ES2639099T3

ES2639099T3 - Polipéptido de unión a albúmina

Info

Publication number: ES2639099T3
Application number: ES13783052.7T
Authority: ES
Inventors: Per Jonasson; Pär EKLUND
Original assignee: Affibody AB
Current assignee: Affibody AB
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: WO2014064237A1; JP2015534994A; EP2912054B1; AU2013336646A1; JP6382826B2; KR102151289B1; EP2912054A1; HK1210793A1; US20150291668A1; DK2912054T3; KR20150077447A; CA2889037A1; AU2013336646B2; CN104854127A; CN104854127B; US10011641B2; CA2889037C; PL2912054T3

Abstract

Polipéptido de unión al Dominio de Unión a Albúmina, que comprende un motivo de unión al Dominio de Unión a Albúmina BM, cuyo motivo consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: i) EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D en donde, independientemente entre sí, X2 se selecciona entre F, I y L; X3 se selecciona entre H, K, N, Q, R, S, T y V; X4 se selecciona entre A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X6 se selecciona entre F, I, L e Y; X7 se selecciona entre A, H, I, K, L, N, Q, R, S, T y V; X10 se selecciona entre G, H, K, N, Q, R y S; X11 se selecciona entre A, D, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V e Y; X16 se selecciona entre N y T; X17 se selecciona entre F, H, L, S y T; X18 se selecciona entre D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T y V; X20 se selecciona entre H, K y R; X21 se selecciona entre I, L y V; X25 se selecciona entre F, I, L, V e Y; X26 se selecciona entre K y S; X28 se selecciona entre D y E; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 89% con la secuencia definida en i), uniéndose el polipéptido a un Dominio de Unión a Albúmina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NO: 161 y 162.

Description

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I. X2 se selecciona entre F y L;

II. X6 se selecciona entre F y L;

III. X16 es T;

IV.: X20 se selecciona entre H y R;

V.: X21 se selecciona entre I y L;

VI. X25 se selecciona entre I y V;

VII. X26 es K; y

VIII. X28 es d

En algunos ejemplos de un polipéptido de unión a ABD de acuerdo con el primer aspecto, la secuencia i) satisface al menos cinco de las ocho condiciones I-VIII. Más específicamente, la secuencia i) puede satisfacer al menos seis de las ocho condiciones I-VIII, tales como al menos siete de las ocho condiciones I-VIII, tales como todas las condiciones I-VIII.

Según se describe con detalle en la sección experimental a continuación, la selección de variantes de polipéptidos de unión a ABD ha conducido a la identificación de numerosas secuencias de motivos de unión a ABD individuales (BM). Estas secuencias constituyen realizaciones individuales de la secuencia i) de acuerdo con este aspecto. Las secuencias de los motivos de unión a ABD individuales se presentan en la Figura 1 y como los SEQ ID NO: 1-52. En algunas realizaciones de este aspecto, la secuencia i) se selecciona entre uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1-52. Más específicamente, la secuencia i) se puede seleccionar entre uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1-7, tal como entre los SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. En particular, la secuencia i) puede ser el SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el BM como se definió anteriormente "forma parte de" un dominio de proteína de haz de tres hélices. Se entiende que esto significa que la secuencia del BM es "insertada" en

o "injertada" sobre la secuencia del dominio del haz de tres hélices original, de manera que el BM reemplaza un motivo estructural similar del dominio original. Por ejemplo, sin desear estar limitado por la teoría, se cree que el BM constituye dos de las tres hélices de un haz de tres hélices y, por lo tanto, puede reemplazar dicho motivo de dos hélices dentro de cualquier haz de tres hélices. Como comprenderá un experto en la técnica, la sustitución de dos hélices del dominio de haz de tres hélices por el BM de dos hélices tiene que ser realizada de manera que no afecte a la estructura básica del polipéptido. Es decir, el plegamiento general de la cadena principal de Cα del polipéptido de acuerdo con esta realización de la invención es sustancialmente el mismo que el del dominio de proteína del haz de tres hélices del que forma una parte, p.ej. teniendo los mismos elementos de estructura secundaria en el mismo orden etc. Así, un BM de acuerdo con la invención "forma parte" de un dominio de haz de tres hélices si el polipéptido de acuerdo con esta realización de la invención tiene el mismo pliegue que el dominio original, lo que implica que las propiedades estructurales básicas son compartidas; dando como resultado, esas propiedades p.ej. espectros de CD similares. El experto en la técnica conoce otros parámetros que son relevantes.

En realizaciones particulares, el motivo de unión a ABD (BM) forma así parte de un dominio de proteína de haz de tres hélices. Por ejemplo, el BM puede constituir esencialmente dos hélices alfa con un bucle de interconexión, dentro de dicho dominio de proteína de haz de tres hélices. En realizaciones particulares, dicho dominio de proteína de haz de tres hélices se selecciona entre los dominios de proteínas receptoras bacterianas. Los ejemplos no limitantes de tales dominios son los cinco dominios de tres hélices diferentes de Proteína A de Staphylococcus aureus, tales como el dominio B, y sus derivados. En algunas realizaciones, el dominio de proteína de haz de tres hélices es una variante de la proteína Z, que se obtiene del dominio B de la proteína A estafilocócica.

En realizaciones en las que el polipéptido de unión a ABD de la invención forma parte de un dominio de proteína de haz de tres hélices, el polipéptido de unión a ABD puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

iii)

K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;

en donde

[BM] es un motivo de unión a ABD como se ha definido anteriormente;

Xa se selecciona entre A y S;

Xb se selecciona entre N y E;

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Xc se selecciona entre A, S y C; Xd se selecciona entre A y S; y iv) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 81% con una secuencia definida por

iii). Como se discutió anteriormente, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con las secuencias de aminoácidos anteriores sin afectar en gran medida a la estructura terciaria y su función están también dentro del alcance de la presente descripción. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la secuencia iv) tiene una identidad de al menos 83%, tal como al menos 85%, tal como al menos 87%, tal como al menos 89%, tal como al

menos 91%, tal como al menos 93%, tal como al menos 95%, tal como al menos 97% con una secuencia definida por iii). En una realización del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, Xa en la secuencia iii) es A.

En una realización alternativa, Xa en la secuencia iii) es S.

En una realización del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, Xb en la secuencia iii) es N. En una realización alternativa, Xb en la secuencia iii) es E. En una realización del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, Xc en la secuencia iii) es A.

En una realización alternativa, Xc en la secuencia iii) es S. En otra realización alternativa, Xc en la secuencia iii) es C.

En una realización del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, Xd en la secuencia iii) es A. En una realización alternativa, Xd en la secuencia iii) es S. En una realización del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, en la secuencia iii), Xa es A;

Xb es N; Xc es Ay Xdes A.

En una realización adicional del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, en la secuencia iii), Xa es A; Xb es N; Xc es C y Xdes A. En una realización adicional del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, en la secuencia iii),

Xa es S; xb es E; Xc es S y Xdes S.

En una realización adicional del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, en la secuencia iii), Xa es S; Xb es E; Xc es C y Xdes S. En una realización adicional del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, en la secuencia iii),

Xa es S; Xb es E; Xc es A y Xdes A.

En una realización adicional del polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, en la secuencia iii), Xa es S; xb es E; Xc es C y Xdes A. En una realización adicional más, la secuencia iii) en la definición de polipéptidos de unión a ABD anterior se

selecciona entre los SEQ ID NO: 53-104, en particular entre los SEQ ID NO: 53-59. En una realización adicional, la secuencia iii) se selecciona entre los SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56. En particular, la secuencia iii) puede ser el SEQ ID NO: 53.

También, en una realización adicional, se proporciona un polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: v) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P; en donde [BM] Es un motivo de unión a ABD como se ha definido anteriormente y Xc se selecciona entre S y C; y vi) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 83% con una secuencia definida por

v). En otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a ABD como se ha definido anteriormente, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

vii) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDAQA P; 9

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La secuencia xi) en tal polipéptido se puede seleccionar entre uno cualquiera de los SEQ ID NO: 105-156. En particular, la secuencia xi) se puede seleccionar entre uno cualquiera de los SEQ ID NO: 105-111, por ejemplo se puede seleccionar entre los SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108. En una realización específica de este polipéptido, la secuencia xi) es el SEQ ID NO: 105.

El polipéptido de la invención puede estar en forma monomérica o multimérica. En una realización de la presente invención, el polipéptido de unión a ABD está presente en forma multimérica, que comprende al menos dos unidades monoméricas de polipéptido de unión a ABD, cuyas secuencias de aminoácidos pueden ser iguales o diferentes. Las formas multiméricas del polipéptido pueden ser ventajosas porque pueden tener propiedades de unión mejoradas.

En una realización, dichas unidades monoméricas de polipéptido de unión a ABD están acopladas covalentemente entre sí. En una realización particular, las unidades monoméricas de polipéptido de unión a ABD se expresan como una proteína de fusión.

Los polipéptidos se pueden unir mediante acoplamiento covalente utilizando métodos conocidos de la química orgánica, o se pueden expresar como uno o más polipéptidos de fusión en un sistema para la expresión recombinante de polipéptidos, o se pueden unir de cualquier otra forma, ya sea directamente o a través de un conector, por ejemplo un conector de aminoácidos. En una realización, dicho polipéptido de unión a ABD está en forma dimérica. Las posibles formas multiméricas también incluyen formas triméricas. Las formas multiméricas del polipéptido pueden comprender un número adecuado de secuencias polipeptídicas como se ha definido anteriormente.

El experto entenderá que se pueden hacer varias modificaciones y/o adiciones a un polipéptido de unión a ABD de acuerdo con cualquier aspecto descrito en la presente memoria con el fin de adaptar el polipéptido a una aplicación específica sin apartarse del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, cualquier polipéptido de unión a ABD descrito en la presente memoria puede comprender otros aminoácidos C-terminales y/o N-terminales. Semejante polipéptido debe entenderse como un polipéptido que tiene residuos de aminoácidos adicionales en la primera y/o última posición en la cadena polipeptídica, es decir, en el extremo N-y/o C-terminal. De este modo, un polipéptido de unión a ABD puede comprender cualquier número adecuado de residuos de aminoácidos adicionales, por ejemplo al menos un residuo de aminoácido adicional. Cada residuo de aminoácido adicional puede ser añadido individual o colectivamente, por ejemplo, para mejorar la producción, la purificación, la estabilización en vivo o in vitro, el acoplamiento o la detección del polipéptido. Dichos residuos de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos añadidos para el acoplamiento químico, que podría permitir por ejemplo el acoplamiento del polipéptido de unión a ABD a una resina o matriz, por ejemplo una resina basada en Sefarosa o una resina de acoplamiento SulfoLink. Un ejemplo de esto es la adición de un residuo de cisteína como un residuo de aminoácido adicional, o como uno de un número de residuos de aminoácidos adicionales. En una realización, el polipéptido de unión de ABD descrito en la presente memoria comprende un residuo de cisteína en el extremo Cterminal del polipéptido, por ejemplo en el extremo C-terminal. En una realización, dicha cisteína es una parte de un tripéptido VDC adicional C-terminal. En una realización, dicha cisteína es una C C-terminal sola.

En una realización particularmente específica, el polipéptido de unión a ABD comprende un dímero de dos dominios de unión de ABD como se ha definido anteriormente, así como un residuo de cisteína C -terminal.

Tales residuos de aminoácidos adicionales pueden proporcionar también una "etiqueta" para la purificación o detección del polipéptido, tal como una etiqueta His6 o una etiqueta "myc" (c-myc) o una etiqueta "FLAG" para la interacción con anticuerpos específicos de la etiqueta o la cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) en el caso de la etiqueta His6.

Los aminoácidos adicionales descritos anteriormente se pueden acoplar al polipéptido de unión a ABD por medio de conjugación química (utilizando métodos de química orgánica conocidos) o por medio de cualquier otro método, tal como la expresión del polipéptido de unión a ABD como una proteína de fusión.

En un aspecto adicional, se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a ABD como se ha descrito anteriormente. Un vector de expresión que comprende tal polinucleótido puede permitir la producción de un polipéptido de unión a ABD, por ejemplo por medio de la expresión en una célula anfitriona. Tales herramientas para la expresión del polipéptido de unión a ABD descrito en la presente memoria están incluidas en la presente descripción, así como los métodos que las utilizan para la producción recombinante del polipéptido de unión a ABD.

En otra realización de la presente invención se proporciona una combinación del polipéptido de unión a ABD y un agente detectable. En una realización particular, el agente detectable se selecciona entre un agente fluorescente y un agente radiactivo. Los agentes detectables fluorescentes incluyen polipéptidos fluorescentes, tales como proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, luciferasa y variantes de los mismos. Los agentes radiactivos detectables útiles en este contexto incluyen, por ejemplo, radionúclidos tales como 3H e 125I.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones ilustrativas, los expertos en la técnica entenderán que se pueden realizar diversos cambios y que se pueden sustituir equivalentes por elementos de los mismos sin apartarse del alcance de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación o molécula particular a las enseñanzas de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma.

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agarosa anti-ABD llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 8. El punto de inyección de muestra se indica mediante una flecha. Se muestra la señal de absorbancia a 280 nm (línea continua). FT y E se refieren a la fracción de flujo continuo y a la fracción eluida, respectivamente. La elución se realizó con HAc 0,1 M, pH 2,9 y el pH (línea de puntos) se controló mediante el medidor de pH incorporado del sistema de HPLC.

La Figura 9B muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas de la purificación descrita en el Ejemplo 8. Calle 1: Extracto bacteriano aclarado cargado en la columna, Calle 2 y Calle 3: Flujo continuo, Calle 4: Fracción E1, Calle 5: Fracción E2, Calle 6: Fracción E3, Calle 7: Fracción E4, Calle 8: Fracción E5. "M" se refiere al patrón de Proteína pre-coloreada de Novex Sharp (Invitrogen, PM: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3,5 kDa). Se cargaron 5 μl de cada muestra en las calles respectivas del gel de SDS-PAGE.

La Figura 10A muestra un cromatograma de purificación por afinidad de la proteína de fusión a ABD PEP06548 sobre agarosa anti-ABD llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 9. El punto de inyección de muestra se indica mediante una flecha. Se muestra la señal de absorbancia a 280 nm (línea continua). FT y E se refieren a la fracción de flujo y a la fracción eluida, respectivamente. La elución se realizó con HAc 0,1 M, pH 2,9 y el pH (línea de puntos) se controló mediante el medidor de pH incorporado del sistema de HPLC.

La Figura 10B muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas de la purificación descrita en el Ejemplo 9. Calle 1: Extracto bacteriano aclarado cargado en la columna, Calle 2: Fracción E1. "M" se refiere al patrón de Proteína pre-coloreada de Novex Sharp (Invitrogen, PM: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3,5 kDa). Se cargaron 5 μl en la calle M y la calle 1 y se cargaron 5,8 μl en la calle 2 del gel de SDS-PAGE.

La Figura 11A muestra un cromatograma de la purificación de la proteína de fusión a ABD PEP17081 sobre agarosa anti-ABD llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 10. Se muestran la señal de absorbancia a 280 nm (línea continua) y la conductividad (línea punteada). El punto de inyección de muestra se indica mediante una flecha. FT y E se refieren a la fracción de flujo continuo y a la fracción eluida, respectivamente.

La Figura 11B muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas de diferentes etapas de la purificación descritas en el Ejemplo 10. Calle M: 5 µl de Patrón de Proteína pre-coloreada de Novex Sharp, Invitrogen (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3,5 kDa). Calle 1: se cargaron 5 μl del producto lisado de E. coli tratado térmicamente, aclarado en la columna de agarosa anti-ABD. Calle 2: 5 μl del flujo continuo de la columna de agarosa anti-ABD (FT en la Figura 11A). Calle 3: 3,6 µl de la agrupación eluida de la columna de agarosa anti-ABD (E en la Figura 11A). Calle 4: 12 µl de PEP17081 purificado adicionalmente por RPC (cromatografía de fase inversa) y con tampón intercambiado.

La Figura 12A muestra un cromatograma de purificación por afinidad de la Proteína 1, que comprende ABD035 (SEQ ID NO: 159) fusionado en su extremo C a una hormona proteica, sobre agarosa anti-ABD realizada como se describe en el Ejemplo 11. El punto de inyección de muestra se indica mediante una flecha. Se muestran la señal de absorbancia a 280 nm (línea continua) y la conductividad (línea punteada). FT, W y E se refieren a la fracción de flujo continuo, fracciones de lavado y fracción eluída, respectivamente. La primera etapa de lavado, W1, se realizó con 4 CV de TST y la segunda etapa de lavado, W2, con 3 CV de NH4Ac 5 mM, pH 5,5.

La Figura 12B muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas de la purificación descrita en el Ejemplo 11. Calles 1 -3: proteína purificada por SEC: 10 µg (1), 5 µg (2) y 1 µg (3). Calle 4: Muestra de proteína cargada en la columna de agarosa anti-ABD, es decir, la proteína purificada por SEC se diluyó 1:10 en TST. Calle 5: FT concentrado 20 veces. Calle 6: W1 concentrado 60 veces. Calles 7, 8 y 9: Proteína eluida: 10 μg (7), 5 μg (8) y 1 μg (9), respectivamente. Las calles marcadas con "M" se cargaron con un marcador de peso molecular de proteína (PM: 200, 116,3, 97,4, 66,3, 55,4, 36,5, 31, 21,5, 14,4, 6, 3,5, 2,5 kDa). Las flechas indican bandas débiles de proteínas contaminantes que eran visibles en el gel de SDS-PAGE en muestras purificadas sólo por SEC, pero que se eliminaron eficazmente por purificación sobre la resina de agarosa anti-ABD.

La Figura 13A muestra un cromatograma de purificación por afinidad de la Proteína 2, que comprende ABD035 (SEQ ID NO: 159) fusionado en su extremo N a una hormona peptídica, sobre agarosa anti-ABD realizada como se describe en el Ejemplo 12. El punto de inyección de muestra se indica mediante una flecha. Se muestran la señal de absorbancia a 280 nm (línea continua) y la conductividad (línea punteada). FT, W y E se refieren a la fracción de flujo continuo, fracciones de lavado y fracción eluída, respectivamente. La primera etapa de lavado, W1, se realizó con 8 CV de TST y la segunda etapa de lavado, W2, con 3 CV de NH4Ac 5 mM, pH 5,5.

La Figura 13B muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas de la purificación descrita en el Ejemplo 12. Calle 1: Muestra de proteína cargada en la columna de agarosa anti-ABD. Calle 2: FT. Calles 4-6: Fracciones lavadas. Calles 7-13: Fracciones de proteína eluidas dentro del doble pico marcado en la figura 13A. Las fracciones correspondientes al primer pico dentro del pico doble se cargaron en las calles 7-10. Las calles marcadas con "M" se cargaron con un marcador de peso molecular de proteína (PM: 200, 116,3, 97,4, 66,3, 55,4, 36,5, 31, 21,5, 14,4, 6, 3,5, 2,5 kDa).

Ejemplos

Se utilizaron los siguientes materiales a lo largo de este trabajo, excepto cuando se indique lo contrario:

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●: Escherichia coli Cepa XL1-Blue (Agilent Technologies, núm. de catálogo 200268)

●: Dominios de unión a la albúmina ABD001 (SEQ ID NO: 157), C-ABD001 (SEQ ID NO: 158), ABD035 (SEQ ID NO: 159), PP013 (SEQ ID NO: 160), PEP07986 (SEQ ID NO: 161), PEP07911 (SEQ ID NO: 162), producidos esencialmente como se describe en los documentos WO2009/016043 o WO2012/004384.

Ejemplo 1

Selección y escrutinio de las variantes Z de unión a ABD

Materiales y métodos

Biotinilación de la proteína diana: ABD001 con una cisteína N-terminal (C-ABD001; SEQ ID NO: 158) y PEP07911 (SEQ ID NO: 162) se biotinilaron utilizando EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin (Pierce, núm. de catálogo 21901). En resumen, la proteína se disolvió en fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH 7,5. Se añadió ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 20 mM y las muestras se incubaron durante 1 h a 34ºC mezclando por volteo. El tampón se intercambió por tampón de conjugación (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0) utilizando columnas PD-10 desechables (GE Healthcare, núm. de catálogo 17-0851-01). Se añadió un exceso molar de 5 veces (5x) de EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin (disuelto en tampón de conjugación) a las muestras de proteína y la incubación prosiguió durante 2 h a temperatura ambiente (RT) mediante mezclado por volteo. El intercambio subsiguiente de tampón por PBS (fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, pH 7,4) se realizó utilizando columnas PD-10. Se biotiniló PEP07986 (SEQ ID NO: 161) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante a RT durante 30 min utilizando No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, núm. de catálogo 21327) con un exceso molar de 10x. El intercambio subsiguiente de tampón por PBS se realizó utilizando una casete de diálisis (Slide-alyzer 3,5 K, 3500 MWCO, Pierce, núm. de catálogo 66333) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Selección por presentación en fagos de las variantes Z de unión a ABD: Se utilizó una biblioteca de variantes aleatorias de la proteína Z presentada sobre el bacteriófago, construida en el fagémido pAY02047 esencialmente como describen Grönwall et al. (J Biotechnol, 128:162-183, 2007), para seleccionar los polipéptidos de unión a ABD. La biblioteca, Zlib004Naive.l, utiliza la molécula de unión a ADN polimerasa de Taq Z03639 (descrita por Gunneriusson et al., en Protein Eng. 12: 873-878, 1999, donde se denominó ZTaqS1-1) como compañero de fusión. La biblioteca tenía un tamaño real de 1,4 x 1010 variantes

Las provisiones de partida de fago se prepararon en un fermentador de 20 l. Se inocularon células de provisión de partida en glicerol que contenía la biblioteca de fagémidos Zlib004Naive.l en 20 I de TSB-YE (Caldo de Soja tratado con Tripsina-Extracto de levadura, 30 g/l TSB, 5 g/l de extracto de levadura) con un suplemento de glucosa al 2% y 100 μg/ml de ampicilina. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C en un fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Cuando las células alcanzaron una densidad óptica (DO) de 0,7-0,8, se infectaron aproximadamente 2,6 l del cultivo utilizando un exceso molar de 10x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs, núm. de catálogo N0315S). Las células se incubaron durante 30 minutos, después de lo cual el fermentador se llenó hasta 20 l con TSB-YE con un suplemento de IPTG 0,1 mM (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, para la inducción de la expresión), 25 μg/ml de kanamicina y 12,5 µg/ml de carbenicilina, y las células se cultivaron a 30ºC durante 22 h. Las células en el cultivo se sedimentaron por centrifugación a 15900 g y las partículas de fago que quedaban en el medio se hicieron precipitar dos veces en PEG/NaCl (polietilenglicol/cloruro sódico), se filtraron y se disolvieron en PBS y glicerol como describen Grönwall et al., más arriba. Las provisiones de partida de fago fueron almacenadas a -80ºC antes de su uso.

Las selecciones se realizaron en tres ciclos contra las diferentes variantes de ABD biotinilado. La preparación de la provisión de partida de fago, el procedimiento de selección y la amplificación del fago entre ciclos de selección se realizaron esencialmente como se describe para la selección frente a otra diana en el documento WO2009/077175. Se utilizó PBS con un suplemento de gelatina al 0,1% y Tween20 al 0,1% como tampón de selección y los complejos diana-fago fueron capturados directamente por Dynabeads® M-280 Streptavidin (Dynal, núm. de catálogo 112.06). Se utilizó 1 mg de cuentas por 0,25 μg de ABD. Se utilizó E coli cepa XL1-Blue para la amplificación del fago. La selección se realizó en tres ciclos divididos en tres pistas: una pista que utilizaba PEP07911, una pista que utilizaba C-ABD001 y una pista que alternaba entre C-ABD001 y PEP07986. En el ciclo 1 de las selecciones, se utilizaron PEP07911 o C-ABD001 100 nM en las diferentes pistas de selección, y se realizaron dos lavados con PBST al 0,1% (PBS con un suplemento de Tween-20 al 0,1%). Se aplicó una rigurosidad mayor, utilizando una concentración reducida de diana y un mayor número de lavados, en los dos ciclos posteriores. Para las pistas de selección con una sola diana, se utilizaron PEP07911 o C-ABD001 50 nM seguido de 25 nM, en el ciclo 2 y 3, respectivamente. En la pista con la diana alternante, se utilizó PEP07986 75 nM en el ciclo 2 y se utilizó C-ABD001 40 nM en el ciclo 3. Para todas las pistas, se realizaron 4 y 8 lavados en el ciclo 2 y 3, respectivamente, utilizando PBST al 0,1%. Después del lavado, se hicieron eluir los fagos unidos con 500 μl de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,2 seguido de neutralización inmediata con 50 μl de Tris-HCl, pH 8,0 y 450 μl de PBS. En el último ciclo de selección, todas las pistas se hicieron eluir primero con HAc 0,5 M, pH 4,0, seguido de elución con glicina-HCl como se ha descrito anteriormente. A continuación se trataron los diferentes productos eluidos por separado.

Escrutinio ELISA de variantes Z: Para verificar que las moléculas de la variante Z seleccionada podrían interactuar

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ELISA de bloqueo: Los clones positivos para PEP07986 o PEP07911 se sometieron a un análisis de bloqueo que incluía HSA, para ver si las variantes Z tenían sitios de unión solapantes con el ligando natural HSA. Para todos los clones sometidos a ensayo, la señal de unión a PEP07911 se extinguió completamente por la presencia de HSA, alcanzando el mismo nivel que el fondo (Figura 3). La unión del control positivo no se vio afectada por la adición de un exceso de HSA y el blanco no mostró ninguna señal de fondo.

Secuenciación: Se realizó la secuenciación para los clones con valores de absorbancia positivos frente a ABD en el escrutinio por ELISA. A cada variante se le asignó un número de identificación único #####, y las variantes individuales se denominan Z#####. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 residuos de aminoácido de longitud se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 105-156. Los motivos de unión a ABD deducidos de estas variantes Z se denominan BM##### y se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 1-52. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 residuos de aminoácidos de longitud que se ha pronosticado que constituyen el haz de tres hélices completo dentro de cada una de estas variantes Z se denominan P##### y se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 53-104.

Ejemplo 2

Clonación y producción de variantes Z de unión a ABD

Materiales y métodos

Subclonación de variantes Z: Se amplificaron los ADN de siete variantes Z de unión a ABD, Z06608 (SEQ ID NO:107), Z06620 (SEQ ID NO:110 Z06638 (SEQ ID NO:106), Z06650 (SEQ ID NO:108), Z06677 (SEQ ID NO:105), Z06678 (SEQ ID NO:109) y Z06695 (SEQ ID NO:111), a partir del vector de la biblioteca pAY02047. Se aplicó una estrategia de subclonación para la construcción de moléculas de variantes Z diméricas con etiqueta His6 N-terminal y Cys C-terminal utilizando técnicas de biología molecular convencionales y como se describe en detalle en el documento WO 2009/077175 para las variantes Z que se unen a otra diana. Los fragmentos del gen Z se subclonaron en el vector de expresión pAY01449 dando como resultado la secuencia codificada MGSSHHHHHHLQ[Z#####][Z#####]-VDC.

Cultivo y purificación: Se transformaron células BL21 de E coli (DE3) (Novagen) con plásmidos que contenían el fragmento del gen dimérico de cada variante Z respectiva y se cultivaron a 37ºC en 1 l de medio TSB + YE (Caldo de soja tratado con Tripsina con extracto de levadura) con un suplemento de 50 μg/ml de Kanamicina. A una DO600 = 1, se añadió IPTG para inducir la expresión de la proteína a una concentración final de 0,17 mM y el cultivo se incubó a 37ºC durante otras 5 h. Las células se cosecharon por centrifugación.

Se suspendieron nuevamente 4,8 g de cada sedimento celular en 30 ml de tampón de unión desnaturalizante (fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, urea 8 M, pH 7,4) con un suplemento de 29 U/ml de Benzonase® (Merck, núm. de catálogo 10.1654.0001) y se incubaron con agitación a RT durante 1 h para liberar la proteína expresada. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación y cada sobrenadante se aplicó sobre una columna His GraviTrap IMAC de 1 ml (GE Healthcare, núm. de catálogo 11-0033 -99). Los contaminantes se eliminaron mediante lavado con tampón de unión desnaturalizante, tampón de unión nativo (fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,4) y tampón de lavado (fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 60 mM, pH 7,4) y las variantes Z de unión a ABD se hicieron eluir posteriormente con tampón de elución (fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 250 mM, pH 7,4). Cada variante Z de unión a ABD purificada se transfirió a NH4HCO3 10 mM por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm, utilizando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 y utilizando el coeficiente de extinción de la proteína respectiva. Las variantes Z de unión a ABD se liofilizaron y la pureza de los productos finales se analizó mediante SDS-PAGE teñida con Azul de Coomassie. Se confirmó la identidad de cada variante Z de unión de ABD purificada mediante análisis HPLC-MS.

Resultados

Cultivo y purificación: Las siete variantes Z de unión a ABD Z06608 (SEQ ID NO:107), Z06620 (SEQ ID NO:110), Z06638 (SEQ ID NO:106), Z06650 (SEQ ID NO:108), Z06677 (SEQ ID NO:105), Z06678 (SEQ ID NO:109) y Z06695 (SEQ ID NO:111), construidas como dímeros y con una etiqueta His6 N-terminal y una Cys C-terminal, se expresaban bien en E coli. La cantidad de proteína purificada por IMAC a partir de 4,8 g de sedimentos bacterianos, determinada espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 280 nm, osciló entre 3 mg y 19 mg para las diferentes variantes Z de unión a ABD.

El análisis por SDS-PAGE de cada preparación de proteína final mostró que éstas contenían predominantemente la respectiva variante Z de unión a ABD. El peso molecular correcto de cada variante Z de unión a ABD se confirmó mediante HPLC-MS.

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Ejemplo 3

Evaluación de las características de unión y elución de las variantes Z de unión a ABD

En este Ejemplo, se estudiaron las características de unión y elución de un conjunto de polipéptidos de unión a ABD, seleccionados y producidos como se describe en los Ejemplos 1 y 2, respectivamente, en un formato a pequeña escala utilizando columnas giratorias.

Materiales y métodos

Acoplamiento de las variantes Z de unión a ABD a la resina: Se resuspendió 1 mg de cada una de las variantes Z de unión a ABD liofilizadas Z6608, Z06620, Z06638, Z06650, Z06677, Z06678 y Z06695, en el formato His6-(Z#####)2-Cys producido como se describe en el Ejemplo 2, en un tampón reductor (Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM, DTT 20 mM, pH 8,5) y se incubó a RT durante 2 h. Las soluciones de proteína reducidas se transfirieron a un tampón de acoplamiento (Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5), incluyendo DTT 50 mM, utilizando cromatografía de exclusión por tamaños y luego se mezclaron con porciones de 0,2 ml de SulfoLink Coupling Resin (Thermo Fisher Scientific, núm. catálogo 20401). Este procedimiento permite la reacción dirigida al sitio entre los grupos tiol de los residuos de cisteína C-terminales de las variantes Z de unión a ABD y los grupos yodoacetilo de la resina, formando un enlace tioéter covalente. La reacción de acoplamiento se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El grado de acoplamiento, definido como mg de variante Z de unión de ABD acoplada por ml de resina, se determinó como sigue: La cantidad de variante Z de unión a ABD acoplada se calculó restando la cantidad de material desacoplado de la cantidad original de muestra, basándose en las concentraciones obtenidas por las medidas espectrofotométricas de la absorbancia a 280 nm. La cantidad de variante Z de unión a ABD acoplada en mg se dividió a continuación por el volumen de la Resina de Acoplamiento SulfoLink.

Estudio de columna I: Evaluación de las resinas acopladas a variantes Z de unión a ABD utilizando una muestra pura: Se realizó un primer estudio de columna para someter a ensayo las propiedades de unión, lavado y elución de cada una de las siete variantes Z de unión a ABD acopladas a resina y utilizando una muestra previamente purificada de la proteína de fusión a ABD PEP08517. PEP08517 comprende el dominio de unión a albúmina PP013 (SEQ D NO: 160) fusionado en su extremo N a una variante de unión a citoquina de la proteína Z. Se transfirieron porciones de 0,1 ml de las resinas a tubos de ensayo y se añadieron 0,1 ml de una muestra pura de PEP08517 a 2 mg/ml en tampón de acoplamiento. Los tubos se incubaron sobre una rueda giratoria durante 1 hora a RT. Cada mezcla de muestra-resina se transfirió a una columna giratoria vacía. La proteína no unida se recogió por centrifugación (flujo continuo, FT). Se añadieron a continuación 0,1 ml de soluciones diferentes, especificadas en la Tabla 1, para lavar y posteriormente eluir las moléculas de PEP08517 unidas. Cada lavado y fracción de elución se recogió por centrifugación.

Las fracciones recogidas se analizaron en un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 280 nm.

Tabla 1: Especificación de la muestra y las soluciones en el estudio de columna I

Etapa: Muestra/Solución Abreviatura

1: Muestra pura de PEP08517 en Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5 PEP08517

2: PEP08517 no unida FT

3: KCl 2,68 mM, KH2PO4, 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na2HPO4 8,1 mM, PH 7,4 PBS

4: Tris-HCl 5 mM, pH 8 Tris

5: HAc 0.5 M/NaAc, pH 4 pH 4 (a)

6: HAc/NaAc 0,5 M, pH 4 pH 4 (b)

7: HAc 0,5 M, pH 2,5 pH 2,5 (a)

8: HAc 0,5 M, pH 2,5 pH 2,5 (b)

Estudio de columna II: Evaluación de las resinas acopladas a variantes Z de unión a ABD utilizando un extracto bacteriano: Se llevó a cabo un segundo estudio de columna para someter a ensayo adicionalmente las propiedades de unión, lavado y elución de cuatro resinas acopladas a variantes Z de unión a ABD del estudio de columna I. Los

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ligandos de estas resinas fueron His6-(Z06608)2-Cys, su6-(Z06638)2-Cys, His6-(Z06677)2-Cys e His6-(Z06650)2-Cys. Se incluyó como referencia una columna adicional cargada con HSA Sefarosa (albúmina de suero humano acoplada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a través de aminas libres a Sefarosa 4 Fast Flow activado con CNBr, GE Healthcare, número de catálogo 17-0981). Un extracto bacteriano aclarado, preparado a partir de 5 un sedimento de E coli por sonicación y centrifugación, se utilizó como muestra en este experimento. Se transfirieron 0,17 ml del extracto bacteriano, que contenía aproximadamente 0,5 mg de PEP08515 (que comprende el dominio de unión a albúmina PP013 (SEQ ID NO: 160) fusionado en su extremo N a una variante de unión a PDGFR-β (Receptor de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas beta) de proteína Z) a columnas giratorias cargadas con cada resina respectiva acoplada con variante Z de unión a ABD o HSA Sefarosa. Se recogió el flujo

10 continuo por centrifugación y se volvió a aplicar dos veces a las columnas. Se añadieron diferentes soluciones, especificadas en la Tabla 2, para eliminar las proteínas anfitrionas bacterianas y posteriormente hacer eluir las moléculas de PEP08515 unidas. Las fracciones de lavado y elución se recogieron por centrifugación y se analizaron en un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 280 nm, y mediante SDS-PAGE.

Tabla 2: Especificación de la muestra y soluciones en el estudio de columna II

Etapa: Muestra/Solución Abreviatura Volumen (ml)

1: Muestra: extracto bacteriano que contiene PEP08515 PEP08515 0,17

2: Flujo continuo I recogido después de la aplicación de muestra FT I 0,17

3: Flujo continuo II recogido después de la re-aplicación del flujo continuo I FT II 0,17

4: KCl 2,68 mM, KH2PO4 1,47 mM, NaCl137 mM, Na2HPO4 8,1 mM, pH 7,4 PBS 4 X 0,2

5: NH4Ac 5 mM, pH 5,5 NH4Ac 2 X 0,2

6: Citrato sódico 0,1 M, pH 3,0 pH 3,0 (a) 0,1

7: Citrato sódico 0,1 M, pH 3,0 pH 3,0 (b) 0,1

8: HAc 0,5 M, pH 2,5 pH 2,5 (a) 0,1

9: HAc 0,5 M, pH 2,5 pH 2,5 (b) 0,1

Resultados

Eficacia de acoplamiento de polipéptidos de unión a ABD: El grado de acoplamiento de cada polipéptido de unión a ABD a la Resina de Acoplamiento SulfoLink se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3 Grado de acoplamiento de las variantes Z de unión a ABD a la Resina SulfoLink

Polipéptido de unión a ABD: Cantidad de polipéptido acoplado por ml de resina (mg) Cantidad de polipéptido acoplado por ml de resina (μmol)

His6-(Z06608)2-Cys: 2,8 0,19

His6-(Z06620)2-Cys: 2,7 0,19

His6-(Z06638)2-Cys: 2,9 0,20

His6-(Z06650)2-Cys: 3,4 0,23

His6-(Z06677)2-Cys: 2,2 0,15

His6-(Z06678)2-Cys: 2,1 0,14

His6-(Z06695)2-Cys: 3,9 0,27

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dos columnas se anclaron al sistema y se equilibraron con PBS. Se cargaron 2 ml de una muestra que contenía 1 mg de PEP08519 (que comprende el dominio de unión a la albúmina PP013 (SEQ ID NO: 160) fusionado en su extremo N a una variante de unión a Taq Polimerasa de proteína Z) en cada columna seguido de lavado con PBS y citrato sódico 0,1 M, NaCl al 0,9%, pH 5,5. La proteína unida se hizo eluir mediante un gradiente de pH lineal que variaba de pH 5,5 a pH 2,3 (utilizando citrato de sodio 0,1 M, NaCl al 0,9%, pH 5,5 y citrato de sodio 0,1 M, NaCl al 0,9%, pH 2,3) a lo largo de 16 volúmenes de la columna (CV). El pH se controló mediante el medidor de pH incorporado del sistema ÄKTAexplorer.

Estudio de cromatografía de la capacidad de unión y resistencia al álcali de un polipéptido de unión de ABD: En este experimento, se sometieron a ensayó la capacidad de unión dinámica y la resistencia al álcali para la resina His6(Z06677)2-Cys y una resina de HSA Sefarosa empaquetada en las columnas Tricorn 5/50 utilizadas en el estudio de cromatografía descrito en la sección anterior.

El experimento se realizó utilizando un sistema de cromatografía ÄKTAexplorer 10. Las dos columnas se anclaron al sistema y se equilibraron con PBS. Para el estudio de capacidad, se cargó en cada columna una muestra que contenía 0,25 mg/ml de PEP08519 en PBS a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min (correspondiente a un tiempo de permanencia de 2,4 minutos) hasta que la absorbancia a 280 nm de la solución que emergía de las columnas alcanzó 10% de la absorbancia de la muestra original (es decir, 10% de ruptura). El volumen muerto (es decir, el volumen del tubo y la columna, medido haciendo circular una muestra a través de una columna que no contiene ligando de afinidad) se restó del volumen de la muestra. La proteína unida se hizo eluir con citrato sódico 0,1 M, NaCl al 0,9%, pH 2,3. Las columnas se reequilibraron después con PBS.

Después de las rondas de capacidad, las columnas se sometieron a un tratamiento alcalino aplicando 5 CV de NaOH 0,2 M a una velocidad de flujo de 1 ml/min, seguido de un período de incubación sin flujo. El tiempo de incubación total en álcali fue de 25 min. La neutralización de las columnas se realizó lavando con 5 CV de PBS a 1 ml/min, seguido de una nueva medición de capacidad como se ha descrito anteriormente.

Se llevaron a cabo dos tratamientos alcalinos más seguidos de medidas de capacidad como anteriormente, pero con la concentración de NaOH aumentada a 0,5 M y, en el último tratamiento con álcali, el tiempo de incubación se prolongó hasta 2 h.

Resultados

Análisis de dicroísmo circular: Se determinó que el punto de fusión de His6-(Z06677)2-Cys era de 54ºC.

Estudio cromatográfico del pH de elución de una variante Z de unión a ABD: Se determinó que el grado de acoplamiento de His6-(Z06677)2-Cys a la resina de EAH Sefarosa activada era de 2,8 mg de polipéptido por ml de resina.

Como se muestra en la Figura 6, la elución de la molécula de fusión a ABD PEP08519 a partir de la columna que contenía la resina de His6-(Z06677)2-Cys apareció antes en el gradiente (es decir, a un pH más alto) que a partir de la columna con la resina de HSA Sefarosa, que también mostró una capacidad de unión inferior con una fracción más grande que emergía en el flujo continuo.

El pH al pico máximo para el pico eluido desde la columna de His6-(Z06677)2-Cys fue de 3,3, mientras que el pH correspondiente para la columna de HSA Sefarosa fue de 2,6.

Estudio cromatográfico de la capacidad de unión y la resistencia al álcali de una variante Z de unión a ABD: La capacidad de unión dinámica se determinó midiendo la cantidad de muestra cargada hasta el 10% de ruptura. Se determinó que la capacidad de unión dinámica de la columna de His6-(Z06677)2-Cys era de 3,0 mg de PEP08519 por ml de resina. La capacidad correspondiente para la columna de HSA Sefarosa se determinó a 0,5 mg por ml de resina. Como en el Ejemplo 3, la diferencia de capacidad no se puede explicar por la diferencia en la densidad de ligando, ya que se estimó que el número de moléculas de HSA inmovilizadas era el doble del número de moléculas de His6-(Z06677)2-Cys en sus respectivas resinas.

La capacidad de unión dinámica se volvió a medir después de cada incubación con álcali. Los resultados se muestran en la Figura 7. La columna de His6-(Z06677)2-Cys mantuvo su capacidad original después de todas las incubaciones. Esto indica una alta resistencia a condiciones alcalinas relativamente duras, que es una característica importante para procedimientos de limpieza in situ (CIP) que permiten el uso repetido de la columna. Por el contrario, la columna de HSA Sefarosa, incluida como referencia, perdía la mayor parte de su capacidad después de 25 min en NaOH 0,2 M.

Ejemplo 5

Estudios de columna de una variante Z de unión a ABD inmovilizada sobre diferentes resinas

En este ejemplo, la variante Z de unión de ABD His6-(Z06677)2-Cys se inmovilizó sobre cuatro tipos diferentes de resinas, y la capacidad de unión y la resistencia al álcali se evaluaron cromatográficamente.

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