ES2637401T3 - Epítopos de toxina épsilon de Clostridium perfringens con toxicidad reducida - Google Patents

Abstract

Un polipéptido del epítopo de la toxina épsilon que comprende una secuencia de al menos 260 aminoácidos de longitud que consiste en los aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 3 y que comprende la secuencia de aminoácidos RMEKYXPNAM (SEQ ID NO: 33) en la que "X" es cualquier aminoácido distinto de Y, siendo el polipéptido capaz de unirse a un anticuerpo que se une a la SEQ ID NO: 5 y que tiene una toxicidad reducida en comparación con la toxicidad de la SEQ ID NO: 5.

Description

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se describe un sistema adecuado en Kulkarni et al. (2008, Vaccine vol. 26, 4194-4203). Preferiblemente, la célula hospedadora no es una célula madre, especialmente no es una célula madre humana.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo creado contra un polipéptido según el primer aspecto de la invención.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una vacuna subunitaria que comprende un polipéptido según el primer aspecto de la invención. Por ejemplo, ésta puede estar en forma de una proteína de fusión y/o en forma de una vacuna recombinante vírica.

Un aspecto adicional proporciona una composición de vacuna que puede comprender una vacuna de un polipéptido, de un polinucleótido, de un vector, de un anticuerpo y/o subunitaria según los aspectos precedentes de la invención. La composición puede comprender adicionalmente los excipientes y/o los diluyentes apropiados para el medio a través del cual va a ser administrada la composición a un sujeto que necesite la vacunación contra el desarrollo de la enfermedad causada por C. perfringens y/o por la Etx. La selección de los componentes apropiados está en la habilidad rutinaria de la persona experta sin la aplicación de la actividad inventiva.

Por ejemplo, la composición de vacuna de la invención puede ser formulada convenientemente mediante el uso de un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, un disolvente acuoso, un disolvente no acuoso, un excipiente no tóxico, tal como una sal, un conservante, un tampón y similares. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Algunos disolventes acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Algunos conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición de vacuna se ajustan según la habilidad rutinaria.

Opcionalmente, la formulación de vacuna puede incluir un portador. Algunas moléculas portadoras usadas habitualmente son albúmina sérica bovina (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina, albúmina sérica de ratón, albúmina sérica de conejo y similares. Pueden usarse portadores sintéticos y están fácilmente disponibles. Los medios para la conjugación de péptidos con proteínas portadoras son bien conocidos en la materia e incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y benzidina bisbiazotizada.

En ciertas situaciones también puede ser deseable la formulación de la composición de vacuna para que comprenda un adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen todos los compuestos inmunoestimulantes aceptables tales como, por ejemplo, una citocina, una toxina o una composición sintética. Algunos coadyuvantes usados habitualmente incluyen hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, adyuvantes de Freund y saponina Quil-A. Además de los adyuvantes, puede ser deseable la administración conjunta de modificadores de la respuesta biológica (BRM) con el péptido o la variante o el derivado, para regular por disminución la actividad de los linfocitos T supresores.

Algunos posibles vehículos para la administración de la formulación de vacuna incluyen liposomas. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean compartimentos acuosos. Los liposomas tienen una composición similar a las membranas celulares, y como resultado, los liposomas pueden ser administrados generalmente de una forma segura y biodegradable. Las técnicas para la preparación de liposomas y la formulación (por ejemplo, la encapsulación) de diversas moléculas, incluyendo péptidos y oligonucleótidos, con liposomas, son bien conocidas.

Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares, y pueden variar de tamaño con unos diámetros que varían desde 0,02 μm hasta más de 10 μm. Los liposomas también pueden adsorberse a prácticamente cualquier tipo de célula, y liberar después el agente encapsulado. Alternativamente, el liposoma se fusiona con la célula objetivo, mediante lo cual el contenido del liposoma se vacía en la célula objetivo. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser endocitado por células que son fagocíticas. La endocitosis está seguida por la degradación intralisosómica de los lípidos del liposoma y la liberación de los agentes encapsulados. En el presente contexto, el polipéptido según la invención puede estar localizado en la superficie del liposoma para facilitar la presentación del antígeno sin la alteración del liposoma ni una endocitosis. Independientemente del mecanismo o de la administración, sin embargo, el resultado es la disposición intracelular del polipéptido asociado.

Los vectores liposomales pueden ser aniónicos o catiónicos. Los vectores liposomales aniónicos incluyen liposomas sensibles al pH que se alteran o se fusionan con la membrana endosómica después de la endocitosis y la acidificación del endosoma. Los liposomas catiónicos se prefieren para la mediación en la transfección de células de mamífero in vitro, o para la administración en general de ácidos nucleicos, pero se usan para la administración de otros productos terapéuticos, tales como péptidos.

Otros liposomas adecuados que se usan en los procedimientos de la invención incluyen vesículas multilaminares (MLV), vesículas oligolaminares (OLV), vesículas unilaminares (UV), pequeñas vesículas unilaminares (SUV), vesículas unilaminares de tamaño medio (MIN), grandes vesículas unilaminares (LUV), vesículas unilaminares

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gigantes (GUV), vesículas multivesiculares (MVV), vesículas individuales u oligolaminares elaboradas mediante un procedimiento de evaporación en fase inversa (REV), vesículas multilaminares elaboradas mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa (MLV-REV), vesículas plurilaminares estables (SPLV), MLV congeladas y descongeladas (FATMLV), vesículas preparadas mediante procedimientos de extrusión (VET), vesículas preparadas mediante una prensa francesa (FPV), vesículas preparadas mediante fusión (FUV), vesículas de deshidratación-rehidratación (DRV) y burbujosomas (BSV). Las técnicas para la preparación de estos liposomas son bien conocidas en la materia.

También se contemplan otras formas de administración de partículas, por ejemplo, microesferas y similares, para la administración de los epítopos o poliepítopos peptídicos.

Alternativamente pueden producirse vacunas basadas en ácidos nucleicos que comprendan un ácido nucleico, tal como, por ejemplo, ADN o ARN, que codifique el epítopo o poliepítopo peptídico inmunológicamente activo, y clonarse en un vector adecuado (por ejemplo, un vector de la variolovacuna, de la viruela del canario, de adenovirus

o de un virus eucariota).

Alternativamente, el polipéptido puede ser administrado en forma de una vacuna celular a través de la administración de APC autólogas o alogénicas o de células dendríticas que han sido tratadas in vitro de forma que presenten el péptido en su superficie. Podrían usarse las cepas Salmonella enterica o de Escherichia coli portadoras de mutaciones que reduzcan su virulencia y les permitan colonizar un animal hospedador sin provocar la enfermedad, para la administración de los antígenos de la vacuna, especialmente para la administración a animales no humanos. Las bacterias usadas podrían incluir cepas que ya se están usando como vacuna en el ganado, en el que la lesión atenuante no está completamente caracterizada. Además, podrían usarse cepas en las que se han introducido deliberadamente mutaciones en la bacteria para atenuar racionalmente la virulencia, para la administración del toxoide épsilon. Dichas mutaciones incluyen las de la ruta de shikimato, la ruta de la biosíntesis de la purina, mutaciones en los genes que codifican la ciclasa de adenilato (cya) y la proteína del receptor camp (crp) o mutaciones en los genes phoP y phoQ, implicados en el sistema regulador bicomponente. Se han estudiado otras cepas mutadas racionalmente que incluyen aquellas con deleciones en los genes implicados en la biosíntesis del peptidoglicano, la recombinación del ADN y la reparación o la metilación del ADN. Las bacterias que son capaces de colonizar normalmente el intestino pero que no son patógenas, tales como cepas de Lactobacillus sp. o de Lactococcus sp. o de Bacillus subtilis, también podrían usarse para la administración de los antígenos de la vacuna. En el caso de B. subtilis, el antígeno de la vacuna podría ser expresado en la célula vegetativa o en la espora. El antígeno también podría ser administrado en forma de una vacuna de ADN desnudo en la que el gen que codifica el toxoide épsilon es clonado en un vector de expresión de mamífero y expresado en un promotor eucariota.

Dicha metodología, por ejemplo, mediante el uso de Salmonella, ofrece diversas ventajas. En primer lugar pueden administrarse por vía oral vacunas de Salmonella viva (la vía de infección natural), permitiendo una vía de administración de la vacuna no invasiva. En segundo lugar, pueden desencadenarse las respuestas inmunitarias tanto de la mucosa como sistémica, lo que puede ser importante para la protección frente a la infección. Además, las vacunas de Salmonella viva atenuada son capaces de simular las respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares que pueden ser importantes para la protección frente a la enfermedad. Finalmente, dado que Salmonella es manejable genéticamente, las vacunas de Salmonella recombinantes son relativamente fáciles de desarrollar y también son relativamente rentables de producir.

Una de las clases más ampliamente estudiadas de Salmonella atenuada usada como portador de antígenos foráneos son auxótrofas. Por ejemplo, se han construido mutantes definidas genéticamente del gen aroA, que codifica la sintasa de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato, tanto en S. enterica var. Typhimurium como en la var. Typhi. Estos mutantes están atenuados y son inmunógenos en ratones. Algunos ejemplos de otros mutantes auxótrofos incluyen Salmonella con deleciones en los genes implicados en la ruta biosintética de la purina. Otro grupo bien estudiado de Salmonella atenuadas son mutantes que tienen deleciones definidas en los genes implicados en la regulación de la virulencia de la Salmonella. Por ejemplo, las mutaciones en los genes que codifican la ciclasa de adenilato (cya) y la proteína del receptor camp (crp) afectan a la expresión de los genes implicados.

En una realización, la composición de vacuna puede estar incluida en un producto alimenticio (es decir, un material alimenticio adecuado para su consumo por parte de un ser humano o de un animal) que comprende un polipéptido y/o un polinucleótido y/o un vector y/o una célula y/o una vacuna subunitaria y/o una composición de vacuna según los aspectos precedentes de la invención. Ésta puede estar, en algunos ejemplos no limitantes, en forma de pellas, granulados o una pulpa, que pueden comprender adicionalmente, de nuevo únicamente como ejemplo, componentes de granos, de pasto y/o de proteína. La composición también puede estar incluida en líquidos para bebida y/o ser administrada a través de un pulverizador en la atmósfera que rodea al animal, que consecuentemente, es inhalada por el animal.

Si la composición de vacuna es para su administración a un sujeto humano, puede estar en una forma adecuada para su administración por vía oral (por ejemplo, en un complemento dietético) y/o parenteral, por ejemplo, mediante una inyección, una inhalación o mediante una administración transdérmica a través de un parche, una loción o un gel. Las formas particulares descritas anteriormente también son útiles generalmente para su administración a un sujeto humano.

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Se cultivaron de forma rutinaria células MDCK.2 (ATCC-LGC Standards, Teddington, Reino Unido) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) complementado con un 10 % de suero bovino fetal Gold (PAA, Pasching, Austria) a 37 ºC en una atmósfera humidificada de un 95 % de aire / 5 % de CO2. El medio de cultivo fue sustituido cada 2-3 días. Las células fueron desprendidas de forma rutinaria mediante una incubación en tripsina/EDTA y divididas según fuera apropiado (normalmente en diluciones de 1:6).

Clonación de la prototoxina épsilon recombinante (P-Etx)

El gen que codifica la prototoxina épsilon, etxD, de la cepa NCTC 8346 de C. perfringens de tipo D, fue amplificado mediante una PCR y clonado en el plásmido PC10 según describen Oyston et al. (1998). Posteriormente el gen etxD fue amplificado mediante una PCR a partir del plásmido pC10 mediante el uso de los oligonucleótidos:

5’GGAATTCCCATGGGTAAAGCTTCTTATGATAATGT-3’ (SEEQ ID NO:30)

5’-ATTGCCGCTCGAGTTTTATTCCTGGTGCC-3’ (SEQ ID NO:31)

Estos incorporaban los sitios de restricción NcoI y XhoI, respectivamente (los sitios de escisión de las enzimas de restricción están subrayados). El ciclo de la PCR consistía en 1 min de desnaturalización inicial del ADN de molde a 94 ºC seguido de 25 ciclos a 94 ºC durante 30 s, a 50 ºC durante 30 s y a 72 ºC durante 30 s, seguido de 10 min de una extensión final a 72 ºC. El fragmento amplificado mediante la PCR fue digerido con las endonucleasas de restricción NcoI y XhoI y clonado en el vector de expresión digerido de forma similar pET-26b(+) (Merck, Darmstadt, Alemania). Esto colocó el gen etxD bajo la regulación de la polimerasa de ARN del bacteriófago T7 y fusionado en el extremo N-terminal de la prototoxina (P-Etx) sin los 13 residuos N-terminales (KEISNTVSNEMSK; SEQ ID NO: 32) con el péptido líder PelB, y el extremo C-terminal de la prototoxina a una etiqueta de afinidad de polihistidina (6 x His) para ayudar en la purificación de la proteína. Además, la P-Etx recombinante contiene la mutación H149A (la numeración de los aminoácidos se corresponde con la prototoxina sin la secuencia peptídica N-terminal, la SEQ ID NO: 26), generando una variante de baja toxicidad de la Etx para permitir la manipulación de la toxina activada a un nivel de contención de 2 (Oyston et al. (1998)). El plásmido recombinante que expresa la P-Etx con la mutación H149A (SEQ ID NO: 16) se denomina pET26-b(+)/P-Etx_H149A.

Mutagénesis dirigida

Se introdujeron mutaciones en el gen que codifica la P-Etx mediante el uso del QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, Estados Unidos) según las instrucciones del fabricante. Se usaron pares de cebadores oligonucleotídicos sintéticos (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemania) para cambiar cada codón de tirosina por un codón de alanina. Los cebadores usados para la mutagénesis dirigida están recogidos en la siguiente Tabla 2. Para la creación de los mutantes de Tyr, el plásmido pET26-b(+)/P-Etx_H149A sirvió de molde, salvo que se indique de otro modo. La presencia de las mutaciones previstas fue verificada mediante la secuenciación del ADN (Source BioScience, Cambridge, Reino Unido).

Expresión y purificación de la prototoxina épsilon recombinante (P-Etx) y de sus derivados

La P-Etx recombinante y sus derivados fueron expresados en células de E. coli Rosetta 2 (DE3) (Merck, Darmstadt, Alemania) cultivadas en medio de autoinducción ZYM-5052 (Studier et al. (2005)) complementado con 50 μg/ml de kanamicina y 34 μg/ml de cloranfenicol. Las células (100 ml) se cultivaron a 37 ºC durante 2-3 h y se cultivaron durante 24 h adicionales a 20 ºC.

Para la purificación de la proteína, las células fueron recogidas mediante una centrifugación y se extrajeron 2 g de la pasta celular con 10 ml de un reactivo de extracción de proteínas Bugbuster (Merck, Darmstadt, Alemania) que contiene 10 μl de lisozima (1 KU/μl) (Merck, Darmstadt, Alemania) y 10 μl de nucleasa de benzonasa (25 u/μl) (Merck, Darmstadt, Alemania). La suspensión de células se incubó en una mezcladora rotatoria a baja velocidad durante 25 min a la temperatura ambiente y se centrifugó a 16.000 x g durante 20 min a 4 ºC para separar las fracciones soluble (sobrenadante) e insoluble (sedimento). El sobrenadante se aplicó a una columna His GraviTrap (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) siguiendo las directrices del fabricante. En resumen, las proteínas con la etiqueta de His se unieron a la columna de afinidad mediante el uso de un tampón formado por fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, a pH 7,4. La columna se lavó con un tampón formado por fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 60 mM, a pH 7,4. La P-Etx se eluyó en un tampón formado por fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, a pH 7,4. Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 4 ºC. El eluído que contenía la P-Etx se aplicó a una columna PD-10 Desalting (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Reino Unido) para el intercambio del tampón y una limpieza adicional de la muestra. La P-Etx se eluyó de la columna PD-10 en tampón de fosfato 10 mM, cloruro de potasio 2,7 mM, NaCl 137 mM, a pH 7,4. Las concentraciones de la proteína se determinaron mediante el uso del ensayo del BCA (Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough, Reino Unido) y la proteína se almacenó en alícuotas a 80 ºC.

La pureza de la P-Etx y de sus derivados se confirmó mediante una SDS-PAGE. Las proteínas se resolvieron mediante geles Bis-Tres NuPAGE al 4-12 % (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) mediante el uso de un aparato Surelock Xcell (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) y tampones de análisis de MES SDS NuPAGE (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido). Todas las muestras se calentaron antes de su carga a 95 ºC durante 5 min en tampón de muestra de LDS NuPAGE (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) que contiene ditiotreitol 0,1 M (DTT). Los geles se

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analizaron normalmente a 200 V durante 45 min. Después de la separación electroforética, las proteínas se visualizaron mediante una tinción SimplyBlue (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante el uso de pilas de transferencia iBlot (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) y un aparato iBlot (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Para la detección de la P-Etx se usó un anticuerpo monoclonal específico de la etiqueta de His conjugado con peroxidasa de rábano picante (Merck, Darmstadt, Alemania). Se usaron patrones de peso molecular teñidos previamente (Merck, Darmstadt, Alemania) como marcadores. El lisado de E. coli Rosetta 2 (DE3)/pET26-b(+) sirvió como control negativo.

Tratamiento con tripsina de la prototoxina épsilon (P-Etx)

Para los ensayos de citotoxicidad, la P-Etx purificada se activó con tripsina de páncreas bovino para generar la toxina activa (Etx). La tripsina se preparó en PBS y se añadió a la prototoxina en una proporción de 1:100 (p:p) y se incubó a la temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió un cóctel inhibidor de la proteasa exento de EDTA (Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough, Reino Unido) al sobrenadante para inhibir la tripsina residual de las muestras. La conversión de la prototoxina en la toxina fue evaluada mediante una SDS-PAGE.

Análisis del espectro de DC de la prototoxina épsilon recombinante purificada y de sus variantes

Para confirmar que las mutaciones de Tyr no alteran la estructura secundaria a las proteínas, los mutantes purificados se analizaron mediante una espectroscopia de DC (King’s College, Londres).

Ensayo de citotoxicidad

La actividad citotóxica de las toxinas épsilon activadas con tripsina frente a las células MDCK.2 fue determinada mediante la medición de la liberación de la deshidrogenasa de lactato (LDH) desde las células necróticas mediante el uso del kit de ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (Promega UK, Southampton, Reino Unido) según el protocolo del fabricante. En resumen, se preparó una serie de diluciones dobles de cada toxina activada (que varían 3 μM hasta 1,46 nM) en PBS y se añadieron a las células MDCK.2 sembradas en placas de 96 pocillos (2 x 104 células/pocillo). Después de una incubación a 37 ºC durante 3 horas, se recogió el medio de cultivo celular (50 μl) de las monocapas de la muestra y se transfirió a nuevas placas de ensayo enzimático de 96 pocillos y se añadieron 50 μl de mezcla de sustrato reconstituido a cada pocillo. La placa se incubó durante 30 min a la temperatura ambiente, protegida de la luz. Se leyó la absorbancia a 490 nm mediante el uso de un lector de microplacas Modelo 680 (Bio-Rad). Se determinó la dosis de la toxina necesaria para destruir el 50 % de la monocapa de células (CT50) mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad). Los valores de la absorbancia de cada muestra fueron normalizados sustrayendo el valor de la absorbancia obtenido para el medio de cultivo de las células no tratadas. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado con tres réplicas técnicas en cada uno.

Ensayo de unión

Se usaron ensayos de inmunotransferencia Western en la célula para la medición directa de la unión de la prototoxina purificada y de sus variantes a las células MDCK.2. La prototoxina inactiva se une a los mismos receptores de la superficie celular que la molécula completamente activa, y puede impedir su unión y una toxicidad adicional (Petit et al. (1997)). En resumen, se sembraron placas de microtitulación de 96 pocillos negras con 2 x 104 células MDCK.2/pocillo en medio EMEM que contiene un 10 % de suero bovino fetal. Para permitir la adhesión de las células, las placas se incubaron durante una noche a 37 ºC en una atmósfera humidificada de un 95 % de aire / 5 % de CO2. Al día siguiente las placas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene MgCl2 1 mM y CaCl2 1 mM. Se añadió cada prototoxina purificada por afinidad a los pocillos por triplicado que contenían las células MDCK.2 a una concentración final de 5 μM. Las células se incubaron con la prototoxina durante 30 min a 37 ºC en una atmósfera humidificada de un 95 % de aire / 5 % de CO2. Para el control de fondo, se incubaron pocillos por triplicado únicamente con PBS. La toxina no unida se eliminó mediante el lavado de las monocapas de células tres veces con PBS. Después las células se fijaron con formaldehído al 4 % a la temperatura ambiente durante 15 min. Después de lavar las monocapas de células con PBS tres veces, los pocillos se bloquearon durante 1,5 horas mediante el uso de tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, Estados Unidos). La proteína unida fue detectada con una dilución a 1:500 y anticuerpo monoclonal de ratón antietiqueta de His (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) y con una dilución a 1:500 de anticuerpo de IgG de cabra antiratón IRDye 800CW (H + l) (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, Estados Unidos). Se obtuvieron las imágenes de las placas a 800 nm para la detección del anticuerpo secundario marcado con IRDye mediante el uso del sistema de obtención de imágenes por infrarrojos Odyssey CLx (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, Estados Unidos). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado con tres réplicas técnicas en cada uno.

Inmunización de los conejos

La variante de la prototoxina épsilon Y43A/Y209A en un trasfondo natural fue enviada a Immune Systems Ltd para la inmunización de conejos blancos de Nueva Zelanda. Para cada inyección se liofilizaron 1,7 mg de proteína y se usaron para la inmunización de tres conejos. Para la inmunización inicial se usó adyuvante completo de Freund. El resto de las inmunizaciones usaron adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones se llevaron a cabo cada 14 días y se realizó una extracción de sangre el día 107, 9 días después de la última inyección.

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Resultados

Expresión de la prototoxina épsilon recombinante (P-Etx) y de sus variantes en E. coli

La P-Etx recombinante contiene la mutación H149A (la numeración de esta mutación se corresponde con la prototoxina sin el péptido N-terminal, la SEQ ID NO: 26), que hace que la toxina activada por tripsina sea 6 veces menos tóxica para las MDCK y 67 veces menor tóxica en ratones (Oyston et al. (1998)), permitiendo la manipulación de la toxina activada a un nivel de contención de 2. La H149 está localizada en el dominio III de la Etx, en estrecha proximidad con la punta de la horquilla β del dominio II, con la cadena lateral de His enterrada por el péptido Cterminal del dominio III. Por lo tanto, es improbable que la presencia de esta mutación interfiera con la unión al receptor de la Etx, lo que se sugiere que está mediada por el dominio I en el N-terminal. Es probable que la H149A reduzca la citotoxicidad de la Etx interfiriendo bien con la oligomerización o bien con el mecanismo de extensión de la horquilla. Además, el ensayo con células MDCK de la H149A mutante dirigida (EtxB) demostró que la H149 no juega un papel clave en la actividad de la Etx (Payne, et al. (1997) Rev. Med. Microbiol. vol. 8, S31).

Para identificar los residuos implicados en la unión al receptor de la Etx, se clonó el gen que codifica la prototoxina épsilon (P-Etx) en el vector de expresión pET-26b(+) según se describe en Materiales y procedimientos. La P-Etx recombinante contiene el péptido de señalización PelB en lugar del péptido de 13 aminoácidos N-terminal, y una etiqueta de polihistidina C-terminal (6 x His) secuencia abajo de la secuencia peptídica C-terminal, para ayudar a la posterior purificación de la prototoxina mediante una cromatografía de afinidad (Figura 1). El péptido de señalización PelB dirige la proteína P-Etx expresada al periplasma bacteriano, donde su secuencia es eliminada por una peptidasa de señalización.

Para un elevado nivel de expresión de la P-Etx, se transfirió el plásmido recombinante a la cepa lisógena DE3 de E. coli Rosetta 2 portadora de una copia cromosómica del gen de la polimerasa de ARN del bacteriófago T7 bajo el control del promotor lacUV5, y la expresión fue inducida mediante el uso del sistema de autoinducción según describe Studier (2005; Prot. Exp. Purif. vol. 41, 207-234). Como se muestra en la Figura 2A, la proteína P-Etx recombinante es expresada fundamentalmente en la fracción soluble. Se predijo que la P-Etx completa sin la secuencia del péptido de señalización PelB codificaría una proteína de 32,79 kDa. La proteína recombinante tenía un tamaño molecular aparente de 35 kDa (proteína marcada con His) según se detectó mediante una SDS-PAGE y un análisis por inmunotransferencia Western (Figuras 2A, B). La purificación por afinidad de la etiqueta de His dio como resultado un elevado rendimiento de aproximadamente 100 mg de proteína purificada por litro de cultivo. El peso molecular real de la prototoxina fue determinado mediante un análisis por espectrometría de masas, que se correspondía con el peso molecular esperado de 32,79 kDa (Figura 2 C).

Mutagénesis dirigida de la P-Etx para la identificación del papel de las tirosinas en la unión al receptor

Para probar el papel del dominio N-terminal I de la Etx en la unión a la célula, los inventores se dirigieron inicialmente a dos bucles de esta región mediante una mutagénesis por deleción, denominados bucle 1 (ΔK32-I55) y bucle 2 (ΔS201-S220). Sin embargo, las deleciones de los bucles dieron lugar a una inestabilidad en la toxina, ya que la mayor parte de la proteína era expresada en la fracción insoluble, y la purificación de la proteína soluble dio como resultado unos rendimientos que eran poco prácticos para los ensayos adicionales de citotoxicidad y de unión. Para identificar el papel de los bucles 1 y 2 en la unión a la célula, los inventores se concentraron a continuación en la mutagénesis de los residuos individuales de estos bucles. Se seleccionaron seis tirosinas superficiales expuestas para la mutagénesis dirigida, cinco residuos en el bucle 1 (Y29, Y33, Y42, Y43 e Y49) y un residuo en el bucle 2 (Y209), siendo cada una sustituida individualmente por alanina. Cada mutante de Tyr fue expresada y purificada mediante el uso del procedimiento desarrollado para la P-Etx natural. De forma similar a la P-Etx natural, todos los mutantes de Tyr se expresaban fundamentalmente en la fracción soluble, y dieron unos rendimientos y una pureza similares a la P-Etx natural (Figuras 3A, 3B), lo que indica que estas mutaciones no afectan a la estructura de la toxina. Además, los perfiles de digestión de la tripsina de todos los mutantes de Tyr eran idénticos a los de la P-Etx natural, produciendo una toxina activa de menor peso molecular (Figura 3C). Un análisis espectral por DC adicional confirmó que todos los mutantes de Tyr están adoptando una conformación predominantemente en lámina β, similar a la P-Etx natural (datos no mostrados), lo que indica que los mutantes de tirosina única están plegados correctamente.

Actividad citotóxica de los mutantes de tirosina única

La P-Etx recombinante puede ser activada mediante una digestión con tripsina, que elimina un péptido C-terminal junto con la etiqueta de His (Figura 1). Para determinar el efecto de las mutaciones de tirosina única sobre la actividad citotóxica de la Etx, se activó cada prototoxina mutante mediante una digestión con tripsina. Se añadió una serie de diluciones dobles (que varían desde 3 μM hasta 1,46 nM) de cada toxina activada, a células MDCK.2 sembradas en placas de 96 pocillos, según se describe en Materiales y procedimientos. Después de 3 h de incubación a 37 ºC, se recogió en medio de cultivo celular y se midió la citotoxicidad mediante el ensayo de la LDH, que mide cuantitativamente la cantidad de LDH liberada desde el citosol de las células lisadas en el medio de cultivo celular. La dosis del cultivo tisular de cada toxina que destruye el 50 % de las células (CT50) se determinó mediante un análisis de regresión no lineal y se comparó con la de la Etx "natural" (que comprende la mutación H149A). La actividad citotóxica de las mutantes de tirosina fue expresada como el cambio en el número de veces en la CT50 con

imagen8

imagen9

(continuación)

Cambio de aminoácido

SEQ ID NO Secuencia del cebador a

Y42A_F

41

Y42A_R

42

Y43A_F2

45

Y43A_R2

46

Y49A_F

47

Y49A_R

48

Y209A_F

49 imagen10

Y209A_R

50 imagen11

A149H_F

51

A149H_R

52

a Las bases subrayadas son los codones usados para la sustitución. La numeración de los aminoácidos para las mutaciones de Y se corresponden con la prototoxina con la secuencia peptídica N-terminal (se corresponde con PDB 1UYJ; SEQ ID NO: 3). La numeración de los aminoácidos para la mutación A149H se corresponde con la prototoxina sin la secuencia peptídica N-terminal.

Tabla 3 -identidad de las secuencias incluidas en la solicitud

SEQ ID NO

Identidad de la secuencia

1

toxina épsilon completa con las mutaciones Y43A e Y209A

2

toxina épsilon nativa natural completa

3

secuencia usada para la obtención de la estructura cristalina (PDB ID:1YUJ)

4

toxina épsilon completa con la mutación Y43A, Y209A y H149As

5

toxina épsilon recombinante natural activada con tripsina

6

toxina épsilon recombinante activada con tripsina con las mutaciones Y43A e Y209A

7

toxina épsilon completa con la mutación Y43A

8

toxina épsilon completa con la mutación Y209A

9

toxina épsilon completa con la mutación H149A

10

toxina épsilon completa con la mutación Y43A y H149As

11

toxina épsilon completa con la mutación Y209A y H149As

12

toxina épsilon recombinante completa

13

toxina épsilon recombinante completa con la mutación Y43A

14

toxina épsilon recombinante completa con la mutación Y209A

15

toxina épsilon recombinante completa la mutación Y43A e Y209A

16

toxina épsilon recombinante completa con la mutación H149A

17

toxina épsilon recombinante completa con las mutaciones H149A e Y43A

18

toxina épsilon recombinante completa con las mutaciones H149A e Y209A

19

toxina épsilon recombinante completa con las mutaciones H149A, Y43A e Y209A

20

toxina épsilon recombinante natural activada con tripsina con la mutación Y43A

21

toxina épsilon recombinante natural activada con tripsina con la mutación Y209A

(continuación)

SEQ ID NO

Identidad de la secuencia

22

toxina épsilon recombinante activada con tripsina con la mutación H149A

23

toxina épsilon recombinante activada con tripsina con las mutaciones H149A e Y43A

24

toxina épsilon recombinante activada con tripsina con las mutaciones H149A e Y209A

25

toxina épsilon recombinante activada con tripsina con las mutaciones H149A, Y43A e Y209A

26

toxina épsilon natural sin el péptido N-terminal

27

toxina épsilon natural sin el péptido N-terminal y con la mutación H149A

28

toxina épsilon recombinante sin el péptido líder PelB

29

toxina épsilon recombinante sin el péptido líder PelB con la mutación H149A

Tabla 4 -secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos

SEQ ID NO del ADN

SEQ ID NO de codificación del aminoácido

55

1

56

4

57

6

58

15

59

19

60

25

Claims (1)

1. imagen1