ES2638340T3

ES2638340T3 - Anticuerpo monoclonal contra interleucina-31 de perro

Info

Publication number: ES2638340T3
Application number: ES12748547.2T
Authority: ES
Inventors: Gary F. BAMMERT; Steven A. DUNHAM
Original assignee: Zoetis Services LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2017-10-19
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: EP3653645B1; FI3653645T3; US20190092854A1; US8790651B2; LT4459282T; SI3653645T1; RS60924B1; HRP20241528T1; US20140315251A1; HRP20201634T1; US10421807B2; ME02837B; HUE068353T2; EP4679089A2; PL3842456T3; MX2014000803A; LT2734549T; EP3219729B1; WO2013011407A1; CA2926379A1

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une de forma específica a IL-31 de perro, en el que dicho anticuerpo reduce, inhibe o neutraliza la señalización de pSTAT mediada por IL-31 de perro en un ensayo basado en células.

Description

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canina utilizada en el presente documento para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 56 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de longitud completa de IL-31 canina utilizada en el presente documento para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoácidos de la construcción de IL-31 canina -20N para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 58 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 canina -20N para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 59 es la secuencia de aminoácidos de la construcción de IL-31 canina -40N para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 60 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 canina -40N para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 61 una secuencia de aminoácidos de la construcción de IL-31 canina -60N para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 62 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 canina -60N para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 63 es la secuencia de aminoácidos de la construcción de IL-31 canina 20-122 para la expresión en

E. coli; SEQ ID NO: 64 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 canina 20-122 para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 65 es la secuencia de aminoácidos de la construcción de IL-31 canina 20-100 para la expresión en

E. coli; SEQ ID NO: 66 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 canina 20-100 para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 67 es la secuencia de aminoácidos de la construcción de IL-31 canina 20-80 para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 68 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 canina 20-80 para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 69 es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la construcción de IL-31 felina de longitud completa para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 70 es la secuencia de aminoácidos que corresponde a la construcción de IL-31 felina de longitud completa para la expresión en E. coli; SEQ ID NO: 71 es una secuencia de la cadena ligera variable denominada en el presente documento como FEL34D03-VL-021-1; SEQ ID NO: 72 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la cadena ligera variable denominada en el presente documento como FEL-34D03-VL-021-1; SEQ ID NO: 73 es una secuencia de la cadena pesada variable denominada en el presente documento como FEL-34D03-VH-035-1; SEQ ID NO: 74 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la cadena pesada variable denominada en el presente documento como FEL-34D03-VH-035-1; SEQ ID NO: 75 es la secuencia de aminoácidos para la región constante de la cadena pesada felina denominada en el presente documento como HC-A Felina (N.º de referencia de GenBank AB016710.1); SEQ ID NO: 76 es la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la cadena pesada felina denominada en el presente documento como HC-A Felina (N.º de referencia de GenBank AB016710.1); SEQ ID NO: 77 es la secuencia de aminoácidos para la región constante de la cadena ligera felina denominada en el presente documento como LC-Kappa Felina (N.º de Referencia de GenBank AF198257.1); SEQ ID NO: 78 es la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la cadena ligera felina denominada en el presente documento como LC-Kappa Felina (N.º de referencia de GenBank AF198257.1);

Definiciones

Antes de describir la presente invención en detalle, se definirán varios términos utilizados en el contexto de la presente invención. Además de estos términos, se definen otros en otras partes de la memoria descriptiva, según sea necesario. A menos que en el presente documento se defina otra cosa de forma expresa, los términos de la técnica utilizados en la presente memoria descriptiva tendrán los significados reconocidos en la técnica.

Como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto estipule claramente otra cosa. Por ejemplo, la referencia a “un anticuerpo” incluye una pluralidad de tales anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “que comprende” está destinado a significar que las composiciones y los procedimientos incluyen los elementos señalados, pero sin excluir otros.

Epítopo, como se usa en el presente documento, se refiere al determinante antigénico que reconocen las CDR del anticuerpo. En otras palabras, epítopo se refiere a la porción de cualquier molécula que tenga la capacidad de reconocer, o de unirse a, un anticuerpo. A menos que se indique otra cosa, el término “epítopo” como se utiliza en el presente documento, se refiere a la región de la IL-31 con la que es reactivo un agente anti IL-31.

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Un “antígeno” es una molécula o una porción de una molécula a la que tiene capacidad de unirse un anticuerpo que, de forma adicional, tiene la capacidad de ser reconocido por, y unirse a, un anticuerpo (la correspondiente región de unión a anticuerpo puede denominarse como un paratopo). En general, los epítopos consisten en agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activas, por ejemplo, cadenas laterales de aminoácidos o azúcares, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

La expresión “de forma específica”, en el contexto de la unión de anticuerpos, se refiere a la alta avidez y/o alta afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno específico, es decir, un polipéptido o epítopo. En muchas realizaciones, el antígeno específico es un antígeno (o un fragmento o subfracción de un antígeno) utilizado para inmunizar al hospedador animal del que se han aislado células productoras de anticuerpos. La unión de forma específica de un anticuerpo a un antígeno es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a otros antígenos. Los anticuerpos que se unen de forma específica a un polipéptido pueden tener la capacidad de unirse a otros polipéptidos a un nivel débil pero detectable (por ejemplo, el 10 % o menos de la unión mostrada con el polipéptido de interés). Tal unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible de la unión específica de un anticuerpo a un polipéptido objeto, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados. En general, los anticuerpos específicos se unen a un antígeno con una afinidad de unión con una KD de 10-7 M o menos, por ejemplo, 10-8 M o menos (por ejemplo, 10-9 M o menos, 10-10 o menos, 10-11 o menos, 10-12 o menos o 10-13 o menos, etc.).

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta que tiene dos cadenas ligeras y dos pesadas. Por lo tanto, un anticuerpo aislado individual, o un fragmento, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico o un anticuerpo caninizado. El término “anticuerpo” se refiere preferentemente a anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, y a equivalentes de unión inmunológicos de los mismos que pueden unirse a la proteína IL-31 o fragmentos de la misma. El término anticuerpo se utiliza para referirse a una molécula homogénea o a una mezcla tal como un producto sérico compuesto de una pluralidad de distintas entidades moleculares.

“Anticuerpos nativos” e “inmunoglobulinas nativas” son habitualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que la cantidad de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los distintos isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracadena espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. La FIG. 2 es un ejemplo de la estructura general de una inmunoglobulina G (IgG) de ratón nativa, que destaca el sitio de unión a antígeno.

La expresión “fragmento de anticuerpo” se refiere a menos que una estructura de anticuerpo intacta, que incluye, pero sin limitación, una cadena de anticuerpo individual aislada, una construcción Fv, una construcción Fab, una construcción Fc, una secuencia de la región variable de la cadena ligera o determinante de complementariedad (CDR), etc.

La expresión región “variable” comprende la región marco conservada y las CDR (conocidas de otra forma como hipervariables) y se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren en secuencia de forma extensa entre anticuerpos, y se utilizan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de forma uniforme a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman la regiones marco conservadas (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno múltiples FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina β, conectados por tres regiones hipervariables, que forman bucles de conexión y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina α. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat, y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), páginas 647-669). Los dominios constantes no están implicados de forma directa en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

La expresión “región hipervariable”, cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácido de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (Kabat, y col. (1991), citado anteriormente) y/o los restos de un “bucle hipervariable” (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987). Los restos de la “región marco conservada” o “FR” son los restos del dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable, como se define en el presente documento.

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La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y aún tiene la capacidad de entrecruzar antígeno.

“Fv” es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión al antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De forma colectiva, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y de unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos al extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en el presente documento para Fab’, en que el resto (o restos) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos Fab’ que tenían cisteínas de la bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno

o dos tipos claramente distintos, llamados kappa (κ) y lambda (λ), a base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a distintas clases. Actualmente existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2 (según se define por la designación en ratón y ser humano). Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se llaman alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulina son bien conocidas en múltiples especies. La prevalencia de los isotipos individuales y las actividades funcionales asociadas con estos dominios constantes son específicos de especie y deben definirse de forma experimental.

“Anticuerpo monoclonal”, como se define en el presente documento, es un anticuerpo producido por un único clon de células (en concreto, un único clon de células de hibridoma) y, por lo tanto, es un único tipo homogéneo puro de anticuerpo. Todos los anticuerpos monoclonales producidos a partir del mismo clon son idénticos y tienen la misma especificidad antigénica. El término “monoclonal” concierne a un único clon de células, a una única célula y a la progenie de esa célula.

En el presente documento, los anticuerpos monoclonales incluyen, de forma específica, anticuerpos (inmunoglobulina) “quiméricos”, en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos obtenidos de una especie particular, mientras que la cadena (o cadenas) restante es idéntica u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos de otra especie, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Normalmente, los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de las cadenas ligera y pesada se han construido, normalmente, mediante ingeniería genética, a partir de los genes de la región variable y constante de anticuerpos que pertenecen a distintas especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a los segmentos constantes de cánido. La FIG. 3 es una representación esquemática de la estructura general de una realización de una IgG de ratón: cánido. En esta realización, el sitio de unión a antígeno se obtiene de ratón mientras que la porción FC es de cánido.

Las formas “caninizadas” de anticuerpos no caninos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos modificados por ingeniería genética que contienen una secuencia mínima obtenida de una inmunoglobulina que no es canina. Los anticuerpos caninizados son secuencias de inmunoglobulinas caninas (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de la región hipervariable del receptor se reemplazan con restos de la región hipervariable de una especie que no es canina (anticuerpo donante), tal como de ratón, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de las secuencias de inmunoglobulina canina se reemplazan con los correspondientes restos no caninos. Adicionalmente, los anticuerpos caninizados pueden incluir restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar aún más el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo caninizado incluirá de forma sustancial todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden con las de una secuencia de inmunoglobulina que no es canina y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina canina. El anticuerpo caninizado, de forma opcional, comprenderá una región constante (Fc) de inmunoglobulina completa, o al menos

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una porción, normalmente la de una secuencia de inmunoglobulina canina. La FIG. 4 es una ilustración de una realización que muestra la especificación o caninización de una IgG de ratón. En esta realización, las CDR de ratón se injertan en regiones marco conservadas caninas.

Las formas “felinizadas” de anticuerpos no felinos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos modificados por ingeniería genética que contienen mínimas secuencias obtenidas de una inmunoglobulina no felina. Los anticuerpos felinizados son secuencias de inmunoglobulina felina (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de la región hipervariable del receptor se reemplazan con restos de la región hipervariable de una especie no felina (anticuerpo donante), tal como de ratón, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de las secuencias de inmunoglobulina felina se reemplazan con los correspondientes restos que no son de felino. Adicionalmente, los anticuerpos felinizados pueden incluir restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar aún más el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo felinizado incluirá sustancialmente todos o al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una secuencia de inmunoglobulina no felina y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina felina. De forma opcional, el anticuerpo felinizado también comprende una región constante (Fc) de inmunoglobulina completa, o al menos una porción, normalmente la de una secuencia de inmunoglobulina felina.

El término “heteroquimérico”, como se define en el presente documento, se refiere a un anticuerpo en el cual una de las cadenas de anticuerpo (pesada o ligera) está caninizada mientras que la otra es quimérica. La FIG. 5 representa una realización de una molécula heteroquimérica. En esta realización, una cadena pesada variable caninizada (en donde todas las CDR son de ratón y todas las FR son de cánido) está emparejada con una cadena ligera variable quimérica (en donde todas las CDR son de ratón y todas las FR son de ratón). En esta realización, tanto las cadenas pesada variable como ligera variable están fusionadas con una región constante canina. Un anticuerpo anti IL-31 “variante”, se refiere en el presente documento a una molécula que difiere de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti IL-31 “parental” en virtud de la adición, deleción y/o sustitución de uno

o más restos de aminoácido en la secuencia del anticuerpo parental, y conserva al menos una actividad deseada del anticuerpo anti IL-31 parental. Las actividades deseadas pueden incluir la capacidad de unirse al antígeno de forma específica, la capacidad de reducir, inhibir o neutralizar la actividad de la IL-31 en un animal, y la capacidad de inhibir la señalización de pSTAT mediada por IL-31 en un ensayo basado en células. En una realización, la variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones hipervariables y/o marco conservadas del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos una, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez, y preferentemente de aproximadamente dos a aproximadamente cinco sustituciones en una o más regiones marco conservadas y/o hipervariables del anticuerpo parental. Normalmente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tenga al menos el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de las cadenas pesada o ligera del anticuerpo parental, más preferentemente al menos el 65 %, más preferentemente al menos el 75 %, más preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 % y muy preferentemente al menos el 95 % de identidad de secuencia. Identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a los restos del anticuerpo parental, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr la máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas, en la secuencia del anticuerpo, se considerará que afecten a la identidad de secuencia u homología. La variante conserva la capacidad de unirse a la IL-31 y, preferentemente, tiene actividades deseadas que son superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede tener una afinidad de unión más fuerte, capacidad potenciada para reducir, inhibir o neutralizar la actividad de la IL-31 en un animal, y/o la capacidad potenciada de inhibir la señalización de pSTAT mediada por la IL-31 en un ensayo basado en células.

Un ácido nucleico "variante", se refiere en el presente documento a una molécula que difiere en secuencia de un ácido nucleico "parental". La divergencia en la secuencia de polinucleótidos puede ser el resultado de cambios mutacionales tales como deleciones, sustituciones o adiciones de uno o más nucleótidos. Cada uno de estos cambios puede producirse solo o en combinación, una o más veces en una secuencia dada.

El anticuerpo "parental", en el presente documento, es uno que está codificado en una secuencia de aminoácidos utilizada para la preparación de la variante. Preferentemente, el anticuerpo parental tiene una región marco conservada canina y, si está presente, tiene la región (o regiones) constante del anticuerpo canino. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo caninizado o canino. Como otro ejemplo, el anticuerpo parental es un anticuerpo monoclonal murino.

El término "aislado" significa que el material (por ejemplo, anticuerpo o ácido nucleico) se separa y/o se recupera de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del material, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Con respecto al ácido nucleico, un ácido nucleico aislado puede incluir uno que se separa de las secuencias 5’ a 3' con las que está normalmente asociado en el cromosoma. En realizaciones preferentes, el material se purificará hasta más del 95 % en peso del material, y muy preferentemente más del 99 % en peso. El material aislado incluye el material in situ dentro de las células recombinantes, dado que al menos un

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A menos que se defina de otra forma, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con los anticuerpos descritos en el presente documento tendrán los significados que un experto en la materia entiende comúnmente. Además, a menos que se requiera otra cosa por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, células y cultivo celulares, biología molecular, proteínas y la química e hibridación de oligo-o polinucleótidos, descritas en el presente documento, son las bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica.

Para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo de tejidos y transfección, se utilizan técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes o como se llevan a cabo comúnmente en la técnica, o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan en general de acuerdo con los procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten en toda la presente memoria descriptiva, véase, por ejemplo, Sambrook y col. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3ª ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) y Ausubel y col. Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), 1993. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, la química analítica, química orgánica sintética y química de medicamentos y farmacéutica, descritas en el presente documento, son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas convencionales se utilizan para la síntesis química, el análisis químico, la preparación farmacéutica, la formulación y suministro, y el tratamiento de pacientes.

Excepto en los ejemplos operativos o cuando se indique otra cosa, todos los números que expresen cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en el presente documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente".

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales recombinantes y sus usos en procedimientos clínicos y científicos, incluyendo procedimientos de diagnóstico. Con el advenimiento de los procedimientos de biología molecular y la tecnología recombinante, es posible producir anticuerpos y moléculas de tipo anticuerpo por medios recombinantes y, de este modo, generar secuencias génicas que codifican secuencias de aminoácidos específicas encontradas en la estructura polipeptídica de los anticuerpos. Tales anticuerpos pueden producirse ya sea clonando las secuencias génicas que codifican las cadenas polipeptídicas de dichos anticuerpos o mediante síntesis directa de dichas cadenas polipeptídicas, con el ensamblaje de las cadenas sintetizadas, para formar estructuras tetraméricas activas (H2L2) con afinidad por epítopos y determinantes antigénicos específicos. Esto ha permitido la producción fácil de anticuerpos que tienen características de secuencias de anticuerpos neutralizantes de distintas especies y fuentes.

Independientemente de la fuente de los anticuerpos o de cómo se construyen de forma recombinante, o de cómo se sintetizan, in vitro o in vivo, utilizando animales transgénicos, grandes cultivos celulares de tamaño de laboratorio o comercial, utilizando plantas transgénicas o mediante síntesis química directa empleando organismos no vivos en cualquier fase del procedimiento, todos los anticuerpos tienen una estructura tridimensional global similar. Esta estructura a menudo se proporciona como H2L2 y se refiere al hecho de que los anticuerpos comúnmente comprenden dos cadenas de aminoácidos ligeras (L) y dos cadenas de aminoácidos pesadas (H). Ambas cadenas tienen regiones que tienen la capacidad de interactuar con una diana antigénica estructuralmente complementaria. Las regiones que interactúan con la diana se denominan como regiones "variables" o "V", y se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de distinta actividad antigénica. Las regiones variables de las cadenas H o L contienen las secuencias de aminoácidos que tienen la capacidad de unirse de forma específica a las dianas antigénicas.

La expresión “región de unión a antígeno”, como se usa en el presente documento, se refiere a la porción de una molécula de anticuerpo que contiene los restos de aminoácido que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad para el antígeno. La región de unión del anticuerpo incluye los restos de aminoácido de la "región marco conservada" necesarios para mantener la conformación apropiada de los restos de unión a antígeno.

Dentro de las regiones variables de las cadenas H o L que proporcionan las regiones de unión a antígeno, hay secuencias más pequeñas llamadas "hipervariables" debido a su extrema variabilidad entre anticuerpos de distinta especificidad. Tales regiones hipervariables también se denominan como "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Estas regiones CDR suponen la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica particular.

Las CDR representan tramos no contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables pero, independientemente de la especie, se ha encontrado que los emplazamientos posicionales de estas secuencias de aminoácidos críticas dentro de las regiones de las cadenas pesada y ligera variables tienen emplazamientos similares dentro de las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas pesada y ligera variables de todos los anticuerpos tienen tres regiones CDR, cada una no continua con la otra.

En todas las especies de mamífero los péptidos de anticuerpo contienen regiones constantes (es decir, altamente

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conservadas) y variables, y dentro de las últimas, existen las CDR, y las denominadas "regiones marco conservadas" compuestas de secuencias de aminoácidos dentro de la región variable de la cadena pesada o ligera, pero fuera de las CDR.

Respecto al determinante antigénico reconocido por las regiones CDR del anticuerpo, este se denomina también "epítopo". En otras palabras, epítopo se refiere a la porción de cualquier molécula que tiene la capacidad de ser reconocida por, y de unirse a, un anticuerpo (la correspondiente región de unión al anticuerpo puede denominarse como un paratopo).

Un “antígeno” es una molécula o una porción de una molécula a la que un anticuerpo tiene la capacidad de unirse, que adicionalmente tiene la capacidad de inducir que un animal produzca un anticuerpo que tenga la capacidad de unirse a un epítopo del antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. La reacción específica a la que se hace referencia anteriormente está destinada a indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden evocar los otros antígenos.

El término “anticuerpo” pretende incluir tanto moléculas de inmunoglobulina intactas como porciones, fragmentos, péptidos y derivados de los mismos tales como, por ejemplo, Fab, Fab’, F(ab')2, Fv, Fse, regiones CDR, paratopos o cualquier porción o secuencia peptídica del anticuerpo que tenga la capacidad de unirse a un antígeno o epítopo. Se dice que un anticuerpo tiene “la capacidad de unirse” a una molécula si tiene la capacidad de reaccionar de forma específica con la molécula para que, de este modo, la molécula se una al anticuerpo.

Anticuerpo también incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos heteroquiméricos o anticuerpos caninizados, así como fragmentos, porciones, regiones, péptidos o derivados de los mismos, proporcionados mediante cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitación, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes. Tales anticuerpos de la presente invención tienen la capacidad de unirse de forma específica a la IL-31 de perro. Los fragmentos o porciones de anticuerpo pueden carecer del fragmento Fc del anticuerpo intacto, eliminarse más rápidamente de la circulación y pueden tener una unión de tejido no específica menor que la de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo pueden producirse a partir de anticuerpos intactos utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante escisión enzimática con enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Véase, por ejemplo, Wahl y col., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983). Las porciones de anticuerpos pueden fabricarse mediante cualquiera de los procedimientos anteriores o pueden fabricarse expresando una porción de la molécula recombinante. Por ejemplo, la región (o regiones) CDR de un anticuerpo recombinante puede aislarse y subclonarse en el vector de expresión apropiado. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.º 6.680.053.

Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los clones 11E12, 34D03 y 19D07

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona nuevos anticuerpos monoclonales que se unen de forma específica a la IL-31 de perro. En una realización, un anticuerpo monoclonal de la invención se une la IL-31 de perro e impide su unión a, y la activación de, su complejo correceptor que comprende el receptor de IL-31 A (RIL31a) y el receptor específico de Oncostatina-M (ROsm o RIL-31b). Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se identifican en el presente documento como "11E12", "34D03" y "19D07", que se refiere al número asignado a su clon de hibridoma. En el presente documento, "11E12", "34D03" o "19D07" también se refiere a la porción del anticuerpo monoclonal, el paratopo o las CDR, que se unen de forma específica con un epítopo de la IL-31 identificado como 11 E12, 34D03 o 19D07, debido a su capacidad para unirse a los anticuerpos 11 E12, 34D03 o 19D07, respectivamente. Las varias formas recombinantes, quiméricas, heteroquiméricas y/o caninizadas de 11 E12, 34D03 y 19D07 descritas en el presente documento pueden denominarse mediante el mismo nombre.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que incluye al menos uno de los siguientes:

una región determinante de complementariedad (CDR)1 de la cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1)

o NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1); una CDR2 de la cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) o TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); una CDR3 de la cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3) o VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH-CDR3); y una variante de las mismas que tengan una o más sustituciones de aminoácido conservativas en al menos una de CDR1, CDR2 o CDR3.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que incluye al menos uno del siguiente grupo:

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una cadena ligera variable (VL) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR)1 que tiene la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL-CDR1) o KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); una CDR2 de la cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) o RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); una CDR3 de la cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3) o QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); y una variante de las mismas que tenga una o más sustituciones de aminoácido conservativas en al menos una de CDR1, CDR2 o CDR3

En otras realizaciones adicionales, un anticuerpo que tenga al menos una de las CDR de la cadena ligera variable descritas anteriormente, puede incluir adicionalmente una de las siguientes CDR de la cadena pesada variable:

una región determinante de complementariedad (CDR)1 de la cadena pesada variable que tenga la secuencia de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) o NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VHCDR1); una CDR2 de la cadena pesada variable que tenga la secuencia de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11 E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) o TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); una CDR3 de la cadena pesada variable que tenga la secuencia de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3) o VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH-CDR3); y una variante de las mismas que tenga una o más sustituciones de aminoácido conservativas en al menos una de CDR1, CDR2 o CDR3.

En algunas realizaciones, el anticuerpo puede incluir al menos uno de los siguientes:

a) una cadena ligera variable que comprende DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPA RFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 19; MU-11 E12-VL), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPD RFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 20; CAN-11 E12-VL-cUn-FW2), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASNLESGVPD RFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 21; CAN-11E12-VL-cUn-13), DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQPPKLLIYGASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22; MU-19D07-VL), EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGASTRESGV PSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 23; CAN-19D07-VL998-1), DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLEAGVPT RFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 24; MU-34D03-VL) o EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLEAGVPS RFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25; CAN-34D03-VL-998-1); b) una cadena pesada variable que comprende QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGGTKYNE TFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARGGTSVIRDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 26; MU11 E12-VH), EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWMGWIFPGDGGTKYN ETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27; CAN -11E12-VH-415-1), EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVATITSGGGYTYSADS VKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 28; MU-19D07 -VH), EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGYTYSA DSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 29; CAN19D07-VH-400-1), EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSYTYYPD NIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 30; MU34D03-VH) o EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSYTYYP DNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 31; CAN34D03-VH-568-1); y

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c) variantes de las mismas que tengan una o más sustituciones de aminoácido conservativas.

En otras realizaciones, la invención proporciona una célula hospedadora que produce un anticuerpo descrito anteriormente.

La presente invención también incluye, dentro de su ámbito, secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo descrito anteriormente, que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti IL-31 de la presente invención. Además, también está incluida dentro del ámbito de la invención cualquier secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia de aminoácidos de 11 E12, 34D03 o 19D07, o péptidos de las mismas.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo descrito anteriormente, que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de los siguientes:

o NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1); una CDR2 de la cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) o TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); una CDR3 de la cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3) o VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH-CDR3); y una variante de las mismas que tenga una o más sustituciones de aminoácido conservativas en al menos una de CDR1, CDR2 o CDR3.

En realizaciones adicionales, el ácido nucleico aislado descrito anteriormente puede incluir adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique al menos uno de los siguientes:

una cadena ligera variable (VL) que comprende una determinante de complementariedad (CDR) 1 que tenga la secuencia de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL-CDR1) o KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); una CDR2 de la cadena ligera variable que tenga la secuencia de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) o RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); una CDR3 de la cadena ligera variable que tenga la secuencia de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3) o QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); y una variante de las mismas que tenga una o más sustituciones de aminoácido conservativas en al menos una de CDR1, CDR2 o CDR3.

La presente invención proporciona adicionalmente un vector que incluye al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente.

Debido a que el código genético es degenerado, puede utilizarse más de un codón para codificar un aminoácido particular. Utilizando el código genético, pueden identificarse una o más secuencias de nucleótidos distintas, cada una de las cuales tendría la capacidad de codificar al aminoácido. La probabilidad de que un oligonucleótido particular constituya, de hecho, la secuencia codificante de XXX real puede estimarse considerando las relaciones de emparejamiento de bases anómalas y la frecuencia con la que un codón particular realmente se utiliza (para codificar un aminoácido particular) en células eucariotas o procariotas que expresan un anticuerpo anti IL-31, una o porción. Tales "reglas de utilización de codones" se desvelan en Lathe, y col., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Utilizando las "reglas de utilización de codones" de Lathe, puede identificarse una única secuencia de nucleótidos, o un conjunto de secuencias de nucleótidos, que contenga una secuencia de nucleótidos teóricamente "más probable" que tenga la capacidad de codificar las secuencias anti IL-31. También se pretende que las regiones que codifican el anticuerpo para su uso en la presente invención puedan proporcionarse también alterando los genes de anticuerpo existentes, utilizando técnicas de biología molecular convencionales que den como resultado variantes (agonistas) de los anticuerpos y de los péptidos descritos en el presente documento. Tales variantes incluyen, pero sin limitación, deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos o péptidos anti IL-31.

Por ejemplo, una clase de sustituciones son las sustituciones de aminoácido conservativas. Tales sustituciones son las que sustituyen un aminoácido dado en un péptido de anticuerpo anti IL-31 por otro aminoácido de características similares. Normalmente se ven como sustituciones conservativas los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los restos hidroxilo de Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los restos amida Asn y Gln, el intercambio de los restos básicos Lys y Arg, el reemplazo entre los restos aromáticos Phe, Tyr y similares. Las directrices respecto a qué cambios de aminoácido son probablemente fenotípicamente silenciosos se encuentra en Bowie y col., 247 Science 1306-10 (1990).

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Los anticuerpos o péptidos anti IL-31 variantes o agonistas pueden ser totalmente funcionales o pueden carecer de función de una o más actividades. Las variantes totalmente funcionales contienen normalmente solo variaciones conservativas o variaciones en restos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener sustituciones de aminoácidos similares que no dan como resultado un cambio de función o dan como resultado uno insignificante. Como alternativa, tales sustituciones pueden afectar en algún grado la función, de forma positiva o negativa. Las variantes no funcionales normalmente contienen una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones o truncamientos de aminoácido no conservativos, o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un resto crítico o región crítica.

Los aminoácidos que son esenciales para la función pueden identificarse por procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida o la mutagénesis mediante alanina. Cunningham y col., 244 Science 1081-85 (1989). El último procedimiento introduce mutaciones de alaninas únicas en cada resto de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se analizan después por su actividad biológica, tal como la unión al epítopo o la actividad ADCC in vitro. Los sitios que son críticos para la unión ligando-receptor también pueden determinarse mediante análisis estructural, tal como cristalografía, resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad. Smith y col., 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos y col., 255 Science 306-12 (1992).

Además, los polipéptidos a menudo contienen aminoácidos distintos de los veinte aminoácidos de "origen natural". Adicionalmente, muchos aminoácidos, que incluyen los aminoácidos terminales, pueden modificarse por procesos naturales, tales como el procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, o por técnicas de modificación química bien conocidas en la técnica. Las modificaciones conocidas incluyen, pero sin limitación, acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, la unión covalente de flavina, la unión covalente de un grupo funcional heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, la unión covalente de fosfatidilinositol, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteínas, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclajes por GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición de aminoácidos a proteínas, mediada por ARN de transferencia, tales como arginilación y ubiquitinación.

Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia y se han descrito con gran detalle en la literatura científica. En textos más básicos, tales como Proteins--Structure and Molecular Properties (2ª ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman & Co., NY, 1993), se describen varias modificaciones particularmente comunes, por ejemplo, glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, carboxilación gamma de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP. En esta materia están disponibles muchas revisiones detalladas, tales como la de Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter y col. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990) y Rattan y col. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).

Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención también abarcan derivados o análogos en los que un resto de aminoácido sustituido no es uno codificado por el código genético.

De forma similar, las adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos, así como las variaciones y modificaciones recién descritas, pueden ser igualmente aplicables a la secuencia de aminoácidos del antígeno y/o epítopo de la IL-31, o péptidos de los mismos. Como se menciona anteriormente, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención son específicamente efectivos en el reconocimiento de la IL-31.

Derivados de anticuerpo

Están incluidos en el ámbito de la presente invención los derivados de anticuerpo. Un “derivado” de un anticuerpo contiene grupos funcionales químicos adicionales que normalmente no son parte de la proteína. Las modificaciones covalentes de la proteína están incluidas en el ámbito de la presente invención. Tales modificaciones pueden introducirse en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácido del anticuerpo que se tienen como objetivo con un agente de derivatización orgánico que tenga la capacidad de reaccionar con las cadenas laterales o restos terminales seleccionados. Por ejemplo, la derivatización con agentes bifuncionales, bien conocida en la técnica, es útil para el entrecruzamiento del anticuerpo, o un fragmento, con una matriz de soporte insoluble en agua o con otros soportes macromoleculares.

Los derivados también incluyen anticuerpos monoclonales que están marcados de forma radioactiva. Por ejemplo, con yodo radioactivo C25I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), indio (111In), tritio (3H) o similar; conjugados de anticuerpos monoclonales con biotina o avidina, con enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucoamilasa, anhidrasa de ácido carboxílico, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, y también conjugados de anticuerpos monoclonales con agentes bioluminiscentes (tales como luciferasa), agentes quimioluminiscentes (tales como ésteres de acridina) o agentes fluorescentes (tales como ficobiliproteínas).

Otro derivado de anticuerpo bifuncional de la presente invención es un anticuerpo biespecífico, generado combinando partes de dos anticuerpos distintos que reconocen dos grupos antigénicos distintos. Esto puede

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leucemia murina de Moloney (Grosschedl y col., 41 Cell 885 (1985)); (b) regiones de corte y empalme y sitios de poliadenilación tales como los obtenidos de la región tardía del SV40 (Okayarea y col., 1983) y (c) sitios de poliadenilación tales como del SV40 (Okayama y col., 1983).

Los genes del ADNc de inmunoglobulina pueden expresarse como se describe en Weidle y col., 51 Gene 21 (1987), utilizando como elementos de expresión el promotor temprano del SV40 y su potenciador, los potenciadores del promotor de la cadena H de inmunoglobulina de ratón, el corte y empalme de ARNm de la región tardía del SV40, la secuencia intermedia de la S-globina de conejo, los sitios de poliadenilación de inmunoglobulina y de la S-globina de conejo, y los elementos de poliadenilación del SV40.

Para los genes de inmunoglobulina compuestos de parte de ADNc, parte de ADN genómico (Whittle y col., 1 Protein Engin. 499 (1987)), el promotor transcripcional puede ser el citomegalovirus humano y los potenciadores de promotor pueden ser de citomegalovirus y de inmunoglobulina de ratón/ser humano, y las regiones de poliadenilación y de corte y empalme de ARNm pueden ser las secuencias de inmunoglobulina cromosómicas nativas.

En una realización, para la expresión de genes de ADNc en células de roedor, el promotor transcripcional es una secuencia de LTR vírico, los potenciadores transcripcionales de promotores son cualquiera o ambos del potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón o el potenciador del LTR vírico, la región de corte y empalme contiene un intrón de más de 31 pb y las regiones de poliadenilación y de terminación de la transcripción se obtienen de la secuencia cromosómica nativa que corresponde a la cadena de inmunoglobulina que se sintetiza. En otras realizaciones, las secuencias de ADNc que codifican otras proteínas se combinan con los elementos de expresión enumerados anteriormente para lograr la expresión de las proteínas en células de mamífero.

Cada gen fusionado puede ensamblarse o insertarse en un vector de expresión. Las células receptoras que tienen la capacidad de expresar el producto del gen de la cadena de inmunoglobulina quimérica se transfectan después de forma individual con un gen que codifica un péptido anti IL-31 o una cadena H quimérica o L quimérica, o se cotransfectan con un gen de la cadena H quimérica y uno de la L quimérica. Las células receptoras transfectadas se cultivan en condiciones que permiten la expresión de los genes incorporados, y las cadenas de inmunoglobulina expresadas o anticuerpos intactos o fragmentos se recuperan del cultivo.

En una realización, los genes fusionados que codifican el péptido anti IL-31 o las cadenas H y L quiméricas, o porciones de los mismos, se ensamblan en vectores de expresión distintos que se usan después para cotransfectar una célula receptora. Como alternativa, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quiméricas pueden ensamblarse en el mismo vector de expresión.

Para la transfección de los vectores de expresión y la producción del anticuerpo quimérico, la línea celular receptora puede ser una célula de mieloma. Las células de mieloma pueden sintetizar, ensamblar y secretar inmunoglobulinas codificadas por los genes de inmunoglobulina transfectados, y poseen el mecanismo para la glucosilación de la inmunoglobulina. Las células de mieloma pueden cultivarse en cultivo o en la cavidad peritoneal de un ratón, en donde la inmunoglobulina secretada puede obtenerse del líquido ascítico. Otras células receptoras adecuadas incluyen células linfoides tales como linfocitos B de origen humano o no humano, células de hibridoma de origen humano o no humano, o células de heterohibridoma interespecies.

El vector de expresión que porta una construcción de anticuerpo quimérico o caninizado, o polipéptido anti IL-31 de la presente invención, puede introducirse en una célula hospedadora apropiada mediante cualquiera de una diversidad de medios adecuados, que incluyen medios bioquímicos tales como la transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, precipitación por fosfato de calcio y aplicación con policationes, tales como dietilaminoetil (DEAE) dextrano, y tales medios mecánicos como electroporación, microinyección directa y bombardeo de microproyectiles. Johnston y col., 240 Science 1538 (1988).

Las levaduras pueden proporcionar ventajas substanciales con respecto a las bacterias para la producción de las cadenas H y L de inmunoglobulina. Las levaduras llevan a cabo modificaciones peptídicas postraduccionales que incluyen la glucosilación. Existen ahora varias estrategias del ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y plásmidos de alto número de copias, que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. La levadura reconoce las secuencias líder de los productos génicos de mamífero clonados y secreta péptidos que portan secuencias líder (es decir, prepéptidos). Hitzman y col., 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, Francia, 1982).

En los sistemas de expresión génica en levadura pueden evaluarse de forma rutinaria los niveles de producción, secreción y la estabilidad de los péptidos, el anticuerpo y los anticuerpos ensamblados murinos y quiméricos, heteroquiméricos, caninizados o felinizados anti IL-31, y fragmentos y regiones de los mismos. Pueden utilizarse cualquiera de una serie de sistemas de expresión génica en levadura que incorporan elementos promotores y de terminación de genes expresados de forma activa, que codifican enzimas glucolíticas producidas en grandes cantidades cuando las levaduras se crecen en medios ricos en glucosa. Los genes glucolíticos conocidos pueden también proporcionar señales muy eficaces de control de la transcripción. Por ejemplo, pueden utilizarse las señales promotoras y terminadoras del gel de la fosfoglicerato quinasa (PGK). Pueden utilizarse varias estrategias para

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evaluar plásmidos de expresión óptima para la expresión en levadura de los ADNc de inmunoglobulina clonados. Véase Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, RU 1985).

También pueden utilizarse cepas bacterianas como hospedadoras para la producción de las moléculas de anticuerpo o péptidos descritos en la presente invención. Los vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y de control que se obtienen de especies compatibles con una célula hospedadora se utilizan en relación a estos hospedadores bacterianos. El vector porta un sitio de replicación, así como genes específicos que tienen la capacidad de proporcionar selección fenotípica en las células transformadas. Pueden utilizarse varias estrategias para evaluar los plásmidos de expresión para la producción de anticuerpos murinos, quiméricos, heteroquiméricos, caninizados o felinizados, fragmentos y regiones o cadenas de anticuerpo codificados por los ADNc de inmunoglobulinas clonados en bacterias (véase Glover, 1985, citado anteriormente; Ausubel, 1993, citado anteriormente; Sambrook, 2001, citado anteriormente; Colligan y col., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001); Colligan y col., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).

Las células de mamífero hospedadoras pueden cultivarse in vitro o in vivo. Las células de mamífero proporcionan modificaciones postraduccionales a las moléculas proteicas de inmunoglobulina, que incluyen la eliminación del péptido líder, el plegamiento y el ensamblaje de las cadenas H y L, la glucosilación de las moléculas de anticuerpo y la secreción de la proteína de anticuerpo funcional.

Las células de mamífero que pueden ser útiles como hospedadores para la producción de proteínas de anticuerpo, además de las células de origen linfoide descritas anteriormente, incluyen células de origen fibroblástico, tales como las células Vero (ATCC CRL 81) o CHO-K1 (ATCC CRL 61).

Están disponibles muchos sistemas de vector para la expresión en células de mamífero de genes clonados de las cadenas H y L de los péptidos anti IL-31 (véase Glover, 1985, citado anteriormente). Pueden seguirse distintas estrategias para obtener anticuerpos H2L2 completos. Es posible coexpresar las cadenas H y L en las mismas células para lograr la asociación intracelular y la unión de las cadenas H y L en anticuerpos H2L2 tetraméricos completos y/o péptidos anti IL-31. La coexpresión puede producirse utilizando los mismos o distintos plásmidos en el mismo hospedador. Los genes para las cadenas H y L y/o los péptidos anti IL-31 pueden colocarse en el mismo plásmido, que después se transfecta en células, seleccionando de esta forma directamente a células que expresan ambas cadenas. Como alternativa, las células pueden transfectarse en primer lugar con un plásmido que codifica una cadena, por ejemplo la cadena L, seguido de la transfección de la línea celular resultante con un plásmido de la cadena H que contiene un segundo marcador de selección. Las líneas celulares que producen péptidos anti IL-31 y/o moléculas H2L2 a través de cualquier ruta, podrían transfectarse con plásmidos que codifican copias adicionales de péptidos, cadenas H, L, o H más L, junto con marcadores de selección adicionales, para generar líneas celulares con propiedades potenciadas, tales como una producción más alta de moléculas de anticuerpo H2L2 ensambladas o una estabilidad potenciada de las líneas celulares transfectadas.

Para una producción de anticuerpos recombinantes prolongada y de alto rendimiento, puede utilizarse expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse técnicamente líneas celulares que expresen de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes víricos de replicación, las células hospedadoras pueden transformarse con casetes de expresión de inmunoglobulinas y un marcador de selección. Después de la introducción del ADN ajeno, se puede permitir que las células técnicamente diseñadas crezcan durante 1-2 días en medio enriquecido y después se cambian a un medio de selección. El marcador de selección del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar el plásmido de forma estable en un cromosoma y crecer para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Tales líneas celulares técnicamente diseñadas pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de compuestos/componentes que interactúan de forma directa o indirecta con la molécula de anticuerpo.

Una vez que se ha producido un anticuerpo de la invención este puede purificarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, en particular de afinidad para el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía en columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. En muchas realizaciones los anticuerpos se secretan de la célula al medio de cultivo y se recogen del medio de cultivo.

Aplicaciones farmacéuticas

Los anticuerpos anti IL-31 de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de afecciones pruriginosas y/o alérgicas en perros. De forma más concreta, la invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, como principio activo, un anticuerpo de acuerdo con la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, heteroquimérico o caninizado de acuerdo con la presente invención. También se prevén las inmunoglobulinas intactas o sus fragmentos de unión, tales como Fab. El anticuerpo y las composiciones farmacéuticas del mismo, de la presente invención, son útiles para la administración parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, vía intramuscular o vía intravenosa.

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reactiva. Los inmunoensayos de flujo lateral son, esencialmente, inmunoensayos adaptados para funcionar a lo largo de un eje único, para ajustarse al formato de tira reactiva. Se han desarrollado como productos comerciales varias variaciones de la tecnología, pero todas funcionan de acuerdo con el mismo principio básico. Una tira reactiva típica consiste en los siguientes componentes: (1) capa de muestra -una capa absorbente sobre la que se aplica la muestra de ensayo; (2) capa de conjugado o reactivo -esta contiene anticuerpos específicos contra el analito diana, conjugados con partículas coloreadas (habitualmente partículas de oro coloidal o microesferas de látex); (3) membrana de reacción -normalmente una membrana de nitrocelulosa hidrófoba o de acetato de celulosa sobre la que se inmovilizan anticuerpos anti analito diana en una línea a través de la membrana, como zona de captura o línea de ensayo (también puede estar presente una zona de control que contiene anticuerpos específicos para los anticuerpos conjugados) y (4) un depósito de mecha o de desechos -una capa absorbente adicional diseñada para extraer la muestra a través de la membrana de reacción mediante capilaridad y recogerla. Los componentes de la tira habitualmente están fijados a un material de refuerzo inerte y pueden presentarse en un formato de varilla individual o dentro de una caja de plástico con un orificio para la muestra y una ventana de reacción que muestra las zonas de captura y de control.

Existen dos tipos principales de inmunoensayo de flujo lateral utilizados en análisis microbiológicos: los ensayos de tipo sándwich de doble anticuerpo y los ensayos competitivos. En el formato de tipo sándwich de doble anticuerpo, la muestra migra desde la capa de la muestra a través de la capa de conjugado, donde cualquier analito diana presente se unirá al conjugado. Después, la muestra continúa migrando a través de la membrana hasta que alcanza la zona de captura, donde el complejo diana/conjugado se unirá a los anticuerpos inmovilizados, produciendo una línea visible en la membrana. Después, la muestra migra más a lo largo de la tira hasta que alcanza la zona de control, donde el conjugado en exceso se unirá y producirá una segunda línea visible en la membrana. Esta línea de control indica que la muestra ha migrado a lo largo de la membrana, como se pretendía. Dos líneas claras en la membrana es un resultado positivo. Una única línea en la zona de control es un resultado negativo. Los ensayos competitivos difieren del formato de tipo sándwich de doble anticuerpo en que la capa de conjugado contiene anticuerpos que ya están unidos al analito diana, o a un análogo del mismo. Si el analito diana está presente en la muestra, este, por lo tanto, no se unirá con el conjugado y permanecerá no marcado. A medida que la muestra migra a lo largo de la membrana y alcanza la zona de captura, un exceso de analito no marcado se unirá a los anticuerpos inmovilizados y bloqueará la captura del conjugado, de forma que no se produce una línea visible. El conjugado no unido se unirá entonces a los anticuerpos en la zona de control, produciendo una línea de control visible. Una única línea de control en la membrana es un resultado positivo. Dos líneas visibles en las zonas de captura y de control es un resultado negativo. Sin embargo, si no está presente un exceso del analito diana no marcado, puede producirse una línea débil en la zona de captura, lo que indica un resultado no concluyente. Existen varias variaciones de la tecnología de flujo lateral. La zona de captura en la membrana puede contener antígenos o enzimas inmovilizados dependiendo del analito diana -en lugar de anticuerpos. También es posible aplicar múltiples zonas de captura para crear una prueba multiplex. Por ejemplo, se han desarrollado tiras reactivas comerciales capaces de detectar las toxinas Shiga ST1 y ST2 de EHEC de forma separada en la misma muestra.

De manera importante, los anticuerpos de la presente invención pueden ser útiles en el diagnóstico de una afección pruriginosa y/o alérgica en perros o gatos. De forma más específica, el anticuerpo de la presente invención puede identificar la expresión aumentada de IL-31 en animales de compañía. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionar una herramienta inmunohistoquímica importante.

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en matrices de anticuerpos, altamente adecuadas para medir perfiles de expresión génica.

Kits

También están incluidos en el ámbito de la presente invención kits para la práctica de los procedimientos objeto. Los kits incluyen al menos uno o más anticuerpos de la presente invención, un ácido nucleico que codifica a los mismos

o una célula que contiene a los mismos. En una realización, puede proporcionarse un anticuerpo de la presente invención, habitualmente en forma liofilizada, en un recipiente. Los anticuerpos, que pueden estar conjugados a un marcador o toxina, o no estar conjugados, se incluyen normalmente en los kits con tampones, tales como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizantes, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, seroalbúmina o similares. En general, estos materiales estarán presentes en menos del 5 % en peso, a base de la cantidad de anticuerpo activo, y habitualmente estarán presentes en una cantidad total de al menos aproximadamente el 0,001 % en peso a base, otra vez, de la concentración del anticuerpo. De manera frecuente, será conveniente incluir un diluyente o excipiente inerte para diluir los principios activos, donde el excipiente puede estar presente en de aproximadamente el 1 % al 99 % en peso de la composición total. Cuando se emplea en el ensayo un segundo anticuerpo que tenga la capacidad de unirse al anticuerpo primario, este habitualmente estará presente en un vial distinto. El segundo anticuerpo normalmente está conjugado a un marcador y está formulado de una manera análoga que las formulaciones de anticuerpo descritas anteriormente. En general, kit incluirá también un conjunto de instrucciones para su uso.

En una realización, un kit de acuerdo con la presente invención es un kit de tira reactiva (kit de inmunoensayo de flujo lateral) útil para la detección de la proteína IL-31 canina en una muestra. Tal tira reactiva normalmente incluye una capa de muestra sobre la que se aplica la muestra de ensayo; una capa de conjugado o de reactivo que

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contiene un anticuerpo específico para la IL-31 canina, en la que el anticuerpo está conjugado a partículas coloreadas (habitualmente partículas de oro coloidal); una membrana de reacción sobre la que están inmovilizados anticuerpos anti IL-31 en una línea a través de la membrana, como una zona de captura o línea de ensayo (también puede estar presente una zona de control, que contiene anticuerpos específicos para los anticuerpos conjugados) y una capa absorbente adicional diseñada para extraer la muestra a través de la membrana de reacción mediante capilaridad, y recogerla. En general, el kit de tira reactiva incluirá también instrucciones de uso.

La invención se describirá ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1 Identificación de anticuerpos monoclonales de ratón que reconocen la Interleucina 31(IL-31) canina

La IL-31 canina recombinante se creó en células CHO utilizando el sistema CHROMOS ACE (Expresión de Cromosoma Artificial) (Chromos Molecular Systems, Inc., Burnaby, Columbia Británica) para generar la proteína IL31 canina secretada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 32. Esta proteína está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33. Se obtuvo el medio condicionado de 400 ml de cultivo celular (línea celular CHO) y se dializó frente a 10 volúmenes de tampón QA (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 20 mM) durante 4,5 horas. El medio dializado se filtró por 0,2 um y se cargó a 1 ml/min en una columna SOURCE™ Q (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) preequilibrada con tampón QA. La proteína se eluyó utilizando un gradiente lineal de etapas múltiples. La mayoría de la IL-31 permaneció en la fracción de flujo continuo (FC), una pequeña cantidad de IL-31 eluyó de forma temprana del gradiente. Previamente se confirmó la identidad de la proteína mediante inmunotransferencia de Western y análisis de espectrometría de masas (MS) de una digestión con tripsina. La proteína de la fracción FC se concentró 4-5 veces y se dializó una noche frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ºC. Se comprobó la estabilidad de la proteína después de la diálisis en PBS. No se observó precipitación y no se observó proteólisis tras varios días a 4 ºC. Los experimentos de desglucosilación utilizando N-glucosidasa F dieron como resultado la condensación de la proteína en una única banda de -15 kDa en SDS-PAGE. La concentración de la proteína se determinó utilizando un ensayo bicinconínico (ensayo BCA) con seroalbúmina bovina (BSA) como patrón (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL). La solución de proteína se dividió en alícuotas, se congeló de forma instantánea (N2 líquido) y se almacenó a -80 ºC.

Los anticuerpos monoclonales de ratón se identificaron utilizando inmunizaciones convencionales de ratones CF-1 hembra con IL-31 canina recombinante producida en células CHO. Los títulos de los ratones inmunizados se determinaron utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La IL-31 canina (50 ng/pocillo) se inmovilizó en microplacas de poliestireno y se utilizó como un antígeno de captura. El suero de los ratones inmunizados se diluyó en solución salina tamponada con fosfato con Tween-20 al 0,05 % (PBST). La presencia de anticuerpos anti-IL-31 canina de ratón se detectó con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc. (KPL, Inc.), Gaithersburg, MD). Después de la adición de un sustrato cromogénico (SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., Gaithersburg, MD) y de una incubación de diez minutos a temperatura ambiente (TA), la reacción se detuvo con la adición de 100 μl de HCl 0,1 N. Se determinó la absorbancia de cada pocillo a una densidad óptica (DO) de 450 nm. La Figura 6 resume la respuesta de anticuerpos de ratones individuales inmunizados con IL-31 canina. Para la fusión se utilizó un conjunto de esplenocitos de donante, de los ratones 3 y 4. Después de la fusión y de la exploración de la unión anti IL-31 a través de ELISA directo, se escogieron 100 pocillos para la expansión y la exploración secundaria de actividad anti IL-31. La exploración secundaria confirmó que 81 fusiones retuvieron la capacidad de producir anticuerpos anti IL-31. Para la evaluación adicional se conservaron reservas congeladas de células y de sobrenadantes de estos 81 candidatos.

Para identificar los candidatos con actividad inhibidora, se evaluó en un ensayo basado en células la capacidad de los 81 sobrenadantes para afectar la señalización de pSTAT mediada por IL-31. Este ensayo basado en células mide la señalización de pSTAT en monocitos DH-82 caninos pretratados durante 24 horas con interferón gamma canino (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 10 ng/ml y privados de suero durante 2 horas antes del tratamiento con IL-31, para aumentar la expresión del receptor de IL-31. Después de este pretratamiento, se añade IL-31 canina recombinante a 1 μg/ml durante 5 minutos y se evalúa la fosforilación de STAT utilizando la tecnología Alpha Screen (Perkin Elmer, Waltham, MA). Dado que las concentraciones y la pureza de los anticuerpos son desconocidas en los sobrenadantes de hibridoma, se midió de forma cualitativa la capacidad de los sobrenadante de inhibir la fosforilación de STAT después de una coincubación de 1 hora con IL-31 1 μg/ml, utilizando diluciones 1:2 o 1:20 de los sobrenadantes. Este experimento identificó 31 sobrenadantes que inhibían >50 % de la fosforilación de STAT con respecto a los pocillos no tratados, justificando de esta forma la purificación y caracterización adicional.

Después de la purificación y la cuantificación de cada anticuerpo monoclonal (Acm), se evaluaron en el ensayo de células DH-82 los valores de la CI50 de los 31 anticuerpos. A base de los valores de CI50 resultantes y de los ELISA competitivos para definir las clases de anticuerpo a base de agrupamientos de epítopos, se avanzó en la caracterización adicional de los tres anticuerpos descritos en la Tabla 1, 11 E12, 19D07 y 34D03.

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Para confirmar la validez de la secuencia de ADNc obtenida de cada una de las cadenas pesada y ligera variables de los anticuerpos, se llevó a cabo un análisis de secuencia N-terminal sobre la proteína del Acm purificado, utilizando degradación de Edman en un secuenciador de proteínas en fase gaseosa modelo 494 de Applied Biosystems. La Tabla 2 describe a continuación la confirmación de las secuencias de la cadena ligera variable para los anticuerpos 11 E12 y 34D03 y la secuencia de la pesada variable de 34D03. El aminoácido N-terminal de la cadena pesada variable del anticuerpo 11 E12, obtenido mediante la traducción de la secuencia de ADNc, se determinó como glutamina. La glutamina, como resto amino terminal de una proteína, puede experimentar ciclizaciones a ácido piroglutámico de forma espontánea, impidiendo la determinación de secuencia mediante degradación de Edman (Chelius y col., Anal Chem. 2006 78(7):2370-6).

TABLA 2*

Cadena ligera variable

Anticuerpo: Secuencia de ADNc traducida Secuencia N-terminal

11E12: DIVLT DIVLT

19D07: DIVMS no ensayado

34D03: DILLT DILLT

Cadena pesada variable

Anticuerpo: Secuencia de ADNc traducida Secuencia N-terminal

11E12: QVQLQ bloqueada

19D07: EVKLV no ensayado

34D03: EVQLV EVQLV

* En la Tabla 2, "DIVLT" corresponde a los restos 1-5 de SEQ ID NO: 19, "DIVMS" corresponde a los restos 1-5 de SEQ ID NO: 22, "DILLT" corresponde a los restos 1-5 de SEQ ID NO: 24, "QVQLQ" corresponde a los restos 1-5 de SEQ ID NO: 26, "EVKLV" corresponde a los restos 1-5 de SEQ ID NO: 28 y "EVQLV" corresponde a los restos1-5 de SEQ ID NO: 30.

Ejemplo 3 Construcción de los anticuerpos quiméricos de 11E12, 19D07 y 34D03

Como se describe anteriormente, los anticuerpos constan de un emparejamiento homodimérico de dos proteínas heterodiméricas. Cada cadena de proteína (una pesada y una ligera) del heterodímero consta de un dominio variable y un dominio constante. Cada dominio variable contiene tres regiones determinantes de complementariedad (las CDR) que contribuyen a la unión al antígeno. Las CDR están separadas en el dominio variable por regiones marco conservadas que proporcionan un armazón para la presentación espacial apropiada de los sitios de unión en el anticuerpo. Juntas, las regiones CDR y las marco conservadas, contribuyen a la capacidad de los anticuerpos de unirse a su antígeno afín (Figura 2).

Como se describe adicionalmente más arriba, un anticuerpo quimérico consiste en la secuencia variable (tanto la CDR como la región marco conservada) del anticuerpo de ratón (como se determina a partir del análisis de secuencia anterior) injertadas en las respectivas regiones constantes pesada y ligera de una molécula de IgG canina (Figura 3). Dado que el dominio variable es responsable de la unión al antígeno, se espera que el injerto del dominio variable de ratón completo en la región constante canina tenga poco o ningún impacto sobre la capacidad del anticuerpo de unirse al inmunógeno IL-31.

Para confirmar de forma simultánea que la secuencia correcta de las regiones variables de la cadena pesada y la ligera se habían identificado y para producir material recombinante homogéneo, se generaron vectores de expresión para producir anticuerpos quiméricos en sistemas de expresión de mamífero. Se diseñaron cebadores directos e inversos para amplificar la región variable de la cadena pesada y la ligera de ratón de la secuencia de anticuerpo obtenida de los hibridomas 11 E12, 19D07 y 34D03. Se incorporó en cada cebador directo un sitio de endonucleasa de restricción exclusivo, la secuencia consenso de Kozak y la secuencia líder de secreción, para facilitar la expresión y la secreción del anticuerpo recombinante en una línea celular de mamífero. Cada cebador inverso se diseñó para amplificar cada respectiva cadena pesada y ligera variable, e incluyó un sitio de restricción exclusivo para facilitar la clonación. Se realizó PCR para amplificar cada cadena pesada y ligera utilizando como molde para cada reacción el ADN clonado de la cadena variable del anticuerpo del hibridoma. Cada producto de PCR se clonó en un plásmido de expresión en mamífero que contenía las regiones constantes de la cadena pesada (denominada en el presente documento como HC-64 o HC-65) o de la ligera (denominada en el presente documento como kappa) de IgG canina, a base de las secuencias del GenBank números de referencia AF354264 o AF354265 y XP_532962, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de HC-64 están representadas por las SEQ ID NO: 40 y 41, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de HC-65 están representadas por las SEQ ID NO: 42 y 43, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de kappa están representadas por la SEQ ID NO: 44 y 45, respectivamente. Los plásmidos que codifican cada cadena pesada y ligera bajo el control del promotor de CMV, se cotransfectaron en células HEK 293 utilizando procedimientos por

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(continuación)

Anticuerpo: Ensayo de pSTAT de DH82 Afinidad por Biacore

Co-incubación CI50 mg/ml Pre-tratamiento CI50 mg/ml: KD (M)

*19D07 quimérico para la cadena pesada, MU-19D07-VH se emparejó con HC-64, y para la cadena ligera, MU19D07-VL se emparejó con kappa. ◘ 34D03 quimérico para la cadena pesada, MU-34D03-VH se emparejó con HC-64, y para la cadena ligera, MU34D03-VL se emparejó con kappa.

Ejemplo 4 Evaluación in vivo de los Acm quiméricos

Para confirmar que la inhibición de la señalización celular mediada por IL-31, observada en el ensayo de DH-82, se correlaciona con la inhibición del prurito mediada por IL-31 en el perro, el anticuerpo monoclonal 11 E12 quimérico descrito anteriormente en la Tabla 3 (11 E12-64 quimérico) se evaluó en el modelo de prurito de perro de IL-31. En este modelo, la IL-31 canina, proporciona por vía intravenosa (IV) a una dosis de 1 a 1,5 μg/kg, produce un rápido inicio de respuesta prurítica consistente que puede cuantificarse a lo largo de un período de dos horas de observación. Para evaluar las respuestas pruríticas, se colocaron los perros en jaulas de alojamiento individuales y las mediciones de actividad pruriginosa se realizaron utilizando video vigilancia. Después de un período de aclimatación de ≥ 1 hora, se determinaron las puntuaciones de prurito de la medida inicial para cada perro utilizando video vigilancia en tiempo real utilizando un sistema de puntuación categórico. En concreto, se tomaron decisiones de tipo "sí/no" a intervalos consecutivos de 1 minuto con respecto a si cada perro presentaba comportamiento prurítico. La presentación de comportamiento prurítico tales como acciones de lamido/mordisqueo de las patas, costados y/o región anal, rascado de los costados, cuello y/o del piso, agitación de la cabeza y deslizamiento de un lado a otro de su trasero sobre el piso de la jaula, fue suficiente para generar una respuesta afirmativa, "sí", durante el intervalo de tiempo designado. Al final de este período, se añadió la cantidad de determinaciones afirmativas, para llegar a un Índice de Puntuación de Prurito (IPP) acumulativo. Las puntuaciones de prurito se determinaron dos veces para cada animal, siendo la primera medición a los 30 minutos de la puntuación de medida inicial medida inmediatamente antes del inicio del período de tratamiento del artículo de ensayo. Tras la finalización de cada período de observación programado, los perros regresaron a sus emplazamientos de alojamiento normales.

Para evaluar si la administración subcutánea (SC) de E12-64 quimérico podía inhibir el prurito mediado por IL-31, se realizó un estudio piloto (76A03) que incluyó tanto un grupo tratado como uno de placebo (N = 4/grupo). En este estudio, las respuestas de medida inicial se realizaron con los 8 perros y dichos perros se asignaron al azar en grupos y se alojaron en función de su IPP. Cabe destacar que, cada grupo consistió en dos respondedores altos (IPP >55) y en dos respondedores moderados (IPP = 30 a 55). Después, a los perros se les administró 11 E12-64 quimérico el día 7 y se realizaron exposiciones a IL-31 los días 8, 14 y 22. Los resultados de este estudio se presentan en la Figura 8. Estos resultados demuestran que la administración de 11 E12-64 quimérico producía una reducción mayor del 75 % del IPP promedio para los días 8 y 14, con respecto al día 1, para los animales tratados con 11 E12-64 quimérico. Esto contrasta con un aumento de 37 -51 % de las puntuaciones IPP para los animales no tratados. El IPP volvió a la medida inicial dos semanas después del tratamiento con Acm, lo que sugiere una duración de la eficacia de entre una y dos semanas para la dosis administrada de 0,3 mg/kg.

Un reto particular cuando se evalúa el IPP, es la variación diaria asociada con el comportamiento prurítico en el perro. Para ayudar a controlar esta variación, se determinó un IPP de medida inicial de 30 minutos para cada perro, el día anterior a la exposición a IL-31. La Figura 9 muestra las puntuaciones de prurito individuales entre los perros incluidos en este estudio (76A60). Los datos de la Figura 9 ilustran que el IPP de medida inicial del día 8 y del día 14 fue de aproximadamente el 25 % de la exposición posterior con IL-31 en el grupo tratado con 11 E12-64 quimérico. Esta observación es coherente con una anulación completa del prurito relacionado con IL-31, dado que el periodo de tiempo de observación de medida inicial (0,5 h) es del 25 % del periodo de tiempo de observación post IL-31 (2 h). En conjunto, estos datos in vivo proporcionan pruebas contundentes de que; 1) el monoclonal 11 E12 quimérico puede neutralizar la capacidad de IL-31 para inducir prurito en perros, 2) la inhibición de la señalización mediada por IL-31 en el ensayo basado en células se correlaciona con la eficacia in vivo y 3) los parámetros necesarios para utilizar este modelo de IL -31 para la evaluación de Acm se establecen para la evaluación de otros anticuerpos candidatos.

Ejemplo 5 Estrategia de Caninización

La generación de anticuerpos antifármaco (AAF) puede asociarse con la pérdida de eficacia de cualquier proteína bioterapéutica, incluyendo los anticuerpos monoclonales. Una evaluación exhaustiva de la biografía ha mostrado que la especiación de los anticuerpos monoclonales puede reducir la propensión de los Acm para ser inmunogénicos, aunque se pueden encontrar ejemplos de Acm inmunogénicos completamente humanos y Acm quiméricos no inmunogénicos. Para ayudar a mitigar los riesgos asociados con la formación de AAF para los anticuerpos monoclonales IL-31 de ratón proporcionados en el presente documento, se empleó una estrategia de caninización. Esta estrategia de caninización se basa en la identificación de las secuencias de anticuerpo de estirpe

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TABLA 4

Anticuerpo: Ensayo de pSTAT de DH82 Afinidad por Biacore

Co-incubación CI50 µg/ml Pre-tratamiento CI50 µg/ml: KD(M)

11E12 de Ratón: 1,61 2,28 8,93E-13

11E12 Caninizado: no activo no activo 5,06E-07

Heteroquimera de 11E12: 2,67 3,35 4,97E-12

11E12 FW2 Caninizado: 2,7 5,31 1,47E-10

11E12 13 Caninizado: 5,49 5,18 5,16E-12

19D07 de Ratón: 1,76 3,46 7,24E-12

19D07 Caninizado: curva inc. curva inc. 9,23E-10

34D03 de Ratón: 1,73 2,28 1,01E-12

34D03 Caninizado: 2,42 2,25 2,91E-11

Anticuerpo: Cadena Variable Pesada Ligera

11E12 Caninizado: CAN-11E12-VH-415-1 CAN-11E12-VL-cUn-1

Heteroquimera de 11E12: CAN-11E12-VH-415-1 11E12 Quimérico

11E12 FW2 Caninizado: CAN-11E12-VH-415-1 CAN-11E12-VL-cUn-FW2

11E12 13 Caninizado: CAN-11E12-VH-415-1 CAN-11E12-VL-cUn-13

19D07 Caninizado: CAN-19D07-VH-400-1 CAN-19D07-VL-998-1

34D03 Caninizado: CAN-34D03-VH-568-1 CAN-34D03-VL-998-1

Cadenas pesadas: Todas las formas caninizadas y heteroquiméricas de 11 E12 incluyen la secuencia de VH de CAN-11E12-VH-415-1 (SEQ ID NO: 27) y la región constante denominada HC-64 (SEQ ID NO: 40); 19D07 caninizado incluía la secuencia de VH de CAN-19D07-VH-400-1 (SEQ ID NO: 29) y HC-64; 34D03 caninizado incluía la secuencia de VH de CAN-34D03-VH-568-1 (SEQ ID NO: 31) y HC-64. Cadenas ligeras: 11E12 caninizado incluía la secuencia de VL de CAN-11E12-VL-cUn-1 (SEQ ID NO: 53) y la región constante denominada kappa (SEQ ID NO: 44); 11E12 heteroquimérico incluía la secuencia de VL de MU-11E12-VL (SEQ ID NO: 19) y kappa; 11E12 FW2 caninizado incluía la secuencia de VL de CAN-11E12-VL-cUn-FW2 (SEQ ID NO: 20) y kappa; 11E12 caninizado incluye la secuencia de VL de CAN-11E12-VL-cUn-13 (SEQ ID NO: 21) y kappa; 19D07 caninizado incluía la secuencia de VL de CAN-19D07-VL-998-1 (SEQ ID NO: 23) y kappa; 34D03 caninizado incluía la secuencia de VL de CAN-34D03-VL-998-1 (SEQ ID NO: 25) y kappa.

Ejemplo 7 Caracterización de la unión de IL-31 de canino con los anticuerpos 11E12 y 34D03

Para determinar los restos de aminoácido implicados en la unión a IL-31 de canino de los anticuerpos 11E12 y 34D03, se utilizó una estrategia mutacional que implicaba 1) el truncamiento de la proteína IL-31 tanto del extremo N como del C y 2) el reemplazo de aminoácidos individuales por alanina (mutagénesis mediante alanina) para determinar el impacto sobre la unión del Acm. Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar un gen de IL-31 de canino que se optimizó con codones para la expresión en un hospedador de E. coli. La secuencia de esta construcción de IL-31 de canino de longitud completa con codones optimizados para la expresión en E. coli se representa en la SEQ ID NO: 55, cuya secuencia de nucleótidos correspondiente es SEQ ID NO: 56. Se diseñaron cebadores para amplificar el gen de longitud completa y para crear truncamientos de 20 aminoácidos de la proteína desplazándose hacia el interior desde los extremos N y C. Con el fin de realizar estos truncamientos N-terminales, la posición 1 correspondía con el resto de glicina inmediatamente después de la etiqueta de 6-His N-terminal en la construcción con codones optimizados. Los productos de amplificación por PCR se clonaron en pET1 01 D (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. El plásmido pET101D permite la fusión de la proteína recombinante con una etiqueta epitópica de 6-His N terminal para la confirmación de la expresión. Los plásmidos con secuencias confirmadas se utilizaron para transformar células de E. coli BL21 Star TOP10 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y se indujo la expresión de la proteína recombinante utilizando Isopropil βD-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM en condiciones de cultivo convencionales. Después de las inducciones, las células se sedimentaron y se lisaron utilizando Reactivos de Extracción de Proteínas Bacterianas (abreviado B-PER, ThermoFisher Scientific Inc., Rockford, IL). Los lisados crudos se sometieron a SDS-PAGE y a transferencia de Western y la transferencia de Western se llevó a cabo como se describió anteriormente. Todas las transferencias de Western para el análisis mutacional se realizaron utilizando las versiones de ratón de 11 E12 y 34D03 debido a la disponibilidad de los anticuerpos purificados y reactivos necesarios. Se analizó la capacidad de cada anticuerpo para unirse a la transferencia de lisado de proteína crudo, que representaba IL-31 de longitud completa y truncada. Las transferencias de control también se sondaron con el Acm anti-His para confirmar la expresión de cada proteína. Las proteínas con un truncamiento N-terminal (-20N, -40N y -60N) mostraron todas una expresión fuerte en E. coli y tenían la capacidad de unirse a 11 E12 y a 34D03 (Figura 13). Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos que

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esterilizó por filtración antes de su uso. El anticuerpo resultante era más del 99 por ciento monomérico mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica, sin observarse agregados de alto peso molecular. Este anticuerpo se utilizó posteriormente para la evaluación en el modelo de prurito de perro para evaluar la eficacia in vivo.

Ejemplo 9 Evaluación del anticuerpo 34D03 caninizado en el modelo de prurito de perro

La actividad antipruriginosa de 34D03 caninizado (CAN 34D03-65 representado por SEQ ID NO 31 (VH) emparejada con SEQ ID NO 25 (VL) en SEQ ID NO 42 (HC-65) y SEQ ID NO 44 (LC-Kappa)) se evaluó utilizando un modelo canino de prurito inducido por IL-31. Con este modelo, se suministró de forma repetida una dosis intravenosa de 1,5 μg/kg de IL-31 canina recombinante que se sabe que induce un periodo transitorio de comportamiento prurítico en perros Beagle (exposición a IL-31, duración del prurito < 24 horas) antes y hasta 63 días después de una sola dosis SC de CAN 34D03-65 1,0 mg/kg. En cada periodo de exposición a IL-31, se utilizó video vigilancia en tiempo real para obtener una medida del comportamiento prurítico durante 0,5 horas antes del suministro de la citocina (periodo de medida inicial pre-IL-31) seguido de una medición similar de 2 horas que comenzó 20 minutos tras la inyección de citocina (periodo de exposición post-IL-31 de 2 h). Las puntuaciones de prurito se generaron en cada periodo de tiempo bajo evaluación haciendo determinaciones de tipo “si/no” si se presentaba un comportamiento prurítico durante intervalos de tiempo consecutivos de 1 minuto (puntuación de prurito máxima = 30 para cada periodo de medida inicial; 120 para el periodo de exposición post-IL-31). La Figura 17 resume las puntaciones de prurito obtenidas antes y después de tratamiento con CAN 34 D03-65, que se proporcionó el día 0 del estudio. Siete días antes del tratamiento con Acm, la puntuación de prurito posterior a la exposición a IL-31 promedio de los perros fue de 68 ± 13 (E.T., n=4). Por comparación, los días de estudio 7, 14, 21, las puntuaciones de prurito promedio posteriores a la exposición con IL-31 se habían reducido a 5 ± 2, 8 ± 4, y 9 ± 5, respectivamente. Estos cambios en la puntuación de prurito entre el día -7 y los días 7-21 representaron una disminución ≥ 85 % de la reactividad prurítica global para IL-31.

El grado de inhibición de prurito inducido por IL-31 puede, de hecho, haber estado más cerca del 100 % durante este periodo de tiempo si se considera que entre los días 0 y 21, las puntuaciones de medida inicial pre-IL-31 de 0,5 h promediaron 1,6 ± 0,6-un nivel que se extrapolaría con una puntuación de prurito de 6-7 durante un periodo de 2 h. La reactividad prurítica de los perros tratados con IL-31 exógena se recuperó de forma gradual a lo largo del tiempo. El día 63 posterior al tratamiento con CAN D03-65, la puntuación de prurito posterior a la exposición a IL-31 de 2 h promedio había aumentado hasta 57 ± 8 o aproximadamente el 84 % de las respuestas preexposición al Acm de IL31 observadas en el día -7. Por lo tanto, en un modelo de prurito inducido por IL-31, una sola inyección en embolada SC de CAN 34D03-65 proporciona semanas de protección antiprurítica a los perros tratados.

Ejemplo 10 Caracterización de IL-31 de felino

La secuencia de IL-31 de felino se identificó mediante una búsqueda de similitud del genoma de felino con IL-31 de canino utilizando los recursos de genoma del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). El gen que representa la IL-31 de felino se sintetizó para la expresión optima en E. coli. Las construcciones de expresión se crearon con los genes de IL-31 de canino y felino de longitud completa que contenían una etiqueta de 6 His N-terminal para la detección y purificación. La construcción de felino de longitud completa utilizada para la expresión en E. coli está representada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 69 y la secuencia de proteína de SEQ ID NO: 70. Los plásmidos con secuencia confirmada se utilizaron para transformar E. coli BL21 Star™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y se llevó a cabo la expresión a 30 ºC durante 5 horas. Después de la lisis de los sedimentos celulares se encontró que la proteína inmunorreactiva estaba altamente enriquecida en el lisado insoluble. Estos sedimentos celulares se solubilizaron en urea 6 M y la purificación de las proteínas recombinantes se llevó a cabo en condiciones desnaturalizantes utilizando una resina de níquel cobalto (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Las fracciones eluídas agrupadas, que mostraron ser positivas a la presencia de la etiqueta de His, se dializaron por etapas frente a PBS urea 0,8 M seguido de PBS, y se analizaron mediante SDS PAGE (Figura 18). Como se observó anteriormente, el rendimiento de la IL-31 de canino recombinante a partir de la inducción en E. coli fue bajo. Sin embargo, se recuperó proteína después de la purificación que migró de acuerdo con la masa molecular espera a través de SDS-PAGE.

Para examinar la actividad biológica de la IL-31 de canino y felino producida a partir de E. coli, se analizó la capacidad de cada proteína para inducir la señalización de pSTAT en el ensayo de células DH82. Dado que la IL-31 recombinante a partir de células de mamífero (IL-31(CHO) de canino) está altamente glucosilada, no estaba claro si la forma no glucosilada conservaría la actividad biológica. La Figura 19 muestra que la IL-31 de felino tiene bioactividad comparable con la IL-31 de referencia producida en células CHO.

La mutagénesis mediante alanina de la IL-31 de canino definió una región dentro de la proteína que es necesaria para la unión a los anticuerpos 11 E12 y 34D03. Se formuló la hipótesis de que, debido a la conservación de secuencia en esta región (Figura 20), estos Acm tendrían reactividad cruzada con la IL-31 de felino.

La Figura 21 muestra que los Acm 11E12 y 34D03 tienen la capacidad de unirse a la IL-31 de canino (E. coli) y que también tienen la capacidad de reaccionar de forma cruzada con la proteína IL-31 de felino. Basándose en estos datos, la especiación del anticuerpo 34D03 se aplicó a la de los felinos (felinización).

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