ES2640979T3 - Formulaciones de células viables para administración oral - Google Patents

Abstract

Una formulación sólida que comprende células bacterianas viables secadas y un agente de unión a bilis para su uso en un método de inmunoterapia que comprende la administración oral de dicha formulación a un individuo que lo necesita, en la que el agente de unión a bilis es colestiramina y las células bacterianas viables son células de vacuna bacteriana.

Description

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DESCRIPCION

Formulaciones de celulas viables para administracion oral

La presente invention se refiere a formulaciones para la administracion oral de celulas de vacunas bacterianas viables.

Actualmente, la administracion oral de bacterias vivas se utiliza en dos tipos principales de aplicacion terapeutica. En primer lugar, las cepas de bacterias entericas sin modificar identificadas a partir de aislados del contenido intestinal tienen interes terapeutico en la re-colonizacion del intestino tras el tratamiento con antibiotico [1], para aliviar los slntomas de quienes padecen enfermedad intestinal inflamatoria [2] y tambien, en formas obtenidas por ingenierla genetica, para la administracion de terapias biologicas (p.ej., IL-10 [3]. En segundo lugar, las bacterias vivas son un atractivo candidato como vacuna. Actualmente, se esta desarrollando una serie de pruebas cllnicas humanas para analizar diversas cepas de bacterias vivas atenuadas de protection contra enfermedades como colera, E. coli enterotoxico y fiebre tifoidea ([4]). Las vacunas bacterianas vivas tienen la ventaja con respecto a las vacunas convencionales de poderse administrar por via oral, evitando el uso de inyecciones y agujas. Las vacunas bacterianas vivas obtenidas por ingenierla genetica tambien pueden llevar ADN heterologo o antlgenos de patogenos o tumores para estimular o cebar una respuesta inmune contra patogenos o celulas tumorales.

Para la administracion de bacterias vivas estas se suelen secar por razones de estabilidad. La alternativa a la formulation seca para administrar bacterias vivas es un formato “humedo”, p.ej., un producto alimentario como yogur. La bacteria viva presenta problemas de estabilidad significativos en formas llquidas, incluso con la refrigeracion.

Se ha propuesto una serie de sistemas de micro-encapsulation para administracion oral de bacterias [5], pero todos ellos adolecen del mismo problema de degradation de la bacteria durante el almacenamiento de las bacterias y la necesidad de una costosa refrigeration para reducir su degradacion.

Se conocen diversas tecnicas para producir bacterias secadas dentro de la tecnica. La mas extendida es el liofilizado convencional. Por otra parte, ultimamente se esta poniendo el punto de mira en el uso de disacaridos como trehalosa y sacarosa, que estabilizan las biomoleculas y hacen mas estables las bacterias secadas a temperatura ambiente [6], [7]. Las bacterias secadas estabilizadas con disacaridos, por ejemplo, pueden almacenarse adecuadamente a temperatura ambiente.

Actualmente, se estan administrando las bacterias vivas secadas por via oral en dos formatos habituales: capsulas entericas de bacterias liofilizadas y sobrecitos de bacterias liofilizadas para su re-suspension en tampon bicarbonato. Frecuentemente, se administran dosis muy altas de bacterias y son necesarias varias dosis para obtener tan solo un efecto moderado. Curiosamente, los datos cllnicos indican que la formulacion de la capsula enterica es significativamente menos eficaz que el sistema de tampon bicarbonato [8][15], si bien se desconoce en gran medida el motivo por el que las capsulas entericas son relativamente ineficaces.

Se desconoce en gran medida el mecanismo de action del sistema de tampon de bicarbonato. Probablemente la cantidad de tampon bicarbonato tragada no absorba el acido segregado en el estomago, de manera que parece probable que las bacterias administradas de esta forma encuentren cierta acidez. A pesar de estas posibles limitaciones, la co-administration con tampon bicarbonato o un tampon similar que neutralice el acido es el modo de administracion convencional hoy en dla en las pruebas cllnicas humanas de cepas de vacunas en desarrollo contra enfermedades como el colera [9] y E. coli enterotoxico [10].

El estomago tiene la capacidad de segregar acido clorhldrico y reducir el contenido a un pH por debajo de 1. Son pocas las bacterias que pueden sobrevivir a este pH [11] y se ha demostrado que las bacterias vivas secadas son incluso mas sensibles que las bacterias de cultivos frescos [12]. Se puede utilizar un revestimiento “enterico” para evitar la inactivation de las formulaciones de bacterias vivas en acido gastrico. Un revestimiento enterico es una capa de pollmero que no se disuelve en condiciones acidas, pero si se disuelve en el intestino tras la evacuation del estomago liberando las bacterias secas hacia intestino delgado superior. Tal como se ha senalado, las capsulas entericas de una vacuna bacteriana viva que existen son relativamente ineficaces pese a su capacidad para proteger las bacterias del acido del estomago [8].

El intestino contiene una mezcla compleja de enzimas y otros agentes microbicidas. La bilis es segregada al duodeno desde la vejiga biliar. La bilis comprende generalmente al menos un 50 % de acidos biliares que actuan como detergentes para disolver y digerir los componentes de alimentos grasos. Los acidos biliares son tambien potentes para eliminar bacterias. Las cepas bacterianas que residen normalmente en emplazamientos intestinales, como Salmonella spp., han desarrollado mecanismos de resistencia a detergentes como sales biliares, dando cabida a su supervivencia y crecimiento en el intestino.

Por lo general, las bacterias pierden su resistencia a los acidos biliares tras el secado o congelado. Las bacterias secadas que se liberan al intestino desde una formulacion enterica son sensibles a los acidos biliares y no

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sobreviven en el entorno intestinal [12].

Se ha notificado el uso de formulaciones que comprenden un primer inmunogeno y uno o mas segundos inmunogenos para administrar el primer inmunogeno en emplazamientos en particular dentro del tracto gastrointestinal [18].

La presente invencion se refiere al hallazgo de que la incorporacion de cantidades reducidas de un agente de union a la bilis en las formulaciones de celulas viables secadas aumenta de forma significativa la supervivencia de las celulas en el tracto intestinal. De acuerdo con la invencion, el agente de union a la bilis es colestiramina, y las celulas viables secadas viables son celulas para vacuna bacteriana viables secadas. Esto se aplica para el resto de la memoria descriptiva, siempre que se haga referencia a la invencion. Estas formulaciones, por tanto, pueden ser utiles para la administracion oral de celulas de vacuna bacteriana vivas al intestino. Un primer aspecto de la invencion proporciona una formulacion solida que comprende celulas de vacuna bacteriana viables secadas y un agente de union a bilis que es colestiramina para su uso en un metodo de inmunoterapia, tal como se expone en la reivindicacion 1. Un segundo aspecto de la invencion proporciona un metodo para producir la formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, comprendiendo dicho metodo las etapas de acuerdo con la reivindicacion 12.

El agente de union a bilis permite que los llquidos acuosos impregnen la formulacion pero absorbe los acidos biliares y retarda su permeacion a traves de la formulacion. Esto protege a las celulas viables secadas de la toxicidad del acido biliar hasta que se rehidratan con el llquido acuoso permeante y recuperan su tolerancia a la bilis. Esto puede aumentar la eficacia de administracion de las celulas en el intestino, por ejemplo. Las celulas viables secadas pueden ser celulas microbianas. Las bacterias entericas son muy conocidas dentro de la tecnica e incluyen patogenos y especies que no son patogenos, como por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus spp, y tambien Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Pseudomonas, Ruminococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Campylobacter y Streptococcus spp.

La administracion de celulas bacterianas entericas al intestino puede ser util, por ejemplo, para restaurar la flora intestinal de un paciente, p.ej., tras un tratamiento con antibioticos, y para aliviar los slntomas de pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria. Las celulas microbianas viables secadas pueden ser celulas eucariotas, como por ejemplo, celulas de levadura o de hongos, como Saccharomyces, Aspergillus spp o Candida spp. La administracion de celulas microbianas con propiedades enzimaticas especlficas uy otras propiedades en el intestino puede ser util por ejemplo, en la descomposicion o metabolismo de compuestos o toxinas asociados a enfermedad, como oxalato, que constituye un factor de riesgo para la formacion de calculos renales, o para reducir los niveles de colesterol, al influir en la absorcion intestinal. Las celulas microbianas pueden expresar un factor terapeutico, como protelna recombinante. Los polipeptidos recombinantes adecuados pueden ser exogenos a la celula bacteriana (es decir, un polipeptido expresado de forma no natural por la celula bacteriana, como por ejemplo un polipeptido humano) y pueden tener un efecto terapeutico sobre el paciente. Entre los polipeptidos recombinantes adecuados se incluyen citoquinas, incluyendo interleuquinas como IL-10; quimioquinas; y anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o moleculas de union relacionadas que se unen a mediadores de la respuesta inmune, tales como citoquinas (p.ej., para neutralizar FNT-alfa en enfermedades inflamatorias intestinales).

Entre las celulas microbianas adecuadas para la expresion de polipeptidos recombinantes se incluyen celulas de especies bacterianas de acido lactico, p.ej., Lactococci como L. lactis (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2005) 60:349), Enterobacteriaceae y otras bacterias entericas como las descritas anteriormente y otras celulas microbianas como levaduras y hongos, como por ejemplo Saccharomyces o Candida spp.

En la invencion, las celulas viables secadas son celulas de una vacuna bacteriana viva. Las vacunas bacterianas vivas son por lo general celulas bacterianas cuya virulencia ha sido atenuada, por ejemplo, por inactivacion de uno o mas genes de virulencia. Dentro de la tecnica, se conocen muchos ejemplos de celulas bacterianas atenuadas para su uso en vacunas.

Una vacuna bacteriana puede ser una celula atenuada de un patogeno bacteriano. La expresion de antlgenos endogenos nativos del patogeno mediante la vacuna atenuada puede estimular o cebar una respuesta inmuno protectora contra cepas del patogeno virulentas que no son vacunas. Entre las vacunas bacterianas adecuadas se incluyen celulas atenuadas de celulas de Vibrio cholerae, cepas enterotoxicas de E. coli, como 0157:H7, 0121 y 0104:H21, especie Shigella, como S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii y S. flexneri, la especie Campylobacter como C. jejuni, y la especie Salmonella como Salmonella enterica (especialmente, serovar Typhi).

Las vacunas de bacterias vivas para su uso en tratamiento terapeutico o profilactico de tifoideas son muy conocidos dentro de la tecnica e incluyen las cepas Salmonella typhiTy21a (Vivotif™), Ty800, CVD908, CVD908-htr, CVD915, y ZH9.

Las vacunas de bacterias vivas para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico contra el colera son muy conocidas dentro de la tecnica e incluyen JBK-70, CVD 101, CVD 102, CVD104, CVD 105,395N1, JJM43, TCP2, CVD 103, CVD103-RM, CVD 103-HgR (Mutachol®), CVD110, Bahrain-3, Peru-3, Peru-5 y Peru-15.

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Las vacunas de bacterias vivas para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de shigelosis y disenterla bacteriana son tambien muy conocidas en la tecnica e incluyen cepas de vacunas atenuadas de Shigella atenuada, como CVD 1204 y WRSS1.

Las vacunas de bacterias vivas para su uso en el tratamiento terapeutico y profilactico contra la diarrea son tambien muy conocidas dentro de la tecnica e incluyen celulas de E. colienterotoxico atenuado como PTL002 y PTL003.

Las vacunas de bacterias vivas para su uso en el tratamiento terapeutico y profilactico de listeriosis son tambien muy conocidas dentro de la tecnica e incluyen cepas atenuadas de Listeria monocytogenes, como Lmdd.

Una vacuna bacteriana puede comprender un acido nucleico heterologo que codifica un antlgeno exogeno, es decir, un antlgeno que no es expresado de forma natural por la celula de la vacuna (por ejemplo un antlgeno humano o viral o un antlgeno de especies bacterianas diferentes). La vacuna bacteriana puede estimular o cebar una respuesta inmune protectora contra el antlgeno exogeno, por ejemplo, cuando se despliega el antlgeno sobre la superficie de un patogeno o una celula enferma, como por ejemplo una celula cancerosa o una celula infectada por un virus.

El termino “heterologo” indica que una secuencia de acidos nucleicos es una secuencia recombinante que ha sido introducida en una construction, un vector o una celula artificialmente empleando medios de ingenierla genetica o recombinantes, es decir, por intervention humana. Las secuencias de nucleotidos que son heterologas no se dan juntas en la naturaleza. Las secuencias de nucleotidos o aminoacidos que son heterologas para una celula, no se dan de forma natural en celulas de ese tipo, variedad o especie (es decir, exogenas o extranas). Una secuencia de acidos nucleicos que es heterologa para una celula puede codificar una secuencia de aminoacidos heterologa, es decir, una secuencia de aminoacidos que es exogena o extrana para la celula.

En algunas realizaciones, el acido nucleico heterologo puede ser expresado por una celula microbiana para producir un antlgeno exogeno. El antlgeno exogeno puede segregarse desde la celula microbiana, desplegarse sobre la superficie de la celula microbiana o permanecer intracelular dentro de la celula microbiana.

En otras realizaciones, es posible que el acido nucleico heterologo no sea expresado por la celula microbiana. Por ejemplo, se puede transferir el acido nucleico heterologo a una celula huesped del individuo tras su administration al intestino y expresarse en la celula huesped. El acido nucleico heterologo puede expresarse para producir el antlgeno exogeno, por ejemplo, en un metodo de vacunacion de ADN o transferencia de ADN, o puede expresarse para producir una molecula de ARN codificante o no codificante, por ejemplo, en un metodo de interferencia de ARN.

Los antlgenos exogenos adecuados que se pueden codificar a traves de un acido nucleico hexogeno incluyen antlgenos relacionados con enfermedad, como antlgenos tumorales, y antlgenos de patogenos virales, bacterianos y otros, como por ejemplo antlgenos derivados de Streptococcus mutans, Shigella sonnei, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, VIH, virus de la gripe, virus de la hepatitis, virus del papiloma, Plasmodium falciparum, Francisella tularensis, y Schistosoma mansoni, o antlgenos derivados de tumores, tales como Her2/neu o antlgeno especlfico de prostata (AEP).

Otros antlgenos exogenos adecuados incluyen moleculas del individuo, tales como idiotipos de anticuerpo, como por ejemplo, para la generation de una respuesta inmune anti-idiotlpica.

Opcionalmente, la vacuna bacteriana puede co-expresar tambien un polipeptido inmunomodulador heterologo recombinante, como por ejemplo, una citoquina, como FNT-alfa, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, IFN-alfa, IFN- gamma, una quimioquina como CCL-25, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo u otro polipeptido de union que inhibe citoquinas (p.ej. IL-10, FCT-beta) u otros mediadores de la respuesta inmune o celulas inmunes (como linfocitos T reguladores o supresores). Esto puede ser util para aumentar la respuesta inmune al antlgeno exogeno.

Entre las vacunas bacterianas adecuadas para la expresion de antlgenos exogenos se incluyen cepas de vacuna bacteriana vivas, tales como bacterias patogenas atenuadas, como Salmonella enteric, Vibrio cholerae, E. coli enterotoxico, Shigella, y Campylobacter jejuni y celulas bacterianas no patogenas, incluyedo bacterias entericas como Enterobacteriaceae, y otras bacterias como Bacillus subtlis y especies de bacterias de acido lactico, p.ej., Lactococci spp., como L. lactis (Nature Reviews Microbiology (2008) 6:349).

Las celulas viables secadas en la formulation solida pueden constituir una poblacion homogenea del mismo tipo de celulas (por ejemplo, celulas de la misma cepa de microorganismo). Alternativamente, las celulas viables secadas en la formulacion solida pueden constituir una poblacion heterologa que contiene una mezcla de diferentes tipos de celulas. Por ejemplo, la formulacion puede comprender celulas de dos o mas, tres o mas, cuatro o mas, o cinco o mas tipos diferentes. Los diferentes tipos de celulas pueden incluir celulas de diferentes cepas o especies de microorganismos y/o celulas con diferentes modificaciones geneticas.

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Las formulaciones descritas en el presente documento se pueden administrar a cualquier individuo adecuado. Por ejemplo, el individuo puede ser un ser humano o un animal no humano, como un roedor (p.ej. una cobaya, un hamster, una rata, un raton), murino (p.ej. un raton), canino (p.ej. un perro), felino (p.ej., un gato), equino (p.ej., un caballo), porcino (p.ej., un cerdo), un primate, simio (p.ej., un mono), un mono (p.ej., titl, mandril), un simio (p. ej., gorila, chimpance, orangutan, gibon), un ave (p.ej., pollo) o un pez (p.ej., salmon, trucha).

Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento que comprenden celulas de salmonella viables secadas pueden ser utiles como vacunas en el tratamiento veterinario de animales no humanos, como cerdos y caballos.

Se puede seleccionar o identificar a los individuos adecuados en la medida en que necesiten el tratamiento.

La formulacion comprende preferentemente una cantidad terapeuticamente eficaz y profilacticamente eficaz de celulas viables secadas.

Las expresiones “cantidad terapeuticamente eficaz” o “cantidad profilacticamente eficaz”, tal como se utilizan en el presente documento conciernen a la cantidad de celulas viables secadas que son eficaces para producir algun efecto terapeutico o profilactico deseado, respectivamente, acorde a una relacion beneficio/riesgo razonable.

Una formulacion descrita en el presente documento puede comprender por ejemplo 103 o mas, 104 o mas, 105 o mas, 106 o mas, 107 o mas, 108 o mas, 109 o mas o 1010 o mas celulas viables secadas.

Las celulas viables secadas de las formulaciones descritas en el presente documento retienen al menos al menos 0,1 %, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 40 % o al menos 60 % de la viabilidad tras la rehidratacion. Por tanto, un significativo numero de celulas dentro de la formulacion es capaz de tener actividad metabolica y de division celular tras la rehidratacion. Los metodos para valorar la viabilidad de las celulas son muy conocidos dentro de la tecnica e incluyen por ejemplo ensayos de placa para unidades de formacion de colona (UFC).

Preferentemente, las celulas viables secadas en las formulaciones descritas en el presente documento retienen la viabilidad, tal como se ha expuesto anteriormente, cuando se almacena la formulacion a temperatura ambiente durante perlodos de tiempo prolongados (p.ej., 15 °C a 30 °C durante 24 meses o mas).

Las celulas secadas tienen un contenido de humedad menor que las celulas sin secar. Por ejemplo, las celulas secadas pueden contener 10 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos o 1% o menos de humedad residual con respecto a las mismas celulas antes del secado.

Las celulas adecuadas para su uso, tal como se describe en el presente documento, pueden secarse a traves de cualquier metodo adecuado que no afecte significativamente a la viabilidad de la celula. Dentro de la tecnica, se conoce una gama de metodos adecuados, entre los que se incluyen liofilizado, secado a temperatura ambiente, secado por pulverizacion, secado de lecho fluidizado, secado con espuma, secado directo durante el granulado para formacion de comprimidos y congelado con crioprotectores (Potts (2004) Micro Rev 58:755-805; Crowe et al (1990) Cryobiol. 27:219-231; Lievense et al (1994) Adv Biochem Eng Biotechnol. 51 45-89). Opcionalmente, se puede llevar a cabo el secado en presencia de un agente estabilizante, por ejemplo, un disacarido y/o un excipiente farmaceutico, como por ejemplo, un pollmero como hidroxi propil metil celulosa.

En algunas realizaciones, se puede liofilizar las celulas por liofilizado. El liofilizado implica la eliminacion del agua de un material congelado por sublimacion y desabsorcion a presion reducida. Las tecnicas de liofilizado adecuadas son muy conocidas dentro de la tecnica. (F. Franks European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 1997 (45)221-229; Fundamentals of freeze-drying JD Mellor Academic Press 1978). Opcionalmente, es posible liofilizar las celulas en presencia de un agente estabilizante, como por ejemplo un disacarido como trehalosa (Israeli et al (1993) Cryobiol 30 519-523; Leslie et al (1995) Appl. Env. Microbiol. 61 3592-3597) y/o un excipiente farmaceutico u otros componentes de la formulacion.

En algunas realizaciones, se puede someter las celulas a secado estabilizado con disacarido. Este puede comprender el aumento del nivel intracelular de un disacarido, como por ejemplo trehalosa, en las celulas y, a continuacion, el secado de las celulas en presencia de un agente estabilizante hidrato de carbono, como por ejemplo, por evaporacion y a presion reducida y temperaturas no congelante. Entre los agentes estabilizantes de hidratos de carbono se incluyen disacaridos como trehalosa, maltitol, lactitol, palatinit, GPS (alfa-D-glucopiranosil-1- >6-sorbitol), GPM (alfa-D-glucopiranosil-1->6-manitol), maltooligosacaridos y maltooligosacaridos hidrogenados. Los metodos de secado estabilizado con disacarido son muy conocidos dentro de la tecnica y se describen por ejemplo en Crowe JH et al Annu Rev Physiol 1998; 60:73-103. Bullifent HL, et al. Vaccine 2000 dic 8; 19(9-10):1239-45; Garcia De Castro A, et al Appl Environ Microbiol 2000 Sep; 66(9):4142-4; US6468782 y US6610531.

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Los acidos biliares son acidos esteroides que se producen en el hlgado por oxidacion del colesterol y se segregan al intestino como componentes de la bilis. Los acidos biliares incluyen acido colico, acido desoxicolico y acido quenodesoxicolico.

Un agente de union a acido biliar o secuestrante es un compuesto que se une, absorbe o secuestra acidos biliares. Entre los agentes de union a bilis se incluyen pollmeros con carga positiva que se unen al grupo principal de acido carboxllico con carga negativa de los acidos biliares. Los pollmeros con carga positiva que se unen a acidos biliares incluyen resinas de intercambio anionico, como colestiramina (p.ej. Questran™ o Dowex 1X2™), colestilan, colestimida, colextran clorhidrato, colesevelam HCl, colestipol, DEAE-dextrano, celulosa aminada, DEAE-celulosa, TEAE-celulosa, Q sepharosa, QAE Sephadex, hidroxietil celulosa etoxilato cuaternizada y quitosano aminado.

Los pollmeros con carga positiva adecuados son conocidos en la tecnica para su uso como agentes de reduccion del colesterol y se describen por ejemplo en los documentos US4557930, US3308020, US3383281, US3499960, US3780171, WO2005023305 y GB929.391.

Otros agentes de union a bilis adecuados incluyen pollmeros hidrofobos que se unen a la cola de colesterol hidrofoba de los acidos biliares. Entre los pollmeros hidrofobos adecuados se incluyen pollmeros relacionados con poliesti reno.

Otros agentes adecuados pueden incluir tambien agentes de origen natural, como fibra de la dieta, carbon activo y carbonizado de hueso. En la invencion, el agente de union a bilis es colestiramina.

El agente de union a bilis puede adoptar cualquier forma o configuration dentro de la formulation, por ejemplo, granulado, polvo, perlas, membranas o monolitos porosos.

Los datos que se exponen en el presente documento demuestran que una pequena cantidad de agente de union a bilis es suficiente para proteger las celulas viables secadas de la toxicidad del acido biliar. La cantidad de agente de union a bilis en la formulacion descrita en el presente documento sera por lo general significativamente menor que la cantidad requerida para unir todos los acidos biliares a los que se expone la formulacion en el intestino de un individuo.

Una formulacion solida puede presentarse una forma de dosis unitaria y puede comprender 5 g o menos, 2 g o menos, 1 g o menos o 0,5 g o menos de material solido.

Una formulacion solida, tal como se describe en el presente documento, puede comprender menos de 95 % (p/p), menos de 90 % (p/p), menos de 80 % (p/p), menos de 70 % (p/p), menos de 60 % (p/p), menos de 50 % (p/p), menos de 40 % (p/p), menos de 30 % (p/p), menos de 20 % (p/p), menos de 10 % (p/p), menos de 1 % (p/p) o menos de 0,1 % (p/p) de dicho agente de union a bilis.

Una formulacion solida, tal como se describe en el presente documento, puede comprender mas de 5 % (p/p), mas de 10 % (p/p) o mas de 20 % (p/p), mas de 30 % (p/p), mas de 40 % (p/p), mas de 50 % (p/p), mas de 60 % (p/p), mas de 70 % (p/p), mas de 80 % (p/p), mas de 90 % (p/p) o mas de 95 % (p/p) de dicho agente de union a bilis.

La relation en peso entre las celulas y el agente de union a bilis en la formulacion puede ser 5 o menos, 1 o menos, 0,5 o menos, 0,1 o menos, 0,01 o menos, 0,001 o menos o 0,0001 o menos.

La relacion en peso entre el agente de union a bilis y las celulas en la formulacion puede ser 0,2 o mas, 1 o mas, 10 o mas, 100 o mas, 1000 o mas o 10000 o mas.

En algunas realizaciones preferentes, las celulas viables secadas, el agente de union a bilis y otros componentes de la formulacion pueden ir encapsulados en una cubierta polimerica.

La cubierta polimerica puede ser util para aumentar aun mas la resistencia a la bilis de la formulacion.

Preferentemente, la cubierta polimerica comprende un pollmero hidrofobo-hidrofilo anfifllico, como por ejemplo hidroxi propil metil celulosa (HPMC). En el mercado hay disponibles cubiertas polimericas adecuadas.

En algunas realizaciones preferentes, la formulacion solida descrita en el presente documento puede estar cubierta con un revestimiento enterico.

Un revestimiento enterico es una capa exterior impermeable que protege las celulas viables secadas de los danos del acido cuando la formulacion pasa a traves del estomago y luego permite la liberation de las celulas cuando la formulacion llega al intestino. El uso de revestimientos entericos es muy conocido dentro de la tecnica.

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Los revestimientos entericos pueden ser sensibles al pH. Por ejemplo, es posible que un revestimiento enterico no presente inestabilidad en las condiciones acidas dentro del estomago (p.ej., pH de 1 a 3), pero puede ser inestable a un pH mas alto, dentro del intestino (p.ej. pH por encima de 5,5).

Los materiales polimericos adecuados para su uso en lo revestimientos entericos son muy conocidos en la tecnica y entre ellos se incluyen por ejemplo acidos grasos, ceras, shellac™, ftalato acetato de celulosa (CAP), copollmeros de acido metacrllico, copollmeros de acrilato de metilo-acido metacrllico, acetato succinato de metil celulosa, ftalato de hidroxipropil metil celulosa, ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), trimelitato de acetato de celulosa, carboximetil etil celulosa y copollmeros de metacrilato de metilo-acido metacrllico.

Una formulacion solida, tal como se describe en el presente documento puede comprender ademas uno o mas componentes adicionales, como por ejemplo, para modificar o ajustar las propiedades de la formulacion para aplicaciones especlficas.

Por ejemplo, una formulacion puede comprender ademas un agente de liberacion retardada que controla la liberacion de las celulas desde la formulacion al intestino, tras la disolucion del revestimiento enterico, por ejemplo, formando una capa gelatinosa estable que se erosiona lentamente para liberar las celulas.

Entre los agentes de liberacion retardada adecuados se incluyen hidroxipropil metil celulosa (HPMC), hidroxietil celulosa y otras celulosas modificada, gomas naturales, como goma guar, polioxido de etileno, polialcohol vinllico y poli(acido lactico-co-glicolico).

Las celulas viables secadas pueden ser sensibles a otras toxinas en el intestino distintas a los acidos biliares, como por ejemplo, lisozima; peptidos anti-microbianos como defensinas; y enzimas digestivas, tales como pepsina, tripsina y lipasa. Una formulacion puede comprender ademas agentes para proteger las celulas de dichas toxinas. Por ejemplo, una formulacion puede comprender una resina de intercambio cationico para unirse a las celulas viables secadas y protegerlas de las enzimas de carga positiva, como lisozima.

Entre las resinas de intercambio de cationes adecuadas se incluyen resinas de intercambio ionico, tales como resina Dowex 50wX1, sulfonato sodico de poliestireno o pollmeros como carboximetil celulosa o acido alglnico.

Una formulacion puede comprender ademas estabilizantes para mantener la viabilidad de las celulas secadas. Entre los ejemplos de estabilizantes adecuados se incluyen hidratos de carbono como los antes descritos.

Una formulacion puede comprender ademas uno o mas vehlculos, adyuvantes, excipientes, aglutinantes, disgregantes, agentes de volumen, deslizantes, diluyentes, cargas, tampones, estabilizantes, conservantes, lubricantes y otros materiales farmaceuticamente aceptables conocidos entre las personas especializadas en la tecnica y, opcionalmente, otros agentes terapeuticos o profilacticos. En algunas realizaciones, una formulacion puede comprender ademas uno o mas mucoadhesivos que retienen la formulacion en el intestino durante la liberacion de las bacterias. Entre los mucoadhesivos adecuados se incluyen polivinil pirrolidona, poliacrilatos, quitosano, metil celulosa, carboxi metil celulosa, hidroxi propil celulosa y otros derivados de celulosa.

La expresion “farmaceuticamente aceptable”, tal como se utiliza en el presente documento concierne a compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que, dentro del marco de un criterio medico solido, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (p.ej., un ser humano), sin una excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica u otro problema o complicacion, acorde a una relacion beneficio/riesgo razonable. Cada excipiente, vehlculo, etc., debe ser asimismo “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demas ingredientes de la formulacion. En los textos convencionales, como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21° edicion, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 2005; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5a edicion, 2006, Pharmaceutical Press, London, se pueden encontrar vehlculos, excipientes, etc., adecuados. La formulacion de la invencion se produce por secado de celulas bacterianas viables y mezclandolas despues las celulas viables secadas con un agente de union a bilis y, opcionalmente, un vehlculo farmaceuticamente aceptable para producir una formulacion solida. Alternativamente, se puede producir la formulacion por mezclado de las celulas bacterianas viables con el agente de union a bilis y, opcionalmente, un vehlculo farmaceuticamente aceptable para producir una mezcla y, a continuacion, se puede secar la mezcla para producir una formulacion solida; en los casos en los que el agente de union a bilis es colestiramina, las celulas bacterianas viables son celulas de vacuna bacteriana. A continuacion, se describen metodos adecuados de secado.

Las celulas viables secadas y el agente de union a bilis pueden mezclarse con otros vehlculos, adyuvantes, excipientes y/u otras materiales antes descritos farmaceuticamente aceptables; comprimirse, moldearse o tratarse de otra forma para preparar una formulacion adecuada para administracion oral; y/o cubrirse con un revestimiento enterico para producir la formulacion.

La resistencia de las celulas en la formulacion a la exposicion de bilis puede determinarse. La cantidad de celulas y/o agente de union a bilis en la formulacion puede alterarse para optimizar la resistencia de las celulas a bilis. Por

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ejemplo, si puede recuperarse un menor numero de celulas viables de la formulacion tras la exposicion a bilis, en relacion con los controles, entonces puede aumentarse la cantidad de agente de union a bilis en la formulacion.

Las formulaciones solidas adecuadas para administracion oral pueden consistir en una o mas unidades discretas, como comprimidos, aglomerados, plldoras, o capsulas. En algunas realizaciones, una unidad discreta como una plldora o una capsula puede comprender multiples sub-unidades, tales como granulos o polvos.

Las formulaciones solidas para administracion oral pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias y puede prepararse a traves de cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica. Dichos metodos pueden incluir la etapa de asociacion de las celulas viables secadas y el agente de union a bilis con el vehlculo que constituye uno o mas de los ingredientes adicionales. En general, las formulaciones se preparan asociando uniformemente e Intimamente la mezcla de celulas viables secadas y el agente de union a bilis con los vehlculos solidos finamente divididos y, a continuation, si es necesario, dando forma al producto.

Las formulaciones adecuadas para administracion oral (p.ej., por ingestion) pueden presentarse como unidades diferenciadas, como capsulas, obleas o comprimidos, conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada de las celulas viables secadas y el agente de union a bilis; por ejemplo, en forma de polvo o granulos.

Se puede fabricar un comprimido a traves de medios convencionales, p.ej., compresion, moldeo, granulation humeda o granulacion seca, opcionalmente, con uno o mas componentes adicionales, como aglutinantes (p.ej., povidona, gelatina, acacia, sorbitol, tragacanto, hidroxipropil metil celulosa), cargas o diluyente (p.ej. lactosa, celulosa microcristalina, hidrogen fosfato calcico); lubricantes (p.ej. estearato de magnesio, talco, sllice); disgregantes (p.ej., glicolato de almidon sodico, povidona reticulada, carboximetil celulosa sodica reticulada), agentes tensioactivos, de dispersion o de humectacion (p.ej., lauril sulfato sodico); y conservantes (p.ej., p- hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, acido sorbico). Por ejemplo, pueden prepararse comprimidos comprimiendo en una maquina adecuada el compuesto activo en una forma fluida, como por ejemplo, granulos o polvos, mezclados opcionalmente con uno o mas componentes adicionales. Los comprimidos moldeados pueden obtenerse moldeando en una maquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente llquido inerte. Opcionalmente, los comprimidos pueden revestirse o ranurarse y pueden formularse para que proporcionen una liberation lenta o controlada del compuesto activo que contienen utilizando por ejemplo, hidroxi propil metil celulosa u otro agente de liberacion retardada variando las proporciones para proporcionar el perfil de liberacion deseado. Tal como se ha descrito, es posible proporcionar un revestimiento enterico sobre los comprimidos, aglomerados, plldoras, capsulas y otras formulaciones solidas para dar lugar a su liberacion en partes del intestino que no sean el estomago.

Las capsulas que comprenden las celulas secadas y el agente de union a bilis en la forma de polvos o granulos encapsulados en una cubierta polimerica pueden fabricarse a traves de los medios convencionales.

Los componentes pueden disponerse en diversas maneras dentro de las formulaciones descritas en el presente documento, y la disposition precisa de los componentes dependera de las propiedades especlficas que se requieran para una aplicacion determinada. Por ejemplo, una formulacion puede ser homogenea, es decir, las celulas viables secadas y los agentes de union a bilis pueden estar distribuidos homogeneamente dentro de la formulacion, o puede ser heterogenea, es decir, las celulas viables secadas y los agentes de union a bilis pueden estar distribuidos heterogeneamente dentro de la formulacion.

En la figura 6, se muestran ejemplos de diferentes disposiciones de los componentes en las formulaciones descritas en el presente documento.

En algunas realizaciones, una formulacion puede comprender un nucleo, que comprende una bacteria secada viva y un agente de union a bilis, y un revestimiento, preferentemente, un revestimiento enterico, que rodea el nucleo. Opcionalmente, el revestimiento puede ser una cubierta polimerica que encapsula el nucleo.

Alternativamente, la formulacion puede comprender un nucleo de un excipiente farmaceuticamente aceptable que comprende granulos de bacterias viables secadas y granulos del agente de union a bilis seco. Opcionalmente, el nucleo puede comprender granulos de material de liberacion retardada. Opcionalmente, el nucleo puede encapsularse en una cubierta polimerica. Opcionalmente, la formulacion puede comprender ademas un revestimiento enterico que rodea el nucleo.

Alternativamente, una formulacion puede comprender un nucleo de bacterias secas viables que esta rodeado de una capa de agente de union a bilis.

Opcionalmente, la capa de agente de union a bilis puede comprender ademas un material de liberacion retardada. Opcionalmente, el nucleo y la capa de agente de union a bilis pueden estar encapsulados en una cubierta polimerica. Opcionalmente, la formulacion puede comprender ademas un revestimiento enterico que rodea la capa de agente de union a bilis.

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Las formulaciones, tal como se describen en el presente documento son estables a temperatura ambiente, es decir, las celulas se mantienen viables tras un perlodo de almacenamiento prolongado a temperatura ambiente (p.ej., de 15 °C a 30 °C).

Las combinaciones de agente de union a bilis y las celulas viables secadas, p.ej., en una formulacion como la descrita, son utiles para administrar celulas vivas al intestino de un individuo.

Las formulaciones, tal como se describen en el presente documento pueden ser utiles para aplicaciones medicinales, terapeuticas o profilacticas. Por ejemplo, una combination del agente de union a bilis y celulas viables secadas, p.ej., en una formulacion como la descrita, pueden ser utiles en el tratamiento terapeutico o profilactico del organismo humano o animal.

La expresion “tratamiento terapeutico”, tal como se utiliza en el presente documento en el contexto de un tratamiento a un individuo de una afeccion, concierne generalmente al tratamiento y la terapia, ya sea a un ser humano o a un animal no humano (p.ej., en aplicaciones veterinarias), con los que se consigue cierto efecto terapeutico deseado, por ejemplo, la inhibition del avance de una afeccion e incluye una reduction de la velocidad de avance, un cese de la velocidad de avance, la mejora de la afeccion o uno o mas slntomas de la misma y la curacion de la afeccion.

La expresion “tratamiento profilactico”, tal como se utiliza en el presente documento, en el contexto del tratamiento de un individuo de una afeccion, concierne generalmente al tratamiento que previene o reduce el riesgo de que una enfermedad o uno o mas slntomas de la misma aparezca o sea recurrente. El tratamiento profilactico puede llevarse a cabo por ejemplo en un individuo (p.ej., un ser humano o un animal no humano) que en el momento del tratamiento no padece la afeccion y no presenta slntomas de la afeccion.

En particular, una combinacion de un agente de union a bilis y celulas viables secadas puede ser util en el tratamiento terapeutico o profilactico de infection por patogenos en un individuo. Un metodo de tratamiento de una infection por patogenos en un individuo puede comprender la administration oral de una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas a un individuo que lo necesita.

Las infecciones por patogenos incluyen infecciones como colera (V. cholerae), tifoideas (S. typhi), disenterla (Shigelia spp), antrax (Bacillus anthracis), peste septicemica (Yersinia pestis), tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), lepra (Mycobacterium leprae), campilobacteriosis (Campylobacter spp) y gastroenteritis (E. coli enterotoxico y Salmonella spp); infecciones virales como gripe, VIH-SIDA, viruela y SRAS e infecciones parasitarias, como malaria (Plasmodium spp), esquistosomiasis (Schistosoma spp).

Una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas puede ser util tambien en metodos de inmunizacion y/o inmunoterapia, como por ejemplo, por estimulacion o cebado de una respuesta inmune a un antlgeno relacionado con enfermedad, codificado y preferentemente expresado por las celulas. Un metodo de tratamiento de un individuo por inmunizacion o inmunoterapia puede comprender la administracion oral de una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas a un individuo que lo necesita.

Tal como se ha descrito, el antlgeno relacionado con enfermedad puede ser expresado de forma natural por las celulas (p.ej., en una vacuna bacteriana atenuada) o el antlgeno relacionado con enfermedad puede ser un antlgeno exogeno que esta expresado en la celula desde el acido nucleico heterologo.

Las celulas pueden comprender ademas acidos nucleicos heterologos que codifican un polipeptido inmuno modulador como por ejemplo, una citoquina como FNT-alfa, GM-CSF, IL-1, lL-6, IL-12, IFN-alfa o IFN-gamma; una quimioquina como CCL-25, o un anticuerpo u otra molecula de union que inhibe las citoquinas (p.ej. IL-10, FCT-beta) u otros mediadores o celulas de la respuesta inmune (como por ejemplo linfocitos T reguladores o supresores) que llevan a la potenciacion de la respuesta inmune.

Los antlgenos relacionados con la enfermedad incluyen antlgenos de tumor y antlgenos de patogenos virales, bacterianos y otros, tal como se ha descrito. Por ejemplo, las celulas pueden expresar un antlgeno de un patogeno como Streptococcus mutans, Shigeila sonnei, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, VIH, virus de la gripe, virus de la hepatitis, Plasmodium falciparum, Francisella tularensis o Schistosoma mansoni, o un antlgeno a partir de un tumor como Her2/neu o antlgeno especlfico de prostata (AEP) para provocar o cebar una respuesta inmune al patogeno o tumor. Las formulaciones, tal como se describen en el presente documento, pueden ser utiles por tanto en el tratamiento terapeutico y profilactico de infeccion por patogenos y cancer.

Una combinacion de un agente de union y celulas viables secadas pueden ser utiles para administrar celulas viables al intestino, por ejemplo, para restaurar la flora microbiana del intestino de un individuo. Esto puede ser util por ejemplo tras un tratamiento con antibioticos. Un metodo de restauracion de la flora microbiana del intestino puede comprender la administracion oral de una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas a un individuo que lo necesita, p.ej., tras el tratamiento con antibioticos.

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Una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas puede ser util tambien en el tratamiento terapeutico o profilactico de enfermedad inflamatoria intestinal o uno o mas slntomas de la misma en un individuo. Un metodo de tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal o uno o mas slntomas de la misma puede comprender la administracion oral de una combinacion de un agente de union a bilis y celulas viables secadas a un individuo que lo necesita.

Una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas tambien puede ser util en el tratamiento terapeutico y profilactico de formacion de calculos renales en un individuo. Un metodo de tratamiento de la formulacion de calculos renales puede comprender la administracion oral de una combinacion de un agente de union a bilis y celulas viables secadas a un individuo que lo necesita.

Una combinacion de agente de union a bilis y celulas viables secadas tambien puede ser util para reducir los niveles de colesterol en un individuo. Un metodo para reducir los niveles de colesterol puede comprender la administracion oral de una combinacion de un agente de union a bilis y celulas viables secadas a un individuo que lo necesita.

Un agente de union a bilis y celulas secadas viables puede ser util en la fabricacion de un medicamento para su uso en aplicaciones terapeuticas y profilacticas y los tratamientos que se han descrito.

Las formulaciones adecuadas, los agentes de union a bilis y las celulas bacterianas secadas viables se han descrito con mas detalle anteriormente.

Los metodos descritos en el presente documento pueden ser utiles por ejemplo para mejorar la eficacia de un agente terapeutico que comprende celulas viables secadas, tales como una vacuna bacteriana. Un metodo para mejorar la eficacia de dicho agente puede comprender la formulacion del agente con un agente de union a bilis, tal como se describe en el presente documento.

Los metodos descritos en el presente documento pueden ser utiles tambien por ejemplo para mejorar la supervivencia de celulas viables secadas en el intestino de un individuo. Un metodo para aumentar la supervivencia en el intestino de celulas de bacterias viables secadas puede comprender una formulacion de celulas con un agente de union a bilis, tal como se describe en el presente documento.

La divulgacion proporciona asimismo el uso de un agente de union a bilis, tal como se describe en el presente documento, en un metodo como el descrito en el presente documento, por ejemplo, un metodo para producir una formulacion solida que comprende celulas viables secadas para administracion oral; aumentar la supervivencia de celulas bacterianas viables secadas en el intestino de un individuo o mejorar la eficacia de un agente terapeutico que comprende celulas viables secadas.

En los casos en los que se utiliza “y/o” en el presente documento, debe interpretarse como una divulgacion especlfica de cada una de las dos caracterlsticas o cada uno de los componentes especlficos con o sin el otro. Por ejemplo “A y/o B” debe interpretarse como una divulgacion especlfica de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si se indicara cada uno de ellos individualmente en el presente documento.

A continuacion, se ilustrara ciertos aspectos y realizaciones de la invencion mediante ejemplos y haciendo referencia a las figuras que se describen a continuacion.

La Figura 1 demuestra la rapida recuperacion de tolerancia a bilis tras la rehidratacion.

La Figura 2 demuestra que la eliminacion de acidos biliares de soluciones de bilis utilizando resina fijadora de acido biliar (BAR por sus siglas en ingles) previene la toxicidad de las soluciones biliares para bacterias secas.

La Figura 3 demuestra que colestiramina evita la toxicidad biliar.

La Figura 4 demuestra que la adicion de resina fijadora de acido biliar (BAR) a un excipiente de secado antes del secado de las bacterias proporciona una significativa proteccion contra la toxicidad cuando se vuelven a suspender las celulas secadas en soluciones de bilis.

La Figura 5 demuestra que la adicion de BAR a comprimidos de matriz comprimida proporciona una significativa proteccion contra la toxicidad de una solucion de bilis al 1 %.

La Figura 6 presenta tres ejemplos de posibles formulaciones para formas de dosis oral.

La Figura 7 presenta la validacion de una formulacion optimizada para proteger las celulas de una vacuna bacteriana viva seca de la bilis.

La Figura 8 presenta la proteccion de una vacuna de Salmonella viva secada contra acido y bilis utilizando una capsula de revestimiento enterico y BAR colestiramina.

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La Figura 9 presenta la proteccion de una bacteria de acido lactico secada contra soluciones biliares en capsulas utilizando bAr colestiramina. Estos resultados no son de acuerdo con la invencion.

Experimentos

Los autores de la invencion utilizaron la cepa de vacuna bacteriana viva SLDAPD pUC18I como modelo para la administracion bacteriana oral [13]. Se cultivaron las bacterias durante toda la noche en medio M9 (con aminoacidos esenciales y nutrientes) mas 250 mM NaCl, a continuacion, se secaron muestras de 10 microlitros en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) mas 40 % trehalosa y 1,5 % PVP en un desecador, tal como se describe en ([14]). Se mantuvieron las muestras replicadas secas o se rehidrataron con 200 microlitros de PBS o agua y se dejaron durante 1, 5 o 20 minutos tal como se indica. A continuacion, se sometieron a ensayo las muestras secas o recuperadas o celulas de control desde caldos de cultivo enriquecidos por incubacion durante 1 hora diluidos generosamente en acido o solucion de bilis y tampon de control, tal como se indica, seguido de dilucion, colocacion en placas agar y recuento de las colonias formadas durante toda la noche. Se corrigieron los recuentos bacterianos para la dilucion durante la recuperacion y el ensayo y se expresaron como ufc/ml en relacion con el volumen de muestra de 10 ul original.

Se observo que las bacterias secadas recuperaban muy rapidamente la tolerancia a la bilis cuando se rehidrataron en agua o tampon antes de su exposicion a bilis. Una preparacion secada de bacterias que perdio 50 x viabilidad cuando se rehidrato en bilis, gano una supervivencia 5 x mejor a los 5 minutos de la rehidratacion y una supervivencia 20 x mejor al cabo de 20 minutos (fig. 1).

Se obtuvieron resultados similares por rehidratacion en tampon y agua. Al cabo de 1 hora de rehidratacion, el comportamiento de las bacterias no se distinguio del de las celulas de control de cultivos llquidos.

Se cultivo durante toda la noche la cepa de vacuna bacteriana viva SLDAPD pUC18I [13] y la cepa E. coli K12 DH5a (Invitrogen) en medio M9 mas 250 mM NaCl, a continuacion, se secaron las muestras de 10 pl en PBS/40 % trehalosa /1,5 % PVP en un desecador, tal como se describe [12]. Se mezclo una solucion al 5% p/v de bilis (Sigma, bilis de buey) en PBS con y sin 10 % p/v de colestiramina (Dowex 1x2, Sigma, Poole RU) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se elimino la colestiramina por centrifugacion seguido de filtracion (0,2 micrometres, miliporo). La medida de las sales biliares aplicando un ensayo enzimatico (Randox Total Bile Acid Assay, Randox labs, Co. Antrim) demostro que la concentracion de las sales biliares se reducla de 130 mM a 0,8 mM con el tratamiento con colestiramina. Se anadieron las soluciones resultantes para replicar muestras de bacterias secadas y se cultivaron durante 1 hora, seguido de dilucion, colocacion en placa, recuento de las colonas de toda la noche y calculo de ufc/ml relativas.

Se observo que la eliminacion de los acidos biliares mediante BAR previene eficazmente la toxicidad de soluciones de bilis contra bacterias secadas (fig. 2). La Figura 2 demuestra tambien la alta toxicidad de bilis contra muestras secadas de diferentes cepas de bacterias, E. coli K12, y demuestra que el pretratamiento con colestiramina protege a estas celulas secadas tambien. Se secaron muestras secas de 10 pl de SLDAPD pUC18I (que contenlan gen de resistencia a ampicilina) en tubos de ensayo de 6 ml. Para replicar las muestras, se anadieron o bien nada o bien 150 mg de colestiramina sobre la parte superior de las celulas secadas. A continuacion, se anadieron 2 ml de una solucion al 2% de bilis en PBS o PBS de control sobre la colestiramina, seguido de incubacion durante 1 hora, a 37 grados. Tras la incubacion, se tomaron las muestras, se diluyeron, se colocaron en placa y se hizo el recuento de las colonias de toda la noche sobre placas de agar con o sin ampicilina y se hizo el calculo de las ufc/ml relativas. Se esterilizo colestiramina antes de anadirla a las muestras de bacterias por pretratamiento con 70 % de etanol y un extenso secado. Asimismo, se observo el mismo numero de colonias con y sin ampicilina, lo que indico que solamente la cepa de bacterias de ensayo estaba presente y no se habla producido contaminacion.

Se observo que la adicion de BAR sobre la parte superior de las bacterias secadas seguida de la adicion de solucion de bilis bloquea la toxicidad de la solucion de bilis. Esto demuestra que la eliminacion secuencial de la bilis seguida de la administracion de llquido en el que se ha eliminado el acido biliar para secar las bacterias no es necesaria para proteger las bacterias, y demuestra que los acidos biliares que forman complejo con BAR no tienen toxicidad contra las bacterias secadas (figura 3).

Se suspendieron muestras de 10 pl replicadas de SLDAPD pUC18I en excipiente de control (40 % trehalosa, 1,5 % PVP en PBS) o excipiente con contenido de BAR (40 % trehalosa, 1,5 % PVP mas 5 o 10 % colestiramina en PBS) y se secaron en tubos de ensayo de 6 ml. Para replicar las muestras, se anadieron 2 ml de soluciones de bilis al 2 % o 0,4 % o tampon de control y se incubaron los tubos durante 1 hora a 37 grados, seguido de la obtencion de muestras, dilucion y colocacion sobre placas de agar. Se observo que la inclusion de BAR en el excipiente de secado proporcionaba una proteccion eficaz de las bacterias secadas de la bilis, incluso en cantidades imposibles de unirse a la cantidad total de acido biliar presente en la solucion de ensayo (fig. 4).

Fundamentalmente, se observo que el simple secado de las bacterias anadiendo pequenas cantidades de colestiramina al excipiente de secado proporciona una significativa proteccion en condiciones en las que cabrla esperar proteccion si se uniera BAR y secuestrara los acidos biliares simplemente. En la figura 4, la cantidad de

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colestiramina presente es bastante mas reducida que la cantidad total de acidos biliares presentes en el medio de ensayo. La colestiramina tiene una capacidad de 1,2 mg de sales biliares por 1 mg (el valor tipico, el valor exacto depende del acido biliar a que se une [14]). Por lo tanto, en la muestra de bacterias secadas de 10 pl hay 1 mg de colestiramina con capacidad para 1,2 mg de acidos biliares, no obstante, en 2 ml de solucion de bilis al 2 % esta presente un total de 20 mg de acidos biliares (normalmente, la bilis de buey utilizada contiene un exceso de acidos biliares de 50 % en peso), mas de 15 veces mas de acidos biliares.

Se secaron celulas SLDAPD pUC18I en excipiente normal (40 % trehalosa, 1,5 % PVP en PBS), despues se trituraron en un mortero para obtener un polvo. Se mezclaron las bacterias secadas en polvo en las siguientes proporciones cuidadosamente pesadas:

Comprimidos de control - carga de sacarosa: 9 % bacterias secadas en polvo//91 % sacarosa en polvo

Comprimidos de control- carga de MCC: 8 % bacterias secadas en polvo /92 % celulosa microcristalina (MCC,

Avicel PH101)

Comprimidos BAR - Colestiramina: 8% bacterias secadas en polvo /33 % colestiramina/58 % carga de MCC

Comprimidos BAR - Dowex 1X2: 6 % bacterias secadas en polvo / 63% Dowex 1X2 resina de 400 mallas /32 %

carga de MCC

A continuacion, se prensaron muestras de 70-90 mg de la mezcla en polvo en un troquel de 7 mm en una prensa (Port-A-Press de International Crystal Laboratories, distribuida por Crystan Ltd, con un torque de 10 newton metros) para obtener comprimidos de matriz comprimida de aproximadamente 1 mm de espesor. A continuacion, se sometieron a ensayo los comprimidos en condiciones simuladas del intestino del siguiente modo: se pesaron los comprimidos y se anadieron individualmente a porciones de 17 ml de fluido intestinal simulado de la Farmacopea Internacional, es decir tampon fosfato sodico/potasico pH 7,0 en solitario o en combinacion con 1 % de solucion de bilis de buey y se incubo durante 45 minutos a 37 °C. Se tomaron muestras, se diluyeron, se colocaron en placa durante toda la noche y se hizo el recuento de ufc vivas. El recuento de las bacterias recuperadas se expreso en lo que se refiere al peso de las bacterias secas originales, es decir, en ufc/mg de bacterias secadas, y cada barra representa un solo comprimido, representando la barra de error multiples recuentos de bacterias para este comprimido.

Se observo que el prototipo de comprimidos para ser humano que contenian BAR ademas de bacterias secadas ofrece una significativa proteccion contra la bilis en un modelo de liberacion intestinal simulado (figura 5). Los autores de la invencion sometieron a ensayo los comprimidos que contenian bacterias secadas vivas con o sin la adicion de la BAR colestiramina o la resina de intercambio ionico equivalente Dowex 1x2, por disolucion en tampon frente a las soluciones de bilis. Con los comprimidos de control que contenian las bacterias secadas diluidas en sacarosa como carga, se recuperaron 1228 veces menos celulas tras la disolucion en 1 % de solucion de bilis en comparacion con la disolucion en tampon solamente, lo que indica una significativa toxicidad de bilis. De manera similar, con los comprimidos fabricados con MCC como carga, se recuperaron 638 veces menos celulas tras la disolucion en 1 % de solucion de bilis en comparacion con el tampon en solitario. En cambio, con los comprimidos que contenian colestiramina o resina Dowex 1x2 ademas de las bacterias secadas y la carga de MCC, la disolucion en bilis tan solo dio una reduccion de 2,5 a 3,1 veces mas en la recuperacion de celulas vivas. Esto representa una mejora de 208 a 254 veces mas de celulas vivas con el comprimido con BAR en comparacion con los comprimidos de control. Cabe destacar que los comprimidos de colestiramina contienen un maximo de 24 mg de colestiramina que tiene capacidad de unir un maximo de 29 mg de acidos biliares, pero 17 ml de solucion biliar al 1 % contiene aproximadamente 85 mg de acidos biliares, por tanto, la colestiramina no secuestra simplemente el total de acidos biliares que estan en exceso en la solucion de ensayo.

Sin pretender quedar ligado a teoria alguna, la formulacion puede funcionar del siguiente modo: la colestiramina en el excipiente se une a los acidos biliares presentes en un volumen limitado del tampon que es absorbido en la muestra seca y, de esta forma, las bacterias secadas se rehidratan en agua “limpia” dando cabida a la rapida recuperacion, tal como se muestra en la figura 1. Posteriormente, cuando se disgrega la muestra rehidratada y se dispersa en la solucion biliar, las bacterias han recuperado ya una resistencia a la bilis significativa.

Incluso con una simple formulacion experimental que consiste en la adicion de BAR a excipiente de secado, se recuperaron 50 veces mas de bacterias vivas con la formulacion con BAR (10 % de colestiramina) que con la formulacion de control, cuando se suspendieron en una solucion de bilis al 2 %, lo que representa una significativa mejora. Esto representa una reduccion de 5 veces mas de recuperacion de celulas vivas con la formulacion cuando se vuelve a suspender en bilis al 2 %, en comparacion con la reduccion de 270 veces mas de recuperacion de celulas vivas con la formulacion de control convencional, con excipiente de secado convencional. De manera similar, con la formulacion de comprimido de matriz comprimida que consiste en BAR mezclada con bacterias secadas antes de la compresion del comprimido, se recuperaron de 208 a 254 veces mas de bacterias vivas con la formulacion de comprimido que contenia BAR que con la formulacion de control cuando se volvio a suspender en una solucion de bilis al 2 %, lo que representa una significativa mejora. Esto representa una reduccion de 2,5 a 3,1 veces mas de recuperacion de celulas cuando se diluyo en bilis al 1 % en comparacion con una reduccion de 1228 a 638 veces mas en la recuperacion de la celula viva con la formulacion de comprimido de control convencional.

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Se sometio a ensayo la capacidad de una formulacion optima para proteger de la bilis la vacuna de bacterias viva secada.

En estos experimentos, se utilizo la cepa de vacuna de peste septicemica de ratones SL3261/pAHL [17]; se obtuvieron resultados similares utilizando la cepa de mantenimiento de plasmido sin antibiotico SLDAPD/pUC18I [12, 16, 13]. Se hizo el recuento de las bacterias utilizando placas de agar LB que contenlan o bien ampicilina para SLDApD/pUC18I o bien canamicina para SL3261/pAHL para asegurar que solamente se hacla el recuento de las bacterias de la vacuna. Se dejaron en cultivo las bacterias y se secaron tal como se describe en [12, 16] y, a continuacion, se agruparon varias preparaciones secadas replicadas y se trituraron con un mortero hasta obtener un polvo homogeneo y se mezclaron con MCC seco para obtener un polvo fluido para formular y cargar en capsulas. El contenido normal del polvo fue 2-5 x 106 ufc/mg y se almaceno en un desecador de vaclo a temperatura ambiente hasta la realizacion del ensayo; la preparacion presento una perdida de menos de 10 % de la viabilidad al cabo de un perlodo de 2 meses.

Se mezclo este polvo con carga de MCC mas BAR a 25 %, a continuacion, o bien se peso directamente para introducirlo en los tubos de ensayo, o bien se cargo en capsulas de tamano 00 del material de cubierta indicado y se pesaron para introducirlos en los tubos de ensayo. Se anadieron entre 20 -30 mg de bacterias por cada 1 g del total de polvo para asegurar que se inclulan entre 6 y 10 mg de bacterias secadas en polvo por capsula. Se cargo manualmente la mezcla en polvo en capsulas de tamano 00 del material de cubierta indicado utilizando un Cap- MQuick (Value Healthcare Company, Sheffield RU); se anadio a la capsula un soporte de bolas de acero de 6,4 mm de diametro para que se hundiera durante la disolucion.

Se anadieron 25 ml de tampon o 1 % o 4 % de bilis de buey y se incubo a 37 durante 50 minutos y, a continuacion, se mezclo a fondo dentro de tubos y se tomaron muestras, se diluyeron, se colocaron sobre placas de agar con canamicina y se incubaron durante toda la noche. Se hizo el recuento de las colonias y se utilizaron para determinar el numero de celulas vivas, expresado como UFC por mg en el polvo para vacuna secada inicial. Se emplearon celulas estabilizadas secadas de la cepa de vacuna de peste septicemica de raton SL3261/pAHL; se observo una proteccion similar en experimentos por separado utilizando celulas secadas en la cepa de vacuna SLDAPD/pUC18I.

Se estudio el efecto de diferentes tipos de BAR en la proteccion contra la bilis dentro de una cubierta de capsula de HPMC de liberation rapida. Las capsulas de HPMC de liberation rapida son capsulas de HPMC modificadas disenadas para producir una liberacion mas rapida que la de las capsulas de HPMC convencionales. Los estudios con imagenes predijeron que la proteccion proporcionada por Dowex 1x2 de 400 mallas podia mejorarse significativamente simplemente eliminando la humedad para generar un polvo no agregado y fluido y, de hecho, cuando se anadio Dowex 1x2 de 400 mallas secado a 25 % a LBV secado y una carga de MCC, se observo una diferencia impresionante, ya que Dowex 1x2 de 400 mallas proporciono una proteccion 92 veces mayor en comparacion con el polvo sin capsulas. En cambio, la preparacion humeda de Dowex 1x2 de 400 mallas no proporciono una proteccion significativa (fig. 7a). Por otra parte, colestiramina proporciono una proteccion incluso mejor que la de Dowex 1x2 de 400 mallas secado, con una proteccion 120 mayor, en comparacion con el polvo sin capsulas, y no presento ninguna perdida significativa de bacterias en 1 % de bilis en comparacion con el tampon (fig. 7a).

A continuacion, se sometio a ensayo una formulacion optimizada aumentando la concentration de bilis. Esta formulacion incorporo las caracterlsticas de proteccion previstas segun el estudio de imagenes y un trabajo teorico - 25 % de colestiramina, una mayor dosis de y la geometrla de la capsula- y se sometio a ensayo tambien utilizando capsulas de HPMC convencionales.

La adicion de 25 % de BAR colestiramina tuvo como resultado una recuperation del 100 % de celulas viables en capsulas de HPMC en condiciones de 4 % de bilis, sin diferencia en la recuperacion de celulas entre la bilis y el tampon (figura 7). Asimismo, no se detecto ninguna perdida significativa de bacterias en 4% de bilis en comparacion con el tampon cuando se cargaron tambien capsulas de HPMC de liberacion rapida con 25% de colestiramina y LBV secado (fig. 7b). Por tanto, la simple adicion de 25 % de colestiramina en preparaciones de LBV secado puede proporcionar una proteccion 4200 veces mayor contra bilis al 4 %. La composition de bilis de cerdo es mas parecida a la de los humanos [8] y tambien se observo un alto grado de proteccion similar con bilis de cerdo al 1 %, 4 % y 8% lo que confirma que esta formulacion optimizada puede proteger las bacterias de la vacuna secadas de concentraciones en exceso de acidos biliares.

La inclusion de BAR en comprimidos proporciona proteccion contra una solution de bilis que contiene una cantidad de acidos biliares que excede la capacidad maxima de la BAR dentro del comprimido [16]. De manera similar, en los experimentos con capsulas, la cantidad total de colestiramina fue 75 mg (25 % de 300 mg de polvo), que puede unir un maximo de 218-292 pmoles de acidos biliares [4]. Se anadio a 25 ml de una solucion de bilis al 4% que contenla un total de 2500 umoles de acidos biliares, que representa un exceso de 8-11 mas de acidos biliares con respecto a la capacidad de BAR, lo que indica que, al igual que con los comprimidos, las capsulas con contenido de BAR proporcionan una proteccion temporal, mientras las bacterias secas recuperan la tolerancia a la bilis, en lugar de simplemente secuestrar todos los acidos biliares dentro de la muestra de ensayo.

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Se sometio a ensayo la capacidad de una capsula con revestimiento enterico y la BAR colestiramina para proteger de acido y bilis la vacuna de Salmonella secada viva.

Se cultivaron bacterias SL3261/pAHL y se secaron de la misma manera que en los experimentos anteriores. Se mezclaron bacterias secadas en polvo con celulosa microcristalina y colestiramina en una relacion de 1:75:25 celulas: MCC: colestiramina. Se cargo este polvo en capsulas HPMC normales de tamano 00, aproximadamente 300 mg por capsula, con un soporte de bolas para sumergirlas durante la prueba de disolucion. Se descubrieron las capsulas o se sumergieron dos veces desde cada extremo en una solucion 10% p/v de pollmero enterico, copollmero de acido metacrllico: acrilato de etilo (Kollicoat MAE 100 P, BASF, Mannheim Alemania) disuelto en una mezcla 3:2 v/v de metanol y diclorometano, y despues se seco durante toda la noche.

Se sumergieron individualmente 5 capsulas con revestimiento enterico durante 40 minutos en 20 ml 0,1M HCl a 37 °C para simular el acido gastrico en el estomago; s egun lo esperado, el revestimiento enterico impidio la disolucion o bien la penetracion del acido en la cubierta de la capsula. A continuacion, se transfirieron estas 5 capsulas a bilis de buey al 2 % disuelto en tampon fosfato, pH 7,0. Al mismo tiempo, se anadieron individualmente 2 capsulas revestidas y 3 capsulas sin revestir a 20 ml de tampon fosfato, pH 7,0 (tampon); al mismo tiempo, se anadieron individualmente 2 capsulas sin revestir a 20 ml de HCl 0,1M. A continuacion, se incubaron todas las capsulas a 37 °C durante 1 hora, despues se mezclaron a fondo. Las capsulas sin revestir se disolvieron completamente en el acido al cabo de 1 hora. Al cabo de 1 hora mas (2 horas en total de incubacion), se tomaron las muestras, se diluyeron y se colocaron sobre placas agar que contenlan canamicina y se incubaron despues durante toda la noche. Se hizo un recuento de las colonias y se calculo la recuperacion de celulas vivas y se expreso como unidades de formacion de colona por ml; cada barra representa 1 capsula y las barras de error indican 1 desviacion tlpica.

Se observo que las capsulas sin revestir liberaban un alto numero de celulas viables al tampon, pero no se recupero ninguna celula viva en acido. En cambio, se recupero un numero similar de celulas viables en tampon y en bilis despues de la inversion en acido con las capsulas con revestimiento enterico (vease Figura 8). Esto demuestra que la dosis solida con revestimiento enterico que contiene la BAR colestiramina protege las celulas de una vacuna bacteriana de antlgeno heterologo secada contra los acidos gastricos seguido de bilis intestinal.

Se sometio a ensayo la capacidad de las capsulas que contienen la BAR colestiramina para proteger las bacterias de acido lactico secadas de soluciones de bilis. Estos ensayos no son de acuerdo con la invencion. Las bacterias de acido lactico vivas fueron de fabricacion comercial en forma de polvo a traves de un proceso de fermentacion y liofilizado. El fabricante sometio a ensayo el cultivo para Salmonella y otros patogenos y lo suministro como suplemento alimentario que es adecuado para el consumo humano.

Se mezclo el polvo de bacterias de acido lactico secadas que contenla Lactobacillus caseii con carga de celulosa microcristalina (MCC) con y sin 50 % p/p de la BAR colestiramina y despues se cargo en capsulas HPMC que contenlan un soporte de bolas de 1 g para hundir las capsulas. Entre 13 y 15 % p/p del contenido de la capsula fue bacterias, que se corresponde con 39 - 45 mg de una capsula de 300 mg, es decir, en el intervalo de 9,8 x 10A9 - 11x10A9 uFC/capsula. Se anadieron capsulas individuales a tubos de 50 ml que contenlan 25 ml de tampon fosfato de control, pH 7,0, o las concentraciones indicadas de bilis de buey o bilis de cerdo en tampon fosfato durante 1 hora a 37 °C. Se tomaron las muestras, se diluyeron y se colocaron porciones sobre placas e cultivo con agar, se incubaron durante 72 horas a 37° C, tras lo cual, se hizo el recuento de las colonias y se calculo las unidades de formacion de colonia (UFC) para indicar el numero de celulas vivas en relacion con el peso original del polvo de acido lactico secado anadido a las capsulas. Cada barra representa la media de 4 capsulas sometidas a ensayo individualmente.

Cuando se dispersaron en el tampon de control, se observo que las capsulas de control contenlan celulas mezcladas con carga de MCC en solitario liberaban segun lo esperado el alto numero de celulas L. caseii vivas; en cambio, las dosis crecientes de bilis proporcionaron reducciones en la recuperacion de celulas vivas, de modo que de bilis de buey al 4 %dio mas de 30 veces mas eliminacion. Cuando se anadio colestiramina en la capsula mezclada con las bacterias y los polvos de carga, se observo una perdida 3 veces menor con de bilis de buey al 4 %, dando una proteccion 10 veces mayor contra la dosis alta de bilis. Se observaron resultados similares con la bilis de cerdo (Figura 9). Esto demuestra que la preparacion de tipo alimenticio liofilizada comercial de bacteria de acido lactico puede protegerse de la bilis mediante el uso de la BAR colestiramina.

Los datos experimentales expuestos demuestran que las bacterias secadas sensibles a la bilis recuperan rapidamente la tolerancia a la bilis si se rehidratan antes de su exposicion a la bilis y el pretratamiento de soluciones de bilis con un secuestrante de acido biliar previene la toxicidad de la bilis para la bacteria secada. Por otra parte, se ha demostrado que la adicion del secuestrante de acido biliar sobre la parte superior de las bacterias secadas previene la toxicidad de la bilis y la adicion de un secuestrante de acido biliar al excipiente antes del secado tambien proporciona una significativa proteccion contra la toxicidad de la bilis en comparacion con las bacterias secadas en un excipiente convencional. Los comprimidos de matriz y las capsulas que contienen el secuestrante de acido biliar tambien presentan una mayor liberation de bacterias viables cuando se anaden a soluciones de bilis, en comparacion con los comprimidos o capsulas de control sin secuestrante de acido biliar.

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Tras la rehidratacion sin acidos biliares, se observo que las bacterias secadas recuperaban muy rapidamente la resistencia a la bilis. Esto demuestra que se puede permitir que las bacterias se recuperen en una forma de administracion oral en el intestino a traves de la rehidratacion con proteccion contra la bilis.

Las BAR se utilizan convencionalmente para secuestrar acidos biliares y bloquear la reabsorcion, pero no se habla demostrado anteriormente que modularan el efecto de los acidos biliares en el intestino.

Los datos expuestos tambien demuestran que si estan presentes en combinacion bacterias secas y agentes de union a acido biliar, se bloquea la toxicidad de los acidos biliares, es decir, los acidos biliares no pueden eliminar las bacterias secadas en presencia de acidos de union a acido biliar. Esto demuestra que las bacterias secadas pueden protegerse in vivo de la toxicidad de acidos biliares.

Los datos expuestos tambien demuestran que si se secan las bacterias en presencia de agentes de union a bilis, se proporciona suficiente proteccion contra la toxicidad de la bilis incluso en una situacion en la que el total de la cantidad de acido biliar en el tubo de ensayo excede la capacidad total de los agentes de union a bilis presentes en la formulacion de bacterias secadas.

Por tanto, es posible incorporar los secuestrantes de acido biliar en formulaciones de dosis para aumentar la eficacia de la administracion de las bacterias vivas al intestino. Cuando se liberen en el intestino a traves de un sistema de administracion enterica convencional, el secuestrante de acido bilis protegera las bacterias vivas de los acidos biliares dando tiempo las bacterias para rehidratarse sin la toxicidad del acido biliares, permitiendo de este modo la recuperacion de la tolerancia a la bilis y mejorando la administracion de bacterias vivas al intestino. Por ejemplo, se protege una vacuna bacteriana (cepa SL3261/pAHL) que contiene un antlgeno recombinante (antlgeno de peste septicemica F1 en un plasmido) (de acuerdo con la invencion) y una preparacion secada comercial de bacteria de acido lactico Lactococcus caseii (no de acuerdo con la invencion) de la bilis con las formulaciones descritas en el presente documento. Asimismo la presencia de un revestimiento enterico, as! como un secuestrante de acido biliar protegen las formulaciones de dosis de la exposition secuencial a acido seguida de soluciones biliares (ingestion simulada).

Referencias

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[16] A.D. Edwards, N.K. Slater Vaccine 27(29) (2009) 3897-3903.

[17] H.L. Bullifent et al Vaccine 19(9-10) (2000) 1239-1245.

[18] WO2007/112747

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   REIVINDICACIONES

   1. Una formulacion solida que comprende celulas bacterianas viables secadas y un agente de union a bilis para su uso en un metodo de inmunoterapia que comprende la administracion oral de dicha formulacion a un individuo que lo necesita, en la que el agente de union a bilis es colestiramina y las celulas bacterianas viables son celulas de vacuna bacteriana.
2. 2. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 en la que las celulas viables se secan aumentando el nivel intracelular de disacarido en las celulas y secando las celulas en presencia de un agente de estabilizacion de hidrato de carbono.
3. 3. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende cualquiera entre

   (i) un nucleo que comprende granulos de celulas bacterianas viables secadas y granulos de agente de union a bilis seco; o

   (ii) un nucleo que comprende celulas bacterianas secadas viables, estando rodeado dicho nucleo de una capa que comprende el agente de union a bilis.
4. 4. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las celulas viables secadas son sensibles a lisozima.
5. 5. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende ademas una resina de intercambio de cationes.
6. 6. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las celulas viables secadas comprenden acido nucleico heterologo.
7. 7. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que el acido nucleico heterologo codifica un antlgeno exogeno.
8. 8. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las celulas viables secadas de la vacuna bacteriana y el agente de union a bilis estan encapsulados en una cubierta polimerica.
9. 9. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que la cubierta polimerica comprende hidroxipropil metil celulosa.
10. 10. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que esta recubierta de un revestimiento enterico.
11. 11. Una formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la formulacion comprende:

    un nucleo que comprende celulas bacterianas viables secadas y un agente de union a bilis, opcionalmente en la que

    el nucleo esta encapsulado en una cubierta polimerica, y

    un revestimiento enterico que rodea el nucleo y la cubierta polimerica opcional.
12. 12. Un metodo para producir una formulacion solida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende: secado de celulas bacterianas viables, y

    mezclado de las celulas viables secadas con un agente de union a bilis y, opcionalmente, un excipiente farmaceuticamente aceptable para producir una formulacion solida; o

    mezclado de celulas bacterianas viables con un agente de union a bilis y, opcionalmente, un vehlculo farmaceuticamente aceptable para producir una mezcla y un secado de la mezcla para producir una formulacion solida;

    en donde el agente de union a bilis es colestiramina y las celulas bacterianas viables son celulas de vacuna bacteriana.