ES2637314T3 - Nuevas alfa-galactosidasas - Google Patents

Nuevas alfa-galactosidasas Download PDF

Info

Publication number
ES2637314T3
ES2637314T3 ES12165987.4T ES12165987T ES2637314T3 ES 2637314 T3 ES2637314 T3 ES 2637314T3 ES 12165987 T ES12165987 T ES 12165987T ES 2637314 T3 ES2637314 T3 ES 2637314T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
galactosidase
linked
glycolipid
fuc
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12165987.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Qiyong Peter Liu
Henrick Clausen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZymeQuest Inc
Original Assignee
ZymeQuest Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZymeQuest Inc filed Critical ZymeQuest Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2637314T3 publication Critical patent/ES2637314T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3695—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the function or physical properties of the final product, where no specific conditions are defined to achieve this
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/09—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from epidermal cells, from skin cells, from oral mucosa cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1315—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from cardiomyocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/14—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/25—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from renal cells, from cells of the urinary tract

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

El uso de una enzima purificada que comprende un polipéptido que tiene una secuencia especificada por SEC ID n.º: 8 como una α-galactosidasa.

Description

imagen1
Tipo 3 de A, O-ligado
GalNAc1-3Gal1-3GalNAc1-O-Ser/Thr 2 Fuc1 O-ligado 5
A tipo 3, Repetitivo
GalNAc1-3Gal1-3GalNAc1-3Gal1-4GlcNA c1-R 2 2 Fuc1 Fuc1 Glucolípido Glucolípido 6
Tipo 4 de A, Globo
GalNAc1-3Gal1-3GalNAc1-3Gal1-R 2 Fuc1 Glucolípido ¿Glucolípido? 7
Tipo 4 de A, Ganglio
GalNAc1-3Gal1-3GalNAc1-3Gal1-R 2 Fuc1 Glucolípido 8
Tipo 1 de B, BLed
Gal1-3Gal1-3GlcNAc1-R 2 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 9
Tipo 1 de B, BLeb
Gal1-3Gal1-3GlcNAc1-R 2 4 Fuc1 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 10
Tipo 2 de B, B
Gal1-3Ga1-4GlcNAc1-R 2 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 11
Tipo 2 de B, BLey
Gal1-3Gal1-4GlcNAc1-R 2 3 Fuc1 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado ¿Glucolípido? 12
Tipo 3 de B, O-ligado
Gal1-3Gal-3GalNAc1-O-Ser/Thr 2 Fuc1 O-ligado 13
Tipo 4 de B, Globo
Gal1-3Gal1-3GalNAc1-3Gal1-R 2 Fuc1 ¿Glucolípido? ¿Glucolípido? 14
Tipo 4 de B, Ganglio
Gal1-3Gal1-3GalNAc1-3Gal1-R 2 Fuc1 ¿Glucolípido? 15
Tipo 1 de H, Le
Gal1-3GlcNAc1-R 2 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 16
Tipo 1 de H, Leb
Gal1-3GlcNAc1-R 2 4 Fuc1 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 17
Tipo 2 de H, H
Gal1-4GlcNAc1-R 2 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 18
Tipo 2 de H, Ley
Gal1-4GlcNAc1-R 2 3 Fuc1 Fuc1 Glucolípido N-ligado O-ligado ¿Glucolípido? 19
Tipo 3 de H, O-ligado
Gal1-3GalNAc1-O-Ser/Thr 2 Fuc1 O-ligado 20
Tipo 3 de H, H-A
Gal1-3GalNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-R 2 2 Fuc1 Fuc1 Glucolípido Glucolípido (A RBC) 21
3
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
imagen9
imagen10
Las -galactosidasas preferidas tienen especificidad de sustrato alta para estructuras de sacáridos ramificadas de grupo sanguíneo B, un pH óptimo generalmente neutro y se pueden producir de forma rentable como proteínas recombinantes en organismos unicelulares tales como bacterias y levadura. La solicitud de patente anterior de los autores de la presente invención (documento U.S.S.N. 10/251271), desarrolló un ensayo de rastreo para las 5 actividades enzimáticas preferidas usando sustratos derivados de AMC de tetrasacárido B y midió actividades enzimáticas a pH neutro. Adicionalmente, se compararon actividades con actividades usando derivados monosacarídicos de p-nitrofenilo para identificar actividades con preferencia o exclusividad por los sustratos complejos, en esa solicitud, los autores de la presente invención revelan el uso de este ensayo de rastreo en un panel grande de aislados bacterianos y fúngicos (3100) y en ella los autores de la presente invención identificaron varios aislados bacterianos que expresan actividades -Ngalactosaminidasa o -galactosidasa medidas con sustratos de AMC de tetrasacárido A o B, pero ningún nivel o niveles insignificantes de actividad con los sustratos de monosacáridos correspondientes. Una de cada de estas actividades se analizó adicionalmente después de serotipar y genotipar estos aislados en forma de cepas de Streptomyces. El análisis de la cepa n.º: 8 que se determinó para tener actividad -N-acetilgalactosaminidasa reveló que la actividad era insoluble y estaba asociada con la masa celular. La
15 cepa n.º: 8 se depositó el 14 de febrero de 2002 con la American Type Culture Collection (ATCC) y se le hubo asignado el número de depósito de ATCC PTA-4076. En contraste, la cepa n.º: 2357 se determinó que tenía actividad -galactosidasa y la actividad se determinó que era soluble, encontrada en el sobrenadante de células transformadas lisadas por prensa francesa. La cepa n.º: 2357 se depositó el 14 de febrero de 2002 con la American Type Culture Collection y se le asignó el n.º de Depósito de ATCC PTA-4077. Debido a que es en gran parte más simple purificar una proteína soluble, los autores de la presente invención eligen purificar y secuenciar inicialmente la proteína a partir de la cepa n.º: 2357.
La enzima que los autores de la presente invención encontraron en la fracción soluble de la cepa n.º: 2357 se purificó parcialmente. El análisis detallado de la especificidad de sustrato de la -galactosidasa purificada parcialmente
25 demostró una especificidad buena sin precedentes por las estructuras de grupo sanguíneo de cadena B ramificadas, pero no se escindió ninguna estructura lineal provista de caperuza por residuos de 1,3 o 1,4 galactosa por esta enzima. El análisis de su pH óptimo mostró que las condiciones preferidas son pH 5,5 a 7,0. La actividad -galactosidasa identificada se prefiere altamente por lo tanto por encima de enzimas conocidas en la técnica anterior debido a su especificidad de sustrato restringida, su alta actividad específica para estructuras de grupo y su pH óptimo. El análisis por SDS-PAGE del extracto en bruto parcialmente purificado resultante reveló 3-4 bandas de proteína en la región de 40-80 KDa que tienen la actividad de -galactosidasa. El análisis de filtración de gel de la preparación mostró la actividad migrada comparable con BSA, indicando una proteína globular que tiene un peso molecular de aproximadamente 40-80 kDa. Se obtuvo una secuencia corta individual: Phe-Ala-Asn-Gly-Leu-Leu-Leu-Thr (SEC ID n.º: 1).
35 Después de estos estudios y como se describe en la presente invención, hemos descubierto una nueva familia de polipéptidos, que tienen actividades -galactosidasa y han desarrollado procedimientos para su inducción, purificación, secuenciación y clonación. Como se discute más adelante, la familia polipeptídica es distinta de la proteína purificada parcialmente previamente de la cepa n.º: 2357 y notablemente estos miembros de la familia no contienen la secuencia mostrada como SEC ID n.º: 1. La nueva estrategia de inducción implica crecimiento de la bacteria apropiada en fuentes de carbono definidas y medio mínimo, lo que da como resultado un incremento significativo en producción de los polipéptidos de -galactosidasa. Los -galactósidos conocidos (que generalmente tienen un pH óptimo ácido y especificidad de sustrato por Gal-pNP u otros monosacáridos simples) no se segregan en S. griseoplanus y en cepas de Streptomyces relacionadas en las mismas condiciones de cultivo que producen estos
45 polipéptidos novedosos.
La presente invención proporciona por lo tanto un procedimiento novedoso para la expresión recombinante y la purificación de ciertos polipéptidos -galactósidos. Esta estrategia de purificación aplicada en combinación con los procedimientos de cultivo e inducción novedosos dio como resultado purificación exitosa a homogeneidad aparente de los polipéptidos de -galactosidasa en cantidades suficientes para la secuenciación de aminoácidos y conversiones tisulares y de producto sanguíneo.
Las siguientes etapas sucesivas se usaron para lograr purificación a homogeneidad aparente: sobrenadante de caldo celular derivado de cultivos de S. griseoplanus n.º: 2357 se hizo pasar primero no unido exitosamente a través de
55 columnas CEX y DEAE (figura 4). Subsiguientemente la actividad se une y se eluye sucesivamente en una columna de hidroxiapatita (figura 5), una columna Cibacron Blue (figura 6) y finalmente una columna AEX (figuras 7 y 8). Por todo el esquema de purificación la proteína se siguió por un análisis de su actividad enzimática en diversas fracciones; el producto de proteína final se analizó también por SDS-NuPAGE. Se obtuvo identificación de la proteína -galactosidasa por comparación del patrón de bandas de proteínas por tinción de plata de SDS-NuPAGE y por cromatografías de filtración de gel de AEX y de S12 (figuras: 8-9). Solamente una banda que migra como 70 kD por SDS-NuPAGE y por filtración de gel de S12, correspondió con la actividad -galactosidasa observada. La proteína identificada según se describe, se separó finalmente por electroforesis en gel NuPAGE y se cortó la banda de 70 kD teñida por Coomassie del gel y se sometió a análisis de secuencia de aminoácidos. Se obtuvo información de secuencia de aminoácidos interna por análisis espectrométrico de masas (MALDI-TOF) y degradación de Edman
65 después de digestión con tripsina. Ninguna de las secuencias cortas obtenidas mostró un alto grado de identidad con
13
secuencias conocidas en bases de datos públicas (GenBank). Una búsqueda de bases de datos de Blast de un péptido de 30 aminoácidos (la secuencia de péptidos más larga obtenida por secuenciación interna y confirmada por EM/EM, usando "Búsqueda en corto, coincidencias casi exactas") identificó una fase de lectura abierta teórica predicha para codificar una proteína (SEC ID n.º: 2) a partir de la secuencia del genoma Streptomyces avermitllis (n.º 5 de acceso de Genbank: BAC74979.1, Gl.: 29610934). El genoma completo de Streptomyces griseoplanus no está disponible y ninguna secuencia relacionada derivada de este género se identificó en búsquedas de bases de datos. Streptomyces avermitilis y Streptomyces griseoplanus están estrechamente relacionados. Los autores de la presente invención pusieron a prueba por lo tanto si Streptomyces avermitilis contenía también la actividad -galactosidasa identificada, que previamente se demostró que es muy rara entre aislados bacterianos incluyendo muchos aislados de
10 Streptomyces.
El sobrenadante de cultivo de Streptomyces avermitilis (ATCC 31267) se sometió a ensayo para la -galactosidasa segregada y como se muestra en la figura 11, se observó evidencia clara de la presencia de actividades -galactosidasa tanto en sobrenadante de cultivo como en lisado de sedimento, según se determinó por digestión de 15 sustratos oligosacarídicos B-tetra. Sin embargo, la escisión de un sustrato simple (-Gal pNP) por la -galactosidasa de Streptomyces avermitilis segregada fue insignificante. En contraste, la escisión completa de -Gal pNP se observó para la -galactosidasa de Streptomyces avermitilis obtenida a partir de la fracción celular. Por lo tanto, las -galactosidasas segregadas y celulares no son probablemente de las mismas identidades. Parte de la galactosidasa segregada es probable que sea la -galactosidasa novedosa que prefiere sustrato ramificado a sustratos simples
20 (lineales), mientras que la mayoría de las actividades de -galactosidasa celular si no todas se observa que tienen actividades glucosidasa convencionales. Las similitudes del polipéptido de S. avermitilis (SEC ID n.º: 2) a la -galactosidasa de S. griseoplanus con respecto a la secreción en caldo de cultivo, peso molecular predicho y las similitudes de secuencia con S. griseoplanus, indica que la proteína de S. avermitilis representa un homólogo de la -galactosidasa derivada de S. griseoplanus identificada originalmente.
25 El polipéptido identificado a partir de S. avermitilis (SEC ID n.º: 2) consiste en 625 aminoácidos y no mostró ninguna similitud significativa con cualesquiera otras proteínas conocidas. Búsquedas de nuevo con la SEC ID n.º: 2 identificaron varias secuencias de proteínas novedosas (SEC ID n.º: 3-8) a partir exclusivamente de genomas procariotas, con similitudes de secuencia mostradas como sigue en la tabla 1A:
30 Tabla 1A:
Identidad (en % general) de -galactosidasa de Bacteroides frente a la enzima de S. avermitilis.
SEC ID n.º
Gl n.º Abreviat Aminoácidos Identidad a secuencia de S. avermitilis (%)
2
gi|29833810|ref|NP_828444.1| S. avermitilis SA 625 100
3
gi |29340474|gb|AA078266.1| Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 BT 568 30,35
4
gi|53715733|ref|YP_101725.1| Bacteroides fragilis YCH46 BF1 605 30,23
5
gi|60495103|emb|CAH09922.1| Bacteroides fragilis NCTC 9343 BF2 605 29,30
6
gi|60491830|emb|CAH06588.1| Bacteroides fragilis NCTC 9343 BF1 595 24,30
7
gi|53712216|ref|YP_098208.1| Bacteroides fragilis YCH46 BF2 595 24,30
8
gi|29341569|gb|AA079356.1| Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 BT 615 22,82
35 Todos los polipéptidos identificados se analizaron por alineamientos de secuencias múltiples como se muestra en la figura 12; se proporciona una secuencia consenso como SEC ID n.º: 9. Estos polipéptidos representan una familia nueva de -galactosidasas novedosas, que tienen especificidad de sustrato única descrita en más detalle más adelante y que tienen la característica común de un pH óptimo aproximadamente neutro.
40 Las secuencias génicas de estos miembros de esta familia de -galactosidasas han permitido desarrollo de sistemas de expresión recombinante para estos polipéptidos, usando una diversidad de células procariotas y eucariotas y de sistemas de expresión procariotas y eucariotas, y permiten purificación de formas recombinantes de estas enzimas
14
imagen11
imagen12
HPTLC de sobrenadantes de cultivos con B-tetra en la figura 2. La desaparición completa de los sustratos usando sobrenadantes de fermentación de 70 horas en carril 4 y 7 distinguieron claramente galactosa y lactosa de otras fuentes de carbono en su capacidad produciendo la -galactosidasa. En la condición del ensayo actual, 25 pmol de sustrato/l de muestra proteica, NaPO4 50 mM (pH 6,8), 1 h a temperatura ambiente, el rendimiento volumétrico de la
5 actividad -galactosidasa puede calcularse como sigue:
25 pmol/(1 l * 60 minutos) ≈ 0,4 mU/ml o 0,4 U/l.
El rendimiento es mucho más grande que un rendimiento típico obtenido de cultivo de medios ricos (~0,1 U/l). Además,
10 el rendimiento está probablemente subestimado dado que carece de punto temporal antes de 1 hora puede haberse perdido en punto final de la reacción. El resultado preliminar muestra gran potencial de usar medios mínimos facilitando producción y purificación de -galactosidasa.
Para confirmar la observación remarcable usando medios mínimos, los autores de la presente invención reevaluaron
15 la fuente de carbono líder galactosa y lactosa para una inducción de -galactosidasa novedosa. La figura 3 muestra el análisis de HPTLC de ensayos de reacción de muestras de fermentación tomadas a diferentes puntos temporales en medios mínimos por galactosa y lactosa como fuentes de carbón. Aproximadamente el 90 % del sustrato se escindió por muestras de cultivo de 3 días, que traducen aproximadamente 4 U/l de sobrenadante de cultivo. Por lo tanto, como se muestra en la figura 3, galactosa (carril n.º: 4) y sorprendentemente lactosa (carril n.º: 7) inducen actividad
20 -galactosidasa significativa. Después las condiciones para el crecimiento e inducción usando galactosa identificada anteriormente se usaron sin optimización adicional desarrollando fermentaciones a gran escala de la cepa de Streptomyces n.º: 2357 para el aislamiento de la enzima. Como será evidente a partir de los siguientes ejemplos estas condiciones eran esenciales para el aislamiento exitoso y la identificación exitosa de la proteína -galactosidasa resultante, que fue diferente de la enzima descrita originalmente por el documento U.S.S.N. 10/251271.
25 Tabla III. Fuentes de carbón usadas rastreando inducción de -galactosidasa novedosas a partir de Streptomyces griseoplanus usando medios mínimos.
Fuente de carbono n.º: Fuente de carbono
1
Harina de semilla de algarrobo
2
Dextrina de almidón de patata
3
D(-) Fructosa
4
D(+) Galactosa
5
D(+) Glucosamina
6
Glicerol
7
D(+) Monohidrato de lactosa
8
Extracto de malta
9
D(+) Monohidrato de maltosa
10
D-manitol
11
D(+) Manosa
12
D(+) Rafinosa
13
L(-) Sorbosa
14
Almidón
15
Sacarosa
16
Xilitol
17
D(+) Xilosa
18
D(+) Glucosa
17
imagen13
imagen14
imagen15
Protocolo de conversión de rutina (200 Glicina, pH 6,8, NaCl 3 mM)
Immucor Anti-B Diagast Anti-B
Enzima de FragB
Dosis g/ml IS 4 ºC IS 4 ºC
Células B humanas
10 0 0 0 0
5
0 0 0 0
2,5
0 0 0 0
1,25
0 0 0 0
0,625
0 W+ W+ 1+
0,3125
0 1+ 1+ 1+
Enzima de Frag. A
Células B humanas
10 0 0 0 0
5
0 0 0 0
2,5
0 0 0 0
1,25
0 0 0 0
0,625
0 W+ W+ 1+
0,3125
1+ 1+ 1+ 2+
Ejemplo 6: clonación y secuenciación de ADN de -galactosidasa desde cepa de Streptomyces griseoplanus n.º: 2357 y deducción de su secuencia de aminoácidos
5 El aislamiento y purificación de la -galactosidasa endógena de S. griseoplanus 2357 se describió en el ejemplo 2. La secuenciación aminoacídica parcial de -galactosidasa que generó un péptido de 30 aminoácidos se describió en el ejemplo 3. La búsqueda de Blast usando este péptido frente a la base de datos "nr" (GenBank) identificó una familia de -galactosidasas teórica. Las secuencias para las 5 -galactosidasas se sometieron a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ y se les asignaron los siguientes números de acceso: AM109953 (Streptomyces avermitilis),
10 AM109954 y AM109955 (Bacteroides fragilis), AM109956 y AM109957 (Bacteriodes thetaiotaomicron). La alineación de secuencias múltiples de -galactosidasas teóricas identificó unas pocas regiones conservadas (figura 15). La fase de lectura abierta que codifica una -galactosidasa teórica de Streptomyces griseoplanus se clonó en base a la amplificación rápida 5' y 3' de extremos genómicos (RAGE). Los cebadores degenerados iniciales estaban basados en las regiones conservadas determinadas de alineamiento de secuencia múltiple de secuencias de -galactosidasa
15 teóricas. Los cebadores en sentido correcto y antisentido degenerados dAVER7 (5'-TTCGGXGTXGTXKGKCAGTWCAGXGAGAA-3' SEC ID. n.º: 15)/dAVER9 (5'-GTXCCXTGXATXTTXATXGGXTCXTCGTG-3' SEC ID. n.º: 16), donde X = inosina y K = G o T, se usaron amplificando por PCR un fragmento de ADN específico de B-zima de 185 pares de bases a partir de ADN genómico de Streptomyces griseoplanus. El producto de PCR se clonó en vector pCR4 (Invitrogen) y se secuenció generando
20 pCR4-dAVER7/9. Los cebadores específicos de -galactosidasa de Streptomyces griseoplanus GRIS10 (5'-ATCGACTCGGTCACCTTCAAGGCCGAC-3' SEC ID n.º: 17) y GRIS11 (5'-AAGACGCTGTTGGTGATGCGTACGGTGC-3' SEC ID. n.º: 18) se derivaron de pCR4-dAVER7/9. El ADN genómico de Streptomyces griseoplanus se trató con endonucleasas hasta finalización con la endonucleasa de restricción Haell, fraccionada en tamaño por electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y ADN de 2-3 kpb fraccionado se
25 purificó por purificación de Quiagel (Qiagen). El ADN purificado se ligó a un adaptador Haell de doble hebra EBRETTE3 (5'-GCGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGGAATTCGGTACCCTCGAGGCGC-3' SEC ID n.º: 19)/EBRETTE4 (5'-CTCGAGGGTACCGAATTCCGGAA-3' SEC ID n.º: 20) que codifica un sitio de unión T7 (subrayado) y saliente de restricción de Haell (mostrado en cursiva). ADN ligado a adaptador se usó en 5' RAGE usando ADN ligado a adaptador de 10 ng, T7/GRIS11 o 3' RAGE usando 10 ng de T7/GRIS10. Los productos 5' RAGE
30 y 3' RAGE generados se clonaron en pCR4 generando 5'-T7/GRIS11-pCR4 y 3'-T7/GRIS10-pCR4 y se secuenciaron completamente. Las secuencias 5'-T7/GRIS11-pCR4 y 3'-T7/GRIST10-pCR4 solapantes representan 1.593 pares de bases de la secuencia génica de B-zima codificante completa. La secuencia 5' y 3' que queda se obtuvo por RAGE repetida en ADN genómico de Streptomyces griseoplanus digerido con BamHI fraccionado, ligado a EBRETTE3/6 de adaptador de BamHI (5'-GATCGCGCCTCGAGGGTACCGAATTCCGGAA-3' SEC ID n.º: 21) (saliente de BamHI
35 mostrado en cursiva). La secuencia 5' completa se obtuvo usando la secuencia de ADN ligado a 10 ng de adaptador y T7/GRIS22 (5'-CGCTTCGGCGTCCGTTCGGGCCAG-3' SEC ID n.º: 22) y secuencia 3' usando T7/GRIS24 (5'-CCGGTGCACCGCAACGTCCTCATC-3' SEC ID n.º: 23). Los productos 5'' RAGE y 3'' RAGE generados se clonaron en pCR4 generando 5'-T7/GRIS22-pCR4 y 3'-T7/GRIS24-pCR4 y se secuenciaron completamente. 5'-T7/GRIS22-pCR4 contenía una metionina de partida que inicia predicha y 3'-T7/GRIS24-pCR4 contenía un codón
40 de parada en fase, completando la secuencia codificante de 2184 pares de bases completa del gen de -galactosidasa
21
imagen16
imagen17
imagen18
Enzima Frag B
Dosis ug/ml IS 4 ºC IS 4 ºC 10 ug/ml
Células B humanas
10 0 0 0 0 0
5
0 0 0 0 0
2,5
0 0 0 0 0
1,25
0 0 0 0 0
0,625
0 W+ W+ 1+ 0
0,3125
0 1+ 1+ 1+ 0
Células de conejo
10 0 0 0 W+ M+
5
0 0 0 W+ Vw+
2,5
0 0 0 W+ W+
1,25
0 0 0 1+ 1+
0,625
0 W+ W+ 3+ 1+
0,3125
0 2+ 4+ 4+ 2+
imagen19
Enzima Frag A
Células B humanas
10 0 0 0 0 0
5
0 0 0 0 0
2,5
0 0 0 0 0
1,25
0 0 0 0 0
0,625
0 W+ W+ 1+. 0
0,3125
1+ 1+ 1+ 2+ 0
Células de conejo
10 4+ 4+ 4+ 4+ 3+
5
4+ 4+ 4+ 4+ 3+
2,5
4+ 4+ 4+ 4+ 3+
1,25
4+ 4+ 4+ 4+ 3+
0,625
4+ 4+ 4+ 4+ 3+
0,3125
4+ 4+ 4+ 4+ 3+
Esto demuestra que la isoforma del polipéptido purificado FragB descrita como parte de la familia de genes de -galactosidasa novedosa comunicada en el presente documento, tiene especificidades de sustrato únicas que son diferentes de varios otros miembros dentro de esta familia, incluyendo los genes relacionados observados en
5 Streptomyces. Además, que el polipéptido FragB descrito es adecuado para la retirada enzimática de los antígenos de grupo sanguíneo B inmunodominantes de los glóbulos rojos, así como para la eliminación del antígeno Galili de xenotrasplantes de las células sanguíneas. El polipéptido purificado FragB es así superior a las otras enzimas conocidas actualmente, con respecto a su pH óptimo (lo más preferible pH 6,5 a pH 7,5), su especificidad de sustrato restringida a uniones Gal1-3 y su actividad específica alta observada.
10 La eliminación enzimática de la galactosa terminal 1-3 unida inmunodominante de los antígenos Galili tiene aplicaciones importantes en el campo de xenotrasplantes. El antígeno Galili constituye la barrera más importante para xenotransplante de órganos, tejidos, tendones, ligamentos y células de animales al hombre y es la causa principal del fenómeno del rechazo hiper-agudo (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86). Aproximadamente el 10% de IgG del
15 suero de individuos sanos normales está dirigido al antígeno Galili. La retirada enzimática del residuo de galactosa terminal expondrá estructuras comunes encontradas en el hombre, que pueden anular el rechazo hiperagudo (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86).
El procedimiento descrito para la retirada enzimática del antígeno Galili en células de conejo en las que las células se
20 lavan e incuban con la -galactosidasa de FragB en un tampón adecuado a pH neutro durante un periodo de tiempo dio como resultado eliminación suficiente del epítopo de Galili (tabla VII). Un procedimiento similar aplicado a órganos, tejidos, tendones, ligamentos y células de animales, da como resultado la eliminación eficiente de antígenos Galili
25

Claims (1)

  1. imagen1
ES12165987.4T 2005-10-31 2006-10-31 Nuevas alfa-galactosidasas Active ES2637314T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73184505P 2005-10-31 2005-10-31
US731845P 2005-10-31
US83600006P 2006-08-07 2006-08-07
US836000P 2006-08-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2637314T3 true ES2637314T3 (es) 2017-10-11

Family

ID=38006440

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10165152T Active ES2386413T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Alfa-Galactosidasas novedosas
ES10165154T Active ES2400838T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Nuevas alfa-galactosidasas
ES12166040.1T Active ES2661929T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Nuevas alfa-galactosidasas
ES12165987.4T Active ES2637314T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Nuevas alfa-galactosidasas

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10165152T Active ES2386413T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Alfa-Galactosidasas novedosas
ES10165154T Active ES2400838T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Nuevas alfa-galactosidasas
ES12166040.1T Active ES2661929T3 (es) 2005-10-31 2006-10-31 Nuevas alfa-galactosidasas

Country Status (7)

Country Link
US (3) US7951552B2 (es)
EP (5) EP2502491B1 (es)
JP (4) JP5395436B2 (es)
AT (1) ATE557039T1 (es)
AU (3) AU2006308953B8 (es)
ES (4) ES2386413T3 (es)
WO (1) WO2007053565A2 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2502491B1 (en) * 2005-10-31 2017-05-10 Velico Medical, Inc. Novel alpha-galactosidases
CA2697999C (en) 2009-04-24 2013-04-30 Werner Hoelke A stabilized aqueous alpha-galactosidase composition and methods relating thereto
CN103349794B (zh) * 2013-05-08 2015-08-19 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 重组α-半乳糖苷酶清除异种皮肤抗原的方法和产品
US20150273111A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-01 Lifecell Corporation Microbial enzymes for reduction of alpha-galactose from collagen based tissue
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
CN116732106A (zh) 2017-04-20 2023-09-12 E开创生物技术股份有限公司 产生基因修改的动物的方法
JP6789886B2 (ja) * 2017-06-09 2020-11-25 株式会社東芝 電子装置
CN117044707A (zh) * 2018-08-17 2023-11-14 不列颠哥伦比亚大学 用于供体器官上的碳水化合物抗原切割的酶促组合物、与其相关的方法和用途
TW202146648A (zh) * 2020-02-28 2021-12-16 美商克迪科思股份有限公司 人類α-半乳糖苷酶變異體
IL302830A (en) 2020-11-13 2023-07-01 Egenesis Inc Cells, tissues, organs and animals with one or more genes that have been modified for improved survival and tolerance of a different-sex transplant
CN116868059B (zh) * 2022-10-18 2024-04-05 天津德祥生物技术股份有限公司 血型抗原三糖偶联物在血型抗体检测中的应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4427777A (en) 1980-08-14 1984-01-24 New York Blood Center, Inc. Enzymatic conversion of red cells for transfusion
US5606042A (en) 1994-09-08 1997-02-25 The Curators Of The University Of Missouri Glycine α-D-galactosidases
US5633130A (en) 1994-09-08 1997-05-27 The Curators Of The University Of Missouri Buffer system for increasing seroconversion efficiency
US5984858A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Crosscart, Inc. Meniscal xenografts
US5865849A (en) 1995-06-07 1999-02-02 Crosscart, Inc. Meniscal heterografts
US6110206A (en) 1995-09-15 2000-08-29 Crosscart, Inc. Anterior cruciate ligament xenografts
US6184017B1 (en) 1996-05-08 2001-02-06 The Curators Of The University Of Missouri Glycine and phaseolus α-D-galactosidases
EP1059891A4 (en) 1998-03-06 2004-05-19 Crosscart Inc XENOTRANSPLANTS MADE OF SOFT FABRIC
US6972041B1 (en) 1998-03-16 2005-12-06 Crosscart, Inc. Bone xenografts
US6383732B1 (en) 1999-02-11 2002-05-07 Crosscart, Inc. Method of preparing xenograft heart valves
US6933326B1 (en) 1998-06-19 2005-08-23 Lifecell Coporation Particulate acellular tissue matrix
US6267786B1 (en) 1999-02-11 2001-07-31 Crosscart, Inc. Proteoglycan-reduced soft tissue xenografts
US7767415B2 (en) * 2001-09-25 2010-08-03 Velico Medical, Inc. Compositions and methods for modifying blood cell carbohydrates
US7064187B2 (en) 2002-11-26 2006-06-20 Crosscart, Inc. Substantially non-immunogenic injectable collagen
AU2004259019B2 (en) 2003-07-21 2010-09-23 Lifecell Corporation Acellular tissue matrices made from galactose alpha-1,3-galactose-deficient tissue
EP2502491B1 (en) * 2005-10-31 2017-05-10 Velico Medical, Inc. Novel alpha-galactosidases

Also Published As

Publication number Publication date
US7951552B2 (en) 2011-05-31
EP2250884B1 (en) 2012-12-05
ES2661929T3 (es) 2018-04-04
AU2010202494A1 (en) 2010-07-08
ATE557039T1 (de) 2012-05-15
US9034626B2 (en) 2015-05-19
US20150087061A1 (en) 2015-03-26
EP2250883A3 (en) 2011-03-09
EP1945269A2 (en) 2008-07-23
EP2250884A2 (en) 2010-11-17
JP5395436B2 (ja) 2014-01-22
US20090220474A1 (en) 2009-09-03
EP2250883B1 (en) 2012-05-09
EP2250885A2 (en) 2010-11-17
ES2386413T3 (es) 2012-08-20
JP2014132904A (ja) 2014-07-24
JP2009516504A (ja) 2009-04-23
EP2250885A3 (en) 2010-12-22
AU2010202494B2 (en) 2013-08-22
AU2006308953B2 (en) 2013-08-15
ES2400838T3 (es) 2013-04-12
AU2006308953A1 (en) 2007-05-10
JP5395747B2 (ja) 2014-01-22
AU2010202013B2 (en) 2013-08-15
JP2010268794A (ja) 2010-12-02
EP2250883A2 (en) 2010-11-17
US8883478B2 (en) 2014-11-11
JP2010263895A (ja) 2010-11-25
AU2006308953B8 (en) 2013-12-05
AU2010202013A1 (en) 2010-06-10
EP1945269A4 (en) 2010-02-17
WO2007053565A2 (en) 2007-05-10
US20110014170A1 (en) 2011-01-20
WO2007053565A3 (en) 2009-05-07
EP2502491A2 (en) 2012-09-26
EP2250884A3 (en) 2011-03-09
EP2502491A3 (en) 2012-12-19
EP2502491B1 (en) 2017-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
De Vouge et al. Isolation and expression of a cDNA clone encoding an Alternaria alternata Alt a 1 subunit
RU2385348C2 (ru) Экспрессирующая система
Titball et al. Biochemical and immunological properties of the C-terminal domain of the alpha-toxin of Clostridium perfringens
US8883478B2 (en) Methods of preparing tissues for xenotransplantation using α-galactosidases
JPS60222429A (ja) 形質転換宿主細胞中にハイブリッド・ポリペプチドを発現させるｄｎａ発現ベクター
Huecas et al. Production and detailed characterization of biologically active olive pollen allergen Ole e 1 secreted by the yeast Pichia pastoris
JPH03504077A (ja) ライグラス花粉アレルゲン
Dahl et al. Carica papaya glutamine cyclotransferase belongs to a novel plant enzyme subfamily: cloning and characterization of the recombinant enzyme
US20100303849A1 (en) Lipidated Vaccine against Dengue Virus Infection
Valentini et al. Mammalian single-stranded DNA binding proteins and heterogeneous nuclear RNA proteins have common antigenic determinants
Pandolfo et al. Single stranded DNA binding proteins derive from hnRNP proteins by proteolysis in mammalian cells
CN103204936B (zh) 沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法
Lee et al. Relation of the Escherichia coli dnaX gene to its two products-the τ and γ subunits of DNA polymerase III holoenzyme
KR101016688B1 (ko) 펩티도글리칸 인식 신호 전달에 관여하는 단백질, 이를코딩하는 유전자, 및 이를 포함하는 박테리아 감염 검출용키트
Kouguchi et al. Characterization of various recombinant antigens from Echinococcus multilocularis for use in the immunodiagnosis
EP1111054B1 (en) A new gene of human lysoenzyme, the encoding polypeptide and methods for preparing them
Berna et al. Immunodetection of a non-structural protein of alfalfa mosaic virus (P2) in infected tobacco plants
Hamaguchi et al. Characterization of an extracellular keratinase from Microsporum canis
EP1111058A1 (en) A novel human lysozyme gene, its encoding polypeptide and the method for preparing them
US20040197852A1 (en) Method of preparing peptide fragment having cell death inhibitory activity
EP2502493B1 (en) Novel alpha-galactosidases
Hoener et al. Conversion of the amphiphilic 115 kDa Form of Glycosyl-Phosphatidylinositol-specific Phospholipase D to an active, hydrophilic 47 kDa Form
WO2001053487A2 (en) Human sperm specific lysozyme-like proteins
EP2110383A1 (en) Hypoallergenic variants
AU2013203945A1 (en) Novel alpha-galactosidases