ES2640906T3 - Modelo primate de la familia de los cercopitécidos infectado por una cepa del VHB de genotipo humano - Google Patents

Abstract

Utilización de una cepa de VHB aislada de un genotipo D humano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 para infectar un macaco de la subfamilia Cercopithecinae para producir un modelo primate para la enfermedad del VHB humano.

Description

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DESCRIPCION

Modelo primate de la familia de los cercopitecidos infectado por una cepa del VHB de genotipo humano

[0001] La solicitud describe un nuevo modelo primate no humano del virus de la hepatitis B (VHB).

[0002] Los cinco tipos de hepatitis viral, genotipos de hepatitis A, B, C, D, E, son ahora bastante bien conocidos. En cada caso, el virus invade el hlgado y provoca un estado inflamatorio con destruccion de las celulas hepaticas.

[0003] La hepatitis B es causada por un virus, el virus de la hepatitis B humana (VHB). En la mayorla de los casos, la infeccion por VHB no da lugar a ningun slntoma y es responsable de la hepatitis aguda asintomatica. La hepatitis aguda se caracteriza por trastornos digestivos, dolores abdominales, coloracion de la orina y heces decoloradas, anormales, astenia e ictericia. La hepatitis aguda puede convertirse en una forma fulminante con necrosis hepatica rapida.

[0004] La infeccion viral tambien puede convertirse en una forma cronica, ya sea en pacientes que han mostrado hepatitis aguda, o en individuos para los que la infeccion era asintomatica. El 10% de los adultos infectados y el 90% de los recien nacidos infectados se convierten en portadores cronicos (Ganem, 1996; Maddrey, 2000). Las infecciones cronicas con frecuencia progresan a cirrosis y cancer de hlgado (Beasley, 1988). Los portadores cronicos presentan lesiones hepaticas de gravedad variable y un mayor riesgo de desarrollar cirrosis y cancer de hlgado primitivo. En Asia y Africa, donde las infecciones son a menudo cronicas, los canceres de hlgado primitivos representan un problema de salud publica importante. Ademas, los portadores cronicos son reservorios de virus y permiten que se extiendan, transponiendo el problema de salud publica a un problema global.

[0005] El virus VHB fue descubierto por Blumberg et al, 1965. Este virus portado en la sangre tambien puede ser adquirido por contacto sexual o por transmision perinatal. VHB es un pequeno virus de ADN con un diametro de 42 nm, que pertenece al grupo de los virus de ADN hepatotropos (hepadnavirus) y se clasifica en la familia Hepadnaviridae. Su estructura genomica es notablemente compacta. El virus comprende una envoltura externa y una nucleocapside. La envoltura se compone principalmente de tres antlgenos de superficie (HBsAg: los antlgenos de superficie de hepatitis B) que desempenan un papel importante en el diagnostico de infecciones por VHB. La nucleocapside contiene el antlgeno del nucleo (HBcAg), una ADN polimerasa/transcriptasa inversa, as! como el genoma viral, y la membrana externa lleva el determinante antigenico principal (epltopo) del virus, el antlgeno HBs. El nucleo viral (aproximadamente 28 nm de diametro) permanece dentro de la envoltura que lleva el determinante antigenico principal (el determinante "a").

[0006] Las partlculas de VHB contienen predominantemente rcADN con una cadena completa negativa y una cadena parcialmente sintetizada positiva. Durante la iniciacion de la infeccion, el ADN del virion se convierte en un cccADN que sirve como molde para la transcripcion de un intermedio de ARN, el pregenoma. A continuacion, se sintetiza un genoma de ADN circular relajado, parcialmente de doble cadena, de ~ 3-kb mediante transcripcion inversa del pregenoma. El mecanismo de slntesis de ADN dirigida por ARN ha sido bien caracterizado mediante estudios geneticos, as! como bioqulmicos, que han sido descritos en varias revisiones. En cambio, los eventos tempranos del ciclo de vida viral, incluyendo la entrada, eliminacion de la envoltura, y la liberacion del genoma viral en el nucleo de la celula, no estan bien comprendidos. Esto es, en parte, debido a la ausencia hasta hace poco de llneas de celulas que sean susceptibles a la infeccion por hepadnavirus.

[0007] Los genotipos del virus de la hepatitis B (VHB) tienen una distribucion geografica caracterlstica. El virus de la hepatitis B (VHB) se ha clasificado en 8 genotipos (AH) en base a una divergencia intergrupo del 8% o mas en la secuencia de nucleotidos completa. Los genotipos A y C predominan en los EE.UU. Sin embargo, los genotipos B y D tambien estan presentes en los EE.UU. El genotipo F predomina en America del Sur y en Alaska, mientras que A, D y E predominan en Africa. El genotipo D predomina en Rusia y en todos sus dominios anteriores, mientras que en Asia, predominan los genotipos B y C. Mediante la secuenciacion y el analisis filogenetico de los aislados locales de VHB, se ha descrito que el genotipo VHB dominante en el Tibet es un hlbrido C/D (Chaoyin Cui et al., 2002).

[0008] A pesar de que se ha desarrollado una vacuna eficaz (vease, por ejemplo Lemon y Thomas, 1997, para una revision), la infeccion por el VHB sigue siendo un problema de salud publica en todo el mundo, con 400 millones de portadores cronicos del VHB haciendo que las infecciones por VHB sean la cuarta causa principal de muerte por enfermedades infecciosas (Wright et al., 1993). Cada ano, casi 1 millon de personas sucumben a la enfermedad hepatica asociada al VHB, especialmente cirrosis y carcinoma hepatocelular. El numero de portadores cronicos ya infectados y la posible aparicion de mutantes de escape de vacunas ponen de relieve la necesidad de tratamientos mas eficaces contra el VHB. De hecho, los tratamientos existentes de la infeccion cronica por VHB aun no son satisfactorios. Por lo tanto, el desarrollo de mejores modelos animales para probar nuevos enfoques terapeuticos es altamente deseable.

[0009] La falta de sistemas de infeccion in vitro adecuados y modelos animales convenientes ha obstaculizado en gran medida el progreso de la investigacion del VHB.

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[0010] La generacion de ilneas celulares de hepatoma humano VHB transfectadas ha contribuido de manera significativa a dilucidar varios aspectos de la replicacion viral y la expresion genica. Ademas, VHB se ha crecido con exito en cultivos primarios de hepatocitos humanos, pero la susceptibilidad a la infeccion es baja y hepatocitos cultivados convertido no permisiva para el VHB muy rapido despues de la siembra. Solo recientemente, Gripon et al. (2002) se describe una llnea celular de hepatoma altamente diferenciadas que, en condiciones especlficas, parece ser susceptible a la infeccion por VHB.

[0011] Los chimpances fueron los primeros animales que se encontro que eran susceptibles a la infeccion por VHB como se ha demostrado por la induccion de la infeccion aguda y hepatitis en estos animales despues de la inyeccion de suero de portadores del virus de la hepatitis B humana (Barker et al., 1973). Son los unicos primates conocidos para desarrollar una respuesta inmune celular similar a la observada en los seres humanos infectados de forma aguda con el VHB (Bertoni et al., 1998). Sin embargo, no desarrollan la enfermedad hepatica cronica. Ademas, su uso esta estrictamente limitado por su coste y por las restricciones eticas obvias, su uso esta prohibido incluso en algunos palses, entre ellos Francia. Ademas, estan en peligro de extincion y son inasequibles (Will et al, 1982; Mac Donald et al., 2000). La infeccion por VHB natural en chimpance, aunque se ha observado durante mucho tiempo, se ha demostrado muy recientemente (Hu et al, 2000).

[0012] El descubrimiento de los virus relacionados con el VHB en el pasado, primero en patos, gansos, garzas, marmotas, ardillas, y mas recientemente en monos lanudos, gibones, gorilas y orangutanes, ofrecio oportunidades para los estudios in vivo en varios animales con hepadnavirus naturales. Sin embargo, la mayorla de los animales correspondientes son diflciles de manejar en cautividad o no estan facilmente disponibles o filogeneticamente estan lejos del ser humano. Los patos, marmotas, ardillas y ratones humanizados recientemente desarrollados son muy buenos modelos para estudiar el ciclo viral, pero estan filogeneticamente lejos del ser humano con respecto de la respuesta inmune, y no desarrollan lesiones inflamatorias hepaticas, excepto de la marmota. Las infecciones experimentales y de origen natural con VHB se han descrito en gibones, orangutanes y gorilas (Shouval, 1994; Warren et al., 1999; Lanford et al, 2000; Takahashi et al., 2000). Sin embargo, no hay informes que demuestren el desarrollo de lesiones hepaticas y elevacion de las enzimas hepaticas en estos animales.

[0013] En base a la estrecha relacion filogenetica entre musaranas de arbol y primates, la especie de musarana de arbol Tupaia belangeri ha sido analizada para el estudio de la infeccion por VHB tanto in vitro como in vivo, tomando ventaja de estos animales en el entorno de laboratorio (Walter et al., 1996; Kock et al, 2001; von Weizsacker et al., 2004, Baumert et al, 2005). Sin embargo, la inoculacion de VHB en musaranas de arbol solo causa una infeccion transitoria que da lugar a una seroconversion y no conduce a un estado de portador cronico. Esta es una limitacion importante para el uso de este modelo animal experimental.

[0014] La marmota es uno de los modelos animales mas utilizados intensamente para VHB. Esto se debe al hecho de que VHM (virus de la hepatitis de la marmota) es mas similar al VHB en terminos de organizacion genomica que los hepadnavirus aviares y permite la investigacion de todo el ciclo de vida viral en hepatocitos naturales del huesped, incluyendo durante el desarrollo de HCC. El VHM es morfologicamente indistinguible de VHB y su genoma comparte aproximadamente el 60% de identidad de secuencia de nucleotidos con su homologo humano. Sin embargo, una desventaja general respecto para el uso de las marmotas es que son animales geneticamente heterogeneos, diflciles de criar en cautividad y de manipular en muchos laboratorios. Finalmente, el sistema inmune de las marmotas no esta bien caracterizado, y solo muy pocos anticuerpos monoclonales contra moleculas de MHC de marmota estan disponibles.

[0015] Mas recientemente, un nuevo hepadnavirus con un huesped intermedio entre los humanos y los roedores se ha aislado de un mono lanudo, Lagothrix lagotricha, un primate del nuevo mundo en peligro de extincion. El analisis filogenetico de las secuencias de nucleotidos de los genes del virus de hepatitis B del mono lanudo (WMVHB) indico que el virus era distinto de VHB y probablemente representa un progenitor de los virus humanos. Desafortunadamente, el pariente mas cercano no en peligro de extincion del mono lanudo, el mono arana de manos negras (Ateles geoffroyi), demostro que era solo marginalmente permisivo para WMVHB, y solo se observo una replicacion minima despues de la inoculacion de un chimpance con WMVHB.

[0016] Todos los modelos animales disponibles actualmente tienen inconvenientes: ninguno es filogeneticamente proximo al ser humano, no estan en peligro de extincion, de facil manejo en el laboratorio, y susceptibles para desarrollar lesiones hepaticas y respuesta inmune innata o celular similar a la observada en los seres humanos de forma aguda o infectados cronicamente con VHB.

[0017] El desarrollo de un nuevo modelo experimental mas cerca de los seres humanos y susceptible a la infeccion por VHB es de particular importancia, ya que representara una herramienta esencial para nuevas pruebas de estrategia terapeutica y estudio de variantes de VHB.

[0018] El virus de VHB siempre se ha considerado altamente especlfico del huesped por la comunidad cientlfica.

[0019] En 2002, Gheit et al. han inoculado intrahepaticamente tres monos M. sylvanus de Marruecos con una construccion de ADN de VHB de genotipo D humano. Muestran que, despues de la transfeccion directa de ADN del

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VHB humano de hlgado de M. sylvanus, se detectan cantidades crecientes de ADN circulante se detectan en el suero durante varias semanas con la presencia de HBsAg, se confirma la presencia de partlculas de virus en el suero y el aumento de los niveles de transaminasas siguio a la presencia de marcadores de virus en el suero. Esto demuestra la aparicion de la replicacion del VHB asociada con hepatitis aguda despues de la transfeccion intrahepatica de monos M. sylvanus con ADN del VHB.

[0020] Los presentes inventores han mostrado sorprendentemente, por primera vez, en dos especies de la familia de cercopitecidos, una infeccion natural por una cepa de VHB de un genotipo humano.

[0021] Las muestras biologicas de un total de 50 macacos cynomolgus se incluyeron en el estudio (hlgado y suero). La PCR subgenomica y la deteccion de HBsAg permitieron la identificacion de marcadores del VHB entre el 42% (21/50) de los animales probados. La PCR cuantitativa indico cargas virales del VHB entre macacos cynomolgus que iban desde 102 a 104 copias de ADN de VHB por ml de suero. La secuencia de VHB completa que circula en estos macacos cynomolgus mostro una secuencia cerca de la secuencia de VHB de genotipo D humano que circula entre los usuarios europeos de drogas intravenosas (U 95551/gi 2182117).

[0022] Ademas, en una muestra de hlgado de un Cercopithecus cephus que murio en un zoologico frances de hepatitis severa, tambien se identifico la presencia de protelnas de la cubierta (AgHBs), protelnas de la capside (AgHBc) y secuencias de ADN de VHB.

[0023] Esto proporciona un nuevo enfoque para obtener modelos primates con VHB, mas cerca de los humanos que los modelos disponibles actualmente, susceptibles a la infeccion por VHB.

[0024] La invention en su sentido mas amplio se define como en las reivindicaciones independientes.

Uso de una cepa de VHB humano para infectar modelos animales primates

[0025] Por lo tanto, la presente solicitud describe el uso de una cepa de VHB aislada de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de genotipos humanos para infectar, preferiblemente infectar artificialmente, un primate no humano de la familia de los cercopitecidos y para producir un modelo animal.

[0026] Un "modelo animal" significa en el presente documento un animal aislado de su entorno natural que ha sido infectado, preferiblemente infectado artificialmente, y puede ser utilizado como modelo para la enfermedad del VHB humano.

[0027] Preferiblemente, dicho genotipo humano de VHB se selecciona del grupo que consiste en genotipo A humano de VHB, genotipo B humano de VHB, genotipo C humano de VHB, genotipo D humano de VHB, genotipo E humano de VHB, genotipo F humano de VHB, genotipo G humano de VHB y genotipo H humano de VHB.

[0028] Mas preferiblemente, dicho genotipo humano de VHB se selecciona del grupo que consiste en genotipo A humano de VHB y genotipo D humano de VHB.

[0029] Preferiblemente, dicha cepa de VHB hlbrida es un hlbrido de dos genotipos humanos como se definio anteriormente.

[0030] En un aspecto preferido, la cepa de VHB comprende o consiste en una secuencia de al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% identica a SEQ ID NO: 1.

[0031] Los cercopitecidos son un grupo de primates, cayendo en la superfamilia Cercopithecoidea en el clado Catarrhini. Desde el punto de vista de la apariencia superficial, no se parecen a los simios en que la mayorla tienen colas (el nombre de la familia significa "simio con cola"), y a diferencia de los monos del Nuevo Mundo en que sus colas no son prensiles.

[0032] Los cercopitecidos son nativos de Africa y Asia hoy en dla, pero tambien son conocidos de Europa en el registro fosil. Incluyen muchas de las especies mas familiares de primates no humanos. Los cercopitecidos incluyen dos subfamilias, la Cercopithecinae, que son principalmente de Africa pero incluye el genero diverso de macacos que son de Asia y el norte de Africa, y la Colobinae, que incluye la mayorla de los generos de Asia, pero tambien los monos colobos africanos.

[0033] Preferiblemente, el modelo animal primate aislado de la familia de los cercopitecidos infectado artificialmente es de la subfamilia Cercopithecinae.

[0034] Preferiblemente, el modelo animal primate aislado de la subfamilia Cercopithecinae es un macaco, mas preferiblemente de la especie Macaca sylvanus o Macaca cynomolgus, o un guenon, mas preferiblemente de la especie Cercopithecus cephus.

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[0035] En un aspecto especlfico, los babuinos estan excluidos del alcance de los cercopitecidos descritos en el presente documento.

[0036] "Aislado" cuando se usa en referencia a las cepas de VHB y/o secuencias de nucleotidos descritas en el presente documento significa que la cepa o secuencia de nucleotidos han sido sometidos al menos a una etapa de purificacion del fluido corporal y/o tejido natural o que no esta presente en su entorno nativo. Alternativamente, las cepas pueden mantenerse en fluido corporal y/o tejido aislado o pueden estar en forma de nucleotidos. Tlpicamente, esto significa que la cepa de virus o la secuencia de nucleotidos esta libre de al menos una de las protelnas del huesped y/o acidos nucleicos del huesped. En general, la cepa de virus o secuencia de nucleotidos aisladas esta presente en un entorno in vitro. "Aislado" no significa que la cepa de virus o secuencia de nucleotidos deba ser purificada u sea homogenea, aunque dichas preparaciones caen dentro del alcance del termino. "Aislado" significa simplemente elevado a un grado de pureza, en la medida requerida con exclusion de producto de la naturaleza y anticipaciones accidentales del alcance de las reivindicaciones. "Aislado" significa que incluye cualquier material biologico tomado ya sea directamente de un ser humano o animal infectado, o despues del cultivo (enriquecimiento).

[0037] Una "cepa" significa una variante genetica o subtipo de un virus.

[0038] Un "genotipo de VHB" es un grupo VHB basado en el 92% de homologla o mas en la secuencia de nucleotidos genomica completa.

[0039] El grado de "homologla" se establece mediante el registro de todas las posiciones para las cuales los nucleotidos de las dos secuencias comparadas son identicos, en relacion con el numero total de posiciones.

[0040] Una "cepa hlbrida a/p" significa una cepa cuya secuencia de ADN genomico resulta de una recombinacion entre una secuencia de nucleotidos genomica del genotipo a y una secuencia de nucleotidos genomica del genotipo p.

[0041] El termino "recombinacion" significa en este documento el mecanismo por el cual genes localizados en diferentes secuencias genomicas homologas se encuentran en la misma estructura genomica recombinante.

[0042] Una "secuencia de nucleotidos genomica del genotipo A humano de VHB" significa el material genetico total de una cepa de VHB del genotipo A humano.

[0043] "Del genotipo l humano de VHB" significa de una cepa de VHB clasificada en el genotipo l humano.

[0044] "Artificialmente" significa que el encuentro entre el virus y el animal no se produce al azar, sino que es un encuentro forzado (es decir, el animal se inocula con la cepa de VHB o secuencia de nucleotidos de VHB por intervencion humana).

[0045] "Infectado" significa en este documento el desarrollo de signos de infeccion.

[0046] "Signos de infeccion" incluyen la presencia de ADN genomico de VHB en el hlgado o en el suero, la presencia de protelnas virales en el hlgado o en el suero y/o una carga viral de al menos 102 copias genomicas/ml

[0047] La presencia de ADN genomico de VHB se puede ensayar por transferencia de puntos de los acidos nucleicos o suero o por PCR seguido de transferencia Southern seguido por hibridacion con una sonda especlfica de VHB, o por analisis de transferencia Northern o por RT PCR para el analisis del ARN. La presencia de las protelnas virales puede ensayarse por inmunofluorescencia, FACS o ensayos de transferencia Western, inmunoensayos (ELISA).

[0048] La carga viral se puede medir por PCR en tiempo real.

[0049] Preferiblemente, la carga viral del VHB en el suero de un modelo animal de acuerdo con la invencion esta comprendida entre 102 y 108 copias/ml, mas preferiblemente entre 103 y 108 copias/ml, lo mas preferiblemente entre 104 y 108 copias/ml.

Uso de un primate de la familia de los cercopitecidos para fabricar un modelo animal infectado por VHB

[0050] Un objeto adicional descrito en este documento es el uso de un primate aislado de la familia de los cercopitecidos para fabricar un modelo animal infectado por una cepa de VHB de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de dos genotipos humanos.

[0051] La solicitud tambien describe el uso de un primate aislado de la familia de los cercopitecidos infectado, por ejemplo infectado artificialmente, por una cepa de VHB de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de dos genotipos humanos como un modelo animal para la infeccion para la enfermedad de VHB humano.

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[0052] Preferiblemente, dicho genotipo humano de VHB se selecciona del grupo que consiste en genotipo A humano de VHB, genotipo B humano de VHB, genotipo C humano de VHB, genotipo D humano de VHB, genotipo E humano de VHB, genotipo F humano de VHB, genotipo G humano de VHB y genotipo H humano de VHB.

[0053] Mas preferiblemente, dicho genotipo humano de VHB se selecciona del grupo que consiste en genotipo A humano de VHB y genotipo D humano de VHB.

[0054] Preferiblemente, dicha cepa de VHB hlbrida es un hlbrido de dos genotipos humanos.

[0055] En un aspecto preferido, la cepa de VHB comprende o consiste en una secuencia de al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% identica a SEQ ID NO: 1.

[0056] Preferiblemente, el primate aislado de la familia de los cercopitecidos es de la subfamilia Cercopithecinae.

[0057] Preferiblemente, el modelo animal primate aislado de la subfamilia Cercopithecinae es un macaco, mas preferiblemente de la especie Macaca sylvanus o Macaca cynomolgus, o un guenon, mas preferiblemente de la especie Cercopithecus cephus.

[0058] En un aspecto especlfico, los babuinos estan excluidos del alcance de los cercopitecidos descritos en el presente documento.

[0059] Un "primate aislado" significa un primate aislado de su entorno natural.

Modelos de VHB de primates no humanos

[0060] Un objeto adicional descrito en este documento es un modelo animal primate de la familia de los cercopitecidos infectado con una cepa de VHB de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de genotipos humanos.

[0061] Preferiblemente, dicho modelo animal primate de la familia de los cercopitecidos esta infectado artificialmente con una cepa de VHB aislada de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de genotipos humanos.

[0062] Preferiblemente, dicho genotipo humano de VHB se selecciona del grupo que consiste en genotipo A humano de VHB, genotipo B humano de VHB, genotipo C humano de VHB, genotipo D humano de VHB, genotipo E humano de VHB, genotipo F humano de VHB, genotipo G humano de VHB y genotipo H humano de VHB.

[0063] Mas preferiblemente, dicho genotipo humano de VHB se selecciona del grupo que consiste en genotipo A humano de VHB y genotipo D humano de VHB.

[0064] Preferiblemente, dicha cepa de VHB hlbrida es un hlbrido de dos genotipos humanos.

[0065] En un aspecto preferido, la cepa de VHB comprende o consiste en una secuencia de al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% identica a SEQ ID NO: 1.

[0066] Preferiblemente, el primate aislado de la familia de los cercopitecidos es de la subfamilia Cercopithecinae.

[0067] Preferiblemente, el modelo animal primate aislado de la subfamilia Cercopithecinae es un macaco, mas preferiblemente de la especie Macaca sylvanus o Macaca cynomolgus, o un guenon, mas preferiblemente de la especie Cercopithecus cephus.

[0068] En un aspecto especlfico, los babuinos estan excluidos del alcance de los cercopitecidos descritos en el presente documento.

[0069] Preferiblemente, el modelo animal primate tiene una carga viral del VHB en el suero comprendida entre 102 y 108 copias/ml, mas preferiblemente entre 103 y 108 copias/ml, lo mas preferiblemente entre 104 y 108 copias/ml.

[0070] Un objeto adicional descrito en este documento es un procedimiento para proporcionar un modelo animal primate, que comprende las siguientes etapas que consisten en:

- aislar un animal de la familia de los cercopitecidos;

- infectar dicho animal con una cepa de VHB aislada de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de genotipos humanos;

- ensayar una carga viral de al menos 102 copias genomicas de VHB/ml de suero.

Secuencias de nucleotidos y procedimientos de expresion

[0071] Otro objeto descrito en este documento es una secuencia de nucleotidos o un acido nucleico que comprende o consiste en una secuencia al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% identica a SEQ iD NO: 1, o una

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secuencia complementaria de la misma.

[0072] SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleotidos genomica de la cepa de VHB aislada por los inventores en Macaca cynomolgus de Isla Mauricio. Esta secuencia se ha demostrado que se clasifica en el genotipo D humano es decir, que tiene mas del 92% de homologla con la secuencia genomica de un genotipo D humano.

[0073] Los terminos "polinucleotido", "acido polinucleico", "acido nucleico", "secuencia de acido nucleico", "secuencia de nucleotidos", "molecula de acido nucleico", "oligonucleotido", "sonda" o "cebador", cuando se usan en este documento se refieren a nucleotidos, ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, nucleotidos de peptidos o nucleotidos bloqueados, o una combination de los mismos, en una forma polimerica de cualquier longitud o cualquier forma (por ejemplo, ADN ramificado). Dichos terminos incluyen ademas polinucleotidos de doble cadena (ds) y de cadena sencilla (ss), as! como polinucleotidos de cadena triple. Dichos terminos tambien incluyen modificaciones de nucleotidos conocidos, tales como metilacion, ciclizacion y “caps” y sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales por un analogo, tal como inosina o por monomeros no amplificables, tales como HEG (hexetilenglicol).

[0074] Los ribonucleotidos se indican como PNT, desoxirribonucleotidos como dNTP y didesoxirribonucleotidos como ddNTP.

[0075] Los nucleotidos pueden marcarse en general radioactivamente, de forma quimioluminiscente, fluorescente, fosforescente o con colorantes infrarrojos o con una etiqueta de Raman de mayor superficie o partlcula resonante plasmonica (PRP).

[0076] Por un nucleotido que tiene una secuencia al menos, por ejemplo, 95% "identica" a una secuencia de consulta, se entiende que la secuencia del nucleotidos objeto es identica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia de nucleotidos objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de acido nucleico por cada 100 acidos nucleicos de la secuencia de consulta. En otras palabras, para obtener un nucleotido que tiene una secuencia al menos 95% identica a una consulta, hasta un 5% (5 de 100) de los acidos nucleicos en la secuencia objeto pueden estar insertados, eliminados o sustituidos por otro acido nucleico.

[0077] Los procedimientos para comparar la identidad y homologla de dos o mas secuencias son bien conocidos en la tecnica. Se puede utilizar, por ejemplo, el programa "needle", que utiliza el algoritmo de alineacion global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970 J. Mol Biol. 48: 443-453) para encontrar la alineacion optima (incluidos los huecos) de dos secuencias cuando se considera toda su longitud. El programa “needle” esta, por ejemplo, disponible en el sitio web ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad descrito en el presente documento se calcula preferiblemente usando el programa EMBOSS::needle (global) con un parametro de "Gap Open" igual a 10,0, un parametro "Gap Extend” igual a 0,5, y una matriz Blosum62

[0078] Un objeto adicional descrito en este documento se refiere a un vector que comprende una secuencia de nucleotidos descrita en este documento colocada bajo el control de los elementos que aseguran la expresion de la secuencia de nucleotidos.

[0079] "Elementos que aseguran la expresion de dicha secuencia de nucleotidos" se refiere en particular a los elementos necesarios para asegurar la expresion de dicha secuencia de nucleotidos despues de su transferencia a una celula diana. Se aplica en particular a secuencias promotoras y/o secuencias reguladoras que son efectivas en dicha celula, y opcionalmente las secuencias requeridas que permiten que un polipeptido se exprese en la superficie de las celulas diana. El promotor utilizado puede ser un promotor viral, ubicuo o especlfico de tejido, o un promotor sintetico. Como ejemplos podemos mencionar los promotores, tales como los promotores de los virus RSV (Virus del sarcoma de rous), MPSV, SV40 (Virus de simio), CMV (Cytomegalovirus) o del virus vaccinia. Ademas, es posible seleccionar una secuencia de promotor especlfica para un tipo de celula dada, o que se pueda activar en condiciones definidas. La literatura contiene un gran volumen de information relativa a dichas secuencias promotoras.

[0080] Los terminos "vector", "vector de donation" y "vector de expresion" significan el vehlculo mediante el cual una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extrano) puede introducirse en una celula huesped, a fin de transformar el huesped y promover la expresion (por ejemplo, transcription y traduction) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plasmidos, fagos, virus, etc.; se discuten en mayor detalle a continuation.

[0081] Los vectores comprenden tlpicamente el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta el ADN extrano. Una forma comun para insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas denominadas enzimas de restriction que escinden el ADN en sitios especlficos (grupos especlficos de nucleotidos) denominados sitios de restriccion. Un "casete" se refiere a una secuencia codificante de ADN o segmento de ADN que codifica un producto de expresion que puede insertarse en un vector en sitios de restriccion definidos. Los sitios de restriccion de casete estan disenados para garantizar que la insertion del casete en el marco de lectura apropiado. Generalmente, se inserta el ADN extrano en uno o mas sitios de restriccion del ADN vector, y a continuacion es transportado por el vector en una celula huesped junto con el ADN vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o anadido, tal como un vector de expresion, tambien puede ser llamado una "construction de ADN". Un tipo comun de vector es un "plasmido", que generalmente es una molecula autocontenida

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de ADN de doble cadena, normalmente de origen bacteriano, que puede aceptar facilmente ADN (extrano) adicional y que puede introducirse facilmente en una celula huesped adecuada. Un vector plasmido contiene a menudo ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o mas sitios de restriccion adecuados para la insercion de ADN extrano. El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoacidos particular para una protelna o enzima particular. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula, o en cualquier caso media o controla la expresion del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo o de diferentes organismos. Un gran numero de vectores, incluyendo plasmidos y vectores fungicos, se han descrito para la replication y/o expresion en una variedad de huespedes eucariotas y procariotas. Los ejemplos no limitantes incluyen plasmidos pKK (Clontech), plasmidos pUC, plasmidos pET (Novagen, Inc., Madison, Wl), plasmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA), o plasmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), y muchas celulas huesped apropiadas, usando procedimientos descritos o citados en este documento o de otra manera conocidos para los expertos en la tecnica relevante. Los vectores de donation recombinantes a menudo incluiran uno o mas sistemas de replicacion para la clonacion o expresion, uno o mas marcadores para la selection en el huesped, por ejemplo, resistencia a antibioticos, y uno o mas casetes de expresion. Los vectores de expresion pueden comprender acido nucleico viral que incluye, pero no se limita a, virus vaccinia, adenovirus, retrovirus y/o acido nucleico del virus adeno-asociado. La secuencia de nucleotidos o vector descrito en este documento tambien pueden estar en un liposoma o un vehlculo de suministro que pueden ser recogidos por una celula a traves de endocitosis mediada por receptor u otro tipo de endocitosis.

[0082] Los terminos "expresar" y "expresion" significa permitir o provocar que la information en un gen o secuencia de aDn se manifieste, por ejemplo produciendo una protelna mediante la activation de las funciones celulares implicadas en la transcription y traduction de un gen o secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una celula para formar un "producto de expresion", tal como una protelna. El propio producto de expresion, por ejemplo la protelna resultante, tambien puede decirse que es "expresado" por la celula. Un producto de expresion puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. El termino "intracelular" significa algo que esta dentro de una celula. El termino "extracelular" significa algo que esta fuera de una celula. Una sustancia es "secretada" por una celula si aparece en medida significativa fuera de la celula, desde algun lugar dentro o fuera de la celula.

[0083] Otro objeto descrito en este documento es una celula huesped que contiene un vector descrito en este documento, por ejemplo, mediante transfection, transformation o infection.

[0084] Esta celula huesped se origina a partir de un organismo procariota o eucariota.

[0085] Numerosas herramientas se han desarrollado para la introduction de varios genes y/o vectores heterologos en las celulas, especialmente celulas de mamlferos. Estas tecnicas se pueden dividir en dos categorlas: la primera categorla implica tecnicas flsicas, tales como microinyeccion, electroporation o bombardeo de partlculas. La segunda categorla se basa en el uso de tecnicas en biologla molecular y celular mediante las cuales el gen se transfiere con un vector biologico o sintetico que facilita la introduccion del material en la celula in vivo. En la actualidad, los vectores mas eficientes son los vectores virales, especialmente los vectores adenovirales y retrovirales. Estos virus poseen propiedades naturales para atravesar las membranas plasmaticas, evitar la degradation de su material genetico e introducir su genoma en el nucleo de la celula. Estos virus han sido ampliamente estudiados y algunos ya estan siendo utilizados de forma experimental en aplicaciones humanas en la vacunacion, en inmunoterapia, o para compensar las deficiencias geneticas. Sin embargo, este enfoque viral tiene limitaciones, debido en particular a la capacidad restringida para la clonacion en estos genomas virales, el riesgo de propagation de las partlculas virales producidas en el organismo y el medio ambiente, el riesgo de mutagenesis por artefacto mediante la insercion en la celula huesped en el caso de los retrovirus, y la posibilidad de inducir una fuerte respuesta inmune inflamatoria in vivo durante el tratamiento, lo que limita el posible numero de inyecciones (McCoy et al, 1995, Human gene Therapy 6: 1553-1560; Yang et al, 1996, Inmunidad 1: 433-422). Existen alternativas a estos sistemas de vectores virales. El uso de procedimientos no virales, por ejemplo co-precipitacion con fosfato de calcio, el uso de receptores que imitan los sistemas vlricos (para un resumen, ver Cotten y Wagner 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 705-710), o el uso de pollmeros, tales como poliamidoaminas (Haensler y Szoka 1993, Bioconjugate Chem., 4: 372-379). Otras tecnicas no virales se basan en el uso de liposomas, cuya eficacia para la introduccion de macromoleculas biologicas, tales como ADN, ARN, protelnas o sustancias farmaceuticamente activas ha sido ampliamente descrita en la literatura cientlfica. En este area, los equipos han propuesto el uso de llpidos cationicos que tienen una fuerte afinidad por las membranas celulares y/o acidos nucleicos. De hecho se ha demostrado que una molecula de acido nucleico en si era capaz de cruzar la membrana plasmatica de ciertas celulas in vivo (WO 90/11092), dependiendo la eficacia en particular de la naturaleza polianionica del acido nucleico. Desde 1989 (Felgner et al, Nature 337: 387-388) se han propuesto llpidos cationicos para facilitar la introduccion de grandes moleculas anionicas, que neutralizan las cargas negativas de estas moleculas y favorecen su introduccion en las celulas. Varios equipos han desarrollado llpidos cationicos de este tipo: DOTMA (Felgner et al, 1987, PNAS 84: 7413-7417), DOGS o Transfectam (TM) (Behr et al, 1989, PNAS 86: 6982-6986), DMRIE y DORIE (Felgner et al, 1993 methods 5: 67-75) DC-CHOL (Gao y Huang 1991, BBRC 179: 280-285), DOtAp (TM) (McLachlan et al, 1995, Gene Therapy 2: 674-622) o Lipofectamine T, y las otras moleculas descritas en las patentes WO9116024, WO9514651, WO9405624. Otros grupos han desarrollado pollmeros cationicos que facilitan la transferencia de macromoleculas, especialmente macromoleculas anionicas, en las celulas. La Patente WO 95/24221 describe el uso de pollmeros dendrlticos, el documento WO96/02655 describe

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el uso de polietilenimina o polipropilenimina y los documentos de patente de Estados Unidos. No. 5595897 y FR2719316 describen el uso de conjugados de polilisina.

[0086] El termino "celula huesped" significa cualquier celula de cualquier organismo que es seleccionada, modificada, transformada, producida, o utilizada o manipulada de cualquier modo, para la produccion de una sustancia por la celula, por ejemplo la expresion por la celula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una protelna o una enzima. Las celulas huesped se pueden usar ademas para el cribado u otros ensayos, tal como se describe infra.

[0087] El termino "sistema de expresion" significa una celula huesped y vector compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresion de una protelna codificada por ADN extrano transportado por el vector e introducido en la celula huesped. Los sistemas de expresion comunes incluyen celulas huesped de E. coli y vectores plasmido, celulas huesped de insectos y vectores de baculovirus, y celulas huesped de mamlferos y vectores. Las celulas adecuadas incluyen celulas de hepatocitos. Lo mas preferiblemente, una celula huesped descrita en este documento es una llnea celular de hepatoma HuH7, HepG2 o celula HepaRG, los hepatocitos humanos o de primates no humanos en cultivo primario o cualquier llnea celular de hepatocitos.

Procedimientos para evaluar un agente terapeutico o una vacuna

[0088] Otro objeto descrito en este documento es un procedimiento para evaluar un agente terapeutico segun el cual un modelo animal descrito en este documento se administra con dosis definidas, en una dosis o en dosis repetidas y a intervalos especlficos de tiempo, de un agente terapeutico o un proceso o un agente o proceso de diagnostico, se toman muestras biologicas antes y a intervalos de tiempo definidos despues de la administration de dicho agente terapeutico y se llevan a cabo y se comparan mediciones cualitativas y cuantitativas de las protelnas virales de VHB en dichas muestras biologicas.

[0089] Los agentes o procesos terapeuticos pueden afectar a cualquier etapa de la infection: fijacion de membrana, fagocitosis, decapsidacion, replication del ADN, maduracion de protelnas virales, ensamblaje de viriones. Incluyen analogos de nucleosidos, inhibidores de proteasas virales, inhibidores de la glicosilacion, oligonucleotidos antisentido, ribozimas, y compuestos immonomoduladores. Los agentes o procesos de diagnostico incluyen ensayos para la detection de la presencia o cantidades de linfocinas, citocinas, quimiocinas, antlgenos, epltopos de antlgenos, anticuerpos particulares u otras macromoleculas biologicas asociadas con la infeccion por VHB.

[0090] Un objeto adicional descrito en este documento se refiere a un procedimiento para evaluar una vacuna de acuerdo con el cual se administra un animal primate de la familia de los cercopitecidos con dosis definidas, en una dosis o en dosis repetidas y a intervalos especlficos de tiempo, de una vacuna, dicho animal es infectado artificialmente con una cepa de VHB aislada de un genotipo humano o una cepa de VHB hlbrida de dos genotipos humanos, se toman muestras biologicas antes y a intervalos definidos de tiempo despues de la infeccion y llevan a cabo y se comparan mediciones cualitativas y cuantitativas de las protelnas virales de VHB en dichas muestras biologicas.

[0091] Las vacunas incluyen VHB vivo atenuado, VHB inactivado y composiciones de vacuna que comprenden protelnas de subunidades, especialmente protelnas recombinantes, ADN que codifica genes virales, solos o en combination con compuestos inmunomoduladores.

[0092] Tal como se pretende en el presente documento, el termino "terapeutico" significa la capacidad de una sustancia para tratar una reaction patologica a la infeccion por VHB.

[0093] Tal como se pretende en el presente documento, el termino "vacuna" se refiere a la capacidad de una sustancia para prevenir una reaccion patologica a la infeccion por VHB.

[0094] En el contexto de la invention, los terminos "tratar", "que trata" o "tratamiento", significa invertir, aliviar, o inhibir el transcurso de una reaccion patologica o uno o mas slntomas de la misma.

[0095] En el contexto de la invencion, los terminos "prevenir" o "prevention", significa el inicio de una reaccion patologica o uno o mas slntomas de la misma.

[0096] La evaluation de la eficacia de un agente terapeutico y el seguimiento terapeutico ex vivo se determinan de la siguiente manera: los agentes terapeuticos a ensayar para la actividad terapeutica y/o para el seguimiento terapeutico se administran por diversas vlas, tales como intramuscular, subcutanea u otras vlas. Se administran varias dosis. Una o mas administraciones pueden llevarse a cabo con diferentes intervalos de tiempo entre cada administracion que van desde unos pocos dlas hasta unos pocos anos. Las muestras biologicas se toman a intervalos de tiempo definidos despues de la administracion del agente terapeutico, preferiblemente de la sangre y del suero. Se llevan a cabo diversos analisis en estas muestras. Justo antes de la primera administracion del agente terapeutico, se toman dichas muestras y tambien se realizan los mismos analisis. El examen cllnico y el examen biologico clasicos tambien se llevan a cabo en paralelo con los analisis complementarios que se describen a continuation, a diferentes tiempos de analisis.

[0097] Se llevan a cabo los siguientes analisis: la medicion cualitativa y cuantitativa de las protelnas virales de VHB

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en el suero o en la sangre mediante ELISA y/o transferencia Western, usando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son capaces de fijarse a al menos una de las protelnas o a uno de sus fragmentos y/o medicion de la actividad de dichas protelnas y/o ensayo de anticuerpos especlficos para las protelnas de interes o de sus fragmentos en las muestras de sangre o suero mediante ELlSA y/o transferencia Western usando una protelna natural aislada y purificada o un fragmento de la protelna natural y/o una protelna sintetica o un fragmento de dicha protelna sintetica o un polipeptido sintetico, y/o ensayo de la respuesta inmune celular inducida contra la protelna o protelnas de interes y cualquier peptido inmunogenico derivado de estas protelnas, como se describe anteriormente, y/o la deteccion de fragmentos de ADN y/o ARN que codifican la protelna o protelnas de interes o un fragmento de dichas protelnas de interes por hibridacion de nucleotidos mediante tecnicas que son familiares para una persona experta en la tecnica (transferencia Southern, transferencia Northern, ELOSA "Enzyme-Linked Oligosorbent Assay" (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., 1993 Dec; 54 (12): 2021-6 y Franpois Mallet et al, Journal of Clinical Microbiology, junio de 1993, p. 14441449)) y/o mediante la amplificacion ADN y/o ARN, por ejemplo por PCR, RT-PCR, utilizando fragmentos de acido nucleico que codifican la protelna o protelnas de interes, y/o mediante biopsia de tejidos, preferiblemente del hlgado, y la observacion de los marcadores de la infeccion por VHB. Se puede realizar por ejemplo mediante inmunohistoqulmica o inmunofluorescencia para la deteccion HBVAg en el hlgado, o mediante hibridacion in situ o mediante PCR para la deteccion de ADN del VHB en las secciones de hlgado.

[0098] La invention se ilustrara adicionalmente en vista de las siguientes figuras y ejemplos.

FIGURAS

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Figura 1: Mapa de transcription y traduction de VHB. La figura muestra el mapa flsico del genoma de VHB. El clrculo interno representa el rcADN con la transcriptasa inversa unida al extremo 5' del ADN completo de cadena negativa (esfera solida) y un oligomero de ARN bloqueado unido al extremo 5' del ADN incompleto de cadena positiva (media esfera solida). Las posiciones de las repeticiones directas, DR1 y DR2, as! como las posiciones de los dos potenciadores, EN1 y EN2, estan indicadas. El clrculo exterior representa los tres principales ARN virales, el nucleo (C) o pgARN, los pre-S (L) de ARNm, y el ARNm S. Los extremos 3' comunes de los tres mARN se indican por las letras A. No se muestra en la figura el posible ARNm X que abarca la region codificante de X y termina en el sitio indicado para los otros tres mARN. Las cuatro regiones de codification de protelnas se muestran entre los clrculos interno y externo. Incluyen el prenucleo (PC) y genes de nucleo, el gen de la polimerasa, y el gen X. Los genes de la envoltura pre-S1 (L), pre-S2 (M), y la superficie (S) solapan con el marco de lectura abierto de la polimerasa.

Figura 2: Estrategia de aislamiento de VHB de macaco cynomolgus.

Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa de genoma de VHB amplificado por PCR (Gunther et al, 1995) e hibridacion de transferencia Southern.

Figura 4: secuencia del gen X de VHB de macaco cynomolgus en el arbol filogenetico del gen X de VHB en humanos y primates no humanos.

Figura 5: marcaje IHC de HBsAg (A) o marcaje IF de HBsAg en las secciones de C. cephus (B) y M. cynomolgus (C) con anticuerpos anti-HBs (Dako, F) (Ampliation: X20). Las flechas amarillas indican los hepatocitos marcados.

Figura 6: analisis de Southern de los productos PCR de VHB obtenidos a partir de fracciones de gradiente de sacarosa del 22,5%, 42,5% y 48%.

Figura 7: Observacion por microscopla electronica de partlculas "virales" en la fraction de gradiente de sacarosa del 42,5% positivo para ADN del VHB y PCR.

Figura 8: Seguimiento de marcadores de infeccion en macacos sylvanus BL12, BL13, BL14.

Figura 9: analisis de transferencia Southern de productos de PCR (145 pb y 118 pb) en los genes S y C de VHB. Figura 10: marcaje IF de HBcAg en secciones de hlgado de M. sylvanus (BL14). Las flechas muestran celulas positivas para HBcAg (X20).

Figura 11: analisis de transferencia Southern de los productos PCR del VHB en el gen S (118 pb). Seguimiento desde el dla 1 al 10 despues de la infeccion.

Figura 12: deteccion de HBsAg en los hepatocitos infectados con sobrenadante en cultivo primario de M cynomolgus. Valor de corte de la prueba fue 1.

Figura 13: Seguimiento de marcadores de infeccion AgHB y transaminasas en macacos sylvanus BL01, BL3, BL04 despues de la inoculation con un conjunto de sueros humanos altamente viremicos (109 copias/ml).

Figura 14: Seguimiento de marcadores de infeccion AgHB y transaminasas en macacos sylvanus BL12, BL13, BL14 despues de la inoculacion con un conjunto de sueros de macacos Cynomolgus hallados infectados de forma natural por VHB (103 copias/ml).

Ejemplos

MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS Animales

[0100] Macacos. Las muestras de suero e hlgado de 50 macacos cynomolgus provenlan de una gran instalacion de crla en Isla Mauricio. Las muestras de suero e hlgado se obtuvieron de veinte M sylvanus capturados en la naturaleza (montanas del Atlas Medio), se pusieron en cuarentena y se mantuvieron en el Instituto Pasteur de Casablanca

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(Marruecos). Todos los animales fueron negativos para los marcadores serologicos de infeccion con virus de hepatitis A, C, HTLV I y HTLV II.

[0101] Cercopithecus cephus. Una muestra de hlgado de un C. cephus que murio en un zoologico frances de hepatitis severa se congelo en la necropsia y se mantuvo a -80°C para su posterior estudio. Ningun otro organo, excepto el hlgado, mostro ninguna lesion.

Serologfa

[0102] Se uso MONLISA AgHBs Plus (BIORAD, Marne La Coquette, Francia) para la detection de HBsAg. Tambien se uso VIDAS II HBs Ag Ultra para detectar HBs, as! como ORTHO HBsAg Elisa Test system 3 (Ortho-Clinical Diagnostics, Levallois Perret, F), VIDAS HBCT II para anti-HBc, VIDAS HBST para anti-HBs, VIDAS HBeAg para la deteccion de HBeAg (bioMerieux, Lyon, F).

Deteccion de ADN de VHB mediante reaccion en cadena de la polimerasa e hibridacion de transferencia de Southern

[0103] Se extrajeron acidos nucleicos de 140 ml de suero o de 10 mg de tejido hepatico con kit de extraction QiaAmp respectivamente (Qiagen, Courtaboeuf, F) y kit de purification de ADN y ARN completo puro master (Epicentre, Le Perray, F). Tambien se realizo extraccion con fenol cloroformo mediante un procedimiento descrito en detalle en otro lugar (Jilbert et al., 1992).

[0104] Los cebadores para la amplification por PCR fueron seleccionados de secuencias que solapan el nucleo y el gen de superficie, que estan altamente conservadas entre todos los genotipos de VHB humanos (Gheit et al., 2002). Una region de 118 pb en el gen de superficie se amplifico (sentido: 5'-GGA GTG GGC CTC AGC CCG TTT CTC-3 inverso: 5'-GCC CCC AAT ACC ACA TCA TCC ATA-3'). Una region de 145 pb en el gen de nucleo tambien se amplifico (sentido: 5'-TCG GAG TGT GGA TTC GCA CTC CTC-3'; inverso: 5 'GAT-TGA GAC CTT CCT CCT CTG CGA GGA- 3').

[0105] La especificidad de las bandas amplificadas se confirmo por hibridacion de transferencia Southern utilizando una sonda de ADN de VHB cebada al azar marcada con 32P. Las condiciones de hibridacion fueron de formamida al 50%/SDS al 7%/fosfato de sodio 0,25 M, pH 7,2/NaCl 0,25 M/EDTA 1 mM a 42°C 20 minutos dos veces, seguido de lavados en 2X-0,5X SSC-0,1% de SDS a 65°C 10 minutos.

Aislamiento de ADN del VHB y la cuantificacion de la carga viral mediante PCR en tiempo real

[0106] Se extrajo ADN de VHB de 100 ml de sobrenadante utilizando el kit de acidos nucleicos virales de alta pureza de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Grenoble, Francia). El analisis cuantitativo de la carga viral se realizo mediante PCR en tiempo real (LightCycler, Roche, Grenoble, Francia). Los cebadores se disenaron con el software Oligo5 (MedProbe, Oslo, Noruega) a secuencias de acido nucleico diana dentro del gen C que se conservan entre todos los genotipos de VHB (A-G) conocidos.

[0107] Para cuantificar el ADN del VHB en el suero de pacientes con VHC con VHB oculto, se realizo un ensayo de PCR a tiempo real (Roche Diagnostic Corporation, Mannheim, Alemania) utilizando cebadores (CASB y CSB) que reconocen sitios altamente conservadas en la region del gen C de VHB. El umbral de sensibilidad de este ensayo (10 copias virales/ml) se evaluo de acuerdo con los estandares y se expreso en copias genomicas/ml. Se llevo a cabo una reaccion de PCR utilizando un volumen total de 20 ml incluyendo 10 ml de molde de ADN, 2 ml de mezcla de hibridacion master de ADN Light Cycler (Taq ADN polimerasa, tampon de reaccion, mezcla de dNTP y 10 mM de MgCh), 3,2 ml de MgCl2 25 mM, 0,3 ml cada uno de los cebadores 20 mM. Las muestras se cargaron en capilares desechables, se centrifugaron, y se colocaron en el Light Cycler con el siguiente programa:

1) desnaturalizacion del ADN y activation de la polimerasa FastStart: 95°C durante 10 min. pendiente 20°C/s. 2) 45 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 15 segundos, hibridacion a 58°C durante 5 segundos, y extension a 72°C durante 15 segundos. La velocidad de transition de temperatura programada fue de 20°C/segundo. El seguimiento por PCR a tiempo real se consiguio mediante la medicion de la fluorescencia al final de cada ciclo. 3) Curva de fusion: se genero un solo ciclo de fusion mediante el mantenimiento de la reaccion a 95°C durante 0 segundos, a continuation a 65°C durante 15 segundos, seguido de calentamiento lento a una velocidad de transicion de 0,1°C/s a 95°C. 4) Refrigeration: 40°C durante 30 segundos con una pendiente de 20°C/segundo.

[0108] El seguimiento de la fluorescencia se produjo a intervalos regulares durante la fase de hibridacion y de forma continua durante toda la fase de fusion.

[0109] Para cada desarrollo, se genero una curva estandar en un rango de 5-log (de 10 a 50.000 copias/ml) mediante diluciones en serie del estandar biologico de ADN del VHB en el kit de ADN del VHB Versant (Bayer diagnostics, Puteaux, F). La curva de fusion y el analisis cuantitativo se llevaron a cabo mediante el uso de software de analisis Light Cycler 3.5 siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Meylan, Francia).

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Amplificacion por cfrculo rodante

[0110] El molde de ADN circular se desnaturalizo para convertirse en una sola cadena. Despues de que los cebadores protegidos de exonucleasa se unan al ADN en multiples sitios, se extienden mediante el ADN polimerasa Phi29. A continuacion, la actividad de desplazamiento de la cadena de ADN polimerasa Phi29 hace que la cadena naciente se desplace cuando Phi29 alcanza un cebador extendido en direccion 3'. El alargamiento continuado y el desplazamiento de cadena dan lugar a la ramificacion y la exposicion de nuevos sitios de union para los cebadores. Una cascada de sucesos de iniciacion da lugar a la amplificacion exponencial y genera copias del ADN molde de doble cadena, de alto peso molecular, repetidas en tandem.

[0111] Las cantidades apropiadas de ADN se mezclaron con 9 cebadores modificados con fosforotioato (Tabla 1) a una concentracion de 10 pM cada uno y 1X tampon Phi29 (New England Biolabs, St Quentin en Yvelines, F) en un volumen final de 10 pl. La mezcla de ADN se desnaturalizo a 95°C durante 3 minutos. A continuacion, se enfrio a temperatura ambiente haciendo algunos pasos intermedios, a saber: 50°C durante 15 segundos, 30°C durante 15 segundos y 20°C durante 10 minutos. Para terminar, el producto desnaturalizado se coloco en hielo antes de proceder con la reaccion de RCA.

[0112] Las mezclas de muestras se combinaron con 10 pl de mezcla de reaccion que contenla: 1x tampon de Phi29, los 9 cebadores modificados con fosforotioato a una concentracion de 10 pM cada uno, 0,4 mg/ml de BSA, 2 mM de dNTPs y 1 U/pl de ADN polimerasa Phi29 (New England Biolabs, St Quentin en Yvelines, Francia). Las reacciones se llevaron a cabo a 30°C durante 18 horas y se terminaron a 65°C durante 10 minutos para inactivar la ADN polimerasa Phi29. Los productos RCA son multlmeros de VHB que puede ser digeridos por la enzima de restriccion Spel. Este sitio de restriccion siendo unico dentro del genoma de VHB, se pueden obtener productos de 3200 bp correspondientes a un genoma completo de VHB.

Secuencias y posiciones de los cebadores usados para la RCA.

Nombre

Secuencia (15 nt) Posicion en el genoma de VHB

RCA1

5'-AATCCTCACAATA*C*C-3' 226-240

RCA2

5'-GAT GGGAT GGGAA*T*A-3' 615-601

RCA3

5'-CCTATGGGAGTGG*G*C-3' 637-652

RCA4

5-'GCAACGGGGTAAA*G*G-3' 1154-1140

RCA5

5'-ATGCAACTTTTTC*A*C-3' 1814-1829

RCA6

5'-TCCAAATTCTTTA*T*A-3' 1916-1930

RCA7

5'-TAGAAGAAGAACT*C*C-3' 2374-2389

RCA8

5'-AGAATATGGTGAC*C*C-3' 2820-2834

RCA9

5'-TAAGAGACAGTCA*T*C-3' 3188-3202

Amplificacion por PCR del genoma completo de VHB

[0113] Se amplifico el genoma de VHB de longitud completa mediante el uso de un procedimiento de PCR de una sola etapa utilizando cebadores P1 P2 nar (5'-CCG GAA AGC TTA TGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCC TAA TCA), P2 nar (5'-CCG GAG AGC TCG AGC TCT TCA AAA AGT TGG CAT GGT GCT GG-3') en las condiciones descritas por Gunther et al (1995) y el sistema de PCR de alta fidelidad FastStart (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Los productos de amplificacion se desarrollaron en un gel de agarosa al 1% y se tineron con bromuro de etidio.

Analisis de los productos de PCR y los productos RCA mediante transferencia Southern

[0114] De cinco a diez microlitros de los productos de PCR o 2 pl de productos de RCA se sometieron a electroforesis y transferencia Southern usando una sonda de oligonucleotido de gen S especlfico marcado con 32P-dCTP por la desoxinucleotido transferasa terminal (Roche Diagnostics, Boehringer Mannheim, Meylan, F).

Inmunofluorescencia o IHC en secciones de hfgado para el antfgeno de superficie y el antfgeno del nucleo de VHB

[0115] Secciones de tejido de hlgado congelado de 5 micrometros de espesor se fijaron en acetona durante 10 minutos a -20°C, se bloquearon durante 10 min con PBS-BSA al 3%, y se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente con anticuerpos policlonales de antisuero de conejo producidos contra el antlgeno del nucleo de VHB (dilucion 1/2) (Serotec, Cergy St Christophe, Francia) o con anticuerpos monoclonales de raton producidos contra antlgeno de superficie de la hepatitis Be (dilucion 1 /40) (Dako, Trappes, F). Despues de esta incubacion, los cubreobjetos de vidrio se lavaron en PBS y se marcaron con anticuerpo secundario anti-raton o anti-conejo de cabra conjugado con fluorescelna (1/100) (BIORAD, Marne La Coquette, Francia). Los cubreobjetos de vidrio se tineron con azul de Evans, se montaron y finalmente se examinaron con un microscopio confocal Leica DM RXE. Para los tejidos del hlgado embebidos en parafina, las secciones de hlgado se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en etanol graduado.

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Las actividades de la peroxidasa endogena se bloquearon con peroxido de hidrogeno al 0,3% en metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente antes del marcaje.

Observacion por microscopfa electronica

[0116] Tres mililitros de ADN positivo de VHB y HBsAg de suero de macaco cynomolgus se centrifugaron durante 4 horas a 40.000 rpm, 4°C. Los sedimentos se suspendieron en 500 ml de TNE (Tris pH 7,5 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM) y despues se diluyeron en 20 ml de TNE. Una segunda centrifugacion se realizo a 40.000 rpm durante la noche a 4°C. Los sedimentos que contienen las partlculas virales se resuspendieron en 300 ml de TNE y se conservaron a - 80°C.

[0117] El producto de purificacion se cargo en un gradiente de sacarosa del 10% al 60% y se centrifugo a 100.000 g durante 16 h. Se recogieron veinte fracciones de 0,6 ml y se ensayaron mediante PCR para el ADN de VHB con cebadores situados en el gen S y C de VHB. Las fracciones positivas se cargaron en rejillas revestidas de carbono y se tineron con acido fosfotungstico al 4%, pH 7,2 antes del examen por microscopla electronica (Jeol 100 CX).

Preparacion de hepatocitos de macaco cynomolgus

[0118] Los hepatocitos fueron aislados de M. cynomolgus despues de la anestesia y los hlgados fueron extraldos quirurgicamente. Las celulas se aislaron mediante un procedimiento de perfusion de colagenasa en dos etapas (Gibco, Cergy-Pontoise, Francia) tal como se ha descrito previamente (Guguen-Guillouzo, 1992). Los hepatocitos recien aislados se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1,8x106 celulas viables/cm2. Esta alta densidad es esencial para obtener una supervivencia a largo plazo de hepatocitos primarios (Rumin et al., 1996). La adhesion se realizo durante la noche en un medio de Williams complementado con glutamina (Biomedia, Boussens, F) complementado con 100 Ul/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (Gibco, Cergy Pontoise, F), 5 mg/l de insulina bovina (Sigma), bicarbonato de sodio al 0,35% y suero de ternera fetal inactivado con calor al 10% (FCS) (Gibco Cergy-Pontoise, F). El dla siguiente, el medio se sustituyo por E de William suplementado tal como se describe anteriormente, mas dimetilsulfoxido al 2% (DMSO; Sigma, St Quentin, F), y hemisuccinato de hidrocortisona 5x10-5 M (Upjohn, SERB, Paris, F). Se infectaron las celulas 1 dla despues de la siembra de la siguiente manera. Los cultivos se incubaron durante 20 horas a 37°C en presencia de 100 ml del inoculo y 900 ml de medio fresco por pocillo. Las celulas de control no infectadas se incubaron en medio fresco mas 2% de suero humano normal. Se recogio el sobrenadante de cada cultivo en el dla 1 y las celulas se lavaron cinco veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y a continuacion se mantuvieron en medio de William complementado como antes. Los sobrenadantes de cada cultivo se recogieron a continuacion en los dias 3, 5, 7, 10 y 12, y se analizaron para HBsAg usando Monolisa HBsAg Plus (BIORAD, Marne la Coquette, Francia) y para el ADN de vHb por PCR.

"Pase" in vitro

[0119] Un fragmento de higado de un macaco cynomolgus, positivo de HBsAg y ADN de VHB, se enjuago en PBS antes de la inoculacion y se mezclo usando un homogeneizador Ultra-Turrax T25 (Karayannis et al, 1989). El homogenado se clarifico por centrifugacion a 4°C a 6000 rpm durante 30 min. Los hepatocitos primarios de M. cynomolgus fueron infectados con 100 ml de extracto de higado en PBS (20%, p/v).

"Pase" in vivo

[0120] Se utilizaron dos grupos de M. sylvanus en este experimento (montanas del atlas, Marruecos). Con el fin de estudiar si el VHB detectado en M. cynomolgus era infeccioso a otros macacos, se utilizo 3 M. sylvanus que recibieron un grupo de suero de M. cynomolgus que contenia 103 particulas/ml. En paralelo, se monitorizaron los mismos parametros virales y biologicos en un grupo control de 3 M. sylvanus que no recibieron ningun tratamiento. Los experimentos in vivo se realizaron bajo anestesia general utilizando Imalgene (Merial, Lyon, Francia) que contenia ketamina (1 mg/kg).

Seguimiento de los animales infectados

[0121] El seguimiento de la infeccion se realizo mediante analisis de sangre semanal de M. sylvanus (5 a 10 ml). Las transaminasas fueron controladas, as! como HBsAg y el ADN de VHB mediante cuantificacion con Amplicor/monitor (Roche, Meylan, F) y PCR cualitativo en el gen S y C de VHB.

Secuenciacion

[0122] Los productos de PCR se secuenciaron mediante Genome Express (Meylan, F) usando secuenciacion automatica Biosystem 373 A. Los analisis de secuencias se realizaron utilizando Mac Vector 6.5.1 y la alineacion se realizo usando el programa "BLAST" en el Genbank.

Clonacion

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[0123] Los productos de PCR (genomas subgenomicos o completos de VHB) se purificaron usando "kit de purificacion Qiaquick PCR" (Qiagen, Courtaboeuf, Francia). En todos los casos, se ligaron 25 ng de ADN plasmido con el inserto en una relacion en exceso de 1 a 3 en comparacion con el vector con ADN ligasa de T4 en un tampon de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, BSA al 3% que contenla DTT 1 mM, ATP 0,1 mM. La ligacion se realizo durante 16 horas a 16°C.

Transformacion

[0124] El plasmido que contenla el producto de PCR se introdujo en bacterias quimiocompetentes con inserto pCAP Le plasmide (de Escherichia coli M15) siguiendo las instrucciones del kit (Promega, Lyon, Francia). La extraccion del plasmido se realizo siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

Transfeccion de amplicon en celulas Huh7

[0125] El genoma completo de VHB generado por PCR se purifico usando "kit de purificacion Qiaquick PCR" (Qiagen, Courataboeuf, F) y se digirio durante 20 horas con Narl (Promega, Lyon, Francia). Por lo tanto, el ADN se diluyo a una concentracion final de 0,25 pg/pl. Las celulas Huh7 se cultivaron en un matraz de 25 cm2 que contenla 1300000 celulas por matraz. La transfeccion se realizo utilizando Fugen siguiendo el protocolo de Roche Applied (Meylan, Francia) 24 horas despues del comienzo del cultivo. Las celulas HuH7 se recogieron y se mantuvieron en un medio que contenla 500 ml de DMEM/HamF12, 50 ml de SVF, 10 ml de glutamina (200 mM), 5 ml de HEPES (1M), 2,5 ml de penicilina/estreptomicina y 2,5 ml de piruvato sodico. Despues de 60 horas, las celulas se tripsinaron y se resuspendieron en medio de cultivo de cultivo concentrado dos veces con ADNasa I y se incubaron durante 45 minutos a 37°C. Despues de la granulacion, las celulas se resuspendieron en medio de cultivo y se distribuyeron en 96 pocillos recubiertos de colageno. Por lo tanto, los cultivos de celulas se trataron durante 4 dlas con varios medicamentos antivirales (lamivudina y adefovir). Cuatro dlas despues de haber lavado las celulas de tratamiento con PS y se anadieron 50 pl de tampon de extraccion (Tris 25 mM, CaCl2 0,5 mM, MgCh 2,5 mM, pH 8, 0,4 mg/ml de ADNasa, 0,4 mg/ml de ARNasa, NP40 al 1%). Las celulas se incubaron durante 1 hora a 37°C bajo agitacion, a continuacion se anadieron 15 pl de NaOH 0,4 M y la incubacion duro 1 hora adicional a 37°C. La alcalinizacion se detuvo con 15 pl de tris 1 M (pH 7). 5 pl de ADN extraldo se utilizo para la cuantificacion de ADN de VHB mediante PCR en tiempo real.

RESULTADOS

Aislamiento VHB en macacos cynomolgus (Figura 2)

[0126] Se incluyeron muestras biologicas de un total de 50 macacos cynomolgus en el estudio (hlgado y suero). La PCR subgenomica (ver Tablas 2 y 3 para secuencias de los cebadores) y la deteccion de HBsAg usando la prueba de Ortho Diagnostic permitieron identificar marcadores del VHB entre el 42% (21/50) de los animales probados. La PCR cuantitativa por Amplicor/monitor (Roche) y la PCR Light Cycler indicaron las cargas virales del VHB entre macacos que iban de 102 a 104 copias de aDn de VHb por ml de suero. La PCR Light Cycler para la deteccion de ADN del VHB de 10 ng de ADN total extraldo de hlgado dio una estimacion de 0,2 a 102 copias de VHB por hepatocito.

Tabla 2: cebadores directos

Secuencias 5'-3'______________________________________________________

L1: 5' - TCC TGC TGG TGG GCT CCA GTT CA - 3'

Pol1 : 5' - CCT GCT GGT GGC TCC AGT TC - 3'

Pol4: 5' - CTC ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC T - 3'

Pol3: 5' - CAA GGT ATG TTG CCC GTTT GTC L2: 5' - CCT GTA TTC CCA TCC CAT C - 3'

Fw S: 5' - GGA GTG GGC CTC AGC CCG TTT CTC -3'

E1: 5' - TAA AAC AAT GCA TGA ACC TTT ACC CCG TTG C - 3'

Por5: 5' - CAA GTG TTT GCT GAC GCA - 3'

R5: 5' - AAG TGT TTG CTG ACG CAA CC - 3'

P197: 5' - CCA TAC TGC GGA ACT CCT - 3'

B1: 5' - GGC AGC ACA SCC TAG CAG CCA TGG - 3'

C1: 5' - ACM TCS TTT CCA TGG CTG CTA GG - 3'

68: 5' - CAT AAG AGG ACT CTT GGA TC - 3'

A3: 5' - TGC GCA CCG CGG CCG CGC AAC TTT TTC ACT CTG CC - 3'

P'1: 5'-TTT TTC ACC TCT GCCTAATCAT- 3'

P1: 5' - CCC GAA AGC TTA TGC TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT C - 3' C2: 5' - CCT TCC GTC AGA GAT CTC C - 3'

Fw C: 5' - TCG GAG TGT GGA TTC GCA CTC CTC - 3'

TP2: 5' - ACC ACC AAA TGC CCC TAT CTT A - 3'

C3: 5'-CCT ATC TTA TCA ACA CTT CC - 3'

posicion genomica

55-76

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230-254

455-476

597-615

645-668

1134-1154

1178- 1197

1179- 1200 1268-1287 1372-1386 1363-1386 1653-1672 1817-1843 1821-1841 1824-1843 1973-1992 2267-2290 2299-2320 2314-2333

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PS1: 5' - GGG TCA CCA TAT TCTT GGG AA - 3'

PS4: 5'-GGA ACA AGA GCT ACA GCA TG - 3'

TPR 1: 5'-TCG GGA AAG AAT CCC AGA GGA TTG G - 3' Fw TPR 2: 5' - TGG GGT GGA GCC CTC AGG C - 3'

2830-2850

2833-2852

2909-2923

3077-3095

Tabla 3: cebadores inversos

Secuencias 5'-3'______________________________________________________

R3: 5' - GGC TCA GTT TAC TAG TGC CAT TTG T - 3'

Rev S: 5' - GCC CCC AAT ACC ACA TCA TCC ATA - 3'

Por4: 5' - TAC CCA AAG ACA AAA GAA AAT TGG - 3'

RV5: 5' - AAG TGT TTG CTG ACG CAA CC - 3'

P198: 5' - TTT TGC TCG CAG CCG GTC TG - 3'

P2: 5' - CCG GAG AGC TCA TGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG - 3'

P201: 5' - ATT AGG CAG AGG TGA AAA AG - 3'

P'2: 5'-ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA A - 3'

67: 5' - GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CC - 3'

D2: 5' - CTA AGG GTC GAC GAT ACA GAG GTC AGG CG - 3'

C6: 5'- AAG AAC TCC CTC GCC TCG - 3'

Rev C: 5' - GAT GAC TGA CTT CCT CCT CTG CGA GGA - 3'

C7: 5' - GGG GCT TTA TTC CTC TAC AGT ACC T- 3'

Ps5: 5'-GGT TGA AGT CCC AAT CTG GAT - 3'

Rev TPR 2: 5 'GCC TGA GGG CTC CAC CCC A - 3'

posicion genomica

693-669

763-739

828-805

1197-1178

1295-1394

1823-1803

1841- 1822

1842- 1821 1959-1937 2016-2000 2397-2380 2412-2388 2516-2492 2992-2972 3095-3077

[0127] Para obtener la secuencia completa de VHB circulante en macacos cynomolgus se realizo la amplification del VHB completo usando el procedimiento descrito por Gunther (1995) utilizando los cebadores P1 nar y P2 nar en extractos de ADN de hlgado de los animales de 4 animales (38, 40, BL13 y BL14).

[0128] BL13 y BL14 fueron macacos sylvanus infectados con el VHB de macacos cynomolgus. Hemos sido capaces de amplificar amplicones de 3200 pb, que se hibridan con una sonda de ADN del VHB despues de transferencia de Southern (Figura 3). La secuenciacion se realizo directamente sobre el amplicon sin donation.

Analisis de secuencias

[0129] La secuencia del VHB amplificado a parti r de tejido hepatico de 38 macacos cynomolgus analizada por BLAST permitio establecer que esta secuencia esta proxima al genotipo D de VHB. La longitud total es de 3182 pb. Se observo una deletion de 33 pb de la region preS1 del nucleotido 1905 y 1938. Esta deletion se observa entre todos los genomas de VHB no humanos, pero tambien en el genotipo D de VHB.

[0130] Las sustituciones de nucleotidos observadas no modifican los marcos de lectura abierta de VHB.

[0131] El analisis en el Genbank mostro que el VHB aislado de M. cynomolgus esta muy proximo a una secuencia de VHB de genotipo D que circula entre IVDU Europea (U 95551/gi 2182117) (Figura 4). Se observaron sustituciones menores en comparacion con la secuencia ya descrita. La arginina en la posicion 122 y la lisina en la posicion 160 clasificaron este genoma de VHB como subtipo ayw3. El analisis filogenetico de las secuencias del gen S confirmo la clasificacion de la protelna S entre el genotipo D. El marco de lectura abierto de la polimerasa viral abarca todo el gen S, parte del gen X y el extremo terminal C del gen de nucleo (48aa). La protelna codificada de la polimerasa viral es identica al genotipo D de VHB/ayw3. Se identificaron una sustitucion de una guanina a adenina en la posicion 1479 (dentro de la protelna X) y una sustitucion de prolina a serina en la posicion 67 (dentro de la protelna preS1). La sustitucion G1479A no conduce a ninguna perdida de funcion o expresion de la protelna X. Se aislo la misma secuencia de VHB con 100% de homologla de BL14, un macaco sylvanus inoculado con un grupo de suero de M cynomolgus, positivo de VHB de Isla Mauricio.

[0132] Los genomas completos de VHB o amplicones subgenomicos se han clonado y se han analizado un numero de secuencias para confirmar los resultados obtenidos. Se produjeron las secuencias recien generados que cubren 3/4 del genoma de VHB y coincidio con la secuencia obtenida directamente.

Cuantificacion del VHB en ambos modelos

[0133] Para macacos cynomolgus para los cuales el suero estaba disponible la prueba de Monitor amplicor (Roche) permitio estimar la carga viral en un rango entre 102 a 104 copias/ml.

[0134] La PCR Light cycler realizada en extractos de hlgado permitio estimar el numero de copias de VHB en el Cercopitheque cephus sobre 1000 por mg de hlgado, que es mil veces mayor en comparacion con el macaco cynomolgus. En el modelo Cercopitheque se pudo detectar CCCDNA por PCR (Werle et al, 2002). La transferencia

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de puntos realizada en extractos de hlgado de ambas especies fue lo suficientemente sensible para estimar la cantidad de ADN de VHB presente en los animales infectados.

Expresion de protefnas de VHB en el hfgado de C. cephus y M cynomolgus

[0135] El estudio histologico despues de la tincion con Hematoxilina/eosina mostro lesiones de hepatitis severa en el C cephus, mientras que ninguno de los macacos infectados cronicamente mostro lesiones hepaticas. La tincion por IF o IHC revelo una fuerte expresion de HBsAg en aproximadamente el 30% de los hepatocitos (Figura 5). HBcAg tambien fue detectado en el 10% de los hepatocitos.

Infectividad del VHB aislado en M. cynomolgus

Infeccion in vivo de macaco sylvanus por un grupo de macacos cynomolgus, positivo en ADN del VHB, positivo en HBsAg

[0136] Se purificaron partlculas vlricas de VHB por ultracentrifugacion (10X concentracion) de suero macaco cynomolgus (HBsAg y ADN del VHB positivos). El material concentrado se cargo despues en un gradiente de sacarosa del 10% al 60% y se centrifugo. Se recogieron veinte fracciones de 0,6 ml y se ensayaron a continuacion por PCR en los genes S y C de VHB. Las fracciones 12 y 14 que corresponden respectivamente al 42,5% y 48% de sacarosa fueron positivas en PCR (Figura 6).

[0137] Se observaron fracciones positivas mediante microscopla electronica (Figura 7). En las fracciones 12 y 14 se pudieron observar partlculas cuya forma y tamano pueden corresponder a partlculas de Dane (Figura 7). En la fraccion 4 (22,5% de sacarosa) se pudieron observar esferas que pueden corresponder a las esferas de 20 nm descritas durante infecciones por VHB.

Infeccion de macaco sylvanus por partlculas de VHB de M cynomolgus.

[0138] La infeccion por VHB productiva se obtuvo en macaco sylvanus despues de la infeccion con un grupo de macacos cynomolgus, como se controla mediante marcadores de la infeccion por VHB (Figuras 8 y 9). Se detectaron secuencias virales despues de la infeccion durante al menos 9 semanas en 3/3 animales infectados. El inoculo de 1 ml contenla una concentracion de 103 copias por ml, 9 semanas despues de la infeccion, se pudo estimar, por ejemplo, para el animal BL14, que la carga viral era de 104 copias por ml. Se midio un pico de transaminasas (aproximadamente 250 U/L) en la novena semana despues de la infeccion en BL12 M. sylvanus y en la tercera semana en BL13 y 14 de M. sylvanus. El examen histologico en la necropsia (32 semanas) mostro lesiones similares a las observadas despues de la hepatitis aguda en humanos (infiltrado de linfocitos, hepatocitos aclarados, modification de la estructura de parenquima). No se observo ninguna modificacion en los animales no infectados.

[0139] La detection de HBsAg que aparece en la cuarta a la novena semana despues de la infeccion sugieren una replication del VHB activo despues de infection. HBsAg y HcAg se detectaron por inmunofluorescencia tal como se ilustra en la Figura 10.

Infeccion in vitro de un cultivo primario de hepatocitos de M. cynomolgus con el VHB aislado de macaco cynomolgus procedente del mismo aislado.

[0140] Con el fin de estudiar la propiedad infecciosa del virus de VHB aislado, se incubaron hepatocitos primarios de M. cynomolgus en cultivo con extracto de hlgado de un M. cynomolgus con VHB positivo. Se detectaron secuencias virales de VHB en el sobrenadante celular despues de la infeccion e intracelularmente (Figura 11).

[0141] Tambien se controlo HBsAg en el sobrenadante de los hepatocitos primarios infectados despues de la infeccion tal como se ilustra (Figura 12). Se realizo un segundo pase en cultivo primario de hepatocitos de M cynomolgus con exito utilizando el sobrenadante positivo en ADN del VHB, HBsAg de las celulas infectadas.

Establecimiento de un modelo de macaco de la infeccion por VHB

[0142] Son posibles dos enfoques diferentes para el desarrollo de un modelo de macaco de la infeccion por VHB.

[0143] Un primer enfoque se basa en la production in vitro de partlculas infecciosas. Se utilizan aislados de Cercopithecidae con VHB descritos anteriormente, con un diseno de partlcula como una unidad de genoma 1,1 en un plasmido o un baculovirus, en paralelo con una cepa de VHB humano (genotipo D). Estas construcciones son evaluadas por su capacidad de replicacion e infectividad en llneas celulares de hepatoma susceptibles (por ejemplo HepaRG) y en hepatocitos de macaco (por ejemplo, hepatocitos de macaco primarios). Las construcciones que mostraron ser infecciosas se inyectan a macacos por inyeccion intravenosa en serie de las partlculas de VHB producidas in vitro, infectando de este modo los macacos.

[0144] Un segundo enfoque se basa en el uso de partlculas de infeccion para la transfection intrahepatica, obteniendo

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de este modo VHB simio infeccioso para la infeccion de macaco de novo.

[0145] En ambos enfoques, se monitoriza la aparicion de marcadores de VHB para la infeccion. Se lleva a cabo durante dos meses el seguimiento de los macacos transfectados intrahepaticos con los clones de aislados de VHB simio, as! como con el VHB humano. Las muestras de suero se analizan una vez a la semana con el fin de detectar antlgenos HBs y HBe por ELISA y con el fin de determinar la carga viral por PCR cuantitativa. Las biopsias tambien se llevan a cabo con el fin de identificar intermedios replicativos virales, antlgenos virales y lesiones hepaticas. Las muestras de suero en el pico de viremia se utilizan para infectar macacos, que se estudian en una manera similar. Los animales transfectados e infectados tambien se analizan por los marcadores serologicos de infeccion despues de seis meses, y se lleva a cabo un examen histopatologico del hlgado.

Seguimiento de la infeccion por VHB de macacos Sylvanus despues de la inoculacion del grupo de partfculas de VHB de macacos cynomolgus o un grupo de partfculas de VHB de los seres humanos

[0146] Se inocularon por via intravenosa un grupo de 3 macacos sylvanus (BL 01, 03, 04) con un grupo de sueros humanos altamente viremicos (109 copias/ml) y la infeccion se monitorizo mediante la medicion de los tltulos de AgHBs y transaminasas. Los virus de VHB del grupo son VHB de genotipo D y la secuenciacion de la secuencia de VHB demuestra que el nucleotido en la posicion 1479 es una guanina.

[0147] Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 13.

[0148] Esta figura ilustra para cada uno de macacos Sylvanus BL 01, BL 03 y BL 04 el cambio en los tltulos de AgHBs (panel izquierdo) y los tltulos de las transaminasas (panel derecho) durante los dlas siguientes a la inoculacion de VHB.

[0149] Esta figura muestra un pico de AgHBs justo despues de la inoculacion de partlculas de VHB seguido por una disminucion continua de tltulos de AgHBs hasta que AgHBs ya no puede ser detectado despues de aproximadamente 3 semanas despues de la infeccion. Se observo un pico de transaminasas (llegando a 292 U/L) en los 3 animales despues de la desaparicion de HBsAg.

[0150] Una senal de PCR debil para el ADN de VHB fue detectable durante 32 semanas (genes S y C) (datos no mostrados).

[0151] Este patron es tlpico de un aclarado de las partlculas de VHB inoculadas originalmente (sueros de VHB humano inoculo por via intravenosa a macacos sylvanus conducen a un perfil de desaparicion del inoculo sin replication "de novo") y sugiere que el VHB de sueros humanos no puede desencadenar una infeccion productiva, es decir, virus de sueros humanos son incapaces de replicarse de manera eficiente.

[0152] Estos resultados confirman un estudio realizado por Lazizi et al. 1993, que tambien mostro la falta de sensibilidad a la infeccion de una especie macaco estrechamente relacionada (Macaca Mulata) por inoculacion intravenosa del virus. En este estudio, HBsAg y HBeAg fueron detectables durante 3 y 2 semanas, respectivamente, y las secuencias virales fueron detectables durante 3 meses, lo que demuestra un secuestro de partlculas virales despues de la inoculacion. En el momento del sacrificio, 9 meses despues de la infeccion, las secciones de hlgado fueron negativos para la tincion de HBs y HBc.

[0153] Se inocularon por via intravenosa un grupo de 3 macacos (BL 12, 13, 14) con un ml de un grupo de sueros de macacos Cynomolgus infectados de forma natural por VHB, comprendiendo dicho grupo de sueros 103 copias de VHB/ml. La secuencia genomica de partlculas de vHb del grupo de sueros se muestra en la SEQ ID NO: 1 (el grupo de sueros provenla de Macacos Cynomolgus que fueron identificados anteriormente como infectados de forma natural por partlculas de VHB que tienen un genoma de la SEQ ID NO: 1).

[0154] Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 14.

[0155] Esta figura ilustra para cada uno de los macacos Sylvanus BL 12, BL 13 y BL 14 el cambio en los tltulos de AgHBs (panel izquierdo) y tltulos de transaminasas (panel derecho) en los dlas siguientes a la inoculacion de VHB.

[0156] Esta figura muestra un pico de AgHBs justo despues de la inoculacion de partlculas de VHB seguido por una disminucion continua de tltulos de AgHBs hasta que AgHBs ya no puede ser detectado despues de aproximadamente 3 semanas despues de la infeccion. Se observo un pico de transaminasas (llegando a 292 U/L) en los 3 animales despues de la desaparicion de HBsAg.

[0157] Despues de la inoculacion con el grupo de sueros de macacos cynomolgus que comprendla solo 103 copias de VHB/ml, se detecto HBsAg en puntos de tiempo individuales (4 o 7 semanas despues de la inoculacion), que es indicativo de la production "de novo" de HBsAg despues de la infeccion. Se observo un pico de transaminasas (250 U/L) despues de 9 semanas para BL12 y la tercera semana para BL13 y BL14. Nueve meses despues de la infeccion, la tincion de HBsAg y HBcAg fue positiva en secciones de hlgado de los animales.

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[0158] Ademas, las secuencias de ADN virales fueron detectadas por PCR que reconoclan los genes S y C de VHB durante todo el seguimiento. Despues de 9 semanas, el ADN del VHB se cuantifico usando un ensayo comercial (Amplicor Monitor) en el M. sylvanus BL14 que dio un tltulo de 1x103 copias/ml. Este tltulo no es insignificante en comparacion con el inoculo que contenla 103 copias, y se confirma una production "de novo" de nuevas secuencias genomicas.

[0159] En general, los resultados demuestran que un grupo de sueros que comprende tan pocas como 103 copias de VHB con una secuencia genomica de SEQ ID NO: 1 es capaz de iniciar una infection productiva en macacos sylvanus, mientras que un grupo de sueros humanos altamente viremicos que comprende 109 copias de VHB de genotipo D no pueden desencadenar la infeccion en macacos sylvanus. Ademas, estos resultados ponen de manifiesto que el VHB con la secuencia genomica de SEQ ID NO: 1 esta particularmente bien adaptado para infectar macacos, en particular macacos cynomolgus y macacos sylvanus.

[0160] Tambien se realizo la inoculation directa de ADN de VHB SEQ ID NO: 1 en el hlgado de macacos sylvanus y se demostro que inducla una infeccion (es decir, se observo un perfil tlpico de infeccion con persistencia de HBsAg (incluso si esporadica), incremento de ADN de VHB y persistencia de marcadores en el momento del sacrificio (9 meses despues de la inoculacion) tal como se demuestra por i) la presencia de ADN del VHB en el hlgado detectado por PCR, y ii) HBsAg y HBcAg detectable por inmunofluorescencia en secciones de hlgado).

[0161] En conjunto, estos experimentos proporcionan evidencia de que partlculas de VHB humanos o ADN del VHB humano no son infecciosos para los macacos en ausencia de mutaciones de adaptation y que el ADN de VHB de la SEQ ID NO: 1 esta ajustado para infectar macacos.

REFEREENCIAS

[0162]

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- Will, H., Kuhn, C., Cattaneo, R. and Schaller, H. (1982b). "Structure and function of the hepatitis B virus genome".

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Princess Takamatsu Symp. 12. 237-47.

- Wright et al., 1993

LISTADO DE SECUENCIAS

[0163]

<110> INSTITUT NOTIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE <120> Un nuevo modelo primate no humano de VHB <130> BET11P0276 <160> 51

<170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 3182 <212>ADN

<213> virus de la hepatitis B <400> 1

Claims (19)

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   REIVINDICACIONES

   1. Utilizacion de una cepa de VHB aislada de un genotipo D humano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 para infectar un macaco de la subfamilia Cercopithecinae para producir un modelo primate para la enfermedad del VHB humano.
2. 2. Utilizacion de un macaco aislado de la subfamilia Cercopithecinae, preferiblemente de la especie Macaca sylvanus o Macaca cynomolgus, para generar un modelo primate para la enfermedad del VHB humano, en la que dicho macaco esta infectado con una cepa de VHB de un genotipo D humano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.
3. 3. Utilizacion, segun la reivindicacion 1 o 2, teniendo dicho modelo primate una carga viral de VHB en el suero comprendida entre 102 y 108 copias genomicas/ml.
4. 4. Modelo animal primate para la enfermedad del VHB humano, en el que dicho primate es un macaco de la subfamilia Cercopithecinae, preferiblemente de la especie Macaca sylvanus o Macaca cynomolgus, infectado con una cepa de VHB de un genotipo D humano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.
5. 5. Modelo animal primate, segun la reivindicacion 4, que es infectado artificialmente con una cepa de VHB aislada de un genotipo D humano, en el que dicha cepa de VHB comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.
6. 6. Modelo animal primate, segun la reivindicacion 4 o 5, teniendo dicho modelo primate una carga viral de VHB en el suero comprendida entre 102 y 108 copias genomicas/ml.
7. 7. Procedimiento para proporcionar un modelo primate para la enfermedad de VHB humana, que comprende las siguientes etapas que consisten en:

   - aislar un macaco de la subfamilia Cercopithecinae;

   - infectar dicho primate con una cepa de VHB aislada de un genotipo D humano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1;

   - ensayar una carga viral de al menos 102 copias genomicas de VHB/ml.
8. 8. Procedimiento para evaluar un agente terapeutico, segun el cual, un modelo animal, segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, es administrado con dosis definidas, en una dosis o en dosis repetidas y a intervalos especlficos de tiempo, de un agente terapeutico, se toman muestras biologicas antes y a intervalos de tiempo definidos despues de la administracion de dicho agente terapeutico y se llevan a cabo y se comparan mediciones cualitativas y cuantitativas de las protelnas virales de VHB en dichas muestras biologicas.
9. 9. Procedimiento para evaluar una vacuna para prevenir una reaccion patologica a una infeccion por VHB, segun el cual:

   - se administra un macaco con dosis definidas, en una dosis o en dosis repetidas y a intervalos especlficos de tiempo, de una vacuna,

   - se infecta artificialmente dicho macaco con una cepa de VHB aislada de un genotipo D humano que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1,

   - se toman muestras biologicas antes y a intervalos de tiempo definidos despues de la infeccion, y

   - se llevan a cabo y se comparan mediciones cualitativas y cuantitativas de protelnas virales de VHB en dichas muestras biologicas.

   imagen1

   Polymerase: Polimerasa HBV: VHB DNA: ADN RNA: ARN CORE: NUCLEO

   pregenomic-RNA: ARN pregenomico

   Figura 1

   imagen2

   Macaco

   Macaco

   Extraccion de acido nucleico del higado

   Inmunohistoquimica

   expresion de HBcAg y HBsAg

   Amplificacion del genoma completa de VHB

   nfecciones

   Clonacion

   Secuenciacion

   PCR subgenomica

   Secuenciacion directa

   Seguimiento de marcadores de infeccion de VHB

   imagen3

   Figura 3

   imagen4

   imagen5

   chimpance (AJ131587)
10. 0.035

    chimpance (DQG220)
11. 0.032

    genotipo B (DQ0330)

    genotipo B(D00331)

    genotipo A (M57S83)
12. 0.032

    genotipo A (X02763)

    genotipo C(M12906)

    m.005

    genotipo C (X52939)

    Macaco cynomolgus
13. 0.037

    0, )07

    genotipo D (X02498)
14. 0.01 s

    0:000

    010

    genotipo D
15. 0.009 ^

    genotipo

    genotipo E (X75664)

    genotipo
16. 0.014
17. 0.051

    genotipo
18. 0.011

    o.noa

    Mono lanudo

    0:194

    Gibon 1
19. 0.043

    O.U 2

    O.U

    Figura 4

    imagen6

    Figura 5

    22,5% 42,5% 48%

    imagen7

    Figura 6

    imagen8

    Semanas despues de

    liiii

    Mil

    a infeccion

    Figura 9

    BL12

    CO

    imagen9

    T TBs As Anti-I fee

    PCR

    ALT

    BL13

    imagen10

    0

    2 4 6

    Semanas despues de la infeccion

    8

    ------------------------------+

    10

    Figura 8

    imagen11

    imagen12

    imagen13

    imagen14

    imagen15

    imagen16

    Actividad de transaminasas en suero

    BL13.

    imagen17

    BL13.

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