ES2640817T3

ES2640817T3 - Líneas celulares que expresan Nav y métodos para su utilización

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Publication number: ES2640817T3
Application number: ES09789449.7T
Authority: ES
Inventors: Kambiz Shekdar; Olga Dedova
Original assignee: Chromocell Corp
Current assignee: Chromocell Corp
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2009-02-02
Publication date: 2017-11-06
Anticipated expiration: 2029-02-02
Also published as: MX2011008130A; WO2010087864A1; JP2012520058A; US20170219606A1; JP5809065B2; EP2391647B1; BRPI0924225A2; EP2391647A1; US20110312533A1; CA2751159A1

Abstract

Una línea celular manipulada genéticamente para expresar de manera estable un NaV 1.7 humano que comprende una subunidad alfa 9 de NaV, una subunidad beta 1 de NaV y una subunidad beta 2 de NaV, en la que la línea celular se produce mediante un método que comprende las etapas de: a) proporcionar una pluralidad de células que expresan mRNA que codifica o codifican el NaV 1.7 humano; b) dispersar las células individualmente en recipientes de cultivo individuales, proporcionando de este modo una pluralidad de cultivos celulares separados; c) cultivar las células con un conjunto de condiciones de cultivo deseadas usando un método de cultivo celular automatizado caracterizado porque las condiciones son sustancialmente idénticas para cada uno de los cultivos celulares separados, durante el cual se normaliza el cultivo de las diversas células por cultivo celular separado, y en el que se hacen pases de los cultivos separados en el mismo calendario; d) someter a ensayo los cultivos de células separados para medir la expresión del NaV 1.7 humano al menos dos veces y para medir un factor Z' en el ensayo de potencial de membrana; e e) identificar un cultivo celular separado que expresa el NaV 1.7 humano a un nivel uniforme en ambos ensayos y que produce un factor Z' de al menos 0,6 en el ensayo de potencial de membrana, obteniendo de este modo dicha colección de células; en la que el ensayo de potencial de membrana comprende: i) cultivar en placas células de la línea celular a 10.000 - 25.000 células por pocillo en una placa de 384 pocillos en medio de crecimiento; ii) mantener las células en la placa de 384 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 ºC con CO2 al 5% durante 22-24 horas; iii) retirar el medio de crecimiento de la placa de 384 pocillos; iv) incubar las células en la placa de 384 pocillos con un colorante de potencial de membrana de florescencia azul diluido en un tampón de carga que comprende NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,25 mM, HEPES 25 mM, glucosa 10 mM durante 1 hora a 37 ºC; v) añadir a las células incubadas a) 25 μM de veratridina y 5-25 μg/ml de veneno de escorpión para pocillos de control positivo; o b) un tampón de control para pocillos de control negativo; vi) cargar la placa de 384 pocillos en un lector de placas fluorescentes de alto rendimiento; y vii) medir las señales de fluorescencia de células de los pocillos de control positivo y los pocillos de control negativo, en la que el factor Z' se calcula usando las señales de fluorescencia de células medidas de la etapa vii) y usando la ecuación: Factor Z' >= 1 - ((3σcontrol positivo + 3σcontrol negativo)/ (μcontrol positivo - μcontrol negativo)) en la que control σpositivo representa una desviación típica de los controles positivos del ensayo; control σnegativo representa una desviación típica de los controles negativos del ensayo; control μpositivo representa el valor medio de los controles positivos; y control μnegativo representa el valor medio de los controles negativos.

Description

DESCRIPCIÓN

Líneas celulares que expresan Nav y métodos para su utilización

Antecedentes de la invención 5

La familia de canales de sodio activados por voltaje conocidos como familia NaV son moléculas grandes y complejas que se expresan en el sistema nervioso central, incluido el cerebro, en el sistema nervioso periférico y en músculo, incluido el músculo cardiaco. Todos los elementos de la familia son importantes blancos u objetivos clínicos en el tratamiento de una diversidad de condiciones que incluyen epilepsia, parálisis muscular y dolor. Los canales NaV 10 son proteínas incrustadas en la membrana celular que tienen una subunidad alfa y una o más subunidades beta. Se han identificado genes que codifican para diez subunidades alfa y cuatro subunidades beta (véase, por ejemplo, Catterall et al., Pharmacol Rev. 55:575-578 (2003); Isom, Neuroscientist, 7:42-54 (2001)). La subunidad alfa forma el poro iónico y se piensa que es el responsable de la conducción selectiva del sodio y de la activación e inactivación dependiente del voltaje (véase, por ejemplo, Liu et al., Assay Drug Dev Tech, 4(1):37-48 (2006)). Se ha demostrado 15 que las subunidades beta modifican los niveles de expresión y las características biofísicas de algunas subunidades alfa. Liu et al., supra. Las subunidades alfa y beta se expresan de manera diferencial en diferentes tejidos. Id.

El descubrimiento de nuevos y mejores agentes terapéuticos que se dirigen específicamente a los elementos de la familia NaV se ha obstaculizado por la ausencia sistemas celulares y en especial sistemas celulares que sean 20 sensibles a formatos de alta productividad para identificar y analizar moduladores de NaV. Los sistemas celulares se prefieren para la investigación de medicamentos y validación porque permiten la aplicación de un ensayo funcional para un compuesto al contrario de los sistemas que no tienen células, los cuales solo permiten un ensayo de unión. Por otra parte, los sistemas celulares tienen la ventaja de que al mismo tiempo se evalúa la citotoxicidad. La presente invención se enfoca a esta necesidad. 25

El documento WO 2007/109324 desvela ensayos para la identificación de bloqueantes del canal Nav 1.7.

Resumen de la invención

30

Hemos descubierto células y líneas celulares nuevas y útiles que expresan varias formas de NaV, que incluyen los NaV funcionales y varias combinaciones de subunidades de NaV. Estas células y líneas celulares son útiles en ensayos celulares, en particular en ensayos de alta productividad para estudiar las funciones de los NaV y seleccionar respecto a los moduladores de NaV.

35

En consecuencia, la invención proporciona una célula o línea celular manipulada genéticamente (alterada) para expresar establemente un NaV 1.7 humano que comprende una subunidad alfa 9 de NaV, una subunidad beta 1 de NaV y una unidad beta 2 de NaV en la que la línea celular se produce mediante un método como se define en la reivindicación 1, y en la que esta célula o línea celular produce en un ensayo un factor Z' de al menos 0,6. En algunas realizaciones, el factor Z' puede ser de al menos 0.65, 0.70, 0.75, 0.80 o 0.85. Las células y líneas celulares 40 de la invención pueden proliferar (por ejemplo, mantenidas) en cultivo en ausencia de presión selectiva y pueden seguir expresando el NaV durante al menos 15, 30, 45, 60, 75, 100, 120 o 150 días a pesar de la ausencia de presión selectiva. En algunas realizaciones, las células o líneas celulares que proliferan en ausencia de presión selectiva expresan NaV en un nivel uniforme durante al menos 15, 30, 45, 60, 75, 100, 120 o 150 días.

45

En algunas realizaciones, el NaV comprende al menos una subunidad que se exprese a partir de un ácido nucleico introducido que lo codifica y/o comprender al menos una subunidad NaV que se exprese a partir de un gen endógeno activado por activación génica. En algunas realizaciones, el NaV es nativo, por ejemplo, no contiene una etiqueta polipeptídica.

50

Las células o líneas celulares de la invención pueden ser células eucariotas (por ejemplo, células de mamífero) y pueden opcionalmente no expresar NAV en forma endógena (o en el caso de activación génica, no expresar NAV en forma endógena antes de la activación génica). Las células pueden ser células primarias o inmortalizadas y pueden ser, por ejemplo, células de primate (por ejemplo, humanas o de mono), de roedor (por ejemplo, ratón, rata o hámster) o de insecto (por ejemplo, mosca de la fruta). 55

La subunidad NaV alfa es

una subunidad alfa 9 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 27;

un polipéptido con al menos 95% de identidad de secuencia o prácticamente idéntico a la SEQ ID NO: 27, en donde el polipéptido puede formar un canal iónico activado por voltaje; y 60

un polipéptido que es una variante alélica respecto a la SEQ ID NO: 27.

En otras realizaciones, la subunidad alfa está codificada por una secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 13; una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la SEQ ID NO: 13; una secuencia de ácido nucleico con al menos 95% de identidad de secuencia o prácticamente idéntica a la SEQ ID NO: 13 y una secuencia 65 de ácido nucleico que es una variante alélica de la SEQ ID NO: 13.

La subunidad beta del NaV se selecciona a partir del grupo formado por:

una subunidad beta 1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 30;

una subunidad beta 2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 31; 5

un polipéptido con al menos 95% de identidad de secuencia o prácticamente idéntico a cualquiera de las SEQ ID NOS. 30-31, en donde el polipéptido puede modular un canal iónico activado por voltaje; y

un polipéptido que es una variante alélica respecto a cualquiera de las SEQ ID NOS: 30-31.

En otras realizaciones, la subunidad beta está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada en 10 forma individual a partir del grupo formado por: SEQ ID NOS. 16-17; una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de rigor (stringent) con cualquiera de las SEQ ID NOS. 16-17; una secuencia de ácido nucleico con al menos 95% de identidad de secuencia o prácticamente idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOS. 16-17 y una secuencia de ácido nucleico que es una variante alélica de cualquiera. Como se reivindica el Nav 1.7 comprende una subunidad alfa 9 de NaV 1.7, una subunidad beta 1 humana y una subunidad beta 2 humana. La subunidad alfa 15 9 humana puede comprender: (1) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 27; o (2) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO. 13. La subunidad beta 1 humana puede comprender (1) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 30 o (2) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO. 16. La subunidad beta 2 humana puede comprender (1) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 31 20 o (2) una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 17. En algunas realizaciones, el NaV nativo puede comprender un polipéptido que contenga una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 27; un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 30; y un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 31.

25

La invención también proporciona un método para identificar un modulador de NaV 1.7 humano, como se define en la reivindicación 4, que consta de los siguientes pasos: poner en contacto una célula, una línea celular o una colección de líneas celulares de la invención con un compuesto de prueba; y detectar un cambio en la función del NaV 1.7 en un célula en comparación con una célula que no está en contacto con el compuesto de prueba, en donde un cambio en la función indica que el compuesto de prueba es un modulador de NaV 1.7 humano. El 30 compuesto de prueba puede ser una molécula pequeña, un polipéptido, un péptido o un anticuerpo o una fracción de unión al antígeno del mismo. El compuesto de prueba puede estar en una biblioteca de compuestos. La biblioteca puede ser una biblioteca de moléculas pequeñas, una biblioteca de combinaciones, una biblioteca de péptidos o una biblioteca de anticuerpos. En el método de la presente, el paso de detección se puede seleccionar a partir de un ensayo de potencial de membrana, un ensayo de electrofisiología, un ensayo de unión y los métodos se pueden 35 implementar para alta productividad.

La invención también proporciona una colección de células manipulada genéticamente para que exprese en forma estable un NaV 1.7 humano que comprende una subunidad alfa 9 de NaV, una subunidad beta 1 de Nav y una subunidad beta 2 de NaV a un nivel uniforme a través del tiempo, como se define en la reivindicación 7, la célula se 40 trabaja por un método que consta de los siguientes pasos: (a) proporcionar a pluralidad de células que expresan mRNA(s) que codifican el NaV 1.7 humano; (b) dispersar las células individualmente en tubos de cultivo individual, para obtener una pluralidad de cultivos celulares por separado; (c) cultivar las células con un conjunto de condiciones de cultivo deseadas utilizando métodos de cultivo celular automatizados caracterizados porque las condiciones son prácticamente idénticas para cada uno de los cultivos celulares individuales, durante las cuales se 45 normaliza el cultivo del número de células por cada cultivo celular individual y en donde los cultivos individuales se subcultivan en el mismo esquema; (d) evaluar los cultivos celulares individuales para medir la expresión del NaV 1.7 humano al menos dos veces; e (e) identificar un cultivo celular individual que exprese el NaV 1.7 humano a un nivel uniforme en los dos ensayos, y obtener así la célula.

50

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica de barras que representa la expresión relativa de las subunidades NaV 1.7 α, β1 y β2 en líneas celulares que expresan NaV 1.7 en forma estable. Los niveles de expresión se analizaron por RT-PCR cuantitativa y se normalizaron respecto al nivel de expresión de un gen GAPDH de control. las barras (+) indican 55 que las reacciones se hicieron con adición de enzima transcriptasa inversa y las barras (-) indican que las reacciones se hicieron sin adición de enzima transcriptasa inversa.

La Figura 2 muestra la regulación de la expresión de la subunidad NaV 1.7 α por subunidades auxiliares β. La RT-PCR comparativa ilustra el aumento en la detección de la expresión de la subunidad α en células seleccionadas en función de medicamentos, cuando las tres subunidades NaV 1.7 se cotransfectaron, 60 comparadas con células transfectadas solo con la subunidad α.

Las Figuras 3A-C muestran datos de electrofisiología de una línea celular producida que expresa establemente las tres subunidades NaV 1.7, indicando la respuesta distintiva para NaV 1.7. La Figura 3A muestra las corrientes de sodio como respuesta a 20 ms (milisegundos) de pulsos de despolarización de -80 mV a +50 mV. La Figura 3B muestra la relación entre corriente y voltaje resultante (I-V) para las corrientes pico de canales de 65 sodio. La Figura 3C muestra la gráfica de inactivación para el canal de sodio.

La Figura 4 muestra que las células que expresan establemente las tres subunidades NaV 1.7 respondieron a dos activadores de NaV conocidos, veratridina y veneno de alacrán, mientras que las células de control no lo hicieron. La respuesta se midió mediante un ensayo celular del potencial de membrana funcional.

Las Figuras 5A y 5B muestran la activación de células que expresan establemente NaV 1.7 como respuesta a los compuestos de prueba. La Figura 5A representa la respuesta de activación del clon C44 (células que 5 expresan las tres subunidades NaV 1.7) cuando se expone a los compuestos de prueba C18 y K21. La Figura 5B representa la respuesta totalmente bloqueada a los mismos compuestos de prueba del clon 60 (células que expresan solo una subunidad alfa NaV 1.7). El % de control se calculó con relación a la respuesta de dos clones solamente a un amortiguador (es decir, sin compuestos de prueba adicionados).

10

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente tienen para la persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece la invención. En caso de conflicto, la presente especificación, incluidas las definiciones, funcionarán como 15 control. A lo largo de esta especificación y reivindicaciones, se deberá entender que la palabra "comprende" o sus variaciones como "que comprende" implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros determinado pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

20

A fin de que la presente invención se pueda comprender con mayor facilidad, primero redefinirán algunos términos. Otras definiciones se establecen a través de la especificación.

En el sentido que se utiliza en la presente, el término proteína "nativa" (por ejemplo, proteína de canal iónico) se refiere a una proteína que no tiene una secuencia de aminoácidos añadida o insertada. Por ejemplo, el "NaV nativo" 25 utilizado aquí, incluye proteínas NaV que no tienen una secuencia etiqueta que se exprese en un nivel de polipéptido. En algunas realizaciones, un NaV nativo comprende todas las subunidades de un NaV que se presenta en forma natural en el que las subunidades están intactas y correctamente ensambladas.

El término "estable" o "que expresa establemente o en forma estable" se refiere a distinguir las células y líneas 30 celulares de la invención de células con expresión transitoria tal como la persona experta en la técnica entendería los términos "expresión estable" y "expresión transitoria"

El término "línea celular" o "línea celular clonal" se refiere a una población de células que son todas progenie de una sola célula original. En el sentido que se utiliza en la presente, las líneas celulares se mantienen in vitro en un cultivo 35 celular y se pueden congelar en alícuotas para generar bancos de células clonales.

El término "condiciones de rigor (stringent)" o "condiciones de hibridación rigurosas (stringent)" describen condiciones de temperatura y salinas para hibridar uno o más sondas de ácidos nucleicos con una muestra de ácido nucleico y eliminar mediante lavados sondas que no se han unido específicamente a ácidos nucleicos elegidos como 40 objetivo en la muestra. Las condiciones de rigor son conocidas para los expertos en la técnica y se pueden encontrar en . En la referencia se describen métodos en medio acuoso y no acuoso y se puede utilizar cualquiera de ellos. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X SSC a una temperatura cercana a 45ºC, seguida de un lavado en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 60ºC. Otro ejemplo de condiciones de hibridación de rigor lo constituye la hibridación en 6X SSC a una temperatura alrededor de 45ºC, seguida de al menos un lavado en 0.2X 45 SSC, 0.1% SDS a 65ºC. Las condiciones de rigor incluyen la hibridación en fosfato de sodio 0.5 M, 7% SDS a 65ºC, seguida de al menos uno

La frase "por ciento idéntica" o "por ciento de identidad" con relación a secuencias de aminoácidos y/o ácidos nucleicos, se refiere a la similitud entre al menos dos secuencias diferentes. Este por ciento de identidad se puede 50 determinar mediante algoritmos de alineamiento estándar, por ejemplo, la herramienta Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410); el algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453); o el algoritmo de Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17). Un conjunto de parámetros puede ser la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por brecha (gap) de 12, una penalización ampliada por brecha de 4 y una penalización por brecha en la pauta de lectura de 5. El por ciento de 55 identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos también se puede determinar mediante el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos por peso PAM120, una penalización por longitud de brecha de 12 y una penalización por brecha de 4. El por ciento de identidad por lo general se calcula comparando secuencias de longitud similar. El software para análisis de proteínas empareja secuencias similares empleando medidas de 60 similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones de aminoácidos conservados. Por ejemplo, el software GCG contiene programas como "Gap" y "Bestfit" que se pueden usar parámetros predefinidos para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos que guardan estrecha relación, por ejemplo, polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las 65 secuencias de polipéptidos también se pueden comparar mediante el uso de FASTA con parámetros

predeterminados o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y por ciento de identidad de secuencia de las regiones de mejor traslape entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). La longitud de las secuencias de polipéptidos comparadas para su homología serán, por lo general, de al menos alrededor de 16 residuos de aminoácidos, por lo general, de al menos alrededor de 20 5 residuos, más comúnmente al menos alrededor de 24 residuos, normalmente al menos alrededor de 28 residuos y de preferencia más de alrededor de 35 residuos.

Los términos "prácticamente como lo establecido", "prácticamente idéntica" o "prácticamente homóloga", se refieren a que la secuencia de aminoácidos o nucleótidos correspondiente será idéntica o tendrá diferencias insignificantes 10 (a través de las sustituciones de aminoácidos conservados) con respecto a las secuencias propuestas. Las diferencias insignificantes incluyen cambios menores en los aminoácidos, como de 1 o 2 sustituciones en una secuencia de 50 aminoácidos de una región especificada.

El término "modulador" de NaV se refiere a un compuesto que altera la actividad biológica de un NaV, por ejemplo, 15 la conductancia iónica a través del NaV. Un modulador de NaV puede actuar sobre todos o sobre un subconjunto específico de NaV o subunidades NaV. Los moduladores incluyen, entre otros, agonistas (potenciadores o activadores) y antagonistas (inhibidores o bloqueadores). Un agonista de NaV se refiere a un compuesto que aumenta la actividad biológica de un NaV. Un antagonista de NaV se refiere a un compuesto que disminuye la actividad biológica de un NaV. 20

Un "NaV funcional" se refiere a un NaV que tiene una o más actividades biológicas de un NaV natural o que se expresa en forma exógena. Las actividades biológicas del NaV incluyen, entre otras, la conductancia de sodio dependiente del voltaje, y se puede evaluar a través de respuestas farmacológicas como la inhibición por lidocaína y tetrodotoxina (TTX). Otros compuestos que son farmacológicamente activos en los NaV y que se pueden usar para 25 evaluar la funcionalidad de un NaV introducido, incluyen los compuestos que abren los canales de sodio que mantienen el canal en su estado de apertura, por ejemplo, veratridina y veneno de alacrán y otros venenos.

El término subunidad NaV "heteróloga" o "introducida" se refiere a que la subunidad NaV es codificada por un polinucleótido introducido en una célula huésped o por una secuencia que codifica NaV endógeno cuya expresión se 30 activa (por ejemplo, por tecnología de activación génica) mediante factores introducidos por vía externa, como los elementos reguladores de transcripción. El término "NaV heterólogo" se refiere a un NaV que comprende una o más subunidades NaV heterólogas.

En un primer aspecto, la invención como se define en la reivindicación 1 proporciona células (por ejemplo, células 35 aisladas, células clonales o mezclas de células clonales) y líneas celulares que expresan (por ejemplo, establemente) una o más subunidades de NaV 1.7 humano heterólogas (introducidas) (por ejemplo, subunidades NaV 1.7 nativas). Las células y líneas celulares pueden expresar constitutivamente las subunidades NaV. Las células y líneas celulares se pueden modular por agentes de apertura como la veratridina y el veneno de alacrán o por cambios en el voltaje de membrana. En realizaciones relacionadas, las células o líneas celulares expresan en 40 forma estable un NaV 1.7 heterólogo funcional. Las células y líneas celulares NaV 1.7 de la invención tienen propiedades mejoradas en comparación con las células y líneas celulares obtenidas por los métodos convencionales. Por ejemplo, las células y líneas celulares NaV 1.7 tienen mejor estabilidad de expresión (incluso cuando se mantienen en cultivo sin presión selectiva como antibióticos) y tienen valores Z' altos en ensayos celulares. Las células y líneas celulares de la invención proporcionan relaciones detectables entre señal y ruido, por 45 ejemplo, una relación entre señal y ruido mayor de 1:1. Las células y líneas celulares de la invención proporcionan lecturas confiables cuando se usan en ensayos de alta productividad como los ensayos de potencial de membrana, que producen resultados que pueden emparejarse con los de ensayos considerados como métodos de referencia en el campo pero demasiado laboriosos para llevarse a cabo en forma intensiva (por ejemplo, los ensayos electrofisiológicos). 50

En varias realizaciones, las células o líneas celulares de la invención expresan el NaV 1.7 humano a un nivel uniforme de expresión durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 días o más de 200 días, en donde la expresión uniforme se refiere a un nivel de expresión que no varía 55 más de: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 9% o 10% durante 2 a 4 días de cultivo celular continuo,; 2%, 4%, 6%, 8%, 10% o 12% durante 5 a 15 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20% durante 16 a 20 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24% durante 21 a 30 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% o 30% durante 30 a 40 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 60 20%, 22%, 24%, 26%, 28% o 30% durante 41 a 45 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% o 30% durante 45 a 50 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% o 35% durante 45 a 50 días de cultivo celular continuo, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% o 30% durante 50 a 55 días de cultivo celular continuo; 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% o 35% 65 durante 50 a 55 días de cultivo celular continuo; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40%

durante 55 a 75 días de cultivo celular continuo;1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% durante 75 a 100 días de cultivo celular continuo; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% durante 101 a 125 días de cultivo celular continuo; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% durante 126 a 150 días de cultivo celular continuo; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% durante 151 a 175 días de cultivo celular continuo; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 5 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% durante 176 a 200 días de cultivo celular continuo; o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% durante más de 200 días de cultivo celular continuo.

Como se define en la reivindicación 1, las células se transfectan tres veces con ácidos nucleicos que codifican y expresan una subunidad alfa 9/SCN9A NaV humano, una subunidad betal/SCN1B NaV humana y una subunidad 10 beta 2/SCN2B NaV humana. En algunas realizaciones, se colocan en el mismo vector secuencias codificantes para dos o más de las subunidades NaV introducidas. En otras realizaciones, cada secuencia codificante de la subunidad se coloca en diferente vector.

También se desvela en el presente documento, las células y líneas celulares de la presente expresan una subunidad 15 alfa introducida, seleccionada entre cualquiera de las subunidades alfa 1-11 y una subunidad beta introducida, seleccionada entre cualquiera de las subunidades beta 1-4, cada una de estas combinaciones se indica con "+" en la siguiente tabla:

: Beta 1 Beta 2 Beta 3 Beta 4

Alfa 1: + + + +

Alfa 2: + + + +

Alfa 3: + + + +

Alfa 4: + + + +

Alfa 5: + + + +

Alfa 7: + + + +

Alfa 8: + + + +

Alfa 9: + + + +

Alfa 10: + + + +

Alfa 11: + + + +

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Estas células y líneas celulares también pueden expresar una o más subunidades beta introducidas, seleccionadas en forma independiente a partir de cualquiera de las subunidades beta 1-4. También se desvela en el presente documento, las células y líneas celulares de la invención expresan un canal NaV que incluye una combinación de subunidades alfa y beta tal como se muestran en la tabla anterior y el canal NaV en estas líneas celulares también comprende una o más subunidades beta seleccionadas entre cualquiera de las subunidades beta 1-4. 25

El ácido nucleico que codifica la subunidad NaV puede ser ADN genómico o ADNc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la subunidad NaV comprende una o más sustituciones, inserciones o deleciones que pueden o no dar como resultado una sustitución de aminoácido. Las subunidades NaV con modificaciones que están dentro del alcance de la invención, conservan al menos una propiedad biológica, por ejemplo, su habilidad para 30 funcionar canal de sodio activado por voltaje o modularlo o responder a agentes de apertura de canal iónico como la veratridina y el veneno de alacrán y otros venenos y bloqueadores de canal como la lidocaína y la tetrodotoxina (TTX). Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico prácticamente idénticas (por ejemplo, al menos con alrededor de 85% de identidad de secuencia) u homólogas (por ejemplo, al menos con alrededor de 85% de homología de secuencia) a las secuencias expuestas aquí, también quedan comprendidas en esta invención. En algún modo, la 35 identidad de secuencia puede ser de alrededor de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. Como alternativa, existe identidad u homología considerable cuando los segmentos de ácido nucleico se hibriden en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo, condiciones de hibridación muy rigurosas) con el complemento de la secuencia de referencia.

40

En algunas realizaciones, cuando la mutación de nucleótido implica una sustitución de aminoácido, el aminoácido nativo puede reemplazarse con una sustitución conservativa o no conservativa. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia entre las secuencias de polipéptidos originales y modificadas puede ser al menos de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. Los expertos en la técnica comprenderán que la sustitución conservativa de aminoácidos es aquella en la cual las cadenas laterales de aminoácidos son similares en estructura y/o 45 propiedades químicas y la sustitución no deberá cambiar en forma considerable las características estructurales de la secuencia natural. En realizaciones que usan un ácido nucleico que incluye una mutación, la mutación puede ser una mutación al azar o una mutación en un sitio específico.

Las modificaciones conservativas producirán receptores de NaV que tienen características funcionales y químicas 50 similares a las del receptor de NaV sin modificar. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con características químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos

conservativa no cambiará de manera considerable las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia o grado de similitud se puede ajustar en forma ascendente para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son muy conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). 5

Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales como propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas alifáticas laterales: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxil alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptofano; 5) cadenas laterals básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas 10 laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterals que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservados preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 publicada por Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992). Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier 15 cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad NaV, también comprende una etiqueta de epítope. Estas etiquetas pueden codificar, por ejemplo, proteína fluorescente amarilla (YFP - yellow fluorescent protein), proteína fluorescente verde (GFP - green fluorescent protein), 6x-HIS (SEQ ID NO: 35), myc, 20 FLAG o hemaglutinina (HA), S-tag, tiorredoxina, proteínas autofluorescentes, GST, V5, TAP, CBP, BCCP, etiqueta de proteína de unión a maltosa, Nus-tag, Softag 1, Softag 3, Strep-tag o alguna variante de las mencionadas. Una etiqueta se puede usar como marcador para determinar los niveles de expresión, la localización intracelular, la interacción proteína-proteína, regulación y función del NaV o una subunidad del mismo. Una etiqueta también se puede usar para facilitar la purificación y fraccionación de la proteína. Estas y otras secuencias etiqueta son 25 conocidas para el experto en la técnica y por lo general corresponden a secuencias de aminoácidos que se pueden incorporar en productos de proteína expresados y con frecuencia seleccionarse con base en la disponibilidad de anticuerpos robustos o reactante de detección de proteína que se pueden utilizar para reportar su presencia. Sin embargo, las secuencias etiqueta descritas aquí no se refieren solamente a secuencias que se pueden utilizar para modificar, a nivel de aminoácidos, productos de proteína codificados por los ARN que están etiquetados o para 30 ayudar en la posterior detección de cualquiera de estos productos de proteína modificados por el uso del correspondiente anticuerpo o reactantes de detección de proteínas. Véase, por ejemplo, más adelante, los comentarios con respecto al uso de etiquetas de ARN empleadas como "faros moleculares".

Las células huésped utilizadas para producir una línea celular de la invención pueden expresar una o más proteínas 35 NaV endógenas o expresar la ausencia de una o más de cualquiera de las proteínas NaV. La célula huésped puede ser una célula primaria, germinal o una célula precursora que incluye una célula precursora embrionaria. La célula huésped también puede ser una célula inmortalizada. La célula huésped se puede derivar de una célula primaria o inmortalizada de capas de mesodermo, ectodermo o endodermo. La célula huésped puede ser célula endotelial, epidérmica, mesenquimatosa, neural, renal, hepática, hematopoyética o inmune. Por ejemplo, las células huésped 40 pueden ser células de la cripta intestinal o de vellosidades intestinales, células clara, células de colon, células intestinales, células calciformes, células enterocromafínicas, células enteroendocrinas. Las células huésped pueden ser células eucariotas, procariotas, de mamíferos, humanas, de primate, de bovinos, de porcinos, felinos, roedores, marsupiales, murinas u otras células. Las células huésped también pueden ser de origen no mamífero, por ejemplo, de levadura, insectos, hongos, vegetales, eucariotas y procariotas de organismos inferiores. Estas células huésped 45 pueden proporcionar antecedentes que sean más divergentes para evaluar con mayor probabilidad la ausencia de productos de expresión producidos por la célula que tenga interacción con el objetivo o blanco. En realizaciones preferidas, la célula huésped es una célula de mamífero. Ejemplos de células de mamífero que se pueden usar para la línea celular de la invención incluyen, entre otras: Células ováricas de hámster chino (CHO), líneas celulares neuronales establecidas, feocromocitomas, neuroblastomas fibroblastos, rabdomiosarcomas, células de la raíz 50 posterior de ganglio nervioso, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, HEK-293 (ATCC CRL1573), PC12 (ATCC CRL-1721), HEK293T (ATCC CRL-11268), RBL (ATCC CRL-1378), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), MDCK (ATCC CCL-34), SJ-RH30 (ATCC CRL-2061), HepG2 (ATCC HB-8065), ND7/23 (ECACC 92090903), CHO (ECACC 85050302), Vero 55 (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCC HTB 37), K562 (ATCC CCL 243), Jurkat (ATCC TIB-152), Per.C6 (Crucell, Leiden, Holanda), Huvec (ATCC Human Primary PCS 100-010, Mouse CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12 (ECACC 01042712), 293 (ATCC CRL 10852), A549 (ATCC CCL 185), IMR-90 (ATCC CCL 186), MCF-7 (ATC HTB-22), U-2 OS (ATCC HTB-96), T84 (ATCC CCL 248) o cualquier línea celular establecida (polarizada o no polarizada) o cualquier línea celular disponible con depositarios como The American Type Culture Collection (ATCC, 10801 60 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209 EE.UU.) o la colección European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury Wiltshire SP4 0JG Inglaterra). La persona con experiencia ordinaria en la técnica comprenderá que existe la posibilidad de que diferentes factores adicionales conocidos y desconocidos interactúen con la función o expresión del blanco o las alteren dependiendo de la elección del tipo de célula huésped.

65

En una realización, la célula huésped es una célula precursora embrionaria que se utiliza luego como base para la

generación de animales transgénicos. Las células precursoras embrionarias que expresan en forma estable al menos una subunidad NaV y de preferencia u receptor NaV heterólogo funcional, se pueden implantar en los organismos directamente o sus núcleos se pueden transferir en otras células recipientes y luego éstas se pueden implantar in vivo para estudiar proliferación y desarrollo. Las células precursoras también se pueden usar para crear animales transgénicos. 5

Como comprenderán los expertos en la técnica, cualquier vector que sea adecuado para usarse con las células huésped se puede utilizar para introducir un ácido nucleico que codifique una subunidad NaV alfa o beta a la célula huésped. Los vectores que comprenden las subunidades alfa y cada una de las beta pueden ser del mismo tipo o de diferentes tipos. Ejemplos de vectores que se pueden usar para introducir los ácidos nucleicos que codifican la 10 subunidad NaV a las células huésped incluyen, entre otros, plásmidos, virus, incluidos los retrovirus y los lentivirus, cósmidos, cromosomas artificiales y pueden incluir, por ejemplo, pFN11A (BIND) Flexi®, pGL4.31, pFC14A (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFC14K (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFN24A (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, pFN24K (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, HaloTag™ pHT2, pACT, pAdVAntage™, pALTER®-MAX, pBIND, pCAT®3-Basic, pCAT®3-Control, pCAT®3-Enhancer, pCAT®3-Promoter, pCI,pCMVTNT™, pG51uc, pSI, pTARGET™, pTNT™, 15 pF12A RM Flexi®, pF12K RM Flexi®, pReg neo, pYES2/GS, pAd⁄CMV⁄V5-DEST Gateway® Vector, pAd⁄PL-DEST™ Gateway® Vector, Gateway® pDEST™27 Vector, Gateway® pEF-DEST51 Vector, Gateway® pcDNA™-DEST47 vector, pCMV/Bsd Vector, pEF6/His A, B, & C, pcDNA™6.2-DEST, pLenti6/TR, pLP-AcGFPI-C, pLPS-AcGFP1-N, pLP-IRESneo, pLP-TRE2, pLP-RevTRE, pLP-LNCX, pLP-CMV-HA, pLP-CMV-Myc, pLP-RetroQ, pLP-CMVneo, pCMV-Script, pcDNA3.1 Hygro, pcDNA3.1neo, pcDNA3.1puro, pSV2neo, pIRES puro y pSV2 zeo. En algunas 20 realizaciones, los vectores comprenden secuencias de control de expresión como los promotores constitutivos o condicionales. La persona con experiencia ordinaria en la técnica podrá seleccionar estas secuencias. Por ejemplo, los promotores adecuados incluyen, entre otros, CMV, TK, SV40 y EF-1α. En algunas realizaciones, los promotores son inducibles, regulados por temperatura, específicos de tejido, suprimibles, de choque térmico, de desarrollo, específicos de un linaje celular, susceptibles de expresarse en células procariotas y/o eucariotas o promotores 25 temporales o una combinación o recombinación de secuencias reordenadas no modificadas o mutagenizadas, aleatorizadas de una o más de las anteriores. Los ácidos nucleicos que codifican subunidades NaV, de preferencia se expresan de manera constitutiva.

En algunas realizaciones, el vector carece de un marcador seleccionable o un gen de resistencia a medicamentos. 30 En otras realizaciones, el vector comprende en forma opcional un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, una proteína que confiera resistencia a medicamentos o antibióticos. Cada vector para una secuencia que codifica una subunidad NaV diferente, puede tener igual o diferente resistencia a medicamentos u otro marcador seleccionable. Si existen dos o más marcadores de resistencia a medicamentos iguales, la selección simultánea se puede lograr aumentando la concentración del medicamento. Los marcadores adecuados 35 son muy conocidos para el experto en la técnica e incluyen, entre otros, genes que confieren resistencia a cualquiera de los siguientes: Neomicina/G418, Puromicina, higromicina, Zeocina, metotrexato y blasticidina. Aunque la selección del medicamento (o la selección mediante cualquier otro marcador de selección adecuado) no sea un paso requerido, se puede utilizar si se quiere, para enriquecer la población de células transfectadas en células transfectadas en forma estable, siempre que los constructos transfectados sean diseñados para conferir resistencia 40 a medicamentos. Si la selección se lleva a cabo utilizando sondas de señalización, la selección realizada demasiado pronto después de la transfección puede dar lugar a algunas células positivas que se transfecten solo de manera transitoria y no en forma estable. Sin embargo, esto se puede minimizar permitiendo suficiente subcultivo celular, que permita la dilución de células transfectadas de manera transitoria, células integradas en forma estable que no expresen al ADN introducido o células que generen ARN que no pueda ser detectado eficientemente por las sondas 45 de señalización.

En otro aspecto de la invención, las células y líneas celulares de la invención expresan de manera estable NaV 1.7 humano o una subunidad de NaV 1.7. Para identificar la expresión estable, la expresión de la línea celular de cada subunidad NaV se mide con respecto a un periodo de tiempo y se comparan los niveles de expresión. Las líneas 50 celulares estable seguirán expresando las subunidades NaV 1.7 humano a través del tiempo prácticamente al mismo nivel (por ejemplo, no habrá más de 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5% o 2% de variación). En algunos aspectos de la invención, el periodo de tiempo puede ser de al menos una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas; o al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve meses o al menos cualquier lapso de tiempo que se ubique entre éstos. Las células aisladas se pueden caracterizar, por ejemplo, por qRT-PCR 55 y RT-PCR con punto de terminación único para determinar las cantidades absolutas o relativas de cada subunidad NaV que se exprese o por cualquier otro método convencional de análisis de expresión de proteínas.

Las células y líneas celulares de la invención tienen la conveniente propiedad adicional de permitir ensayos con alta reproducibilidad como se hace evidente por su factor Z'. Véase, Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, "A Simple 60 Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays." J. Biomol. Screen. 1999;4(2):67-73. Los valores Z' corresponden a la calidad de una célula o línea celular porque reflejan el grado en el que una célula o línea celular responderá en forma uniforme a los moduladores. El valor Z' es un cálculo estadístico que toma en cuenta el intervalo entre señal y ruido y la variabilidad de señal (es decir, de pocillo a pocillo) de la respuesta funcional a un compuesto de referencia en toda una placa multipocillos. Z' se calcula con datos obtenidos 65 de varios pocillos con un control positivo y varios pocillos con control negativo. La relación entre sus desviaciones

estándar combinadas multiplicada por tres y la diferencia en sus valores medios se respuesta de uno para obtener el factor Z', según la siguiente ecuación:

Factor Z' = 1 – ((3control positivo + 3control negativo)/ (control positivo - control negativo))

5

El factor Z' máximo teórico es 1.0, que indicaría un ensayo ideal sin variabilidad e intervalo dinámico sin límites. En el sentido que se utiliza en la presente, un valor "Z' alto" se refiere a un factor Z' de Z' de al menos 0.6, al menos 0.7, al menos 0.75 o al menos 0.8 o cualquier decimal entre 0.6 y 1.0. Un valor menor de 0 es indeseable porque indica que existe un traslape entre los controles positivo y negativo. En la industria, para ensayos celulares simples, valores Z' hasta de 0.3 se consideran puntuaciones marginales, valores Z' entre 0.3 y 0.5 se consideran aceptables y valores 10 Z' por arriba de 0.5 se consideran excelentes. Ensayos no celulares o bioquímicos puede alcanzar puntuaciones Z' más altas, pero las puntuaciones Z' para los sistemas celulares tienden a ser menores porque los sistemas celulares son complejos.

Como admitirán las personas con experiencia ordinaria en la técnica, históricamente los ensayos en células que 15 utilizan células que expresan una proteína monocatenaria, por lo general, no alcanzan un valor Z' mayor de 0.5 a 0.6. Estas células no serían confiables para utilizarse en un ensayo debido a que los resultados no son reproducibles. Por otra parte, las células y líneas celulares de la invención, tienen valores Z' altos y en forma conveniente producen resultados uniformes en los ensayos. Las células y líneas celulares NaV de la invención aportan la base para ensayos compatibles de tamizaje alta productividad (HTS - high throughput screening) debido a 20 que por lo general tienen factores Z' mínimos de 0.7. En algunos aspectos de la invención, las células y líneas celulares dan valores Z' de al menos 0.3, al menos 0.4, al menos 0.5, al menos 0.6, al menos 0.7 o al menos 0.8. En otros aspectos de la invención, las células y líneas celulares de la invención dan como resultado un valor Z’ de al menos 0.7, al menos 0.75 o al menos 0.8 mantenido durante múltiples subcultivos, por ejemplo, entre 5 y 20 subcultivos, incluido cualquier número entero entre 5 y 20. En algunos aspectos de la invención, las células y líneas 25 celulares dan como estado valores Z’ de al menos 0.7, al menos 0.75 o al menos 0.8 mantenidos durante 1, 2, 3, 4 o 5 semanas o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 meses, incluido cualquier lapso de tiempo entre ellos.

También según la invención, las células y líneas celulares que expresan una forma recombinante de un heteromultímero NaV natural (en comparación con líneas celulares que expresan combinaciones que no se 30 presentan en forma natural de subunidades alfa y beta o que expresan solo las subunidades alfa o beta) se pueden caracterizar respecto a funciones NaV, por ejemplo, conductancia de ión sodio. En algunas realizaciones, las células u líneas celulares de la invención muestran la actividad "fisiológicamente importante" de un canal iónico introducido. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "fisiológicamente importante" se refiere a la propiedad de una célula o línea celular que expresa un canal iónico introducido por lo que el canal iónico introducido se comporta, por 35 ejemplo, responde a un modulador, prácticamente en la misma forma que lo hace un canal natural del mismo tipo, por ejemplo, un receptor natural que también la misma combinación de subunidades alfa y beta. Las células y líneas celulares de esta invención, de preferencia, demuestran una función comparable a la de las células que normalmente expresan NaV endógeno (nativo) (por ejemplo, células primarias) en un ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo de potencial de membrana que utiliza sodio como activador del NaV, un ensayo 40 electrofisiológico y un ensayo panorámico o de unión. Estas comparaciones se usan para determinar la importancia fisiológica de una célula o línea celular.

En otro aspecto de la invención, se pueden usar moduladores identificados con las líneas celulares de la invención, en ensayos adicionales para confirmar la funcionalidad. Otra propiedad ventajosa de las células y líneas celulares de 45 la invención es que los moduladores identificados en tamizaje inicial son funcionales en ensayos funcionales secundarios, por ejemplo, en ensayo de potencial de membrana o ensayo electrofisiológico. Como admitirán las personas con experiencia ordinaria en la técnica, los compuestos identificados en ensayos de tamizaje inicial, por lo general, tienen que modificarse, por ejemplo, por química combinatoria, química médica o química de síntesis, para que sus derivados o análogos sean funcionales en ensayos funcionales secundarios. Sin embargo, debido a la alta 50 importancia fisiológica de las células y líneas celulares de la presente, es posible que los compuestos identificados con ellos no requieran tal afinación "gruesa".

En algunas realizaciones, las células y líneas celulares de la invención tienen sensibilidad aumentada para los moduladores de NaV. Las células y líneas celulares de la invención responden a moduladores con valores EC50 o 55 IC50 en el intervalo fisiológico para NaV. En el sentido que se utiliza en la presente, EC50 se refiere a la concentración de un compuesto o sustancia requerida para inducir una respuesta activadora a la mitad de la máxima en las células o líneas celulares. En el sentido que se utiliza en la presente, IC50 se refiere a la concentración de un compuesto o sustancia requerida para inducir una respuesta inhibidora a la mitad de la máxima en las células o líneas celulares. Los valores EC50 e IC50 se pueden determinar mediante técnicas que son muy conocidas en la 60 técnica, por ejemplo, una curva de respuesta a la dosis que correlaciona la concentración de un compuesto o sustancia con la línea celular que expresa el NaV. Por ejemplo, la IC50 para tetrodotoxina (TTX) en una línea celular de la invención es alrededor de 1-100 nM, por ejemplo 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 nM.

En algunas realizaciones, propiedades de las células y líneas celulares de la invención, como estabilidad, 65 importancia fisiológica, reproducibilidad en un ensayo (Z') o valores EC50 o IC50 fisiológicos, son susceptibles de

lograrse en condiciones de cultivo específicas. En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo específicas se normalizan y se mantienen en forma rigurosa sin variación, por ejemplo, por automatización. Las condiciones de cultivo pueden incluir cualquier condición adecuada en la cual proliferen las células o líneas celulares y pueden incluir las conocidas en la técnica. Una variedad de condiciones de cultivo pueden dar como resultado propiedades biológicas convenientes para el NAV o sus mutantes o variantes alélicas. 5

En otras realizaciones, las células y líneas celulares de la invención con propiedades deseadas, como estabilidad, importancia fisiológica, reproducibilidad en un ensayo (Z') o valores EC50 o IC50 fisiológicos, se pueden obtener en un mes o menos. Por ejemplo, las células o líneas celulares se pueden obtener en 2, 3, 4, 5 o 6 días o en 1, 2, 3 o 4 semanas o cualquier lapso de tiempo intermedio. 10

Las células y líneas celulares de la presente se pueden usar en una colección o panel, cada conjunto de células o cada línea celular expresan una forma de NaV [por ejemplo, NaV constituido por varias combinaciones (por ejemplo, dímeros, trímeros, etc.) de subunidades alfa y beta o variantes (por ejemplo, mutantes, fragmentos o variantes de corte y empalme) de las subunidades o un mono o multímero de solo una subunidad alfa o beta]. La colección puede 15 incluir, por ejemplo, líneas celulares que expresen dos o más de los receptores de NaV anteriormente mencionados. En algunas realizaciones, la colección o panel también puede comprender elementos que expresen el mismo NaV o que expresen proteínas de control.

Cuando las colecciones o paneles de células o líneas celulares se producen, por ejemplo, para tamizaje con 20 medicamentos, las células o líneas celulares en la colección o panel pueden emparejarse de tal manera que sean Rgules (o también prácticamente iguales) con respecto a una o más propiedades fisiológicas selectivas. La frase "propiedad fisiológica igual" en este contexto se refiere a que la propiedad fisiológico seleccionada es lo suficientemente similar entre los elementos en la colección o panel para que la colección o panel de células puedan dar resultados confiables en los ensayos de tamizaje para medicamentos; por ejemplo, las variaciones en lecturas 25 en un ensayo de tamizaje para medicamentos se deberán, por ejemplo, a las diferentes actividades biológicas de los compuestos de prueba en células que expresan diferentes formas de NaV, más que a variaciones inherentes a las células. Por ejemplo, las células o líneas celulares se pueden emparejar para que tengan la misma velocidad e proliferación, es decir, índices de proliferación con no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco horas de diferencia entre los elementos de la colección o panel de células. Esto se puede lograr, por ejemplo, células ordenadas (binning) por 30 su velocidad de proliferación en cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez grupos y formando un panel con células a partir de este grupo ordenado (binned). Los métodos para determinar la velocidad o índice de proliferación celular son muy conocidos en la técnica. Las células o líneas celulares en un panel también se pueden emparejar para que tengan el mismo factor Z' (por ejemplo, factores Z' que no sean diferentes por más de 0.1), el nivel de expresión de NaV (por ejemplo, niveles de expresión de NaV que no se distingan por más de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% o 30%), 35 adherencia a las superficies del cultivo de tejido. Las células y líneas celulares emparejadas pueden proliferar en condiciones idénticas, que se logran, por ejemplo, por procesamiento paralelo automatizado, para mantener la propiedad fisiológica seleccionada.

Los paneles de células emparejadas de la invención se pueden usar, por ejemplo, para identificar moduladores con 40 actividad definida (por ejemplo, agonista o antagonista) en un NaV; para generar el perfil de actividad del compuesto frente a diferentes formas de NaV; para identificar moduladores activos en solo una forma de NaV; y para identificar moduladores activos sobre un solo subconjunto de NaV. Los paneles celulares emparejados de la invención permiten tamizaje de alta productividad. Los tamizajes que se utilizan que consumen meses para realizarse ahora se puede llevar a cabo en semanas. 45

Para obtener las células y líneas celulares de la invención, uno puede usar, por ejemplo, la tecnología descrita en la Patente de los Estados Unidos Núm. y en 6,692,965 y WO/2005/079462. Esta tecnología permite la evaluación en tiempo real de millones de células y de cualquier número de clones que se desee (desde cientos hasta miles de clones). Mediante técnicas de separación celular, como la citometría de flujo (por ejemplo, con un aparato FACS) o 50 separación celular magnética (por ejemplo, con un aparato MACS), se deposita en un frasco de cultivo y de manera automática una célula por pocillo con alta confianza estadística (por ejemplo, en una placa de cultivo de 96 pocillos). La velocidad y automatización de la tecnología permite aislar con facilidad líneas celulares recombinantes multigénicas.

55

Utilizando la tecnología, la secuencia de ARN para cada subunidad NaV, se puede detectar mediante una sonda de señalización, también conocida como faro molecular o sonda fluorogénica. En algunas realizaciones, el vector que contiene la secuencia codificante de la subunidad NaV tiene una secuencia adicional que codifica una secuencia etiqueta ARN. La "secuencia etiqueta" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es un ARN expresado o una fracción de un ARN que se va a detectar mediante una sonda de señalización. Las sondas de señalización pueden 60 detectar una variedad de secuencias ARN, de las cuales cualquiera se puede utilizar como etiqueta, incluidas aquellas que codifican etiquetas peptídicas y proteicas descritas en lo anterior. Las sondas de señalización se pueden dirigir a la etiqueta al diseñar las sondas para que incluyan una fracción que sea complementaria a la secuencia de la etiqueta. La secuencia etiqueta puede ser un región sin traducir 3' del plásmido que se transcribe simultáneamente con un transcrito NaV y comprende una secuencia objetivo para la unión de la sonda de 65 señalización. La secuencia etiqueta puede estar en el marco de lectura con la fracción codificante para la proteína

del mensaje del gen o fuera del marco de lectura respecto a éste, dependiendo de si se quiere etiquetar la proteína producida. Así, la secuencia etiqueta no tiene que ser traducida para la detección por la sonda de señalización. Las secuencias etiqueta pueden comprender varias secuencias blanco u objetivo que sean iguales o diferentes, en donde una sonda de señalización se hibrida a cada secuencia objetivo. La secuencia etiqueta puede estar ubicada dentro del ARN que codifica el gen de interés o bien, la secuencia etiqueta puede estar ubicada dentro de una región 5 5'- o 3'-no traducida. Las secuencias etiqueta pueden ser un ARN que tenga estructura secundaria. La estructura puede ser una estructura de tres ramas. En algunas realizaciones, la sonda de señalización detecta una secuencia dentro de la secuencia que codifica la subunidad NaV.

Ácidos nucleicos que comprendan una secuencia que codifica una subunidad NaV, opcionalmente una secuencia 10 que codifique para una secuencia etiqueta y como opción un ácido nucleico que codifique para un marcador seleccionable, se pueden introducir en las células huésped seleccionadas utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Los métodos incluyen transfección, incorporación viral, inserción mediada por proteína o péptido, métodos de coprecipitación, reactantes de incorporación de lípidos (lipofección), citofección, incorporación de lipopoliamina, rectantes de incorporación de dendrímeros, electroporación o incorporación mecánica. Ejemplos de reactantes de 15 transfección son: GenePORTER, GenePORTER2, LipofectaminA, LipofectaminA 2000, OligofectaminA, Transfast, Transfectam, GeneSHUTTLE, Trojene, GeneSilencer, X-tremeGENE, PerFectinA, CItofectinA, siPORT, UniFECTOR, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, siFECTOR, TransIT-LT1, TransIT-LT2, TransIT-Express, iFECT, RNAi Shuttle, MetafectenO, LyoVec, LipoTAXI, GeneEraser, GeneJuice, CytoPure, JetSI, JetPEI, Megafectin, Polyfect, TransMessanger, RNAiFect, SuperFect, Effectene, Tf-PEI-Kit, CLONfectinA y MetafectinA. 20

Después de la transfección de los constructos de ADN en las células y la posterior selección frente a medicamentos (si es el caso) o después de la activación génica según se describe en lo anterior, se pueden introducir en las células faros moleculares (por ejemplo, sondas fluorogénicas) cada uno de los cuales se direcciona a una secuencia etiqueta diferente y marcada diferencialmente y para aislar las células positivas por sus señales se utiliza la 25 separación celular por citometría de flujo (se pueden realizar varias corridas de separación). En una realización, la separación celular por citometría de flujo es un aparato FACS. También se puede utilizar la técnica MACS (separación celular magnética) o ablación láser de células negativas mediante análisis y procesamiento habilitado con láser. También se pueden emplear otros lectores de placa de fluorescencia, incluidos aquellos que son compatibles con el tamizaje de alta productividad. Las células positivas a la señal han captado y posiblmente 30 integrado en sus genomas al menos una copia de la secuencia o secuencias NaV introducidas. Se identifican las células introducidas con una o más de las subunidades NaV. Como ejemplo, las secuencias de las subunidades NaV se pueden integrar a la célula en diferentes ubicaciones del genoma. El nivel de expresión de los genes introducidos que codifican las subunidades NaV puede variar con base en el número de copias o sitio de integración. Por otra parte, se pueden obtener células que comprendan una o más de las subunidades NaV, en donde uno o más 35 de los genes introducidos que codifican una subunidad NaV son epidermisómicos o resultan de la activación génica.

Las sondas de señalización útiles en esta invención son conocidas en la técnica y por lo general son oligonucleótidos que comprenden una secuencia complementaria a una secuencia blanco u objetivo y un sistema emisor de señal dispuesto de manera que no se emita la señal cuando la sonda no está unida a la secuencia 40 objetivo y se emita una señal cuando la sonda se una a la secuencia objetivo. Como ilustración no limitativa, la sonda de señalización puede comprender un fluoróforo y un inactivador ubicado en la sonda para que el inactivador y el fluoróforo entren en contacto en la sonda sin unir. Durante la unión entre la sonda y la secuencia objetivo, el inactivador y el fluoróforo se separan dando lugar a la emisión de la señal. La publicación internacional WO/2005/079462, por ejemplo, describe varias sondas de señalización que se pueden usar en la producción de las 45 células y líneas celulares de la presente. Los métodos descritos en lo anterior para introducir ácidos nucleicos a las células se pueden utilizar para introducir sondas de señalización.

Cuando se usan las secuencias etiqueta, el vector para cada subunidad NaV puede tener la misma secuencia etiqueta o una diferente. Sean las secuencias etiqueta iguales o diferentes, las sondas de señalización pueden tener 50 diferentes emisores de señal, por ejemplo, fluoróforos de diferentes colores de tal manera que la expresión de cada subunidad se puede detectar por separado. Como ilustración, la sonda de señalización que detecta específicamente el ARNm de la subunidad alfa NaV puede comprender un fluoróforo rojo, la sonda que detecta la primera subunidad beta NaV puede contener un fluoróforo verde y la sonda que detecta la segunda subunidad beta NaV puede contener un fluoróforo azul. Los expertos en la técnica se percatarán de que existen otros medios para detectar de 55 manera diferencial la expresión de las tres subunidades con una sonda de señalización en una célula triplemente transfectada.

En una realización, las sondas de señalización se diseñan para que sean complementaria a una fracción del ARN que codifica una subunidad NaV o a fracciones de sus regiones 5' o 3' sin traducir. Incluso, si la sonda de 60 señalización diseñada para reconocer un ARN mensajero de interés, es capaz de detectar secuencias objetivo expresadas en forma endógena ficticia, la proporción éstas en comparación con la proporción de la secuencia de interés producida por células transfectadas es tal que la separación es apta para discriminar los dos tipos de células.

El nivel de expresión de una subunidad NaV introducida puede variar de línea celular a línea celular. El nivel de 65 expresión en una línea celular también puede disminuir a través del tiempo debido a eventos epigenéticos como la

mutilación del ADN y el silenciamiento génico y pesada de copias transgénicas. Estas variaciones se pueden atribuir a una diversidad de factores, por ejemplo, el número de copia del transgén captado por la célula, el sitio de la integración genómica del transgén y la integridad del transgén después de la integración genómica. Uno puede usar FACS para evaluar los niveles de expresión. Las células que expresen una subunidad NaV introducida a los niveles deseados, se pueden aislar, por ejemplo, por FACS. Las sondas de señalización también se pueden volver a aplicar 5 a células o líneas celulares generadas previamente, por ejemplo, para determinar si las células todavía son positivas y a qué grado, para uno o más de los ARN para los cuales se aislaron originalmente.

Una vez que las células que expresan las tres subunidades NaV se aíslan, se pueden cultivar durante un periodo de tiempo suficiente para identificar aquellas que expresan en forma estable todas las subunidades deseadas. En otra 10 realización de la invención, las células adherentes se pueden adaptar a la suspensión antes o después de la separación celular y aislar células solas. En otras realizaciones, las células aisladas se pueden proliferar en forma individual o mezcladas para generar poblaciones de células. Las líneas celulares también se pueden hacer proliferar en forma individual o mezcladas. Si se produce una mezcla de líneas celulares con una actividad deseada o una propiedades deseada, ésta se puede fraccionar después hasta que se identifique la línea celular o grupo de líneas 15 celulares que tenga este efecto. La mezcla de células o líneas celulares puede facilitar el mantenimiento de gran número de líneas celulares sin la necesidad de mantenerlas cada una por separado. Así, una mezcla de células o líneas celulares se puede enriquecer en cuanto a células positivas. Una mezcla enriquecida puede tener al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o 100% de células positivas frente a la propiedad o actividad deseada. 20

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir las células y líneas celulares de la invención como se define en la reivindicación 8.

Según el método, las células se cultivan bajo un conjunto de condiciones de cultivo deseadas. Las condiciones 25 pueden ser cualquier condición deseada. Los expertos en la técnica sabrán qué parámetros están comprendidos dentro un conjunto de condiciones de cultivo. Por ejemplo, las condiciones de cultivo incluyen, entre otras: el medio (medio base (DMEM, MEM, RPMI, libre de suero, con suero, plenamente definido químicamente, sin componentes de origen animal), concentración de iones mono y divalentes (sodio, potasio, calcio, magnesio), componentes adicionales añadidos (aminoácidos, antibióticos, glutamina, glucosa u otras fuentes de carbono, HEPES, 30 bloqueadores de canal, moduladores de otros blancos, vitaminas, microelementos, metales pesados, cofactores, factores de crecimiento, reactantes antiapoptosis), medio tal cual o acondicionado, con HEPES, pH, carente de ciertos nutrientes o limitado (aminoácidos, fuente de carbono)), nivel de confluencia al que se permite a las células llegar antes de corte-empalme/subcultivo, capas alimentadoras de células o células irradiada con rayos gamma, CO2, sistema de tres gases (oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono), humedad, temperatura, en reposo o en un 35 agitador, las cuales son muy conocidas para los expertos en la técnica.

Las condiciones de cultivo celular se pueden elegir por conveniencia dado un uso particular deseado para las células. En forma ventajosa, la invención proporciona células y líneas celulares que están preparadas en forma óptima para un uso particular deseado. Es decir, en realizaciones de la invención en los que las células se cultivan 40 en condiciones para un uso deseado particular, las células se seleccionan en función de que tengan las características deseadas en la condición para el uso deseado. Como ilustración, si las células se utilizan en ensayos en placas en donde es conveniente que las células sean adherentes, se pueden seleccionar las células que muestran adherencia en las condiciones del ensayo. Del mismo modo, si las células se van a utilizar para la producción de proteínas, las células se pueden cultivar en condiciones apropiadas para la producción de proteínas y 45 seleccionarse respecto a propiedades ventajosas para este uso.

En algunas realizaciones, el método comprende el paso adicional de medir los índices de proliferación de los cultivos celulares individuales. Los índices de proliferación se pueden determinar mediante alguno entre una variedad de técnicas que serán muy conocidas para los expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen, entre otras, medición de 50 ATP, confluencia celular, dispersión luminosa, densidad óptica (por ejemplo, DO 260 para ADN). De preferencia, los índices de proliferación se determinan con medios que reduzcan al mínimo la cantidad de tiempo que consumen los cultivos fuera de las condiciones de cultivo seleccionadas.

En algunas realizaciones, se mide la confluencia celular y se calculan los índices de proliferación celular a partir de 55 los valores de confluencia. En algunas realizaciones, las células se dispersan y los aglomerados se eliminan antes de medir la confluencia celular para obtener mayor exactitud. Los medios para las células monodispersantes son muy conocidos y se pueden obtener, por ejemplo, mediante la adición de un reactante dispersante a un cultivo que se va a medir. Los agentes dispersantes son muy conocidos y de fácil disponibilidad e incluyen, entre otros, agentes dispersantes enzimáticos, como tripsina y agentes dispersantes con base en EDTA. Los índices de proliferación se 60 pueden calcular a partir de datos de confluencia mediante un software comercial para el fin, por ejemplo, HAMILTON VECTOR. La medición de confluencia automatizada, por ejemplo, la que utiliza un lector de placa microscópico automatizado, es en particular muy útil. Los lectores de placa que miden la confluencia están disponibles en el mercado e incluyen, entre otros, el CLONE SELECT IMAGER (Genetix). Por lo general, se hacen al menos 2 mediciones de confluencia celular antes de calcular un índice de proliferación. El número de valores de confluencia 65 utilizados para determinar el índice de proliferación puede ser cualquier número que sea conveniente o adecuado

para el cultivo. Por ejemplo, la confluencia se puede medir varias veces durante, por ejemplo, una semana, 2 semanas, 3 semanas o cualquier periodo de tiempo y a cualquier frecuencia deseada.

Cuando se conocen los índices de proliferación, según el método, la pluralidad de cultivos celulares individuales se dividen en grupos por similitud entre los índices de proliferación. Al agrupar los cultivos en compartimientos por 5 índice de proliferación, se pueden manipular juntos los cultivos en el grupo, obteniendo con ello otro nivel de normalización que reduce la variación entre cultivos. Por ejemplo, los cultivos en un compartimiento se pueden subcultivar al mismo tiempo, tratarse con un reactante dado al mismo tiempo, etc. Por otra parte, los resultados de ensayos funcionales, por lo general, dependen de la densidad celular en un pocillo de ensayo. Una comparación real de clones individuales solo se lleva a cabo al tenerlos depositados y evaluados a la misma densidad. Al agrupar en 10 cohortes con índice de proliferación específico se facilita el depósito de clones a una densidad específica que permite que se les caracterice por su funcionalidad en un formato de alta productividad.

El intervalo de índices de proliferación en cada grupo puede ser cualquier intervalo conveniente. Es en particular conveniente seleccionar un intervalo de índices de proliferación que permita a las células subcultivarse al mismo 15 tiempo y evitar la renormalización frecuente de números de células. Los grupos de índice de proliferación pueden incluir un intervalo muy estrecho para un agrupamiento compacto, por ejemplo, un promedio de tiempos suplicados en lapsos de una hora entre sí. Pero según el método, el intervalo puede ser hasta de 2 horas, hasta de 3 horas, hasta de 4 horas, hasta de 5 horas o hasta de 10 horas entre sí o incluso intervalos más amplios. La necesidad de renormalización surge cuando los índices de proliferación en un compartimiento no son iguales de manera que el 20 número de células en algunos cultivos aumenta más rápido que en otros. Para mantener condiciones prácticamente idénticas para todos los cultivos en un compartimiento, es necesario eliminar células en forma periódica para renormalizar los números en el compartimiento. Mientras más divergentes son los índices de proliferación, la necesidad de renormalización es más frecuente.

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Las células y líneas celulares se pueden evaluar y seleccionar respecto a cualquier propiedad fisiológica que incluye: un cambio en un proceso celular codificado por el genoma; un cambio en un proceso celular regulado por el genoma; un cambio en un patrón de actividad cromosómica; un cambio en un patrón de silenciamiento cromosómico; un cambio en un patrón de silenciamiento génico; un cambio en un patrón o en la eficiencia de la activación génica; un cambio en un patrón o en la eficiencia de la expresión génica; un cambio en un patrón o en la 30 eficiencia de la expresión de ARN; un cambio en un patrón o en la eficiencia de la expresión de ARNi; un cambio en un patrón o en la eficiencia de procesamiento de ARN; un cambio en un patrón o en la eficiencia del transporte de ARN; un cambio en un patrón o en la eficiencia de la traducción de proteína; un cambio en un patrón o en la eficiencia del plegamiento de proteína; un cambio en un patrón o en la eficiencia del ensamblado de proteína; un cambio en un patrón o en la eficiencia de la modificación de proteína; un cambio en un patrón o en la eficiencia del 35 transporte de proteína; un cambio en un patrón o en la eficiencia de transportar una proteína de membrana a una superficie celular; un cambio en el índice de proliferación; un cambio en el tamaño de la célula; un cambio en la forma de la célula; un cambio en la morfología de la célula; un cambio en el contenido de ARN en %; un cambio en contenido de proteína en %; un cambio en contenido de agua en %; un cambio contenido de lípidos en %; un cambio contenido ribosómico; un cambio en contenido mitocondrial; un cambio masa ER; un cambio en el área superficial de 40 la membrana plasmática; un cambio volumen celular; un cambio composición lipídica de la membrana plasmática; un cambio composición lipídica de la envoltura nuclear; un cambio composición proteica de la membrana plasmática; un cambio en la proteína; composición de la envoltura nuclear; un cambio en el número de vesículas secretoras; un cambio en el número de lisosomas; un cambio en el número de vacuolas; un cambio en la capacidad o potencial de una célula para: producción de proteína, secreción de proteína, plegamiento de la proteína, ensamblado de 45 proteínas, modificación de la proteína, modificación enzimática de la proteína, glucosilación de la proteína, fosforilación de la proteína, defosforilación de la proteína, biosíntesis de metabolitos, biosíntesis de lípidos, síntesis de ADN, síntesis de ARN, síntesis de proteínas, absorción de nutrientes, proliferación celular, mitosis, meiosis, división celular, para desdiferenciarse, para transformación en una célula precursora, para transformación en células pluripotentes, para transformación en una célula omnipotente, para transformación en una célula tipo precursora en 50 cualquier órgano (por ejemplo, hígado, pulmón, piel, músculo, páncreas, cerebro, testículos, ovario, sangre, sistema inmune, sistema nervioso, huesos, sistema cardiovascular, sistema nervioso central, tracto gastrointestinal, estómago, tiroides, lengua, vesícula biliar, riñón, nariz, ojo, uñas, pelo, papilas gustativas), para transformación en cualquier tipo de célula diferenciada (por ejemplo, de músculo, de músculo cardiaco, neurona, piel, pancreática, de sangre, inmune, eritrocito, leucocito, célula T asesina, célula enteroendocrina, célula de papila gustativa, célula 55 secretora, célula de riñón, célula epitelial, célula endotelial, también se incluye cualquiera de los tipos de células animales o humanas ya enlistadas que se puedan utilizar para la introducción de secuencias de ácido nucleico), para captar ADN, para captar moléculas pequeñas, para captar sondas fluorogénicas, para captar ARN, para adherirse a superficie sólida, para adaptarse a condiciones en las que no hay suero, para adaptarse a condiciones en suspensión libre de suero, para adaptarse a cultivo celular incrementado, para usarse en el cultivo celular a gran 60 escala, para usarse en el descubrimiento de medicamentos, para usarse en tamizaje de alta productividad, para usarse en un ensayo celular funcional, para usarse en ensayos de potencial de membrana, para usarse en ensayos con células reporteras, para usarse en estudios ELISA, para usarse en ensayos in vitro, para usarse en aplicaciones in vivo, para usarse en análisis secundario, para usarse en evaluación de compuestos, para usarse en ensayo de unión, para usarse en ensayos panorámicos, para usarse en un ensayo panorámico de anticuerpos, para usarse en 65 ensayos de imagen, para usarse en ensayos de imagen microscópicos, para usarse en placas multipocillos, para

adaptación a cultivos celulares automatizados, para adaptación a cultivos celulares automatizados miniaturizados, para adaptación a cultivos celulares a gran escala automatizados, para adaptación a cultivos celulares en placas multipocillos (6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o densidad mayor), para usarse chips celulares, para usarse en portaobjetos, para usarse portaobjetos de vidrio, para micromatrices en portaobjetos o portaobjetos de vidrio, para usarse en producción de biológicos y usarse en la producción de reactantes para investigación. 5

Las pruebas que se pueden usar para caracterizar las células y líneas celulares de la invención y/o paneles emparejados de la invención incluyen, entre otras: análisis de aminoácidos, secuenciación de ADN, secuenciación de proteínas, NMR, prueba para el transporte de proteínas, prueba para el transporte nucelocitoplásmico, prueba para localización subcelular de proteínas, prueba para localización subcelular de ácidos nucleicos, análisis 10 microscópico, análisis submicroscópico, microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica, microscopía confocal, tecnología de ablación con láser, cuenta celular y diálisis. El experto sabría como utilizar cualquiera de las pruebas mencionadas en lo anterior.

Según el método, las células se pueden cultivar en cualquier formato de cultivo celular siempre que las células o 15 líneas celulares se dispersen en cultivos individuales antes de realizar el paso de medición de los índices de proliferación. Por ejemplo, por conveniencia, las células inicialmente se pueden combinar para el cultivo en las condiciones deseadas y luego separar células individuales para depositar una célula por pocillo o depósito. Las células se pueden cultivar en placas de cultivo de tejidos de pocillos múltiples. Estas placas se encuentran con facilidad en el comercio y son muy conocidas para el experto en la técnica. En algunos casos, las células, de 20 preferencia, se pueden cultivar en viales o en cualquier otro formato conveniente, los diversos formatos son muy conocidos para el experto en la técnica y fácilmente se encuentran en el comercio.

En realizaciones que incluyen el paso que consiste en medir el índice de proliferación, antes de medir los índices de proliferación, las células se cultivan durante un periodo de tiempo suficientemente largo para que se aclimaten a las 25 condiciones de cultivo. Como se percatará el experto, la cantidad de tiempo variará dependiendo de varios factores como el tipo de célula, las condiciones elegidas, el formato de cultivo y puede ser cualquier cantidad de tiempo, desde un día hasta unos cuantos días, una semana o más.

De preferencia, cada cultivo individual en la piad de cultivos celulares individuales se mantiene en condiciones 30 prácticamente idénticas según lo que se expone adelante y que incluye un esquema de mantenimiento normalizado. Otra particularidad conveniente del método es que se puede mantener al mismo tiempo un número grande de cultivos individuales, de tal manera que una célula con un determinado conjunto de atributos se puede identificar incluso si fuera muy escasa. Por estas y otras razones, de conformidad con la invención, la pluralidad de cultivos celulares individuales se cultivan por medio métodos de cultivo celular automatizado así que las condiciones son 35 prácticamente idénticas para cada pocillo. El cultivo celular automatizado previene la inevitable variabilidad inherente al cultivo celular manual.

Se puede usar cualquier sistema de cultivo celular en el método de la invención. En el comercio se encuentran disponibles varios sistemas de cultivo celular automatizado y serán muy conocidos para el técnico experimentado. 40 En algunas realizaciones, el sistema automatizado es un sistema robótico. De preferencia, el sistema incluye canales que se mueven de manera independiente, un cabezal de canales múltiples (por ejemplo, un cabezal de 96 puntas) y un brazo con abrazadera o grúa y un dispositivo de filtración HEPA para mantener la esterilidad durante el procedimiento. El número de canales en la pipeta debe ser el adecuado para el formato del cultivo. Las pipetas adecuadas tienen, por ejemplo, 96 o 384 canales. Estos sistemas son conocidos y se encuentran disponibles en el 45 comercio. Por ejemplo, se puede usar un instrumento MICROLAB STAR™ (Hamilton) en el método de la invención. El sistema automatizado debe ser capaz de realizar una variedad de operaciones de cultivo celular. Estas operaciones son conocidas para el experto en la técnica. Éstas incluyen, entre otras: eliminar el medio, reemplazar el medio, adicionar reactantes, lavado celular, eliminar la solución de lavado, adicionar agente dispersante, eliminar células del frasco de cultivo, adicionar células a un frasco de cultivo y lo similar. 50

La producción de una célula o línea celular de la invención puede incluir cualquier número de cultivos celulares individuales. Sin embargo, las ventajas proporcionadas por el método aumentan a medida que aumenta el número de células. No existe un límite teórico superior para el número de células o de cultivos celulares individuales que se pueda utilizar en el método. Según la invención, el número de cultivos celulares individuales puede ser de dos o más 55 pero tiene más ventajas que sea al menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más cultivos celulares individuales, por ejemplo, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 48, al menos 50, al menos 75, al menos 96, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 384, al menos 400, al menos 500, al menos 1000, al menos 10,000, al menos 100,000, al menos 500,000 o más. 60

La facilidad para aislar y volver a aislar a partir de una población de células mixta aquellas células que tienen las propiedades deseadas (por ejemplo, que expresen los ARN deseados a los niveles apropiados) hace posible mantener líneas celulares a una presión de selección con medicamentos mínima o nula. La presión de selección se aplica en un cultivo celular para seleccionar células con secuencias o atributos deseados y por lo general se logra 65 ligando la expresión de un polipéptido de interés con la expresión de un marcador de selección que imparta a las

células resistencia a un correspondiente agente o presión selectiva. La selección con antibióticos incluye, entre otros, el uso de antibióticos (por ejemplo, puromicina, neomicina, G418, higromicina, bleomicina). La selección no antibiótica incluye, entre otros, el uso de carencia de nutrientes, exposición a temperaturas selectivas, exposición a condiciones mutagénicas y expresión de marcadores fluorescentes en donde el marcador de selección puede ser, por ejemplo, glutamina sintetasa, dihidrofolato reductasa (DHFR), oabaína, timidina cinasa (TK), hipoxantin guanina 5 fosfororribosiltransferasa (HGPRT) o una proteína fluorescente como GFP. En los aspectos inmediatos de la invención, ninguno de estos pasos de selección se aplican a las células en cultivo. En algunas realizaciones preferidas, las células y líneas celulares de la invención, se mantienen en cultivo sin ninguna presión selectiva. En otras realizaciones, las células y líneas celulares se mantienen sin ningún antibiótico. En el sentido que se utiliza en la presente, el mantenimiento de las células se refiere a cultivar las células después de que se han seleccionado par 10 su expresión de NaV, por ejemplo, a través de separación celular. El mantenimiento no se refiere al paso opcional de desarrollar las células en un medicamento selectivo (por ejemplo, un antibiótico) antes de la clasificación celular en donde el o los marcadores de resistencia a medicamentos introducido a las células permite el enriquecimiento de transfectantes estables en una población mixta.

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El mantenimiento de las células sin medicamento tiene varias ventajas. Por ejemplo, las células resistentes a medicamentos no siempre expresan el transgén cotransfectado de interés a los niveles adecuados, porque la selección se basa en la supervivencia de las células que han captado el gen resistente al medicamento, con o sin el transgén. Por otra parte, los medicamentos selectivos con frecuencia son mutagénicos o interfieren de algún otro modo con la fisiología de las células, lo que conduce a resultados sesgados en los ensayos celulares. Por ejemplo, 20 los medicamentos selectivos pueden disminuir la susceptibilidad a la apoptosis (Robinson et al., Biochemistry, 36(37): 1169-11178 (1997)), aumentar la reparación de ADN y el metabolismo del medicamento (Deffie et al., Cancer Res. 48(13): 3595-3602 (1988)), aumentar el pH celular (Thiebaut et al., J Histochem Cytochem. 38(5): 685-690 (1990); Roepe et al., Biochemistry. 32(41): 1042-11056 (1993); Simon et al., Proc Natl Acad Sci USA. 91(3): 1128-1132 (1994)), disminuir el pH lisosómico y endosómico (Schindler et al., Biochemistry. 35(9): 2811-2817 25 (1996); Altan et al., J Exp Med. 187(10): 1583-1598 (1998)), disminuir el potencial de la membrana plasmática (Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993)), aumentar la conductancia de la membrana plasmática al cloruro (Gill et al., Cell. 71(1):23-32 (1992)) and ATP (Abraham et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90(1):312-316 (1993)) y aumentar las velocidades del transporte vesicular (Altan et al., Proc Natl Acad Sci USA. 96(8): 4432-4437 (1999)). La GFP que es un marcador selectivo no antibiótico de uso común puede provocar la muerte celular en ciertas 30 líneas celulares (Hanazono et al., Hum Gene Ther. 8(11): 1313-1319 (1997)). Así, las células y líneas celulares de esta invención permiten ensayos de tamizaje que están libres de cualquier artefacto ocasionado por los medicamentos o marcadores selectivos. En algunas realizaciones preferidas, las células no se cultivan con medicamentos selectivos como los antibióticos antes o después de la separación celular, de manera que las células con las propiedades deseadas se aíslan por separación incluso sin comenzar con una población celular enriquecida. 35

En el presente documento también se desvelan métodos para usar las células y líneas celulares de la invención. Las células o líneas celulares de la invención se pueden usar en cualquier aplicación para la cual se requiera una o varias subunidades funcionales NaV o el canal iónico NaV completo. Las células y líneas celulares se pueden usar, por ejemplo, en un ensayo celular in vitro o en un ensayo celular in vivo en el que las células se implanten en un 40 animal (por ejemplo, un mamífero no humano) para, por ejemplo, tamizar moduladores de NaV; producir proteína para estudios de cristalografía y unión; e investigar selectividad y dosificación de un compuesto, cinética y estabilidad de unión de un compuesto y su receptor y efectos de la expresión del receptor en la fisiología celular (por ejemplo, electrofsiología, tráfico de pinas, plegamiento de proteínas y regulación de proteínas). Las células y líneas celulares de la presente también se pueden usar en estudios de silenciamiento para investigar las funciones de 45 subunidades NaV específicas.

Las líneas celulares que expresan varias combinaciones de subunidades alfa y beta (por ejemplo, heterotrímeros naturales o heterotrímeros que no se encuentran de manera natural) se pueden usar juntas o separadas como una colección para identificar moduladores de NaV, incluidos los específicos para una NaV particular, una subunidad de 50 un NaV particular o una combinación particular de subunidades NaV y para obtener información acerca de las actividades de subunidades individuales. La invención también proporciona métodos para usar moduladores específicos para formas modificadas particulares; esta información puede ser útil para determinar si el NaV tiene formas modificadas que se encuentran en forma natural. Utilizar las células y líneas celulares de la presente puede ayudar a determinar si las diferentes formas de NaV participan en diferentes patologías relacionadas con el NaV y 55 permiten la selección de moduladores NaV específicos para la enfermedad o e tejido para tratamiento muy dirigido de patologías relacionadas con el NaV.

En el sentido que se utiliza en la presente, un "modulador" incluye cualquier sustancia o compuesto que tenga una actividad moduladora con respecto a por lo menos una subunidad NaV. El modulador puede ser un agonista de NaV 60 (potenciador o activador) o un antagonistas (inhibidor o bloqueador), incluidos los agonistas o antagonistas parciales, agonistas o antagonistas selectivos y agonistas inversos y puede ser un modulador alostérico. Una sustancia o compuesto es un modulador incluso si su actividad moduladora cambia en función de diferentes condiciones o concentraciones. En algunos aspectos de la invención, el modulador altera la selectividad de un canal iónico. Por ejemplo, un modulador puede afectar qué iones son aptos para pasar a través de un canal iónico. 65

Para identificar un modulador de NaV, uno puede exponer una línea celular de la invención a un compuesto de prueba en condiciones en las que se esperaría que el NaV sea funcional y detecte un cambio estadísticamente significativo (por ejemplo, p < 0.05) en la actividad del NaV en comparación con un control adecuado, por ejemplo, células de la línea celular que no está en contacto con el compuesto de prueba. Como alternativa o de manera adicional, se pueden usar controles positivos y/o negativos utilizando agonistas o antagonistas conocidos, células 5 que expresen diferentes combinaciones de subunidades NaV. En algunas realizaciones, la actividad del NaV que se detecta y/o se mide es la despolarización de membrana, el cambio en el potencial de membrana o la fluorescencia que resulta de estos cambios en la membrana.

En algunas realizaciones, se exponen una o más líneas celulares de la invención a una pluralidad de compuestos de 10 prueba, por ejemplo, una biblioteca de compuestos de prueba. Una biblioteca de compuestos de prueba se puede tamizar mediante el uso de las líneas celulares de la invención para identificar uno o más moduladores. Los compuestos de prueba pueden ser entidades químicas que incluyen moléculas pequeñas, polipéptidos, péptidos, pseudopéptidos, anticuerpos o sus fracciones de unión al antígeno. En el caso de anticuerpos, éstos pueden ser anticuerpos no humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos totalmente humanos. Los 15 anticuerpos pueden ser anticuerpos intactos que comprenden todo el complemento de cadenas pesada y ligera o fracciones de unión al antígeno, incluidos los fragmentos de anticuerpos (como Fab y Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, dAb), anticuerpos de una sola subunidad (scFv), anticuerpos de dominio simple, toda o una fracción de unión al antígeno de una cadena pesada o ligera.

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En el presente documento también se desvelan, en algunas realizaciones, antes de la exposición a un compuesto de prueba, las células se pueden modificar mediante pretratamiento, por ejemplo, con enzimas, incluidas las enzimas provenientes de mamífero o de otros animales, enzimas vegetales, enzimas bacterianas, enzimas que modifican proteínas y enzimas que modifican lípidos y enzimáticas de la cavidad bucal, el tracto gastrointestinal, el estómago o la saliva. Estas enzimas pueden incluir, por ejemplo, cinasas, proteasas, fosfatasas, glicosidasas, oxidorreductasas, 25 transferasss, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células se someten a pretratamiento con al menos una enzima proteolítica como tripsina o furina. Como alternativa, las células se pueden exponer primero al compuesto de prueba y después a tratamiento para identificar compuestos que alteren la modificación del NaV por el tratamiento.

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En el presente documento también se desvela, se evalúan grandes colecciones de compuestos respecto a la actividad moduladora de NaV en un prueba de tamizaje celular de alta productividad (HTS - high-throughput screen), funcional, por ejemplo, utilizando un formato de pocillos de 96, 384, 1536 o mayor densidad. Los aciertos a partir del tamizaje HTS se pueden evaluar después en ensayos adicionales para confirmar la función, por ejemplo, ensayos de determinación de sus estructuras químicas, evaluación de compuestos con estructuras relacionadas para 35 optimizar la actividad y la especificidad y posterior evaluación en modelos animales. En el presente documento también se desvela, el potencial terapéutico de los moduladores se prueba en modelos animales para evaluar su utilidad en el tratamiento de enfermedades y padecimientos humanos, incluyendo epilepsia, parálisis periódica, cardiopatías, enfermedades del sistema nervioso central, ataxia y dolor (crónico o agudo), pérdida de la capacidad para sentir dolor. Como ejemplo, una línea celular de la invención que expresa NaV 1.7, se puede usar para 40 identificar un antagonista de NaV 1.7 para utilizarlo como un analgésico y reducir o eliminar dolor.

Estas y otras realizaciones de la invención se pueden ilustrar también en lo siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos 45

Ejemplo 1 Generar una línea celular que expresa un heterotrímero NaV 1.7 estable

Generar constructos de expresión

50

Se generaron vectores de expresión plásmidos que permiten clonación streamlined, con base en pCMV-SCRIPT (Stratagene) y con varios componentes necesarios para transcripción y traducción de un gen de interés. Promotores eucariotas CMV y SV40; secuencias de poliadenilación SV40 y HSV-TK; múltiples sitios de clonación; secuencias Kozak; y casetes de respuesta a neomicina/kanamicina (o casetes de resistencia a ampicilina, higromicina, puromicina, zeocina). 55

Generación de líneas celulares

Se cotransfectaron células 293T con tres plásmidos individuales, uno que codifica para una subunidad NaV 1.7 a (SEQ ID NO: 13), otro que codifica para una NaV 1.7 β1 humana (SEQ ID NO: 16), y otro que codifica para una NaV 60 1.7 β2 humana (SEQ ID NO: 17)), por medio de las técnicas estándar. (Ejemplos de reactantes que se pueden usar para introducir ácidos nucleicos a las células huésped incluyen, entre otros, LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, reactantes TFX™, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, Metafectine o FECTURIN™.).

65

Aunque la selección de medicamentos es opcional para producir las células o líneas celulares de la invención,

incluimos un marcador de resistencia a medicamento por plásmido. Las secuencias se sometieron al control del promotor CMV. Una secuencia sin traducir que codifica una secuencia objetivo o blanco para la detección por sonda de señalización también estuvo presente junto con la secuencia que codifica para el marcador de respuesta a medicamentos. Las secuencias blanco utilizadas fueron la secuencia blanco 1 (SEQ ID NO: 1), secuencia blanco 2 (SEQ ID NO: 2), y secuencia blanco 3 (SEQ ID NO: 3). En este ejemplo, el vector que contiene el gen de la 5 subunidad NaV 1.7 α comprende la secuencia blanco 1 (SEQ ID NO: 1); el vector que contiene el gen de la subunidad NaV 1.7 β1 comprende la secuencia blanco 2 (SEQ ID NO: 2); y el vector que contiene el gen de la subunidad NaV 1.7 β2 comprende la secuencia blanco 3 (SEQ ID NO: 3).

Las células transfectadas se hicieron proliferar durante 2 días en medio DMEM-FBS, seguidos de 10 días en medio 10 DMEM-FBS con antibiótico. Durante el periodo con antibiótico, los antibióticos se adicionaron al medio en la forma siguiente: puromicina (0.1 μg/ml), higromicina (100 μg/ml) y zeocina (200 μg/ml).

Después del enriquecimiento en antibiótico, las células se subcultivaron 6 a 18 veces en ausencia de la selección de antibiótico para que hubiera tiempo para que la expresión que era estable durante el periodo de tiempo seleccionado 15 se asentara.

Las células se cosecharon y transfectaron con sondas de señalización (SEQ ID NOS: 4, 5, 34) mediante el uso de las técnicas estándar. (Ejemplos de reactantes que se pueden usar para introducir ácidos nucleicos a las células huésped incluyen, entre otros, LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, reactantes 20 TFX™, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, Metafectine o FECTURIN™.).

Sonda de señalización 1 (SEQ ID NO: 4), unida a secuencia blanco 1 (SEQ ID NO: 1); sonda de señalización 2 (SEQ ID NO: 5), unida a secuencia blanco 2 (SEQ ID NO: 2); y sonda de señalización 3 (SEQ ID NO: 34), unida a secuencia blanco 3 (SEQ ID NO: 3). Luego, las células se disociaron y se recolectaron para análisis y separación 25 utilizando un separador celular activado por fluorescencia.

Secuencias blanco detectadas por las sondas de señalización

Se utilizaron las siguientes secuencias etiqueta para los transgenes de la subunidad NaV 1.7. 30

Secuencia blanco 1

5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’ (SEQ ID NO: 1) (subunidad NaV 1.7 α)

Secuencia blanco 2

5’-GAAGTTAACCCTGTCgttctgcgac-3’ (SEQ ID NO: 2) (subunidad NaV 1.7 β1)) 35

Secuencia blanco 3

5’-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 3) (subunidad NaV 1.7 β2))

Sondas de señalización

40

Suministradas como reservas de 100 µM.

Sonda de señalización 1 - Esta sonda se une a la secuencia blanco 1.

5’ - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 quench -3’ (SEQ ID NO: 4)

Sonda de señalización 2 - Esta sonda se une a la secuencia blanco 2. 45

5’- Cy5.5 CGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 quench -3’ (SEQ ID NO: 5)

Sonda de señalización 3 - Esta sonda se une a la secuencia blanco 3.

5’- Fam CGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 quench -3’ (SEQ ID NO: 34)

BHQ3 en las sondas de señalización 1 y 2 se puede reemplazar con BHQ2 o una partícula de oro. BHQ1 en la 50 sonda de señalización 3 se puede reemplazar con BHQ2, una particular de oro o DABCYL.

Por otra parte, una sonda similar utilizando un colorante Quasar® Dye (BioSearch) con propiedades espectrales similares al Cy5 se usó en ciertos experimentos. En algunos experimentos, se usaron las sondas 5-MedC y 2-amino dA mixmer, en lugar de sondas de ADN. 55

Se utilizaron métodos analíticos estándar para células compuerta (gate cells) que fluorescen por arriba de la línea de fondo y aislar células que quedan dentro de la compuerta definida, directamente en las placas de 96 pocillos. La separación celular por citometría de flujo se manejó de manera que se depositara una sola célula por pocillo. Después de la selección, las células se expandieron en medio carente de medicamento. Se utilizó la siguiente 60 jerarquía de compuerta (gatting):

compuerta de coincidencia  compuerta singlets  compuerta live  compuerta sort en la gráfica FAM vs. Cy5: 0.1 – 1.0% de células vivas.

65

Los pasos anteriores se repitieron para obtener un mayor número de células. Por lo menos se completaron cuatro

rondas independientes de los pasos anteriores y para cada una de estas rondas, se realizaron al menos dos ciclos internos de subcultivo celular y aislamiento.

Las placas se transfirieron a un manejador de líquidos automatizado Microlabstar (Hamilton Robotics). Las células se incubaron durante 5 a 7 días en una mezcla 1:1 de medio de cultivo completo nuevo (DMEM/10% FBS) y 2 a 3 5 días con medio de cultivo acondicionado, suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 0.1mg/ml de estreptomicina. Luego, las células se dispersaron por tripsinización para reducir al mínimo los agregados y se transfirieron a placas de 96 pocillos. Después de que los clones se dispersaron, las placas se analizaron por imagen para determinar la confluencia de los pocillos (Genetix). Se enfocó cada placa para la adquisición de imágenes confiables en toda la placa. Confluencias reportadas mayores a 70% no contaron. Las mediciones de confluencia se 10 obtuvieron 3 veces al día durante 9 días (es decir, entre los días 1 y 10 posteriores a la dispersión) y se usaron para calcular los índices de proliferación.

Las células se ordenaron (se agruparon de manera independiente y se depositaron como cohorte) según el índice de proliferación entre 10 y 11 días después de la operación de dispersión en el paso 7. Los bins fueron recolectados 15 independientemente y depositados en placas de 96 pocillos individuales para el manejo descendente; algunos bins de proliferación resultaron en más de una placa de 96 pocillos. Los bins se calcularon considerando la dispersión de los índices de proliferación y englobando un alto porcentaje del número total de población de células. Dependiendo de la reiteración de separación descrita en el paso 5, se utilizaron entre 5 y 9 bins de proliferación con una partición de 1 a 4 días. Por lo tanto, cada bin corresponde a un índice de proliferación o un tiempo de duplicación de 20 población entre 8 y 14.4 horas dependido de la reiteración.

Las células pueden tener tiempos de duplicación de menos de 1 día a más de 2 semanas. Con el fin de procesar los clones más diversos que al mismo tiempo pueden ser razonablemente procesados (binned) según el índice de proliferación, es preferible usar de 3 a 9 bins con un tiempo de duplicación de 0.25 a 0.7 días por bin. El experto en 25 la técnica observará que la estrechez de los bins y el número de bins se puede ajustar para la situación particular y que la estrechez y número de bins se puede ajustar después si las células se sincronizan respecto a su ciclo celular.

Las placas se incubaron en condiciones estándar y fijas (humidificadas a 37ºC, 5%CO2) en medio DMEM-10%FBS sin antibiótico. Las placas de células se dividieron para obtener 4 juegos de placas blanco. Estos 4 juegos de placas 30 comprendían todas las placas con todos los bins de proliferación para garantizar que hubiera 4 réplicas del grupo inicial. Hasta 3 placas blanco fueron asignadas para crioconservación (descrita en el paso 10) y el juego restante se trabajó a escala y otra réplica se depositó en la placa para subcultivos y experimentos de ensayo funcional. Se usaron distintos e independientes reactantes de cultivo de tejidos, incubadores, personal y fuentes de dióxido de carbono para placas réplica descendentes. Se realizaron pasos de control de calidad para asegurar la adecuada 35 producción y calidad de todos los reactantes de cultivo de tejidos: cada componente adicionado a cada frasco de medio preparado para utilizarse fue adicionado por una persona designada en una campana designada solo con ese reactante en la campana mientras una segunda persona designada monitoreaba para evitar errores. Las condiciones para el manejo de líquidos se establecieron para eliminar contaminación cruzada entre los pocillos. En todos los pasos se utilizaron puntas nuevas o se utilizaron protocolos rigurosos de lavado con puntas. Las 40 condiciones de manejo de líquidos se establecieron para transferencia de volumen exacto, manipulación eficiente de células, ciclos de lavado, velocidades y ubicaciones de pipeta, número de ciclos de pipeteo para dispersión celular y posición relativa de la punta con la placa.

Tres grupos de placas se congelaron de -70 a 80ºC. Las placas en cada juego se dejaron primero llegar a 45 confluencias de 70 a 80%. El medio se aspiró y se adicionó FBS 90% y DMSO 5-10%. Las placas se sellaron herméticamente con Parafilm, en forma individual se rodearon con 1 a 5 cm de espuma y luego se colocaron en un congelador a -80ºC.

El juego restante de placas se mantuvo tal como se describe en el paso 9. Toda la división celular se realizó 50 mediante operaciones de manejo de líquidos automatizadas, que incluyen eliminación del medio, lavado celular, adición de tripsina e incubación, inactivación y pasos de dispersión celular. En algunas operaciones de depósito en el ensayo, las células se disociaron con amortiguador (por ejemplo, CDB, Invitrogen o CellStripper, CellGro) en lugar de tripsina.

55

Se controló la uniformidad y normalización de la célula y las condiciones de cultivo para todas las poblaciones de células. Las diferentes entre las placas debida a ligeras diferencias en índices de proliferación se controló mediante normalización periódica del número de células en las placas cada 2 a 8 subcultivos. Las poblaciones de células que dieron valores atípicos se detectaron y se eliminaron.

60

Las células se mantuvieron durante 3 a 8 semanas para permitir su evolución in vitro en estas condiciones. Durante este tiempo, observamos tamaño, morfología, fragilidad, respuesta a tripsinización o disociación, redondez/circularidad promedio posterior a la disociación, porcentaje de viabilidad, tendencia a la microconfluencia u otros aspectos del mantenimiento celular como adherencia a las superficies de la placa de cultivo.

65

Las poblaciones de células se evaluaron de acuerdo a criterios funcionales. Los estuches para ensayo de potencial

de membrana (Molecular Devices/MDS) se utilizaron según las instrucciones del fabricante. Las células se evaluaron a varias densidades diferentes en placas de 96 o 384 pocillos y se analizaron las respuestas. Se utilizaron varios puntos de evaluación posteriores a la aplicación en placa, por ejemplo, 12 a 48 horas después de hacer la aplicación en placa. También se evaluaron diferentes densidades de aplicación en placa para analizar las diferencias en la respuesta. 5

Las respuestas funcionales a partir de los experimentos realizados números de subcultivos con bajos y altos, se compararon para identificar células con las respuestas más uniformes durante periodos de tiempo definidos, que variaron entre 3 y 9 semanas. También se observaron otras características de las células que cambiaron a través del tiempo.

10

Las poblaciones de células que cumplieron con los criterios funcionales y otros criterios se evaluaron también para determinar aquellas más aptas para la producción de líneas celulares viables, estables y funcionales. Las poblaciones seleccionadas de células se expandieron en frascos más grandes para cultivo de tejidos y los pasos de caracterización descritos en lo anterior se continuaron o repitieron en esas condiciones. En este punto, se introdujeron operaciones de normalización adicionales, como diferentes densidades celulares de aplicación en la 15 placa, tiempo de subcultivo, formato y tamaño de la caja de cultivo y recubrimiento, optimización de fluidos, optimización de la disociación celar (por ejemplo, tipo, volumen utilizado y amplitud del tiempo) y operaciones de lavado, para obtener subcultivos uniformes y confiables. También se usaron diferencias de temperatura para la normalización (es decir, 30ºC vs. 37ºC).

20

Por otra parte, se determinó la viabilidad de las células en cada subcultivo. Se incrementó la intervención manual y las células se observaron más de cerca y se monitorearon. Esta información se usó para ayudar a identificar y seleccionar líneas celulares finales que conservaron las propiedades deseadas. Se seleccionaron las líneas celulares finales y líneas celulares de respaldo que mostraron proliferación uniforme, adherencia adecuada y respuesta funcional. 25

Las placas congeladas de subcultivos bajos descritas en lo anterior correspondientes a las líneas celulares finales y líneas celulares de respaldo, se descongelaron a 37ºC, se lavaron dos veces con DMEM-10% FBS y se incubaron y humidificaron en condiciones de 37ºC/5% CO2. Las células se expandieron luego durante un periodo de 2 a 3 semanas. Se establecieron bancos de células para cada línea celular final y de respaldo consistieron de 15 a 20 30 viales.

También se puede realizar la siguiente operación para confirmar que las líneas celulares son viables, estables y funcionales. Al menos un vial del banco de células se descongeló y se expandió en el cultivo. Las células resultantes se evaluaron para determinar si presentaban las mismas características por las cuales originalmente se 35 seleccionaron.

Ejemplo 2 Caracterización de la expresión relativa de subunidades NaV 1.7 heterólogas en líneas celulares que expresan NaV 1.7

40

Se utilizó RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para determinar la expresión relativa de las subunidades NaV 1.7 α, β1 y β2 en las líneas celulares producidas que expresan NaV 1.7 estable. El ARN total se purificó a partir de 1-3 x 106 células de mamíferos por medio de un estuche de extracción de ARN (RNeasy Mini Kit, Qiagen). El tratamiento con DNasa se hizo según el protocolo de tratamiento riguroso con DNasa (TURBO DNA-free Kit, Ambion). La síntesis de la primera hebra de ADNc se realizó utilizando un estuche de transcriptasa inversa (SuperScript III, Invitrogen) en un 45 volumen de reacción de 20 μl con 1 μg de ARN total libre de ADN y 250 ng Random Primers (Invitrogen). Muestras sin transcriptasa inversa y muestras sin ARN se usaron como controles negativos en esta reacción. La síntesis se hizo en un incubador térmico (Mastercycler, Eppendorf) en las siguientes condiciones: 5 min a 25ºC, 60 min a 50ºC; la terminación de la reacción se llevó a cabo durante 15 min a 70ºC.

50

Para el análisis de la expresión génica, se diseñaron cebadores y sondas para qRT-PCR (sondas MGB TaqMan, Applied Biosystems) para aparearse específicamente con las secuencias blanco u objetivo (SEQ ID NOS: 1 - 3). Para la normalización de la muestra, se utilizaron reactantes control (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)) Pre-Developed Assay (TaqMaN, Applied Biosystems). Las reacciones, incluidos los controles negativos y positivos (ADN plásmido), se realizaron por triplicado con 40 ng de ADNc en un volumen de reacción de 50 μl. Se 55 determinaron las cantidades relativas de cada una de las tres subunidades NaV 1.7 que se expresaron. Como se muestra en la Figura 1, las tres subunidades se expresaron en forma satisfactoria en la línea celular estable que expresa NaV 1.7.

Ejemplo 3 Caracterización de líneas celulares que expresan NaV 1.7 estable para la función de NaV nativo 60 mediante la aplicación de un ensayo electrofisiológico

Se usó un sistema patch-clamp (técnica de pinzamiento zonal de membrana) automatizado para registrar corrientes de sodio a partir de las líneas celulares HEK293T estables que expresan subunidades NaV 1.7 α, β1 y β2. También se puede usar el siguiente protocolo ilustrado para sistemas QPatch, Sophion o Patchliner, Nanion. La solución de 65 Ringer extracelular contenía 140 mM de NaCl, 4.7 mM de KCl, 2.6 mM de MgCl2, 11 mM de glucosa y 5 mM de

HEPES, pH 7.4 a temperatura ambiente. La solución de Ringer intracelular contenía 120 mM de CsF, 20 mM de Cs-EGTA, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 y 10 mM de HEPES, pH 7.2. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.

Las células que expresan en forma estable subunidades NaV 1.7 α, β1 y β2 se desarrollaron según los protocolos de 5 cultivo estándar tal como se describe en el Ejemplo 1. Las células se cosecharon y se mantuvieron en suspensión con agitación continua hasta por 4 horas sin que hubiera un cambio significativo en la calidad o habilidad para pinzamiento (patch). Se realizó un experimento electrofisiológico (célula completa) utilizando la placa de pinzamiento estándar. El orificio de pinzamiento (patch-clamp) (micrograbado en el chip) tiene un diámetro de alrededor de 1 µm y una resistencia de ~2 MΩ. El potencial de membrana se fijó a un potencial de retención de -100 mV. 10

La relación entre corriente y voltaje y las características de inactivación del canal de sodio NaV 1.7 humano activado por voltaje y expresado en forma estable en células HEK293T , se muestra en las Figuras 3A-C. La Figura 3A muestra corrientes de sodio como respuesta a pulsos de despolarización durante 20 ms (milisegundos) de - 80 mV a +50 mV. El potencial de retención fue de -100 mV. La Figura 3B muestra la relación resultante entre corriente y 15 voltaje (I-V) para corrientes pico del canal de sodio. El límite de activación fue -35 mV (punto medio de activación, Va = -24.9 mV +/- 3.7 mV) y la amplitud de corriente máxima se obtuvo a -10 mV. La Figura 3C muestra la gráfica de inactivación para el canal de sodio. El potencial de membrana se mantuvo a un potencial de retención de -100 mV, después se cambió a potenciales de acondicionamiento que variaron de -110 mV a +10 mV para 1000 ms y por último la corriente se midió a un paso de 0 mV. La amplitud de corriente resultante indica la fracción de canales de 20 sodio en estado de inactivación. A potenciales más negativos que -85 mV, los canales estaban predominantemente cerrados, mientras que a potenciales superiores a -50 mV predominó el estado de inactivación. La curva representa el ajuste de Boltzmann a partir del cual se estimó que el valor V1/2 para inactivación en estado de equilibrio es -74 mV. El perfil de corriente - voltaje para las líneas celulares que expresan NaV 1.7 estable obtenidas es congruente con el perfil corriente - voltaje reportado con anterioridad (Va= - 28.0 mV ±1.1 mV; V1/2 = -71.3 mV ± 0.8 mV) (Sheets 25 et al., J Physiol. 581(Pt 3):1019-1031. (2007)).

Ejemplo 4 Caracterización de líneas celulares que expresan NaV 1.7 estable para la función de NaV nativo mediante la aplicación de un ensayo de potencial de membrana

30

Las células estables producidas que expresan subunidades NaV 1.7 a, β1 y β2 se mantuvieron en condiciones de cultivo celular estándar en medio Eagles modificado de Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagles) suplementado con suero fetal de bovino 10%, glutamina y HEPES. Un día antes del ensayo, las células se cosecharon a partir de las placas de reserva utilizando amortiguador de disociación celular, por ejemplo, CDB (GIBCO) o cell-stripper (Mediatech) y se aplicaron en una proporción de 10,000 a 25,000 células por pocillo en placas de 384 pocillos en 35 medio de cultivo. Las placas de ensayo de mantuvieron en un incubador de cultivo celular a 37ºC en 5%CO2 durante 22 a 24 horas. Luego, el medio se eliminó de las placas de ensayo y se adicionó colorante de potencial de membrana de fluorescencia azul (Molecular Devices Inc.) diluido en amortiguador de carga (137 mM de NaCl, 5 mM de KCl,1.25 mM de CaCl2, 25 mM de HEPES, 10 mM de glucosa). Las células se incubaron con colorante de potencial de membrana azul durante 1 hora a 37ºC. Las placas de ensayo se depositaron en un lector de placas 40 fluorescente de alta productividad (Hamamastu FDSS). El lector de placas fluorescente midió la fluorescencia celular en imágenes tomadas a la placa con células una vez por segundo y los datos se expresaron como unidades de fluorescencia relativa.

La Figura 4 muestra la respuesta de ensayo de células que expresan NaV 1.7 estable y células control (células 45 progenitoras HEK293T) a la adición de amortiguador y activadores de canal (por ejemplo, veratridina y veneno de alacrán (SV - scorpion venom). En una primera operación de adición (Adición 1 en la Figura 4), solo se añadió amortiguador, sin compuestos de prueba. Si se desea, prueba se pueden adicionar compuestos de prueba en este paso. En una segunda operación de adición, veratridina y veneno de alacrán, que son activadores de los canales de sodio, se diluyeron en amortiguador de ensayo a la concentración deseada (es decir, 25 µM de veratridina y 5 - 25 50 µg/mL de veneno de alacrán) y se adicionaron en microplacas de microvaloración de polipropileno de 384 pocillos. Una vez unidas, la veratridina y las proteínas de veneno de alacrán modulan la actividad de los canales de sodio activados por voltaje a través de una combinación de mecanismos, entre los que se incluye una alteración de la cinética de activación e inactivación. La activación manifestada por los canales de sodio en células que expresan NaV 1.7 cambia el potencial de membrana de las células y aumenta la señal fluorescente. También se puede usar el 55 ensayo funcional descrito en lo anterior para caracterizar las potencias relativas de los compuestos de prueba en los canales iónicos NaV 1.7.

Ejemplo 5 Caracterización de la regulación de la subunidad NaV 1.7 alfa por las subunidades beta

60

Regulación de la expresión génica de la subunidad alfa por las subunidades beta

Mezclas de células HEK293T se manipularon para expresar varias mezclas en diferentes proporciones de subunidades α y β por manipulación de las relaciones molares de ADN plásmidos independientes o plásmidos α y de control (por ejemplo, α:β1:β2 = 1:1:1). Después de la selección con medicamentos, la expresión de subunidades en 65 seis diferentes mezclas de células, se evaluó con qRT-PCR tal como se describe en el Ejemplo 2. El análisis qRT-

PCR indicó que la expresión de una subunidad α en detección de seleccionadas por medicamentos aumentó cuando las tres subunidades NaV 1.7 humanas (es decir, α, β1 y β2) se cotransfectaron (Figura 2, panel a la izquierda) en comparación con la subunidad α sola y el plásmido de control transfectado (Figura 2, panel a la derecha). La presencia de los transcritos de la subunidad β afecta la expresión génica de la subunidad α, lo que demuestra la importancia de coexpresar las tres subunidad NaV 1.7 en un ensayo funcional de importancia fisiológica. 5

Regulación de las propiedades farmacológicas por subunidades beta

Se utilizó un ensayo celular de potencial de membrana para medir la respuesta a los compuestos de prueba de las células que coexpresan de manera estable las tres subunidades NaV 1.7 (es decir, α, β1 y β2) y las células de control que expresan de manera estable solo una subunidad NaV 1.7 α. Los compuestos (Figura 5) (es decir, C18 y 10 K21) se evaluaron en un ensayo de potencial de membrana realizado prácticamente según el protocolo del Ejemplo 4. Específicamente para este ejemplo, los compuestos de prueba se adicionaron en el primer paso de adición.

Como se muestra en la Figura 5, C18 y K21 potenciaron la respuesta del clon C44 (que expresa las subunidades NaV 1.7 α, β1 y β2, Figura 5A) y bloquearon la respuesta del clon C60 (que expresa la subunidad α de NaV 1.7, 15 Figura 5B). La respuesta de ensayo de los dos compuestos de prueba se normalizaron con respecto a la respuesta del amortiguador solo para cada uno de los dos clones.

LISTADO DE SECUENCIAS

20

Secuencia objetivo 1

5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’ (SEQ ID NO: 1)

Secuencia objetivo 2

5’-GAAGTTAACCCTGTCgttctgcgac-3’ (SEQ ID NO: 2) 25

Secuencia objetivo 3

5’-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 3)

Sonda de señalización 1 (unión objetivo 1) 30

5’ - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 quench -3’ (SEQ ID NO: 4)

Sonda de señalización 2 – (unión objetivo 2)

5’- Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 quench -3’ (SEQ ID NO: 5)

35

Homo sapiens (H.s.) SCN1A

H.s. SCN2A

5

H.s. SCN3A

5

H.s. SCN4A

5

H.s. SCN5A

5

H.s. SCN7A

H.s. SCN8A

5

H.s. SCN9A

H.s. SCN10A

5

H.s. SCN11A

H.s. SCN1B

5

H.s. SCN2B

10

H.s. SCN3B

H.s. SCN4B

H.s. SCN1A 5

H.s. SCN2A 10