ES2641604T3 - Bacteria productora de equol y uso de la misma - Google Patents

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Description

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Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) según un procedimiento divulgado en un manual de
producto adjunto al mismo. Se empleó el analizador génico AB 3130 (Applied Biosystems) como secuenciador. Se
llevaron a cabo el análisis filogénico molecular y el análisis de homología de la secuencia de ARNr 16S por medio de
Clustal X v1.83, TreeView vl.6.6 y GENETIX(R) Ver.7 (Genetics). Como resultado, se descubrió que la cepa
5 pertenecía a la familia Coriobacteriaceae (fig. 1). Aunque Slackia exigua ATCC 700122T fue el pariente filogénico
conocido más cercano, la cepa presentó una homología baja (92,4 %). Se descubrió que la cepa obtenida en el
ejemplo de prueba 1 tenía una homología de un 99 % o mayor con respecto a Slackia spp. TM-30 divulgada en el
documento de patente 3 y estas cepas formaron un agrupamiento con cepas bacterianas no cultivadas registradas
en la base de datos. Por lo tanto, se pensó que posiblemente la cepa del ejemplo de prueba 1 era de la misma 10 especie que Slackia spp. TM-30.
Se investigaron las propiedades bioquímicas de la cepa del ejemplo de prueba 1 y S. exigua ATCC 700122T, que es
el pariente filogénico conocido más cercano analizado a través del análisis de secuencia de ARNr 16S, por medio de
Rapid ID 32A (SYSMEX bioMerieux Co., Ltd.). Se cultivó cada bacteria sometida a prueba en un medio de GAM 15 agar (1 % de glucosa añadida) a 37 ºC durante 24 horas en condiciones anaerobias. Se emplearon dos láminas de
medio de GAM agar (1 % de glucosa añadida) con respecto a un kit de identificación. Se realizaron la preparación
de la solución bacteriana aplicada al kit, la reacción y la determinación según un manual adjunto al kit. La tabla 1
muestra los resultados. En el análisis por medio de Rapid ID 32A, la bacteria que tiene una capacidad de conversión
en equol presentó propiedades considerablemente diferentes de las de S. exigua ATCC 700122T. Además, en el 20 análisis por medio de Rapid ID 32A, la bacteria que tiene una capacidad de conversión en equol presentó utilización
de D-manosa y utilización de D-rafinosa y fue positiva para fosfatasa alcalina. Estas propiedades bioquímicas
difieren de las de Slackia spp. TM-30 divulgada en el documento de patente 3. Por lo tanto, se descubrió que la cepa
del ejemplo de prueba 1 era diferente de las cepas divulgadas. Por tanto, los estudios en biología molecular y
bioquímica han revelado que se cree que la cepa es una cepa novedosa perteneciente al género Slackia, y los 25 autores de la presente invención han denominado la cepa como una bacteria perteneciente al género Slackia, YIT
11861 (Slackia sp. YIT 11861).
[Tabla 1]
Comparación de propiedades bioquímicas analizadas por medio de Rapid ID 32A
Slackia sp. YIT 11861 Slackia exigua ATCC 700122T
Slackia spp. TM-30*
Ureasa
-- -
Arginina dihidrolasa
+ + +
-Galactosidasa
-- -
-Galactosidasa
-- -
-Galactosidasa-6-fosfato
-- -
-Glucosidasa
-- -
-Glucosidasa
-- -
-Arabinosidasa
-- -
-Glucuronidasa
-- -
N-Acetil--glucosaminidasa
-- -
D-Manosa
+ + -
D-Rafinosa
+ + -
Glutamato descarboxilasa
+ + +
-Fucosidasa
-- -
Reducción con nitrato
-- -
Indol
-- -
Fosfatasa alcalina
+ - -
Arginina arilamidasa
-+ +
Prolina arilamidasa
-+ -
Leucilglicina arilamidasa
-- -
Fenilalanina arilamidasa
-+ -
Leucina arilamidasa
-+ -
Piroglutamato arilamidasa
-- -
Tirosina arilamidasa
-+ -
Alanina arilamidasa
-+ -
Glicina arilamidasa
-+ -
10 5
10
15
20
25
30
Comparación de propiedades bioquímicas analizadas por medio de Rapid ID 32A
Histidina arilamidasa Glutamilglutamato arilamidasa Serina arilamidasa
Slackia sp. YIT 11861 Slackia exigua ATCC 700122T -+ ---+ Slackia spp. TM-30* ---
*Divulgado en el documento de patente 3
Ejemplo de prueba 3: Actividad de conversión de daidzeína en equol de Slackia sp. YIT 11861
Se investigó la actividad de conversión de daidzeína en equol de Slackia sp. YIT 11861. Se inoculó la bacteria en un medio GAM que contenía daidzeína a una concentración de 100 o 400 μM a la concentración celular de 107 células/ml de medio, y se mantuvo el medio a 37 ºC. Se determinó la concentración de equol de la solución de cultivo a través de HPLC para una pluralidad de tiempos durante el transcurso del cultivo, para determinar de este modo la actividad de conversión de daidzeína en equol.
Los resultados se muestran en la tabla 2. También se investigaron las actividades de algunas cepas bacterianas divulgadas en memorias descriptivas de patente y en artículos y se compararon con la actividad de la bacteria de la presente invención. Como resultado, Slackia sp. YIT 11861 convirtió 100 μM de daidzeína en equol en incubación durante 8 horas a un porcentaje de conversión de un 95 % y durante 24 horas al 100 %, y 400 μM de daidzeína en equol en incubación durante 24 horas a un porcentaje de conversión de un 94 % y durante 96 horas al 100 %. Por el contrario, una cepa do-03 de bacteria grampositiva (documento distinto de patente 3) convirtió 193 μM de daidzeína en equol en incubación durante 48 horas a un porcentaje de conversión de un 33 % (concentración celular inicial: no divulgada, concentración celular final: DO660 = 0,277; posiblemente de 106 a 108 células/ml de medio), y la cepa TM30 convirtió 391 μM de daidzeína en equol en incubación durante 24 horas a un porcentaje de conversión de apenas aproximadamente un 1 % (concentración celular inicial: no divulgada, concentración celular final: 109 células/ml de medio). En el caso de la cepa 92-90 de L. gariviae, se requirieron 72 horas para una conversión del 100 % de apenas 42 μM de daidzeína en equol, y no se produjo conversión (0 %) en incubación durante 24 horas (concentración celular inicial: 107 células/ml de medio). Por tanto, se descubrió que Slackia sp. YIT 11861 tenía una actividad de conversión de daidzeína en equol notablemente mayor que la de cepas bacterianas conocidas.
[Tabla 2]
Actividad de conversión de daidzeína en equol de Slackia sp. YIT 11861 y comparación con cepas conocidas
Tasa de
Condición de reacción
Concentración de isoflavona (μM) conversión de daidzeína en Referencia
Cepa
equol (%)
Temp. (ºC)
Tiempo (h) Conc. daidzeína inicial (μM) Daidzeína Equol DHD*
37
6 100 49,7 44,4 1,8 44
Slackia sp. YIT 11861
37 37 37 8 24 24 100 100 400 0,9 0,8 1,2 95 107 376 5,5 1,1 31,5 95 100 94 Este estudio
37
96 400 2,1 417 0,0 100
Bacteria
37 48 193 62,3 64 45,3 33 Documento
grampositiv
distinto de
a do-03
37 96 193 ND** 139 ND 72 patente 3
Slackia spp. Documento de
37 24 391 269 4,2ND 1
TM-30 patente 3
3796 42 0420 100
92-90
DHD*: dihidrodaidzeína, ND**: No descrito
Ejemplo de prueba 4: Diseño del fragmento de ácido nucleico específico para Slackia sp. YIT 11861 Se diseñó un cebador en base a una secuencia característica de Slackia sp. YIT 11861. Específicamente, se obtuvo una secuencia de ARNr 16S de una bacteria perteneciente a la familia Coriobacteriaceae a partir de una base de
11
imagen9
imagen10

Claims (1)

  1. imagen1
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