ES2640048T3 - Medicamento para la reducción de la colesterolemia y de la trigliceridemia - Google Patents
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Abstract
Células de la levadura Saccharomyces boulardii para su utilización en la reducción de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular o en la prevención o el tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia en un individuo.
Description
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DESCRIPCION
Medicamento para la reduccion de la colesterolemia y de la trigliceridemia Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un medicamento destinado a reducir la colesterolemia y/o la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular o a prevenir o tratar la hipercolesterolemia y/o la hipertrigliceridemia en un individuo.
Antecedentes de la tecnica
La hipercolesterolemia es un factor de riesgo importante de enfermedades cardiovasculares, tales como la ateroesclerosis, el infarto de miocardio y las enfermedades cerebrovasculares.
El tratamiento de primera lmea para la hipercolesterolemia es un regimen alimenticio adaptado pobre en colesterol. Si el cambio del regimen alimenticio resulta insuficiente para tratar la hipercolesterolemia, se consideran entonces tratamientos farmacologicos, especialmente a base de inhibidores de la HMG-CoA reductasa (estatinas) y de fibratos.
Otros diversos medios de tratamiento de la hipercolesterolemia estan igualmente disponibles, en particular como complemento del regimen alimenticio adaptado, tales como los fitosteroles, que se encuentran incorporados en numerosas preparaciones alimentarias, o los probioticos, especialmente bacterianos.
Debido a sus otras propiedades interesantes para la salud humana y a la practica ausencia de efectos secundarios, se ha propuesto asf utilizar numerosos probioticos diferentes en el marco del tratamiento de la hipercolesterolemia. Sin embargo, esto se basa lo mas a menudo en estudios in vitro de extraccion del colesterol por los probioticos a partir de un medio de cultivo. Ahora bien, estos estudios no son directamente indicativos de un efecto anti- hipercolesterolemico in vivo. Por lo tanto, sobre la base de estudios in vitro, se ha podido sugerir que Lactobacillus rhamnosus puede ejercer un efecto anti-hipercolesterolemico (Xanthopoulos et al. (1998) Microbiologie, Aliments, Nutrition 16: 199-203), aunque no se observa ningun efecto in vivo (Hattaka et al. (2O08) J. Am. Coll. Nutr. 27: 441447).
De hecho, en la actualidad, no ha podido ser demostrado de manera adecuada un verdadero efecto anti- hipercolesterolemico por experimentos in vivo mas que para un pequeno numero de probioticos. Se puede citar como tal, una asociacion de los probioticos Lactobacillus acidophilus y Streptococcus faecalis (Fukushima & Nakano (1996) Br. J. Nutr. 76: 857-867) o una asociacion de probioticos compuesta de Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Saccharomyces y Candida (Fukushima & Nakano (1995) Br. J. Nutr. 73: 701-710).
Saccharomyces boulardii (Ultra-Levure®) es una cepa particular de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Este probiotico esta principalmente indicado como complemento de la rehidratacion para el tratamiento de las diarreas. Su utilidad ha sido establecida especialmente en los ninos (Villarruel et al. (2007) Acta Pediatr. 96: 538-541; Szajewska et al. (2007) Aliment Pharmacol Ther. 25: 257-264) y para las diarreas relacionadas con la toma de antibioticos (Surawicz et al. (1989) Gastroenterology 96: 981-988; Kotowska et al. (2005) Aliment Pharmacol Ther 21: 583-590) o en las infecciones por Clostridium difficile (Surawicz et al. (2000) Clin. Infect. Dis. 31: 1012-1017).
Resumen de la invencion
La presente invencion se deriva de la demostracion inesperada, por los inventores, de que el Saccharomyces boulardii permitfa reducir la hipercolesterolemia y la hepatomegalia inducidas en la rata por un regimen enriquecido en colesterol, asf como la hipercolesterolemia y la hipertrigliceridemia inducidas en el hamster por un regimen enriquecido en colesterol.
Asf, la presente invencion se refiere a las celulas de levadura de Saccharomyces boulardii para su utilizacion en la reduccion de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular o en la prevencion o el tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia en un individuo.
La presente invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende como sustancias activas:
- celulas de la levadura Saccharomyces boulardii, y
- al menos un compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia seleccionado en el grupo constituido por una estatina, un fibrato y un fitosterol, eventualmente en asociacion con un vehfculo farmaceuticamente aceptable, en particular para su utilizacion en la reduccion de la
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colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo, mas particularmente para tratar la hipercolesterolemia y/o la hipertrigliceridemia.
La presente invencion se refiere tambien a productos que contienen:
- celulas de la levadura Saccharomyces boulardii, y
- al menos un compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia,
como un producto de combinacion para una utilizacion simultanea, separada o escalonada en el tiempo para la reduccion de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular, especialmente para tratar la hipercolesterolemia y/o la hipertrigliceridemia.
Descripcion de la figura
La figura representa el efecto de Saccharomyces boulardii administrado a 3 g/kg/dfa sobre el aumento de la colesterolemia de las ratas (eje de las ordenadas, en mg/dl) inducido por un regimen alimenticio enriquecido en colesterol al 2%, en funcion del tiempo (eje de las abscisas, en dfas). El regimen enriquecido en colesterol y el S. boulardii se administran a partir del dfa 0 y dfa 4 respectivamente. *: p <0,05, prueba estadfstica ANOVA con medidas repetidas de los grupos tratados en comparacion con el grupo testigo y #: p <0,05 para el grupo de S. boulardii + colesterol en comparacion con el grupo de colesterol solo. El grupo de ratas testigos esta representado por los drculos abiertos, el grupo de ratas que reciben un regimen alimenticio normal y S. boulardii esta representado por cuadrados negros, el grupo de ratas que reciben un regimen alimenticio enriquecido en colesterol esta representado por drculos negros, y el grupo de ratas que reciben un regimen alimenticio enriquecido en colesterol y S. boulardii esta representado por triangulos negros.
Descripcion detallada de la invencion
El termino "colesterolemia" es bien conocido por los expertos en la tecnica. Representa un nivel de colesterol en sangre, y especialmente el nivel de colesterol total en suero. La colesterolemia se expresa especialmente en g/l o en mmol/l.
Tal como se entiende en la presente memoria, la expresion "reducir la colesterolemia" significa especialmente disminuir el nivel serico de colesterol total.
El termino "hipercolesterolemia" designa una colesterolemia patologica. La hipercolesterolemia designa en particular una colesterolemia superior a 2 g/l, mas particularmente superior a 2,4 g/l en los seres humanos.
Las expresiones "en el tratamiento de la hipercolesterolemia" y "para tratar la hipercolesterolemia" son sinonimas y significan disminuir, en particular para que vuelva a ser normal, la colesterolemia en un individuo que presenta una hipercolesterolemia.
El individuo en el que se quiere reducir la colesterolemia puede presentar una hipercolesterolemia. El individuo puede presentar tambien una colesterolemia que no es en sf misma patologica, es decir, que es con preferencia inferior o igual a 2 g/l, pero que es suficientemente elevada para hacer que sea deseable una disminucion de la colesterolemia, por ejemplo, si el individuo presenta otros factores de riesgo cardiovascular o en prevencion de una hipercolesterolemia. Asf, el individuo segun la invencion puede presentar una colesterolemia superior a 1,8 g/l e inferior o igual a 2 g/l.
En particular, el individuo segun la invencion puede presentar una hipercolesterolemia, especialmente moderada, es decir que presenta una colesterolemia con preferencia superior a 2 g/l y con preferencia inferior o igual a 2,4 g/l, y esta sometido a un regimen alimenticio bajo en colesterol.
Se denomina "regimen alimenticio bajo en colesterol" un regimen en el que la cantidad de colesterol esta disminuida en comparacion con un regimen alimenticio normal. Los expertos en la tecnica saben definir bien un regimen bajo en colesterol. En particular, en un regimen bajo en colesterol, la cantidad de colesterol es inferior a la cantidad de colesterol que se encuentra habitualmente en el regimen alimenticio del individuo antes de que empiece a utilizar el regimen bajo en colesterol.
El termino "trigliceridemia" es bien conocido tambien por los expertos en la tecnica. Representa un nivel de trigliceridos en sangre, y especialmente el nivel de trigliceridos totales en suero. La trigliceridemia se expresa, especialmente en g/l o en mmol/l.
Tal como se entiende en la presente memoria, la expresion "reducir la trigliceridemia" significa especialmente disminuir el nivel serico de trigliceridos totales.
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El termino "hipertrigliceridemia" designa una trigliceridemia patologica. La hipertrigliceridemia designa en particular una trigliceridemia superior a 1,5 g/l, mas preferiblemente superior a 5 g/l.
Las expresiones "en el tratamiento de la hipertrigliceridemia" y "para tratar la hipertrigliceridemia " son sinonimas y significan disminuir, en particular para que vuelva a ser normal, la trigliceridemia en un individuo que presenta una hipertrigliceridemia.
El individuo en el que se quiere reducir la trigliceridemia puede presentar una hipertrigliceridemia. El individuo puede presentar tambien una trigliceridemia que no es en sf misma patologica, es decir, que es con preferencia inferior o igual a 1,5 g/l, pero que es suficientemente elevada para hacer que sea deseable una disminucion de la trigliceridemia, por ejemplo, si el individuo presenta otros factores de riesgo cardiovascular o en prevencion de una hipertrigliceridemia. Asf, el individuo segun la invencion puede presentar una trigliceridemia superior a 1,3 g/l e inferior a 1,5 g/l para un hombre, o superior a 1,1 g/l e inferior a 1,5 g/l para una mujer.
El individuo segun la invencion es un animal, preferiblemente un mairnfero, y mas preferiblemente un ser humano.
Tal como se entiende en la presente memoria, la expresion "celulas de levadura" agrupa las celulas de levadura viables o muertas, enteras o en forma de restos. Preferiblemente, al menos una parte de las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii segun la invencion son viables.
La viabilidad de una celula de levadura se define como la capacidad de una celula de levadura para multiplicarse. El numero de celulas viables en una muestra se puede estimar determinando el numero de unidades formadoras de colonias (UFC) comprendidas en la muestra.
A modo de ejemplo, el numero de UFC de celulas de levadura de una muestra lfquida que comprende las levaduras se puede determinar extendiendo un volumen determinado de la muestra sobre un medio solido, por ejemplo agar, permitiendo el crecimiento de las levaduras e incubando el medio solido durante un penodo de tiempo, por ejemplo 48 h, y a una temperatura, por ejemplo 30 °C, que permita el crecimiento de colonias de levaduras. El numero de colonias con respecto al volumen extendido sobre el medio solido permite determinar el numero de unidades formadoras de colonias comprendidas en la muestra. Un protocolo detallado de la determinacion de UFC segun la invencion esta especialmente descrito en Toothaker & Elmer (1984) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 26: 552-556 en el parrafo "Assay for S. boulardii". Por otra parte, cuando la muestra de levadura se presenta en la forma de un solido, por ejemplo, un polvo liofilizado, se prefiere determinar el numero de UFC comprendido en la muestra despues de haber recogido una masa determinada de la muestra en una solucion acuosa, especialmente en agua destilada o en una solucion de NaCl al 0,9% a pH 7.
Una "levadura" segun la invencion es un hongo preferiblemente unicelular. Las celulas de levadura segun la invencion son de la especie Saccharomyces boulardii. Saccharomyces boulardii es bien conocido por los expertos en la tecnica y esta especialmente descrito en Hennequin et al. (2001) J. Clin. Microbiol. 39: 551-559.
De manera particularmente preferida, las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii segun la invencion se obtienen de medicamentos de la marca Ultra-Levure®, Bioflor®, Codex®, Econorm®, Enflor®, Enterol®, Florastor®, Floratil®, Florestor®, Inteflora®, Perenterol®, Perenteryl®, Precosa®, Reflor®, Ultra-Levura® o a partir de los depositos efectuados en la American Type Culture Collection (ATCC, USA) bajo la referencia 74012 o en la Collection Nationale de Culture et de Microorganismes (CNCM, Francia) bajo la referencia I-745.
Preferiblemente, tambien las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii segun la invencion estan liofilizadas, tales como las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii de marca Ultra-Levure®, Bioflor®, Codex®, Econorm®, Enflor®, Enterol®, Florastor®, Floratil®, Florestor®, Inteflora®, Perenterol®, Perenteryl®, Precosa®, Reflor®, o Ultra-Levura®.
De manera ventajosa, la viabilidad y la vitalidad de las celulas de levadura obtenidas a partir de liofilizados son superiores a las que se pueden obtener a partir de otro modo de conservacion de las celulas de levadura.
Tal como se entiende en la presente memoria, la "liofilizacion" es un metodo de conservacion en el que las celulas de levadura se congelan y despues se someten a una sublimacion del agua congelada que contienen para dar un liofilizado en la forma de un polvo de levadura seco, que contiene preferiblemente menos de 2% de agua y mas preferiblemente menos de 1% de agua. Preferiblemente, las celulas de levadura liofilizadas se obtienen a partir de concentrados de celulas de levadura. No importa que tipo de metodo de liofilizacion de celulas de levadura conocido por los expertos en la tecnica pueda ser utilizado. Sin embargo, las celulas de levadura preferiblemente se liofilizan segun la invencion utilizando el siguiente metodo de liofilizacion:
- cultivar las celulas de levadura en un medio nutritivo lfquido hasta que las celulas alcancen una fase estacionaria;
- concentrar las celulas de levadura cultivadas y congelar el concentrado;
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- liofilizar el concentrado.
Preferiblemente, las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii segun la invencion se administran en forma de capsulas o de sobres.
Tambien preferiblemente, las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii segun la invencion se administran a una dosis de 0,5.108 a 100.1010 UFC/kg/dfa o a una dosis de 0,00125 g/kg^a a 25 g/kg/dfa.
Por otra parte, la composicion farmaceutica tal como se ha definido antes, o los productos tales como se han definido antes, comprenden, preferiblemente, una dosis de 50 a 250 mg de celulas de la levadura Saccharomyces boulardii. Ademas, las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii para su uso tal como se ha definido anteriormente se administran preferiblemente en una dosis unitaria de 50 a 250 mg.
Como los expertos en la tecnica entenderan, la cantidad de celulas de levadura a administrar por unidad de masa (kg) se refiere a la masa del individuo al que se destinan las celulas de levadura. Por otra parte, cuando la cantidad de celulas de levadura a ser administrada se expresa en unidades de masa (g), las celulas de levadura estan preferiblemente en forma liofilizada.
Tal como se entiende en la presente memoria, la expresion "compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia" agrupa el conjunto de los compuestos utilizados para reducir la colesterolemia, especialmente en un individuo que sufre hipercolesterolemia. Estos compuestos pueden ser de cualquier tipo y cubren especialmente los compuestos farmacologicos, los probioticos y los prebioticos. Se prefiere, sin embargo, que el compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia segun la invencion sea seleccionado del grupo constituido por una estatina, un fibrato, niacina, y un fitosterol.
De la misma manera, la expresion "un compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipertrigliceridemia" agrupa el conjunto de los compuestos utilizados para reducir la trigliceridemia, especialmente en un individuo que sufre de hipertrigliceridemia. Estos compuestos pueden ser de cualquier tipo y cubren especialmente los compuestos farmacologicos, los probioticos y los prebioticos. Se prefiere, sin embargo, que el compuesto adicional destinado al tratamiento de la trigliceridemia segun la invencion sea seleccionado del grupo constituido por una estatina, un fibrato, niacina, y un fitosterol.
Sin embargo, en un modo de realizacion particular de la invencion, las celulas de la levadura S. boulardii:
- para su utilizacion segun la invencion en la reduccion de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular, especialmente para tratar la hipercolesterolemia y/o la hipertrigliceridemia, o
- cuando se utilizan para la reduccion de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia, en particular para el tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia, no se asocian, ni se administran conjuntamente, con la niacina o con el acido linoleico, o con otro acido graso poliinsaturado, o mas generalmente no se asocian, ni se administran conjuntamente con un compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia tal como se ha definido anteriormente. En otras palabras, en un modo de realizacion particular de la invencion, las celulas de la levadura S. boulardii para su utilizacion segun la invencion o cuando se utilizan segun la invencion, son el unico principio activo destinado a reducir la colesterolemia y/o la trigliceridemia, en particular para tratar la hipercolesterolemia y/o la hipertrigliceridemia.
Por otra parte, en otro modo de realizacion particular de la invencion, las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii no se administran con otro probiotico, y la composicion farmaceutica no comprende mas probioticos que el Saccharomyces boulardii.
Tal como se entiende en la presente memoria, el termino "probiotico" significa cualquier microorganismo, preferiblemente viable, administrado a un individuo, especialmente con vistas a mejorar su estado de salud.
Ejemplos
Ejemplo 1
1. Materiales y metodos
1.1. Animales
Se utilizan ratas Sprague Dawley (Janvier), con un peso comprendido entre 200 y 220 gramos al principio del estudio, despues de su aclimatacion durante al menos 7 dfas en el animalario (t° = 22 ± 2 °C; humedad: 50 ± 20%; alimentacion SAFE "A04"; ritmo circadiano 12 h/12 h).
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1.2. Protocolo
1.2.1. Regimen alimenticio
4 grupos de 8 a 10 ratas se sometieron, respectivamente, a:
- un regimen alimenticio normal "A04" (SAFE)
- un regimen alimenticio normal con Saccharomyces boulardii a 3 g/kg/dfa,
- un regimen alimenticio que incorpora 2% de colesterol (MP Biomedicals, ref. 904691), y
- un regimen alimenticio que incorpora 2% de colesterol (MP Biomedicals, ref. 904691) suplementado con Saccharomyces boulardii a 3 g/kg/dfa.
1.2.2. Extracciones de sangre
Se extrae sangre de la vena caudal utilizando una aguja Terumo 21 G (ref. NN2125R) y una jeringa Terumo de 2 ml (ref. 55-025) 3 dfas antes del principio del experimento para determinar la colesterolemia basal. Se utiliza un antihemorragico (Dycinone®) para detener el eventual derramamiento de sangre.
La sangre se vierte en un tubo Sarstedt Multivette de 600 pl que contiene un activador de la coagulacion (ref. 15.1670). El tubo se centrifuga a 10000 g (14000 rpm) durante 5 min a temperatura ambiente en una centnfuga Centrifuge 5415C Eppendorf. Se recupera el suero en varios micro-tubos Sarstedt de 0,5 ml (ref. 72.699), que se ponen a -80 °C antes del analisis.
Se hacen a continuacion diferentes extracciones el dfa del principio del regimen enriquecido en colesterol (dfa 0) y despues los dfas 4, 7, 11, 14, 18, 21 y 25 despues del principio del regimen enriquecido en colesterol.
1.2.3. Valoracion del colesterol total por colorimetna
Se prepara una solucion madre de colesterol (Sigma, ref. C3045) a 3 g/l disolviendo 30 mg de colesterol en 10 ml de una solucion de desoxicolato de sodio a 150 g/l a 40 °C durante 60 min como mmimo. La solucion de desoxicolato de sodio se obtiene por disolucion de 15 g de desoxicolato de sodio en 100 ml de NaCl al 0,9% agitando despues a 40 °C durante 60 min como mmimo.
Se prepara una escala de patrones por diluciones sucesivas en la solucion de desoxicolato de sodio a partir de la solucion madre para obtener concentraciones de 0,375; 0,75; 1,5 y 3 g/l de colesterol.
Se mezclan 10 pl de la muestra o del patron con 1000 pl de reactivo CHOL destinado a medir el colesterol total (Menarini, ref. 30990). 30 min despues, se realiza la medida de la absorbancia con respecto a un blanco de reactivo a una temperatura de 37 °C a una longitud de onda de 510 nm, en un espectrofotometro SPEDCOR 2005 con cubetas que tienen un camino optico de 1 cm (Spectrovettes Evergreen, Dutscher, ref. 064005).
1.2.3. Determinacion del peso del hngado
Al final del estudio (dfa 25), se sacrifican las ratas y se extrae y se pesa su hngado.
1.3. Productos
El Saccharomyces boulardii liofilizado (Ultralevure® lote 4325, Biocodex) se conserva entre 4 y 6 °C, se solubiliza en agua destilada.
El colesterol (Sigma, ref. C3045) se almacena a -20 °C. El desoxicolato de sodio se obtiene de Fluka (ref. 30970).
El reactivo de valoracion CHOL (Menarini) se almacena entre 4 y 6 °C.
1.4. Administracion
Se administra Saccharomyces boulardii por via oral 4 dfas despues del principio del regimen alimenticio enriquecido en colesterol cuando se ha establecido la hipercolesterolemia.
2. Resultados
No se observa ninguna diferencia significativa en el peso de los animales en funcion del regimen alimenticio al que han sido sometidos.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 que sigue y en la Figura.
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Tabla 1: Efecto de S. boulardii administrado a 3 g/kg/dia sobre el aumento de la colesterolemia (mg/dl) inducida por un regimen alimenticio enriquecido en colesterol al 2%
- S. boulardii
- Colesterol 2% n Dia 3 Dia 0 Dia 4 Dia 7 Dia 11 Dia 14 Dia 18 Dia 21 Dia 25
- -
- -
- 10 107,3 ±2,9 97,6 ±3,4 95,9 ±3,0 90,0 ±3,4 83,1 ±2,5 86,0 ±2,7 76,3 ±2,7 72,3 ±2,7 70,4 ±2,9
- +
- - 9 105,6 ±2,5 98,0 ±1,7 96,7 ±2,6 92,1 ±3,1 81,9 ±3,4 81,5 ±2,8 71,6 ±4,2 73,7 ±3,3 72,8 ±3,0
- -
- + 8 109,9 ±2,2 97,3 ±2,8 142,3 ±6,4* 127,6 ±5,1 * 123,5 ±5,1 * 120,6 ±5,3* 115,2 ±4,3* 110,3 ±7,1 * 113,5 ±6,8*
- +
- +
- 9 106,6 ±3,1 97,6 ±3,5 131,1 ±3,0* 120,1 ±2,5* 109,6 ±4,5*# 103,4 ±3,0*# 97,2 ±3,1 *# 97,5 ±3,1 *# 94,7 ±3,5*#
El regimen enriquecido en colesterol y el S. boulardii se dan a partir del Dia 0 y Dia 4 respectivamente.
*: p <0,05, prueba estadistica ANOVA con medidas repetidas de los grupos tratados comparados con el grupo testigo #: p <0,05 para el grupo de S. boulardii + colesterol comparado con el grupo de colesterol solo.
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El regimen enriquecido en colesterol causa un aumento significativo de la colesterolemia desde la primera valoracion realizada el dfa 4 con un nivel de colesterol de 142,3 mg/dl, es decir un aumento del 48% de la colesterolemia serica con respecto a la del grupo testigo (95,9 mg/dl).
A partir del dfa 11 y hasta el final del estudio, la colesterolemia del grupo de S. boulardii + colesterol disminuye significativamente con respecto al grupo de colesterol.
Por otra parte, se observa un aumento significativo del 20% en el peso medio de los hngados del grupo de colesterol (16,2 ± 0,6 g) con respecto al grupo testigo (13,5 ± 0,4 g). El S. boulardii no tiene efecto propio (13,0 ± 0,4 g). En cambio, para el grupo de S. boulardii + colesterol, el peso del hngado (14,9 ± 0,3 g) no se aumenta mas que en un 10%, y de manera no significativa.
En conclusion, el S. boulardii limita de manera significativa la hipercolesterolemia y la hepatomegalia inducidas por un regimen alimenticio enriquecido en colesterol en la rata.
Ejemplo 2
En este ejemplo, los resultados obtenidos en la rata han sido confirmados en el hamster, otro modelo animal reconocido para el estudio de la hipercolesterolemia (Bhathena et al. (2009) J. Med Food 12: 310-319; Chiu et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 71: 238-245).
1. Materiales y metodos
1.1. Animales
Se utilizan hamsteres sirios dorados machos (Janvier), con un peso comprendido entre 70 y 80 gramos al principio de los estudios, despues de su aclimatacion durante al menos 7 dfas en el animalario (t° = 22 ± 2 °C; alimentacion SAFE "105"; ritmo circadiano 12 h/12 h).
1.2. Protocolo
1.2.1. Regimen alimenticio enriquecido en colesterol
Diferentes lotes de regimen "105" enriquecido en colesterol al 0,1-0,25-0,5-1% fueron preparados por SAFE. Los hamsteres se ponen 5 por jaula al principio del experimento. El Saccharomyces boulardii Biocodex se administra por via oral.
1.2.2. Extracciones de sangre y de tngado
Los hamsteres se mantienen en ayunas la vfspera de las extracciones.
Al final del experimento, se extrae sangre por puncion cardiaca, bajo anestesia con isoflurano. A continuacion, se extrae el hngado, despues se congela a -80 °C para analisis posteriores.
La sangre se vierte en un tubo Sarstedt Multivette de 600 pl que contiene un activador de la coagulacion (ref. 15.1670). El tubo se centrifuga a 10000 g (14000 rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente en la centnfuga Centrifuge 5415C Eppendorf. Se recupera el suero en varios micro-tubos Sarstedt de 0,5 ml (ref. 72.699), que se ponen en un congelador a -80 °C antes del analisis.
1.2.3. Valoracion del colesterol serico por colorimetna
Se prepara una solucion madre de colesterol (Sigma, ref. C3045) a 3 g/l disolviendo 30 mg de colesterol en 10 ml de una solucion de desoxicolato de sodio a 150 g/l a 40 °C durante 60 min como mmimo. La solucion de desoxicolato de sodio se obtiene por disolucion de 15 g de desoxicolato de sodio en 100 ml de NaCl al 0,9% agitando despues a 40 °C durante 60 min como mmimo.
Se prepara una escala de patrones por diluciones sucesivas en la solucion de desoxicolato de sodio a partir de la solucion madre para obtener concentraciones de 0,375; 0,75; 1,5 y 3 g/l de colesterol.
Se mezclan 10 pl de la muestra o del patron con 1000 pl de reactivo destinado a medir el colesterol total (Menarini, ref. 30990). 30 min despues, se realiza la medida de la absorbancia con respecto a un blanco de reactivo a una temperatura de 37 °C a una longitud de onda de 510 nm, en un espectrofotometro SPEDCOR 2005 con cubetas que tienen un camino optico de 1 cm (Spectrovettes Evergreen, Dutscher, ref. 064005).
Los controles se realizan con el kit multicalibrador (Menarini ref. 37484), el kit de control bajo (ref. 37492) y el kit de control alto (ref. 37493).
1.2.4. Valoracion del colesterol hepatico por colorimetna
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Se adapta el protocolo de Loison et al. (2002) Reprod. Nutr. Dev. 42: 101-14. Se descongela 1 g de Idgado y despues se tritura y se homogeniza en 5 ml de isopropanol (tubo Sarstedt de 50 m) utilizando un molino Ultra-Turax. Se incuba el triturado a 60 °C durante 1 hora con agitacion (250 rpm, NBS incubador agitador C24) y despues se centrifuga a 3000 g durante 5 min a 4 °C (Beckmann Allegra 21R rotor c0650). Se recupera el sobrenadante (sobrenadante 1) y se recoge el sedimento en 5 ml de isopropanol y despues se centrifuga (3000 g, 5 min, a 4 °C). El sobrenadante obtenido (sobrenadante 2) se mezcla con el sobrenadante 1, y despues se centrifuga de nuevo. Se conservan alfcuotas de 1,7 ml del sobrenadante obtenido de este modo en el congelador a -80 °C antes del analisis, si es necesario.
Se analizan 10 pl de la mezcla de los 2 sobrenadantes del extracto de Idgado como se ha indicado anteriormente para el colesterol serico total.
1.2.5. Valoracion del colesterol HDL serico
El ensayo consiste en dos etapas de reaccion distintas con ayuda del kit de colesterol HDL de Menarini ref. 37459. Hay ante todo una eliminacion de los quilomicrones, del colesterol VLDL y del colesterol LDL por la accion de una colesterol esterasa, una colesterol oxidasa y una catalasa (reactivo R1), despues una medida espedfica de colesterol HDL tras la liberacion del colesterol HDL por los detergentes contenidos en el reactivo R2. La intensidad del colorante "quinona-imina" es directamente proporcional a la concentracion de colesterol medida a 600 nm.
Para la realizacion de una curva patron, se preparan diluciones sucesivas de una solucion madre que contiene colesterol HDL 3,66 mM (es decir, 141,2 mg/dl) (kit de calibracion de HDL Menarini, ref. 37485) en agua destilada para obtener concentraciones de 4.41 - 8,82 - 17,6 - 35,3 - 70,6 - 141,2 mg/dl.
Para las medidas, se mezclan 575 pl de reactivo R1 con 10 pl de patron o de muestra (previamente diluido a la mitad) en una cubeta, despues se deja incubar 5 minutos con agitacion. Se anaden entonces 175 pl de reactivo R2 y se agita durante 5 minutos antes de medir la absorbancia frente a un blanco de reactivo. La temperatura de trabajo es de 37 °C y la absorbancia se mide a una longitud de onda de 600 nm y con cubetas de espectrofotometro de un camino optico de 1 cm (Spectrovettes Evergreen semi-micro de precision de un solo uso, ref. 064005).
1.2.6. Valoracion de los trigliceridos sericos
La determinacion de los trigliceridos se hace despues de la separacion enzimatica del glicerol con la lipoprotema- lipasa. El producto coloreado es una quinona-imina que se mide a 510 nm y que es directamente proporcional a la concentracion de trigliceridos en la muestra.
Para la realizacion de una curva patron, se realizan diluciones sucesivas de una solucion madre de glicerol a 2,5 mg/ml en agua destilada para obtener concentraciones de 0, 31,25, 62,5, 125 y 250 mg/dl.
Las medidas se realizan utilizando el kit de trigliceridos de Menarini (ref. 37481) mezclando 10 pl de muestra o de patron con 1000 pl de reactivo Menarini. La absorbancia se determina despues de 30 min con respecto a un blanco de reactivo. La temperatura de trabajo es de 20-25 °C y la absorbancia se mide a una longitud de onda de 510 nm y con cubetas de espectrofotometro de un camino optico de 1 cm (Spectrovettes Evergreen semi-micro de alta precision de un solo uso, ref. 064005).
1.3. Productos
El Saccharomyces boulardii liofilizado (Ultralevure® lote 4325, Biocodex) se conserva entre 4 y 6 °C, se disuelve en agua destilada.
El colesterol (Sigma, ref. C3045) se almacena a -20 °C. El desoxicolato de sodio se obtiene de Fluka (ref. 30970).
El isopropanol se obtiene de VWR (ref. 20880.290).
El glicerol (5 ml, a 2,5 mg/ml) se obtiene de Sigma (ref. G7793) y se almacena a 2-8 °C.
Los kits de valoracion de Menarini (Reactivo de medida del colesterol total, ref. 30990; kit de colesterol, ref. 90132; kit de trigliceridos, ref. 37481; kit de colesterol HDL, ref. 37459; kit multicalibrador, ref. 37484; kit de control bajo ref. 37492; kit de control alto, ref. 34493; reactivo de LDL/HDL, ref. 37485) se mantienen entre 4 y 6 °C.
1.4. Analisis estadfstico
Los resultados se expresan como la media ± SEM. La prueba estadfstica utilizada es un analisis de varianza de un factor o dos factores, salvo para el parametro de los pesos corporales. Cuando el resultado no depende del azar (5%) se determinan los grupos tratados que difieren del grupo testigo con ayuda del test de Student Newman-Keuls o de Bonferoni y del software Sigma Stat (version 3.1). Para los pesos corporales, la prueba estadfstica utilizada es un analisis de varianza con medidas repetidas.
2. Resultados
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2.1. Estudio N° 1
En este primer estudio (n = 5 por grupo), se ha administrado un regimen enriquecido en colesterol al 0,1 -0,5-1 % durante 14 o 28 dfas para medir el efecto de cada uno de estos 3 regfmenes sobre la colesterolemia en el hamster.
No se constata ninguna modificacion significativa inducida por los 3 regfmenes enriquecidos con respecto al grupo testigo en lo que concierne a la evolucion de los pesos corporales.
La colesterolemia basal se situa en 144 ± 10 mg/dl al principio del estudio (dfa 0). En los dos grupos testigos, la colesterolemia disminuye ligeramente a 137 ± 6 mg/dl el dfa 14 y a 125 ± 11 mg/dl el dfa 28, pero no significativamente.
El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento del 36% de la colesterolemia medida el dfa 14 a 186 ± 4 mg/dl y un aumento significativo del 65% el dfa 28 (206 ± 9 mg/dl). A concentraciones superiores a 0,5 y 1% de colesterol en el regimen, se observa un aumento todavfa mas fuerte de la colesterolemia.
Ademas, el regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del colesterol hepatico. Se observa un aumento de colesterol hepatico todavfa mas fuerte para los regfmenes enriquecidos con concentraciones de 0,5 y 1% de colesterol.
Este primer estudio demuestra que un regimen enriquecido a partir de 0,1% de colesterol permite obtener una hipercolesterolemia significativa en el hamster.
2.2. Estudio N° 2
En este estudio (n = 10 por grupo), se ha administrado un regimen enriquecido en colesterol al 0,1% (SAFE) durante 14 dfas para medir el efecto de Saccharomyces boulardii Biocodex a 2x3 g/kg/dfa sobre la hipercolesterolemia.
No se constata ninguna modificacion significativa del peso corporal inducida por el regimen enriquecido y/o por el Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2x3 g/kg/dfa con respecto al grupo testigo.
La colesterolemia del grupo testigo es de 138 ± 3 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 55% en la colesterolemia medida el dfa 14 (214 ± 11 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2x3 g/kg/dfa no modifica la colesterolemia basal (134 ± 3 mg/dl), pero la levadura limita el aumento de la colesterolemia del grupo que recibe el regimen enriquecido a solamente el 33% (184 ± 3 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex disminuye por lo tanto significativamente en un 14% el aumento de la colesterolemia inducida por regimen enriquecido en colesterol al 0,1%.
Asimismo, el regimen enriquecido aumenta significativamente el colesterol hepatico en 387%: 3,22 ± 0,09 mg de colesterol por gramo de tngado en el grupo testigo y 15,67 ± 0,78 mg/g en el grupo que recibe el regimen enriquecido. El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2x3 g/kg/dfa no modifica el colesterol hepatico basal (2,76 ± 0,13 mg/g), pero la levadura limita el aumento del colesterol hepatico del grupo que recibe el regimen enriquecido a solamente 261% (11,62 ± 0,79 mg/g). El Saccharomyces boulardii Biocodex, disminuye por lo tanto significativamente en un 26% el aumento del colesterol hepatico inducido por el regimen enriquecido en colesterol al 0,1%.
2.3. Estudio N° 3
En este estudio (n = 10), se ha reproducido el mismo protocolo que para el estudio precedente, utilizando una dosis inferior de Saccharomyces boulardii Biocodex a 2 x 1 g/kg/dfa.
No se constata ninguna modificacion significativa en el peso corporal inducida por el regimen enriquecido y/o por el Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 1 g/kg/dfa con respecto al grupo testigo.
Valoracion del colesterol
La colesterolemia del grupo testigo es de 132 ± 5 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 52% en la colesterolemia serica medida el dfa 14 (200 ± 10 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 1 g/kg/dfa no modifica la colesterolemia basal (129 ± 6 mg/dl), pero la levadura limita el aumento de la colesterolemia del grupo que recibe el regimen enriquecido a solamente el 34% (176 ± 4 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex disminuye significativamente en un 12% el aumento de la colesterolemia inducida por el regimen enriquecido en colesterol al 0,1%.
Valoracion del colesterol HDL
La concentracion serica de colesterol HDL del grupo testigo es de 76,3 ± 1,8 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 34% en el colesterol HDL medido el dfa 14 (102,2 ± 6,1 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 1 g/kg/dfa no modifica la concentracion basal de colesterol HDL (72,7 ± 2,4 mg/dl), pero la levadura limita el aumento del colesterol HDL del grupo que recibe el
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regimen enriquecido en solamente el 18% (90,4 ± 3,1 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex, disminuye por lo tanto significativamente el aumento del colesterol HDL inducido por el regimen enriquecido en colesterol al 0,1%.
Calculo del colesterol VLDL + LDL
El colesterol en la forma no HDL, es decir, el colesterol bajo la forma VLDL (lipoprotema de muy baja densidad) y LDL ha sido calculado segun la formula:
Colesterol no HDL = Colesterol total - colesterol HDL
La concentracion serica de colesterol VLDL + LDL del grupo testigo es de 55,3 ± 3,5 mg/dl. El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 75% del colesterol VLDL+ LDL serico medido el dfa 14 (96,6 ± 5,5 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 1 g/kg/dfa no modifica la concentracion basal de colesterol VLDL + LDL (56.5 ± 4.5 mg/dl), pero la levadura limita el aumento del colesterol VLDL + LDL del grupo que recibe el regimen enriquecido en solamente el 55% (85,7 ± 3,0 mg/dl).
Valoracion de los trigliceridos
La concentracion serica de trigliceridos del grupo testigo es de 214 ± 33 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 82% en los trigliceridos sericos medidos el dfa 14 (389 ± 75 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 1 g/kg/dfa no modifica la concentracion basal de trigliceridos (222 ± 28 mg/dl), pero la levadura bloquea completamente el aumento de los trigliceridos sericos del grupo que recibe el regimen enriquecido (251 ± 32 mg/dl).
2.4. Estudio N° 4
En este estudio (n = 10), se ha administrado Saccharomyces boulardii Biocodex a 2 x 3 g/kg/dfa a partir del dfa 14 desde el principio del regimen enriquecido en colesterol al 0,1%, y durante 14 dfas, para estudiar el efecto de la levadura sobre la hipercolesterolemia ya establecida.
No se constata ninguna modificacion significativa del peso corporal inducida por el regimen enriquecido y/o por el Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 3 g/kg/dfa con respecto al grupo testigo.
Valoracion del colesterol
La colesterolemia del grupo testigo es de 111 ± 3 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un incremento significativo de 108% de la colesterolemia medida el dfa 28 (231 ± 10 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 3 g/kg/dfa a partir del dfa 14 no modifica la colesterolemia basal (116 ± 4 mg/dl), pero la levadura limita el aumento de la colesterolemia del grupo que recibe el regimen enriquecido a solamente un 82% (203 ± 5 mg/dl). Cuando la hipercolesterolemia esta establecida, el Saccharomyces boulardii Biocodex es entonces capaz de disminuir significativamente en un 12% el aumento de la colesterolemia inducida por el regimen enriquecido en colesterol al 0,1% despues de 14 dfas.
Valoracion del colesterol HDL
La concentracion serica de colesterol HDL del grupo testigo es de 73,3 ± 2,1 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 61% del colesterol HDL serico medido el dfa 28 (118.0.2 ± 3,2 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 3 g/kg/dfa a partir del dfa 14 no modifica la concentracion basal de colesterol HDL (77,0 ± 2,5 mg/dl), pero la levadura limita el aumento del colesterol HDL del grupo que recibe el regimen enriquecido a solamente el 43% (105,0 ± 2,6 mg/dl). Cuando la hipercolesterolemia esta establecida, el Saccharomyces boulardii es entonces capaz de disminuir significativamente en un 11% el aumento del colesterol HDL inducido por el regimen enriquecido en colesterol al 0,1% despues de 14 dfas.
Calculo del colesterol VLDL + LDL
La concentracion serica de colesterol VLDL + LDL del grupo testigo es de 38,0 ± 3,0 mg/dl. El regimen enriquecido con 0,1% de colesterol causa un aumento significativo del 189% del colesterol VLDL + LDL serico medido el dfa 28 (110,0 ± 7,7 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado a 2 x 3 g/kg/dfa no modifica la concentracion basal de colesterol VLDL + LDL (38,9 ± 2,9 mg/dl), pero la levadura limita el aumento del colesterol VLDL + LDL del grupo que recibe el regimen enriquecido a solamente el 158% (98,0 ± 3,8 mg/dl).
Valoracion de los trigliceridos
La concentracion serica de trigliceridos del grupo testigo es de 151 ± 31 mg/dl (Tabla 2). El regimen enriquecido con 0,1% colesterol causa un aumento significativo de 130% en los trigliceridos sericos medidos el dfa 28 (348 ± 66 mg/dl). El Saccharomyces boulardii Biocodex administrado 2x3 g/kg/dfa a partir del dfa 14 cuando la hipercolesterolemia esta presente, no modifica la concentracion basal de trigliceridos (132 ± 20 mg/dl), pero la levadura bloquea completamente el aumento de los trigliceridos sericos del grupo que recibe el regimen enriquecido (212 ± 25 mg/dl).
En conclusion, la administracion de Saccharomyces boulardii Biocodex en el momento de la instalacion de una hipercolesterolemia, o cuando esta instalada una hipercolesterolemia, causa una reduccion significativa de la hipercolesterolemia inducida por un regimen alimenticio enriquecido en colesterol en el hamster. El Saccharomyces boulardii Biocodex permite tambien oponerse de manera significativa al aumento de la concentracion de trigliceridos 5 sericos inducido por el regimen alimenticio enriquecido en colesterol en el hamster.
Tabla 2: Resumen de los efectos de Saccharomyces boulardii Biocodex sobre los parametros de la colesterolemia y de la trigliceridemia modificados por un regimen enriquecido con 0,1% de colesterol en el hamster.
- Regimen
- Saccharomyces Colesterolemia % Colesterol HDL % Trigliceridos %
- enriquecido en
- boulardii (mg/dl) var (mg/dl) var (mg/dl) var
- colesterol
- De dfa 0 a dfa 14
- De dfa 0 a dfa 14
- -
- -
- 138 ± 3
- 0,1%
- - 214±11* + 55
- 0
- 2 x 3 g/kg/dfa 134 ± 3 + 3
- 0,1%
- 2 x 3 g/kg/dfa 184 ± 3* @ + 33
- De dfa 0 a dfa 14
- De dfa 0 a dfa 14
- -
- -
- 132 ± 5 76,3 ± 1,8 214 ± 33
- 0,1%
- - 200±10 * + 52 102,2 ± 6,1* + 34 389 ± 75* + 82
- 0
- 2 x 1 g/kg/dfa 129 ± 6 -2 72,7 ± 2,4 -5 222 ± 28 + 4
- 0,1%
- 2 x 1 g/kg/dfa 176±4 *@ + 34 90,4 ± 3,1* @ + 18 251 ± 32 @ + 17
- De dfa 0 a dfa 28
- De dfa 14 a dfa 28
- -
- -
- 111 ± 3 73,3 ± 2,1 151 ± 31
- 0,1%
- - 231 ± 10* + 108 118,0 ± 3,2* + 61 348 ± 66* + 130
- 0
- 2 x 3 g/kg/dfa 116 ± 4 + 4 77,0 ± 2,5 + 5 132 ± 20 - 13
- 0,1%
- 2 x 3 g/kg/dfa 203 ± 5* @ + 82 105,0 ± 2,6* @ + 43 212±25@ + 40
- (*: prueba estadfstica ANOVA de 2 factores de los grupos tratados en comparacion con los grupos testigos respectivos; @: prueba estadfstica ANOVA de 2 factores de los grupos que reciben S, boulardii Biocodex y el regimen enriquecido en
- comparacion con los grupos respectivos que reciben solamente el regimen enriquecido), (% var: porcentaje de variacion con respecto al grupo testigo sin tratamiento)
Claims (12)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Celulas de la levadura Saccharomyces boulardii para su utilizacion en la reduccion de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular o en la prevencion o el tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia en un individuo.
- 2. Celulas de la levadura Saccharomyces boulardii para su utilizacion segun la reivindicacion 1, estando liofilizadas las celulas de levadura.
- 3. Celulas de la levadura Saccharomyces boulardii para su utilizacion segun la reivindicacion 1 o 2, siendo administradas las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii en forma de capsulas o de sobres.
- 4. Celulas de la levadura Saccharomyces boulardii para su utilizacion segun una de las reivindicaciones 1 a 3, siendo administradas las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii a una dosis de 0,00125 a 25 g/kg/dfa.
- 5. Composicion farmaceutica que comprende como sustancias activas:- celulas de la levadura Saccharomyces boulardii, y- al menos un compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia seleccionado del grupo constituido por una estatina, un fibrato y un fitosterol,eventualmente en asociacion con un vehuculo farmaceuticamente aceptable.
- 6. Composicion farmaceutica de la reivindicacion 5, que comprende una dosis de 50 a 250 mg de celulas de levadura de la especie Saccharomyces boulardii en forma liofilizada.
- 7. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5 o 6, para reducir la colesterolemia y/o la trigliceridemia en un individuo.
- 8. Composicion farmaceutica segun una de las reivindicaciones 5 a 7, para su utilizacion en el tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia.
- 9. Productos que contienen:- celulas de la levadura Saccharomyces boulardii, y- al menos un compuesto adicional destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia,como un producto de combinacion para una utilizacion simultanea, separada o escalonada en el tiempo para la reduccion de la colesterolemia y/o de la trigliceridemia en un individuo que presenta factores de riesgo cardiovascular o para el tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia en un individuo.
- 10. Productos para utilizacion segun la reivindicacion 9, en los cuales el compuesto destinado al tratamiento de la hipercolesterolemia y/o de la hipertrigliceridemia se selecciona del grupo constituido por una estatina, un fibrato, niacina, y un fitosterol.
- 11. Productos para utilizacion segun la reivindicacion 9 o 10, en los que las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii estan liofilizadas.
- 12. Productos para utilizacion segun una de las reivindicaciones 9 a 11, en los que las celulas de la levadura Saccharomyces boulardii se administran a una dosis de 0,00125 a 25 g/kg/dfa.
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