ES2639093T3 - Procedimiento para el tratamiento de la osteoporosis - Google Patents

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ES2639093T3 ES12770368.4T ES12770368T ES2639093T3 ES 2639093 T3 ES2639093 T3 ES 2639093T3 ES 12770368 T ES12770368 T ES 12770368T ES 2639093 T3 ES2639093 T3 ES 2639093T3
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Douglas Clary
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Abstract

Compuesto 1 **Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para utilizar en el tratamiento de la osteoporosis, en el que el compuesto 1 se administra entre 0,01 y 25 mg una vez diaria.

Description

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Procedimiento para el tratamiento de la osteoporosis Campo de la invencion
[0001] Esta descripcion se refiere al tratamiento de la osteoporosis usando N-(4-{[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il]oxi} fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropano-1,1-dicarboxamida.
Antecedentes de la invencion
[0002] La osteoporosis es una enfermedad caracterizada por una baja masa osea y un deterioro de la microarquitectura del tejido oseo que conduce a una mayor fragilidad osea y un aumento consiguiente del riesgo de fractura. La enfermedad hace que los huesos se vuelvan fragiles y quebradizos y afecta tanto a hombres como a mujeres. Los huesos osteoporoticos aumentan el riesgo de fractura despues de un traumatismo mfnimo. A nivel mundial se estima que hay 35 millones de mujeres y 14 millones de hombres con osteoporosis o baja masa osea. En los Estados Unidos, uno de cada cuatro adultos mayores de 50 son propensos a sufrir una fractura osteoporotica. La osteoporosis y las fracturas resultantes representan una enorme carga para la salud publica, en parte debido a que esta enfermedad golpea en silencio, en el momento en que un paciente es diagnosticado con una fractura osteoporotica, el dano a los huesos ya se ha producido.
[0003] El hueso sufre continuamente un proceso llamado remodelacion. La perdida de hueso tiene lugar en la osteoporosis debido a que el proceso normal de remodelacion, o recambio oseo, elimina mas hueso del que reemplaza. La remodelacion osea implica dos etapas distintas: la resorcion osea (descomposicion) y la formacion de hueso. El calcio se almacena en el hueso. Cuando se necesita en el cuerpo, las celulas oseas llamadas osteoclastos se adhieren a la superficie del hueso y lo descomponen, dejando cavidades en el hueso. Las celulas formadoras de huesos llamadas osteoblastos llenan a continuacion las cavidades con una matriz organica llamada osteoide. El osteoide entonces mineraliza espontaneamente con fosfato de calcio para volver a formar el hueso duro. Los osteoblastos que permanecen incrustados en la matriz se denominan osteocitos.
[0004] Durante el envejecimiento y como resultado de otras afecciones que pueden conducir a un aumento del riesgo de perdida de masa osea, tales como durante el tratamiento del cancer de prostata o mama o como resultado de la desnutricion, la tasa de recambio oseo aumenta en ambos sexos, y a nivel de los tejidos, la formacion de hueso osteoblastica es mas lenta que la resorcion osea osteoclastica, debido a la disminucion en el numero y actividad de las celulas osteoblasticas individuales (Marie y Kassem, 2011). La resorcion osea lleva menos tiempo que la formacion de hueso. La resorcion osea en un sitio de hueso particular tarda aproximadamente dos semanas; la formacion lleva tres meses o mas. Como resultado, hay un deficit de hueso en los llamados espacios de remodelacion. Normalmente, esto es de poca importancia, pero si el ciclo de remodelacion esta fuera de equilibrio, el recambio oseo puede dar lugar a una perdida osea importante. Se cree que un recambio oseo elevado aumenta el riesgo de fractura.
[0005] Como resultado, sigue existiendo la necesidad de procedimientos para tratar la osteoporosis.
Descripcion resumida de la invencion
[0006] Estas y otras necesidades se satisfacen por la presente invencion que esta dirigida al Compuesto 1:
imagen1
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F
Compuesto 1
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, en el que el Compuesto 1 se administra de entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
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[0007] De manera mas general, la presente descripcion proporciona un procedimiento para tratar la osteoporosis. El procedimiento comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto a un paciente en necesidad de dicho tratamiento.
[0008] En una realizacion de este y otros aspectos de la descripcion, el compuesto es un compuesto de Formula I
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-)c.
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que: R1 es halo;
R2 es halo;
R3 es alquilo (C1-C6);
R4 es alquilo (C1-C6); y Q es CH o N.
[0009] En otra realizacion, el compuesto de formula I es un compuesto de Formula la
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que: R1 es halo;
R2 es halo; y Q es CH o N.
[0010] En otra realizacion, el compuesto de Formula I es el Compuesto 1:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. El compuesto 1 se conoce como N-(4-{[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropano-1,1-dicarboxamida y como cabozantinib.
[0011] En otra realizacion, el compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 se administran como una composicion farmaceutica que comprende un aditivo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable en una dosis suficiente para mejorar los efectos del recambio oseo anormal.
[0012] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para el tratamiento de osteoporosis en pacientes con un mayor riesgo de perder masa osea. Los pacientes con un mayor riesgo de perder masa osea incluyen pacientes que son mujeres posmenopausicas y hombres de edad avanzada, o que tienen o que actualmente estan en tratamiento para el cancer, tal como el cancer de prostata o de mama o de pacientes con desnutricion. El procedimiento comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 a un paciente en necesidad de dicho tratamiento.
[0013] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para prevenir la osteoporosis, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 a un paciente en necesidad de dicho tratamiento.
[0014] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para aumentar la densidad mineral osea de pacientes con osteoporosis, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 a un paciente en necesidad de dicho tratamiento.
[0015] En estos y otros aspectos, la capacidad del compuesto de Formula I para tratar, mejorar, o reducir la gravedad de la osteoporosis se puede determinar cualitativa y cuantitativamente usando varios marcadores circulantes o varias tecnologfas de formacion de imagenes. Los marcadores que pueden ser utiles para la monitorizacion individual de pacientes osteoporoticos tratados con agentes contra la resorcion incluyen fosfatasa alcalina total en suero, fosfatasa alcalina especffica del hueso en suero, osteocalcina en suero, propeptido C-terminal de procolageno de tipo 1 C1NP en suero o propeptido N-terminal de procolageno de tipo I (P1NP) en suero [para monitorizar la formacion de hueso], hidroxiprolina urinaria, piridinolina total urinaria (PYD), desoxipiridinolina libre urinaria (DPD), telopeptidos N-terminales reticulados de colageno tipo 1 (NTx) urinarios, telopeptidos C-terminales reticulados de colageno tipo 1 (CTx) urinarios o en suero, sialoprotefna osea (BSP), y fosfatasa acida 5b resistente a tartrato (TRACP-5b) [para monitorizar la resorcion osea].
[0016] Las tecnologfas de imagenes que pueden ser utiles en la evaluacion de la capacidad de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1 para tratar, mejorar, o reducir la gravedad de la osteoporosis incluyen imagenes de resonancia magnetica, tomograffa de emision de positrones, tomograffa computarizada (CT) y absorciometrfa de rayos X.
[0017] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento de pronostico para la osteoporosis en un sujeto, que comprende:
(a) medir el nivel de P1NP, CTx o TRACP 5b en una muestra del sujeto;
(b) comparar el nivel de P1NP, CTx o TRACP 5b medido en la etapa (a) con un nivel estandar de P1NP, CTx o TRACP 5b para determinar si la muestra del sujeto tiene niveles aberrantes de P1 NP, CTx o TRACP 5b;
(c) seleccionar un regimen de tratamiento con el Compuesto de Formula I, Ia, o 1 basado en los niveles aberrantes de P1 NP, CTx o TRACP 5b o administrar el compuesto de Formula I, Ia, o 1 de acuerdo con el regimen de tratamiento, de manera que la osteoporosis se inhibe en el sujeto.
[0018] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para estimular la diferenciacion y/o actividad de los osteoblastos en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1.
[0019] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para estimular la formacion de hueso en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1.
[0020] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para inhibir la diferenciacion de osteoclastos en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1.
[0021] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para modular el recambio oseo hacia la formacion de hueso en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1.
[0022] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para el tratamiento de osteoporosis en pacientes
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ovariectomizadas, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1.
[0023] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para modular el recambio oseo hacia la formacion de hueso en pacientes ovariectomizadas, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1.
Breve resumen de las figuras
[0024]
La Figura 1 representa el efecto del compuesto 1 sobre la diferenciacion de osteoclastos medida en el dfa 7 como la actividad de TRACP 5b (U/L) secretada en el medio de cultivo.
La Figura 2 representa el efecto del compuesto 1 sobre la actividad de resorcion de los osteoclastos humanos en el dfa 7 como valores de CTX/TRACP 5b.
La figura 3 representa el efecto del Compuesto 1 sobre la diferenciacion de osteoblastos en el dfa 8 como la actividad de ALP celular/mg de protefna.
La figura 4 representa el efecto del compuesto 1 sobre la actividad de formacion de hueso de osteoblastos de raton en el dfa 11 como PINP secretado en el medio de cultivo.
La figura 5 representa el efecto del Compuesto 1 sobre la actividad de formacion de hueso de osteoblastos de raton en el dfa 13 como la deposicion de calcio en el dfa 13.
La Figura 6 representa el diseno de un estudio de los efectos a corto plazo del Compuesto 1 sobre los marcadores de recambio oseo en una ovariectomfa de rata (modelo OVX).
Descripcion detallada de la invencion
Abreviaturas y definiciones
[0025] Las siguientes abreviaturas y terminos tienen los significados indicados a lo largo de la memoria:
Abreviatura
Significado
Ac
acetilo
Br
ancho
°C
grados Celsius
c-
ciclo
CBZ
CarboBenZoxi =benciloxicarbonilo
d
doblete
dd
doblete de doblete
dt
doblete de triplete
DCM
diclorometano
DME
1,2-dimetoxietano
DMF
N, N-dimetilformamida
DMSO
Dimetil sulfoxido
Dppf
1,1'-bis(difenilfosfano)ferroceno
El
lonizacion por impacto de electrones
G
gramo(s)
h
hora(s)
HPLC
cromatografia liquida de alta presion
L
litro(s)
M
molar o molaridad
m
multiplete
Mg
miligramo(s)
MHz
megaherzio (frecuencia)
Min
minuto(s)
ml
mililitro(s)
P1
microlitro(s)
pM
miromol(es) o micromolar
mM
milimolar
Mmol
milimol(es)
Mol
mol(es)
MS
Analisis por espectro de masas
N
normal o normalidad
nM
nanomolar
RMN
espectroscopfa de resonancia
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magnetica nuclear
q
cuarteto
RT
temperatura ambiente
s
singlete
t o tr
triplete
TFA
acido trifluoroacetico
THF
tetrahidrofurano
TLC
cromatograffa en capa fina
[0026] El sfmbolo significa un enlace simple, "=" significa un doble enlace.
[0027] Cuando las estructuras qufmicas se representan o describen, a menos que se indique explfcitamente lo contrario, todos los atomos de carbono se supone que tienen sustitucion de hidrogeno para ajustarse a una Valencia de cuatro. Por ejemplo, en la estructura en el lado izquierdo del siguiente esquema, hay nueve hidrogenos implfcitos. Los nueve hidrogenos se representan en la estructura de la derecha. A veces, un atomo particular en una estructura se describe en formula textual como que tiene un hidrogeno o hidrogenos como sustitucion (hidrogeno expresamente definido), por ejemplo, -CH2CH2-. Se entiende por un experto en la tecnica que las tecnicas descriptivas mencionadas anteriormente son habituales en las tecnicas qufmicas para proporcionar brevedad y simplicidad a la descripcion de estructuras por lo demas complejas.
imagen8
[0028] Si un grupo "R" se representa como "flotante" en un sistema de anillo, como por ejemplo en la formula:
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entonces, a menos que se defina lo contrario, un sustituyente "R" puede residir en cualquier atomo del sistema de anillo, asumiendo la sustitucion de un hidrogeno representado, implfcito o expresamente definido de uno de los atomos en el anillo, siempre que se forme una estructura estable.
[0029] Si un grupo "R" se representa como flotante en un sistema de anillos condensados, como por ejemplo en las formulas:
imagen10
entonces, a menos que se defina lo contrario, un sustituyente "R" puede residir en cualquier atomo del sistema de anillos condensados, asumiendo la sustitucion de un hidrogeno representado (por ejemplo el -NH- en la formula anterior), el hidrogeno implfcito (por ejemplo como en la formula anterior, donde no se muestran los hidrogenos pero se entiende que estan presentes), o hidrogeno expresamente definido (por ejemplo, cuando en la formula anterior, "Z" es igual a =CH-) de uno de los atomos en el anillo, siempre que se forme una estructura estable. En el ejemplo representado, el grupo "R" puede residir en el anillo de 5 miembros o en el anillo de 6 miembros del sistema de anillos condensados. Cuando un grupo "R" se representa como existente en un sistema de anillos que contiene carbonos saturados, como por ejemplo en la formula:
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en la que, en este ejemplo, "y" puede ser mas de uno, suponiendo que cada uno sustituye un hidrogeno actualmente representado, implfcito o definido expresamente en el anillo; entonces, a menos que se defina lo contrario, cuando la estructura resultante es estable, dos "R" pueden residir en el mismo carbono. Un ejemplo simple es cuando R es un grupo metilo; no puede existir un dimetilo geminal en un carbono del anillo representado (un carbono “anular”). En otro ejemplo, dos R en el mismo carbono, incluyendo ese carbono, pueden formar un anillo, creando de este modo una estructura de anillo espirocfclico (un grupo "espirociclilo") con el anillo representado como por ejemplo en la formula:
imagen12
[0030] "Halogeno" o "halo" se refiere a fluor, cloro, bromo o yodo.
[0031] "Rendimiento" para cada una de las reacciones descritas en el presente documento se expresa como un porcentaje del rendimiento teorico.
[0032] "Paciente" para los fines de la presente descripcion incluye seres humanos y otros animales, particularmente mamfferos, y otros organismos. Asf, los procedimientos son aplicables tanto a la terapia humana como a aplicaciones veterinarias. En otra realizacion, el paciente es un mamffero, y en otra realizacion el paciente es humano.
[0033] Una "sal farmaceuticamente aceptable" de un compuesto significa una sal que es farmaceuticamente aceptable y que posee la actividad farmacologica deseada del compuesto original. Se entiende que las sales farmaceuticamente aceptables no son toxicas. Informacion adicional sobre sales farmaceuticamente aceptables adecuadas se pueden encontrar en Remington Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985 o SM Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci, 1977; 66: 1-19.
[0034] Los ejemplos de sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con acidos inorganicos tales como acido clorhfdrico, acido bromhfdrico, acido sulfurico, acido nftrico, acido fosforico, y similares; asf como acidos organicos, tales como acido acetico, acido trifluoroacetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido oxalico, acido maleico, acido malonico, acido succfnico, acido fumarico, acido tartarico, acido malico, acido cftrico, acido benzoico, acido cinamico, acido 3- (4-hidroxibenzoil)benzoico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etanodisulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido 4-clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-toluenosulfonico, acido alcanforsulfonico, acido glucoheptonico, 4,4'-metilenbis-(acido 3-hidroxi-2-eno-1-carboxflico), acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido butilacetico terciario, acido lauril sulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salicflico, acido estearico, acido muconico, acido p-toluenosulfonico, y acido salicflico y similares.
[0035] "Profarmaco" se refiere a compuestos que se transforman (habitualmente rapidamente) in vivo para producir el compuesto parental de las formulas anteriores, por ejemplo, mediante hidrolisis en sangre. Los ejemplos mas comunes incluyen, pero no se limitan a, formas de ester y amida de un compuesto que tiene una forma activa que contiene un resto de acido carboxflico. Los ejemplos de esteres farmaceuticamente aceptables de los compuestos de esta descripcion incluyen, pero no se limitan a, esteres de alquilo (por ejemplo, con entre aproximadamente uno y aproximadamente seis carbonos), el grupo alquilo es una cadena lineal o ramificada. Los esteres aceptables tambien incluyen esteres de cicloalquilo y esteres de arilalquilo, tales como, pero no limitados a, bencilo. Los ejemplos de amidas farmaceuticamente aceptables de los compuestos de esta descripcion incluyen, pero no se limitan a, amidas primarias, y alquilamidas secundarias y terciarias (por ejemplo, con entre aproximadamente uno y aproximadamente seis carbonos). Las amidas y esteres de los compuestos de la presente descripcion se pueden preparar de acuerdo con procedimientos convencionales. Una descripcion a fondo de profarmacos se proporciona en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol 14 de la ACS Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987.
[0036] "Cantidad terapeuticamente eficaz" es una cantidad de un compuesto de la descripcion, que cuando se administra a un paciente, mejora un sfntoma de la enfermedad. Una cantidad terapeuticamente eficaz pretende incluir
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una cantidad de un compuesto solo o en combinacion con otros principios activos eficaces para tratar, mejorar, o reducir la gravedad de la osteoporosis. La cantidad de un compuesto de la descripcion que constituye una "cantidad terapeuticamente eficaz" variara dependiendo del compuesto, el estado de enfermedad y su gravedad, la edad del paciente a tratar, y similares. La cantidad terapeuticamente eficaz puede determinarse por un experto en la tecnica teniendo en cuenta sus conocimientos y esta descripcion, pero generalmente estara en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1000 mg por dfa, y mas especfficamente en el intervalo de 1 a 100 mg por dia.
[0037] "Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad, trastorno, o sfndrome, tal como se usa en el presente documento, incluye (i) prevenir que se produzca la enfermedad, trastorno, o sfndrome en un ser humano, es decir, hacer que los sfntomas clfnicos de la enfermedad, trastorno, o sfndrome no se desarrollen en un animal que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, trastorno o sfndrome, pero que todavfa no experimenta o muestra sfntomas de la enfermedad, trastorno o sfndrome; (ii) inhibir la enfermedad, trastorno, o sfndrome, es decir, detener su desarrollo; y (iii) aliviar la enfermedad, trastorno, o sfndrome, es decir, provocar la regresion de la enfermedad, trastorno, o sfndrome. Como se sabe en la tecnica, los ajustes para la administracion sistemica frente a la administracion localizada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administracion, la interaccion de farmacos y la gravedad de la afeccion pueden ser necesarios, y seran determinables con experiencia de rutina.
Realizaciones
[0038] En una realizacion de la descripcion, el compuesto de formula I es el compuesto de Formula la:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que: R1 es halo;
R2 es halo; y Q es CH o N.
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[0039] En otra realizacion, el compuesto de Formula I es el Compuesto 1:
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Compuesto 1
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
[0040] Como se indico anteriormente, el Compuesto 1 se denomina en el presente documento como N-(4-{[6,7-bis (metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropan-1,1-dicarboxamida. El documento WO 2005/030140 da a conocer el compuesto 1 y describe como se produce (Ejemplo 12, 37, 38, y 48) y tambien da a conocer la actividad terapeutica de este compuesto para inhibir, regular y/o modular la transduccion de senales de quinasas, (ensayos, Tabla 4, entrada 289). El ejemplo 48 esta en el parrafo [0353] en el documento WO 2005/030140.
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[0041] En otras realizaciones, el compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1, o una sal farmaceuticamente
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aceptable de los mismos, se administran como una composicion farmaceutica, en la que la composicion farmaceutica comprende adicionalmente un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.
[0042] El compuesto de Formula I, Formula la y el Compuesto I, tal como se describen en el presente documento, incluyen tanto los compuestos citados como los isomeros individuales y mezclas de isomeros. En cada caso, el compuesto de Formula I incluye las sales farmaceuticamente aceptables, hidratos y/o solvatos de los compuestos citados y cualquier isomero individual o mezcla de isomeros de los mismos.
[0043] En otras realizaciones, el compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 puede ser la sal (L)-malato. La sal de malato del compuesto de formula I y del compuesto 1 se describe en los documentos PCT/US2010/021194 y 61/325095.
[0044] En otras realizaciones, el compuesto de formula I puede ser la sal de (D)-malato.
[0045] En otras realizaciones, el compuesto de Formula Ia puede ser la sal de malato.
[0046] En otras realizaciones, el compuesto de Formula Ia puede ser la sal de (L)-malato.
[0047] En otras realizaciones, el Compuesto 1 puede ser la sal de (D)-malato.
[0048] En otras realizaciones, el Compuesto 1 puede ser la sal de malato.
[0049] En otras realizaciones, el Compuesto 1 puede ser la sal de (D)-malato.
[0050] En otra realizacion, la sal de malato esta en la forma N-1 cristalina de la sal de (L)-malato y/o la sal de (D)- malato del Compuesto 1, tal como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos de No. de Ser. 61/325095. Tambien vease el documento WO 2008/083319 para las propiedades de los enantiomeros cristalinos, incluyendo las formas cristalinas N-1 y/o N-2 de la sal de malato del compuesto 1. Los procedimientos de preparacion y caracterizacion de tales formas se describen completamente en el documento PCT/US10/21194.
[0051] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento.
[0052] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1. En esta y en las siguientes realizaciones, la dosis es una cantidad que es mayor que 0 mg.
[0053] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 90 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0054] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 80 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0055] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 70 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0056] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 60 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0057] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 50 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0058] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis,
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que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 40 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0059] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 30 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0060] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 20 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0061] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 10 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0062] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 5 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0063] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es 0,01 mg a 25 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0064] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es 0,1 mg a 15 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0065] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar los sfntomas de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es 1 mg a 10 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1.
[0066] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para reducir la gravedad de la osteoporosis en pacientes que han sido tratados o que se someten a tratamiento para el cancer de mama o cancer de prostata que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25,20, 15, 10, o 5 mg. En algunas realizaciones, el cancer es cancer de mama, cancer de prostata, cancer de hueso y/o tumores oseos. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg.
[0067] En otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para mejorar la deposicion anormal de hueso no estructurado acompanado por el aumento de las fracturas del esqueleto, la compresion de la medula espinal, y el dolor oseo grave de la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente cantidad eficaz de un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 1100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg.
[0068] Tal como se indica anteriormente, la capacidad del compuesto de Formula I para tratar, mejorar, o reducir la gravedad de la osteoporosis se puede determinar cualitativa y cuantitativamente usando diversos marcadores circulantes o urinarios. En algunas realizaciones, los marcadores utiles para la monitorizacion individual de los pacientes osteoporoticos tratados con agentes contra la resorcion se pueden seleccionar entre fosfatasa alcalina total en suero, fosfatasa alcalina especffica del hueso en suero, osteocalcina en suero, procolageno de tipo 1 en suero (C-temrinal/N-terminal): C1NP o P1NP [para monitorizar la formacion de hueso], hidroxiprolina urinaria, piridinolina total urinaria (PYD), desoxipiridinolina libre urinaria (DPD), telopeptidos N-terminales reticulados de colageno tipo 1 (NTx) urinarios, telopeptidos C-terminales reticulados de colageno tipo 1 (CTx) urinarios o en suero, sialoprotefna osea (BSP), y fosfatasa acida 5b resistente a tartrato (TRACP-5b) [para monitorizar la resorcion osea].
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[0069] En una realizacion particular, el marcador es CTx. CTx es la porcion de colageno de tipo 1 que se escinde por los osteoclastos durante la resorcion osea, y por lo tanto sus niveles en suero se considera que son proporcionales a la actividad osteoclastica en el momento que se extrae la muestra de sangre. En consecuencia, CTx en suero se usa ampliamente para controlar los efectos de los bisfosfonatos en el hueso (Marx et al, 2007). El subestudio del recambio oseo de la prueba de Evaluacion de la reduccion de la fractura de denosumab en Osteoporosis cada 6 meses (FREEDOM) incluyo 160 mujeres asignadas al azar a inyecciones subcutaneas de denosumab (60 mg) o de placebo cada 6 meses durante 3 anos. Un mes despues de la inyeccion, los niveles sericos de CTx en todos los sujetos tratados con denosumab disminuyeron a niveles por debajo del intervalo de referencia premenopausico. Ademas, hubo una correlacion significativa entre la reduccion de CTx y el aumento de la densidad mineral osea en los sujetos tratados con denosumab (Eastell et al, 2011). Ademas de estos efectos sobre CTx, en un estudio de Fase 1, una inyeccion subcutanea de denosumab suprimio los NTx urinarios de una manera dependiente de la dosis en hasta un 81% en las mujeres posmenopausicas durante el tiempo de 6 meses (Bekker et al, 2004).
[0070] En otra realizacion, el marcador es TRACP-5b
[0071] En pacientes con cancer de prostata resistente a la castracion metastasico, la administracion del Compuesto 1 se asocio con una disminucion en plasma de CTx independientemente de si los sujetos fueron tratados previamente con bisfosfonatos (Hussain et al, 2011). Se observaron efectos similares con el Compuesto 1 en pacientes sin metastasis oseas conocidas (Gordon et al, 2011), donde el uso previo de bisfosfonatos era presumiblemente para tratar pacientes con osteoporosis. La capacidad del compuesto 1 para reducir los niveles de CTX en plasma en los pacientes, independientemente del tratamiento previo con bisfosfonatos e independientemente de la presencia de lesiones oseas metastasicas sugiere un efecto potente en el bloqueo del recambio oseo anormal.
[0072] Por lo tanto, en otra realizacion, la descripcion se refiere a un procedimiento para disminuir los CTx en plasma en un paciente que sufre de osteoporosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento un compuesto de Formula I en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg.
[0073] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento de pronostico para la osteoporosis en un sujeto, que comprende:
(a) medir el nivel de P1NP, CTx o TRACP 5b en una muestra del sujeto;
(b) comparar el nivel de P1 NP, CTx o TRACP 5b medida en la etapa (a) con un nivel estandar de P1 NP, CTx o TRACP 5b para determinar si la muestra del sujeto tiene niveles aberrantes de P1 NP, CTx o TRACP 5b;
(c) seleccionar un regimen de tratamiento con el Compuesto de Formula I, la, o 1 basado en los niveles aberrantes de P1 NP, CTx o TRACP 5b o administrar el compuesto de Formula I, la, o 1 de acuerdo con el regimen de tratamiento, de manera que la osteoporosis es inhibida en el sujeto.
[0074] En otra realizacion, la descripcion proporciona un procedimiento para estimular la diferenciacion y/o actividad de osteoblastos en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 , 15, 10, o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
[0075] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para estimular la formacion de hueso en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
[0076] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para inhibir la diferenciacion de osteoclastos en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
[0077] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para modular el recambio oseo hacia la formacion de hueso en un paciente en necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
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[0078] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para el tratamiento de la osteoporosis en pacientes ovariectomizadas, que comprende administrar a la paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg una vez al dfa . En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
[0079] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para modular el recambio oseo hacia la formacion de hueso en pacientes ovariectomizadas, que comprende administrar a la paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, la, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion especffica, el Compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
[0080] En otra realizacion, la descripcion proporciona un procedimiento para tratar la osteoporosis en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un compuesto de Formula I, Ia, o el Compuesto 1 en cualquiera de las realizaciones descritas en este documento en una dosis diaria que es inferior o igual a 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg una vez al dfa. En una realizacion, el tratamiento da lugar a la estimulacion de la diferenciacion de osteoblastos. En otra realizacion, el tratamiento da lugar a la estimulacion de la formacion de hueso. En otra realizacion, el tratamiento da lugar a la inhibicion de la diferenciacion y/o actividad de los osteoclastos. En otra realizacion, el tratamiento da lugar a una modulacion del recambio hacia la formacion de hueso. En estas y otras realizaciones, el compuesto de Formula I es el Compuesto 1 y la dosis esta entre 0,01 y 25 mg una vez al dfa.
Administracion
[0081] La administracion del compuesto de Formula I, Formula Ia, o el Compuesto 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en forma pura o en una composicion farmaceutica apropiada, puede llevarse a cabo a traves de cualquiera de los modos aceptados de administracion o agentes para servir en utilidades similares. De este modo, la administracion puede ser, por ejemplo, por via oral, nasal, parenteral (intravenosa, intramuscular, o subcutanea), topica, transdermica, intravaginal, intravesical, intracisternal, o rectal, en forma de polvo solido, semisolido, liofilizado, o formas de dosificacion lfquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, supositorios, pfldoras, dosis de gelatina elastica blandas y duras (que puede ser en capsulas o comprimidos), polvos, soluciones, suspensiones, o aerosoles, o similares, especfficamente en formas de dosificacion unitaria adecuadas para la administracion simple de dosis precisas.
[0082] Las composiciones incluiran un portador o excipiente farmaceutico convencional y un compuesto de Formula I como el/un agente activo, y, ademas, pueden incluir portadores y adyuvantes, etc.
[0083] Los adyuvantes incluyen agentes conservantes, humectantes, de suspension, edulcorantes, aromatizantes, perfumantes, emulsionantes, y dispersantes. La prevencion de la accion de microorganismos se puede asegurar mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares, cloruro de sodio, y similares. La absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede ser provocada por el uso de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0084] Si se desea, una composicion farmaceutica del compuesto de Formula I tambien puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, antioxidantes, y similares, tales como, por ejemplo, acido cftrico, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, hidroxitolueno butilado, etc.
[0085] La eleccion de la composicion depende de varios factores, tales como el modo de administracion del farmaco (por ejemplo, para la administracion oral, las composiciones en forma de comprimidos, pfldoras o capsulas) y la biodisponibilidad de la sustancia farmaco. Recientemente, las composiciones farmaceuticas han sido desarrolladas especialmente para farmacos que muestran una mala biodisponibilidad basandose en el principio de que la biodisponibilidad puede aumentarse aumentando el area superficial, es decir, disminuyendo el tamano de partfcula. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.107.288 describe una composicion farmaceutica que tiene partfculas en el intervalo de tamano de 10 a 1.000 nm en que el material activo esta soportado en una matriz reticulada de macromoleculas. La patente de Estados Unidos. No. 5.145.684 describe la produccion de una composicion farmaceutica en la que la sustancia farmaco se pulveriza en nanopartfculas (tamano promedio de partfcula de 400 nm) en presencia de un modificador de superficie y, a continuacion, se dispersa en un medio lfquido para dar una composicion farmaceutica que presenta una biodisponibilidad notablemente alta.
[0086] Las composiciones adecuadas para inyeccion parenteral pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones esteriles, acuosas o no acuosas, fisiologicamente aceptables, y polvos esteriles para reconstitucion en soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes
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o vehfculos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
[0087] Una via especffica de administracion es la oral, utilizando un regimen de dosificacion diaria conveniente que puede ajustarse de acuerdo con el grado de gravedad del estado de la enfermedad a tratar.
[0088] Las formas de dosificacion solidas para administracion oral incluyen capsulas, comprimidos, pfldoras, polvos, y granulos. En tales formas de dosificacion solidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente (o portador) inerte habitual, tal como citrato de sodio o fosfato dicalcico o (a) cargas o extendedores, como por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y acido silfcico, (b) aglutinantes, como por ejemplo, derivados de celulosa, almidon, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma de acacia, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes disgregantes, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido algfnico, croscarmelosa sodica, silicatos complejos y carbonato de sodio, (e) retardadores de la solucion, como por ejemplo parafina, (f) aceleradores de la absorcion, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes, como por ejemplo, alcohol cetflico y monoestearato de glicerol, estearato de magnesio y similares, (h) adsorbentes, como por ejemplo, caolfn y bentonita, y (i) lubricantes, como por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato de sodio, o mezclas de los mismos. En el caso de capsulas, comprimidos, y pfldoras, las formas de dosificacion tambien pueden comprender agentes tamponantes.
[0089] Las formas de dosificacion solidas como se describen anteriormente se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entericos y otros bien conocidos en la tecnica. Pueden contener agentes de opacificacion, y tambien pueden ser de una composicion tal que liberen el compuesto o compuestos activos en una cierta parte del tracto intestinal de una manera retardada. Ejemplos de composiciones embebidas que pueden usarse son sustancias polimericas y ceras. Los compuestos activos tambien pueden estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o mas de los excipientes mencionados anteriormente.
[0090] Las formas de dosificacion lfquidas para administracion oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires farmaceuticamente aceptables. Tales formas de dosificacion se preparan, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc., el compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y adyuvantes farmaceuticos opcionales en un portador, tales como, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares; agentes solubilizantes y emulsionantes, como por ejemplo, alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencflico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida; aceites, en particular, aceite de semilla de algodon, aceite de cacahuete, aceite de germen de mafz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sesamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurflico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan; o mezclas de estas sustancias, y similares, para formar de este modo una solucion o suspension.
[0091] Las suspensiones, ademas de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspension, como por ejemplo, alcoholes isoestearflicos etoxilados, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares.
[0092] Las composiciones para administracion rectal son, por ejemplo, supositorios que pueden prepararse mezclando el compuesto de Formula I con, por ejemplo, excipientes o portadores no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio, que son solidos a temperaturas ordinarias, pero lfquidos a la temperatura corporal y por lo tanto, se funden mientras estan en una cavidad corporal adecuada y liberan el componente activo de los mismos.
[0093] Las formas de dosificacion para la administracion topica del compuesto de Formula I incluyen pomadas, polvos, pulverizaciones, e inhalantes. El componente activo se mezcla en condiciones esteriles con un portador fisiologicamente aceptable y cualquier conservante, tampon, o propelente que puedan ser necesarios. Las composiciones oftalmicas, pomadas oculares, polvos y soluciones tambien se contemplan dentro del alcance de esta descripcion.
[0094] Los gases comprimidos pueden utilizarse para dispersar el compuesto de Formula I en forma de aerosol. Los gases inertes adecuados para este proposito son nitrogeno, dioxido de carbono, etc.
[0095] Generalmente, dependiendo del modo pretendido de administracion, las composiciones farmaceuticamente aceptables contendran aproximadamente del 1% a aproximadamente el 99% en peso de un compuesto o compuestos de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y del 99% al 1 % en peso de un excipiente farmaceutico adecuado. En un ejemplo, la composicion estara entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 75% en peso de un compuesto o compuestos de formula I, formula Ia, o el Compuesto 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, siendo el resto excipientes farmaceuticos adecuados.
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[0096] Los procedimientos reales para preparar tales formas de dosificacion son conocidos, o seran evidentes, para los expertos en esta tecnica; por ejemplo, vease Remington Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990). La composicion a administrar contendra, en cualquier caso, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para el tratamiento de un estado de la enfermedad de acuerdo con las ensenanzas de esta descripcion.
[0097] Los compuestos de esta descripcion, o sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, se administran en una cantidad terapeuticamente eficaz que variara dependiendo de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto especffico empleado, la estabilidad metabolica y la duracion de accion del compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y tiempo de administracion, la velocidad de excrecion, la combinacion de farmacos, la gravedad de los estados de la enfermedad particulares, y el huesped sometido a terapia. El compuesto de Formula I, Formula la, o el Compuesto 1, se puede administrar a un paciente a niveles de dosificacion en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 mg por dfa, y desde aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mg por dfa. Para un adulto humano normal que tiene un peso corporal de aproximadamente 70 kilogramos, una dosificacion en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por dfa es un ejemplo. La dosificacion especffica usada, sin embargo, puede variar. Por ejemplo, la dosificacion puede depender de un numero de factores incluyendo los requisitos del paciente, la gravedad de la afeccion a tratar, y la actividad farmacologica del compuesto que se utiliza. La determinacion de las dosificaciones optimas para un paciente particular es bien conocida para un experto en la tecnica.
[0098] En otras realizaciones, el compuesto de formula I, formula la, o el Compuesto 1, se puede administrar al paciente simultaneamente con otros tratamientos contra el cancer. Tales tratamientos incluyen otros agentes quimioterapeuticos del cancer, la terapia de reemplazo hormonal, la terapia de radiacion, o inmunoterapia, entre otros. La eleccion de otra terapia dependera de un numero de factores incluyendo la estabilidad metabolica y la duracion de accion del compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y tiempo de administracion, la velocidad de excrecion, la combinacion de farmacos, la gravedad de los estados de la enfermedad particulares, y el huesped sometido a terapia.
[0099] En una realizacion, el compuesto de Formula I, Formula la, o el Compuesto 1 se administra por via oral como una capsula. En otra realizacion, el Compuesto 1 se administra por via oral como una capsula. La capsula puede contener 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 mg o menos de Compuesto 1. En una realizacion, la dosis esta entre 0,01 y 25 mg.
[0100] En otra realizacion, el compuesto de formula I, formula Ia, o el Compuesto 1 se administra por via oral como un comprimido.
[0101] En otra realizacion, el Compuesto 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del Compuesto 1 se administra por via oral como un comprimido conforme a lo dispuesto en la tabla siguiente.
Ingrediente
(% p/p)
Compuesto 1
31,68
Celulosa microcristalina
38,85
Lactosa anhidra1
9,42
Hidroxipropil Celulosa
3,00
Croscarmelosa de sodio
3,00
Total intragranular
95,95
Dioxido de silicio, coloidal
0,30
Croscarmelosa de sodio
3,00
Estearato de magnesio
0,75
Total
100,00
[0102] En otra realizacion, el Compuesto 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del Compuesto 1 se administra por via oral como un comprimido conforme a lo dispuesto en la tabla siguiente.
Ingrediente
(% p/p)
Compuesto 1
25,00-33,3
Celulosa microcristalina
c.s.
Hidroxipropil Celulosa
3
Poloxamero
0-3
Croscarmelosa de sodio
6,00
Dioxido de silicio, coloidal
0,5
Estearato de magnesio
0,5-1,0
Total
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[0103] En otra realizacion, el Compuesto 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del Compuesto 1 se administra por via oral como un comprimido conforme a lo dispuesto en la tabla siguiente.
Ingrediente
(% P/P)
Compuesto 1
100,0
Celulosa microcristalina PH-102
155,4
Lactosa anhidra 60M
77,7
Hidroxipropil Celulosa, EXF
12,0
Croscarmelosa de sodio
24
Dioxido de silicio coloidal
1,2
Estearato de magnesio (no bovino)
3,0
Opadry amarillo
16,0
Total
416
[0104] Las formulaciones de comprimidos descritas anteriormente pueden adaptarse para proporcionar una dosis oral de 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 , 10, o 5 mg o menos de Compuesto 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del Compuesto 1. En una realizacion, la dosis esta entre 0,01 y 25 mg.
Preparacion del compuesto 1
[0105] Preparacion de N-(4-{[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropano-1,1-dicarboxamida y la sal (L)-malato de la misma.
[0106] La ruta sintetica usada para la preparacion de
N-(4-[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropano-1,1-dicarboxamida y la sal (L)-malato de la misma se representa en el Esquema 1:
Esquema 1
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Preparacion de 4-cloro-6,7-dimetoxi-quinolina
[0107] En un reactor se cargo secuencialmente 6,7-dimetoxi-quinolina-4-ol (10,0 kg) y acetonitrilo (64,0 l). La mezcla resultante se calento a aproximadamente 65°C y se anadio oxicloruro de fosforo (POCl3, 50,0 kg). Despues de la adicion de POCl3, la temperatura de la mezcla de reaccion se elevo a aproximadamente 80°C. La reaccion se
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considero completa (aproximadamente 9,0 horas) cuando permanecfa menos del 2 por ciento del material de partida (en el analisis en el proceso mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento [HPLC]). La mezcla de reaccion se enfrio hasta aproximadamente 10°C y despues se inactivo en una solucion enfriada de diclorometano (DCM, 238,0 kg), 30% de NH4OH (135,0 kg), y hielo (440,0 kg). La mezcla resultante se calento hasta aproximadamente 14°C, y las fases se separaron. La fase organica se lavo con agua (40,0 kg) y se concentro por destilacion al vacfo para eliminar el disolvente (aproximadamente 190,0 kg). Se anadio metil t-butil eter (MTBE, 50,0 kg) al lote, y la mezcla se enfrio hasta aproximadamente 10°C, durante cuyo tiempo el producto cristalizo. Los solidos se recuperaron por centrifugacion, se lavaron con n-heptano (20,0 kg), y se secaron a aproximadamente 40°C para proporcionar el compuesto del tftulo (8,0 kg).
Preparacion de 6,7-dimetil-4-(4-nitro-fenoxi)-quinolina
[0108] En un reactor se cargo secuencialmente 4-cloro-6,7-dimetoxi-quinolina (8,0 kg), 4-nitrofenol (7,0 kg), 4- dimetilaminopiridina (0,9 kg), y 2,6-lutidina (40,0 kg). El contenido del reactor se calento hasta aproximadamente 147°C. Cuando la reaccion fue completa (menos de 5 por ciento de material restante determinado por analisis en proceso mediante HPLC, aproximadamente 20 horas de partida), el contenido del reactor se dejo enfriar hasta aproximadamente 25°C. Se anadio metanol (26,0 kg), seguido por carbonato de potasio (3,0 kg) disuelto en agua (50,0 kg). El contenido del reactor se agito durante aproximadamente 2 horas. El precipitado solido resultante se filtro, se lavo con agua (67,0 kg), y se seco a 25°C durante aproximadamente 12 horas para proporcionar el compuesto del tftulo (4,0 kg).
Preparacion de 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina
[0109] Se anadio una solucion que contenfa formiato de potasio (5,0 kg), acido formico (3,0 kg), y agua (16,0 kg) a una mezcla de 6,7-dimetoxi-4-(4-nitro-fenoxi)-quinolina ( 4,0 kg), 10 por ciento de paladio sobre carbono (50 por ciento de agua en humedo, 0,4 kg) en tetrahidrofurano (THF, 40,0 kg) que se habfa calentado hasta aproximadamente 60°C. La adicion se llevo a cabo de tal manera que la temperatura de la mezcla de reaccion se mantuvo aproximadamente a 60°C. Cuando la reaccion se considero completa determinado usando analisis en proceso mediante HPLC (menos de 2 por ciento del material de partida restante, habitualmente de 15 horas), se filtro el contenido del reactor. El filtrado se concentro por destilacion al vacfo a aproximadamente 35°C hasta la mitad de su volumen original, que dio como resultado la precipitacion del producto. El producto se recupero por filtracion, se lavo con agua (12,0 kg) y se seco bajo vacfo a aproximadamente 50°C para proporcionar el compuesto del tftulo (3,0 kg; 97 por ciento del area bajo la curva (AUC)).
Preparacion de acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)ciclopropancarboxflico
[0110] Se anadio trietilamina (8,0 kg) a una solucion enfriada (aproximadamente 4°C) de acido ciclopropano-1,1-dicarboxflico disponible comercialmente (2 1, 10,0 kg) en THF (63,0 kg) a una velocidad tal que la temperatura del lote no excedfa los 10°C. La solucion se agito durante aproximadamente 30 minutos, y despues se anadio cloruro de tionilo (9,0 kg), manteniendo la temperatura del lote por debajo de 10°C. Cuando la adicion fue completa, se anadio una solucion de 4-fluoroanilina (9,0 kg) en THF (25,0 kg) a una velocidad tal que la temperatura del lote no excedfa los 10°C. La mezcla se agito durante aproximadamente 4 horas y despues se diluyo con acetato de isopropilo (87,0 kg). Esta solucion se lavo secuencialmente con hidroxido de sodio acuoso (2,0 kg disueltos en 50,0 l de agua), agua (40,0 L), y cloruro de sodio acuoso (10,0 kg disueltos en 40,0 l de agua). La solucion organica se concentra por destilacion al vacfo seguido de la adicion de heptano, que dio como resultado la precipitacion de un solido. El solido se recupero por centrifugacion y despues se seco a aproximadamente 35°C bajo vacfo para proporcionar el compuesto del tftulo. (10,0 kg).
Preparacion de cloruro de 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarbonilo
[0111] Se anadio cloruro de oxalilo (1,0 kg) a una solucion de acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)ciclopropancarboxflico (2,0 kg) en una mezcla de THF (11 kg) y N,N-dimetilformamida (DMF; 0,02 kg) a una velocidad tal que la temperatura del lote no excedfa los 30°C. Esta solucion se uso en la siguiente etapa sin mas procesamiento.
Preparacion de N-(4-{[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropano-1,1-dicarboxamida
[0112] La solucion de la etapa anterior que contenfa cloruro de 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarbonilo se anadio a una mezcla de 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina (3,0 kg) y carbonato de potasio (4,0 kg) en THF (27,0 kg) y agua (13,0 kg) a una velocidad tal que la temperatura del lote no excedfa los 30°C. Cuando la reaccion fue completa (habitualmente en 10 minutos), se anadio agua (74,0 kg). La mezcla se agito a 15-30°C durante aproximadamente 10 horas, lo que dio lugar a la precipitacion del producto. El producto se recupero por filtracion, se lavo con una solucion prefabricada de THF (11,0 kg) y agua (24,0 kg), y se seco a aproximadamente 65°C bajo vacfo durante aproximadamente 12 horas para proporcionar el compuesto del tftulo (base libre, 5,0 kg). RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO): 8 10,2 (s, 1H), 10,05 (s, 1H), 8,4 (s, 1H), 7,8 (m, 2H), 7,65 (m, 2H), 7,5 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,15 (m, 2H), 6,4 (s, 1H), 4,0 (d, 6H), 1,5 (s, 4H). LC/MS: M +H = 502.
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Preparacion de N-(4-{[6,7-bis (metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil) ciclopropano-
1.1- dicarboxamida, sal de (L)-malato
[0113] Se anadio una solucion de acido L-malico (2,0 kg) en agua (2,0 kg) a una solucion de base libre de (4-fluoro-fenil)-amida de la [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico (15, 5,0 kg) en etanol, manteniendo una temperature de lote de aproximadamente 25°C. a continuacion, se anadieron carbono (0,5 kg) y tiol silice (0,1 kg) y la mezcla resultante se calento hasta aproximadamente 78°C, momento en que se anadio agua (6,0 kg). Se filtro entonces la mezcla de reaccion, seguido de la adicion de isopropanol (38,0 kg), y se dejo enfriar hasta aproximadamente 25°C. El producto se recupero por filtracion y se lavo con isopropanol (20,0 kg), y se seco a aproximadamente 65°C para proporcionar el compuesto del titulo (5,0 kg).
Preparacion alternativa de N-(4-{[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il]oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropan-
1.1- dicarboxamida y la sal (L)-malato de la misma.
[0114] Una ruta sintetica alternativa que se puede utilizar para la preparacion de N-(4-{[6,7-bis(metiloxi)quinolin-4-il] oxi}fenil)-N'-(4-fluorofenil)ciclopropan-1,1-dicarboxamida y la sal (L)-malato de la misma se representa en el Esquema 2.
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Esquema 2
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Preparacion de 4-cloro-6,7-dimetoxi-quinolina
[0115] En un reactor se cargo secuencialmente 6,7-dimetoxi-quinolina-4-ol (47,0 kg) y acetonitrilo (318,8 kg). La mezcla resultante se calento hasta aproximadamente 60°C y se anadio oxicloruro de fosforo (POCh, 130,6 kg). Despues de la adicion de POCh, la temperatura de la mezcla de reaccion se elevo hasta aproximadamente 77°C. La reaccion se considero completa (aproximadamente 13 horas) cuando permaneda menos del 3% del material de partida (analisis en el proceso mediante de cromatograffa lfquida de alto rendimiento [HPLC]). La mezcla de reaccion se enfrio hasta aproximadamente 2-7°C y despues se inactivo en una solucion enfriada de diclorometano (DCM, 482,8 kg), NH4OH al 26% (251,3 kg), y agua (900 l). La mezcla resultante se calento hasta aproximadamente 20-25°C, y las fases se separaron. La fase organica se filtro a traves de un lecho de AW Hyflo super-cel NF (Celite; 5,4 kg) y el lecho del filtro se lavo con DCM (118,9 kg). La fase organica combinada se lavo con solucion acuosa saturada de cloruro sodico (282,9 kg) y se mezclo con agua (120 L). Las fases se separaron y la fase organica se concentro por destilacion al vacfo con la eliminacion del disolvente (aproximadamente 95 l de volumen residual). Se cargo DCM (686,5 kg) en el reactor que conterna la fase organica y se concentro por destilacion al vacfo con la eliminacion del disolvente (aproximadamente 90 l de volumen residual). A continuacion, se cargo metil t-butil eter (MTBE, 226,0 kg) y la temperatura de la mezcla se ajusto hasta -20 a -25°C y se mantuvo durante 2,5 horas dando como resultado un precipitado solido que a continuacion se filtro y lavo con n-heptano (92,0 kg) y se seco sobre un filtro a aproximadamente 25°C bajo nitrogeno para producir el compuesto del tttulo. (35,6 kg).
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[0116] Se cargo 4-aminofenol (24,4 kg) disuelto en N,N-dimetilacetamida (DMA, 184,3 kg) a un reactor que contenfa 4-cloro-6,7-dimetoxiquinolina (35,3 kg), t-butoxido de sodio (21,4 kg ) y DMA (167,2 kg) a 20-25°C. A continuacion se calento esta mezcla hasta 100-105°C durante aproximadamente 13 horas. Despues de que la reaccion se considero completa tal como se determina usando analisis en proceso HPLC (permanece menso del 2 por ciento del material de partida), el contenido del reactor se enfrio a 15-20°C y se cargo agua (preenfriada, 2-7°C, 587 l) a una velocidad para mantener la temperatura de 15-30°C. El precipitado solido resultante se filtro, se lavo con una mezcla de agua (47 l) y DMA (89,1 kg) y finalmente con agua (214 L). La torta de filtracion se seco a aproximadamente 25°C en el filtro para producir 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina crudo (59,4 kg humedo, 41,6 kg seco calculada basado en LOD). La 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina cruda se puso en reflujo (aproximadamente 75°C) en una mezcla de tetrahidrofurano (THF, 211,4 kg) y DMA (108,8 kg) durante aproximadamente 1 hora a 0-5°C y se envejecio durante aproximadamente 1 hora, despues de lo cual el solido se filtro, se lavo con THF (147,6 kg) y se seco sobre un filtro al vacfo a aproximadamente 25°C para producir 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina (34,0 kg).
Preparacion alternativa de 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina
[0117] Se cargaron 4-cloro-6,7-dimetoxiquinolina (34,8 kg) y 4-aminofenol (30,8 kg) y terc-pentoxido de sodio (1,8 equivalentes) 88,7 kg, 35 por ciento en peso en THF) en un reactor, seguido por N,N-dimetilacetamida (DMA, 293,3 kg). A continuacion se calento esta mezcla hasta 105-115°C durante aproximadamente 9 horas. Despues de que la reaccion se considero completa tal como se determina usando analisis en proceso mediante HPLC (permanecfa menos de 2 por ciento del material de partida), el contenido del reactor se enfrio a 15-25°C y se anadio durante un perfodo de dos horas mientras que el agua (315 kg) mantenfa la temperatura entre 20-30°C. La mezcla de reaccion se agito durante una hora adicional a 20-25°C. El producto bruto se recogio por filtracion y se lavo con una mezcla de 88 kg de agua y 82,1 kg de DMA, seguido por 175 kg de agua. El producto se seco en un secador de filtro durante 53 horas. El LOD mostro menos de 1 por ciento p/p.
[0118] En un procedimiento alternativo, se usaron 1,6 equivalentes de terc-pentoxido de sodio y la temperatura de reaccion se aumento de 110-120°C. Ademas, el enfriamiento de temperatura aumento a 35-40°C y la temperatura de inicio de la adicion de agua se ajusto a 35-40°C, con una exotermia permitida hasta 45°C.
Preparacion de acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)ciclopropancarboxflico
[0119] Se anadio trietilamina (19,5 kg) a una solucion enfriada (aproximadamente 5°C) de acido ciclopropan-1,1 dicarboxflico (24,7 kg) en THF (89,6 kg) a una velocidad tal que la temperatura del lote no excedfa los 5°C. La solucion se agito durante aproximadamente 1,3 horas, y despues se anadio cloruro de tionilo (23,1 kg), manteniendo la temperatura del lote por debajo de 10°C. Cuando la adicion fue completa, la solucion se agito durante aproximadamente 4 horas manteniendo la temperatura por debajo de 10°C. A continuacion, se anadio una solucion de 4-fluoroanilina (18,0 kg) en THF (33,1 kg) a una velocidad tal que la temperatura de la carga no excedfa los 10°C. La mezcla se agito durante aproximadamente 10 horas, despues de lo cual la reaccion se considero completa. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de isopropilo (218,1 kg). Esta solucion se lavo secuencialmente con hidroxido de sodio acuoso (10,4 kg, 50 por ciento disuelto en 119 l de agua) diluido adicionalmente con agua (415 l), despues con agua (100 l) y finalmente con cloruro de sodio acuoso (20,0 kg disueltos en 100 l de agua). La solucion organica se concentro por destilacion a vacfo (100 l de volumen residual) por debajo de 40°C seguido de la adicion de n-heptano (171,4 kg), lo que dio como resultado la precipitacion de un solido. El solido se recupero por filtracion y se lavo con n-heptano (102,4 kg), lo que dio lugar a acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)ciclopropancarboxflico (29,0 kg) crudo humedo. El acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)ciclopropancarboxflico crudo se disolvio en metanol (139,7 kg) a aproximadamente 25°C seguido de la adicion de agua (320 l), dando lugar a una suspension que se recupero por filtracion, se lavo secuencialmente con agua (20 l) y n-heptano (103,1 kg) y despues se seco en el filtro a aproximadamente 25°C en atmosfera de nitrogeno para proporcionar el compuesto del tftulo (25,4 kg).
Preparacion de cloruro de 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarbonilo
[0120] Se anadio cloruro de oxalilo (12,6 kg) a una solucion de acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarboxflico (22,8 kg) en una mezcla de THF (96,1 kg) y N,N-dimetilformamida (DMF; 0,23 kg) a una velocidad tal que la temperatura del lote no supere los 25°C. Esta solucion se uso en la siguiente etapa sin mas procesamiento.
Preparacion alternativa de cloruro de 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarbonilo
[0121] Se cargo un reactor con acido 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarboxflico (35 kg), 344 g de DMF, y THF 175 kg. La mezcla de reaccion se ajusto a 12-17°C y a continuacion a la mezcla de reaccion se cargo 19,9 kg de cloruro de oxalilo durante un perfodo de 1 hora. La mezcla de reaccion se dejo agitando a 12-17°C durante 3 a 8 horas. Esta solucion se uso en la siguiente etapa sin mas procesamiento.
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Preparacion de [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico
[0122] Se anadio la solucion de la etapa anterior que contenfa cloruro de
1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarbonilo a una mezcla del compuesto
4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina (23,5 kg) y carbonato de potasio (31,9 kg) en THF (245,7 kg) y agua (116 l) a una velocidad tal que la temperature de la carga no exceda de 30°C. Cuando la reaccion fue completa (en aproximadamente 20 minutos), se anadio agua (653 l). La mezcla se agito a 20-25°C durante aproximadamente 10 horas, lo que resulto en la precipitacion del producto. El producto se recupero por filtracion, se lavo con una solucion prefabricada de THF (68,6 kg) y agua (256 L), y se seco primero en un filtro bajo nitrogeno a aproximadamente 25°C y despues a aproximadamente 45°C bajo vacfo para proporcionar el compuesto del tftulo (41,0 kg, 38,1 kg, calculado sobre la base de LOD).
Preparacion alternativa de [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico
[0123] Se cargo un reactor con 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina (35,7 kg, 1 equivalente), seguido por 412,9 kg de THF. A la mezcla de reaccion se cargo una solucion de 48,3 K2CO3 en 169 kg de agua. La solucion de cloruro de acido descrita en la Preparacion alternativa de cloruro de 1-(4-fluoro-fenilcarbamoil)-ciclopropancarbonilo anterior fue transferida al reactor que contenfa 4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenilamina mientras se mantenfa la temperatura entre 20-30°C durante un mfnimo de dos horas. La mezcla de reaccion se agito a 20-25°C durante un mfnimo de tres horas. A continuacion, la temperatura de reaccion se ajusto a 30-25°C y la mezcla se agito. La agitacion se detuvo y se dejo que las fases de la mezcla se separaran. La fase acuosa inferior se extrajo y se descarto. A la fase organica superior remanente se anadieron 804 kg de agua. La reaccion se dejo en agitacion a 15-25°C durante un mfnimo de 16 horas.
[0124] El producto precipito. El producto se filtro y se lavo con una mezcla de 179 kg de agua y 157,9 kg de THF en dos porciones. El producto crudo se seco bajo vacfo durante al menos dos horas. A continuacion, el producto seco se recogio en 285,1 kg de THF. La suspension resultante se transfirio al recipiente de reaccion y se agito hasta que la suspension se convirtio en una solucion clara (disuelta), que requerfa calentamiento a 30-35°C durante aproximadamente 30 minutos. Se anadio entonces 456 kg de agua a la solucion, asf como 20 kg de etanol SDAG-1 (etanol desnaturalizado con metanol durante dos horas. La mezcla se agito a 15-25°C durante al menos 16 horas. El producto se filtro y se lavo con una mezcla de 143 kg de agua y 126,7 THF en dos porciones. El producto se seco en un punto de ajuste de temperatura maxima de 40°C.
[0125] En un procedimiento alternativo, la temperatura de reaccion durante la formacion de cloruro de acido se ajusto a 10-15°C. La temperatura de recristalizacion se cambio de 15-25°C a 45-50°C durante 1 hora y despues se enfrio a 15-25°C durante 2 horas.
Preparacion de [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico, la sal de malato
[0126] Se cargaron [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico (1-5; 13,3 kg), acido L-malico (4,96 kg), metil etil cetona (MEK; 188,6 kg) y agua (37,3 kg) en un reactor y la mezcla se calento a reflujo (aproximadamente 74°C) durante aproximadamente 2 horas. La temperatura del reactor se redujo a 50 - 55°C y el contenido del reactor se filtro. Estos pasos secuenciales descritaos anteriormente se repitieron dos veces mas a partir de cantidades similares de material de partida (13,3 kg), acido L-malico (4,96 kg), MEK (198,6 kg) y agua (37,2 kg). El filtrado combinado se seco azeotropicamente a presion atmosferica usando MEK (1133,2 kg) (volumen residual aproximado 711 l; KF < 0,5% p/p) aproximadamente a 74°C. La temperatura del contenido del reactor se redujo a 20 - 25°C y se mantuvo durante aproximadamente 4 horas dando lugar a un precipitado solido que se filtro, se lavo con MEK (448 kg) y se seco bajo vacfo a 50°C para proporcionar el compuesto del tftulo (45,5 kg).
Preparacion alternativa de [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico, la sal de (L)-malato
[0127] Se cargaron [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida de acido ciclopropano-1,1-dicarboxflico (47,9 kg), acido L-malico (17,2), 658,2 kg de metil etil cetona, y 129,1 kg de agua (37,3 kg) en un reactor y la mezcla se calento 50-55°C durante aproximadamente 1-3 horas, y a continuacion 55-60°C para una adicion de 4-5 horas. La mezcla se clarifico por filtracion a traves de un cartucho de 1 pm. La temperatura del reactor se ajusto a 20-25°C y se destilo al vacfo con un vacfo a 150-200 mm Hg con una temperatura maxima de la camisa de 55°C al intervalo de volumen de 558 a 731 L.
[0128] La destilacion al vacfo se llevo a cabo dos veces mas con la carga de 380 kg y 380,2 kg de metil etil cetona, respectivamente. Despues de la tercera destilacion, el volumen del lote se ajusto a 18 v/p de [4-(6,7-dimetoxi-quinolina-4-iloxi)-fenil]-amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropano-1,1-dicarboxflico mediante
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la carga de 159,9 kg de metil etil cetona para dar un volumen total de 880 L. Una adicion a destilacion al vacfo se llevo a cabo mediante el ajuste de 245,7 metil etil cetona. La mezcla de reaccion se dejo con agitacion moderada a 20-25°C durante al menos 24 horas. El producto se filtro y se lavo con 415,1 kg de metil etil cetona en tres porciones. El producto se seco bajo un vacfo con el punto de ajuste de temperature de la camisa a 45°C.
[0129] En un procedimiento alternativo, el orden de adicion se cambio de modo que se anadio una solucion de 17,7 kg de acido L-malico disuelto en 129,9 kg de agua a [4-(6,7-dimetoxi quinolina-4-iloxi)]-fenil]amida (4-fluoro-fenil)-amida del acido ciclopropan-1,1-dicarboxflico (48,7 kg) en etil metil cetona (673,3 kg).
Ejemplo 1
Ensayo de un compuesto 1 en ensayos in vitro de diferenciacion y actividad de osteoclastos y osteoblastos
[0130] El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de 7 concentraciones del compuesto 1 sobre la diferenciacion y la actividad de los osteoclastos humanos y osteoblastos de raton in vitro. Las siguientes concentraciones fueron probadas: 0,004, 0,012, 0,037, 0,11, 0,33, 1,0 y 3,0 pM. El estudio se realizo utilizando celulas precursoras de osteoclastos CD34+ derivadas de medula osea humana que se cultivaron en trozos de hueso bovino, y celulas osteoprogenitoras KS483 de raton que fueron inducidas a diferenciarse en osteoblastos que forman el hueso.
[0131] El estudio se realizo en cuatro partes. En la primera parte, las celulas precursoras de osteoclastos CD34+ derivadas de medula osea humana se cultivaron en trozos de hueso bovino durante 7 dfas, despues de lo cual los osteoclastos formados se cuantificaron midiendo la actividad de la fosfatasa acida 5b resistente al tartrato (TRACP 5b) en el medio de cultivo. Este ensayo demuestra los efectos del Compuesto 1 sobre la diferenciacion de osteoclastos. La osteoprotegerina (OPG) se incluyo como inhibidor de referencia de la diferenciacion de los osteoclastos para demostrar que el sistema de cultivo funciona como se espera.
[0132] En la segunda parte, el medio de cultivo de los osteoclastos humanos se sustituye por medio nuevo en el dfa 7, y los osteoclastos maduros formados se cultivaron durante 3 dfas adicionales, lo que les permite reabsorber hueso. El compuesto 1 se anadio al medio de cultivo en el dfa 7. Este ensayo demuestra los efectos del Compuesto 1 sobre la actividad de resorcion osea de los osteoclastos maduros. Los telopeptidos reticulados C-terminales de colageno de tipo I (CTX) se midieron en el medio de cultivo recogido en el dfa 10 para cuantificar la resorcion osea durante los dfas 7-10. TRACP 5b se midio en el dfa 7 para cuantificar el numero de osteoclastos antes de anadir el compuesto 1. Los valores de CTX fueron divididos por los valores de TRACP 5b, lo que resulta en un fndice de resorcion que indica la actividad de los osteoclastos promedio. El inhibidor de cistefna proteasa E64 se incluyo como inhibidor de referencia de la actividad de los osteoclastos para demostrar que el sistema de cultivo funciona como se espera.
[0133] En la tercera parte, las celulas osteoprogenitoras de raton KS483 se cultivaron durante 8 dfas, despues de lo cual los osteoblastos maduros formados se cuantificaron midiendo la cantidad de actividad intracelular de la fosfatasa alcalina (ALP). Este ensayo demuestra los efectos del Compuesto 1 sobre la diferenciacion de los osteoblastos. 1713-estradiol se incluyo en el estudio como compuesto de referencia que estimula la diferenciacion de osteoblastos para demostrar que el sistema de cultivo funciona como se espera.
[0134] En la cuarta parte del estudio, las celulas osteoprogenitoras de raton KS483 se cultivaron durante 13 dfas, durante los cuales cual el propeptido N-terminal de procolageno de tipo I (PINP) secretado en el medio de cultivo se determino en el dfa 11 para demostrar los efectos sobre la formacion de la matriz osea organica, y la cantidad de calcio depositado en la matriz osea formada se determino en el dfa 13 para demostrar los efectos sobre la formacion de la matriz osea inorganica. Este ensayo de actividad de osteoblastos demuestra los efectos del Compuesto 1 sobre la actividad de formacion de hueso de los osteoblastos. 173-estradiol se incluyo en el estudio como compuesto de referencia que estimula la diferenciacion y la actividad de los osteoblastos para demostrar que el sistema de cultivo funciona como se espera.
[0135] El compuesto 1 mostro una inhibicion dependiente de la dosis de la diferenciacion de osteoclastos que fue significativa con concentraciones de 0,11, 0,33, 1,0 y 3,0 pM. El analisis microscopico mostro que las concentraciones de 0,11 y 0,33 pM no afectaron el numero de celulas mononucleares positivas Hoechst y TRACP, lo que sugiere la inhibicion especffica de la diferenciacion de osteoclastos. Sin embargo, las concentraciones de 1,0 y 3,0 pM disminuyeron el numero de celulas mononucleares positivas Hoechst y TRACP, lo que sugiere que los efectos inhibidores observados con estas concentraciones son al menos en parte citotoxicos. No se observaron efectos en el ensayo de actividad de los osteoclastos.
[0136] El compuesto 1 mostro una estimulacion dependiente de la dosis de la diferenciacion y actividad de los osteoblastos. Las concentraciones del compuesto 1 0,012, 0,037, 0,11, 0,33 y 1,0 pM aumentaron y la concentracion de 3,0 pM disminuyeron los valores de fosfatasa alcalina en el ensayo de diferenciacion de osteoblastos. En el ensayo de actividad de osteoblastos, las concentraciones de 0,012 y 0,037 pM aumentaron los valores de PINP, y las concentraciones de 0,004, 0,012, 0,037 y 0,11 pM aumentaron los valores de calcio. Las concentraciones de 0,33, 1,0 y 3,0 pM disminuyeron los valores de calcio y PINP. Estos resultados demuestran que las concentraciones 0,004,
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0,012, 0,037 y 0,11 pM del Compuesto 1 tienen efectos beneficiosos sobre las celulas oseas, activando la formacion de hueso osteoblastico y que no tienen efectos o inhiben la formacion de osteoclastos de resorcion osea.
Descripcion del estudio
[0137] El objetivo de este estudio fue investigar los efectos del Compuesto 1 seleccionado por el Sponsor en la diferenciacion y la actividad de los osteoclastos humanos y osteoblastos de raton in vitro. Los efectos sobre los osteoclastos se estudiaron usando un modelo en el que las celulas precursoras de osteoclastos humanos derivadas de medula osea se cultivan sobre trozos de hueso bovino durante 7 dfas en condiciones que favorecen la diferenciacion de los osteoclastos, y se les permitio diferenciarse en osteoclastos de resorcion osea. Despues de la terminacion de la diferenciacion de osteoclastos en el dfa 7, el medio de cultivo se extrajo y se anadio en los pocillos nuevo medio de cultivo que favorece la actividad de los osteoclastos. Los osteoclastos maduros se cultivaron a continuacion durante 3 dfas adicionales, lo que les permite reabsorber hueso. En el ensayo de diferenciacion de los osteoclastos, se anadieron los compuestos de prueba y un inhibidor de la osteoprotegerina de referencia (OPG) en cultivos en el dfa 0. En el ensayo de actividad de los osteoclastos, se anadieron los compuestos de prueba y un inhibidor de referencia E64 en cultivos en el dfa 7. Las siete concentraciones en 8 replicas se probaron en ambos ensayos. La actividad de la fosfatasa acida 5b resistente al tartrato (TRACP 5b) se midio del medio de cultivo recogido en el dfa 7 como un fndice del numero de osteoclastos formados en cada pocillo durante el perfodo de diferenciacion. Los telopeptidos reticulados C-terminales de colageno tipo I (CTX) se midieron del medio de cultivo recogido en el dfa 10 para cuantificar la resorcion osea durante los dfas 7-10.
[0138] Los efectos sobre los osteoblastos se estudiaron usando celulas osteoprogenitoras KS483 de raton que pueden ser inducidas a diferenciarse en osteoblastos que forman el hueso. 1713-estradiol (E2) se incluyo en el estudio como compuesto de referencia que estimula la diferenciacion y la actividad de los osteoblastos, para demostrar que los sistemas de cultivo pueden detectar la estimulacion de la diferenciacion y actividad de los osteoblastos. En el ensayo de diferenciacion de osteoblastos, las celulas se cultivaron durante 8 dfas, despues de lo cual los osteoblastos maduros formados se cuantificaron midiendo la cantidad de actividad intracelular de la fosfatasa alcalina (ALP). En el ensayo de actividad de los osteoblastos, las celulas osteoprogenitoras se cultivaron durante 13 dfas, durante los cuales se determino el propeptido N-terminal de procolageno de tipo I (PINP) secretado en el medio de cultivo en el dfa 11 para demostrar los efectos sobre la formacion de la matriz osea organica, y se determino la cantidad de calcio depositado en la matriz osea formada en el dfa 13 para demostrar los efectos sobre la formacion de la matriz osea inorganica.
[0139] Los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos que contenfan un grupo de lfnea de base que inclufa vehfculo, un grupo de control que inclufa el compuesto de referencia, y los grupos que inclufan el compuesto de ensayo. Los compuestos de referencia se incluyen para demostrar que los sistemas de ensayo funcionan como se esperaba. En los cultivos de osteoclastos, el estudio fue aprobado si los resultados del grupo de control fueron significativamente mas bajos que los resultados del grupo de lfnea de base. En cultivos de osteoblastos, el estudio fue aprobado si los resultados del grupo de control fueron significativamente mas altos que los resultados del grupo de lfnea de base.
Compuesto 1
[0140] El compuesto 1 se obtiene a partir del Sponsor como un compuesto solido. El compuesto se suspendio en DMSO a una concentracion de 10 mM para obtener una solucion madre. La solucion madre fresca se fabrico antes de las pruebas, que se almaceno en seco y en oscuridad a temperatura ambiente. Para largo plazo (mas de 5 dfas), la solucion madre se almaceno a -70°C. Las diluciones apropiadas se prepararon a partir de la solucion madre para obtener las concentraciones de ensayo deseadas; 0,004 pM, 0,012 pM, 0,037 pM, 0,11 pM, 0,33 pM, 1 pM y 3 pM.
Compuestos de referencia
[0141] La osteoprotegerina (OPG, 5 nM, numero de catalogo 450-14, obtenida de PeproTech EC Ltd, Londres, Reino Unido) se uso como inhibidor de referencia de la diferenciacion de osteoclastos y el inhibidor de cistefna proteasa E64 (1 _M, numero de catalogo E-3132, obtenida de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, eE.UU.) como inhibidor de referencia de la actividad de resorcion de los osteoclastos.
[0142] 173-estradiol (E2; 10 nM, numero de catalogo E1024, obtenido de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) se utilizo como un estimulador de referencia de la diferenciacion y actividad de los osteoblastos.
Procedimiento
Cultivos de osteoclastos
[0143] El procedimiento de cultivo de osteoclastos en trozos de hueso fue descrito originalmente por Boyde y companeros de trabajo (1984) y por Chambers y companeros de trabajo (1984). Originalmente, se determino el numero de osteoclastos mediante el calculo del numero de celulas multinucleares positivas en fosfatasa acida
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(TRACP) resistente a tartrato bajo un microscopio. Mas tarde, se demostro que la actividad de TRACP 5b secretada refleja el numero de osteoclastos en cultivos de osteoclastos de raton (Alatalo et al. 2000). Mientras que la actividad TRACP 5b secretada se correlaciona fuertemente con el numero de osteoclastos, TRACP 5b no fue secretada por las celulas precursoras de los osteoclastos mononucleares positivas en TRACP antes de haberse diferenciado en osteoclastos multinucleares maduros. Por lo tanto, la TRACP 5b secretada es un marcador fiable del numero de osteoclastos multinucleares maduros.
[0144] La tasa de resorcion osea en los cultivos se determino originalmente mediante el recuento del numero de cavidades de resorcion en cada trozo de hueso o de dentina usando un microscopio con los objetivos de contraste de fase. Mas tarde, las cavidades se visualizaron utilizando lectina de aglutinina de germen de trigo que se une especfficamente al area reabsorbida en el hueso, por lo que es posible cuantificar el area reabsorbida total usando un microscopio y un sistema de analisis de imagen asistido por ordenador. Estos procedimientos tienen dos desventajas: consumen mucho tiempo y no pueden detectar las diferencias en la profundidad de las cavidades de resorcion, lo que puede causar que los resultados sean falsos. Mas tarde, se demostro que telopeptidos reticulados C-terminales de colageno tipo I (CTX) cuantifican los productos de degradacion de colageno de hueso liberados en el medio de cultivo (Bagger et al. 1999). Este procedimiento es rapido y sensible, y es un parametro fiable del volumen total reabsorbido (incluyendo la profundidad de las cavidades).
[0145] Se desarrollo un sistema de cultivo de osteoclastos humanos para usar en este estudio donde las celulas precursoras de osteoclastos CD34+ derivadas de medula osea humana (Poietics® Human Osteoclast Precursors, Lonza, Walkersville, EE.UU.) se cultivan en trozos de hueso bovino en presencia de factores de crecimiento apropiados, incluyendo M-CSF y ligando RANK (Rissanen et al. 2009). En primer lugar, se deja que las celulas se diferencien en osteoclastos de resorcion osea maduros, y se deja que los osteoclastos formados reabsorban hueso. Los compuestos de ensayo y de referencia se anaden a los cultivos de celulas en el comienzo del periodo de diferenciacion y/o resorcion, y se determinan sus efectos sobre la actividad de resorcion y/o diferenciacion de los osteoclastos.
[0146] La TRACP 5b secretada se determina del medio de cultivo despues del periodo de diferenciacion utilizando un procedimiento disponible comercialmente (BoneTRAPO, IDS Ltd, Boldon, Reino Unido). La TRACP 5b secretada describe con precision el numero de osteoclastos formados en cada pocillo durante el periodo de diferenciacion. CTX se determina a partir del medio de cultivo despues del periodo de resorcion utilizando un procedimiento disponible comercialmente (CrossLapsO para cultivos, IDS Ltd, Boldon, Reino Unido). CTX describe con precision la cantidad de productos de degradacion de colageno del hueso liberados en el medio de cultivo en cada pocillo durante el periodo de resorcion. Un indice de resorcion que demuestra la actividad promedio de los osteoclastos (Rissanen et al. 2009) se calcula dividiendo el volumen de resorcion obtenido (valor CrossLapsO) por el numero de osteoclastos (valor BoneTRAPO).
Cultivos de osteoblastos
[0147] Los osteoblastos son celulas formadoras de hueso que surgen a partir de celulas madre mesenquimales. Durante el desarrollo de los osteoblastos, se han definido tres perfodos distintos: 1) la proliferacion celular y la secrecion de matriz extracelular (ECM); 2) la maduracion de eCM; 3) la mineralizacion de ECM. Durante estos perfodos, se ha caracterizado una expresion secuencial de marcadores de fenotipo de osteoblastos. La fosfatasa alcalina (ALP) se asocia con el fenotipo de celulas oseas y se expresa activamente durante la maduracion de los osteoblastos. El propeptido N-terminal del procolageno tipo I (PINP) es un marcador de la sfntesis de colageno de tipo I y la produccion de ECM y una medida relevante para la evaluacion de los farmacos candidatos nuevos para osteoporosis en estudios preclfnicos (Rissanen et al. 2008). Con el inicio de la mineralizacion, grandes cantidades de calcio e hidroxiapatita se depositan en la matriz organica madura para formar nodulos parecidos a huesos. A rafz de estos marcadores, es posible estudiar todas las etapas de la diferenciacion y la actividad de los osteoblastos en un sistema de cultivo.
[0148] Se establecieron varios sistemas modelo para estudiar los osteoblastos. El aislamiento de celulas con el fenotipo osteoblastico de calvaria fue el primer intento. Sin embargo, estas celulas representan solo la etapa de madurez de los osteoblastos porque solo una pequena fraccion de las celulas de calvaria son precursoras de osteoblastos (Bellows et al. 1989). Alternativamente, las celulas de medula osea mesenquimales o lfneas de celulas progenitoras pueden ser estimuladas para diferenciarse en celulas osteoblasticas. Las celulas KS483, clonadas a partir de calvaria de raton, son precursores de osteoblastos sensibles a estrogeno que son capaces de diferenciarse en osteoblastos que forman el hueso y formar nodulos oseos mineralizados in vitro (Dang et al. 2002).
[0149] Se establecio un sistema de cultivo que se puede utilizar como modelo in vitro para estudiar los efectos de los compuestos anabolicos y similares a los estrogenos sobre la diferenciacion y actividad de los osteoblastos. En este sistema de cultivo, proliferan primero las celulas KS483 de raton y entonces se diferencian en osteoblastos capaces de formar nodulos oseos mineralizados en presencia de acido ascorbico y p-glicerofosfato (Fagerlund et al. 2009). Los compuestos de ensayo y de referencia se anaden a los cultivos de celulas de forma concomitante con el cambio de medio, y se determinan sus efectos sobre la diferenciacion y actividad de los osteoblastos. Se determina la ALP celular, un marcador de la diferenciacion de osteoblastos, a partir de los lisados celulares tal como se describio
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anteriormente (Lowry et al. 1954). El PINP secretado, un marcador de formacion de la matriz osea organica, se determina a partir del medio de cultivo usando un procedimiento disponible en el mercado (Rat/Mouse PINP EIA, IDS Ltd, Boldon, Reino Unido). La deposicion de calcio, un fndice de la formacion de la matriz osea inorganica, se mide usando un ensayo de calcio disponible en el mercado (Roche Diagnostics).
Procedimientos
Ensayo de diferenciacion de los osteoclastos
[0150] En este estudio, se suspendieron celulas madre CD34+ derivadas de medula osea humana (10.000 celulas/pocillo) en medio de cultivo y se dejaron adherir a trozos de hueso bovino en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. El medio de cultivo (que contiene FBS al 10%, OCP BulletKit® Lonza, Walkersville, EE.UU.) fue suplementado con cantidades apropiadas de factores de crecimiento importantes que favorecen la diferenciacion y la actividad de osteoclastos, incluyendo M-CSF (33 ng/ml, OCP BulletKit® Lonza, Walkersville, EE.UU.) y ligando RANK (66 ng/ml, OCP BulletKit ® Lonza, Walkersville, EE.UU.) en 200 |il de medio. Las celulas se incubaron en un incubador de CO2 en atmosfera humidificada de 95% de aire y 5% de dioxido de carbono a 37°C durante 7 dfas. Se anadieron los compuestos de ensayo y el compuesto de referencia OPG en el dfa 0. Los sobrenadantes recogidos en el dfa 7 se almacenaron a -70°C hasta el analisis de TRACP 5b. La TRACP 5b se midio del medio de cultivo (20 ^l/muestra) usando el contador VICTOR2™ Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.). Las celulas se fijaron con paraformaldehfdo al 3% y se tineron para la actividad de TRACP (kit de fosfatasa acida de leucocitos; Sigma Aldrich, St Louis , MO, EE.UU.) y Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.).
[0151] Se incluyeron los siguientes grupos (cada grupo contiene 8 replicas):
Placa 1:
1) grupo de lfnea de base con vehfculo (DMSO)
2) grupo de control con 5 nM de OPG
3) 0,004 |iM del Compuesto 1
4) 0,012 |iM del Compuesto 1
5) 0,037 |iM del Compuesto 1
6) 0,11 |iM del Compuesto 1
7) 0,33 |iM del Compuesto 1
8) 1,0 |iM del Compuesto 1
9) 3,0 |iM del Compuesto 1
Ensayo de actividad de los osteoclastos
[0152] En este estudio, celulas madre CD34+ derivadas de la medula osea humana (10.000 celulas/pocillo) se suspendieron en medio de cultivo y dejaron que se adherieran a porciones de hueso bovino en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. El medio de cultivo (que contiene FBS al 10%, OCP BulletKit® Lonza, Walkersville, EE.UU.) se suplemento con cantidades apropiadas de factores de crecimiento importantes que favorecen la diferenciacion y la actividad de osteoclastos, incluyendo M-CSF (33 ng/ml, OCP BulletKit® Lonza, Walkersville, EE.UU.) y ligando RANK (66 ng/ml, OCP BulletKit® Lonza, Walkersville, EE.UU.) en 200 |il de medio. Las celulas se incubaron en un incubador de CO2 en atmosfera humidificada del 95% de aire y 5% de dioxido de carbono a 37°C. Despues de la terminacion de la diferenciacion de osteoclastos en el dfa 7, todo el medio de cultivo se extrajo y se anadieron 200 |il nuevos de medio de cultivo que favorecfan la actividad de osteoclastos en los pocillos.
[0153] Los osteoclastos maduros se cultivaron durante 3 dfas adicionales, lo que les permite reabsorber hueso. Los compuestos de prueba y el compuesto de referencia E64 se anadieron en el dfa 7, despues de la finalizacion del perfodo de diferenciacion de los osteoclastos. Los sobrenadantes recogidos en el dfa 7 y el dfa 10 fueron almacenados a -70°C hasta el analisis de TRACP 5b y CTX. TRACP 5b se midio del medio de cultivo (20 ^l/muestra) recogido en el dfa 7 y CTX del medio de cultivo (50 ^l/muestra) recogido en el dfa 10 usando el contador VICTOR2™ Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA, Estados Unidos).
[0154] Se incluyeron los siguientes grupos (cada grupo contiene 8 replicas):
Placa 1:
1) grupo de lfnea de base con vehfculo (DMSO)
2) grupo de control con 1 _M de E64
3) 0,004 |iM del Compuesto 1
4) 0,012 |iM del Compuesto 1
5) 0,037 |iM del Compuesto 1
6) 0,11 |iM del Compuesto 1
7) 0,33 |iM del Compuesto 1
8) 1,0 |iM del Compuesto 1
9) 3,0 |iM del Compuesto 1
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Ensayo de diferenciacion de los osteoblastos
[0155] Se cultivaron celulas de raton KS483 en matraces de cultivo de tejidos T-75 en aMEM suplementado con suero bovino fetal privado de carbon vegetal al 10% hasta 80-90% de confluencia. Las celulas se incubaron en un incubador de CO2 en atmosfera humidificada de 95% de aire y 5% de dioxido de carbono a 37°C. Despues de alcanzar el 80-90% de confluencia, se prepararon subcultivos. Las celulas se extrajeron de los matraces con el tratamiento con tripsina y se contaron. Para la induccion de la maduracion de los osteoblastos y la formacion de hueso, las celulas osteoblasticas inmaduras se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con colageno de tipo I. Las celulas se cultivaron durante 8 dfas con un suplemento de acido ascorbico (50 _g/ml), y la mitad del medio se cambio cada 3-4 dfas. El compuesto de ensayo y la sustancia de control (E2) se anadieron en el comienzo del periodo de cultivo y cuando se cambio el medio. Los cultivos se detuvieron en dfa 8 mediante la extraccion de los medios de cultivo de los pocillos, y se prepararon lisados celulares. La actividad de ALP celular y el contenido total de protefnas (ensayo de protefnas, Bio-Rad Laboratories Inc, CA, EE.UU.) se cuantificaron utilizando el contador VICToR2tm Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.).
[0156] Se incluyeron los siguientes grupos (cada grupo contiene 8 replicas):
Placa 1:
1) grupo de lfnea de base con vehfculo (DMSO)
2) grupo de control con 10 nM de E2
3) 0,004 pM del Compuesto 1
4) 0,012 pM del Compuesto 1
5) 0,037 pM del Compuesto 1
6) 0,11 pM del Compuesto 1
7) 0,33 pM del Compuesto 1
8) 1,0 pM del Compuesto 1
9) 3,0 pM del Compuesto 1
Ensayo de actividad de los osteoblastos
[0157] Se cultivaron celulas de raton KS483 se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos T-75 en aMEM suplementado con suero bovino fetal privado de carbon vegetal al 10% hasta 80-90% de confluencia. Las celulas se incubaron en un incubador de CO2 en atmosfera humidificada de 95% de aire y 5% de dioxido de carbono a 37°C. Despues de alcanzar el 80-90% de confluencia, se prepararon subcultivos. Las celulas se extrajeron de los matraces con el tratamiento con tripsina y se contaron. Para la induccion de la maduracion de los osteoblastos y la formacion de hueso, las celulas osteoblasticas inmaduras se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas de colageno de tipo I. Las celulas se cultivaron durante 13 dfas con un suplemento de acido ascorbico (50 pg/ml) y p-glicerofosfato (5 mM), y la mitad del medio se cambio cada 3-4 dfas. El compuesto de ensayo y la sustancia de control (E2) se anadieron en el comienzo del periodo de cultivo y cuando se cambio el medio. El PINP secretado se midio del medio de cultivo en el dfa 11 como un marcador de la formacion de la matriz osea organica. Los cultivos se detuvieron en el dfa 13 mediante la extraccion de los medios de cultivo de los pocillos y la adicion de acido clorhfdrico. El calcio depositado en la matriz osea formado se cuantifico mediante el uso del contador VICTOR2® Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.).
[0158] Se incluyeron los siguientes grupos (cada grupo contiene 8 replicas):
Placa 1:
1) grupo de lfnea de base con vehfculo (DMSO)
2) grupo de control con 10 nM de E2
3) 0,004 pM del Compuesto 1
4) 0,012 pM del Compuesto 1
5) 0,037 pM del Compuesto 1
6) 0,11 pM del Compuesto 1
7) 0,33 pM del Compuesto 1
8) 1,0 pM del Compuesto 1
9) 3,0 pM del Compuesto 1
Analisis estadfstico
[0159] Todos los datos relevantes se presentan como figuras y/o tablas [media, desviacion estandar (SD) y la significacion estadfstica] con unidades. Los analisis estadfsticos se realizaron con el paquete estadfstico Origen (Origin Corporation, Northampton, MA, EE.UU.). Se utilizo el analisis de una via de la varianza (ANOVA) para estudiar si los valores obtenidos entre los diferentes grupos (lfnea de base frente a compuestos inhibidores de referencia y de prueba) eran estadfsticamente diferentes (con p <0,05). Si el ANOVA de una via revelaba diferencias estadfsticamente significativas, se utilizo la prueba t para comparaciones estadfsticas entre grupos.
Resultados
[0160] El efecto del compuesto 1 sobre la diferenciacion de osteoclastos se midio en el dfa 7 tal como se representa en la Figura 1. Los resultados se muestran como la actividad de TRACP 5b (U/L) secretada en el medio de cultivo. En esta
5 y en otras figuras, BL significa lfnea de base (no hay compuestos anadidos); C significa control (5,0 nM de OPG). Los resultados se compararon con la BL utilizando ANOVA de una via (p menor de 0,001 entre todos los grupos). Tres asteriscos (***) indican un efecto inhibidor estadfsticamente significativo con un valor de p de menos de 0,001. Dos asteriscos (**) indican un efecto estadfsticamente significativo con un valor de p de menos de 0,01. Un asterisco (*) indica un valor de p de menos de 0,05. Los asteriscos con parentesis en la figura ([***]) indican una diferencia
10 significativa opuesta al nivel de lfnea de base.
[0161] Los resultados se resumen adicionalmente en la Tabla 1. Como en la Figura, tres asteriscos ([***]) indican un efecto inhibidor estadfsticamente significativo con un valor de p de menos de 0,001. Como en las figuras, y en esta y otras tablas, tres asteriscos (***) indican un efecto inhibidor estadfsticamente significativo con un valor de p de menos
15 de 0,001; dos asteriscos (**) indican un efecto estadfsticamente significativo con un valor de p de menos de 0,01; un asterisco (*) indica un valor de p de menos de 0,05. Los asteriscos con parentesis en la figura ([***]) indican una diferencia significativa opuesta al nivel de lfnea de base.
Tabla 1
20
Ensayo de diferenciacion de osteoclastos. Actividad de TRACP 5b en el dfa 7
Concentracion del compuesto 1 (pM)
0,004 0,012 0,037 0,11 0,33 1,0 3,0
Porcentaje de actividad (%) en comparacion con BL
85 80 74 45(***) 15(***) 4(***) 0(***)
[0162] El efecto del compuesto 1 sobre la actividad de resorcion de los osteoclastos humanos se representa en la Figura 2. Los resultados se muestran como valores de CTX/TRACP 5b valores. Los valores de CTX se determinaron al final del perfodo de resorcion en el dfa 10, y los valores de TRACP al comienzo del perfodo de la resorcion en el dfa 7. 25 Los resultados se resumen adicionalmente en la Tabla 2.
Tabla 2
Ensayo de diferenciacion de osteoclastos. Actividad de CTX en el dfa 10 y TRACP 5b en el dfa 7
Concentracion del compuesto 1 (pM)
0,004 0,012 0,037 0,11 0,33 1,0 3,0
Porcentaje de actividad (%) en comparacion con BL
84 104 115 107 102(***) 111 (***) 85(***)
30 [0163] El efecto del compuesto 1 sobre la diferenciacion de osteoblastos en el dfa 8 se representa en la Figura 3. Los
resultados se muestran como la actividad de ALP celular/mg de protefna. Los resultados se resumen adicionalmente en la Tabla 3.
Tabla 3
Ensayo de diferenciacion de osteoblastos. Actividad de ALP en el dfa 8
Concentracion del compuesto 1 (PM)
0,004 0,012 0,037 0,11 0,33 1,0 3,0
Porcentaje de actividad (%) en comparacion con BL
109 113 134(***) 181 (***) 166(***) 117(*) 57([***])
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[0164] El efecto del Compuesto 1 sobre la actividad de formacion de hueso de osteoblastos de raton se representa en la Figura 4. Los resultados se muestran como PINP secretado en el medio de cultivo en el dfa 11. Los resultados se resumen adicionalmente en la Tabla 4.
Tabla 4
Ensayo de diferenciacion de osteoblastos. Actividad de PINP en el dfa 11
Concentracion del compuesto 1 (pM)
0,004 0,012 0,037 0,11 0,33 1,0 3,0
Porcentaje de actividad (%) en comparacion con BL
117 122(***) 135(***) 101 73([**]) 42([***]) 21([***])
[0165] El efecto del Compuesto 1 sobre la actividad de formacion de hueso de osteoblastos de raton se representa en la Figura 5. Los resultados se muestran como la deposicion de calcio en el dfa 13. Los resultados se muestran como PINP secretado en el medio de cultivo en el dfa 11. Los resultados se resumen adicionalmente en la tabla 4.
Tabla 5
Ensayo de diferenciacion de osteoblastos. Deposicion de calcio en el dfa 13
Concentracion del compuesto 1 (pM)
0,004 0,012 0,037 0,11 0,33 1,0 3,0
Porcentaje de actividad (%) en comparacion con BL
145(***) 167(***) 180(***) 144(*) 59([**]) 12([***]) 4([***])
Conclusion
[0166] Los inhibidores de referencia OPG y E64 inhibieron significativamente la diferenciacion y actividad de osteoclastos, respectivamente, y el estimulador de referencia 17p-estradiol estimulo significativamente la diferenciacion y la actividad de osteoblastos describiendo que los ensayos se llevaron a cabo con exito y los resultados obtenidos son fiables. El compuesto 1 mostro una inhibicion dependiente de la dosis de la diferenciacion de osteoclastos que fue significativa con concentraciones de 0,11, 0,33, 1,0 y 3,0 pM. El analisis microscopico mostro que las concentraciones de 0,11 y 0,33 pM del Compuesto 1 no afectaron el numero de celulas mononucleares positivas Hoechst y TRACP, lo que sugiere la inhibicion espedfica de la diferenciacion de osteoclastos. Sin embargo, las concentraciones de 1,0 y 3,0 pM disminuyeron el numero de celulas mononucleares positivas Hoechst y TRACP, lo que sugiere que los efectos inhibidores observados con estas concentraciones son al menos en parte citotoxicos.
[0167] El compuesto 1 no tuvo efectos sobre la actividad de resorcion de los osteoclastos con las concentraciones ensayadas. El compuesto 1 mostro una estimulacion dependiente de la dosis de la diferenciacion de osteoblastos con concentraciones de 0,012, 0,037, 0,11, 0,33 y 1,0 pM y efectos inhibidores con una concentracion de 3,0 pM. El compuesto 1 mostro una estimulacion dependiente de la dosis de la actividad de formacion de hueso de los osteoblastos con concentraciones de 0,004, 0,012, 0,037 y 0,11 pM y efectos inhibidores con concentraciones de 0,33, 1,0 y 3,0 pM. Como conclusion, las concentraciones de 0,004, 0,012, 0,037 y 0,11 pM del Compuesto 1 mostraron efectos beneficiosos sobre las celulas oseas, activando la formacion de hueso osteoblastico y que no tiene efectos o inhiben la formacion de osteoclastos de resorcion osea.
Referencias
[0168]
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Bagger YZ, Foged NT, Andersen L, Lou H, Qvist P (1999) CrossLaps for culture: An improved enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring bone resorption in vitro. J Bone Miner Res 14, Suppl. 1, S370.
Bellows CG, Aubin JE (1989) Determination of the number of osteoprogenitors in isolated fetal rat calvarial cells in vitro. Develop Biol 113:8-13.
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Boyde A, Ali NN, Jones SJ (1984) Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. Br Dent J 156:216-220. Chambers TJ, Revell PA, Fuller K, Athanasou NA (1984) Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. J Cell Sci 66:383-399.
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Fagerlund KM, Rissanen JP, Suutari T, Chan A, Halleen JM (2009) Validation of an in vitro osteoblast culture model using estrogen responsive KS483 mouse osteoblast precursor cell line. J Bone Miner Res 24 (Suppl 1). Disponible en
http://www.asbmr.org/Meetings/AnnualMeeting/AbstractDetail.aspx?aid=9815c5a5-00eb4952-b1aa-838899f5e151. Accedido el 1 de octubre de 2009.
Lowry OH, Roberts NR, Wu ML, Hixon WS, Crawford EJ (1954) The quantitative histochemistry of brain. II. Enzyme measurements. J Biol Chem 207:19-37.
Rissanen JP, Suominen MI, Peng Z, Morko J, Rasi S, Risteli J, Halleen JM (2008) Short-term changes in serum PINP predict long-term changes in trabecular bone in the rat ovariectomy model. Calcif Tissue Int 82:155-161.
Rissanen JP, Ylipahkala H, Fagerlund KM, Long C, Vaananen hK, Halleen JM (2009) Improved methods for testing antiresorptive compounds in human osteoclast cultures. J Bone Miner Metab 27:105-109.
Ejemplo 2
Efectos a corto plazo del Compuesto 1 sobre los marcadores de recambio oseo en el modelo de ovariectomfa de rata (OVX)
[0169] El objetivo de este estudio fue investigar los efectos a corto plazo del compuesto I sobre marcadores sericos bioqufmicos del metabolismo oseo en un estudio de prevencion en un modelo de ovariectomfa de rata (OVX) para la osteoporosis postmenopausica. Se uso 17 p-estradiol (E2) como compuesto de referencia. Los siguientes cinco grupos experimentales fueron incluidos en el estudio:
1) ratas de control operadas simuladamente que recibieron vehfculo (5 ml/kg/d p.o.)
2) ratas de control OVX que recibieron vehfculo (5 ml/kg/d p.o.)
3) ratas de control OVX que recibieron 17 p-estradiol (4 pg/kg/d s.c.)
4) ratas de control OVX que recibieron compuesto de ensayo compuesto 1 (1 mg/kg/d p.o.)
5) ratas de control OVX que recibieron compuesto de ensayo compuesto 1 (3 mg/kg/d p.o.)
[0170] Cada grupo contenfa ocho ratas hembra (Sprague-Dawley) que tenfan tres meses de edad en el comienzo de la fase en vida del estudio. Antes del inicio de la fase en vida, los animales se pesaron, se recogieron sus muestras de sangre, y los animales fueron asignados al azar a los grupos de estudio por estratificacion de acuerdo con el peso corporal y los niveles sericos de propeptido N-terminal de procolageno de tipo I (PINP). Al comienzo de la fase en vida, los animales se pesaron y fueron operados. El tratamiento se inicio un dfa despues de las operaciones y continuo una vez al dfa durante dos semanas. Se utilizo agua esteril como vehfculo en los grupos 1 y 2. Se determino el peso corporal despues de una semana de tratamiento y las dosis de tratamiento se ajustaron en consecuencia. Despues de dos semanas de tratamiento, los animales se pesaron, se recogieron sus muestras de sangre, los animales fueron sacrificados, y se determino su peso uterino relativo. Para el analisis de los efectos a corto plazo de los tratamientos, se determinaron los niveles de cuatro biomarcadores del metabolismo oseo en muestras de suero recogidas antes del comienzo y al final de la fase en vida. Estos biomarcadores incluyen PINP como marcador de la formacion de hueso, fragmento medio N-terminal de la osteocalcina (OC) como marcador general de recambio oseo, telopeptidos reticulados C-terminales de colageno de tipo I (CTX) como marcador de la resorcion osea, e isoforma 5b de fosfatasa acida resistente a tartrato (TRACP 5b) como marcador de numero de osteoclastos. Los niveles en suero en el dfa -7 se usaron como niveles de referencia y los niveles sericos en el dfa 14 como los niveles afectados por las operaciones y tratamientos.
[0171] La ovariectomfa quirurgica aumento el peso corporal, disminuyo el peso uterino relativo, aumento los niveles sericos de CTX, OC y PINP, y disminuyo la actividad de TRACP 5b en suero en ratas hembra despues de dos semanas despues de la cirugfa. Estos resultados de biomarcadores del metabolismo oseo indican que la ovariectomfa aumento la resorcion osea, aumento el recambio oseo y la formacion de hueso, y disminuyo el numero total de osteoclastos. Estas conclusiones implican que la ovariectomfa quirurgica acelera la tasa de recambio oseo en ratas hembras.
[0172] Los efectos a corto plazo de 17 p-estradiol se estudiaron mediante la comparacion de los animales OVX tratados con 17 p-estradiol a la dosis subcutanea de 4 pg/kg/d con animales OVX tratados con vehfculo. El tratamiento con 17 p-estradiol tenia los siguientes efectos sobre el peso corporal, el peso uterino relativo y biomarcadores del metabolismo oseo en ratas OVX:
- El tratamiento con 17 p-estradiol impidio la ganancia inducida por OVX en el peso corporal y la reduccion inducida por OVX en el peso uterino relativo.
- El tratamiento con 17 p-estradiol impidio el aumento inducido por OVX en los niveles en suero de CTX, OC y PINP.
- El tratamiento con 17 p-estradiol no afecto a la reduccion inducida por OVX en la actividad de TRACP 5b en suero.
[0173] Los resultados de biomarcadores del metabolismo oseo indican que el tratamiento con 17 p-estradiol a la dosis
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subcutanea de 4 pg/kg/d impidio la mejora inducida por OVX en la resorcion osea y el aumento inducido por OVX en el recambio oseo y la formacion de hueso, pero no afecto a la reduccion inducida por OVX en el numero total de osteoclastos en ratas OVX despues de dos semanas de tratamiento. Estas conclusiones implican que el tratamiento con 17 p-estradiol a la dosis subcutanea de 4 pg/kg/d impidio la aceleracion inducida por OVX en la tasa de recambio oseo en ratas hembra.
[0174] Los efectos a corto plazo del Compuesto 1 se estudiaron mediante la comparacion de los animales OVX tratadas con el Compuesto 1 a las dosis orales de 1 y 3 mg/kg/d con animales OVX tratados con vehfculo. El tratamiento con compuesto 1 tenia los siguientes efectos sobre el peso corporal, el peso uterino relativo y los biomarcadores del metabolismo oseo en ratas OVX:
- El tratamiento con Compuesto 1 a la dosis oral de 1 mg/kg/d impidio parcialmente la ganancia inducida por OVX en el peso corporal.
- El tratamiento con el Compuesto 1 a las dosis orales de 1 y 3 mg/kg/d no afecto a la reduccion inducida por OVX en el peso uterino relativo.
- El tratamiento con el Compuesto 1 a la dosis oral de 3 mg/kg/d mejoro el aumento inducido por OVX en los niveles de PINP en suero y la reduccion inducida por OVX en la actividad de TRACP 5b en suero.
- El tratamiento con el Compuesto 1 a las dosis orales de 1 y 3 mg/kg/d no afecto al aumento inducido por OVX en los niveles de CTX y OC en suero.
[0175] Los resultados de biomarcadores del metabolismo oseo indican que el tratamiento con el Compuesto 1 a la dosis oral de 3 mg/kg/d mejoro el aumento inducido por OVX en la formacion de hueso y la reduccion inducida por OVX en el numero total de osteoclastos, pero no afecto el aumento inducido por OVX en la resorcion osea y recambio oseo en ratas OVX despues de dos semanas de tratamiento. La formacion de hueso mejorada en asociacion con el numero total reducido de los osteoclastos y los niveles inalterados de la resorcion osea implican que el tratamiento con el Compuesto 1 a la dosis oral de 3 mg/kg/d desplazo el recambio oseo estimulado por OVX hacia la formacion de hueso en ratas hembras.
Descripcion
[0176] La osteoporosis humana es una enfermedad esqueletica sistemica caracterizada por una baja masa osea y deterioro de la microarquitectura osea, que conduce a la fragilidad osea y mayor riesgo de fractura (Raisz et al. 2008). La naturaleza cronica de la osteoporosis hace que sea cada vez mas caro para la sociedad. Como se estima que la esperanza de vida aumenta, tambien se estima que la frecuencia de osteoporosis aumentara causando una carga adicional a nuestro sistema de salud. Aunque terapias eficaces ya estan disponibles para el tratamiento de la osteoporosis, nuevas terapias son necesarias con una mejor ventana terapeutica, es decir, una relacion eficacia/seguridad mejorada. Los estudios de eficacia preclinicos con modelos animales para la osteoporosis proporcionan informacion de primera mano sobre los efectos de nuevas terapias potenciales antes de proceder con ellos para ensayos clinicos (Rissanen y Halleen 2010). Las autoridades reguladoras de la administracion de farmacos han aprobado ratas gonadectomizadas que sufren de osteopenia para ser utilizadas como modelo animal pequeno predictivo en la prueba de la eficacia preclinica de nuevas terapias potenciales para el tratamiento de osteoporosis.
[0177] El objetivo de este estudio fue investigar los efectos a corto plazo del Compuesto 1 en los marcadores bioquimicos sericos del metabolismo oseo en un estudio de prevencion en un modelo de ovariectomia de ratas (OVX) para la osteoporosis postmenopausica. Se uso 17p-estradiol (E2) como compuesto de referencia (Lindsay y Cosman 2008). Los siguientes cinco grupos experimentales fueron incluidos en el estudio:
1) ratas de control operadas simuladamente que recibieron vehfculo (5 ml/kg/d p.o.)
2) ratas de control OVX que recibieron vehfculo (5 ml/kg/d p.o.)
3) ratas de control OVX que recibieron 17 p-estradiol (4 pg/kg/d s.c.)
4) ratas OVX que recibieron compuesto 1 (1 mg/kg/d p.o.)
5) ratas OVX que recibieron compuesto 1 (3 mg/kg/d p.o.)
[0178] Cada grupo contenfa ocho ratas hembra (Sprague-Dawley) que tenfan tres meses de edad en el comienzo de la fase en vida del estudio. El diseno experimental del estudio se presenta en la figura 1. Los animales fueron asignados al azar a los grupos de estudio por estratificacion de acuerdo con el peso corporal y se midieron los niveles sericos de propeptido N-terminal de procolageno de tipo I (PINP) una semana antes del inicio de la fase en vida (en el dfa -7). Al comienzo de la fase en vida (en el dfa 0), los animales se pesaron, los animales en los grupos 2-5 se ovariectomizaron y los animales en el grupo 1 se operaron de forma simulada. El tratamiento se inicio un dfa despues de las operaciones y continuo una vez al dfa durante dos semanas (hasta el dfa 13). Se utilizo agua esteril como vehfculo en los grupos 1 y 2. Se determino el peso corporal al inicio de la fase en vida (en el dfa 0), despues de una semana de tratamiento de la fase en ida (en el dfa 7) y al final de la fase en vida (en el dfa 14). Las dosis de tratamiento se ajustaron segun el ultimo peso corporal obtenido. Despues de dos semanas de tratamiento (en el dfa 14), los animales se pesaron, se recogieron sus muestras de sangre, los animales fueron sacrificados, y se determino su peso uterino relativo. Para el analisis de los efectos a corto plazo de los tratamientos, se determinaron los niveles de cuatro biomarcadores del metabolismo oseo en muestras de suero recogidas antes del comienzo (en el dfa -7) y al final (en el dfa 14) de la fase en vida. Estos marcadores bioquimicos en suero incluyen PINP, fragmento medio N-terminal de la osteocalcina (OC),
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telopeptidos reticulados C-terminales de colageno de tipo I (CTX) e isoforma 5b de fosfatasa acida resistente a tartrato (TRACP 5b). Los niveles en suero obtenidos en el dfa -7 se usaron como niveles de referencia y los niveles sericos obtenidos en el dfa 14 como los niveles afectados por las operaciones quirurgicas y tratamientos.
Materiales y equipamiento
Compuesto 1
[0179] El compuesto solido 1 se almaceno a temperatura ambiente en un ambiente seco durante todo el estudio. Se prepararon suspensiones de dosificacion nuevas del Compuesto 1 sobre una base diaria. Se formularon alfcuotas diarias del compuesto solido en agua esteril (Baxter, Deerfield, IL, EE.UU.) que inclma una pequena cantidad de cloruro de hidrogeno (HCl; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) de la siguiente manera.
[0180] Para el Grupo Experimental 4. Se dispersaron 4,5-5,8 mg del Compuesto 1 en 22,5-29,0 ml de agua esteril que da lugar a una suspension de dosificacion que contema 0,2 mg/ml del Compuesto 1. Las caractensticas de la formulacion se mejoraron mediante la adicion de 7,5-9,7 pl de HCl 1N en la suspension de dosificacion.
[0181] Para el Grupo Experimental 5. Se dispersaron 10,4-17,4 mg del Compuesto 1 en 17,333-29,0 ml de agua esteril que da lugar a una suspension de dosificacion que contema 0,6 mg/ml del Compuesto 1. Las caractensticas de la formulacion se mejoraron mediante la adicion de 17,3-29,0 pl de HCl 1N en la suspension de dosificacion.
[0182] Cada parte alfcuota diaria del compuesto solido se mezclo con agua esteril mediante agitacion con vortex breve. La dispersion del compuesto fue facilitado por sonicacion en bano de agua (Finnsonic Ultrasonic Cleaner Modelo m03; Finnsonic, Lahti, Finlandia) durante un minuto seguido por agitacion con vortex durante cinco segundos. Este procedimiento de sonicacion y agitacion con vortex se repitio hasta 3 - 5 veces. Las caractensticas de la formulacion se mejoraron mediante la adicion de una pequena cantidad de HCl en cada suspension de dosificacion. La dispersion del compuesto se facilito adicionalmente mediante la repeticion del procedimiento de sonicacion y agitacion con vortex hasta 1-2 veces.
[0183] Se utilizaron suspensiones de dosificacion homogeneas finas para tratar a los animales en los grupos experimentales 4 y 5 dentro de una hora despues de la formulacion del compuesto. El tratamiento de los animales comenzo un dfa despues de su operacion quirurgica OVX (en el dfa 1) y continuo una vez al dfa durante dos semanas (hasta el dfa 13).
[0184] Las suspensiones de dosificacion se administraron por via oral a un volumen de 5 ml/kg, lo que da lugar a una dosis de compuesto 1 oral de 1 mg/kg/d en el grupo experimental 4 y una dosis de compuesto 1 oral de 3 mg/kg/d en el grupo experimental 5. Las suspensiones de dosificacion se mezclaron con frecuencia durante la administracion con el fin de tratar a los animales con suspensiones de dosificacion lo mas homogeneas posibles. El sobrante de suspensiones de dosificacion diarias se dispuso correctamente despues de cada dfa de administracion y el resto del Compuesto 1 solido se almaceno despues de la fase en vida.
Compuesto de referencia 17 P-estradiol
[0185] Se uso 17 P-estradiol (E2; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como compuesto de referencia en el estudio. El compuesto de referencia se manipulo de acuerdo con las instrucciones detalladas proporcionadas por el proveedor. La solucion madre de 17 P-estradiol se preparo de benzoato de bencilo (Sigma-Aldrich) en un vial de vidrio, teniendo cuidado de que el
[0186] 17 P-estradiol se disolviera completamente, de la siguiente manera:
[0187] Para el Grupo Experimental 3. Se disolvieron 1,6 mg de 17p-estradiol en 80,0 ml de benzoato de bencilo, dando como resultado una solucion madre que contiene 20 pg/ml de 17 P-estradiol. La solucion madre se almaceno en su vial de vidrio a 4°C en la oscuridad hasta su uso diario durante dos semanas. A partir de la solucion madre, se preparo una solucion de dosificacion nueva sobre una base diaria, de la siguiente manera:
[0188] Para el Grupo Experimental 3. 1 ml de la solucion madre se diluyo en 4 ml de aceite de ricino (aceite de ricino; lote # 319108624; Cat. 4702,1; Carl Roth, Karlsruhe, Alemania), se mezclo a fondo, y se mantuvo en la oscuridad. La solucion de dosificacion nueva contema 4 pg/ml de 17 P-estradiol y exhibio 20% de benzoato de bencilo y 80% de aceite de ricino como su composicion vetuculo. La solucion se utiliza para tratar a los animales en el grupo experimental 3. Su tratamiento se inicio un dfa despues de su operacion quirurgica OVX (en el dfa 1) y continuo una vez al dfa durante dos semanas (hasta el dfa 13). La solucion de dosificacion se administro por via subcutanea en un volumen de 1 ml/kg, lo que resulta en una dosis subcutanea de 17 P-estradiol de 4 pg/kg/d. El sobrante de la solucion de dosificacion diaria se dispuso correctamente despues de cada administracion diaria y el resto de la solucion madre despues de la fase en vida.
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Vehfculo
[0189] Dos grupos que recibieron vehfculo compuesto de ensayo se incluyeron en el estudio, a saber los grupos experimentales 1 y 2. La solucion de vehfculo fue agua esteril y se almaceno a 4°C hasta su uso diario durante dos semanas. El tratamiento de animales en los grupos 1 y 2 se inicio un dfa despues de sus operaciones quirurgicas (en el dfa 1) y continuo una vez al dfa durante dos semanas (hasta el dfa 13). La solucion de vehfculo se administro por via oral a un volumen de 5 ml/kg, lo que resulta en una dosis oral de vehfculo de 5 ml/kg/d. El sobrante de vehfculo se dispuso correctamente despues de la fase en vida.
Descripcion de los procedimientos utilizados
[0190] Los marcadores bioqufmicos del metabolismo oseo son herramientas utiles para el seguimiento de la terapia de la osteoporosis y para la prediccion del riesgo de fractura y de los cambios a largo plazo en la densidad mineral osea (Cremers et al. 2008). En este estudio, las muestras de suero se usaron para medir los niveles de cuatro marcadores bioqufmicos del metabolismo oseo (Rissanen et al 2008a, Rissanen et al 2008b); a saber PINP utilizado como un marcador de la formacion de hueso (Rat/Mouse PINP EIA; Immunodiagnostic Systems Ltd, Boldon, Reino Unido), OC utilizado como un marcador general de recambio oseo (Rat-MID osteocalcin EIA; Immunodiagnostic Systems Ltd), CTX utilizado como un marcador de la resorcion osea (RatLaps [CTX-I] EIA; Immunodiagnostic Systems Ltd), y TRACP 5b utilizado como un marcador del numero de osteoclastos (Rattrap [TRACP 5b] ELISA; Immunodiagnostic Systems Ltd). OC se utilizo como marcador general de recambio oseo, ya que es secretada en la circulacion durante la formacion de hueso y la resorcion osea (Cremers et al. 2008). Los niveles sericos de estos cuatro marcadores bioqufmicos se determinaron en muestras recolectadas antes del inicio de la fase en vida del estudio (en el dfa 7) y al final de la fase en vida (en el dfa 14). Los niveles obtenidos en el dfa 7 se usaron como niveles de lfnea de base y los niveles obtenidos en el dfa 14 como los niveles afectados por las operaciones quirurgicas y tratamientos. Los ensayos se realizaron segun las instrucciones proporcionadas por el proveedor y sus resultados se cuantificaron utilizando el contador VICTOR2™ Multilabel (PerkinElmer, Waltham, mA, EE.UU.). Se recogio la sangre para las muestras de suero de la vena lateral de la cola despues de un ayuno durante la noche con el fin de evitar la variabilidad diurna. Los niveles de PINP y TRACP 5b se midieron en muestras de suero diluidas en las proporciones de 1:5 y 1:4, respectivamente, y los niveles de OC y CTX se determinaron en el suero sin ninguna dilucion de la muestra. Las mediciones de muestras, cuyos resultados estaban por debajo o por encima de los lfmites de deteccion de los ensayos se habrfan repetido, pero estos resultados no fueron obtenidos en este estudio. Las mediciones de muestras cuyos valores fueron sustancialmente diferentes del valor medio de su grupo experimental se habrfan repetido tambien, incluidos los valores con una diferencia de mas de 2,5 veces la desviacion estandar (SD) del grupo. Sin embargo, estos tipos de valores no fueron obtenidos en este estudio.
Procedimiento
Fase en vida del estudio
[0191] La fase en vida incluyo alojamiento y la manipulacion de los animales, operaciones quirurgicos OVX y simuladas, la dosificacion, la determinacion del peso del cuerpo y el peso uterino relativo, sacrificio, y recogida de muestras de sangre. Las operaciones quirurgicas OVX y simuladas se realizaron bajo anestesia y la analgesia utilizando un enfoque dorsal (Peng et al. 1994, Wronski et al. 1986). En la operacion oVx, los ovarios se extrajeron junto con oviductos y una pequena porcion del utero. La anestesia se realizo con inyecciones de medetomidina (0,6 mg/kg s.c.; CP-Pharma Handelsgesellschaft, Burhdorf, Alemania), queetamina (30 mg/kg s.c.; Ketaminol; Intervetn International, Boxmeer, Pafses Bajos) y atipamezol (2 mg/kg s.c.; Revertor; CP-Pharma Handelsgesellschaft). La analgesia postoperatoria se realizo utilizando buprenorfina (25-37,5 pg/kg s.c.; Temgesic; Schering-Plough, Kenilworth, NJ, EE.UU.) administrada antes de las operaciones quirurgicas y en la manana siguiente. Carprofeno (5 mg/kg s.c.) iba a ser utilizado como analgesico durante el estudio cuando fuera necesario, pero no fue necesario. Al final de la fase en vida (en el dfa 14), los animales se sacrificaron mediante asfixia utilizando una mezcla de CO2-O2 bajo anestesia y por dislocacion cervical posterior. Los siguientes cinco grupos experimentales fueron incluidos en el estudio:
1) ratas de control con operacion simulada que recibieron vehfculo (5 ml/kg/d p.o.)
2) ratas de control OVX que recibieron vehfculo (5 ml/kg/d p.o.)
3) ratas de control OVX que recibieron 17 p-estradiol (4 micras g/kg/d s.c.)
4) ratas OVX que recibieron compuesto de ensayo cabozantinib (1 mg/kg/d p.o.)
5) ratas OVX que recibieron compuesto de ensayo cabozantinib (3 mg/kg/d p.o.)
[0192] Cada grupo contenfa ocho ratas hembra Sprague-Dawley que tenfan tres meses de edad en el comienzo de la fase en vida. El diseno experimental del estudio se presenta en la Figura 1. La salud de los animales se controlo dos veces al dfa durante la semana y una vez al dfa durante los fines de semana durante toda la fase en vida. A los animales se les permitio aclimatarse al medio de la instalacion para animales durante once dfas antes del inicio de la fase en vida. Los animales se pesaron y sus muestras de sangre se recogieron de la vena lateral de la cola una semana antes del inicio de la fase de la vida (en el dfa -7). Los animales fueron asignados al azar a los grupos de estudio de la estratificacion en funcion de su peso corporal y los niveles sericos de PINP.
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[0193] Los animales en mal estado de salud no se asignaron a los grupos, pero estos animales no se observaron en este estudio. Los animales fueron identificados por las marcas de la cola y dos animales del mismo grupo experimental fueron alojados en cada jaula en condiciones controladas de temperatura y luz y con acceso ilimitado a agua corriente y una comida de rata estandar (Teklad Dieta Global 2016; Harlan Laboratories, Madison, WI, Estados Unidos). Al comienzo de la fase en la vida (en el dfa 0), los animales se pesaron, los animales de los grupos 2-5 fueron ovariectomizados, y los animales en el grupo 1 fueron operados de forma simulada. Las operaciones quirurgicas se realizaron bajo anestesia y analgesia. El tratamiento se inicio un dfa despues de las operaciones y continuo una vez al dfa durante dos semanas (hasta el dfa 13). Se utilizo agua esteril como vehfculo en los grupos 1 y 2. El peso corporal se determino al comienzo de la fase en vida (en el dfa 0), una semana despues del inicio de la fase en vida (en el dfa 7), y al el final de la fase en vida (en el dfa 14). Las dosis de tratamiento se ajustaron segun el ultimo peso corporal obtenido. Despues de dos semanas de tratamiento (en el dfa 14), los animales se pesaron, se recogieron sus muestras de sangre, los animales fueron sacrificados, y se determino su peso uterino relativo.
Recogida y procesamiento de muestras de estudio
[0194] Se recogieron muestras de estudio, se manipularon y almacenaron como se describe a continuacion. Todas las condiciones que pueden haber afectado la integridad de las muestras y/o integridad de los datos primarios obtenidos usando las muestras se controlaron durante todo el estudio. Todas las muestras fueron marcadas conteniendo al menos la siguiente informacion: numero de estudio, numero de grupo de tratamiento, numero de animal, y el nombre de la muestra.
Muestras de sangre
[0195] Se recogio sangre con un volumen de 0,6 ml para muestras de suero antes del inicio de la fase en vida del estudio (en el dfa -7) y al final de la fase en la vida (en el dfa 14). La recogida de sangre se realizo de la vena lateral de la cola despues de un ayuno durante la noche, y se evito la hemolisis durante el procesamiento de recogida de sangre y suero. La sangre se recogio en tubos de gel de suero incluyendo sflice de aluminio como activador de la coagulacion (Multivette 600; Sarstedt AG & Co, Numbrecht, Alemania). Despues de la recogida de cada muestra, su tubo se mezclo suavemente y se dejo que la sangre se coagulara durante 30-60 minutos. Despues de la coagulacion, la muestra se centrifugo a 2500 g durante 10 minutos. El suero resultante se separo y se transfirio a un tubo de muestra limpio. Se obtuvieron alfcuotas con volumenes de 30, 50, 50 y 60 pl de cada muestra para ser utilizadas para las mediciones de los niveles de PINP, OC, CTX y TRACP 5b en suero, respectivamente. Estas alfcuotas y el suero remanente se congelaron y almacenaron a -70°C.
Analisis experimentales
[0196] El diseno experimental del estudio se representa en la Figura 6. Los analisis experimentales de hueso llevados a cabo en el estudio incluyeron mediciones de los niveles sericos de biomarcadores del metabolismo oseo. Estos analisis se realizaron por Pharmatest.
Analisis de hueso
[0197] Los analisis de hueso realizados en el estudio incluyeron el seguimiento de los niveles sericos de biomarcadores del metabolismo oseo. Estos marcadores bioqufmicos del metabolismo oseo incluyen PINP utilizado como un marcador de la formacion de hueso, OC utilizada como un marcador general de recambio oseo, CTX utilizados como un marcador de la resorcion osea, y TRACP 5b utilizada como un marcador del numero de osteoclastos. Sus niveles se determinaron en muestras de suero recogidas antes del comienzo de la fase en vida del estudio (en el dfa -7) y al final de la fase en vida (en el dfa 14). Los niveles obtenidos en el dfa -7 se usaron como niveles de la lfnea de base y los niveles obtenidos en el dfa 14 como los niveles afectados por las operaciones quirurgicas y tratamientos. El material de estudio sobrante de los estudios experimentales esta disponible para analisis adicionales y/o puede ser entregado al sponsor para otros analisis a peticion del sponsor. Este material ha incluido el resto de las muestras de suero recogidas durante el estudio y almacenadas a - 70°C.
Analisis estadfstico
[0198] Todos los datos relevantes se presentan como figuras y una tabla (media, SD y la significacion estadfstica) y como un apendice (datos individuales) con unidades. Los valores dentro de un grupo que muestran una diferencia de mas de dos veces SD del valor medio del grupo y con una causa de procedimiento para la desviacion serfan considerados como valores atfpicos y retirados del analisis. Tales valores no se obtuvieron en este estudio.
[0199] Los analisis estadfsticos se realizaron con el software estadfstico SPSS para Windows version 19 (SPSS; Chicago, IL, EE.UU.) como pruebas bilaterales. Un valor de p menor que 0,05 fue considerado como estadfsticamente significativo. El uso de transformaciones y pruebas no parametricas se decidio despues de examinar supuestos de modelos estadfsticos, es decir, la normalidad de la distribucion de datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk y homogeneidad de las varianzas por el test de Levene. En un caso de violacion de estas suposiciones, se aplico transformacion logarftmica o de otro tipo adecuado (es decir, la rafz cuadrada y recfprocas). Si los supuestos de los
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modelos estadfsticos se cumplieron como tal o despues de las transformaciones, se evaluaron las diferencias entre grupos usando analisis parametrico de una via de la varianza (ANOVA). Si el ANOVA de una via revelo diferencias estadfsticamente significativas, se utilizo la prueba de Dunnett para comparaciones estadfsticas entre los grupos. Si las suposiciones de los modelos estadfsticos no se cumplieron, incluso despues de las transformaciones, se utilizo la prueba no parametrica de Kruskal-Wallis para evaluar las diferencias entre los grupos. Si la prueba de Kruskal-Wallis revelo diferencias estadfsticamente significativas, se utilizo la prueba de Mann-Whitney para las comparaciones estadfsticas entre los grupos.
Mediciones de seguimiento
[0200] Las mediciones de seguimiento realizadas en el estudio incluyeron la determinacion del peso corporal y mediciones de los niveles sericos de biomarcadores del metabolismo oseo. Los analisis estadfsticos de los datos se realizaron usando un cambio relativo en cada animal. Para calcular el cambio relativo en la primera semana de la fase en vida del estudio, un valor obtenido una semana despues del inicio de la fase en vida (el dfa 7) fue dividido por un valor obtenido al inicio de la fase en vida (en el dfa 0). Para el calculo del cambio relativo en la fase en vida, un valor obtenido al final de la fase en vida (en el dfa 14) fue dividido por un valor obtenido al comienzo de la fase en vida (en el dfa 0) o antes del inicio de la fase en vida (en el dfa -7).
Mediciones de punto final
[0201] Las mediciones de punto final realizadas en el estudio incluyeron la determinacion del peso uterino relativo y la determinacion del peso corporal y mediciones de los niveles sericos de PINP utilizados para la aleatorizacion de los animales a grupos de estudio. Los analisis estadfsticos de los datos se realizaron con los valores obtenidos al final de la fase en vida del estudio (el dfa 14) y una semana antes del inicio de la fase en vida (en el dfa -7) como tal.
Comparaciones entre grupos
[0202] Se realizaron las siguientes comparaciones estadfsticas entre los grupos:
- Los efectos a corto plazo de la ovariectomfa se estudiaron mediante la comparacion de los animales de control OVX tratados con vehfculo (grupo 2) con los animales de control con operacion simulada tratados con vehfculo (grupo 1).
- Los efectos a corto plazo de los tratamientos se estudiaron mediante la comparacion de los animales OVX tratados con los compuestos de ensayo y de referencia (grupos 3-5) con los animales de control OVX tratados con vehfculo (grupo 2).
Resultados
[0203] En este estudio, las ratas hembra Sprague-Dawley fueron ovariectomizadas y operadas de forma simulada a la edad de tres meses. Su tratamiento se inicio un dfa despues de las operaciones quirurgicas, y los efectos del tratamiento fueron seguidos durante dos semanas (fase en vida). El compuesto 1 (1 - 3 mg/kg/d p.o.) se utilizo como compuesto de ensayo, 17 p-estradiol (E2; 4 pg/kg/d s.c.) como compuesto de referencia y agua esteril como vehfculo (5 ml/kg/d p.o.). Los efectos de la ovariectomfa se estudiaron mediante la comparacion de los animales de control OVX tratados con vehfculo (grupo 2) con los animales de control con operacion simulada tratados con vehfculo (grupo 1). Los efectos de E2 se estudiaron mediante la comparacion de los animales de control OVX tratados con E2 (grupo 3) con los animales de control OVX tratados con vehfculo (grupo 2). Los efectos de tratamiento con el compuesto 1 se estudiaron mediante la comparacion de los animales OVX tratados con cabozantinib (grupos 4-5) con los animales de control OVX tratados con vehfculo (grupo 2).
[0204] Las tablas 5a y 5b resumen los resultados. Una flecha hacia arriba (t) indica un aumento estadfsticamente significativo y una flecha hacia abajo (^) una disminucion estadfsticamente significativa. Un asterisco (*) indica una significacion estadfstica con un valor de p <0,05, dos asteriscos (**) con un valor de p <0,01, y tres asteriscos (***) con un valor de p <0,001. NS = no significativo.
[0205] De acuerdo con la Tabla 5b, los resultados demuestran que la ovariectomfa quirurgica aumento el peso corporal, disminuyo el peso uterino relativo, aumento los niveles de CTX, OC y PINP en suero, y disminuyo la actividad de TRACP 5b en suero en ratas hembra dos semanas despues de la ovariectomfa.
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Tabla 5a
Efectos a corto plazo del compuesto 1 sobre el peso cor
poral en el modelo OVX de rata
METODO/PARAMETRO
OVX E2 4 |ig/kg/d s.c cabozantinib (mg/kg/d p.o.)
1 3
PESO CORPORAL Peso corporal, cambio Durante la primera
'I'** NS
semana Durante la fase en vida
'I'** NS
PESO UTERINO RELATIVO peso uterino relativo en el
NS NS
dfa 14
Tabla 5a
Efectos a corto plazo del compuesto 1 sobre los biomarcadores del metabolismo oseo en el modelo OVX de
rata
METODO/PARAMETRO
OVX E2 4 pg/kg/d s.c cabozantinib (mg/kg/d p.o.)
1 3
MARCADORES BIOQUIMICOS DE METABOLISMO OSEO Niveles de PINP en suero, cambio Durante la fase en vida Niveles de OC en suero, cambio
'I'** ^** NS t*
Durante la fase en vida
t* ^*** NS NS
Niveles de CTX en suero, cambio Durante la fase en vida
t* ^*** NS NS
Actividad de TRACP 5b en suero, cambio Durante la fase en vida
^*** NS NS ^*
[0206] Los resultados de los biomarcadores indican que la ovariectomfa quirurgica mejoro la resorcion osea, aumento el recambio oseo y la formacion de hueso, y disminuyo el numero total de osteoclastos. Las conclusiones implican que la ovariectomfa acelero la tasa de recambio oseo en ratas hembras. Los resultados que describen los efectos a corto plazo de la ovariectomfa estan en lfnea con los resultados publicados en la literatura que demuestran que el presente estudio se puede utilizar para evaluar la eficacia preclfnica de terapias en ratas OVX (Rissanen et al. 2008a, Rissanen et al. 2008b).
[0207] Tal como se ha indicado, los resultados de biomarcadores del metabolismo oseo indican que el tratamiento con el Compuesto 1 a la dosis oral de 3 mg/kg/d mejoro el aumento inducido por OVX en la formacion de hueso y la reduccion inducida por OVX en el numero total de osteoclastos, pero no afecto el aumento inducido por OVX en la resorcion osea y recambio oseo en ratas OVX despues de dos semanas de tratamiento. La formacion de hueso mejorada en asociacion con el numero total reducido de los osteoclastos y los niveles inalterados de la resorcion osea implican que el tratamiento con el Compuesto 1 a la dosis oral de 3 mg/kg/d desplazo el recambio oseo estimulado por OVX hacia la formacion de hueso en ratas hembras.
Referencias
[0208]
Lindsay R and Cosman F (2008) The pharmacology of estrogens in osteoporosis. In: Bilezikian JP, Raisz LG and Martin TJ (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp. 1769-75.
Raisz LG, Bilezikian JP and Martin TJ (2008) Pathophysiology of osteoporosis. In: Bilezikian JP, Raisz LG and Martin TJ (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp. 1635-47.
Rissanen JP and Halleen JM (2010) Models and screening assays for drug discovery inosteoporosis. Expert Opin Drug Discov. 5: 1163-74.
Cremers S, Garnero P and Seibel MJ (2008) Biochemical markers of bone metabolism. In: Bilezikian JP, Raisz LG and Martin TJ (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp. 1857-81.
Rissanen JP, Suominen MI, Peng Z and Halleen JM (2008a) Secreted tartrate-resistant acid phosphatase 5b is a marker of osteoclast number in human osteoclast cultures and the rat ovariectomy model. Calcif Tissue Int. 82: 108-15.
Rissanen JP, Suominen MI, Peng Z, Morko J, Rasi S, Risteli J and Halleen JM (2008b) Short-term changes in serum PINP predict long-term changes in trabecular bone in the rat ovariectomy model. Calcif Tissue Int. 82: 155-61.
Peng Z, Tuukkanen J, Zhang H, Jamsa T and Vaananen HK (1994) The mechanical strength of bone in different rat models of experimental osteoporosis. Bone. 15: 523-32.
5 Wronski TJ, Walsh CC and Ignaszewski LA (1986) Histologic evidence for osteopenia and increased bone turnover in ovariectomized rats. Bone. 7: 119-23

Claims (12)

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    1. Compuesto 1
    imagen1
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para utilizar en el tratamiento de la osteoporosis, en el que el compuesto 1 se administra entre 0,01 y 25 mg una vez diaria.
  2. 2. Compuesto para utilizar, segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto 1 esta en forma de la sal de malato.
  3. 3. Compuesto para utilizar, segun la reivindicacion 2, en el que el compuesto 1 esta en forma de la sal de (L)-malato o
    (D)-malato.
  4. 4. Compuesto para utilizar, segun la reivindicacion 3, en el que el compuesto 1 esta en forma de la sal de (L)-malato.
  5. 5. Compuesto para utilizar, segun las reivindicaciones 1-4, en el que el compuesto 1 esta en la forma cristalina N-1 de
    la sal de (L)-malato y/o la sal de (D)-malato.
  6. 6. Compuesto para utilizar, segun las reivindicaciones 1-4, en el que el compuesto 1 esta en la forma cristalina N-2 de la sal de (L)-malato y/o la sal de (D)-malato.
  7. 7. Compuesto para utilizar, segun las reivindicaciones 1-6, en el que el compuesto 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, se administra como una composicion farmaceutica comprendiendo adicionalmente un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  8. 8. Compuesto 1:
    imagen2
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para utilizar en el tratamiento de la osteoporosis en pacientes que tienen o actualmente estan en tratamiento para el cancer, en el que el compuesto 1 se administra entre 0,01 y 25 mg una vez diaria.
  9. 9. Compuesto 1:
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    H
    N
    H
    N
    imagen3
    Compuesto 1
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para utilizar en mejorar la deposicion anormal de hueso no estructurado acompanado por el aumento de las fracturas del esqueleto, la compresion de la medula espinal y el dolor oseo severo de la osteoporosis, en el que el compuesto 1 se administra entre 0,01 y 25 mg una vez diaria.
  10. 10. Compuesto para utilizar, segun la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en el que el compuesto 1 esta en forma de la sal de malato.
  11. 11. Compuesto para utilizar, segun la reivindicacion 10, en el que el compuesto 1 esta en forma de la sal de (L)-malato o (D)-malato.
  12. 12. Compuesto para utilizar, segun la reivindicacion 11, en el que el compuesto 1 esta en forma de la sal de (L)-malato.
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