pH 2,5-4,0, mas preferiblemente pH 2,5-3,5.
Otro aspecto de la presente invencion es un procedimiento que comprende las etapas de
(a) poner en contacto una suspension acuosa que comprende micropartfculas de hidrogel funcionalizado con maleimida, con una solucion que comprende el reactivo de insulina-conector que lleva grupos tiol tiol a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C, en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5, dando como resultado un conjugado de insulina-conector-hidrogel;
(b) opcionalmente, tratar el conjugado de insulina-conector-hidrogel de la etapa (a) con un compuesto que contiene tiol de 34 Da a 500 Da a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C, en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5.
Otro aspecto de la presente invencion es un procedimiento que comprende las etapas de
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(a) poner en contacto una suspension acuosa que comprende micropardculas de hidrogel funcionalizado con tiol con una solucion que comprende el reactivo de insulina-conector que lleva grupos maleimida a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5, dando como resultado un conjugado de insulina-conector-hidrogel;
(b) opcionalmente, tratar el conjugado de insulina-conector-hidrogel de la etapa (a) con un compuesto que contiene maleimida de 100 a 300 Da a temperaturas entre temperatura ambiente y 4°C en una solucion acuosa tamponada de pH 2-5.
Un metodo particularmente preferido para la preparacion de un profarmaco de insulina de la presente invencion comprende las etapas de
(a) hacer reaccionar un compuesto de formula C(A'-X1)4, en donde A'-X1 representa A antes de su union a Hyp o un precursor de Hyp y X1 es un grupo funcional adecuado, con un compuesto de formula Hyp'-X2, en donde Hyp'-X2 representa Hyp antes de su union a A o un precursor de Hyp y X2 es un grupo funcional adecuado para reaccionar con X1;
(b) opcionalmente, hacer reaccionar el compuesto resultante de la etapa (a) en una o mas etapas adicionales para dar un compuesto de formula C(A-Hyp)4 que tiene al menos cuatro grupos funcionales;
(c) hacer reaccionar los al menos cuatro grupos funcionales del compuesto resultante de la etapa (b) con un reactivo reticulador basado en polietilenglicol, en donde los grupos reactivos del reactivo reticulador se usan en una cantidad subestequiometrica comparado con el numero total de grupos funcionales reactivos de C(A-Hyp)4 para dar un hidrogel;
(d) hacer reaccionar los grupos funcionales que no han reaccionado que quedan (que representan los grupos funcionales reactivos de la cadena principal comprendidos en el hidrogel de la presente invencion) en la cadena principal de hidrogel de la etapa (c) con un conjugado covalente de insulina y conector del profarmaco transitorio, o primero hacer reaccionar los grupos funcionales que no han reaccionado con el conector del profarmaco transitorio y posteriormente con insulina;
(e) opcionalmente rematar los grupos funcionales que no han reaccionado que quedan para dar un profarmaco de la presente invencion.
Espedficamente, los hidrogeles para el profarmaco de insulina de la presente invencion se sintetizan como sigue:
Para la polimerizacion en masa, se mezclan el reactivo de la cadena principal y el reactivo reticulador en una relacion de amina/ester activo de 2:1 a 1,05:1.
Tanto el reactivo de la cadena principal como el reactivo reticulador se disuelven en DMSO para dar una solucion con una concentracion de 5 a 50 g por 100 ml, preferiblemente de 7,5 a 20 g por 100 ml y lo mas preferiblemente de 10 a 20 g por 100 ml.
Para realizar la polimerizacion, se anaden N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA) de 2 a 10% (en vol) a la solucion de DMSO que contiene el reactivo reticulador y el reactivo de la cadena principal, y la mezcla se agita durante 1 a 20 segundos y se deja reposar. La mezcla solidifica en menos de 1 min.
Dicho hidrogel de acuerdo con la invencion preferiblemente se muele por procedimientos mecanicos tales como agitacion, trituracion, cortado prensado o molienda y opcionalmente tamizado. Para la polimerizacion en emulsion, la mezcla de reaccion esta compuesta de la fase dispersa y la fase continua.
Para la fase dispersa, el reactivo de la cadena principal y el reactivo reticulador se mezclan en una relacion de amina/ester activo de 2:1 a 1,05:1 y se disuelven en DMSO para dar una solucion con una concentracion de 5 a 50 g por 100 ml, preferiblemente de 7,5 a 20 g por 100 ml y lo mas preferiblemente de 10 a 20 g por 100 ml.
La fase continua es cualquier disolvente, que no sea miscible con el DMSO, no basico, aprotico y que muestre una viscosidad inferior a 10 Pa.s, el disolvente no es miscible con el DMSO, no basico, aprotico y muestra una viscosidad inferior a 2 Pa.s y no es toxico. Mas preferiblemente, el disolvente es un hidrocarburo lineal o ramificado saturado con 5 a 10 atomos de carbono. Lo mas preferiblemente, el disolvente es n-heptano.
Para formar una emulsion de la fase dispersa en la fase continua, se anade un emulsionante a la fase continua antes de anadir la fase dispersa. La cantidad de emulsionante es de 2 a 50 mg por ml de fase dispersa, mas preferiblemente de 5 a 20 mg por ml de fase dispersa, lo mas preferiblemente 10 mg por ml de fase dispersa.
El emulsionante tiene un valor de HLB de 3 a 8. Preferiblemente, el emulsionante es un triester de sorbitol y un acido graso o un conjugado de poli(hidroxil-acido graso)-poli(etilenglicol). Mas preferiblemente, el emulsionante es un conjugado de poli(hidroxi-acido graso)-polietilenglicol, con un polietilenglicol lineal de un peso molecular en el intervalo de 0,5 kDa a 5 kDa y unidades de poli(hidroxi-acido graso) de peso molecular en el intervalo de 0,5 kDa a 3 kDa en cada extremo de la cadena. Lo mas preferiblemente, el emulsionante es polietilenglicol-dipolihidroxi-
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estearato, Cithrol DPHS (Cithrol DPHS, antes Arlacel P135, Croda International Pic).
Se generan pequenas gotas de la fase dispersa por agitacion con un impulsor de flujo axial con una geometna similar a los agitadores tales como Isojet, Intermig, Propeller (EKATO Ruhr- und Mischtechnik GmbH, Alemania), lo mas preferiblemente similar a Isojet con un diametro de 50 a 90% el diametro del reactor. Preferiblemente, la agitacion se inicia antes de la adicion de la fase dispersa. La velocidad del agitador se ajusta de 0,6 a 1,7 m/s. La fase dispersa se anade a temperatura ambiente y la concentracion de la fase dispersa es de 2% a 70%, preferiblemente de 5 a 50%, mas preferiblemente de 10 a 40%, y lo mas preferiblemente de 20 a 35% del volumen total de reactivo. La mezcla de la fase dispersa, emulsionante y fase continua se agita durante 5 a 60 min antes de anadir la base para realizar la polimerizacion.
Se anaden de 5 a 10 equivalentes (respecto a cada enlace amida que se va a formar) de una base a la mezcla de fase dispersa y continua. La base es aprotica, no nucleofila y soluble en la fase dispersa. Preferiblemente, la base es aprotica, no nucleofila, bien soluble tanto en la fase dispersa como en DMSO. Mas preferiblemente la base es aprotica, no nucleofila, bien soluble tanto en la fase dispersa como en DMSO, una base amina no toxica. Los mas preferiblemente, la base es N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA). La agitacion en presencia de base se continua durante 1 a 16 h.
Durante la agitacion, pequenas gotas de fase dispersa se endurecen para convertirse en perlas de hidrogel reticulado de acuerdo con la invencion, que se pueden recoger y se lleva a cabo el fraccionamiento de acuerdo con el tamano en una maquina de tamizado continuo vibratoria con una plataforma de 75 pm y una de 32 pm para dar micropartroulas de hidrogel de acuerdo con la invencion.
El hidrogel para el profarmaco de insulina de la presente invencion se puede obtener por el metodo de preparacion en forma de micropartroulas. En una realizacion preferida de la invencion, el hidrogel reactivo es un artroulo conformado tal como una malla o una endoprotesis. Lo mas preferiblemente, el hidrogel se forma en perlas de micropartroulas que se pueden administrar como inyeccion subcutanea o intramuscular mediante una jeringa estandar. Dichas perlas blandas pueden tener un diametro entre 1 y 500 micrometres.
Preferiblemente, las micropartroulas tienen un diametro entre 10 y 100 micrometros si estan suspendidas en un tampon de formulacion acuosa isotonica, lo mas preferiblemente un diametro de entre 20 y 100 micrometros, lo mas preferiblemente un diametro de entre 25 y 80 micrometros.
Preferiblemente, las micropartroulas se pueden administrar por inyeccion a traves de una aguja menor de 0,6 mm de diametro interno, preferiblemente a traves de una aguja menor de 0,3 mm de diametro interno, mas preferiblemente a traves de una aguja menor de 0,225 mm de diametro interno, incluso mas preferiblemente a traves de una aguja menor de 0,175 mm de diametro interno, y lo mas preferiblemente a traves de una aguja menor de 0,16 mm de diametro interno.
Se entiende que las expresiones “se puede administrar por inyeccion”, “inyectable” o “inyectabilidad” se refieren a una combinacion de factores tales como una determinada fuerza aplicada a un embolo de una jeringa que contiene el hidrogel biodegradable de acuerdo con la invencion hinchado en un lfquido a una determinada concentracion (p/v) y a una determinada temperatura, una aguja de un diametro interno dado conectada a la salida de dicha jeringa y el tiempo requerido para extruir un determinado volumen del hidrogel biodegradable de acuerdo con la invencion de la jeringa a traves de la aguja.
Con el fin de proporcionar inyectabilidad, se puede extruir un volumen de 1 ml de profarmacos de insulina de acuerdo con la invencion hinchado en agua a una concentracion de al menos 5% (p/v) y contenido en una jeringa que tiene un embolo de 4,7 mm de diametro, a temperatura ambiente en el espacio de 10 segundos aplicando una fuerza menor de 50 Newton.
Preferiblemente, la inyectabilidad se logra para un profarmaco de insulina de acuerdo con la invencion hinchado en agua a una concentracion de aproximadamente 10% (p/v).
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza por ser una composicion lfquida que tras inyeccion forma un deposito.
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza por ser administrada por inyeccion, tal como subcutanea o intramuscular.
En una realizacion adicional, la composicion es para usar en el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en el que es beneficioso el tratamiento o prevencion con un compuesto de insulina, tal como hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, srndrome X. Tfpicamente, dicha enfermedad o trastorno es la diabetes tipo II.
En una realizacion adicional, el compuesto de insulina se selecciona de insulina humana o no humana o analogos y derivados de insulina o conjugados de los mismos. Es mas preferida la insulina humana y analogos de insulina, tales como por ejemplo, insulina glargina, insulina detemir, insulina lispro, insulina aspart, insulina glulisina. Cuando se
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administra el compuesto de insulina, se alcanza una concentracion pico maxima tipicamente en las primeras 48 horas. En una realizacion adicional, la concentracion maxima se alcanza en las primeras 24 horas de la administracion, tal como en las primeras 12 horas de la administracion, p. ej., en las primeras 6 horas de la administracion.
En un aspecto adicional, la composicion farmaceutica de la presente invencion comprende ademas un compuesto de GLP-1, tipicamente un agonista de GLP-1.
Dichos compuesto de GLP-1 tfpicamente se selecciona de uno cualquiera de [Seq ID No: 1] Exendina-4
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2 [Seq ID No: 2] Exendina-3
HSDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2 [Seq ID No: 3]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG P [Seq ID No: 4]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG Y [Seq ID No: 5]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG [Seq ID No: 6]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG-NH2 [Seq ID No: 7]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKN-NH2 [Seq ID No: 8]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEFLKNGG PSSGAPPPS-NH2 [Seq ID No: 9]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEFLKN-NH2 [Seq ID No: 10]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LAIEFLKN-NH2 [Seq ID No: 11]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2 [Seq ID No: 12]
HGDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2 [Seq ID No: 13] GLP-1 (7-36) amida HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2 [Seq ID No: 14]
HSEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2 [Seq ID No: 15] GLP-1 (7-37)
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGRG [Seq ID No: 16]
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HAXaaGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2 En donde Xaa se selecciona de P, F, Y.
[Seq ID No: 17]
HXaaEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
En donde Xaa se selecciona de T, acido a-aminobutrnco, D-Ala, V, Gly.
[Seq ID No: 18]
HaEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGG [Seq ID No: 19]
R-HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
En donde R se selecciona de acetilo, piroglutamilo, N-2-hidroxibenzoilo, N-trans-3-hexenoilo.
[Seq ID No 20]
HXaaAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2 En donde Xaa es 6-amino-hexanoilo.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de insulina para preparar una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de insulina en una concentracion que es suficiente para mantener un nivel terapeuticamente eficaz del compuesto de insulina en el plasma sangumeo durante al menos 3 dfas, tfpicamente al menos 80 horas, p. ej., una semana o mas, caracterizada por tener un perfil farmacocinetico in vivo sin sustancialmente aumento brusco del compuesto de insulina, para el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en el que es beneficioso el tratamiento o prevencion con un compuesto de insulina.
Dicha concentracion variara de un sujeto a otro y depende de la ventana terapeutica en un sujeto individual, pero con el fin de que este presente un efecto terapeutico durante al menos 3 dfas, p. ej., una semana (es decir, aproximadamente 7 dfas) la concentracion tfpicamente es al menos aproximadamente l0 mg/ml, p. ej., mas de 10 mg/ml.
En los siguientes parrafos se da una composicion preferida de un profarmaco de insulina-hidrogel.
La composicion del profarmaco de insulina-hidrogel se puede proporcionar como una composicion en suspension o como una composicion seca. Preferiblemente, la composicion farmaceutica del profarmaco de insulina-hidrogel es una composicion seca. Los metodos adecuados de secado son, por ejemplo, secado por atomizacion y liofilizacion (congelacion-secado). Preferiblemente, la composicion farmaceutica del profarmaco de insulina-hidrogel se seca por liofilizacion.
Preferiblemente, el profarmaco de insulina-hidrogel tiene una dosificacion en la composicion suficiente para proporcionar la cantidad terapeuticamente eficaz de insulina durante al menos tres dfas en una aplicacion. Mas preferiblemente, una aplicacion del profarmaco de insulina-hidrogel es suficiente para una semana.
La composicion farmaceutica del profarmaco de insulina-hidrogel de acuerdo con la presente invencion contiene uno o mas excipientes.
Los excipientes usados en las composiciones parenterales se pueden clasificar como agentes de tamponamiento, modificadores de la isotonicidad, conservantes, estabilizantes, agentes antiadsorcion, agentes de proteccion frente a la oxidacion, viscosificadores/agentes de potenciacion de la viscosidad, u otros agentes auxiliares. En algunos casos, estos ingredientes pueden tener funcion doble o triple. Las composiciones del profarmaco de insulina-hidrogel de acuerdo con la presente invencion contienen uno o mas de un excipiente, seleccionado del grupo que consiste en:
(i) Agentes de tamponamiento: tampones fisiologicamente tolerados para mantener el pH en un intervalo deseado, tales como fosfato sodico, bicarbonato, succinato, histidina, citrato y acetato, sulfato, nitrato, cloruro, piruvato. Tambien se pueden usar antiacidos tales como Mg(OH)2 o ZnCO3. La capacidad de tamponamiento se puede ajustar para que se corresponda con las condiciones mas sensibles a la estabilidad del pH.
(ii) Modificadores de la isotonicidad: para minimizar el dolor que puede producirse por el dano a la celula debido a diferentes de presion osmotica en el deposito de inyeccion. Son ejemplos la glicerina y el cloruro sodico. Las concentraciones eficaces se pueden determinar por osmometna usando una osmolalidad supuesta para el suero de 285-315 mOsmol/kg.
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(iii) Conservantes y/o antimicrobianos: las preparaciones parenterales de multiples dosis requieren la adicion de conservantes en una concentracion suficiente para minimizar el riesgo de que los pacientes se infecten tras la inyeccion y se han establecido los correspondientes requisitos reguladores. Los conservantes tipicos incluyen m- cresol, fenol, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, clorobutanol, alcohol bendlico, nitrato fenilmercurico, timerosol, acido sorbico, sorbato potasico, acido benzoico, clorocresol, y cloruro de benzalconio.
(iv) Estabilizantes: La estabilizacion se logra fortaleciendo las fuerzas estabilizadores de la protema, por desestabilizacion del estado desnaturalizado o por union directa de excipientes a la protema. Los estabilizantes pueden ser aminoacidos tales como alanina, arginina, acido aspartico, glicina, histidina, lisina, prolina, azucares tales como glucosa, sacarosa, trehalosa, polioles tales como glicerol, manitol, sorbitol, sales tales como fosfato potasico, sulfato sodico, agentes quelantes tales como EDTA, hexafosfato, ligandos tales como iones de metales divalentes (zinc, calcio, etc.), otras sales o moleculas organicas tales como derivados fenolicos. Ademas, se pueden usar oligomeros o polfmeros tales como ciclodextrinas, dextrano, dendnmeros, PEG o PVP o protamina o HSA.
(v) Agentes antiadsorcion: Se usan principalmente tensioactivos ionico o no ionicos u otras protemas o polfmeros solubles para recubrir o adsorber de forma competitiva la superficie interior de la composicion o del recipiente de la composicion. P. ej., poloxamero (Pluronic F-68), eter de dodecilo y PEG (Brij 35), polisorbato 20 y 80, dextrano, polietilenglicol, PEG-polihistidina, BSA y HSA y gelatinas. La concentracion y tipo de excipiente elegido depende del efecto que se quiere evitar, pero tfpicamente se forma una monocapa de tensioactivo en la interfase justo por encima del valor de CMC.
(vi) Lio y/o crioprotectores: Durante la liofilizacion o secado por atomizacion, los excipientes pueden contrarrestar los efectos desestabilizantes causados por la rotura de enlaces de hidrogeno y la eliminacion de agua. Para este fin se pueden usar azucares y polioles, pero tambien se han observado los correspondientes efectos positivos para tensioactivos, aminoacidos, disolventes no acuosos y otros peptidos. La trehalosa es particularmente eficaz para reducir la agregacion inducida por la humedad y tambien mejora la estabilidad termica potencialmente causada por exposicion de los grupos hidrofobos de la protema al agua. Tambien se pueden usar manitol y sacarosa, sea como lio/crioprotector solo o en combinacion entre ellos, donde se sabe que las proporciones mas altas de manitol:sacarosa potencian la estabilidad ffsica de una torta liofilizada. El manitol tambien se puede combinar con trehalosa. La trehalosa tambien se puede combinar con sorbitol o se puede usar el sorbitol como el unico protector. Tambien se puede usar almidon y derivados de almidon.
(vii) Agentes de proteccion frente a la oxidacion: antioxidantes tales como acido ascorbico, ectoma, metionina, glutation, monotioglicerol, morina, polietilenimina (PEI), galato de propilo, vitamina E, agentes quelantes tales como acido dtrico, EDTA, hexafosfato, acido tioglicolico.
(viii) Viscosificadores o potenciadores de la viscosidad: retardan el asentamiento de las partmulas en el vial y la jeringa y se usan con el fin de facilitar la mezcla y resuspension de las partmulas y para hacer que la suspension sea mas facil de inyectar (es decir, fuerza baja en el embolo de la jeringa). Los viscosificadores o potenciadores de la viscosidad adecuados son, por ejemplo, viscosificadores de carbomero como Carbopol 940, Carbopol Ultrez 10, derivados de celulosa como hidroxipropilmetilcelulosa (hipromelosa, HPMC) o dietilaminoetilcelulosa (DEAE o DEAE-C), silicato de magnesio coloidal (Veegum) o silicato sodico, gel de hidroxiapatito, gel de fosfato tricalico, xantanos, carragenanos como goma Satia UTC 30, poli(hidroxi-acidos) alifaticos, tales como poli(acido D,L- o L- lactico) (PLA) y poli(acido glicolico) (PGA) y sus copolfmeros (PLGA), terpolfmeros de D,L-lactida, glicolido y caprolactona, poloxameros, bloques de poli(oxietileno) hidrofilos y bloques de poli(oxipropileno) hidrofobos para componer un trilbloque de poli(oxietilenoe)-poli(oxipropileno)-poli(oxietileno) (p. ej. Pluronic®), copolfmero de poli- eter-ester, tal como copolfmero de poli(tereftalato de etilenglicol)/poli(tereftalato de butileno), acetato isobutirato de sacarosa (SAIB), dextrano o derivados del mismo, combinaciones de dextranos y PEG, polidimetilsiloxano, colageno, chitosan, poli(alcohol vimlico) (PVA) y derivados, polialqulimidas, poli(acrilamida-co-dialildimetilamonio (DADMA)), polivinilpirrolidona (PVP), glucosaminoglucanos (GAGs) tales como sulfato de dermatan, sulfato de condroitina, sulfato de keratan, heparina, sulfato de heparan, hialuronano, copolfmeros tribloque ABA o bloques AB compuestos de bloques A hidrofobos, tales como polilactida (PLA) o poli(lactida-co-glicolido) (PLGA), y bloques B hidrofilos, tales como polietilenglicol (PEG) o polivinilpirrolidona. Dichos copolfmeros de bloques, asf como los poloxameros mencionados antes pueden presentar un comportamiento de gelacion termico inverso (estado fluido a temperatura ambiente para facilitar la administracion y estado de gel por encima de la temperatura de transicion de sol-gel a la temperatura corporal despues de inyeccion).
(ix) Agente de expansion o difusion: modificadores de la permeabilidad del tejido conjuntivo por la hidrolisis de los componentes de la matriz extracelular en el espacio intersticial, tales como, pero no limitado a acido hialuronico, un polisacarido encontrado en el espacio intercelular del tejido conjuntivo. Un agente de expansion tal como, pero no limitado a hialuronidasa disminuye temporalmente la viscosidad de la matriz extracelular y promueve la difusion de los farmacos inyectados.
(x) Otros agentes auxiliares: tales como agentes humectantes, modificadores de la viscosidad, antibioticos, hialuronidasa. Los acidos y bases tales como acido clorhfdrico e hidroxido sodico son agentes auxiliares necesarios para ajustar el pH durante la fabricacion.
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Preferiblemente, la composicion de profarmaco de insulina-hidrogel contiene uno o mas de un viscosificador y/o agente de modificacion de la viscosidad.
El termino “excipiente” preferiblemente se refiere a un diluyente, adyuvante o vetuculo con el que se administra el agente terapeutico. Dicho excipiente farmaceutico puede ser Kquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los procedentes del petroleo, animales, vegetales o sinteticos, incluyendo pero no limitado a aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. El agua es un excipiente preferido cuando la composicion farmaceutica se administra por via oral. La solucion salina y dextrosa acuosa son los excipientes preferidos cuando la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se usan preferiblemente como excipientes lfquidos para soluciones inyectables. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sflice, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden tener forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La composicion se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y excipientes tradicionales, como trigliceridos. La formulacion oral puede incluir excipientes convencionales tales como manitol, lactosa, almidon, estearato magnesico, sacarina sodica, celulosa, carbonato magnesico, etc. de calidades farmaceuticas. Los ejemplos de excipientes farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Dichas composiciones contendran una cantidad terapeuticamente eficaz del agente terapeutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de excipiente, para asf proporcionar la forma de administracion adecuada para el paciente. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion.
En una realizacion general, una composicion farmaceutica de la presente invencion sea en forma seca o como una suspension o en otra forma, se puede proporcionar como una composicion de dosis unica o de multiples dosis.
En una realizacion de la presente invencion, la composicion seca del profarmaco de insulina-hidrogel se proporciona como una sola dosis, lo que significa que el recipiente en el que se suministra contiene una dosis farmaceutica.
Por lo tanto, en otro aspecto de la presente invencion, la composicion se proporciona como una composicion de dosis unica.
Preferiblemente, la composicion en suspension es una composicion de multiples dosis, lo que significa que contiene mas de una dosis terapeutica. Preferiblemente, una composicion de multiples dosis contiene al menos 2 dosis. Dicha composicion de multiples dosis de insulina-hidrogel la pueden usar diferentes pacientes que lo necesiten o esta dirigida para usar en un solo paciente, en donde las dosis restantes se almacenan despues de la aplicacion de la primera dosis, hasta que sea necesario.
En otro aspecto de la presente invencion, la composicion esta comprendida en un recipiente. Preferiblemente, el recipiente es una jeringa de doble camara. En especial, la composicion seca de acuerdo con la presente invencion se proporciona en una primera camara de la jeringa de doble camara y se proporciona solucion de reconstitucion en una segunda camara de la jeringa de doble camara.
Antes de aplicar la composicion seca de profarmaco de insulina-hidrogel a un paciente que lo necesite, la composicion seca se reconstituye. La reconstitucion puede tener lugar en el recipiente en el que se proporciona la composicion seca de profarmaco de insulina-hidrogel, tal como en un vial, jeringa, jeringa de doble camara, ampolla y cartucho. La reconstitucion se hace por adicion de una cantidad predefinida de solucion de reconstitucion a la composicion seca. Las soluciones de reconstitucion son lfquidos esteriles, tales como agua o tampon, que pueden contener aditivos adicionales, tales como conservantes y/o antimicrobianos. Si la composicion de profarmaco de insulina-hidrogel se proporciona como una sola dosis, la solucion de reconstitucion puede contener uno o mas conservantes y/o antimicrobianos. Preferiblemente, la solucion de reconstitucion es agua esteril. Si la composicion de profarmaco de insulina-hidrogel es una composicion de multiples dosis, se prefiere que la solucion de reconstitucion contenga uno o mas conservantes y/o antimicrobianos tales como, por ejemplo, alcohol bendlico y cresol.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere al metodo de administracion de una composicion de profarmaco de insulina-hidrogel reconstituida. La composicion de profarmaco de insulina-hidrogel se puede administrar por metodos de inyeccion o infusion, que incluyen transdermica, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraosea e intraperitoneal.
Un aspecto adicional es un metodo de preparacion de una composicion reconstituida que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un profarmaco de insulina-hidrogel, y opcionalmente uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables, en donde la insulina esta transitoriamente unida a un hidrogel, comprendiendo el metodo las etapas de
- poner en contacto la composicion de la presente invencion con una solucion de reconstitucion.
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Otro aspecto es una composicion reconstituida que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un profarmaco de insulina-hidrogel, y opcionalmente uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables, en donde la insulina esta transitoriamente unida a un hidrogel que se puede obtener por el metodo anterior.
Otro aspecto de la presente invencion, es el metodo de fabricacion de una composicion seca de profarmaco de insulina-hidrogel. En una realizacion, dicha composicion en suspension se hace por
(i) mezcla del profarmaco de insulina-hidrogel con uno o mas excipientes,
(ii) transferencia de cantidades equivalentes a dosis individuales o dosis multiples a un recipiente adecuado,
(iii) secado de la composicion en dicho recipiente, y
(iv) sellado del recipiente.
Los recipientes adecuados son viales, jeringas, jeringas de doble camara, ampollas y cartuchos.
Otro aspecto es un kit de piezas. Cuando el dispositivo de administracion es simplemente una jeringa hipodermica, entonces el kit puede comprender la jeringa, una aguja y un recipiente que comprende la composicion de profarmaco de insulina-hidrogel para usar con la jeringa y un segundo recipiente que comprende la solucion de reconstitucion. En realizaciones mas preferidas, el dispositivo de inyeccion es distinto de una simple jeringa hipodermica y por lo tanto el recipiente separado con el profarmaco de insulina-hidrogel reconstituido se adapta para encajar con el dispositivo de inyeccion, de modo que cuando se usa, la composicion lfquida en el recipiente esta en conexion fluida con la salida del dispositivo de inyeccion. Los ejemplos de dispositivos de administracion incluyen, pero no se limitan a jeringas hipodermicas y dispositivos inyectores tipo bolfgrafo. Los dispositivos de inyeccion particularmente preferidos son inyectores de tipo bolfgrafo, en cuyo caso el recipiente es un cartucho, preferiblemente un cartucho desechable.
Un kit de piezas preferido comprende una aguja y un recipiente que contiene la composicion de acuerdo con la presente invencion y opcionalmente contiene una solucion de reconstitucion, estando el recipiente adaptado para usar con la aguja. Preferiblemente, el recipiente es una jeringa de doble camara.
En otro aspecto, la invencion proporciona un cartucho que contiene una composicion de profarmaco de insulina- hidrogel como se ha descrito en lo que antecede, para usar con un dispositivo inyector de bolfgrafo. El cartucho puede contener una sola dosis o una multiplicidad de dosis de insulina.
En una realizacion de la presente invencion, la composicion en suspension del profarmaco de insulina-hidrogel no comprende solo un profarmaco de insulina-hidrogel y uno o mas excipientes, sino tambien otros agentes biologicamente activos, sea en forma libre o como profarmacos. Preferiblemente, dichos uno o mas agentes biologicamente activos adicionales es un profarmaco, mas preferiblemente un profarmaco de hidrogel. Dichos agentes biologicamente activos incluyen, pero no se limitan a compuestos de las siguientes clases:
(i) Sulfonilureas, tales como, por ejemplo, clorpropamida, tolazamida, tolbutamida, gliburida, glipizida, glimepirida, y similares,
(ii) Meglitinidas, tales como, por ejemplo, repaglinida,
(iii) Peptido similar al glucagon tipo 1 (GLP-1) y sus mimeticos, peptido insulinotropico dependiente de glucosa (GIP) y sus mimeticos, Exendina y sus mimeticos, inhibidores de dipeptidilo proteasa (DPPIV),
(iv) Biguanidas, tales como, por ejemplo, metformina,
(v) Tiazolidinadionas, tales como, por ejemplo, rosiglitazona, pioglitazona, troglitazona, isaglitazona (conocida como MCC-555), acido 2-[2-[(2R)-4-hexil-3,4-dihidro-3-oxo-2H-1,4-benzoxazin-2-il]etoxi]-benceno-acetico, y similares
(vi) GW2570, y similares,
(vii) moduladores de receptor retinoide-X (RXR), tales como, por ejemplo, targretina, acido 9-cis-retinoico, y similares,
(viii) Otros agentes sensibilizadores de insulina, tales como, por ejemplo, INS-1, inhibidores de PTP-1B, inhibidores de GSK3, inhibidores de glucogeno fosforilasa a, inhibidores de fructosa-1,6-bisfosfatasa, y similares,
(ix) Insulinas, incluyendo insulinas normales o de accion corta, accion intermedia y accion prolongada, insulina inhalada y analogos de insulina, tales como moleculas de insulina con diferencias menores en la secuencia de aminoacidos natural,
(x) Moleculas pequenas mimeticos de insulina, que incluyen, pero no se limitan a L-783281, TE-17411, y similares,
(xi) inhibidores del cotransportador de Na-glucosa, tales como T-1095, T-1095A, florizina, y similares,
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(xii) Agonistas de amilina que incluyen, pero no se limitan a pramlintida, y similares,
(xiii) Antagonistas de glucagon tales como AY-279955, y similares.
Ademas de agentes antidiabeticos, los compuestos bioactivos pueden ser agentes antiobesidad como orlistat, un inhibidor de lipasa pancreatica, que previene la rotura y absorcion de grasa; o sibutramina, un supresor del apetito e inhibidor de la recaptacion de serotonina, norepinefrina y dopamina en el cerebro, factores de crecimiento que aumentan la movilizacion de grasa (p. ej., hormona del crecimiento, IGF-1, factor de liberacion de la hormona del crecimiento), oxintomodulina y moduladores de grelina. Otros potenciales agentes antiobesidad bioactivos incluyen, pero no se limitan a supresores del apetito que actuan por mecanismos adrenergicos tales como benzfetamina, fenmetrazina, fentermina, dietilpropion, mazindol, sibutramina, fenilpropanolamina o, efedrina; agentes supresores del apetito que actuan por mecanismos serotonergicos tales como quipazina, fluoxetina, sertralina, fenfluramina, o dexfenfluramina; agentes supresores del apetito que actuan por mecanismos de la dopamina, p. ej., apomorfina; agentes supresores del apetito que actuan por mecanismos histaminergicos (p. ej., mimeticos de histamina, moduladores de receptor H3); potenciadores del gasto de energfa tales como agonistas beta-3 adrenergicos y estimuladores de la funcion de protemas desacoplantes; leptina y mimeticos de leptina (p. ej., metreleptina); antagonistas del neuropeptido Y; moduladores del receptor de melanocortina-1, 3 y 4; agonistas de colecistoquinina; mimeticos y analogos del peptido similar al glucagon de tipo 1 (GLP-1) (p. ej., Exendina); androgenos (p. ej., deshidroepiandrosterona y derivados tales como etiocolandiona), testosterona, esteroides anabolicos (p. ej., oxandrolona), y hormonas esteroideas; antagonistas del receptor de galanina; agentes de citoquinas tales como factor neurotrofico ciliar; inhibidores de amilasa; agonistas/mimeticos de enterostatina; antagonistas de orexina/hipocretina; antagonistas de urocortina; agonistas de bombesina; moduladores de protema quinasa A; mimeticos del factor de liberacion de corticotropina; mimeticos de transcrito regulado por cocama y anfetamina; mimeticos de peptido relacionado con el gen de la calcitonina; e inhibidores de la acido graso sintasa.
En una realizacion alternativa, la composicion de profarmaco de insulina-hidrogel de acuerdo con la presente invencion, se combina con un segundo compuesto biologicamente activo de modo que el profarmaco de insulina- hidrogel se administra primero a un paciente que lo necesita, seguido de la administracion de un segundo compuesto. Alternativamente, la composicion de insulina-hidrogel se administra a un paciente que lo necesita despues de que se ha administrado otro compuesto al mismo paciente.
Ademas de agentes antidiabeticos, los compuestos bioactivos pueden ser agentes antiobesidad tales como orlistat, un inhibidor de lipasa pancreatica, que previene la rotura y absorcion de grasa; o sibutramina, un supresor del apetito e inhibidor de la recaptacion de serotonina, norepinefrina y dopamina en el cerebro, factores de crecimiento que aumentan la movilizacion de grasa (p. ej., hormona del crecimiento, IGF-1, factor de liberacion de la hormona del crecimiento), oxintomodulina y moduladores de grelina. Otros potenciales agentes antiobesidad bioactivos incluyen, pero no se limitan a supresores del apetito que actuan por mecanismos adrenergicos tales como benzfetamina, fenmetrazina, fentermina, dietilpropion, mazindol, sibutramina, fenilpropanolamina o, efedrina; agentes supresores del apetito que actuan por mecanismos serotonergicos tales como quipazina, fluoxetina, sertralina, fenfluramina, o dexfenfluramina; agentes supresores del apetito que actuan por mecanismos de la dopamina, p. ej., apomorfina; agentes supresores del apetito que actuan por mecanismos histaminergicos (p. ej., mimeticos de histamina, moduladores de receptor H3); potenciadores del gasto de energfa tales como agonistas beta-3 adrenergicos y estimuladores de la funcion de protemas desacoplantes; leptina y mimeticos de leptina (p. ej., metreleptina); antagonistas del neuropeptido Y; moduladores del receptor de melanocortina-1, 3 y 4; agonistas de colecistoquinina; mimeticos y analogos del peptido similar al glucagon de tipo 1 (GLP-1) (p. ej., Exendina); androgenos (p. ej., deshidroepiandrosterona y derivados tales como etiocolandiona), testosterona, esteroides anabolicos (p. ej., oxandrolona), y hormonas esteroideas; antagonistas del receptor de galanina; agentes de citoquinas tales como factor neurotrofico ciliar; inhibidores de amilasa; agonistas/mimeticos de enterostatina; antagonistas de orexina/hipocretina; antagonistas de urocortina; agonistas de bombesina; moduladores de protema quinasa A; mimeticos del factor de liberacion de corticotropina; mimeticos de transcrito regulado por cocama y anfetamina; mimeticos de peptido relacionado con el gen de la calcitonina; e inhibidores de la acido graso sintasa.
En una realizacion alternativa, la composicion de profarmaco de insulina-hidrogel de acuerdo con la presente invencion, se combina con un segundo compuesto biologicamente activo de modo que el profarmaco de insulina- hidrogel se administra primero a un paciente que lo necesita, seguido de la administracion de un segundo compuesto. Alternativamente, la composicion de insulina-hidrogel se administra a un paciente que lo necesita despues de que se ha administrado otro compuesto al mismo paciente.
Los pacientes que necesitan tratamiento con composiciones de insulina de accion prolongada descritas en la presente invencion tienen un riesgo alto de desarrollar comorbilidades. Por consiguiente, se puede usar la combinacion de la insulina de accion prolongada de la presente con compuestos bioactivos adecuados, p. ej., para prevenir, retrasa el avance o el tratamiento de enfermedades y trastornos seleccionados del grupo que consiste en hipertension (que incluye pero no se limita a hipertension sistolica aislada e hipertension dislipidemica familiar), insuficiencia cardfaca congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad arterial periferica, retinopatfa diabetica, degeneracion macular, cataratas, nefropatfa diabetica, glomerulosclerosis, insuficiencia renal cronica, neuropatfa diabetica, smdrome X, smdrome premenstrual, cardiopatfa coronaria, angina de pecho, trombosis, aterosclerosis, Infarto de miocardio, ataques isquemicos transitorios, accidente cerebrovascular, reestenosis
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vascular, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, resistencia a la insulina, alteracion del metabolismo de la glucosa, afecciones de alteracion de la glucosa en ayunas, obesidad, disfuncion erectil, trastornos de la piel y del tejido conectivo, ulceraciones del pie y colitis ulcerosa, disfuncion endotelial y distensibilidad vascular deteriorada.
La prevencion, retraso del avance o tratamiento de enfermedades y trastornos seleccionados del grupo anterior, se puede lograr por la combinacion de la composicion de insulina de accion prolongada de la presente invencion con al menos un compuesto bioactivo seleccionado de las clases de farmacos usadas para tratar dichas afecciones, que incluyen antagonistas del receptor AT1; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE); inhibidores de renina; bloqueadores del receptor beta adrenergico; bloqueadores del receptor alfa adrenergico; bloqueadores de canales de calcio; inhibidores de la aldosterona sintasa; antagonistas del receptor de aldosterona; inhibidores de la endopeptidasa neutral (NEP); inhibidores dobles de la enzima convertidora de angiotensina/endopeptidasa neutral (ACE/NEP); un antagonista del receptor de endotelina; diureticos; estatinas; nitratos; agentes antiocoagulantes; peptidos natriureticos; compuestos digitalicos; moduladores de PPAR.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de insulina para preparar una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de insulina en una concentracion de al menos 10 mg/ml, caracterizada porque tiene un perfil farmacocinetico sin sustancialmente aumento brusco del compuesto de insulina, para el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en cuyo tratamiento o prevencion es beneficioso un compuesto de insulina.
En una realizacion de la presente invencion, la concentracion del compuesto de insulina es al menos 11 mg/ml, tal como de 11 mg/ml a 35 mg/ml, mas preferido de 15 mg/ml a 25 mg/ml, incluso mas preferido aproximadamente 20 mg/ml, e incluso mas preferido aproximadamente 24 mg/ml.
El volumen que se va a administrar, tal como mediante una jeringa, a un sujeto, tal como un ser humano, preferiblemente es menor de 1,5 ml, tipicamente 1,0 ml o menos.
En una realizacion adicional, la enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en cuyo tratamiento o prevencion es beneficioso un compuesto de insulina, se selecciona de hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X. Tfpicamente, dicha enfermedad o trastorno es la diabetes tipo II.
Una realizacion adicional mas se refiere al tratamiento o prevencion de la hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X, en un sujeto mairnfero, tal como un sujeto humano.
En una realizacion adicional, al sujeto humano se le ha diagnosticado prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, obesidad, hipertension, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X.
En una realizacion adicional mas, el perfil farmacocinetico se mide en el plasma sangumeo de mamffero tal como plasma sangumeo humano.
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza por presentar una relacion de pico a valle menor que 2, tal como menor que 1,75, menor que 1,5, o menor que 1,25.
En una realizacion adicional mas, la composicion se caracteriza por una liberacion continua de un compuesto de insulina estructuralmente intacta a lo largo del periodo de tiempo completo entre administraciones.
En una realizacion adicional el periodo de tiempo completo entre administraciones es al menos aproximadamente 80 horas, tal como aproximadamente 110 horas, tfpicamente una semana.
En una realizacion adicional mas el compuesto de insulina es un profarmaco. Dicho profarmaco se puede seleccionar tfpicamente de los descritos antes representados por la formula D-L.
En una realizacion adicional el compuesto de insulina esta totalmente contenido en un deposito, tfpicamente un gel polimerico, tal como un hidrogel, p. ej., una matriz de polfmero bien hidratada. Tfpicamente una matriz de polfmero bien hidratada minimiza el contacto intermolecular de moleculas de insulina.
En una realizacion adicional mas el compuesto de insulina esta covalentemente unido en el deposito, tfpicamente el gel polimerico, tal como el hidrogel, p. ej., una matriz de polfmero bien hidratada.
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza por ser una composicion lfquida, la cual tras inyeccion forma un deposito.
En una realizacion adicional mas, la composicion se administra por inyeccion, tal como subcutanea o intramuscular.
En una realizacion adicional, el compuesto de insulina se selecciona de insulina humana o no humana o analogos y derivados de insulina o conjugados de los mismos. Es mas preferida la insulina humana y analogos de insulina, tales como por ejemplo, insulina glargina, insulina detemir, insulina lispro, insulina aspart, insulina glulisina.
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En una realizacion adicional mas, la concentracion maxima se alcanza en las primeras 24 horas de la administracion, tal como en las primeras 12 horas de la administracion, p. ej., en las primeras 6 horas de la administracion.
En una realizacion adicional, la composicion comprende ademas un compuesto de GLP-1.
Una realizacion adicional mas esta en combinacion con un compuesto de GLP-1. Tfpicamente, el compuesto de insulina se puede administrar primero o viceversa, y el compuesto de insulina y el compuesto de GLP-1 se puede administrar de forma simultanea o secuencial.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un metodo el para el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en cuyo tratamiento o prevencion es beneficioso un compuesto de insulina, tal como hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X, en un sujeto mamffero que necesite dicho tratamiento o prevencion, por la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de insulina en una concentracion que es suficiente para mantener un nivel terapeuticamente eficaz del compuesto de insulina en el plasma sangumeo durante al menos 3 dfas, tfpicamente al menos 80 horas, p. ej., una semana o mas, caracterizado por tener un perfil farmacocinetico in vivo sin sustancialmente aumento brusco del compuesto de insulina.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refriere a un metodo para el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en cuyo tratamiento o prevencion es beneficioso un compuesto de insulina, tal como hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X, en un sujeto mamffero que necesite dicho tratamiento o prevencion, por la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de insulina en una concentracion de al menos 10 mg/ml, caracterizado por tener un perfil farmacocinetico in vivo sin sustancialmente aumento brusco del compuesto de insulina.
Una realizacion se refiere al tratamiento o prevencion de la hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X, en un sujeto mairnfero, tal como un sujeto humano. Tfpicamente, al sujeto humano se le ha diagnosticado prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, obesidad, hipertension, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X.
En una realizacion adicional, la concentracion del compuesto de insulina es al menos 11 mg/ml, tal como de 11 mg/ml a 35 mg/ml.
En una realizacion adicional mas, el perfil farmacocinetico se mide en el plasma sangumeo de mamffero tal como plasma sangumeo humano.
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza por presentar una relacion de pico a valle menor que 2, tal como menor que 1,75, menor que 1,5, o menor que 1,25.
En una realizacion adicional mas, la composicion se caracteriza por una liberacion continua de un compuesto de insulina estructuralmente intacta a lo largo del periodo de tiempo completo entre administraciones.
En una realizacion adicional el periodo de tiempo completo entre administraciones es al menos aproximadamente 80 horas, tal como aproximadamente 110 horas, tfpicamente una semana.
En una realizacion adicional mas el compuesto de insulina es un profarmaco, tal como uno cualquiera de los profarmacos descritos en la presente memoria.
En una realizacion adicional el compuesto de insulina esta totalmente contenido en un deposito, tfpicamente un gel polimerico, tal como un hidrogel, p. ej., una matriz de polfmero bien hidratada.
En una realizacion adicional mas el compuesto de insulina esta covalentemente unido en el deposito, tfpicamente el gel polimerico, tal como el hidrogel, p. ej., una matriz de polfmero bien hidratada.
En una realizacion adicional, la composicion se caracteriza por ser una composicion lfquida, la cual tras inyeccion forma un deposito.
En una realizacion adicional mas, la composicion se administra por inyeccion, tal como subcutanea o intramuscular.
En una realizacion adicional, el compuesto de insulina se selecciona de insulina humana o no humana o analogos y derivados de insulina o conjugados de los mismos. Es mas preferida la insulina humana y analogos de insulina, tales como por ejemplo, insulina glargina, insulina detemir, insulina lispro, insulina aspart, insulina glulisina. En una realizacion adicional mas, la concentracion maxima se alcanza en las primeras 24 horas de la administracion, tal como en las primeras 12 horas de la administracion, p. ej., en las primeras 6 horas de la administracion.
En una realizacion adicional, la composicion comprende ademas un compuesto de GLP-1.
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Una realizacion adicional mas esta en combinacion con un compuesto de GLP-1. ^picamente, el compuesto de insulina se puede administrar primero o viceversa, y el compuesto de insulina y el compuesto de GLP-1 se puede administrar de forma simultanea o secuencial.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un kit de piezas que comprende una composicion farmaceutica de una cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria y un recipiente para la administracion de la composicion. Tfpicamente, el recipiente es una jeringa.
Una realizacion del kit comprende ademas un compuesto de GLP-1.
Figura 1a. Cromatograma de UPLC del conjugado de insulina-conector 12a.
Figura 1b. Cromatograma de UPLC del conjugado de insulina-conector 12b.
La figura 2 muestra la concentracion de insulina plasmatica media de los animales 1-10 despues de una sola dosis subcutanea del artfculo de ensayo 11a que contiene 6 mg de insulina, en ratas sanas a los largo de un periodo de 2 semanas. (Las barras de error se dan como ± desviacion tfpica, obtenida de los 10 animales, los valores to se tomaron 3 dfas antes de la administracion).
Figura 3: Concentracion de insulina plasmatica media de los animales 1-8 despues de una sola dosis subcutanea del artfculo de ensayo 11da que contiene 3 mg de insulina, en ratas sanas a los largo de un periodo de 13 dfas. (Las barras de error se dan como ± desviacion tfpica, obtenida de los 8 animales, los valores to se tomaron 1 dfa antes de la administracion).
Figura 4: Concentracion de insulina plasmatica (cuadrados grises) y nivel de glucosa en la sangre (drculos negros) despues de una sola dosis subcutanea del artfculo de ensayo 11da que contiene 6,4 mg de insulina, en ratas diabeticas (n=7). (Las barras de error se dan como ± desviacion tfpica, obtenida de los 7 animales, los valores to se tomaron 4 dfas antes de la administracion).
Figura 5: Nivel de insulina plasmatica media despues de una sola dosis subcutanea de 8 mg/kg del artfculo de ensayo 11db, en ratas durante las primeras 24 horas despues de la administracion (analisis del aumento brusco). 8 ratas se dividieron en 2 grupos y se tomaron muestras de sangre para la farmacocinetica alternando entre ambos grupos. En ninguno de los grupos hubo un efecto de aumento brusco perceptible. (Las barras de error se dan como ± desviacion tfpica, obtenida de todos los animales por grupo, los valores to se tomaron 1 dfa antes de la administracion).
Figura 6: Concentracion de insulina plasmatica (cuadrados grises) y nivel de glucosa en la sangre (drculos negros) durante un periodo de 4 semanas despues 3 dosis subcutaneas semanales de 8 mg/kg del artfculo de ensayo 11da, en ratas diabeticas (n=8). (Las barras de error se dan como ± desviacion tfpica, obtenida de los 8 animales, los valores to se tomaron 3 dfas antes de la administracion).
Figura 7: Concentracion de insulina plasmatica media de los animales 1-8 (animales 1-4 y animales 5-8 para el valor de 0,3, 1 h 2 y 4 h, respectivamente) despues de una sola inyeccion subcutanea de 12 mg/kg de insulina formulada en el artfculo de ensayo 11dc, en ratas sanas a los largo de un periodo de 13 dfas. (Las barras de error se dan como ± desviacion tfpica, obtenida de los 8 animales, los valores to se tomaron 4 dfas antes de la administracion).
Figura 8: Superposicion de la liberacion de insulina y la degradacion de hidrogel de insulina-conector-hidrogel 11a. La cantidad de contenido de insulina en el insulina-conector-hidrogel (triangulos) y liberacion de restos de cadena principal (drculos) tras incubacion del insulina-conector-hidrogel a pH 7,4 y 37°C, se representan graficamente frente al tiempo de incubacion.
La figura 9 muestra una representacion grafica de la fuerza frente al flujo usando una aguja 30G. Puntos de datos: cuadrados negros = etilenglicol; triangulos negros = agua; puntos negros = profarmaco de hidrogel-insulina
Ejemplos
Materiales y metodos
La insulina humana recombinante se obtuvo de Biocon Ltd., Bangalore, India.
El amino-PEG de 4 brazos de 5 kDa se obtuvo de JenKem Technology, Beijing, P. R. China.
El ester de NHS del acido N-(3-maleimidopropil)-21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-heneicosanoico (Mal-PEG6- NHS) se obtuvo de Celares GmbH, Berlin, Alemania.
La resina de cloruro de 2-clorotritilo, HATU, N-ciclohexil-carbodiimida-N'-metil-poliestireno, y aminoacidos eran de Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Alemania, si no se expone otra cosa. Fmoc(NMe)-Asp(OtBu)-OH se obtuvo de Bachem AG, Bubendorf, Suiza. El acido S-tritil-6-mercaptohexanoico se adquirio en Polipeptide, Strasbourg, Francia. Los aminoacidos usados eran la configuracion L si no se expone otra cosa.
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Todos los demas productos qmmicos eran de Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania.
La smtesis en fase solida se llevo a cabo en resina de cloruro de 2-clorotritilo (TCP) con una carga de 1,3 mmol/g. Se usaron jeringas equipadas con fritas de polipropileno como recipientes de reaccion.
La carga del primer aminoacido en las resinas se llevo a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Desproteccion de Fmoc:
Para la eliminacion del grupo protector Fmoc, la resina se agito con piperidina/DBU/DMF 2/2/96 (v/v/v) (2 veces, 10 min cada vez) y se lavaron con DMF (10 veces).
Desproteccion de Fmoc de resinas cargadas con Fmoc-Aib
La desproteccion de Fmoc de Fmoc-Aib-OH inmovilizado se logro por agitacion de la resina en DMF/piperidina 4/1 (v/v) a 50 °C durante 20 min (2 veces).
Protocolo de escision para la resina de cloruro de 2-clorotritilo
Tras completase la smtesis, la resina se lavo con DCM, se seco a vacrn y se trato dos veces durante 30 min con 6/4 DCM/HFIP (v/v). Los eluatos se combinaron, los productos volatiles se separaron con una corriente de nitrogeno y el producto bruto resultante se purifico por RP-HPLC. Las fracciones de HPLC que conteman producto se combinaron y liofilizaron.
Los productos que conteman amina obtenidos como sales de TFA se convirtieron en las correspondientes sales de HCl usando resina de intercambio ionico (Discovery DSC-SAX, Supelco, EE.UU.). Esta etapa se llevo a cabo en el caso de que se esperase que el THF residual interfiriera con, p. ej., una posterior reaccion de acoplamiento.
Purificacion por RP-HPLC:
La RP-HPLC se hizo en una columna de 100x20 mm o 100x40 mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5|j (Dr. Maisch, Ammerbuch, Alemania) conectada a un sistema de HPLC Waters 600 y detector de absorbancia Waters 2487. Se usaron gradientes lineales de solucion A (TFA al 0,1% en H2O) y solucion B (TFA al 0,1% en acetonitrilo). Las fracciones de HPLC que conteman producto se liofilizaron.
Cromatograffa ultrarrapida
Se llevaron a cabo purificaciones por cromatograffa ultrarrapida en un sistema Isolera One de Biotage AB, Suecia, usando cartuchos de sflice Biotage KP-Sil y n-heptano y acetato de etilo como eluyentes. Los productos se detectaron a 254 nm.
Para las perlas de hidrogel, se usaron jeringas equipadas con fritas de polipropileno como recipientes de reaccion o para las etapas de lavado.
Metodos analfficos
Se llevo a cabo la CL de ultra rendimiento analffica (UPLC) en un sistema Waters Acquity equipado con una columna Waters BEH300 C18 (2,1 x 50 mm, tamano de parffculas 1,7 jm) acoplad a un espectrometro de masas LTQ Orbitrap Discovery de Thermo Scientific.
La MS de los productos de PEG mostraba una serie de restos de (CH2CH2O)n debido a la polidispersidad de los materiales de partida de PEG. Para una interpretacion mas facil, solo se da una senal m/z representativa en los ejemplos. La Ms de los conjugados de insulina se da para los isotopos representativos y se refiere a aductos de cuatro protones [M+4H]4+.
La cromatograffa de exclusion por tamanos (SEC) se llevo a cabo usando un sistema de Amersham Bioscience AEKTAbasic equipado con una columna Superdex200 5/150 GL (Amersham Bioscience/GE Healthcare) equipado con un filtro de entrada de 0,45 jm, si no se expone otra cosa. Se uso fosfato sodico 20 mM, NaCl 140 mM, a pH 7,4, como fase movil.
Ejemplo 1
Smtesis del reactivo de la cadena principal 1g
El reactivo de la cadena principal 1g se sintetizo a partir del amino-PEG5000 4 brazos 1a de acuerdo con el siguiente esquema:
5 Para la smtesis del compuesto 1b, el amino-PEG5000 4 brazos 1a (PM aproximadamente 5200 g/mol, 5,20 g, 1,00
mmol, sal de HCl) se disolvio en 20 ml de DMSO (anhidro). Se anadieron Boc-Lis(Boc)-OH (2,17 g, 6,25 mmol) en 5 ml de DMSO (anhidro), EDC HCl (1,15 g, 6,00 mmol), HOBt-^O (0,96 g, 6,25 mmol), y colidina (5,20 ml, 40 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 30 min a t.a.
La mezcla de reaccion se diluyo con 1200 ml de diclorometano y se lavo con 600 ml de H2SO4 0,1 N (2 x), salmuera 10 (1 x), NaOH 0,1 M (2 x), y salmuera/agua 1/1 (v/v) (4 x). Las capas acuosas se volvieron a extraer con 500 ml de
DCM. Las fases organicas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron para dar 6,3 g de producto bruto 1b en forma de un aceite incoloro. El compuesto 1b se purifico por RP-HPLC.
Rendimiento 3,85 g (59%) del producto vttreo incoloro 1b.
MS: m/z 1294,4 = [M+5H]5+ (calculado = 1294,6).
15 El compuesto 1c se obtuvo por agitacion de 3,40 g del compuesto 1b (0,521 mmol) en 5 ml de metanol y 9 ml de HCl 4 N en dioxano a t.a. durante 15 min. Los compuestos volatiles se separaron a vado. El producto se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
MS: m/z 1151,9 = [M+5H]5+ (calculado = 1152,0).
Para la smtesis del compuesto 1d, se disolvieron 3,26 g del compuesto 1c (0,54 mmol) en 15 ml de DMSO (anhidro). 20 Se anadieron 2,99 g de Boc-Lis(Boc)-OH (8,64 mmol) en 15 ml DMSO (anhidro), 1,55 g de DC HCl (8,1 mmol), 1,24 g de HOBtH2O (8,1 mmol), y 5,62 ml de colidina (43 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 30 min a t.a.
La mezcla de reaccion se diluyo con 800 ml de DCM y se lavo con 400 ml de H2SO4 0,1 N (2 x), salmuera (1 x), NaOH 0,1 M (2 x), y 1/1 (v/v) salmuera/agua (4 x). Las capas acuosas se volvieron a extraer con 800 ml de DCM.
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Las fases organicas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se evaporaron para dar un producto bruto vftreo.
El producto se disolvio en DCM y precipito con eter dietilico enfriado (-18 °C). Este procedimiento se repitio dos veces y el precipitado se seco a vado.
Rendimiento: 4,01 g (89%) de producto vftreo incoloro 1d, que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. MS: m/z 1405,4 = [M+6H]®+ (calculado = 1405,4).
El compuesto 1e se obtuvo agitando una solucion del compuesto 1d (3,96 g, 0,47 mmol) en 7 ml de metanol y 20 ml de HCl 4 N en dioxano a t.a. durante 15 min. Los compuestos volatiles se separaron a vado. El producto se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
MS: m/z 969,6 = [M+7H]7+ (calculado = 969,7).
Para la smtesis del compuesto 1f, el compuesto 1e (3,55 g, 0,48 mmol) se disolvio en 20 ml de DMSO (anhidro). Se anadieron Boc-Lis(Boc)-OH (5,32 g, 15,4 mmol) en 18,8 ml de DMSO (anhidro), EDC HCl (2,76 g, 14,4 mmol), HOBt H2O (2,20 g, 14,4 mmol), y 10,0 ml de colidina (76,8 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 60 min a t.a.
La mezcla de reaccion se diluyo con 800 ml de DCM y se lavo con 400 ml de H2SO4 0,1 N (2 x), salmuera (1 x), NaOH 0,1 M (2 x), y salmuera/agua 1/1 (v/v) (4 x). Las capas acuosas se volvieron a extraer con 800 ml de DCM. Las fases organicas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron para dar el producto bruto 1f en forma de un aceite incoloro.
El producto se disolvio en DCM y precipito con eter dietftlico enfriado (-18 °C). Esta etapa se repitio dos veces y el precipitado se seco a vado.
Rendimiento 4,72 g (82%) de producto vftreo incoloro 1f, que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. MS: m/z 1505,3 = [M+8H]8+ (calculado = 1505,4).
El reactivo de la cadena principal 1g se obtuvo agitando una solucion del compuesto 1f (PM aproximado 12035 g/mol, 4,72 g, 0,39 mmol) en 20 ml de metanol y 40 ml de HCl 4 N en dioxano a t.a. durante 30 min. Los compuestos volatiles se separaron a vado.
Rendimiento 3,91 g (100 %), de producto vftreo reactivo de la cadena principal 1g. MS: m/z 977,2 = [M+9H]9+ (calculado = 977,4).
Ruta sintetica alternativa para 1g
Para la smtesis del compuesto 1b, a una suspension de PEG5000-4 brazos-tetraamina (1a) (50,0 g, 10,0 mmol) en 250 ml de /PrOH (anhidro), se anadieron boc-Lis(boc)-OSu (26,6 g, 60,0 mmol) y DIEA (20,9 ml, 120 mmol) a 45 °C y la mezcla se agito durante 30 min.
Posteriormente, se anadieron n-propilamina (2,48 ml, 30,0 mmol). Despues de 5 min la solucion se diluyo con 1000 ml de MTBE y se almaceno durante la noche a -20 °C sin agitacion. Aproximadamente 500 ml del ftquido sobrenadante se separaron por decantacion y se descartaron. Se anadieron 300 ml de MTBE fno y despues de 1 min de agitacion el producto el producto se recogio por filtracion a traves de un filtro de vidrio y se lavo con 500 ml de MTBE fno. El producto se seco a vado durante 16 h.
Rendimiento: 65,6 g (74%) 1b como un solido blanco grumoso MS: m/z 937,4 = [M+7H]7+ (calculado = 937,6).
El compuesto 1c se obtuvo por agitacion del compuesto 1b de la etapa previa (48,8 g, 7,44 mmol) en 156 ml de 2- propanol a 40 °C. Se anadieron una mezcla de 196 ml de 2-propanol y 78,3 ml de cloruro de acetilo con agitacion en 1-2 min. La solucion se agito a 40 °C durante 30 min y se enfrio a -30 °C durante la noche con agitacion. Se anadieron 100 ml de MTBE fno, la suspension se agito durante 1 min y se enfrio durante 1 h a -30 °C. El producto se recogio por filtracion a traves de un filtro de vidrio y se lavo con 200 ml de MTBE fno. El producto se seco a vado durante 16 h.
Rendimiento: 38,9 g (86%) de 1c en forma de un polvo blanco MS: m/z 960,1 = [M+6H]6+ (calculado = 960,2).
Para la smtesis del compuesto 1d, a una suspension de 1c de la etapa previa (19,0 g, 3,14 mmol) en 80 ml 2- propanol, se anadieron boc-Lis(boc)-OSu (16,7 g, 37,7 mmol) y DIEA (13,1 ml, 75,4 mmol) a 45 °C y la mezcla se agito durante 30 min a 45 °C. Posteriormente, se anadio n-propilamina (1,56 ml, 18,9 mmol). Despues de 5 min la solucion precipito con 600 ml de MTBE fno y se centrifugo (3000 min-1, 1 min) El precipitado se seco a vado durante 1 h y se disolvio en 400 ml THF. Se anadieron 200 ml de eter dietflico y el producto se enfrio a -30 °C durante 16 h
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sin agitacion. La suspension se filtro a traves de un filtro de vidrio y se lavo con 300 ml de MTBE fno. El producto se seco a vado durante 16 h.
Rendimiento: 21,0 g (80%) de 1d como un solido blanco MS: m/z 1405,4 = [M+6H]6+ (calculado = 1405,4).
El compuesto 1e se obtuvo disolviendo el compuesto 1d de la etapa previa (15,6 g, 1,86 mmol) en HCl 3 N en metanol (81 ml, 243 mmol) y agitando durante 90 min a 40 °C. Se anadieron 200 ml de MeOH y 700 ml de iPrOH y la mezcla se almaceno durante 2 h a -30 °C. Para que se completara la cristalizacion, se anadieron 100 ml de MTBE y la suspension se almaceno a -30 °C durante la noche. Se anadieron 250 ml de MTBE fno, la suspension se agito durante 1 min y se filtro a traves de un filtro de vidrio y se lavo con 100 ml de MTBE fno. El producto se seco a vado.
Rendimiento: 13,2 g (96%) 1e como un polvo blanco
MS: m/z 679,1 = [M+10H]10+ (calculado = 679,1).
Para la smtesis del compuesto 1f, a una suspension del compuesto 1e de la etapa previa, (8,22 g, 1,12 mmol) en 165 ml de 2-propanol, se anadieron boc-Lis(boc)-OSu (11,9 g, 26,8 mmol) y DIEA (9,34 ml, 53,6 mmol) a 45 °C y la mezcla se agito durante 30 min. Posteriormente, se anadio n-propilamina (1,47 ml, 17,9 mmol). Despues de 5 min la solucion se enfrio a -18 °C durante 2 h, despues se anadieron 165 ml de MTBE fno, la suspension se agito durante 1 min y se filtro a traves de un filtro de vidrio. Posteriormente, la torta de filtracion se lavo con 4x 200 ml de MTBE fno/iPrOH 4:1 y 1x 200 ml de MTBE fno. El producto se seco a vado durante 16 h.
Rendimiento: 12,8 g, PM (90 %) de 1f en forma de un solido amarillo palido grumoso
MS: m/z 1505,3 = [M+8H]8+ (calculado = 1505,4).
El reactivo de la cadena principal 1g se obtuvo disolviendo 4BrazosPEG5kDa(-LisLis2Lis4(boc)s)4 (1f) (15,5 g, 1,29 mmol) en 30 ml de MeOH y enfriando a 0 °C. Se anadio HCl 4 N en dioxano (120 ml, 480 mmol, enfriado a 0 °C) en el espacio de 3 min y se retiro el bano de hielo. Despues de 20 min, se anadio HCl 3 N en metanol (200 ml, 600 mmol, enfriado a 0 °C) en el espacio de 15 min y la solucion se agito durante 10 min a temperatura ambiente. La solucion de producto precipito con 480 ml de MTBe fno y se centrifugo a 3000 rpm durante 1 min. El precipitado se seco a vado durante 1 h y se volvio a disolver en 90 ml de MeOH, precipito con 240 ml de MTBE fno y la suspension se centrifugo a 3000 rpm durante 1 min. El producto 1g se seco a vado
Rendimiento: 11,5 g (89 %) como copos amarillo palido.
MS: m/z 1104,9 = [M+8H]8+ (calculado = 1104,9).
Ejemplo 2
Smtesis del reactivo de reticulacion 2d
El reactivo reticulador 2d se preparo a partir del ester monobendlico del acido adfpico (English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347) y PEG2000 de acuerdo con el siguiente esquema:
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Una solucion de PEG 2000 (2a) (11,0 g, 5,5 mmol) y semiester de adipato bendlico (4,8 g, 20,6 mmol) en diclorometano (90,0 ml) se enfrio to 0°C. Se anadio diciclohexilcarbodiimida (4,47 g, 21,7 mmol) seguido de una cantidad catalttica de DMAP (5 mg) y la solucion se agito y se dejo que alcanzara la temperatura ambiente durante la noche (12 h). El matraz se almaceno a +4°C durante 5 h. El solido se filtro y el disolvente se elimino completamente por destilacion a vado. El residuo se disolvio en 1000 ml de eter dietflico/acetato de etilo 1/1(v/v) y se almaceno a t.a. durante 2 horas, mientras se formaba una pequena cantidad de un solido en escamas. El solido se separo por filtracion a traves de una almohadilla de Celite®. La solucion se almaceno en un matraz hermeticamente cerrado a -30°C en el congelador durante 12 h hasta completase la cristalizacion. El producto cristalino se filtro a traves de una frita de vidrio y se lavo con eter dietflico enfriado (-30°C). La torta de filtracion se seco a vado. Rendimiento: 11,6 g (86 %) de 2b como un solido incoloro. El producto se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
MS: m/z 813,1 = [M+3H]3+ (calculado = 813,3)
En un recipiente de autoclave de vidrio de 500 ml se disolvio el PEG2000-bis-acido adfpico-bis-ester de bencilo 2b (13,3 g, 5,5 mmol) en acetato de etilo (180 ml) y se anadio paladio sobre carbon al 10% (0,4 g). La solucion se hidrogeno a 6 bar, 40°C hasta que ceso el consumo de hidrogeno (5-12 h). El catalizador se separo por filtracion a traves de una almohadilla de Celite® y el disolvente se evaporo a vado. Rendimiento: 12,3 g (cuantitativo) de 2c en forma de aceite amarillo. El producto se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
MS: m/z 753,1 = [M+3H]3+ (calculado = 753,2)
Una solucion de PEG2000-bis-semiester de acido adfpico 2c (9,43 g, 4,18 mmol), W-hidroxisuccinimida (1,92 g, 16,7 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (3,44 g, 16,7 mmol) en 75 ml de DCM (anhidro) se agito durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se enfrio a 0 °C y el precipitado se separo por filtracion. El DCM se evaporo y el residuo se recristalizo en THF.
Rendimiento: 8,73 g (85%) reactivo reticulador 2d como un solido incoloro.
MS: m/z 817,8 = [M+3H]3+ (calculado = 817,9 g/mol).
Ejemplo 3
Preparacion de perlas de hidrogel (3) y (3a) que contiene grupos amino libres
Una solucion de 275 mg del compuesto 1g y 866 mg del compuesto 2d en 14 ml de DMSO se anadio a una solucion de 100 mg Arlacel P135 (Croda International Plc) en 60 ml heptano. La mezcla se agito a 700 rpm con un agitador
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metalico adaptado durante 10 min a 25 °C para formar una suspension. Se anadio 1,0 ml de N,N,N',N'-tetrametil- etilendiamina para llevar a cabo la polimerizacion. Despues de 2 h, la velocidad del agitador se redujo a 400 rpm y la mezcla se agito durante 16 h adicionales. Se anadieron 1,5 ml de acido acetico y despues tras 10 min se anadieron 50 ml de agua. Despues de 5 min, el agitador se detuvo y la fase acuosa se dreno.
Para el fraccionamiento por tamano de las perlas, la suspension de agua-hidrogel se tamizo por via humeda en tamices de acero de malla de 75, 50, 40, 32 y 20 pm. Las fracciones de perlas que se retuvieron en los tamices de 32, 40, y 50 pm se juntaron y se lavaron 3 veces con agua, 10 veces con etanol y se secaron durante 16 h a 0,1 mbar para dar el producto 3 como un polvo blanco.
El producto 3a se preparo como se ha descrito para 3 excepto que se usaron 1200 mg de 1g, 3840 mg de 2d, 28,6 ml de DMSO, 425 mg de Arlacel P135, 100 ml de heptano y 4,3 ml de TMEDA. Para el tratamiento, se anadieron 6,6 ml de acido acetico y despues tras 10 min se anadieron 50 ml de agua y 50 ml de solucion acuosa saturada de cloruro sodico.
El contenido de grupos amino del hidrogel se determino por conjugacion de un fmoc-aminoacido con los grupos amino libres del hidrogel y posterior determinacion de fmoc como describen Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206.
El contenido de grupos amino en 3 y 3a se determino que era entre 0,11 y 0,16 mmol/g.
Ejemplo 4
Preparacion de perlas de hidrogel funcionalizadas con maleimida (4) y (4a) y (4aa) y determinacion de la sustitucion de maleimida
Una solucion de 600 mg de Mal-PEG6-NHS (1,0 mmol) en 4,5 ml de acetonitrilo/agua 2/1 (v/v) se anadio a 200 mg de perlas de hidrogel secas 3. Se anadieron 500 pl de tampon de fosfato sodico (pH 7,4, 0,5 M) y la suspension se agito durante 30 min a temperatura ambiente. Las perlas 4 se lavaron cinco veces con acetonitrilo/agua 2/1 (v/v), metanol y acetonitrilo/agua/TFA 1/1/0,001 (v/v/v/).
El producto 4a se sintetizo como se ha descrito antes, excepto que se uso 3a en lugar de 3.
Alternativamente, las perlas de hidrogel 3a se prelavaron con DMSO/DIEA 99/1 (v/v), se lavaron con DMSO y se incubaron durante 45 min con una solucion de Mal-PEG6-NHS (2,0 eq respecto a la cantidad teorica de grupos amino en el hidrogel) en DMSO. Las perlas 4aa se lavaron dos veces con DMSO y tres veces con succinato a pH 3,0 (20 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,01%). La muestra se incubo en fosfato sodico a pH 6,0 (50 mM, etanolamina 50 mM, Tween-20 al 0,01%) durante 1 h a t.a. y se lavo cinco veces con succinato sodico a pH 3,0 (20 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,01 %).
Para la determinacion del contenido de maleimida, una parte alfcuota de las perlas de hidrogel 4, 4a, o 4aa, respectivamente, se liofilizo y se peso. Otra parte alfcuota de las perlas de hidrogel 4, 4a o 4aa, respectivamente, se hizo reaccionar con exceso de mercaptoetanol (en tampon de fosfato sodico 50 mM, 30 min a t.a.), y el consumo de mercaptoetanol se detecto por ensayo de Ellman (Ellman, G. L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95). Se determino que el contenido de maleimida estaba entre 0,11 y 0,13 mmol/g de hidrogel seco.
Ejemplo 5
Smtesis del reactivo conector 5d
El reactivo conector 5d se sintetizo de acuerdo con el siguiente esquema:
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Smtesis del reactivo conector intermedio 5a:
Se disolvio cloruro de 4-etoxitritilo (3 g, 9,71 mmol) en DCM (20 ml) y se anadio gota a gota a una solucion de etilendiamina (6,5 ml, 97,1 mmol) en DCM (20 ml). Despues de dos horas, la solucion se vertio en eter dietnico (300 ml) y se lavo tres veces con salmuera/solucion de NaOH 0,1 M 30/1 (v/v) (50 ml cada uno) y una vez con salmuera (50 ml). La fase organica se seco sobre Na2SO4 y los productos volatiles se separaron a presion reducida para obtener el producto intermedio protegido con Mmt (3,18 g, 9,56 mmol).
El producto intermedio protegido con Mmt (3,18 g, 9,56 mmol) se disolvio en DCM anhidro (30 ml). Se anadieron acido 6-(tritilmercapto)-hexanoico (4,48 g, 11,47 mmol), PyBOP (5,67 g, 11,47 mmol) y DIEA (5,0 ml, 28,68 mmol) y la mezcla se agito durante 30 min a t.a. La solucion se diluyo con eter dietilico (250 ml) y se lavo tres veces con salmuera/solucion de NaOH 0,1 M 30/1 (v/v) (50 ml cada vez) y una vez con salmuera (50 ml). La fase organica se seco sobre Na2SO4 y los productos volatiles se separaron a presion reducida. El producto 5a se purifico por cromatograffa ultrarrapida.
Rendimiento: 5,69 g (8,09 mmol).
MS: m/z 705,4 = [M+H]+ (calculado = 705,0).
Smtesis del reactivo conector intermedio 5b:
A una solucion del producto 5a (3,19 g, 4,53 mmol) en THF anhidro (50 ml) se anadio BH3THF (solucion 1 M, 8,5 ml, 8,5 mmol) y la solucion se agito durante 16 horas a t.a. Se anadio BH3THF adicional (solucion 1 M, 14 ml, 14 mmol) y se agito durante 16 horas a t.a. La reaccion se inactivo por la adicion de metanol (8,5 ml), se anadio N,N- dimetil-etilendiamina (3 ml, 27,2 mmol) y la solucion se calento a reflujo y se agito durante tres horas. La mezcla se diluyo con acetato de etilo (300 ml) a t.a., se lavo con solucion acuosa saturada de Na2CO3 (2 x 100 ml) y solucion acuosa saturada de NaHCO3 (2 x 100 ml). La fase organica se seco Na2SO4 y los productos volatiles se evaporaron a presion reducida para obtener la amina intermedia bruta (3,22 g).
La amina intermedia se disolvio en DCM (5 ml), se anadieron Boc2O (2,97 g, 13,69 mmol) disuelto en DCM (5 ml) y DIEA (3,95 ml, 22,65 mmol) y la mezcla se agito a t.a. durante 30 min. La mezcla se purifico por cromatograffa ultrarrapida para obtener el producto intermedio protegido con Boc y Mmt (3 g).
MS: m/z 791,4 = [M+H]+, 519,3 = [M-Mmt+H]+ (calculado = 791,1).
Se anadio HCl acuoso 0,4 M (48 ml) a una solucion del producto intermedio protegido con Boc y Mmt en acetonitrilo (45 ml). La mezcla se diluyo con acetonitrilo (10 ml) y se agito durante 1 hora a t.a. Posteriormente, el valor de pH de la mezcla de reaccion se ajusto a 5,5 por adicion de solucion de NaOH 5 M, se separo el acetonitrilo a presion reducida y la solucion acuosa se extrajo con DCM (4 x 100 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre
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Na2SO4 y los productos volatiles se separaron a presion reducida. El producto 5b bruto se uso sin purificacion adicional.
Rendimiento: 2,52 g (3,19 mmol).
MS: m/z 519,3 = [M+H]+ (PM calculado = 518,8 g/mol).
Smtesis del reactivo conector intermedio 5c:
El producto 5b (780 mg, 0,98 mmol, ~65% de pureza) y NaCNBH3 (128 mg, 1,97 mmol) se disolvieron en metanol anhidro (13 ml). Se anadio una solucion de 2,4-dimetoxibenzaldetnso (195 mg, 1,17 mmol) en DCM (2 ml), y la mezcla se agito durante 2 h a t.a. Los disolventes se evaporaron a presion reducida y el producto bruto se disolvio en DCM y se lavo con solucion saturada de NaCO3. La fase acuosa se extrajo tres veces con DCM, y las fases organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron a presion reducida. El producto 5c se purifico por cromatograffa ultrarrapida usando DCM y MeOH como eluyentes.
Rendimiento: 343 mg (0,512 mmol).
MS: m/z 669,37 = [M+H]+, (calculado = 669,95).
Smtesis del reactivo conector 5d:
La resina TCP cargada con Fmoc-Aib (980 mg, ~0,9 mmol) se desprotegio con DMF/piperidina, se lavo con DMF (5 veces) y DCM (6 veces) y se seco a vado. La resina se trato con una solucion de cloroformiato de p-nitrofenilo (364 mg, 1,81 mmol) y colidina (398 pl, 3,0 mmol) en THF anhidro (6 ml) y se agito durante 30 min. La solucion de reactivo se separo por filtracion y la resina se lavo con THF (5 veces) antes de anadir una solucion de amina 5c (490 mg, 0,7 mmol) y DIEA (1,23 ml, 7,1 mmol) en THF anhidro (6 ml). Despues de agitar durante 18 h a t.a., la solucion de reactivo se separo por filtracion y la resina se lavo con DCM (5 veces). El reactivo conector se escindio de la resina y se purifico por RP-HPLC. Las fracciones de producto se llevaron a pH 6 por adicion de solucion acuosa saturada de NaHCO3 y se concentro a presion reducida. La suspension resultante se repartio entre solucion acuosa saturada de NaCl y DCM, y la capa acuosa se extrajo con DCM. Las fracciones organicas combinadas se concentraron hasta sequedad para dar el reactivo conector 5d.
Rendimiento: 230 mg, (0,29 mmol).
MS m/z 798,41 = [M+H]+, (calculado = 798,1).
Ejemplo 6
Smtesis del reactivo conector 6c
El reactivo conector 6c se sintetizo de acuerdo con el siguiente esquema:
Smtesis de la amina 6a:
Se suspendio trifenilmetanotiol (11,90 g, 43,08 mmol) en DMSO (40 ml). Se anadieron DBU (7,41 ml, 49,55 mmol) y 6-bromohexilftalimida (13,32 g, 42,94 mmol) y la mezcla se dejo que reaccionara durante aproximadamente 15 min. La mezcla de reaccion se repartio entre acetato de etilo (700 ml) y HCl 0,1 M (200 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml), y las fracciones organicas combinadas se lavaron con NaHCO3 sat. (80 ml) y salmuera (80 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El aceite amarillo bruto se recristalizo en n-
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heptano/acetato de etilo. La 6-(S-tritil-)mercaptohexilftalimida intermedia se obtuvo como un solido blanco (13,3 g, 26,4 mmol, 62%).
La 6-(S-tritil-)mercaptohexilftalimida (14,27 g, 28,2 mmol) se suspendio en etanol (250 ml). Se anadio hidrato de hdirazina (3,45 ml, 70,5 mmol) y la mezcla se calento a reflujo durante 2 h. La mezcla se filtro y el filtrado se concentro a vado. Se anadio cloroformo (180 ml) al aceite residual y la suspension resultante se agito a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla se filtro y el filtrado se extrajo con agua (60 ml) y salmuera (60 ml), se seco sobre MgSO4 y se concentro para dar la 6-(tritilmercapto)-hexilamina bruta (10,10 g, 26,87 mmol, 95%).
MS: m/z 376,22 = [M+H]+, (calculado = 376,20).
Se anadieron DIEA (1,41 ml, 8,11 mmol) y cloroformiato de n-butilo (908 pl, 7,14 mmol, en 1 ml de THF) a una solucion enfriada (0 °C) de 6-(tritilmercapto)-hexilamina (2,44 g, 6,49 mmol) en THF (50 ml). Se anadio LiAlH4 (1 M en THF, 9,74 ml, 9,47 mmol) despues de 30 minutos y la mezcla se calento a reflujo durante 90 min.
La adicion de agua, NaOH ac. 3,75 M y condujo a la formacion de un precipitado que se separo de la mezcla por filtracion. El filtrado se concentro a vado para obtener el producto 6a.
Rendimiento: 2,41 g (6,20 mmol).
MS: m/z 390,22 = [M+H]+, (calculado = 390,22).
Smtesis del reactivo conector intermedio 6b:
A una solucion del producto 6a (2,1 g, 5,31 mmol) se anadio 2-bromoetilftalimida (1,96 g, 7,7 mmol) y K2CO3 (1,09 g, 7,9 mmol) y la mezcla se calento a reflujo durante 6 h. Despues de filtracion y concentracion, la mezcla bruta se repartio entre acetato de etilo y solucion acuosa saturada de NaHCO3. La (2-(W-metil-W-(6-tritilmercaptohexil- )amino)etil)ftalimida intermedia bruta se purifico por cromatograffa ultrarrapida.
Rendimiento: 1,23 g (2,18 mmol).
MS: m/z: 563,27 = [M+H]+, (calculado = 563,27).
A una solucion de (2-(A/-metil-W-(6-tritilmercaptohexil-)amino-)etil)ftalimida (672 mg, 1,19 mmol) en etanol (12 ml) se anadio hidrazina monohidrato (208 pl, 4,17 mmol), y la mezcla se calento a reflujo durante 1 h. La mezcla de reaccion se filtro, se concentro y la A/-(2-aminoetil-)-A/-metil-A/-(6-tritilmercaptohexil-)amina se purifico por RP-HPLC.
Rendimiento: 624 mg (0,944 mmol).
MS: m/z 433,27 = [M+H]+, (calculado = 433,26).
A una solucion de W-(2-aminoetil-)-W-metil-A/-(6-tritilmercaptohexil-)amina (151 mg, 0,229 mmol) y NaCNBH3 (30 mg, 0,463 mmol) en MeOH anhidro (6 ml) se anadio una solucion de 2,4-dimetoxibenzaldeddo en CH2O2 anhidro (0,6 pl). Despues de agitar durante 1 h a t.a., la mezcla de reaccion se concentro, se volvio a disolver en 2 ml de agua/acetonitrilo 1/9 (v/v) y el producto 6b se purifico por RP-HPLC.
Rendimiento: 177 mg (0,219 mmol).
MS: m/z 583,33 = [M+H]+, (calculado = 583,33).
Smtesis del reactivo conector 6c
El reactivo conector 6c se preparo a partir de la resina cargada con Fmoc-Aib (704 mg, ~0,6 mmol) como se ha descrito para 5d, excepto que se uso la amina 6b (como sal de TFA, 430 mg, 0,53 mmol) en lugar de 5c.
Rendimiento: 285 mg, (0,330 mmol).
MS: m/z 712,37 = [M+H]+, (calculado = 712,37).
Ejemplo 7
Smtesis del reactivo conector 7f
HATU/co hdina
NH -f HO
boc
NMe O
I mob
Tmob NMe 0
fmoc
fmoc
piperidina
6-(Trt-mercapto)-
acido hexanoico / HATU /
co hdina
boc
boc
Tmob NMe O
Tmob
NHMe
LiOH
TrtS
V'A'S
boc
boc
Tmob .NMe O
Tmob NMe 0 A—/
DCC/NHS
TrtS
TrtS
A una solucion enfriada (0 °C) de W-Metil-W-boc-etilendiamina (0,5 ml, 2,79 mmol) y NaCNBH3 (140 mg, 2,23 mmol) en MeOH (10 ml) y acido acetico (0,5 ml) se anadio una solucion de 2,4,6-trimetoxibenzaldelmdo (0,547 mg, 2,79 mmol) en EtOH (l0 ml). La mezcla se agito a t.a. durante 2 h, se acidifico con HCl 2 M (1 ml) y se neutralizo con 5 solucion acuosa saturada de Na2CO3 (50 ml). La evaporacion de todos los productos volatiles, extraccion con DCM de la suspension acuosa resultante y concentracion de las fracciones organicas di la W-Metil-W-boc-W-tmob- etilendiamina (7a) en forma de un aceite bruto que se purifico por RP-HPLC.
Rendimiento: 593 mg (1,52 mmol)
MS: m/z 377,35 = [M+Na]+, (calculado = 377,14).
10 Se disolvio W-Fmoc-W-Me-Asp(OtBu)-OH (225 mg, 0,529 mmol) en DMF (3 ml) y se anadieron el producto 7a (300 mg, 0,847 mmol), HATU (201 mg, 0,529 mmol), y colidina (0,48 ml, 3,70 mmol). La mezcla se agito a t.a. durante 2 h para dar el producto 7b. Para la desproteccion de fmoc, se anadio piperidina (0,22 ml, 2,16 mmol) y se continuo agitando durante 1 h. Se anadio acido acetico (1 ml) y el producto 7c se purifico por RP-HLPC.
Rendimiento: 285 mg (0,436 mmol como sal de TFA)
15 MS: m/z 562,54 = [M+Na]+, (calculado = 562,67).
Se disolvio acido 6-tritilmercaptohexanoico (0,847 g, 2,17 mmol) en DMF anhidra (7 ml). Se anadieron HATU (0,825 g, 2,17 mmol), y colidina (0,8 ml, 6,1 mmol) y el producto 7c (0,78 g, 1,44 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 60 min a t.a., se acidifico con AcOH (1 ml) y se purifico por RP-HPLC. Las fracciones de producto se neutralizaron con solucion acuosa saturada de NaHCO3 y se concentraron. La fase acuosa que quedaba se extrajo 20 con DCM y el producto 7d se aislo tras evaporacion del disolvente.
Rendimiento: 1,4 g (94%)
MS: m/z 934,7 = [M+Na]+, (calculado = 934,5).
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A una solucion del producto 7d (1,40 mg, 1,53 mmol) en MeOH (12 ml) y H2O (2 ml) se anadio LiOH (250 mg, 10,4 mmol) y la mezcla de reaccion se agito durante 14 h a 70 °C. La mezcla se acidifico con AcOH (0,8 ml) y el producto 7e se purifico por RP-HPLC. Las fracciones de producto se neutralizaron con solucion acuosa saturada de NaHCO3 y se concentraron. La fase acuosa que quedaba se extrajo con DCM y el producto 7e se aislo tras evaporacion del disolvente.
Rendimiento: 780 mg (60 %)
MS: m/z 878,8 = [M+Na]+, (calculado = 878,40).
A una solucion del producto 7e (170 mg, 0,198 mmol) en DCM anhidro (4 ml) se anadieron DCC (123 mg, 0,59 mmol) y W-hidroxi-succinimida (114 mg, 0,99 mmol), y la mezcla de reaccion se agito a t.a. durante 1 h. La mezcla se filtro y el filtrado se acidifico con 0,5 ml de AcOH y el producto 7f se purifico por RP-HPLC. Las fracciones de producto se neutralizaron con solucion acuosa saturada de NaHCO3 y se concentraron. La fase acuosa que quedaba se extrajo con DCM y el producto 7f se aislo tras evaporacion del disolvente.
Rendimiento: 154 mg (0,161 mmol)
MS: m/z 953,4 = [M+H]+, (calculado = 953,43).
Alternativamente, el reactivo conector 7f se sintetizo de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Esquema de reaccion alternativo:
6 - (T rl-nicrc apto )- acido hexanoico, COMU
Tmob
Tmob
OBn COMU, colidina
Tmob
DBU
co hdina
LiOII
Tmob
A una solucion de W-Metil-W-boc-etilendiamina (2 g, 11,48 mmol) y NaCNBH3 (819 mg, 12,63 mmol) en MeOH (20 ml) se anadio 2,4,6-trimetoxibenzaldelddo (2,08 mg, 10,61 mmol) en porciones. La mezcla se agito a t.a. durante 90 min, se acidifico con HCl 3 M (4 ml) y se agito 15 min adicionales. La mezcla de reaccion se anadio a solucion saturada de NaHCO3 (200 ml) y se extrajo 5 x con CH2Ch. Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y los disolventes se evaporaron a vado. La W-Metil-W-boc-N'-tmob-etilendiamina resultante (7a) se seco completamente con alto vado y se uso en la siguiente etapa sin mas purificacion adicional.
Rendimiento: 3,76 g (11,48 mmol, 89 % de pureza, 7a : producto protegido con Tmob doble = 8 :1)
MS: m/z 355,22 = [M+H]+, (calculado = 354,21).
A una solucion del producto 7a (2 g, 5,65 mmol) en CH2Ch (24 ml) se anadieron COMU (4,84 g, 11,3 mmol), N-
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Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH (2,08 g, 4,52 mmol) y colidina (2,65 ml, 20,34 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 3 h a t.a., se diluyo con CH2Cl2 (250 ml) y se lavo 3 x con H2SO4 0,1 M (100 ml) y 3 x con salmuera (100 ml). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2O2 (100 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el residuo se concentro hasta un volumen de 24 ml. El producto 7g se purifico usando cromatograffa ultrarrapida.
Rendimiento: 5,31 g (148 %, 6,66 mmol)
MS: m/z 796,38 = [M+H]+, (calculado = 795,37).
A una solucion del producto 7g [5,31 g, max. 4,51 mmol respecto a W-Fmoc-W-Me-Asp(OBn)-OH] en THF (60 ml) se anadio DBU (1,8 ml, 3 % v/v). La solucion se agito durante 12 min a t.a., se diluyo con CH2Ch (400 ml) y se lavo 3 x con H2SO4 0,1 M (150 ml) y 3 x con salmuera (150 ml). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2Cl2 (100 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. El producto 7h se aislo tras evaporacion del disolvente y se uso en la siguiente reaccion sin purificacion adicional.
MS: m/z 574,31 = [M+H]+, (calculado = 573,30).
El producto 7h (5,31 g, 4,51 mmol, bruto) se disolvio en acetonitrilo (26 ml) y se anadieron COMU (3,87 g, 9,04 mmol), acido 6-tritilmercaptohexanoico (2,12 g, 5,42 mmol) y colidina (2,35 ml, 18,08 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 4 h a t.a., se diluyo con CH2O2 (400 ml) y se lavo 3 x con H2SO4 0,1 M (100 ml) y 3 x con salmuera (100 ml). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2O2 (100 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el producto 7i se aislo tras evaporacion del disolvente. El producto 7i se purifico usando cromatograffa ultrarrapida.
Rendimiento: 2,63 g (62 %, 94 % de pureza)
MS: m/z 856,41 = [M+H]+, (calculado = 855,41).
A una solucion del producto 7i (2,63 g, 2,78 mmol) en /-PrOH (33 ml) y H2O (11 ml) se anadio LiOH (267 mg, 11,12 mmol) y la mezcla de reaccion se agito durante 70 min a t.a. La mezcla se diluyo con CH2O2 (200 ml) y se lavo 3 x con H2SO4 0,1 M (50 ml) y 3 x con salmuera (50 ml). Las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2Cl2 (100 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el producto 7e se aislo tras evaporacion del disolvente. El producto 7j se purifico usando cromatograffa ultrarrapida.
Rendimiento: 2,1 g (88 %)
MS: m/z 878,4 = [M+Na]+, (calculado = 878,40).
A una solucion del producto 7e (170 mg, 0,198 mmol) en DCM anhidro (4 ml) se anadieron DCC (123 mg, 0,59 mmol), y una cantidad catalttica de DMAP. Despues de 5 min, se anadio W-hidroxi-succinimida (114 mg, 0,99 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a t.a. durante 1 h. La mezcla de reaccion se filtro, el disolvente se separo a vacfo y el residuo se recogio en acetonitrilo al 90% mas TFA al 0,1% (3,4 ml). La mezcla bruta se purifico por RP-HPLC. Las fracciones de producto se neutralizaron con tampon de fosfato 0,5 M a pH 7,4 y se concentraron. La fase acuosa que quedaba se extrajo con DCM y el producto 7f se aislo tras evaporacion del disolvente.
Rendimiento: 154 mg (81%)
MS: m/z 953,4 = [M+H]+, (calculado = 953,43).
Ejemplo 8
Smtesis de los conjugados de NaA1-insulina-conector 8b y 8c
8c
Smtesis del conjugado de insulina-conector protegido 8a
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El reactivo conector 5d se disolvio en DCM (20 mg/mL) y se activo con resina de N-ciclohexil-carbodiimida-N'-metil- poliestireno (1,9 mmol/g, 10 eq.) durante 1 h. La soluciOn del reactivo conector activado se anadiO a una soluciOn de insulina (1,2 eq.) y DIEA (3,5 eq.) en DMSO (100 mg insulina/ml), y la mezcla se agitO a t.a. durante 45 min. La soluciOn se acidificO con acido acetico, el DCM se evaporO a presiOn reducida y el conjugado de NaA1-insulina protegida conjugada-conector 8a se purificO por RP-HPLC.
El producto 8a liofilizado se tratO con una mezcla de HFIP/TFA/agua/trietilsilano 90/10/2/2 (v/v/v/v) (2 ml/100 mg de 8a) durante 45 min a t.a. La mezcla de reacciOn se diluyO con agua, y os productos volatiles se separaron con una corriente de nitrOgeno. El conjugado de NaA1-insulina conjugada-conector 8b se purificO por RP-HPLC.
8b:
Rendimiento: 139 mg (0,023 mmol) a partir de 62 mg (0,078 mmol) del conector 5d MS: m/z 1524,45 = [M+4H]4+ (calculado = 1524,75).
El conjugado de NaA1-insulina conjugada-conector 8c se sintetizO como se ha descrito para 8b excepto que se usO 6c (72 mg, 0,101 mmol) en lugar del producto 5d.
8c:
Rendimiento: 237 mg (0,039 mmol)
MS: m/z 1528,23 = [M+4H]4+ (calculado = 1528,28).
Ejemplo 9
Smtesis del conjugado de NaB1-insulina-conector 9
La Wa-boc-GlyA1-WE-boc-LisB29-insulina protegida doble se preparO como se ha descrito previamente (J. Markussen, J. Halstr0m, F. C. Wiberg, L. Schaffer, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18814-18818).
El reactivo conector 5d (0,04 mmol) se disolviO en DCM (0,5 ml) y se activO con resina de N-ciclohexil-carbodiimida- N'-metil-poliestireno (0,205 mmol) a t.a. durante 2 h. La soluciOn resultante del reactivo conector activado se anadiO a una soluciOn de insulina bis-boc-protegida (24 mg, 0,004mmol) y DIEA (5 pl, 0,0229 mmol) y se agitO a t.a. durante 1 h. La mezcla de reacciOn se acidificO con 100 pl de acido acetico y el conjugado de insulina-conector se purificO por RP-HPLC.
Rendimiento: 5 mg (0,00075 mmol).
MS: m/z 1660,27 = [M+4H]4+ (calculado = 1660,43).
El conjugado de insulina-conector protegido liofilizado se tratO con 1 ml de HFIP/TFA/agua/TES 90/10/2/2 (v/v/v/v) a t.a. durante 45 min. La mezcla de reacciOn se diluyO con 0,5 ml de agua y los productos volatiles se separaron con una corriente de nitrOgeno. El conjugado de NaB1-insulina conjugada-conector 9 se purificO por RP-HPLC.
Rendimiento: 4 mg (0,0007 mmol)
MS: m/z 1524,46 = [M+4H]4+ (calculado = 1524,75).
Ejemplo 10
Smtesis del conjugado de NEB29-insulina-conector 10
Se disolvio insulina (644 mg, 0,111 mmol) en 6,5 ml de DMSO. Se anadieron 3 ml de tampon de borato sodico 0,5 M enfriado (4 °C) (pH 8,5) y el producto 7f (70 mg, 0,073 mmol) en 2,5 ml de DMSO y la mezcla se agito durante 5 min a t.a. Se anadieron 400 jl de AcOH y el conjugado de insulina protegida se purifico por RP HPLC.
5 Rendimiento: 172 mg (0,025 mmol).
MS: m/z 1662,27 = [M+4H]4+ (calculado = 1662,48).
La eliminacion de los grupos protectores se realizo por tratamiento de las fracciones de producto liofilizadas con 6 ml de HFIP/TFA/TES/agua 90/10/2/2 (v/v/v/v) durante 1h a t.a. El conjugado de NEB29-insulina conjugada-conector 10 se purifico por RP HPLC.
10 Rendimiento: 143 mg (0,023 mmol).
MS: m/z 1531,46 = [M+4H]4+ (calculado = 1531,71).
Ejemplo 11
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Preparacion insulina-conector-hidrogel 11a, 11b, 11c, 11d, 11da, 11db, y 11dc
Se cargo hidrogel funcionalizado con maleimida seco 4 (82 mg, 10,3 jmol de grupos maleimido) en una jeringa
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equipada con una frita de vidrio. Se anadio una solucion de insulina-conector-tiol 8b (27,8 mg, 4,6 pmol) en 1,0 ml de acetonitrilo/agua/TFA 1/1/0,001 (v/v/v) y la suspension se incubo durante 5 min a t.a. Se anadio tampon de acetato (0,4 ml, pH 4,8, 1,0 M) y la muestra se incubo a t.a. durante 1 h. El consumo del tipo se siguio por la prueba de Ellman. El hidrogel se lavo 10 veces con acetonitrilo/agua/TFA 1/0,43/0,001 (v/v/v) y 2 veces con sarcosina 1,0 M pH 7,4/acetonitrilo/tampon de fosfato 0,5 M a pH 7,4/agua 1/1/0,2/0,25 (v/v/v/v). Finalmente, el hidrogel se suspendio en la solucion de sarcosina y se incubo durante 2 h a t.a.
El insulina-conector-hidrogel 11a se lavo 10 veces con acetonitrilo/agua/TFA 1/1/0,001 (v/v/v) y se almaceno a 4°C.
El contenido de insulina se determino por hidrolisis total de una parte alfcuota del insulina-conector-hidrogel en condiciones reductoras a pH 12 y posterior cuantificacion de la cadena A de insulina y la cadena B de insulina por RP-HPLC.
Carga de insulina de 11a: 175 mg insulina/g de insulina-conector-hidrogel
Cantidad de insulina en una suspension de 11a en tampon de acetato sodico 10 mM pH 5, cloruro sodico 135 mM; 12 mg de insulina por 1 ml de suspension de 11a.
Los productos 11b, 11c y 11d se prepararon como se ha descrito antes excepto que se uso 8c, 9, y 10, respectivamente, en lugar del producto 8b.
El producto 11da se preparo como se ha descrito antes excepto que se uso 10 y 4a en lugar del producto 8b y 4.
El producto 11db se preparo como sigue: Una suspension de hidrogel funcionalizado con maleimida 4a en HCl a pH
2.5, Tween-20 al 0,01 % (5,0 ml, 119 pmol de grupos maleimido) se cargo en una jeringa equipada con un filtro. Se anadio una solucion de insulina-conector-tiol 10 (166 mg, 24,4 pmol) en 8,0 ml de HCl a pH 2,5, Tween-20 al 0,01% y la suspension se incubo durante 5 min a t.a. Se anadio tampon de succinato sodico (3,9 ml, pH 4,0, 150 mM; EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,01%) para dar pH 3,6 y la muestra se incubo a t.a. durante 90 min. El consumo de tiol se siguio por la prueba de Ellman. El hidrogel se lavo 10 veces con tampon de succinato sodico (pH 3,0, 50 mM; EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,01%) y 3 veces con tampon de succinato sodico (pH 3,0, 50 mM; EDTA 1 mM, 0 Tween- 20 al 0,01%) que contema acetil-cistema 200 mM. Finalmente, el hidrogel se suspendio en el tampon que contema acetil-cistema y se incubo durante 1 h a t.a.
El insulina-conector-hidrogel 11db se lavo 10 veces con tampon de succinato (pH 3,0, 50 mM; EDTA 1 mM, Tween- 20 al 0,01%) y 8 veces con tampon de acetato sodico (pH 5,0, 10 mM; NaCl 130 mM, Tween-20 al 0,01%).
Carga de insulina de 11db: 6,12 mg de insulina por ml de suspension de insulina-conector-hidrogel
El producto 11dc se preparo como sigue: Una suspension de hidrogel funcionalizado con maleimida 4a en HCl a pH
2.5, Tween-20 al 0,01% (58,3 ml, 958 pmol grupos maleimido) se anadio a un reactor de smtesis en fase solida. Se anadio una solucion de insulina-conector-tiol 10 (117 ml, 460 pmol) en HCl 2,5, Tween-20 al 0,01% al producto 4a. La suspension se incubo a t.a. durante 5 min. Se anadio tampon de succinato (4,8 ml, pH 4,0, 150 mM; EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,01%) para dar un pH de 3,6 y la suspension se incubo a t.a. durante 90 min.
El consumo de tiol se siguio por la prueba de Ellman. El hidrogel se lavo 10 veces con tampon de succinato (pH 3,0, 50 mM; EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,01%) y 2 veces con tampon de succinato (pH 3,0, 50 mM; EDTA 1 mM, Tween- 20 al 0,01%) que contema mercaptoetanol 10 mM. Finalmente, el hidrogel se suspendio en el tampon que contema mercaptoetanol y se incubo durante 3 h a t.a.
El insulina-conector-hidrogel 11dc se lavo 10 veces con tampon de succinato (pH 3,0, 50 mM; EDTA 1 mM, Tween- 20 al 0,01%) y 6 veces con tampon de succinato/Tris (pH 5,0, 10 mM; trehalosa 85 g/l, Tween-20 al 0,01%).
Carga de insulina de 11dc: 18,7 mg de insulina por ml de suspension de insulina-conector-hidrogel
Alternativamente, se pueden usar micropartmulas de hidrogel derivatizado con maleimida 4aa en lugar del producto 4a.
Ejemplo 12
Cinetica de liberacion in vitro
Los insulina-conector-hidrogeles 11a, 11b, 11c y 11d, respectivamente, (insulina-conector-hidrogel que contiene aproximadamente 1 mg de insulina) se suspendieron en 2 ml de fosfato sodico 60 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,01%, pH 7,4, y se incubaron a 37 °C. Las suspensiones se centrifugaron a intervalos de tiempo y el lfquido sobrenadante se analizo por RP-HPLC a 215 nm y ESI-MS. Las senales de UV que se correlacionaban con la insulina liberada se integraron y se representaron graficamente frente al tiempo de incubacion.
Se aplico el software de ajuste de la curva para calcular el tiempo medio de liberacion correspondiente.
Las semividas in vitro de 16 d, 10 d, 30 d, y 14 d se determinaron para los productos 11a, 11b, 11c y 11d, respectivamente.
Alternativamente, el insulina-conector-hidrogel 11db se transfirio a jeringas equipadas con filtro, suspendido en 6 ml de fosfato sodico 60 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,01%, pH 7,4, y se incubo a 37 °C. En tiempos de medicion 5 definidos, el lfquidos sobrenadante se intercambio y se cuantifico la insulina liberada por RP-HPLC a 215 nm. La cantidad de insulina liberada se represento graficamente frente al tiempo de incubacion. Se aplico el software de ajuste de la curva y se calculo para 11 db el tiempo medio in vitro de 15 d.
Alternativamente, el insulina-conector-hidrogel 11db se cargo en una columna cromatografica y se puso en un incubador a temperatura controlada (37°C). Se bombeo fosfato sodico (pH 7,4, 60 mM; EDTA 3 mM, Tween-20 al 10 0,01%) a traves de la columna con un flujo constante de 0,25 ml/h (nominal) y se recogio fuera del incubador. En
tiempo de medicion definidos la solucion se analizo por RP-HPLC a 215 nm. La cantidad de insulina liberada se represento graficamente frente al tiempo de incubacion. Se aplico el software de ajuste de la curva y se calculo para 11 db el tiempo medio in vitro de 13 d.
Ejemplo 13
15 Smtesis de un conjugado de LisB29-conector de insulina (12a) y un conjugado de LisB28-conector de insulina lispro
(12b):
Smtesis del conjugado de LisB29-conector de insulina (12a)
Se disolvieron 1,2 g (0,206 mmol, 0,85 eq) de insulina en DMSO a t.a. Despues de 30 min la solucion se enfrio a 0 20 °C mientras se anadfa tampon de borato (0,5 M, pH 8,5, 21,6 ml) a lo largo de un periodo de 4,40 min. La temperatura de la solucion se mantuvo entre 25 y 28 °C. Se anadio constante en el tiempo una solucion de 228 mg (0,239 mmol, 1 eq) del producto 7f se disolvio en 40 ml de DMSO a lo largo de un periodo de 3 min. Se retiro el bano de hielo y la mezcla de reaccion se agito durante 5 min a t.a. La reaccion se inactivo por adicion de 70 ml de MeCN/H2O (1:1, TFA al 0,1%) y 400 pl de AcOH. El producto 12a se purifico por RP HPLC (disolvente A: H2O con 25 TFA al 0,1%, disolvente B: MeCN con TFA al 0,1%, gradiente: 30-80% de B a lo largo de 14 min, flujo: 40 ml/min).
Regioselectividad de acuerdo con el analisis por UPLC (antes de la purificacion por RP-HPLC): 0,70% de 7f unido a la GlyA1 de la insulina y 76,2% de 7f unido a la LisB29 de la insulina (vease la Fig. 1a).
Rendimiento: 862 mg (sal de TFA, 60%).
MS [M+H]1/4+ = 1662,25 g/mol ((MW+H)1/4 calculado = 1662,35 g/mol).
30 Smtesis del conjugado de LisB28-conector de insulina lispro (12b)
STrt
STn.
'N
Ixic
Tmob
.N-s
O
V
7f
- insulina, DMSO O \\
- f—\
- tampon de borato, pH 8,5 Tmob N
- J •>
- ^ ,-NO
- V\
- 5 min, T.a.
- N -- lf -
- 0
- boo O
- 12b
-insulina H lispro
Se disolvieron 0,347 g (0,059 mmol, 0,85 eq) de insulina lispro en 6 ml DMSO a t.a. Despues de 30 min la solucion se enfrio a 0°C mientras se anadfa tampon de borato (0,5 M, pH 8,5, 5,64 ml) a lo largo de un periodo de 1,40 min. La temperatura de la solucion se mantuvo entre 25 y 30 °C. Se anadio constante en el tiempo una solucion de 67 mg 35 (0,070 mmol, 1 eq) de 7f disuelto en 8 ml DMSO a lo largo de un periodo de 2 min. Se retiro el bano de hielo y la
mezcla de reaccion se agito durante 5 min a t.a. La reaccion se inactivo por adicion de 20 ml de MeCN/H2O (1:1, TFA al 0,1%) y 1 ml de AcOH. El producto 12a se purifico por RP HpLc (disolvente A: H2O con TFA al 0,1%,
5
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45
50
disolvente B: MeCN con TFA al 0,1%, gradiente: 30-80% de B a lo largo de 14 min, flujo: 40 ml/min).
Regioselectividad de acuerdo con el analisis por UPLC (antes de la purificacion por RP-HPLC): 1,3% del producto era 7f unido a la GlyAI de la insulina lispro y 76,7% del producto era 7f unido a la LisB29 de la insulina lispro (vease la Fig. 1b).
Rendimiento: 305 mg (sal de TFA, 72%).
MS [M+H]1/4+ = 1662,25 g/mol ((MW+H)-iM calculado = 1662,35 g/mol).
Ejemplo 14
Estudio farmacocinetico en rata
La farmacocinetica del producto 11a se determino midiendo la concentracion de insulina en el plasma despues de aplicacion subcutanea de una sola dosis en ratas.
Se uso un grupo que consistfa en 10 ratas macho Wistar (200-250 g) para estudiar los niveles de insulina plasmatica a lo largo de un periodo de 14 dfas. Cada uno de los animales recibio una sola inyeccion subcutanea de 500 pl de suspension de 11a en tampon de acetato a pH 5, que contema 6 mg de insulina (12 mg de insulina/ml). Se extrajeron 200 pl de sangre por animal y tiempo de medicion, por via sublingual para obtener 100 pl de plasma con heparina-Li. Se recogieron muestras antes de la aplicacion y despues 4 h, 1,2, 3, 4, 7, 9, 11 y 14 dfas despues de inyeccion. Las muestras de plasma se congelaron en el espacio de 15 min despues de la extraccion de sangre y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron.
Las concentraciones de insulina plasmatica se midieron usando el kit de ELISA de insulina ultrasensible (Mercodia) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras de plasma se diluyeron en tampon de ELISA (1:5 y 1:10 con calibrador 0) antes de la medicion. Las concentraciones de insulina se calcularon a partir de la curva de calibracion que se genero midiendo referencias de insulina por duplicado y ajustando los valores usando regresion lineal. La concentracion de insulina se definio como la media de dos series de dilucion independientes corregidas por el respectivo factor de dilucion y representadas graficamente frente al tiempo. Las concentraciones de insulina plasmatica promediadas para cada punto de tiempo se obtuvieron calculando la media de todos los animales usados como se muestra en la figura 2.
Se observo una liberacion sostenida y sin aumento brusco de insulina a lo largo de 14 dfas.
Ejemplo 15:
Estudio farmacocinetico en rata
La farmacocinetica del producto 11da se determino midiendo la concentracion de insulina en el plasma despues de un periodo de 13 dfas en ratas sanas.
8 ratas Wistar (aproximadamente 250 g de peso corporal) recibieron una sola inyeccion subcutanea de 500 pl del artfculo de ensayo 11da en tampon de acetato a pH 5, que contema 3 mg de insulina (12 mg de insulina/ml). Se extrajeron 200 pl de sangre por animal y por tiempo de medicion, de la vena de la cola, para obtener 100 pl de plasma con heparina-Li. Se recogieron muestras 1 dfa antes y 4 h, 1 d, 2d, 3d, 6 d, 7 d, 8 d, 10 d y 13 dfas despues de administracion del artfculo. Las muestras de plasma se congelaron y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron. El contenido de insulina de las muestras de plasma se midio usando un kit de ELISA de insulina ultrasensible (DRG Instruments GmbH, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incluyeron blancos (calibrador 0) en la curva de calibracion y se restaron de los valores de muestra y la curva de calibracion se ajusto usando una ecuacion polinomica de 3er orden. Antes del analisis las muestras de plasma se agitaron con vortice y se diluyeron en tubos de reaccion (1:5 y 1:10 con calibrador 0). Para el analisis se midio la DO a 450 nm con un lector de placa de microvaloracion (Tecan Ultra) sin correccion de longitud de onda de referencia. Los resultados del contenido de insulina en el plasma hasta el dfa 13 para todos los animales en investigacion se muestran en la figura 3.
Despues de una sola inyeccion subcutanea de 500 pl del producto 11d que contema 3 mg de insulina, el nivel de insulina plasmatica medio subio a un maximo de aproximadamente 500 pM el dfa 1. Como se esperaba, la concentracion de insulina plasmatica posteriormente disminuyo continuamente en 2 semanas. La relacion de pico a valle de los niveles de insulina plasmatica en la primera semana del estudio era aproximadamente 1,7.
Ejemplo 16:
Estudio farmacocinetico y farmacodinamico en ratas
La cantidad y la bioactividad de la insulina liberada se investigaron analizando la concentracion de insulina en el plasma y el efecto de disminucion de glucosa en la sangre en un estudio farmacocinetico/farmacodinamico de exploracion usando ratas Sprague-Dawley (SD) diabeticas.
5
10
15
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25
30
35
40
45
50
55
Para este proposito se indujo diabetes en 8 ratas con esteptozotocina (STZ) y todos los animales con niveles de glucosa en la sangre por encima de 350 mg/dl el dfa 0 se incluyeron en este estudio. 7 de 8 ratas SD se volvieron diabeticas y recibieron una sola inyeccion subcutanea de 500 pl del artfculo de ensayo 11da en tampon de acetato a pH 5, que contema 6,4 mg de insulina. Se extrajeron 200 pl de sangre por animal y por tiempo de medicion, de la vena de la cola, para obtener 100 pl de plasma con heparina-Li. Se recogieron muestras 4 dfas antes y 2 h, 1 d, 2d, 3d, 6 d, 7 d, 8 d, 10 d y 13 dfas despues de administracion del artfculo de ensayo. Las muestras de plasma se congelaron y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron. La glucosa en la sangre se midio con un dispositivo AccuChek Comfort a partir de la vena de la cola 3 veces antes de inyeccion y 2 h, 1 d, 2d, 3d, 6 d, 7 d, 8 d, 10 d, 13 d, 15 d, 17 d, 20 d, 22 d y 24 d despues de la administracion del artfculo de ensayo. El contenido de insulina de las muestras de plasma se midio usando un kit de ELISA de insulina humana (dRg Instruments GmbH, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incluyeron blancos (calibrador 0) en la curva de calibracion y se restaron de los valores de muestra y la curva de calibracion se ajusto usando una ecuacion polinomica de 3er orden. Antes del analisis las muestras de plasma se agitaron con vortice y se diluyeron en tubos de reaccion (1:5 y 1:10 con calibrador 0). Para el analisis se midio la DO a 450 nm con un lector de placa de microvaloracion (Tecan Ultra) sin correccion de longitud de onda de referencia. El nivel de insulina en el plasma se vigilo a lo largo de 2 semanas y el nivel de glucosa en la sangre a lo largo de 3 semanas como se muestra en la figura 4.
Despues de una sola inyeccion subcutanea de hidrogel de insulina 11da el nivel de glucosa en la sangre habfa disminuido eficazmente a lo largo de un periodo de 10 dfas con valores por debajo de 100 mg/dl sin ningun smtoma de hipoglucemia. Debido a la mayor dosificacion de 6,4 mg de insulina por animal, la concentracion de insulina plasmatica maxima era aproximadamente 800 pM el dfa 1 y disminuyo continuamente a lo largo de 2 semanas a aproximadamente 300 pM. Simultaneamente los valores de glucosa en la sangre empiezan a subir despues de 10 dfas y alcanzan niveles predosis despues de 3 semanas.
Ejemplo 17:
Estudio farmacocinetico a lo largo de 24 horas (estudio de aumento brusco) en ratas
Con el fin de probar que la insulina es liberada del insulina-conector-hidrogel sin un aumento brusco, se siguio la concentracion de insulina en el plasma a lo largo de un periodo de 24 horas en ratas sanas.
8 ratas Wistar (200-250 g de peso corporal) se dividieron en 2 grupos y recibieron una sola inyeccion subcutanea de
2 ml del artfculo de ensayo 11db en tampon de acetato a pH 5 por kg de peso corporal. El artfculo de ensayo tema una concentracion de 4 mg /ml de insulina, de modo que cada animal recibfa 8 mg de insulina por kg de peso corporal. Se extrajeron 200 pl de sangre por animal y tiempo de medicion, de la vena de la cola, para obtener aproximadamente 100 pl de plasma con heparina-Li. Las muestras del grupo A se recogieron antes de la dosis y 5 min, 30 min, 2 h, 4 h y 8 h despues de aplicacion del artfculo de ensayo, y el grupo B antes de la dosis y 15 min, 1 h,
3 h, 6 h y 24 h despues de aplicacion del artfculo de ensayo. Las muestras de plasma se congelaron y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron. El contenido de insulina de las muestras de plasma se midio usando un kit de ELISA ultrasensible de insulina ultrasensible (DRG Instruments GmbH, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incluyeron blancos (calibrador 0) en la curva de calibracion y se restaron de los valores de muestra y la curva de calibracion se ajusto usando una ecuacion polinomica de 3er orden. Antes del analisis las muestras de plasma se agitaron con vortice y se diluyeron en tubos de reaccion (1:5 y 1:10 con calibrador 0). Para el analisis se midio la DO a 450 nm con un lector de placa de microvaloracion (Tecan Ultra) sin correccion de longitud de onda de referencia. Los resultados se muestran en la figura 5 e indican claramente que la insulina es liberada sin ningun aumento brusco.
Ejemplo 18:
Estudio farmacocinetico y farmacodinamico de dosis multiples en ratas
Se determino la farmacocinetica y farmacodinamica despues de 3 dosis semanales del producto 11da midiendo las concentraciones de insulina en el plasma y los niveles de glucosa en la sangre a lo largo de un periodo de 4 semanas en ratas diabeticas.
Se usaron 8 ratas Sprague-Dawley con un peso corporal medio de 239 g. Se indujo diabetes con esteptozotocina (STZ) y todos los animales con niveles de glucosa en la sangre por encima de 350 mg/dl el dfa 0 (el dfa de inyeccion del artfculo de ensayo) se incluyeron en este estudio. 8 de 8 animales que recibieron tratamiento de STZ se volvieron diabeticas y recibieron 3 inyecciones subcutaneas semanales los dfas 0, 7 y 14 de 2 ml del artfculo de ensayo 11da en tampon de acetato a pH 5 por kg de peso corporal. Con una concentracion de insulina del artfculo de ensayo de 4 mg/ml, la dosis aplicada era 8 mg de insulina por kg de peso corporal. Se extrajeron 200 pl de sangre por animal y tiempo de medicion, de la vena de la cola, para obtener aproximadamente 100 pl de plasma con heparina-Li. Se recogieron muestras 3 dfas antes y hasta 28 dfas despues de administracion del artfculo de ensayo. Las muestras de plasma se congelaron y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron. La glucosa en la sangre se midio con un dispositivo AccuChek Comfort a partir de la vena de la cola 3 veces antes de inyeccion y hasta 30 dfas despues de inyeccion. El contenido de insulina de las muestras de plasma se midio usando un kit de ELISA de insulina humana (DRG Instruments GmbH, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incluyeron
5
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20
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blancos (calibrador 0) en la curva de calibracion y se restaron de los valores de muestra y la curva de calibracion se ajusto usando una ecuacion polinomica de 3er orden. Antes del analisis las muestras de plasma se agitaron con vortice y se diluyeron en tubos de reaccion (1:5 y 1:10 con calibrador 0). Para el analisis se midio la DO a 450 nm con un lector de placa de microvaloracion (Tecan Ultra) sin correccion de longitud de onda de referencia. El nivel de insulina en el plasma y el nivel de glucosa en la sangre se vigilaron a lo largo de un periodo de 4 semanas y ambos se muestra en la figura 6.
La forma de las curvas indica que la insulina liberada era bioactiva disminuyendo de forma constante el nivel de glucosa en la sangre a valores de aproximadamente 100 mg/dl despues de la 3a inyeccion que permanecio bajo durante aproximadamente una semana. Al mismo tiempo la concentracion maxima de insulina aumento de forma constante de 200 pM despues de la primera dosis y a 300 pM despues de la segunda dosis a 400 pM despues de la tercera dosis y posterior disminucion de nuevo en 2 semanas a valores inferiores a 100 pM.
Ejemplo 19:
Estudio farmacocinetico en rata
La farmacocinetica del producto 11dc se determino midiendo las concentraciones de insulina en el plasma a lo largo de un periodo de 13 dfas en ratas sanas.
8 ratas Wistar (aproximadamente 230 g de peso corporal) recibieron una sola inyeccion subcutanea de 2 ml/kg del artfculo de ensayo 11dc en tampon de succinato a pH 5 (succinato/tris 10 mM, trehalosa 85 g/l, Tween-20 al 0,01%, pH 5,0), que contema 3 mg de insulina (dosis 12 mg/kg). Se extrajeron 200 pl de sangre por animal y por tiempo de medicion, de la vena de la cola, para obtener aproximadamente 100 pl de plasma con heparina-Li. Se recogieron muestras 4 dfas antes y 0,3 h (4 animales), 1 h (4 animales), 2 h (4 animales), 4 h (4 animales), 1 d, 2 d, 3 d, 6 d, 8 d, 10 d y 13 d despues de administracion del artfculo de ensayo. Las muestras de plasma se congelaron y se almacenaron a -80°C hasta que se ensayaron. El contenido de insulina de las muestras de plasma se midio usando un kit de ELISA ultrasensible de insulina humana (DRG Instruments GmbH, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incluyeron blancos (calibrador 0) en la curva de calibracion y se restaron de los valores de muestra y la curva de calibracion se ajusto usando una ecuacion polinomica de 3er orden. Antes del analisis las muestras de plasma se agitaron con vortice y se diluyeron en tubos de reaccion (1:5 y 1:10 con calibrador 0). Para el analisis se midio la DO a 450 nm con un lector de placa de microvaloracion (Tecan Ultra) sin correccion de longitud de onda de referencia. Los resultados del contenido de insulina en el plasma hasta el dfa 13 para todos los animales en investigacion se muestran en la figura 7.
Despues de una sola inyeccion subcutanea de 12 mg/kg del producto 11dc, el nivel de insulina plasmatica medio subio a un maximo de aproximadamente 500 pM el dfa 1. Como se esperaba, la concentracion de insulina en el plasma posteriormente disminuyo continuamente en 2 semanas. La relacion de pico a valle de los niveles de insulina plasmatica en la primera semana del estudio era aproximadamente 1,4.
Ejemplo 20
Liberacion de insulina en tiempo real y degradacion del hidrogel a pH 7,4
El Insulina-conector hidrogel 11a (730 pl, que contema 3,19 mg de insulina) en tampon de acetato a pH 5,0 (10 mM, NaCl 130 mM, Tween-20 al 0,01 % (p/v)) se cargo en un tubo de preparacion de muestra, se lavo 3x con tampon de liberacion a pH 7,4 (fosfato sodico 60 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,01 % (p/v)) y se completo hasta 1,00 ml. Una parte alfcuota de la suspension (0,5 ml, 1,59 mg de insulina) se cargo en una columna de cromatograffa y se puso en un incubador de temperatura controlada (37°C). Se bombeo tampon de liberacion (pH 7,4) a traves de la columna con un flujo constante de 0,25 ml/h (nominal) y se recogio fuera del incubador. En tiempos de medicion definidos la solucion se analizo por RP-HPLC (215 nm). La cantidad de insulina liberada se represento graficamente frente al tiempo de incubacion y se aplico el software de ajuste de la curva para calcular el correspondiente tiempo medio de la liberacion. Se determino un tiempo medio de 9,4 d para la liberacion de insulina.
Despues de 39 d de incubacion a 37°C, la suspension de hidrogel se transfirio a un tubo de preparacion de muestra, el hidrogel residual se arrastro por lavado de la columna con tampon de liberacion a pH 7,4 y la muestra se completo hasta 1,0 ml. Se transfirieron dos partes alfcuotas (300 pl cada una) a tubos de preparacion de muestra esteriles, se completaron hasta 1,5 ml y se incubaron a 37°C. Se tomaron muestras a intervalos de tiempo y se analizaron por cromatograffa por exclusion de tamanos. Las senales de UV que correspondfan a los productos de degradacion solubles en agua liberados del hidrogel que comprendfan uno o mas restos de cadena principal (que correspondfan a grupos funcionales reactivos) se integraron y se representaron graficamente frente al tiempo de incubacion, vease la figura 8.
Ejemplo 21
Inyectabilidad del profarmaco de insulina-conector-hidrogel
Se usaron 5 ml del profarmaco de insulina-conector-hidrogel 11dc (distribucion del tamano de perlas 32-75 pm, 18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mg de insulina/ml) en acido succmico/tris pH 5,0 (10 mM, manitol 40 g/l; trehalosa dihidrato 10 g/l; TWEEN-20 al 0,05%). La suspension de profarmaco de insulina-conector-hidrogel se cargo en una jeringa de 1 ml (longitud 57 mm) mediante una aguja 20 G. La aguja 20 G se sustituyo por una aguja 30 G y se puso en el montaje de jeringa (Aqua Computer GmbH&Co. KG) y la medicion comenzo con una velocidad del piston de 172 mm/min (igual a 50 |jl/s) (Soporte de ensayo de fuerza: Multitest 1-d, Software de recogida de datos: EvaluatEmperor Lite, Version 1,16015, Forge Gauge: BFG 200 N (todos Mecmesin Ltd., Reino Unido). Se llevaron a cabo experimentos con velocidades del piston crecientes mostradas en la siguiente tabla con una nueva muestra de profarmaco de insulina- conector-hidrogel. Se llevaron a cabo experimentos con agua y etilenglicol en concordancia. Para todos los experimentos se uso la misma aguja 30G. En la figura 9 se muestra la fuerza frente al flujo usando una aguja 30G.
- Flujo /
- Flujo /
- Velocidad del piston / Fuerza / N Fuerza / N Fuerza / N
- (s/ml)
- (jl/s) (mm/min) (agua) 11dc (etilenglicol)
- 6
- 167 573 13 36 83
- 8
- 125 430 10 29 62
- 10
- 100 344 7 24 51
- 15
- 67 229 4 22 35
- 20
- 50 172 3 17 27
Abreviaturas:
AcOH acido acetico
AcOEt acetato de etilo
Aib acido 2-aminoisobuffrico
Bn bencilo
Boc t-butiloxicarbonilo
COMU hexafluorofosfato de (1-Ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbenio
DBU 1,3-diazabiciclo[5.4.0]undeceno
DCC N,N,-diciclohexilcarbodiimida
DCM diclorometano
DIEA diisopropiletilamina
DMAP dimetilamino-piridina
DMF N,N-dimetilformamida
Dmob 2,4-dimetoxibencilo
DMSO dimetilsulfoxido
EDC 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EDTA acido etilendiaminatetraacetico
eq equivalente estequiometrico
ESl-MS espectrometna de masas con ionizacion por electropulverizacion
EtOH etanol
Fmoc
HATU
HFIP
HPLC
HOBt
iPrOH
LCMS
Mal
Mal-PEG6-NHS
Me
MeCN
MeOH
Mmt
MS
MTBE
MW
n.d.
NHS
OD
OBu
OtBu
PEG
Phth
PiBOP
RP-HPLC
rpm
9-fluorenilmetoxicarbonilo
hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
hexafluoroisopropanol
cromatograffa ffquida de alto rendimiento
N-hidroxibenzotriazol
2- propanol
espectrometna de masas-cromatograffa ffquida acolada
3- maleimido-propilo
ester de NHS del acido N-(3-maleimidopropil)-21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-heneicosanoico
metilo
acetonitrilo
metanol
4- metoxitritilo
espectro de masas/espectrometna de masas
eter de metilo y ferc-butilo
masa molecular
no determinado
N-hidroxi-succinimida
densidad optica
butiloxi
terc-butiloxi
poli(etilenglicol)
ftal-
hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa ciclos por minuto
10
- RT
- temperatura ambiente
- SEC
- cromatograffa por exclusion de tamanos
- Su
- succinimidilo
- TCP
- resina de cloruro de 2-clorotritilo
- TES
- trietilsilano
- TFA
- acido trifluoroacetico
- THF
- tetrahidrofurano
- TMEDA
- N,N,N'N'-tetrametiletilen-diamina
- Tmob
- 2,4,6-trimetoxibencilo
- Trt
- trifenilmetilo, tritilo
- UPLC
- cromatograffa Kquida de ultra rendimiento
- UV
- ultravioleta
- VIS
- visible
Claims (24)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1.- Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de insulina en una concentracion de al menos 10 mg/ml, caracterizada por tener un perfil farmacocinetico in vivo sustancialmente sin aumento brusco del compuesto de insulina, y en donde el compuesto de insulina esta completamente contenido en un deposito, y en donde el compuesto de insulina esta unido covalentemente en el deposito,en donde el compuesto de insulina es un profarmaco o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable, que es un conjugado de insulina-conector D-L, en dondeD representa el resto de insulina; y-L es un resto conector biologicamente no activo -L1 representado por la formula (I),
imagen1 en donde la lmea de trazos indica la union a uno de los grupos amino de la insulina por formacion de un enlace amida;X es C(R3R3a); o N(R3);R1a, R3a se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, NH(R2b), N(R2b)C(O)R4 y alquilo C1-4;R1, R2 R2a, R2b, R3, R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-4,en donde L1 esta sustituido con un L2-Z y opcionalmente sustituido adicionalmente, con la condicion de que el hidrogeno marcado con un asterisco en la formula (I) no se sustituya por ningun sustituyente, y en dondeL2 es un enlace simple qmmico o un espaciador; yZ es un hidrogel. - 2. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de insulina segun la reivindicacion 1, en una concentracion de al menos 11 mg/ml para administrar en una sola dosis de al menos 10 mg de compuesto de insulina.
- 3. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la concentracion del compuesto de insulina es al menos 11 mg/ml, tal como de 11 mg/ml a 35 mg/ml.
- 4. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque presenta una relacion de pico a valle menor de 2, tal como menor de 1,75, menor de 1,5 o menor de 1,25.
- 5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por una liberacion continua de un compuesto de insulina estructuralmente intacta a lo largo del periodo de tiempo completo entre administraciones.
- 6. La composicion de la reivindicacion 5, en donde el periodo de tiempo completo entre administraciones es al menos aproximadamente 80 horas, tal como al menos aproximadamente 110 horas, tfpicamente al menos una semana.
- 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque se administra por inyeccion, tal como subcutanea o intramuscular.
- 8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el compuesto de insulina se selecciona de insulina humana, insulina glargina, insulina detemir, insulina lispro, insulina aspart, insulina glulisina o un profarmaco de las mismas.
- 9. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la concentracion maxima se alcanza en las primeras 24 horas de la administracion, tal como en las primeras 12 horas de la administracion, p. ej., en las primeras 6 horas de la administracion.
- 10. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que ademas comprende un compuesto de GLP-1.
- 11. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar en el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de insulina, en el que es beneficioso el57tratamiento o prevencion con un compuesto de insulina, tal como hiperglucemia, prediabetes, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo I, diabetes tipo II, smdrome X.
- 12. Una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la composicion farmaceutica esta seca.5 13. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 12, en donde la composicion farmaceutica se secapor liofilizacion.
- 14. Una composicion segun la reivindicacion 12 o 13, en donde el profarmaco de insulina-hidrogel tiene una dosis suficiente en la composicion para proporcionar una cantidad terapeuticamente eficaz de insulina durante al menos tres dfas en una aplicacion.10 15. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 13-14, en donde es una composicionde una sola dosis.
- 16. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 12-14, en donde es una composicion de multiples dosis.
- 17. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 12-16, caracterizada porque contiene 15 uno o mas agentes biologicamente activos adicionales, sea en su forma libre; como un profarmaco, en especial unprofarmaco de hidrogel; y en donde el uno o mas agentes biologicamente activos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en sulfonilureas, tales como, por ejemplo, clorpropamida, tolazamida, tolbutamida, gliburida, glipizida, glimepirida, y similares; meglitinidas, tales como, por ejemplo, repaglinida, peptido similar al glucagon tipo 1 (GLP-1) y sus mimeticos, peptido insulinotropico dependiente de glucosa (GIP) y sus mimeticos, exendina y sus 20 mimeticos, inhibidores de dipeptidilo proteasa (DPPIV); biguanidas, tales como, por ejemplo, metformina; tiazolidinadionas, tales como, por ejemplo, rosiglitazona, pioglitazona, troglitazona, isaglitazona (conocida como MCC-555), acido 2-[2-[(2R)-4-hexil-3,4-dihidro-3-oxo-2H-1,4-benzoxazin-2-il]etoxi]-benceno-acetico, y similares; GW2570, y similares; moduladores de receptor retinoide-X (RXR), tales como, por ejemplo, targretina, acido 9-cis- retinoico, y similares; otros agentes sensibilizadores de insulina, tales como, por ejemplo, INS-1, inhibidores de PTP- 25 1B, inhibidores de GSK3, inhibidores de glucogeno fosforilasa a, inhibidores de fructosa-1,6-bisfosfatasa, y similares;insulinas, incluyendo insulinas de accion normal o corta, accion intermedia y accion prolongada, y analogos de insulina, tales como moleculas de insulina con diferencias menores en la secuencia de aminoacidos natural; moleculas pequenas mimeticos de insulina, que incluyen, pero no se limitan a L-783281, TE-17411, y similares; inhibidores del cotransportador de Na-glucosa, tales como T-1095, T-1095A, florizina, y similares; agonistas de 30 amilina que incluyen, pero no se limitan a pramlintida, y similares; antagonistas de glucagon tales como AY-279955, y similares; agentes antiobesidad tales como orlistat, un inhibidor de lipasa pancreatica; sibutramina; norepinefrina y dopamina; hormona del crecimiento, IGF-1, factor de liberacion de la hormona del crecimiento; oxintomodulina y moduladores de grelina; supresores del apetito tales como benzfetamina, fenmetrazina, fentermina, dietilpropion, mazindol, sibutramina, fenilpropanolamina o, efedrina; supresores del apetito tales como quipazina, fluoxetina, 35 sertralina, fenfluramina, o dexfenfluramina; agentes supresores del apetito tales como apomorfina; agentes supresores del apetito tales como mimeticos de histamina, moduladores de receptor H3; potenciadores del gasto de energfa tales como agonistas beta-3 adrenergicos y estimuladores de la funcion de protemas desacoplantes; leptina y mimeticos de leptina (p. ej., metreleptina); antagonistas del neuropeptido Y; moduladores del receptor de melanocortina-1, 3 y 4; agonistas de colecistoquinina; mimeticos y analogos del peptido similar al glucagon de tipo 1 40 por ejemplo exendina; androgenos tales como deshidroepiandrosterona y derivados tales como etiocolandiona; testosterona; esteroides anabolicos tales como oxandrolona, y hormonas esteroideas; antagonistas del receptor de galanina; agentes de citoquinas tales como factor neurotrofico ciliar; inhibidores de amilasa.
- 18. Un recipiente que contiene la composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 1215.45 19. Un recipiente segun la reivindicacion 18, en donde el recipiente es una jeringa de camara doble.
- 20. Una suspension que comprende la composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 110, 13-17.
- 21. Un metodo de preparacion de una suspension de acuerdo con la reivindicacion 20, que comprende las etapas de reconstituir la composicion farmaceutica seca segun las reivindicaciones 12 o 13 por adicion de solucion50 de reconstitucion.
- 22. Un kit de piezas que comprende una composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 110, 12-17, y un recipiente para la administracion de la composicion.
- 23. Un kit de piezas que comprende una aguja y un recipiente que contiene solucion de reconstitucion, y la composicion seca segun la reivindicacion 12 o 13, para usar con la aguja.55 24. Un kit de piezas segun la reivindicacion 23, en donde el recipiente es una jeringa de camara doble y endonde una de las dos camaras de la jeringa de camara doble contiene la solucion de reconstitucion.
- 25. Un kit de piezas segun una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la composicion es inyectable mediante una aguja.
- 26. Un kit de piezas de la reivindicacion 25, en donde la aguja tiene un diametro interior menor de 300 pm.
- 27. Un kit de piezas de la reivindicacion 25, en donde la aguja tiene un diametro interior menor de 225 pm.
- 28. Un kit de piezas de la reivindicacion 25, en donde la aguja tiene un diametro interior menor de 175 pm.
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