ES2642205T3 - Inmunoempobrecimiento selectivo de un nicho de células madre endógenas para injerto - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Inmunoempobrecimiento selectivo de un nicho de celulas madre endogenas para injerto

Las celulas madre proporcionan los medios para que los organismos mantengan y reparen ciertos tejidos, a traves de la capacidad de estas celulas de auto-renovarse y a traves de la replicacion asimetrica, para generar celulas diferenciadas. La potencia de las celulas madre varla: mientras que las celulas madre embrionarias pueden dar origen a todos los tejidos de un organismo, las celulas madre somaticas pueden estar limitadas a un linaje especlfico. Cllnicamente, el trasplante de medula osea y de celulas madre hematopoyeticas (HSC) se utilizan habitualmente como un medio para proporcionar a los pacientes la capacidad de generar celulas sangulneas, por lo general cuando el paciente ha empobrecido sus celulas madre endogenas como consecuencia de dosis altas de quimioterapia o radiacion. La medula osea y la sangre periferica se utilizan actualmente como fuentes de celulas madre autologas. En el futuro, las celulas madre cultivadas pueden suponer una alternativa a las celulas autologas para trasplantes.

En pacientes con cancer, las celulas madre hematopoyeticas pueden administrarse como cuidados de soporte para eludir la morbilidad y la mortalidad asociadas con reglmenes de tratamiento ablativo de dosis altas que se usan en intentos de curar o prolongar la supervivencia en pacientes con alto riesgo de fracaso terapeutico o cancer recurrente utilizando la terapia convencional.

El rechazo del injerto se define como el fracaso del establecimiento del injerto (rechazo del injerto primario) o la perdida de un injerto establecido (rechazo del injerto secundario). La aceptacion del injerto (o el rechazo del injerto) puede detectarse determinando la presencia de antlgenos de superficie celular del tipo donante, isoenzimas, marcadores cromosomicos o polimorfismos de longitud de fragmento de restriccion de ADN. Para el injerto hematopoyetico, el rechazo puede definirse como granulocitos que no se recuperan hasta > 0,5 x 109/l o que caen por debajo de este nivel durante > 3 dlas despues de la recuperacion inicial.

El rechazo del injerto o el mal funcionamiento del injerto pueden ser causados por la administracion de farmacos mielosupresores, enfermedad de injerto contra huesped e infecciones en el perlodo inicial posterior al trasplante. El ganciclovir, administrado para la prevencion o el tratamiento de las infecciones por citomegalovirus, es el farmaco mas comun que produce rechazo del injerto; este es generalmente reversible cuando se suspende el farmaco. Trimetoprim-sulfametoxazol administrado para prevenir infecciones por Pneumocystis carinii es modestamente mielosupresor y en raras ocasiones produce mal funcionamiento del injerto. El citomegalovirus, el parvovirus, el herpesvirus humano 6 y las infecciones micobacterianas y fungicas tambien pueden comprometer el injerto. Una aceptacion insuficiente tambien puede ser debido al microambiente o disfuncion del estroma de la medula osea relacionada con la enfermedad subyacente del paciente o con la terapia previa.

Las celulas madre hematopoyeticas endogenas habitualmente residen dentro de los sinusoides de la medula osea, aunque un numero pequeno de las mismas circulan en la sangre periferica. La movilizacion en la sangre periferica se ve reforzada por la administracion de citocinas tales como el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF). Esta movilizacion produce un aumento sustancial en el numero de celulas progenitoras circulantes.

La interaccion de las celulas madre con su microambiente proporciona importantes senales de mantenimiento, proliferacion y diferenciacion. Este entorno flsico en el que residen las celulas madre puede denominarse microambiente o nicho de celulas madre. Las celulas del estroma y otras celulas implicadas en este nicho proporcionan factores solubles y ligados, que tienen una multitud de efectos. Por ejemplo, se sabe que dos familias de protelnas, la familia TGFp y la familia Wnt, estan implicadas en la regulacion de las celulas madre y se ha observado que son operativas en una serie de sistemas y organismos diferentes.

Las interacciones celula-celula y celula-matriz extracelular (ECM) son importantes tanto para la induccion como para el mantenimiento de la diferenciacion en varios linajes celulares. En el caso de la ECM, los receptores especlficos de la superficie celular pueden unirse a componentes particulares de la ECM, activando una via de transduccion de la senal intracelular que es analoga a las vlas de senalizacion que se han identificado para los factores de crecimiento polipeptldicos y los inhibidores del crecimiento.

La adhesion a la matriz extracelular esta mediada por varias clases de receptores, siendo las integrinas las mas extensamente caracterizadas. Es necesaria una elevada expresion de integrinas pi para el mantenimiento de celulas madre epidermicas y las integrinas pi regulan la diferenciacion de queratinocitos y otros tipos de celulas a traves de la senalizacion de la MAP quinasa. Las integrinas pueden mantener la posicion de las celulas en un tejido, y la perdida o alteracion de la expresion de la integrina puede conducir a la perdida de una posicion en un nicho. La matriz extracelular tambien puede secuestrar y modular la concentration local de factores secretados disponibles dentro del nicho de celulas madre.

Otras senales que controlan las celulas madre requieren el contacto directo celula-celula. Por ejemplo, la interaccion entre el receptor Notch y su ligando Delta, los cuales son moleculas transmembrana, requiere el contacto celula-

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celula. La senalizacion de Notch esta implicada en la regulacion de tejidos embrionarios y adultos de vertebrados; ejemplos incluyen neuroepitelio retiniano, musculo esqueletico y sangre.

Se han propuesto varios modelos para la interaccion entre las celulas madre y el nicho. En su forma mas simple, se ha sugerido un modelo donde, cuando una celula madre se divide, solo una hija permanece en el nicho y la otra celula hija sale del nicho para diferenciarse. En otra alternativa, se ha sugerido que el fenotipo del injerto se determina simplemente por la proportion entre celulas madre del hospedador y del donante, siendo innecesario el empobrecimiento de celulas madre endogenas (Quesenberry and Becker (1998)). Burt et al, Blood, vol. 92, 1998, paginas 3505-3514, se refiere al tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria por acondicionamiento inmunosupresor intenso y trasplante autologo de celulas madre hematopoyeticas. El documento WO 2004/002425 se refiere a un proceso para promover la aceptacion del injerto por empobrecimiento de celulas madre hematopoyeticas. Ishikawa et al., Experimental Hematology vol. 30, N.° 5, 2002 paginas 488-494, “An assay for longterm engrafting human hemaopoietic cells based on newborn NOD/SCID/p2-microglobulinnuN mice”.

Los metodos mejorados para el injerto de celulas madre, incluyendo celulas madre hematopoyeticas, son de gran interes cllnico. La presente invention responde a esta necesidad.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para el injerto de celulas madre, por ej., celulas madre hematopoyeticas, donde las celulas madre endogenas son selectivamente extraldas, abriendo as! un nicho para el injerto de celulas madre donantes. La extraction selectiva elimina sustancialmente las celulas madre endogenas en el tejido diana, sin extraction general de las celulas del tejido. La eficacia del injerto se mejora significativamente mediante la extraccion selectiva, en comparacion con el injerto obtenido sin pretratamiento. Tal extraccion selectiva permite mejorar la funcion del tejido diana durante el perlodo de injerto, en comparacion con los metodos que implican la extraccion no selectiva. Los metodos de la invencion permiten as! un injerto eficaz de celulas madre en ausencia de metodos de extraccion no selectivos, por ej., radiation o quimioterapia, que tienen el efecto indeseable de extraccion de celulas diferenciadas implicadas en la funcion del tejido diana, as! como efectos secundarios indeseables sobre otros tejidos (por ejemplo, en celulas del sistema gastrointestinal, crecimiento del cabello), as! como el aumento del riesgo de tumores malignos secundarios.

En una realization, la invencion proporciona una composition con un anticuerpo que se une selectivamente a c-kit e interfiere con la senalizacion del factor de crecimiento esencial para el crecimiento o mantenimiento de celulas madre hematopoyeticas para su uso en un metodo de injerto de celulas madre en un mamlfero, en el que el metodo comprende:

poner en contacto dicho mamlfero con dicha composicion para extirpar selectivamente celulas madre endogenas en dicho tejido diana e introducir celulas madre exogenas a dicho mamlfero despues de un perlodo de tiempo suficiente para eliminar sustancialmente dicho anticuerpo de la circulation del paciente. La invencion esta definida por las reivindicaciones adjuntas.

La extraccion selectiva se logra administrando un agente que es un anticuerpo que se une selectivamente a c-kit e interfiere con la senalizacion del factor de crecimiento esencial para el crecimiento o mantenimiento de celulas madre hematopoyeticas. Dichos agentes son conocidos en la tecnica, o pueden identificarse por selection de anticuerpos candidatos, etc. para la inhibition del crecimiento de la celula madre objetivo, por ej., en un ensayo in vitro.

En una realizacion de la invencion, las celulas madre son celulas madre hematopoyeticas. Dichas celulas madre se pueden usar en el tratamiento de diversos trastornos sangulneos, por ej., trastornos geneticos incluyendo anemia aplasica; anemia falciforme; talasemias; inmunodeficiencia grave y similares. En una realizacion, el metodo para tratar un trastorno genetico de la sangre en un paciente comprende administrar a un paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente como se ha definido anteriormente y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre hematopoyeticas de un donante.

La invencion es tambien util en la induction de tolerancia en un paciente, por ejemplo tolerancia al tejido donante, por ej., en trasplantes de organos; tolerancia a los autoantlgenos, por ej., en el contexto del tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria y similares. En una realizacion, el metodo para inducir tolerancia en un paciente comprende administrar a un paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente como se ha definido anteriormente y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre hematopoyeticas de un donante, cuya administration se puede realizar conjuntamente con la introduction de un aloinjerto en dicho paciente, el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, etc.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Los nichos de HSC disponibles se pueden saturar con HSC del donante. Se analizo la sangre periferica de ratones RAG2"/"yc"/" no acondicionados trasplantados 16 semanas despues del trasplante de HSC para

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granulocitos Ter119-CD3-B220-Mac-1alt°dispersi6n lateral3'40 derivados del donante GFP+. En el panel de la derecha, los ratones fueron co-trasplantados con 1.000 HSC CD45.1 y 100.000 celulas KLS CD34+ GFP+. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 4-5 para cada dosis); ** indica un valor de p <0,05 con relaci6n al quimerismo procedente del grupo trasplantado con 10 HSC. La llnea discontinua representa el quimerismo de HSC te6rico si el injerto aumentase linealmente con la dosis de celulas trasplantadas.

Figura 2. El tratamiento con ACK2 empobrece las HSC in vivo. A) ACK2 se elimina del suero de ratones RAG2'/_ Yc'/_ siete dlas despues de la inyecci6n. El suero de ratones que recibieron 500 pg de ACK2 se analiz6 cada dos dlas para determinar la persistencia del anticuerpo ACK2 por tinci6n de mastocitos c-kit+. B) La administraci6n de ACK2 conduce al empobrecimiento de HSC de la medula 6sea. El numero de HSC KLS CD135- CD150+ en ambos femures y tibia de ratones tratados con ACK2 y de control se determin6 por citometrla de flujo en varios puntos de tiempo despues del tratamiento. Se muestran valores medios +/- EEM (n = 3 para cada punto temporal); ** indica valor p <0,001. C) ACK2, pero no el tratamiento con 2B8, empobrece las HSC funcionales de la medula 6sea. El trasplante de 200.000 celulas de medula 6sea no fraccionadas de ratones tratados con 500 pg de ACK2 nueve dlas antes en receptores irradiados conduce a un quimerismo disminuido en comparaci6n con los controles y otro anticuerpo anti-c-kit 2B8. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 5-8); ** indica un valor de p <0,01. D) El tratamiento con ACK2 no causa directamente la movilizaci6n de HSC al bazo. Las suspensiones monocelulares de los bazos se generaron a partir de ratones tratados con 500 pg de ACK2 nueve dlas antes y las suspensiones enteras se trasplantaron junto con 200.000 celulas de medula 6sea competidora de ratones de tipo silvestre. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 3-9); ** indica valor p <0,001. E) ACK2 inhibe la proliferaci6n de HSC 19 mediada por SCF. Se aislaron HSC de ratones de tipo silvestre y se cultivaron en presencia de SCF o TPO y ACK2 o 2B8. La proliferaci6n se observ6 mediante microscopla 6ptica. ** indica un valor de p <0,05 en comparaci6n con muestras tratadas con ACK2. F) El tratamiento con ACK2 empobrece selectivamente las HSC en los momentos iniciales. Se cuantificaron los numeros totales de HSC (lin'c-kit+Sca- 1+CD135- CD150+), MEP (lin-c'kit+Sca-1'CD34'FcYR'), CMP (lmc-kit+Sca-rCD34b3j°FcYRbaj°) y GMP (lin-c- kit+Sca-1+CD343lt°FcYRalt°) y se compararon con los de los ratones de control no tratados. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 3); ** indica un valor de p <0,001 en comparaci6n con el numero relativo de HSC en el mismo punto temporal.

Figura 3. El tratamiento con ACK2 mejora el injerto de HSC. A) El acondicionamiento con ACK2 conduce a mayor quimerismo mieloide del donante. El quimerismo de los granulocitos del donante se midi6 tras el trasplante de 5.000 HSC en ratones RAG2'/_ acondicionados con ACK2 siete dlas antes del trasplante y se compar6 con el de los ratones no acondicionados. Se muestran valores medios +/- EEM (n = 4); ** indica valor p <0,01. B) El trasplante de HSC de animales tratados con ACK2 conduce a la reconstituci6n de linfocitos. Los linfocitos B derivados del donante y los linfocitos T de ratones RAG2'/_ tratados con ACK2 y no acondicionados esplenicos se enumeraron 39 semanas despues del trasplante con HSC de tipo silvestre. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 3-5); ** indica valor p <0,01. C) El quimerismo de los granulocitos mide con exactitud el quimerismo de HSC de la medula 6sea. El quimerismo de los granulocitos de sangre periferica (Ter119'CD3'B220'Mac-13lt°dispersi6n lateral3lt°) a las 37 semanas despues del trasplante se correlacion6 con el quimerismo de HSC (c-kit+ linaje- Sca-1+ CD34'CD150+) en la medula 6sea a las 39 semanas despues del trasplante tras el sacrificio. La llnea continua ilustra la regresi6n lineal con un intervalo de confianza del 95 % sombreado en gris. La llnea discontinua representa los valores te6ricos si el quimerismo del granulocito del donante era identico al quimerismo de las HSC del donante. D) Las HSC del donante, trasplantadas secundariamente de ratones tratados con ACK2, dan lugar a un injerto multilinaje a largo plazo. El quimerismo de sangre periferica de linfocitos B (B), linfocitos T (T) y granulocitos (G) se muestra 16 semanas despues del trasplante secundario en 2 experimentos independientes. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 7-8 en cada experimento).

Figura 4. El quimerismo del donante aumenta con el numero de celulas HSC trasplantadas en ratones tratados con ACK2. A) El tratamiento con ACK2 aumenta el espacio de nicho de HSC disponible. En dos experimentos independientes, se trataron ratones RAG2'/'yc'/' con ACK2 y se trasplantaron nueve dlas despues con dosis variables de HSC (CD45.1). El quimerismo de los granulocitos de los donantes se midi6 como antes 24 semanas despues del trasplante en el primer experimento y 4 semanas despues del segundo experimento. Se muestran los valores medios +/- EEM. B) Perfiles de citometrla de flujo de ratones trasplantados con 35.000 HSC. Se muestra el quimerismo de los granulocitos de sangre periferica CD3'B220'Mac13lt° dispersi6n lateral3lt°.

Figura 5. El quimerismo total del donante no refleja con exactitud el quimerismo de las HSC despues del trasplante de medula 6sea no fraccionado. Se trasplantaron 6,5 x 107 celulas de medula 6sea nucleadas no fraccionadas de ratones CD45.2 hembra de tipo silvestre a receptores F1 CD45.1 x CD45.2 femeninos no irradiados de tipo silvestre. La sangre periferica total y el quimerismo de las HSC de medula 6sea (definido como KLS CD135-CD34-) se midi6 16 semanas despues del trasplante.

Figura 6. El tratamiento con ACK2 conduce a una marcada reducci6n de la celularidad de la medula 6sea y aumenta el tamano de los osteoblastos. Los huesos de humero de ratones RAG2'/'yc'/' no tratados (Dla 0) o tratados con ACK2 se aislaron 2 o 9 dlas despues de la inyecci6n del anticuerpo. Los huesos fueron fijados, descalcificados, embebidos en parafina y se realizaron tinciones de hematoxilina y eosina en cortes. Ob, osteoblasto; Er, colonia eritroide inmadura.

Figura 7. El tratamiento con ACK2 da como resultado un empobrecimiento de HSC casi completo pero transitorio in vivo. Se utiliz6 la celularidad de la medula 6sea y la frecuencia de HSC para determinar el numero de HSC en la medula 6sea. Tambien se evaluaron los tamanos de bazo para detectar signos de hematopoyesis extramedular. A), control, B) En el momento de la eliminaci6n de ACK2 (Dla 9), C) una semana despues de la

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eliminacion de ACK2 (Dla 16). Los perfiles de citometrla de flujo de las HSC en medula osea linaje- utilizando 3C11, un anticuerpo especlfico de c-kit que se une a un epltopo distinto de ACK2, as! como la frecuencia de KLS CD135-CD150+, de las cuales 19,5 % son HSC, se muestran adyacentes a cada punto temporal correspondiente. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 3 para cada punto temporal).

Figura 8. La administration de ACK2 da lugar al empobrecimiento de HSC tanto en ratones de tipo silvestre como inmunodeficientes. El numero de HSC KLS CD135-CD150+ tanto en los femures como en la tibia de ratones tratados con ACK2 y control se determinaron mediante citometrla de flujo 2 dlas despues del tratamiento con 1 mg de ACK2. Se muestran los valores medios +/- EEM (n = 2); ** indica valor p <0,001.

Figura 9. Estado normal del ciclo celular en HSC receptoras y donantes despues del tratamiento con ACK2. Se obtuvieron los perfiles de ciclo celular de los controles no tratados y tanto de las HSC receptoras como donantes de ratones RAG2"/"yc"/" que hablan sido trasplantados 7 meses antes con HSC de tipo silvestre. Las HSC se identificaron como celulas KLS CD150+CD34-.

Figura 10. Multiples rondas de tratamiento con ACK2 y trasplante de HSC dan como resultado niveles sistematicamente altos de quimerismo del donante. A) Ratones RAG2"/"yc"/" fueron acondicionados con 500 gig de ACK2 y trasplantados siete dlas mas tarde con 5.000 LT-HSC CD45.1+. Se permitio la recuperation de los ratones durante siete dlas y se acondicionaron una vez mas con ACK2 y se trasplantaron siete dlas mas tarde con 5.000 HSC LT GFP+. Se realizo una tercera ronda de tratamiento con ACK2 y trasplante de HSC LT utilizando 5.000 HSC CD45.2+CD45.1. La sangre periferica se analizo 24 semanas mas tarde para determinar el quimerismo de los granulocitos donantes como antes. Se muestran los valores de quimerismo procedentes de cada trasplante en cuatro animales separados.

Figura 11: El empobrecimiento transitorio de CD4 permite el injerto productivo de HSC con incompatibilidades en el complejo menor de histocompatibilidad. Tres ratones Cg_/" que fueron tratados con anticuerpo anti-CD4 y dos ratones Cg'/' que no se trataron fueron trasplantados con 800 HSC GFP+. Se analizo la sangre periferica a las 8 semanas despues del trasplante para determinar el quimerismo de granulocitos, linfocitos B y linfocitos T.

Descripcion detallada de las realizaciones

Se describen en la presente metodos para el injerto de celulas madre, donde las celulas madre endogenas son extraldas selectivamente. La extraction selectiva puede conseguirse administrando anticuerpos citotoxicos especlficos de celulas madre al paciente antes del injerto. Como alternativa, la extraccion selectiva se logra administrando un anticuerpo o farmaco que interfiere selectivamente con la serialization del factor de crecimiento esencial para el crecimiento o mantenimiento de celulas madre, por ej., un agente que interfiere con la senalizacion de c-kit, etc. Despues de la extraccion, y despues de un perlodo de tiempo suficiente para eliminar sustancialmente el agente de extraccion de celulas madre de la circulation del paciente, se introducen celulas madre exogenas en el paciente, donde las celulas madre exogenas ocupan el mismo nicho que las celulas madre endogenas extraldas. Las celulas madre exogenas pueden ser autologas, alogenicas o xenogenicas en relation con el paciente.

El periodo de tiempo requerido para la eliminacion del agente de extraccion puede determinarse emplricamente, o puede estar basado en la experiencia previa de la farmacocinetica del agente. Cuando el agente es un anticuerpo, la determination puede controlarse convenientemente conteniendo celulas madre con suero receptor y determinando la presencia de anticuerpos que se unen a las celulas madre. En otra alternativa, el suero del paciente puede controlarse para determinar la presencia de inhibition del crecimiento selectivo de celulas madre. El tiempo de eliminacion es habitualmente el tiempo suficiente para que el nivel del agente de extraccion disminuya al menos aproximadamente 10 veces respecto a los niveles maximos, habitualmente al menos aproximadamente 100 veces, 1.000 veces, 10.000 veces o mas. Es preferible introducir las celulas madre donantes dentro de la “ventana” de nicho vaclo despues de la extraccion, habitualmente en aproximadamente 3 dlas, aproximadamente 2 dlas, aproximadamente 1 dla o en el momento de la eliminacion.

Es un objetivo de la presente invention proporcionar un nuevo metodo cllnicamente aplicable de trasplante de celulas madre que facilite el injerto y reconstituya la inmunocompetencia del receptor sin necesidad de radioterapia o quimioterapia o desarrollo de GVHD o rechazo de injerto. Los aspectos de la presente invencion se basan en el descubrimiento de que el empobrecimiento del nicho de celulas madre endogenas facilita el injerto eficaz de celulas madre hematopoyeticas (HSC). En particular, la presente invencion combina el uso de la extraccion selectiva de celulas madre endogenas, en combination con la administracion al receptor de celulas madre exogenas, dando como resultado un injerto y tolerancia eficaces a largo plazo.

Las celulas madre endogenas se extraen especlficamente mediante la administracion de un agente selectivo, por ej., un anticuerpo que destruye las celulas diana, es decir, las celulas a las que se une el agente; o un farmaco que interfiere selectivamente con la senalizacion del factor de crecimiento requerida para el crecimiento o mantenimiento de las celulas madre. En algunas realizaciones, el agente es un anticuerpo que se une selectivamente a las celulas madre endogenas de interes. Se entendera por un experto en la materia que los marcadores pueden ser compartidos entre celulas madre y por lo tanto un marcador selectivo puede unirse a ciertas otras celulas presentes en el tejido diana y un farmaco selectivo puede actuar sobre otras determinadas celulas. Por extraccion se entiende una reduction en el numero de celulas madre endogenas viables en el tejido diana, que puede ser una reduction de al menos aproximadamente 20 % de celulas madre endogenas viables, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 90 % o mas, mediante la administracion de uno o mas agentes

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citotoxicos que extraen selectivamente dichas celulas madre endogenas.

El tejido objetivo esta determinado por el nicho en el que normalmente reside una celula madre de interes. En un mamlfero adulto, las celulas madre hematopoyeticas endogenas residen en la medula osea y, por lo tanto, los agentes de extraccion reduciran el numero de celulas madre hematopoyeticas residentes en la medula osea. En un mamlfero adulto, las celulas madre neuronales pueden residir en el hipocampo y, por lo tanto, los agentes de extraccion reduciran el numero de celulas madre neurales residentes en el hipocampo. Las celulas madre mesenquimales tambien residen en la medula osea y, por lo tanto, pueden empobrecerse, con agentes para los marcadores apropiados de la medula osea. Un experto en la materia determinara facilmente el tejido apropiado para las celulas madre residentes.

Ejemplos de marcadores descritos en la presente invencion para la extraccion mediada por anticuerpos de celulas madre hematopoyeticas humanas incluyen CD34; CD90 (thy-1); CD59; CD110 (c-mpl); c-kit; etc. Las celulas madre hematopoyeticas de raton pueden ser extraldas selectivamente a traves de los marcadores Sca-1; CD150; c-kit; ESAM; etc. Los marcadores utiles para la extraccion de celulas madre mesodermicas incluyen FcyRII, FcyRIII, Thy- 1, CD44, VLA-4a, LFA-1p, HSA, |CaM-1, CD45, Aa4.1, Sca-1, etc. Las celulas madre de la cresta neural pueden seleccionarse positivamente con anticuerpos especlficos del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR). Se han descrito en la tecnica celulas madre/progenitoras neurales y su uso en varios protocolos terapeuticos ha sido ampliamente descrito. Por ejemplo, entre otros, en las patentes US-6.638.501, Bjornson et al.; US-6.541.255, Snyder et al.; US-6.498.018, Carpenter; Solicitud de patente de los Estados Unidos 20020012903, Goldman et al.; Palmer et al. (2001) Nature 411 (6833): 42-3; Palmer et al. (1997) Mol Cell Neurosci. 8(6):389-404; Svendsen et al. (1997) Exp. Neurol. 148(1):135-46 y Shihabuddin (1999) Mol Med Today. 5(11): 474-80. Las celulas madre mesenquimales humanas pueden ser extraldas usando los marcadores tales como SH2 (CD105), SH3 y SH4 y Stro-1.

En una realizacion de la invencion, el marcador para la extraccion mediada por anticuerpos es el c-kit (CD117). Los anticuerpos de interes pueden unirse a, y bloquear la actividad de senalizacion de, c-kit.

Como se usa en la presente memoria, el termino “anticuerpo” incluye referencia a una molecula de inmunoglobulina inmunologicamente reactiva con un antlgeno particular, e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. El termino tambien incluye formas geneticamente modificadas tales como anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados. El termino “anticuerpo” tambien incluye formas de anticuerpos que se unen a antlgenos, incluyendo fragmentos con capacidad de union al antlgeno (por ejemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv y rlgG. El termino tambien se refiere a fragmentos Fv de cadena unica recombinantes (scFv). El termino anticuerpo tambien incluye moleculas bivalentes o biespeclficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos.

La seleccion de anticuerpos para la extraccion de celulas madre endogenas puede estar basada en varios criterios, incluyendo selectividad, afinidad, citotoxicidad, etc. La frase “se une especlficamente (o selectivamente)” a un anticuerpo o “es especlficamente (o selectivamente) inmunorreactivo con”, cuando se refiere a una protelna o peptido, se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia de la protelna, en una poblacion heterogenea de protelnas y otras sustancias biologicas. De este modo, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a secuencias de protelnas particulares al menos en un factor dos veces respecto al valor de fondo y mas generalmente en un factor de 10 a 100 veces respecto al valor de fondo. En general, los anticuerpos de la presente invencion se unen a antlgenos en la superficie de celulas diana en presencia de celulas efectoras (tales como celulas asesinas naturales o macrofagos). Los receptores Fc en las celulas efectoras reconocen los anticuerpos unidos. La accion cruzada de los receptores Fc indica a las celulas efectoras que deben destruir las celulas diana por citolisis o apoptosis. En una realizacion, la induccion se consigue mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En realizaciones alternativas, los anticuerpos son activos en la inhibicion del crecimiento de las celulas diana y la extraccion se consigue interfiriendo con la senalizacion del factor de crecimiento, por ej., anticuerpos especlficos para receptores de factor de crecimiento tales como c-kit.

Un anticuerpo inmunologicamente reactivo con un antlgeno particular puede ser generado por metodos recombinantes tales como la seleccion de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, o por inmunizacion de un animal con el antlgeno o con ADN que codifica el antlgeno. Los metodos de preparacion de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos pueden ser, en otra alternativa, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando metodos de hibridoma. En un metodo de hibridoma, un animal hospedador apropiado es generalmente inmunizado con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran especlficamente al agente inmunizante. En otra alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos se fusionan despues con una llnea celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma.

Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo bibliotecas de presentacion de fagos. De forma similar, pueden producirse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena han sido parcial o completamente inactivados. Tras la estimulacion, se observa la

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produccion de anticuerpos humanos, la cual se parece mucho a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos.

Los anticuerpos tambien existen como un numero de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestion con diversas peptidasas. De este modo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la region bisagra para producir F(ab)'2, un dlmero de Fab que es una cadena ligera unida a Vh-Chi por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la region bisagra, convirtiendo de esta manera el dlmero F(ab)2 en un monomero Fab'. El monomero Fab' es esencialmente Fab con parte de la region bisagra. Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, un experto apreciara que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea qulmicamente o utilizando la metodologla del ADN recombinante. De este modo, el termino anticuerpo, tal como se utiliza en la presente memoria, tambien incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificacion de anticuerpos enteros o los sintetizados de novo utilizando metodologlas de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla) o aquellos identificados utilizando bibliotecas de presentacion de fagos.

Un “anticuerpo humanizado” es una molecula de inmunoglobulina que contiene una secuencia minima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de una region determinante del complemento (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos del marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o estructurales importadas. En general, un anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno y, generalmente, dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales (FR) son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera optimamente al menos una parte de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, generalmente la de una inmunoglobulina humana.

La selectividad de un anticuerpo particular se determina generalmente por la capacidad de un anticuerpo para inhibir competitivamente la union del segundo anticuerpo al antlgeno o por la capacidad de un anticuerpo para reaccionar de forma cruzada con multiples epltopos. Puede usarse cualquiera de una serie de ensayos de union competitiva para medir la competencia entre dos anticuerpos frente al mismo antlgeno o entre dos antigenos a un anticuerpo. Un ejemplo de ensayo es un ensayo BIACORE™. Brevemente en estos ensayos, los sitios de union pueden ser cartografiados en terminos estructurales probando la capacidad de los interactuantes, por ej., diferentes anticuerpos, para inhibir la union de otro. Inyectar dos muestras de anticuerpo o antlgeno consecutivas en concentracion suficiente puede identificar pares de anticuerpos competidores para el mismo epitopo de union. Las muestras de anticuerpos deben tener el potencial de alcanzar una saturation significativa con cada inyeccion. La union neta de la segunda inyeccion de anticuerpo es indicativa del analisis de epitopos de union. Se pueden utilizar dos niveles de respuesta para describir los limites de la competencia perfecta frente a la union no competitiva debido a distintos epitopos. La cantidad relativa de respuesta de union de la segunda inyeccion de anticuerpo con relation a la union de epitopos de union identicos y distintos determina el grado de superposition del epitopo.

Los anticuerpos de interes para la extraction se pueden ensayar en cuanto a su capacidad para inducir ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). La actividad de ADCC asociada con anticuerpos puede controlarse y cuantificarse mediante la detection de la liberation de marcador o lactato deshidrogenasa de las celulas lisadas, o la deteccion de la viabilidad celular reducida de la diana (por ejemplo, el ensayo de anexina). Los ensayos de apoptosis pueden realizarse mediante el ensayo Marcado de final de corte de dUTP de Terminal desoxinucleotidil transferasa (TUNEL) (Lazebnik et al., Nature: 371, 346 (1994). La citotoxicidad tambien puede detectarse directamente mediante kits de deteccion conocidos en la tecnica, tales como el kit de deteccion de citotoxicidad de Roche Applied Science (Indianapolis, Ind ). Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invention inducen al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 80 % de citotoxicidad de las celulas diana.

Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con un aumento de la actividad ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), especialmente a dosis bajas de anticuerpo. Los metodos para preparar anticuerpos sin fucosa incluyen el crecimiento en celulas YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las celulas YB2/0 expresan niveles bajos de ARNm de FUT8, que codifica una enzima (a 1,6-fucosiltransferasa) necesaria para la fucosilacion de polipeptidos. Las realizaciones alternativas para promover la citotoxicidad de las celulas con el tratamiento con anticuerpos incluyen la estimulacion mediada por anticuerpos de cascadas de serialization que da como resultado la muerte celular de la celula unida al anticuerpo. Ademas, la estimulacion mediada por anticuerpos del sistema inmunitario innato (por ejemplo, a traves de linfocitos NK) tambien puede dar como resultado la muerte de celulas tumorales o celulas infectadas viralmente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un resto efector. El resto efector puede ser cualquier numero de moleculas, incluyendo restos marcadores tales como marcadores radiactivos o marcadores fluorescentes, o puede ser un resto citotoxico. Los agentes citotoxicos son numerosos y variados e incluyen, pero no se limitan a,

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farmacos citotoxicos o toxinas o fragmentos activos de tales toxinas. Las toxinas adecuadas y sus correspondientes fragmentos incluyen cadena A de la difteria, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina, auristatina-E y similares. Los agentes citotoxicos tambien incluyen compuestos radioqulmicos fabricados conjugando radioisotopos a anticuerpos. El direccionamiento del resto citotoxico a protelnas transmembrana sirve para aumentar la concentracion local del resto citotoxico en el area diana.

En algunas realizaciones de la invencion, el anticuerpo es de un isotipo que puede unirse a los receptores Fc en los macrofagos e impulsar la opsonizacion (Rashid et al., J. Immunol 1992, 148:1382-1388). En algunas realizaciones, el anticuerpo es de un isotipo de IgG, por ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de roedor del tipo IgG2b. En otras realizaciones, el isotipo es un anticuerpo humano o humanizado del isotipo IgG3 (para revision, vease Davies y Metzger, Ann Rev Immunol 1983 1:87-117). Cuando un anticuerpo candidato es de un isotipo que no se une a los receptores Fc y/o impulsa la opsonizacion, el anticuerpo puede modificarse a traves de diversos metodos conocidos en la tecnica para cambiar el isotipo a uno que se una a los receptores Fc y/o impulse la opsonizacion.

En ciertas realizaciones, el agente de extraccion es un inhibidor selectivo de la senalizacion del factor de crecimiento requerida para el mantenimiento o crecimiento de las celulas madre. Ejemplos de tales agentes son los que inhiben la senalizacion mediada por c-kit, que se requiere para el mantenimiento de las celulas madre hematopoyeticas. Tales agentes incluyen anticuerpos que se unen e interfieren con la senalizacion de c-kit y farmacos que inhiben selectivamente la senalizacion de c-kit, por ej., imatinib, nilotinib, ciertos 1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazoles 5- sustituidos, etc., como se conoce en la tecnica y se describen, por ejemplo, en los documentos WO03028711; WO/2005/115304; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2007) 17:3136-3140 y Chow et al. (2007) Leuk Lymphoma. 2007 48(7):1379-88. Dichos agentes pueden ser seleccionados para determinar la actividad de extraccion in vitro o in vivo, por ej., como se ha demostrado en el Ejemplo 1. Dichos metodos de seleccion pueden implicar la adicion de un agente candidato a un cultivo de celulas madre y la determinacion de la inhibicion del crecimiento obtenida por el mismo. La inhibicion selectiva puede determinarse cuantificando el crecimiento en presencia de uno o mas factores de crecimiento. Ademas de c-kit, los receptores de factor de crecimiento de interes incluyen el receptor de trombopoyetina (CD110) sobre celulas madre hematopoyeticas y el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) en celulas madre neurales. Al igual que con los anticuerpos de extraccion, se administran agentes inhibidores del factor de crecimiento a una dosis eficaz para disminuir el numero de celulas madre endogenas viables en el tejido diana, la cual puede ser una reduction de al menos aproximadamente 20 % de celulas madre endogenas viables, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 90 % o mas. Por ejemplo, se puede administrar imatinib a una dosis de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones de la invencion, se administra una combination de anticuerpos de extraccion y agentes inhibidores del factor de crecimiento. En tales terapias de combinacion, se pueden obtener efectos sinergicos cuando se utiliza una cantidad reducida de uno o ambos agentes para conseguir el efecto deseado.

Para la extraccion, el agente de extraccion se formula en una composition farmaceutica. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento y sera verificable por un experto en la materia usando tecnicas conocidas (por ej., Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery; Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) y Pickar, Dosage Calculations (1999)). Como es sabido en la tecnica, pueden ser necesarios ajustes para el acondicionamiento del paciente, la administration sistemica frente a localizada, as! como la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de administracion, la interaction del farmaco y la gravedad de la afeccion y sera verificable con experimentation rutinaria por los expertos en la materia.

Un “paciente” para los propositos de la presente invencion incluye tanto humanos como otros animales, particularmente mamlferos, incluyendo animales de companla y animales de laboratorio, por ej., ratones, ratas, conejos, etc. Por lo tanto, los metodos son aplicables tanto a la terapia humana como a las aplicaciones veterinarias. En una realization, el paciente es un mamlfero, preferiblemente un primate. En otras realizaciones, el paciente es un ser humano.

La administracion de los agentes se puede hacer de diversas maneras como se ha descrito anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a, por via oral, subcutanea, intravenosa, intranasal, transdermica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular.

En una realizacion, las composiciones farmaceuticas estan en una forma soluble en agua, tal como estar presentes como sales farmaceuticamente aceptables, que se pretende que incluyan tanto sales de adicion de acido como de base. “Sal de adicion de acido farmaceuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biologica de las bases libres y que no son biologicamente o de otro modo indeseables, formadas con acidos inorganicos tales como acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido nltrico, acido fosforico y similares y acidos organicos tales como acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido maleico, acido malonico, acido succlnico, acido fumarico, acido tartarico, acido cltrico, acido benzoico, acido

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cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p- toluenosulfonico, acido salicllico y similares. “Sales de adicion de bases farmaceuticamente aceptables” incluyen las derivadas de bases inorganicas tales como las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Particularmente utiles son las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases organicas no toxicas farmaceuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas clclicas y resinas basicas de intercambio ionico, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina.

Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir uno o mas de los siguientes: protelnas portadoras tales como seroalbumina; tampones; cargas tales como celulosa microcristalina, lactosa, malz y otros almidones; agentes aglutinantes; edulcorantes y otros agentes aromatizantes; agentes colorantes y polietilenglicol.

Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en varias formas de dosificacion unitarias dependiendo del metodo de administracion. Por ejemplo, las formas de dosificacion unitarias adecuadas para administracion oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, comprimidos, plldoras, capsulas y pastillas para chupar. Se reconoce que las composiciones de la invencion cuando se administran por via oral, deben protegerse de la digestion. Esto se logra generalmente mediante la formacion de complejos de las moleculas con una composition para hacerlas resistentes a la hidrolisis acida y enzimatica, o envasando las moleculas en un vehlculo adecuadamente resistente, tal como un liposoma o una barrera de protection. Los medios para proteger a los agentes de la digestion son bien conocidos en la tecnica.

Las composiciones para administracion comprenderan comunmente un anticuerpo u otro agente de extraction disuelto en un vehlculo farmaceuticamente aceptable, preferiblemente un vehlculo acuoso. Se puede usar varios vehlculos acuosos, por ejemplo, una solution salina tamponada y similares. Estas soluciones son esteriles y generalmente estan exentas de materia indeseable. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante tecnicas de esterilizacion convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requiera para aproximarse a condiciones fisiologicas tales como agentes de ajuste del pH y agentes tamponadores, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentration de agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionara principalmente basandose en volumenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares, de acuerdo con el modo particular de administracion seleccionado y las necesidades del paciente (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., 1980) y Goodman and Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., Eds., 1996)).

Por lo tanto, una composicion farmaceutica tlpica para administracion intravenosa serla de aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente y dla. Puede usarse dosis de 0,1 hasta 100 mg por paciente y dla, particularmente cuando el farmaco se administra a un sitio aislado y no al torrente sangulneo, tal como en una cavidad corporal o en un lumen de un organo. Pueden administrarse dosis sustancialmente mayores en la administracion topica. Los metodos actuales para preparar composiciones administrables por via parenteral seran conocidos o evidentes para los expertos en la materia, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science y Goodman and Gillman, The Pharmacologial Basis of Therapeutics, supra.

Las composiciones que contienen agentes de extraccion, por ej., anticuerpos, se pueden administrar para tratamiento terapeutico. Las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para extirpar sustancialmente celulas madre endogenas dirigidas, como se ha descrito anteriormente. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una “dosis terapeuticamente eficaz”. Las administraciones unicas o multiples de las composiciones pueden administrarse dependiendo de la dosificacion y frecuencia segun se requiera y toleradas por el paciente. La dosis particular requerida para un tratamiento dependera de la afeccion y la historia del mamlfero, as! como de otros factores tales como edad, peso, sexo, via de administracion, eficacia, etc.

En una realization alternativa de la invencion, se administra un agente acondicionador, particularmente un anticuerpo especlfico de uno o mas de CD4, una especificidad de linfocitos NK, una especificidad de macrofagos y CD8 antes de la infusion de celulas madre exogenas. En una realizacion, el anticuerpo especlfico de uno o mas de CD4; una especificidad de linfocitos NK, una especificidad de macrofagos y CD8 se administra antes del trasplante de las celulas, por lo general desde alrededor 3 dlas hasta alrededor 12 horas antes del trasplante, mas generalmente alrededor de un dla antes del trasplante. Puede mantenerse una reduction en el nivel de linfocitos T en el animal receptor durante al menos una semana, al menos dos semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas o mas despues del trasplante. Tal reduccion puede proporcionar alrededor de aproximadamente un 50 %, alrededor de aproximadamente un 75 %, alrededor de aproximadamente un 90 % de reduccion de los linfocitos T CD4 positivo, en comparacion con los niveles de linfocitos T en ausencia de tratamiento. La reduccion de los linfocitos T puede lograrse, por ejemplo, mediante administracion semanal de un anticuerpo anti-CD4, a una dosis eficaz para disminuir los linfocitos T en el nivel deseado.

La expresion celula madre se utiliza en la presente memoria para referirse a una celula de mamlfero que tiene la capacidad de auto-renovarse y de generar progenie diferenciada (vease Morrison et al. (1997) Cell 88: 287- 298). Generalmente, las celulas madre tambien tienen una o mas de las siguientes propiedades: una capacidad de

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someterse a la replicacion asincronica o simetrica, es decir, donde las dos celulas hijas despues de la division pueden tener diferentes fenotipos; amplia capacidad de auto-renovacion; capacidad para la existencia en una forma mitoticamente quiescente y la regeneracion clonal de todo el tejido en el que existen, por ejemplo, la capacidad de las celulas madre hematopoyeticas para reconstituir todos los linajes hematopoyeticos.

Las celulas madre endogenas pueden caracterizarse por la presencia de marcadores asociados con epltopos especlficos identificados por anticuerpos. Las celulas madre de interes incluyen celulas madre hematopoyeticas; celulas madre de la cresta neural (vease Morrison et al. (1999) Cell 96: 737 - 749); celulas madre mesenquimales; celulas madre mesodermicas; etc. Las celulas de interes son generalmente de mamlferos, donde el termino se refiere a cualquier animal clasificado como mamlfero, incluyendo seres humanos, animales domesticos y de granja y animales de zoologico, de laboratorio, deportivos o animales de companla, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ratones, ratas, conejos, etc. Preferiblemente, el mamlfero es un ser humano.

Para los fines del injerto, se administra a un paciente una composicion que comprende celulas madre, incluyendo, sin limitacion, celulas madre hematopoyeticas. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, Negrin et al. (2000) Biol Blood Marrow Transplant. 6(3): 262-71 describe el trasplante de celulas madre hematopoyeticas de sangre periferica CD34+Thy-1+ intensivamente purificadas. Despues de una dosis alta de quimioterapia, las celulas se perfundieron a una mediana de la dosis de 11,3 x 105/kg. Los receptores mostraron una aceptacion del injerto hematopoyetico rapido y sostenido. McNiece et al. (2000) Blood 96 (9): 3001-7 observaron que las celulas progenitoras de sangre periferica expandidas ex vivo proporcionan una recuperacion rapida de los neutrofilos despues de una quimioterapia de dosis alta en pacientes con cancer de mama. Los injertos autologos de celulas madre hematopoyeticas se describen, entre otros, en Balduzzi et al. (2001) Leukemia. 15(1):50-6. Se perfundieron celulas CD34+ linaje-, lo que permitio la aceptacion inmediata del injerto y la reconstitucion inmunologica. Abundantes trabajos exploran varios metodos para la purificacion de celulas madre y el subsecuente injerto, incluyendo la citometrla de flujo; un sistema isolex (Klein et al. (2001) Bone Marrow Transplant. 28(11):1023-9; Prince et al. (2002) Cytotherapy 4(2):137-45); separacion inmunomagnetica (Prince et al. (2002) Cytotherapy 4(2):147-55; Handgretinger et al. (2002) Bone Marrow Transplant. 29(9):731-6; Chou et al. (2005) Breast Cancer. 12(3): 178-88) y similares. Cada una de estas referencias se cita especlficamente en la presente memoria en particular con respecto a procedimientos, composiciones celulares y dosis para el trasplante de celulas madre hematopoyeticas.

Las celulas que se emplean pueden ser frescas, congeladas o haber sido sometidas a cultivo previo. Pueden ser fetales, de neonatos, adultos, etc. Las celulas madre hematopoyeticas pueden obtenerse del hlgado fetal, medula osea, sangre, particularmente de sangre periferica movilizada por G-CSF o GM-CSF, o cualquier otra fuente convencional. Las celulas para injerto opcionalmente se alslan de otras celulas, donde la forma en la que las celulas madre se separan de otras celulas del linaje hematopoyetico u otro no es crltica para esta invention. Si se desea, puede obtenerse una poblacion sustancialmente homogenea de celulas madre o progenitoras mediante aislamiento selectivo de celulas libres de marcadores asociados con celulas diferenciadas, al tiempo que presentan caracterlsticas epitopicas asociadas con las celulas madre.

Las celulas pueden ser alteradas geneticamente para introducir genes utiles en la celula diferenciada, por ej., para la reparation de un defecto genetico en un marcador individual seleccionable, etc., o genes utiles en la selection contra celulas ES indiferenciadas. Las celulas tambien pueden ser modificadas geneticamente para aumentar la supervivencia, la proliferation de control y similares. Las celulas pueden alterarse geneticamente por transfection o transduction con un vector adecuado, recombination homologa, u otra tecnica apropiada, de manera que expresen un gen de interes. En una realization, las celulas se transfectan con genes que codifican un componente catalltico de telomerasa (TERT), generalmente bajo un promotor heterologo que aumenta la expresion de la telomerasa mas alla de lo que ocurre bajo el promotor endogeno (vease la Solicitud de patente internacional WO 98/14592). En otras realizaciones, se introduce un marcador seleccionable, para proporcionar una mayor pureza de la celula diferenciadora deseada. Las celulas pueden alterarse geneticamente usando sobrenadantes que contienen vector durante un periodo de 8-16 h y despues intercambiarse a medio de crecimiento durante 1-2 dlas. Las celulas geneticamente alteradas se seleccionan usando un agente de seleccion de farmacos tal como puromicina, G418, o blasticidina y despues se vuelven a cultivar.

Las celulas de esta invencion tambien pueden ser alteradas geneticamente con el fin de aumentar su capacidad para participar en la regeneracion de tejidos, o para administrar un gen terapeutico a un sitio de administration. Se disena un vector utilizando la secuencia de codification conocida para el gen deseado, operativamente unido a un promotor que es constitutivo, panespeclfico, especlficamente activo en un tipo celular diferenciado, etc. Los promotores inducibles adecuados se activan en un tipo de celula diana deseada, ya sea la celula transfectada, o su progenie. Por activation transcripcional, se pretende que la transcription se incremente por encima de los niveles basales en la celula diana al menos aproximadamente 100 veces, mas habitualmente por lo menos aproximadamente 1000 veces. Se conocen varios promotores que son inducidos en diferentes tipos de celulas.

Existen muchos vectores utiles para transferir genes exogenos a celulas de mamlfero diana. Los vectores pueden ser episomales, por ej., plasmidos, vectores derivados de virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc. o pueden estar integrados en el genoma de la celula diana, mediante recombinacion homologa o integration aleatoria,

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por ej., vectores derivados de retrovirus tales como MMLV, HIV-1, ALV, etc. Para la modificacion de las celulas madre, se prefieren vectores lentivirales. Los vectores lentivirales tales como los basados en secuencias gag del VIH o VIF pueden usarse para transfectar celulas que no se dividen, tales como la fase de reposo de las celulas madre humanas (ver Uchida et al. (1998) P.N.A.S. 95(20):11939-44).

Tambien pueden utilizarse combinaciones de retrovirus y una llnea de empaquetado apropiada, donde las protelnas de la capside seran funcionales para infectar las celulas diana. Normalmente, las celulas y el virus se incubaran durante al menos aproximadamente 24 horas en el medio de cultivo. Las celulas se dejan a continuacion crecer en el medio de cultivo durante intervalos cortos en algunas aplicaciones, por ej., 24-73 horas, o durante al menos dos semanas y pueden dejarse crecer durante cinco semanas o mas, antes del analisis. Los vectores retrovirales comunmente utilizados son “defectuosos”, es decir, incapaces de producir protelnas virales necesarias para la infeccion productiva. La replicacion del vector requiere crecimiento en la llnea celular de empaquetado.

La especificidad de la celula hospedadora del retrovirus esta determinada por la protelna de la envoltura, env (p120). La protelna de la envoltura es proporcionada por la llnea de celulas de empaquetado. Las protelnas de la envoltura son de al menos tres tipos, ecotropico, anfotropico y xenotropico. Los retrovirus empaquetados con una protelna de cubierta ecotropica, por ej., MMLV, son capaces de infectar a la mayorla de los tipos de celulas murinas y de ratas. Las llneas celulares de empaquetado ecotropicas incluyen BOSC23 (Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90:8392-8397). Los retrovirus que llevan una protelna de envoltura anfotropica, por ej., 4070A (Danos et al, supra.), son capaces de infectar la mayorla de los tipos de celulas de mamlfero, incluyendo el ser humano, perro y raton. Las llneas celulares de empaquetamiento anfotropico incluyen PA12 (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902) GRIP (Danos et al. (1988) PnAs 85:6460-6464). Los retrovirus empaquetados con una protelna de envoltura xenotropica, por ej., AKR env son capaces de infectar la mayorla de los tipos de celulas de mamlferos, excepto las celulas murinas.

Los vectores pueden incluir genes que deben eliminarse posteriormente, por ej., utilizando un sistema de recombinasa tal como Cre/Lox o las celulas que las expresan pueden ser destruidas, por ej., mediante la inclusion de genes que permiten la toxicidad selectiva, como herpesvirus TK, bcl-xs, etc.

En los metodos de la invencion, el agente de extraccion y el agente acondicionador opcional se administran en forma de ciclo corto de terapia antes del trasplante. Normalmente, el tratamiento de extraccion se completa al menos aproximadamente una semana antes del trasplante, al menos aproximadamente 5 dlas antes del trasplante, al menos aproximadamente 3 dlas antes del trasplante. El perlodo de tiempo entre la finalizacion del tratamiento de extraccion y el trasplante es suficiente para eliminar sustancialmente los agentes de extraccion de la circulacion del paciente. Como se usa en la presente memoria, la expresion “eliminar sustancialmente” cuando se hace referencia a anticuerpos puede proporcionar una concentracion de menos de aproximadamente 10 ng/ml presente en el torrente sangulneo. En otra alternativa, una muestra de sangre o suero del paciente puede ser ensayada para determinar la citotoxicidad in vitro de celulas madre exogenas, por ejemplo, en las que no mas de aproximadamente el 1 % de las celulas madre presentes en una muestra se destruyen despues de la exposicion a dicha sangre o muestra de suero del paciente.

Las celulas madre exogenas, que pueden ser parcialmente o sustancialmente purificadas, se administran al paciente de acuerdo con la practica estandar, por ej., a una concentracion de aproximadamente 104 aproximadamente 106 celulas madre/kg de peso del paciente.

El proceso de extraccion, acondicionamiento opcional y trasplante puede repetirse, por ejemplo como se muestra en la Figura 10, en procesos en serie.

Las realizaciones del sistema y los metodos de acuerdo con la invencion son cllnicamente aplicables al trasplante en receptores humanos y, por ejemplo, son adaptables para tener en cuenta incertidumbres tales como el momento de la disponibilidad de celulas alogenicas para receptores humanos y similares. Las realizaciones de acuerdo con la invencion son aplicables a trasplantes semi-alogenicos tales como, pero sin limitarse a, trasplante entre donantes/receptores relacionados que son parcialmente incompatibles en un locus del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o clase II y a trasplantes totalmente alogenicos tales como, pero sin limitarse a, trasplante entre donante/receptor no relacionados, completamente incompatibles para MHC, incluyendo trasplantes xenogenicos a seres humanos. En realizaciones especlficas, se realizan trasplantes de acuerdo con la invencion en los que el donante y el receptor no comparten loci de histocompatibilidad, por ejemplo, trasplantes entre especies o trasplantes entre el donante y el receptor de la misma especie en el que el donante y el receptor no comparten loci. En un ejemplo mas especlfico, el trasplante es de un donante humano a un receptor humano, donde el donante y el receptor no comparten marcadores HLA. La invencion abarca el trasplante de donantes a receptores de cualquier especie, en los que el donante y el receptor no comparten ningun inmunodeterminante analogo a los marcadores HLA o los loci del MHC. En diversas realizaciones, el donante y el receptor pueden ser individuos geneticamente no relacionados, o pueden ser parientes proximos.

Las realizaciones de la invencion incluyen el trasplante en un paciente que sufre un trastorno genetico sangulneo, donde se trasplantan celulas madre exogenas de un fenotipo normal al paciente. Tales enfermedades incluyen, sin

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limitacion, el tratamiento de anemias causadas por la slntesis de hemoglobina defectuosa (hemoglobinopatlas).

La molecula de Hb de un adulto normal (Hb A) consiste en dos pares de cadenas polipeptldicas a y p. La Hb fetal (Hb F, en la cual las cadenas gamma reemplazan a las cadenas beta) disminuye gradualmente en los primeros meses de vida hasta alcanzar <2 % de la Hb total en adultos. En ciertos trastornos de la slntesis de Hb y en los estados aplasicos y mieloproliferativos, se puede aumentar la HbF. La sangre normal tambien contiene aproximadamente el 2,5 % de Hb A2 (compuesta por cadenas alfa y delta). Los defectos pueden tener como resultado moleculas de Hb con propiedades flsicas o qulmicas anormales; algunos tienen como resultado anemias que son graves en homocigotos pero leves en heterocigotos. Algunos pacientes pueden ser heterocigotos por dos de tales anomallas y tienen anemia con caracterlsticas de ambos rasgos.

Las enfermedades de celulas falciformes incluyen la enfermedad HbS, la anemia drepanocltica y la meniscocitosis. La anemia hemolltica cronica que se produce casi exclusivamente en los negros y se caracteriza por eritrocitos en forma de hoz causada por la herencia homocigotica de la Hb S. Los homocigotos tienen anemia de celulas falciformes; los heterocigotos no son anemicos, pero el rasgo falciforme (anemia falciforme) puede ser demostrado in vitro. En la Hb S, la valina esta sustituida por acido glutamico en el sexto aminoacido de la cadena beta. La desoxi-Hb S es mucho menos soluble que la desoxi-Hb A; forma un gel semisolido de tactoides en forma de varilla que hace que los globulos rojos se hinchen en sitios de baja PO2. Los eritrocitos distorsionados e inflexibles se adhieren al endotelio vascular y tapan pequenas arteriolas y capilares, lo que conduce a la oclusion y al infarto. Debido a que los eritrocitos falciformes son demasiado fragiles para resistir el embate mecanico de la circulacion, se produce la hemolisis despues de entrar en la circulacion. En los homocigotos, las manifestaciones cllnicas son causadas por la anemia y acontecimientos de oclusion de vasos que tienen como resultado isquemia e infarto del tejido. El crecimiento y el desarrollo se deterioran y la susceptibilidad a la infeccion aumenta. La anemia suele ser grave, pero varla mucho entre los pacientes. La anemia puede exacerbarse en los ninos por secuestro agudo de las celulas falciformes en el bazo.

La crisis aplasica se produce cuando la eritropoyesis de la medula disminuye durante la infeccion aguda (especialmente viral). Los infartos oseos producen crisis de dolor, el complejo de slntomas mas comun en los estados Hb S-S, S-A y S-C. El dolor de huesos largos es el slntoma mas comun; en ninos, el dolor intenso en las manos y los pies es comun y tlpico. Puede producirse artralgia con fiebre y es comun la necrosis avascular de la cabeza femoral. Las ulceras cronicas perforadas en los tobillos tambien son comunes. El dolor abdominal intenso con vomito puede simular trastornos abdominales graves; tales crisis dolorosas suelen asociarse con dolor de espalda y articular. La hemiplejla, la paralisis de los nervios craneales y otras alteraciones neurologicas pueden tener como resultado la oclusion de los vasos intracraneales mayores. Las infecciones, particularmente neumococicas, son comunes, especialmente en la primera infancia y se asocian con una alta tasa de mortalidad.

En la actualidad, la terapia es sintomatica porque no hay ningun farmaco antidepranocltico in vivo. En general, las crisis se manejan con una hidratacion oral o IV intensa y con analgesicos, incluyendo narcoticos para el dolor. En caso necesario pueden administrarse transfusiones (generalmente cada 3 a 4 semanas) para mantener la Hb A en> 50 % (50 a 70 %) de la Hb total. El trasplante de medula osea ha tenido exito en un pequeno numero de pacientes. La terapia genica ofrece actualmente la mejor esperanza para la curacion.

En la enfermedad de la hemoglobina C, el grado de anemia es variable pero puede ser moderadamente grave. De los negros en los EE.UU., del 2 al 3 % muestran el rasgo. Los slntomas en los homocigotos son causados por la anemia. La artralgia es comun. Puede producirse dolor abdominal, pero no se producen las crisis abdominales de la anemia de celulas falciformes. El paciente puede tener una ligera ictericia. El bazo generalmente se agranda. Pueden ocurrir episodios de secuestro esplenico con dolor en el cuadrante superior izquierdo y disminuciones abruptas en los valores de eritrocitos; si son graves, puede ser necesaria una esplenectomla.

En los homocigotos, la anemia es normocltica, donde se observa en el frotis del 30 al 100 % de celulas diana, esferocitos asociados y, raramente, globulos rojos que contienen cristales. En pacientes con microcitosis que no presentan deficiencia de Fe, esta presente alfa-talasemia concomitante. Los reticulocitos aumentan ligeramente y pueden observarse eritrocitos nucleados. Los eritrocitos no tienen forma de hoz. En la electroforesis, la Hb es de tipo C. La bilirrubina serica esta ligeramente elevada y el urobilinogeno aumenta en las heces y la orina. No hay un tratamiento especlfico. La anemia no suele ser lo suficientemente grave como para requerir la transfusion de sangre.

La enfermedad por hemoglobina E es la tercera Hb mas frecuente en el mundo (despues de la Hb A y la Hb S), principalmente en las poblaciones de Asia Sudoriental (> 15 %) y negras, pero rara vez en las poblaciones chinas. La Hb E es a2 p2 26 (glu ^ lis). En los heterocigotos (Hb AE), no se observan anomallas en la sangre periferica. La Hb E homocigotica se asocia con una anemia microcltica leve con focalizacion prominente. Los heterocigotos dobles para la Hb E y la beta-talasemia tienen una enfermedad hemolltica mas grave que en el caso de la S-talasemia.

Las talasemias son un grupo de anemias cronicas, hereditarias y microclticas, caracterizadas por una slntesis de Hb defectuosa y una eritropoyesis ineficaz, particularmente comun en personas de ascendencia mediterranea, africana y del sudeste asiatico. La talasemia es uno de los trastornos hemollticos hereditarios mas comunes. Es el resultado de la slntesis desequilibrada de Hb causada por la disminucion de la production de al menos una cadena

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polipeptidica de globina (p, a, y, 5).

La p-talasemia es el resultado de la disminucion de la produccion de cadenas peptldicas p. La enfermedad suele ser autosomica recesiva: los heterocigotos son portadores y tienen anemia microcltica leve a moderada asintomatica (talasemia menor); los slntomas tlpicos se producen en los homocigotos (talasemia mayor). Tambien existen las formas autosomicas dominantes. La a-talasemia, que resulta de la disminucion de la produccion de cadenas de polipeptido a, tiene un patron de herencia mas complejo, porque el control genetico de la slntesis de la cadena a implica dos pares de genes estructurales. Los heterocigotos para el defecto en un solo gen (alfa-talasemia-2 [silenciosa]) no suelen presentar anomallas cllnicas. Los heterocigotos para un defecto en dos genes u homocigotos para el defecto en un solo gen (alfa-talasemia-1 [rasgo]) tienden a manifestar un cuadro cllnico similar al de los heterocigotos para p-talasemia. La herencia tanto de un defecto de un solo gen como de un defecto para dos genes perjudica mas gravemente a la produccion de la cadena alfa. La deficiencia en la cadena a da lugar a la formacion de tetrameros de las cadenas p en exceso (Hb H) o, en lactantes, de las cadenas y (Hb de Bart). La homocigosidad para el defecto de doble gen es letal porque la Hb que carece de cadenas alfa no transporta O2.

Las caracterlsticas cllnicas de las talasemias son similares pero varlan en gravedad. La p-talasemia menor es cllnicamente asintomatica. La p-talasemia mayor (anemia de Cooley) presenta slntomas de anemia grave, espacio de medula ampliamente expandido y sobrecarga de Fe transfusional y absorbente. Los pacientes tienen ictericia y ulceras en las piernas y se produce colelitiasis (como en la anemia de celulas falciformes). La esplenomegalia es comun y el bazo puede ser enorme. Si se desarrolla un secuestro esplenico, se acorta el tiempo de supervivencia de los eritrocitos normales transfundidos. La hiperactividad de la medula osea provoca el engrosamiento de los huesos craneales y las eminencias malares. La afectacion de los huesos largos hace que las fracturas patologicas sean comunes. Las tasas de crecimiento se deterioran y la pubertad puede verse significativamente retrasada o ausente. Los depositos de Fe en el musculo cardlaco pueden causar disfuncion e insuficiencia cardlaca. La siderosis hepatica es tlpica, lo que conduce a trastornos funcionales y cirrosis. La a-talasemia-1 (rasgo) tiene una presentacion similar a la de la p-talasemia menor. Los pacientes con enfermedad de la Hb H a menudo tienen anemia hemolltica sintomatica y esplenomegalia.

El trasplante alogenico de medula osea ha tenido exito en el pequeno numero de pacientes que lo han recibido, pero el trasplante para enfermedades hematologicas se ha visto limitado por la morbilidad y mortalidad asociadas con la radiacion y la quimioterapia utilizadas para el acondicionamiento.

La anemia aplasica es el resultado de una perdida de precursores de eritrocitos, ya sea por un defecto en la reserva de celulas madre o por una lesion en el microambiente que soporta la medula osea, y a menudo con valores de MCV altos en el llmite. El termino anemia aplasica implica comunmente una panhipoplasia de la medula con leucopenia y trombocitopenia asociadas.

Aproximadamente la mitad de los casos de anemia aplasica verdadera son idiopaticos. Una forma rara de anemia aplasica, la anemia de Fanconi ocurre en ninos con cromosomas anormales. La aplasia pura de eritrocitos implica un mecanismo selectivamente destructivo para los precursores eritroides. La aplasia cronica de los eritrocitos se ha asociado con trastornos hemollticos (eritroblastopenia aguda), timomas, lesiones inmunologicas y menos frecuentemente con farmacos (por ejemplo, tranquilizantes, anticonvulsionantes), toxinas (fosfatos organicos), deficiencia de riboflavina y leucemia linfocltica cronica. Una forma congenita rara, el slndrome de Blackfan-Diamond, que originalmente se crela que se manifestaba durante la lactancia, se ha diagnosticado en la edad adulta.

El trasplante de medula osea de un gemelo identico o un hermano HLA compatible es un tratamiento probado para la anemia aplasica grave, particularmente en pacientes de <30 anos. Al diagnostico, los hermanos pueden ser evaluados para la compatibilidad HLA.

La inmunodeficiencia combinada es un grupo de trastornos caracterizados por una deficiencia congenita y habitualmente hereditaria de sistemas de linfocitos B y T, aplasia linfoide y displasia tlmica. Las inmunodeficiencias combinadas incluyen inmunodeficiencia combinada severa, agammaglobulinemia suiza, inmunodeficiencia combinada con deficiencia de adenosina desaminasa o nucleosido fosforilasa e inmunodeficiencia combinada con inmunoglobulinas (slndrome de Nezelof). La mayorla de los pacientes presentan infecciones tempranas con aftas, neumonla y diarrea. Si no se trata, la mayorla muere antes de los 2 anos. La mayorla de los pacientes tienen deficiencia profunda de linfocitos B e inmunoglobulina. Los siguientes puntos son caracterlsticos: linfopenia, niveles bajos o ausencia de linfocitos T, respuesta proliferativa deficiente a mitogenos, anergia cutanea, ausencia de sombra tlmica y reduccion del tejido linfoide. La neumonla por Pneumocystis y otras infecciones oportunistas son comunes.

Existen varias variantes del trastorno. En el 67 % de los casos, puede establecerse una herencia ligada al cromosoma X o una herencia autosomica recesiva. La mayorla de los pacientes con herencia ligada al cromosoma X tienen inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X, asociada con mutaciones de la cadena y del receptor de IL-2.

Aproximadamente la mitad de los pacientes con una herencia autosomica recesiva tienen deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), una enzima de la via de recuperacion de las purinas que convierte la adenosina y la

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desoxiadenosina en inosina y desoxiinosina, respectivamente. La deficiencia de ADA produce cantidades elevadas de desoxiadenosina trifosfato (dATP), que inhibe la slntesis de ADN. Los pacientes deficientes en ADA pueden ser normales al nacer pero desarrollan un deterioro inmunologico progresivo a medida que se acumula el dATP. En el slndrome de Nezelof (inmunodeficiencia combinada con Igs), existe una profunda inmunodeficiencia celular, pero niveles normales, casi normales o elevados de Igs, pero con una funcion deficiente de anticuerpos.

Otras variantes incluyen deficiencias de citocinas (deficiencia de IL-1, deficiencia de IL-2, deficiencia multiple de citocinas), defectos estructurales del receptor de linfocitos T, defectos de la transduccion de senales, ausencia de antlgenos HLA de la clase II y/o de la clase I (slndrome de linfocitos desnudos), enanismo de miembros cortos, hipoplasia cartllago-cabello con inmunodeficiencia e inmunodeficiencia combinada con eosinofilia (slndrome de Omenn).

Parte experimental Ejemplo 1

Empobrecimiento basado en anticuerpos de nichos vacfos de celulas madre hematopoyeticas para el trasplante eficiente

Demostramos que la administracion de un anticuerpo empobrecedor especlfico de c-kit conduce a la eliminacion altamente eficiente de las celulas madre hematopoyeticas (HSC) del hospedador y a altos niveles de quimerismo de las HSC del donante despues del trasplante.

Tras el trasplante intravenoso, las celulas madre hematopoyeticas (HSC) pueden albergar nichos especializados de medula osea, sin embargo los niveles de aceptacion del injerto rara vez superan el 0,5 % tras el trasplante en receptores inmunodeficientes sin acondicionamiento toxico. Aqul, proporcionamos la prueba de que, aparte de las barreras inmunitarias, el injerto de HSC del donante esta restringido por la ocupacion de los nichos apropiados por las HSC del hospedador. La administracion de ACK2, un anticuerpo empobrecedor especlfico de c-kit, condujo a la eliminacion transitoria de > 98 % de las HSC endogenas y el trasplante de estos animales con HSC del donante condujo a niveles de quimerismo de hasta el 90 %. La extrapolacion de estos metodos a seres humanos puede permitir reglmenes de acondicionamiento eficientes pero menos estrictos para el trasplante.

Las HSC son las unicas celulas dentro de la medula osea (BM) que poseen la capacidad de diferenciarse en todos los linajes de sangre y sin embargo auto-renovarse y mantenerse durante toda la vida. Estas dos propiedades, junto con la capacidad de albergar microambientes altamente especializados dentro de la medula osea que les permiten funcionar correctamente, han permitido que las HSC, incluidas en las preparaciones hematopoyeticas en los trasplantes de BM, se conviertan en las unicas celulas madre en el uso cllnico rutinario. Son ampliamente utilizadas para el tratamiento de algunos trastornos hematologicos, como la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) y el fracaso hematopoyetico despues de la irradiacion y la quimioterapia. Tambien se usan en varios otros trastornos hematologicos. En modelos animales y anecdoticamente en seres humanos, las HSC de donantes normales tambien han demostrado ser utiles en el tratamiento de una amplia gama de trastornos autoinmunitarios tales como diabetes, el modelo NZB/W de lupus y esclerosis multiple. Las HSC tambien son capaces de inducir la tolerancia al trasplante a los tejidos donantes de HSC. Sin embargo, el uso de HSC para tales trastornos no es comun debido a los reglmenes de acondicionamiento toxicos actualmente requeridos para el injerto y la enfermedad de injerto contra huesped causada por linfocitos T en la medula o sangre movilizada que suministra las HSC.

Generalmente, el trasplante alogenico eficiente requiere acondicionamiento del receptor con tratamientos citorreductores toxicos con el fin de prevenir el rechazo inmunologico del injerto. Sin embargo, incluso en ausencia de barreras inmunitarias, los niveles de aceptacion del injerto del donante despues del trasplante de HSC parecen estar restringidos en receptores no acondicionados. En concordancia con los datos cllnicos sobre el trasplante de BM de pacientes con SCID que no hablan sido acondicionados con farmacos citorreductores, se encontro que el trasplante de HSC en ratones SCID no acondicionados condujo a una restauracion de los linfocitos B y T funcionales, aunque el quimerismo de las HSC del donante permanecio < 1%. Estos niveles bajos de quimerismo tambien se pudieron lograr cuando se trasplantaron HSC CD45.1 en ratones CD45.1 x CD45.2 de tipo silvestre no acondicionados, que son geneticamente incapaces de rechazar el injerto, pero no en receptores de CD45.2, los cuales presumiblemente pueden rechazar el injerto basandose en las diferencias antigenicas de la protelna CD45.

Hemos planteado la hipotesis de que la aceptacion del injerto de HSC del donante podrla estar limitada por la ocupacion de los nichos de HSC adecuados y que la eliminacion especlfica de las HSC del hospedador de estos nichos podrla aumentar la aceptacion del injerto de HSC del donante. En los estudios que se describen a continuacion, se proporciona la prueba de que el empobrecimiento mediado por anticuerpos especlficos de las HSC del hospedador conduce a una drastica mejora en la eficacia del injerto de HSC del donante. Estos datos confirman que la disponibilidad de nichos regula la eficiencia del trasplante de HSC. Ademas, estos estudios proporcionan un marco para el uso de anticuerpos altamente especlficos para eliminar de forma segura y reemplazar las HSC geneticamente anormales para el tratamiento de trastornos hematologicos.

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Hemos demostrado previamente que las HSC normales en la medula estan en recirculacion continua de la medula a la sangre y de nuevo a la medula. Las celulas de la sangre entran en la medula osea, el bazo y el higado y pueden establecer una auto-renovacion y una hematopoyesis a largo plazo. Hemos demostrado previamente que en cualquier instante, aproximadamente 0,1-4,5 % de las HSC estan en este proceso, lo que nos lleva a proponer que hay un numero equivalente de nichos vacios de HSC en cualquier instante. De acuerdo con esta hipotesis, observamos poca diferencia en el quimerismo de granulocitos o de HSC cuando dosis de celulas que van desde 500 a 4.000 HSC purificadas se trasplantaron en un unico bolo en ratones no acondicionados deficientes en el gen de activacion de la recombinasa 2 (RAG2-/-) o con deficiencia en la cadena gamma comun de la interleucina 2 RAG2-/- (RAG2-/-yc-/-), que se comportan de manera similar entre si con respecto al trasplante de HSC.

Para abordar mas rigurosamente si los nichos apropiados en receptores no acondicionados pueden ser saturados por HSC trasplantados de una manera dependiente de la dosis, trasplantamos ratones Rag2-/-Yc-/- no acondicionados con numeros variables de HSC c-kit+linaje- Sca-1 + (KLS) CD34"CD150+ de ratones transgenicos GFP. El quimerismo de granulocitos de sangre periferica se midio a las 16 semanas despues del trasplante, lo que previamente se ha demostrado que refleja con exactitud el quimerismo de las HSC del donante en este sistema no acondicionado. El quimerismo de los granulocitos de los donantes aumento significativamente en dosis entre 10 y 250 de HSC trasplantadas, pero el trasplante de mas de 250 celulas condujo a aumentos mas modestos en el quimerismo (Fig. 1).

Por lo tanto, el aumento de la dosis de HSC trasplantadas no dio lugar a un aumento lineal en el quimerismo del donante, como cabria esperar en un modelo donde las HSC endogenas pueden reemplazarse facilmente por HSC trasplantadas. En cambio, los datos confirman que el nicho de HSC es una entidad muy especifica y sugieren que el numero de nichos disponibles para el injerto en cualquier punto dado en condiciones homeostaticas es similar al numero de HSC estimado en su fase circulatoria. En este modelo, las dosis aumentadas de HSC trasplantadas conducen a niveles de quimerismo ligeramente aumentados, lo que aumenta la probabilidad de que una HSC endogeno salga a la circulacion y desocupe un nicho en una proximidad espacial cercana a la HSC de un donante aun no injertado. Sin embargo, el proceso es claramente ineficiente y no lineal, ya que el trasplante de 1.000 HSC, equivalente a aproximadamente el 5 % del numero total de HSC en un raton, condujo solo al 0,6 % de quimerismo (Fig. 1).

Para determinar si pueden ocupar estos nichos solo las HSC o bien otros tipos celulares, trasplantamos competitivamente ratones Rag2'/'Yc'/' (CD45.2) no acondicionados con 1.000 HSC CD45.1 junto con 100.000 celulas progenitoras GFP KLS CD34 +, que son la progenie descendente inmediata de las HSC. La inclusion de 100.000 celulas progenitoras KLS CD34+ en el trasplante no afecto a la aceptacion del injerto del HSC, ya que no hubo diferencias significativas en el quimerismo del donante en relacion a los receptores que recibieron 1.000 HSC solo (Fig. 1). A pesar de la inclusion de un exceso de 100 veces de celulas progenitoras, el quimerismo del donante resultante de las 1.000 HSC fue significativamente mayor que la dosis de celulas HSC 10 (Fig. 1). Estos datos implican que las celulas progenitoras KLS CD34+ no compiten efectivamente con las HSC para los mismos nichos y que la presencia o ausencia de estas celulas progenitoras no auto-renovables no afecta el injerto de HSC.

La contribucion mieloide y linfoide derivada del donante GFP+ de las celulas KLS CD34+ trasplantadas se mantuvo hasta al menos 8 semanas despues del trasplante en niveles similares a los que hemos observado anteriormente, lo que sugiere que las HSC y su progenie inmediata utilizan nichos distintos para mantener la funcion. Los estudios en ratones no acondicionados han demostrado que los trasplantes de BM no fraccionados de donantes conducen a niveles de quimerismo que son linealmente proporcionales a la dosis de celulas trasplantadas, lo que sugiere que el “espacio” no es un factor limitante en los trasplantes de BM. Sin embargo, estos estudios no determinaron si todos los tipos de celulas o solo ciertos subconjuntos de celulas que estan presentes dentro del compartimento heterogeneo de la BM son facilmente desplazados.

Debido a que las HSC representan <0,01 % de todas las celulas nucleadas de la medula osea, quisimos determinar si el quimerismo total del donante medido en estos estudios refleja con exactitud el quimerismo de las HSC. Para examinar este punto, se trasplantaron 6,5 x 107 celulas de medula osea no fraccionadas de ratones CD45.2 hembra en receptores F1 CD45.1 x CD45.2 para excluir la posibilidad de rechazo del injerto. Esta dosis celular trasplantada representa 12-15 % de la celularidad total de la medula osea receptora, segun una estimation, o 20-28 % segun otra. Dieciseis semanas despues del trasplante, medimos el quimerismo total de sangre periferica y el quimerismo de las HSC de medula osea directamente. El quimerismo total en la sangre periferica fue del 11 % (Fig. 5), similar a las predicciones realizadas en estudios anteriores. Sin embargo, el quimerismo medio de las HSC fue solo 4,5 %, aproximadamente 2,5 veces menor que el quimerismo total (Fig. 5). Estos datos demuestran que la medicion del quimerismo total conduce a una sobrestimacion del quimerismo de las HSC de la BM. Por lo tanto, los datos confirman que incluso en este sistema, la sustitucion de HSC es ineficiente en receptores no acondicionados.

Teniendo en cuenta estos datos, razonamos que la elimination especifica de las HSC del hospedador que ocupan estos nichos altamente especificos en animales no acondicionados permitiria altos niveles de aceptacion del injerto de HSC del donante. In vivo, se ha demostrado que en muchos contextos, la administration de anticuerpos especificos de antigenos particulares, tales como CD20, media el empobrecimiento celular especifico mediante opsonization, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), reclutamiento de complemento o la

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interruption de vlas de serialization esenciales. Hemos planteado la hipotesis de que los anticuerpos tambien pueden ser utilizados para dirigir y empobrecer las HSC, creando as! mas nichos disponibles de HSC para el injerto de HSC del donante. Para probar esta hipotesis, comparamos una serie de diferentes anticuerpos monoclonales y ACK2 seleccionados, un anticuerpo conocido por reconocer c-kit, el receptor para el factor de celulas madre (SCF), y antagonizar la funcion in vivo.

Ademas, planteamos la hipotesis de que si los anticuerpos ACK2 eran capaces de empobrecer las HSC endogenas, los anticuerpos residuales en el suero de ratones tambien inhibirlan y/o empobrecerlan las HSC del donante trasplantado. Para determinar la cinetica del aclaramiento de anticuerpos in vivo, se administraron 500 pg de ACK2 por via intravenosa a ratones inmunodeficientes Rag2-/-Yc-/- y se ensayo el suero cada dos dlas para determinar la presencia de anticuerpo mediante tincion de mastocitos c-kit+. El anticuerpo residual se detecto en el suero hasta cinco dlas despues de la inyeccion; sin embargo, todos los anticuerpos ACK2 detectables se hablan eliminado del suero siete dlas despues de la inyeccion (Fig. 2A). En ciertas otras preparaciones de ACK2, el anticuerpo persistio en el suero de ratones hasta ocho dlas despues de la inyeccion.

Para determinar si la administration de ACK2 podrla empobrecer las HSC in vivo, hemos cuantificado los numeros de HSC y las frecuencias en la medula osea de ratones tratados en el momento de la elimination de ACK2. En este punto temporal, se observo una disminucion de ~ 99 % en el numero de HSC fenotlpicamente identificables (KLS CD135- CD150+) (Fig. 2B). Tambien se cuantifico el numero de HSC de medula osea utilizando la expresion de Sca- 1 y CD150, junto con la falta de expresion de CD34, CD135, CD244, CD48 y CD41 y otros antlgenos asociados con el compromiso de linaje y observamos una disminucion similar en el numero de HSC y de la frecuencia. Este tratamiento no condujo a una movilizacion evidente de HSC, ya que no se detecto un aumento en las HSC fenotlpicas en los bazos o sangre de ratones tratados con ACK2.

Con el fin de controlar la posibilidad de que el tratamiento con ACK2 cambiase el fenotipo de la superficie celular de las celulas HSC del hospedador y para verificar que ACK2 empobrecla las HSC funcionales del hospedador, la medula osea no fraccionada de animales acondicionados con ACK2 o control tratados con IgG de rata, se trasplantaron en receptores irradiados junto con la medula osea competidora. Los ratones Rag2-/-Yc-/- fueron acondicionados con 500 pg de ACK2 y en el momento de la eliminacion del anticuerpo, 200.000 celulas de medula osea de animales acondicionados con ACK2 se trasplantaron junto con 200.000 celulas de medula osea competidora marcadas congenicamente procedentes de ratones de tipo silvestre no tratados a receptores irradiados letalmente. El trasplante de BM a partir de animales tratados con ACK2 condujo a unos valores de aceptacion del injerto marcadamente reducidos con respecto a los obtenidos con el trasplante de BM de control (Fig. 2C). Estos datos demuestran que ACK2 empobrece las HSC funcionales de la BM.

Para determinar los posibles efectos de la movilizacion directa del tratamiento con ACK2, se trasplanto toda la poblacion de esplenocitos de animales acondicionados con ACK2 o control junto con 200.000 celulas de medula osea competidora marcadas congenicamente procedentes de ratones de tipo silvestre no tratados a receptores irradiados letalmente. El quimerismo del donante resultante del trasplante de esplenocitos de animales acondicionados con ACK2 se redujo significativamente en relation con el quimerismo resultante del trasplante de esplenocitos de control (Fig. 2D). Estos datos indican que el tratamiento con ACK2 empobrece las HSC del bazo as! como de la BM y no induce directamente a la movilizacion temprana de las HSC.

Con el fin de determinar el mecanismo mediante el cual ACK2 empobrece las HSC, se compararon los efectos del tratamiento con ACK2 con el de 2B8, otro anticuerpo monoclonal anti-c-kit del mismo isotipo que IgG2b, que tine celulas que expresan c-kit con intensidad equivalente a la de ACK2. Sin embargo, el tratamiento con 2B8 no disminuyo los numeros de HSC funcionales in vivo y el trasplante de celulas de medula osea de ratones tratados con 2B8 dio lugar a un injerto normal (Fig. 2C). Planteamos la hipotesis de que ACK2 puede empobrecer las HSC antagonizando la funcion de c-kit mediada por SCF, como se ha demostrado anteriormente en los melanocitos. Para probar esta hipotesis, cultivamos HSC purificadas en presencia de ACK2 y observamos que inhibla la proliferation dependiente de SCF (Fig. 2E), pero no la proliferacion mediada por trombopoyetina (TPO) (Fig. 2E). A diferencia de ACK2, los efectos de 2B8 (un anticuerpo anti-c-kit diferente) sobre la proliferacion mediada por SCF fueron modestos (Fig. 2E). Por lo tanto, es probable que ACK2 provoque el empobrecimiento de HSC a traves de la inhibition de la senalizacion de SCF, mientras que 2B8 se une a una region de la molecula c-kit que no es esencial para la senalizacion. La importancia de la senalizacion de c-kit mediada por SCF para las HSC se ha demostrado en ratones W/W, que carecen de la expresion de c-kit funcional y mueren in utero salvo que se trasplanten con HSC normales.

Adicionalmente, se ensayo el efecto de ACK2 sobre varias celulas progenitoras hematopoyeticas in vivo a los dos y nueve dlas despues de la administracion de ACK2. Dos dlas despues de la administracion de ACK2, todos los progenitores mieloides en la medula osea, que expresan niveles similares de c-kit como las HSC, comenzaron a disminuir, sin embargo las HSC se vieron mas afectadas (Fig. 2F). Por lo tanto, estos datos son de nuevo incompatibles con una actividad de empobrecimiento directa mediada por Fc de celulas c-kit+ por ACK2 y mas bien apoyan un mecanismo por el cual las celulas progenitoras se pierden gradualmente debido a la falta de reposition por HSC y otros progenitores tempranos dentro del compartimento de KLS, o por el bloqueo de sus receptores de c- kit.

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En consonancia con este mecanismo, nueve dlas despues de la administration de ACK2, las HSC (Fig. 2F), los progenitores mieloides (Fig. 2F) y los progenitores linfoides comunes estaban muy disminuidos. Tras el examen histologico, encontramos una disminucion gradual similar de la celularidad de la medula osea (Fig. 6). Ademas, se observo un aumento progresivo en el tamano de los osteoblastos (Fig. 6, columna derecha). Estos datos indican que ACK2 provoca un empobrecimiento significativo pero transitorio de las HSC del hospedador y da como resultado una ventana corta en la cual los animales tratados con ACK2 son receptivos al trasplante de HSC de un donante.

Es importante destacar que todos los ratones sobrevivieron al tratamiento sin signos evidentes de estres aparte de una perdida temporal del color de la piel, como se ha descrito anteriormente. La falta de mortalidad en ratones tratados con ACK2 es probablemente debida al mecanismo de empobrecimiento de ACK2, dado que las celulas sangulneas efectoras maduras no se ven afectadas directamente por el tratamiento y solo se pierden gradualmente debido al desgaste. Esto es apoyado por la observation de que una serie de parametros hematologicos en la sangre periferica solo se ven ligeramente afectados por el tratamiento con ACK2 (Tabla 1).

Tabla complementaria S1. Efectos hematologicos del tratamiento con ACK2.

Control ACK2

Eritrocitos (x 106 celulas/pl)

9,92 8,21

Hemoglobina (gramos/dl)

14,5 11,8

Hematocrito (%)

45,9 36,9

Volumen corpuscular medio (fl)

46,3 45,0

Hemoglobina corpuscular media (pg)

14,6 14,4

Hematocrito corpuscular medio (g/dl)

31,6 32,0

Ademas, se observo un numero significativo de eritrocitos maduros y colonias eritroides regeneradoras en la medula osea 9 dlas despues del tratamiento con ACK2 (Figura 6, panel inferior izquierdo). Ademas, tanto los ratones machos como los hembras tratados con ACK2 permanecieron fertiles y tuvieron descendencia viable. Por lo tanto, los efectos secundarios del empobrecimiento mediado por anticuerpos de las HSC estan en marcado contraste con la irradiation letal, que requiere el trasplante temprano de la medula osea o progenitores hematopoyeticos para prevenir la muerte del animal, un procedimiento que en los seres humanos se acompana de altos niveles de morbilidad y mortalidad significativa.

Se observo un empobrecimiento casi completo de las HSC ya a los dos dlas despues de la administracion de ACK2. Sin embargo, algunas HSC claramente permanecen y conservan la capacidad de auto-renovacion, ya que dos semanas despues de la elimination del suero del anticuerpo, los perfiles de superficie celular de HSC (Fig. 7) y los numeros (Fig. 2B) hablan vuelto a niveles casi normales. Aunque el tratamiento con ACK2 no causa directamente la movilizacion de HSC del hospedador (Fig. 2D), se produce una hematopoyesis extramedular esplenica significativa durante la fase de recuperation una semana despues del aclaramiento de ACK2 (Fig. 7). A las dos semanas despues de la eliminacion de ACK2 del suero, los bazos de los animales pareclan identicos a los de los animales de control no tratados. Los ratones de tipo silvestre, as! como los ratones pMT deficientes en linfocitos B tambien mostraron niveles disminuidos de HSC en su medula osea despues del tratamiento con ACK2 (Fig. 8). Curiosamente, la recuperacion de los numeros de HSC parecla ser mas rapida en animales con un numero suficiente de linfocitos B o con un numero suficiente de linfocitos T despues de la eliminacion de ACK2, lo que sugiere un papel potencial inesperado para los linfocitos en la estimulacion de la recuperacion hematopoyetica.

Para probar si la extraction de HSC del hospedador podrla mejorar la eficacia del injerto de HSC del donante, acondicionamos ratones RAG2-/- (CD45.1), que se comportan de forma identica a RAG2-/-yc-/- con respecto al tratamiento con anticuerpos, con 500 pg de ACK2. Estos ratones se trasplantaron despues con 5.000 LT-HSC de CD45.2 de tipo silvestre siete dlas despues de la administracion del anticuerpo, un punto temporal en el que no habla ACK2 detectable en el suero. Se obtuvo sangre periferica de los receptores cada cuatro semanas despues del trasplante y se cuantifico quimerismo de granulocitos. El quimerismo medio de los granulocitos de los donantes a las 37 semanas despues del trasplante fue del 16,1 %, lo que refleja un aumento de> 10 veces en comparacion con los animales de control no tratados que fueron trasplantados con el mismo numero de HSC (Fig. 3A). Las HSC injertadas tambien dieron lugar a linfocitos B y linfocitos T perifericos derivados del donante (Fig. 3B). Tambien analizamos el quimerismo de HSC de la medula osea del donante directamente en este punto temporal tardlo para confirmar el aumento de aceptacion del injerto del donante, y de hecho encontro que se correlacionaba bien con el quimerismo de granulocitos de la sangre periferica del donante (Fig. 3C).

Finalmente, para verificar que estabamos identificando con precision las HSC funcionales del donante con fenotipos normales de superficie celular, se volvieron a aislar HSC KLS CD34- CD150+ de donantes de la medula osea de receptores primarios y realizaron trasplantes secundarios en ratones receptores irradiados junto con 200.000 celulas de medula osea competidora de tipo silvestre. Estas HSC dieron lugar a un injerto multi-linaje durante al menos 16 semanas despues del trasplante (Fig. 3D), confirmando que las HSC trasplantadas recuperaban su fenotipo de superficie celular normal al menos 7-9 meses despues del trasplante en animales tratados con ACK2. En

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consonancia con esta observacion, se encontro que los perfiles del ciclo celular de HSC tanto del hospedador como del donante en la BM de ratones tratados con ACK2 y trasplantadas 7 meses antes eran identicos a los de los animales no tratados (Fig. 9).

Estos datos indican que a traves de la extraccion especlfica de HSC del hospedador, hemos sido capaces de aumentar significativamente la aceptacion del injerto de HSC del donante. Sin embargo, no estaba claro si el tratamiento con ACK2 aumentaba el espacio de nicho, conduciendo a un alto nivel de aceptacion del injerto inicial de las HSC despues del trasplante, o si debido al empobrecimiento de las HSC del hospedador, se podlan expandir competitivamente un numero pequeno de HSC inicialmente injertadas en ratones tratados con ACK2. Si el espacio del nicho hubiera sido realmente liberado, se esperarla que el quimerismo de HSC aumentara con la dosis de celulas trasplantadas. Por el contrario, si el injerto de HSC inicial era el mismo entre ratones tratados con ACK2 y no acondicionados, no se esperarla un aumento lineal en el quimerismo del donante con numeros de HSC trasplantadas por encima de 250 celulas, ya que dosis superiores a estas no conducen a incrementos linealmente proporcionales del quimerismo en animales no acondicionados (Fig. 1). Con el fin de determinar los efectos de la dosis de celulas en este sistema, se acondicionaron ratones Rag2-/-Yc-/- (CD45.2) receptores con 500 pg de ACK2 como antes y se trasplantaron con dosis variables de LT-HSC CD45.1 doble clasificado. La sangre periferica se ensayo cada cuatro semanas para determinar el quimerismo de los granulocitos del donante hasta 24 semanas despues del trasplante. La aceptacion del injerto del donante aumento linealmente con la dosis de HSC trasplantadas (Fig. 4A) y, por tanto, se demostro que la dosis de HSC trasplantadas necesaria para saturar los nichos disponibles se habla incrementado significativamente con respecto a los ratones no acondicionados (Fig. 1). Estos datos demuestran que el tratamiento con ACK2 aumenta la proporcion de nichos disponibles para el injerto y que la disponibilidad de nichos esta regulada por la ocupacion de las HSC del hospedador y que superar esta barrera puede proporcionar altos niveles de aceptacion del injerto de HSC del donante.

Los estudios previos que intentaron aumentar el numero de nichos disponibles para el trasplante mediante la movilizacion de HSC endogenas pueden haber fracasado debido a la presencia residual de farmacos movilizadores en el momento del trasplante o debido a los efectos perjudiciales de estos agentes en las propias celulas del nicho de HSC. En el primer experimento mostrado en la presente memoria, ambos ratones que recibieron 35.000 HSC (1,4 x 106 HSC/kg) presentaron niveles extremadamente altos de quimerismo del donante (90,1 % y 62,7 % Figura 4B). Es importante senalar que la obtencion de un alto numero de HSC ya ha demostrado ser cllnicamente factible, porque la mayorla de los injertos humanos de HSC se alslan de la sangre periferica de los donantes movilizados utilizando reglmenes que conducen a una expansion de HSC. Sin embargo, el trasplante de un bolo de celulas tan grande puede ser evitable ya que se obtuvieron consistentemente altos niveles de quimerismo del donante mediante tres rondas de acondicionamiento y trasplante de 5.000 HSC (para un total de 15.000 HSC trasplantadas) (Fig. 10). La contribucion total del tercer trasplante fue sistematicamente superior a los dos primeros trasplantes combinados de HSC.

El trasplante de medula osea (BMT) alogenico se utiliza rutinariamente para una serie de propositos cllnicos, mas comunmente para el tratamiento de las neoplasias malignas despues de dosis altas de irradiacion y quimioterapia, pero tambien para el tratamiento de deficiencias hematopoyeticas heredadas tales como la SCID. Los niveles terapeuticos mlnimos de quimerismo de las HSC del donante varlan entre las enfermedades, oscilando desde <1 % para ciertas formas de SCID hasta ~ 20 % para la anemia de celulas falciformes. Sin embargo, el nivel terapeutico mlnimo de quimerismo puede no ser cllnicamente optimo. Por ejemplo, los niveles de quimerismo del HSC de <1 % en los pacientes con SCID deficientes en yc pueden restaurar los linfocitos T funcionales, pero los linfocitos B siguen siendo en gran parte de origen del hospedador. Ademas, la nueva produccion de linfocitos T se correlaciona con el quimerismo mieloide y presumiblemente el quimerismo de HSC, lo que sugiere que los bajos niveles de aceptacion del injerto de HSC inicial conducen solo a perlodos finitos de produccion de linfocitos T en pacientes con SCID.

Aqul, proporcionamos pruebas de que la aceptacion del injerto de HSC del donante esta limitada por la ocupacion de los nichos apropiados por las HSC del hospedador. Estos datos ofrecen una explicacion clara de la deficiente aceptacion del injerto de HSC del donante observada en pacientes con SCID no acondicionados (Tjonnfjord et al. (1994) Blood 84, 3584; Muller et al. (2000) Blood 96, 4344).

El reto en el BTM, particularmente para el tratamiento de tumores no malignos, es maximizar la eficacia del injerto de HSC del donante, minimizando al mismo tiempo los efectos secundarios daninos. Uno de los principales efectos secundarios asociados con el BMT alogenico es la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD), una afeccion potencialmente mortal en la que la presencia de linfocitos T alorreactivos dentro del injerto conduce a la destruccion de los tejidos del hospedador. Es importante destacar que los estudios han demostrado que el trasplante de HSC alogenico purificado no provoca la GVHD. Otros efectos secundarios graves del BMT se asocian a menudo con reglmenes de acondicionamiento citotoxico. Incluso si se emplea con moderacion mediante acondicionamiento no mieloablativo, los reglmenes de acondicionamiento citotoxico conllevan riesgos significativos para la salud, incluyendo infertilidad, trombocitopenia prolongada, dano a organos, inmunosupresion y altas tasas de neoplasias secundarias. De hecho, son estos mismos efectos secundarios los que impiden el uso cllnico rutinario de BMT para el tratamiento de enfermedades graves pero que no amenazan la vida de forma inmediata, como la anemia de celulas falciformes y ciertos tipos de autoinmunidad, que han demostrado ser curados por trasplante de HSC en modelos en animales y en un numero limitado de casos cllnicos.

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Se postulo que la forma mas especlfica y, en consecuencia, la mas segura para aumentar el espacio de nicho de las HSC serla a traves de la reduccion dirigida mediada por anticuerpos. Para generar datos precllnicos que apoyen el uso de anticuerpos que empobrecen las HSC, se ha demostrado anteriormente que la administracion de ACK2 in vivo conduce al empobrecimiento rapido pero transitorio de HSC y progenitores del hospedador. El trasplante de HSC altamente purificadas en receptores acondicionados con ACK2 conduce a niveles de quimerismo del donante de hasta el 90 %. Estos niveles serlan casi seguramente terapeuticos para las deficiencias hematopoyeticas heredadas. Para los pacientes con SCID, el empobrecimiento especlfico de HSC puede ser el unico requisito de un regimen de acondicionamiento eficaz para permitir una reconstitucion inmunitaria permanente y completamente funcional por las HSC del donante. Para otros tipos de trastornos hematopoyeticos heredados, los tratamientos con anticuerpos que empobrecen las HSC en combinacion con agentes inmunosupresores especlficos podrlan emplearse potencialmente en lugar de, o en combinacion con, dosis bajas de farmacos disenados para la mielosupresion. Por lo tanto, el uso de reactivos que empobrecen las HSC es una alternativa atractiva a los metodos convencionales de acondicionamiento para el BMT y que reduce los riesgos actualmente asociados con el trasplante de medula osea considerablemente, aumentando as! su utilidad en el tratamiento de varios trastornos hematologicos y no hematologicos.

Materiales y metodos

Ratones. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comite Internacional de Cuidado y Uso de Animales. Los ratones receptores utilizados en estos estudios fueron ratones de 4 a 8 semanas de edad, deficientes en el gen de activacion de la recombinasa 2 (RAG2'/‘), con deficiencia en la cadena gamma comun de la interleucina 2 RAG2'/_ (RAG2'/'yc'/‘) o gMT. Los ratones donantes utilizados fueron ratones transgenicos GFP de 8-12 semanas de edad que expresan GFP del promotor de la p-actina de pollo, o ratones C57BI/Ka CD45.1 o CD45.2 congenicamente distinguibles. Todas las llneas de raton se criaron y se mantuvieron en las instalaciones de animales de investigacion de la Universidad de Stanford.

Trasplante de HSC. La medula osea se cosecho a partir de ratones donantes mediante trituracion de los huesos, lisis de eritrocitos con tampon de lisis ACK (NH4Cl 150 mM, KHCO3 1 mM y EDTA 0,1 mM) y la elimination de los desechos mediante gradiente de densidad usando Histopaque 1119 (Sigma, St. Louis, MO). La medula osea a continuation se enriquecio en c-kit+ usando microesferas CD117 + (AutoMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las celulas se tineron con anticuerpos descritos a continuacion y se aislaron HSC mediante FACS simple o doble basandose en la reactividad definida previamente para marcadores de superficie celular particulares (c-kit+linaje'Sca- 1+CD34-CD150+) en el BD FACS-Aria (BD Biosciences, San Jose, CA). Las celulas fueron trasplantadas por inyeccion retro-orbital.

Anticuerpos. Los siguientes anticuerpos monoclonales fueron purificados y conjugados usando hibridomas mantenidos en nuestro laboratorio: 2C11 (anti-CD3), GK1.5 (anti-CD4), 53-6.7 (anti-CD8), 6B2 (anti-B220), 8C5 (anti-Gr-1), M1/70 (anti-Mac-1), TER119 (anti-Ter119), A20.1.7 (anti-CD45.1), AL1-4A2 (anti-CD45.2), 2B8 (anti-c- kit), 3C11 (anti-c-kit), E13-161-7 (anti-Sca-1). Los anticuerpos se conjugaron con biotina, Pacific Blue, Pacific Orange, PE, aloficocianina (APC), Alexa 488, Alexa 647 o Alexa 680 (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los siguientes fueron adquiridos a eBiosciences (San Diego, CA): anticuerpos contra CD3, CD4, CD8, B220, Mac-1, Ter119 y Gr-1 conjugado con PE-Cy5; anti-c-kit y anti-Mac-1 conjugado con PECy7; anti-CD135 (A2F10) conjugado con PE; anti-CD34 conjugado con FITC o biotina y anti-B220 conjugado con APC- Cy7. Anti-CD41 conjugado con FITC, anti-CD48 conjugado con FITC, anti-IgG de rata de cabra conjugado con APC y and anti-TCRR. (H57-597) conjugado con APC se adquirieron a BD Biosciences. Anti-CD150 conjugado con Alexa 647 fue adquirido a Biolegend (San Diego, CA). Estreptavidina conjugada con Alexa 488 y Alexa 680 y anti-IgG de rata de cabra conjugado con Alexa 488 fue adquirido a Invitrogen. La estreptavidina conjugada con Quantum Dot 605 se adquirio a Invitrogen.

Produccion y purificacion de ACK2. El hibridoma ACK2 fue un regalo. La llnea celular se expandio y subclono para establecer una llnea celular de hibridoma de alta produccion de ACK2. Las celulas se hicieron crecer en el sistema de matraz Integra (Integra Biosciences, Chur, Suiza) y se recogieron los medios que contenlan el anticuerpo. Se purifico ACK2 en una columna de purificacion de IgG uniendo ACK2 a la columna y eluyendo con Glicina 100 mM y NaN3 5 mM. Las fracciones positivas eluidas (OD280> 0,2) se combinaron, se dializaron durante 12 horas en PBS y se concentraron utilizando un concentrador Vivaspin (Sartorius AG, Goettingen, Alemania). Las preparaciones subsiguientes de ACK2 fueron preparadas por Bio Express (W. Lebanon, New Hampshire).

Administracion de ACK2 y eliminacion. Se administraron 500 pg de ACK2 mediante inyeccion retro-orbital a ratones Rag2'/'Yc'/' de 4-8 semanas. Se aislo sangre periferica de la vena de la cola de estos ratones cada dos dlas y se dejo coagular durante 1 hora. Las muestras se centrifugaron durante varios minutos y se aislo el suero. Posteriormente se tineron 10.000 mastocitos con 50 gl de suero, seguido de IgG de rata anti-cabra APC o Alexa 488, para probar la presencia de anticuerpos ACK2. Ademas, los mastocitos se tineron con un anticuerpo anti-c-kit conocido, 2B8 conjugado con APC como control. Estas celulas se analizaron en el BD FACS-Aria. Para determinar el empobrecimiento de las HSC, se obtuvieron tanto los femures como la tibia de ratones acondicionados y se prepararon igual que antes. Se contaron las celulas y se determino la frecuencia de HSC en el FACS-Aria de BD acotando las celulas KLS CD135-CD150+.

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Acondicionamiento con ACK2 y trasplante. Se administraron 500 |jg de ACK2 por via intravenosa a ratones Rag2'/' o Rag2'/'Yc'/' de 4-8 semanas. Los ratones se trasplantaron en el momento en el que se demostro que ACK2 ya no estaba presente en el suero (D7 o D9 dependiendo de la preparacion). Las HSC para el trasplante se obtuvieron a partir de medula osea de ratones donantes, que se aislaron en el BD FACS-Aria acotando las celulas c-kit+linaje- Sca-1+CD34-CD150+.

Analisis de la aceptacion del injerto. Se obtuvo sangre a partir de la vena de la cola de ratones trasplantados en diversos puntos temporales. Se separo usando dextrano al 2 % a 37 °C durante 30 minutos y posteriormente se liso usando tampon de lisis ACK (NH4O 150 mM, KHCO3 1 mM y EDTA 0,1 mM) durante 5 minutos. Las celulas se tineron con anticuerpos descritos anteriormente y se analizaron en el BD FACS-Aria. El quimerismo de los granulocitos del donante se determino analizando el porcentaje de celulas Ter119"CD3" B220"Mac1alt° dispersion lateralalto que tambien eran donante+. Se sacrificaron varios animales y se aislaron HSC de forma similar a la de los ratones donantes para confirmar que el quimerismo de HSC imitaba el quimerismo de los granulocitos. Para determinar los efectos de ACK2 en progenitores hematopoyeticos, se aislo medula osea de ratones tratados con 500 pg de ACK2 como antes. Se contaron las celulas y se determino la frecuencia de los progenitores en el BD FACS- Aria. Los numeros de celulas se compararon con los de animales no tratados. Las HSC fueron acotadas como lin'c- kit+Sca-1+CD135"CD150+, las MEP fueron acotadas como lin"c-kit+Sca-1" CD34" FcyR", las CMP fueron acotadas como lin'c-kit+Sca-1'CD34baj°FcYRbaj° y las GMP fueron acotadas como lin'c-kit+Sca-1+CD34alt°FcYRalt°.

Trasplante en receptores irradiados. Los ratones receptores fueron tratados con 950 cGy antes del trasplante. Cada raton se trasplanto con toda la poblacion de esplenocitos de un raton ACK2 tratado 9 dlas antes, 200.000 celulas de medula osea no fraccionada de un raton ACK2 tratado 9 dlas antes, o 100 HSC donante+ KLS CD34- CD150+ de un raton trasplantado primario (ACK2 acondicionado y trasplantado con 5.000 donantes de HSC 39 semanas antes).

Cultivo in vitro. Se clonaron exactamente 10 HSC (KLS CD34-CD150+) en el BD-Aria en placas de 96 pocillos de fondo redondo y se cultivaron en presencia de 50 ng/ml de SCF (R&D Systems) o 50 ng/ml de TPO (R&D Systems) en medio de Dulbecco modificado por Iscove (Invitrogen) con suero fetal de ternera al 10 % (Omega), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen), 100 pM de aminoacidos no esenciales (Invitrogen) y 50 pM de p-mercaptoetanol. Las HSC tratadas con anticuerpo recibieron 10 pg/ml de ACK2 o 2B8. Las celulas viables se contaron al microscopio todos los dlas.

Analisis del ciclo celular. Las celulas de medula osea se enriquecieron en c-kit como antes y se tineron con anti- CD34 FITC, anti-kit (2B8) PE-Cy7, anti-CD150 Alexa 647, anti-Sca-1 Alexa 680 y anti-linaje PECy5. Las celulas se fijaron a continuacion con paraformaldehldo al 2 % en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS/saponina al 0,2 % + 2 jg/ml de 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Histologfa. Los ratones se trataron con 500 pg de ACK2 y a los 2 dlas y 9 dlas despues del tratamiento, se extrajo el humero y se coloco en fijador de Bouin durante > 1 dla. Los huesos fueron descalcificados en acido formico, embebidos en parafina, cortados, tenidos con hematoxilina y eosina y montados utilizando medios a base de xileno.

Analisis de la sangre periferica. Se recogio sangre periferica de la vena de la cola y se deposito directamente en tubos revestidos con heparina. El analisis fue realizado por el Laboratorio de Diagnostico del Departamento de Medicina Comparativa de la Universidad de Stanford.

Ejemplo 2 (Ejemplo de referenda)

Linfoextraccion mediada por anticuerpos y trasplante de HSC para el tratamiento de la agammaglobulinemia.

Se trato de determinar si el empobrecimiento transitorio de linfocitos T CD4 + de ratones que normalmente rechazan un trasplante alogenico de HSC permitirla una aceptacion del injerto de HSC con incompatibilidad en el complejo de histocompatibilidad menor. Se trataron ratones Cj”, que son un modelo de agammaglobulinemia y son resistentes a la aceptacion mantenida del injerto de HSC del donante en ausencia de irradiacion, con anticuerpo anti-CD4 (clon GK1.5), que empobrece mas del 95 % de los linfocitos T CD4+ in vivo, antes del trasplante con HSC de ratones transgenicos GFP. Se observo la aceptacion del injerto a corto plazo y la reconstitucion de linfocitos B en todos los animales tratados con anticuerpos anti-CD4, pero nunca se observo en ninguno de los animales no tratados (Figura 11). Este quimerismo, sin embargo, se perdio entre 8-12 semanas despues del trasplante ya que los recuentos de linfocitos T CD4+ volvieron a la normalidad. Por lo tanto, en este sistema, la tolerancia al trasplante permanente no se genero por ~0,1-0,2 % de quimerismo de HSC.

Anticuerpos que empobrecen especlficamente HSC humanas candidatas. Se adquirieron anticuerpos candidatos especlficos de marcadores expresados por HSC humanas, incluyendo c-kit (clon BA7.3C.9, IgG2a), CD133 (clon AC133.1, IgG1) y c-mpl (clon BAH-1, IgG1) en forma de hibridomas de la American Type Culture Collection o como soluciones purificadas de otros proveedores. Aproximadamente 100-500 pg de estos anticuerpos se inyectan en ratones NOD-SCID/yc'/_ que se han trasplantado 4 a 6 semanas antes con ~10.000 HSC de sangre de cordon humano. El quimerismo mieloide de la sangre periferica se mide a los 2, 4 y 6 dlas despues del tratamiento con anticuerpos. A los 7 dlas despues del tratamiento, se sacrifican los ratones y se cuantifica el numero de HSC

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humanas fenotlpicas en la medula de ratones tratados y no tratados. Los anticuerpos que tienen un efecto de empobrecimiento especlfico producen una reduction drastica del quimerismo mieloide y en el numero de HSC humanas injertadas. Las versiones recombinantes de la region variable pueden combinarse con una region constante CY2b de raton, puesto que los anticuerpos de clase IgG2b son el isotipo mas eficaz en el complemento de union y tambien son activos en cuanto a la ADCC y la opsonization. El isotipo del Mab ACK2 de raton es IgG2b. Estos anticuerpos recombinantes se ensayan in vitro por tincion y posteriormente incubation de sangre de cordon humano o medula osea con complemento de raton purificado. El empobrecimiento especlfico de las HSC humanas se verifica mediante citometrla de flujo.

Los anticuerpos candidatos capaces de empobrecer las HSC humanas se someten a prueba para empobrecimiento que crea un espacio de nicho adicional para las HSC humanas recien trasplantados. Aproximadamente 7 dlas despues del tratamiento con anticuerpos de ratones xenoquimericos, estos ratones y los ratones xenoquimericos de control que no han sido tratados con el anticuerpo empobrecedor se trasplantan de nuevo con ~10.000 HSC de sangre de cordon distinguibles por HLA. Si se ha creado espacio de nicho adicional mediante la elimination de las HSC del primer trasplante, el quimerismo que surge del segundo trasplante deberla ser considerablemente mayor en los ratones tratados con anticuerpos.

Ejemplo 3 (Ejemplo de referenda)

El injerto de celulas madre hematopoyeticas purificadas de nichos raros corrige deficiencias linfoides graves sin acondicionamiento del hospedador

En ausencia de irradiation u otro acondicionamiento citorreductor, se cree que las celulas madre hematopoyeticas endogenas (HSC) llenan los nichos unicos dentro de la medula osea que permiten el mantenimiento del potencial hematopoyetico completo y de este modo impiden el injerto productivo de HSC trasplantadas de donantes. Mediante el trasplante de HSC exogenas purificadas en llneas de ratones histocompatibles congenicos, no acondicionados, se demuestra que ~ 0,1-1,0 % de estos nichos de HSC estan disponibles para el injerto en cualquier punto dado y no se han encontrado ninguna prueba que demuestre que las HSC endogenas puedan ser desplazadas de los nichos que ocupan. Demostramos que el injerto productivo de HSC dentro de estos nichos vaclos es inhibido por linfocitos T CD4+ del hospedador que reconocen diferencias en el complejo de histocompatibilidad menor muy sutiles. Sorprendentemente, el trasplante de HSC purificadas en un panel de ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) conduce a un rescate rapido y completo de las deficiencias linfoides mediante el injerto de estos nichos muy raros y la expansion de progenitores linfoides del donante. Demostramos ademas que la empobrecimiento mediada por anticuerpos transitoria de linfocitos T CD4+ permite el injerto de HSC a corto plazo y la regeneration de linfocitos B en un modelo de raton no SCID B(-). Estos experimentos proporcionan un mecanismo general mediante el cual las HSC trasplantadas pueden corregir las deficiencias hematopoyeticas sin ningun acondicionamiento del hospedador o con solo una linfoextraccion altamente especlfica y transitoria.

El seguimiento de la funcion inmunitaria evita el injerto de HSC con una incompatibilidad sutil. Se trasplantaron HSC en 4.000 celulas ckit+ Thy1.1bajo linaje- Sca-1 + Flk2- CD34- de ratones CD45.1 por via intravenosa en cinco ratones CD45.1 x CD45.2 (F1) no irradiados y en cinco ratones CD45.2 congenicos no irradiados. Cada 4 semanas tras el trasplante, se analizo la sangre periferica para determinar el quimerismo de granulocitos, linfocitos B y linfocitos T. El quimerismo de los granulocitos del donante, que refleja con exactitud el quimerismo de las HSC, solo se observo en los receptores F1 geneticamente no reactivos en todos los puntos temporales analizados con una mediana del quimerismo a las 16 semanas de ~ 0,1 %. Estos datos demuestran que las sutiles diferencias antigenicas que existen entre estas cepas congenicas de CD45 de ratones son suficientes para evitar el injerto cruzado de HSC productivas.

Rapida correccion mediada por las HSC de las deficiencias linfoides en ratones SCID. Para medir la potencial importancia cllnica de estos ricos nichos disponibles, hemos trasplantado repetidamente HSC de ratones transgenicos GFP en ratones deficientes en RAG2 y en la cadena y comun del receptor de IL-2 (RAG2-/-yc-/-), los cuales carecen de linfocitos B, T y NK. Se observaron cantidades enormes de linfocitos B y T derivadas del donante en todos los puntos temporales, lo que condujo a un quimerismo global del donante de ~50 % hasta al menos 30 semanas despues del trasplante final. Tambien se detectaron linfocitos NK del donante en todos los animales trasplantados. Ademas, todos los ratones RAG2'/'yc'/' mostraron quimerismo mieloide derivado del donante persistente (que varla de 0,5 a 2,0 % de granulocitos derivados del donante).

Para confirmar que las frecuencias de los granulocitos del donante reflejaban con exactitud el quimerismo de las HSC de la medula osea, se sacrificaron a los animales a las 30 semanas tras el trasplante y se analizo la medula osea. Las celulas del donante comprendlan ~0,8 % de las reservas de HSC a largo plazo (LT) totales. Este quimerismo fue esencialmente el mismo en las celulas madre que se reconstruyen a corto plazo (ckit+ linaje- Sca-1 + CD34+ FIk2-) y en los progenitores multipotentes (ckit+ linaje- Sca-1+ CD34+ FIk2+). No se pudo detectar ninguna celula con estos fenotipos de superficie en el bazo, un organo principal asociado con la hematopoyesis extramedular. Estos datos confirmaron que en estos animales, las frecuencias de granulocitos perifericos del donante reflejan mucho mas exactamente el quimerismo de las HSC que la contribution general del donante en la sangre. Los datos tambien demuestran que un pequeno numero de HSC trasplantadas de medula osea puede

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corregir graves deficiencias linfoides sin acondicionamiento citorreductor previo. El quimerismo de las HSC en los ratones RAG2'/'yc'/' era comparable al quimerismo observado en los ratones F1 de tipo silvestre geneticamente no reactivos, lo que demuestra que no hay un numero evidentemente mayor de nichos de HSC disponibles en estos animales.

Para confirmar que se hablan injertado HSC funcionales, aislamos medula osea a las 31 semanas despues del trasplante de ratones RAG2-/-yc-/- no irradiados que hablan recibido trasplantes de HSC GFP+ y se realizaron trasplantes secundarios usando medula no fraccionada o enriquecida en c-kit, lo que aumenta la frecuencia de las HSC por ~ 10 veces, en ratones de tipo silvestre irradiados letalmente, tal como ~ 6-20 HSC GFP+ junto con 1.000 de HSC RAG2"/"yc"/" se transfirieron a cada receptor secundario. Se observaron celulas GFP+ derivadas del donante en todos los receptores secundarios hasta al menos 25 semanas despues del trasplante y 6 de 13 receptores secundarios mantuvieron niveles detectables de quimerismo de los granulocitos. Estos datos confirmaron que las HSC GFP+ raras dentro de la medula osea de los receptores RAG2"/-yc"/" se hablan injertado productivamente. Por el contrario, el trasplante de un gran numero de esplenocitos en receptores secundarios no condujo a una reconstitucion sostenida de las celulas madre multilinaje.

Expansion oportunista de progenitores linfoides del donante. Para determinar la etapa de desarrollo en la que los linfocitos B del donante superan a los linfocitos B del donante en receptores RAG2"/"yc"/", analizamos las frecuencias de los donantes en las celulas progenitoras mieloides y linfoides en la medula osea. Los progenitores mieloides comunes (CMP) y los progenitores linfoides comunes (CLP) mostraron un quimerismo del donante que era comparable al quimerismo de las HSC, lo que indica que las celulas derivadas de donantes no tienen una ventaja proliferativa competitiva en estas primeras etapas del desarrollo. El quimerismo de los donantes en las etapas de desarrollo de los progenitores de macrofagos y granulocitos (GMP) y de los progenitores de eritrocitos y megacariocitos (MEP) tambien fue similar al quimerismo de las HSC. De acuerdo con estos resultados, las frecuencias de HSC, CLP, CMP, GMP y MPE endogenas dentro de la medula osea son similares entre ratones no trasplantados de tipo silvestre y RAG2"/-yc"/". El analisis de las fracciones celulares pro-B-A y pro-B-B, sin embargo, mostro un quimerismo del donante que era drasticamente mayor que el de los de los CLP precedentes. En la etapa de celulas pro-B-B y en todas las etapas subsiguientes de los linfocitos B, las celulas procedlan exclusivamente de donantes. Aunque el receptor de IL-7, que utiliza la yc para la senalizacion adecuada, se expresa en la etapa de CLP, estos resultados sugieren que la senalizacion de IL-7 no es una via necesaria para el desarrollo o expansion de los CLP, de acuerdo con observaciones anteriores.

Respuestas inmunitarias normales en ratones SCID reconstituidos con HSC. Para verificar que el sistema inmunitario de los ratones RAG2'/'yc'/' reconstituidos con HSC habla sido restaurado y era capaz de crear respuestas inmunitarias apropiadas, se inmunizaron receptores reconstituidos con 4-hidroxi-3-nitrofenilacetilo (NP) precipitado con aluminio, conjugado con Y-globulina de pollo, que provoca una respuesta humoral dependiente de Th2. Los niveles sericos de anticuerpos especlficos de NP fueron similares 1 semana despues de la inmunizacion entre los ratones RAG2'/'yc'/' trasplantados con HSC y los ratones de tipo silvestre, lo que demuestra la inmunocompetencia de los receptores RAG2'/'yc'/' trasplantados.

Los linfocitos T CD4+ del hospedador son esenciales para el rechazo de HSC con una incompatibilidad sutil. Para investigar si la ausencia de yc era critica para la aceptacion del injerto de HSC en huespedes no acondicionados, tal vez al impartir una desventaja competitiva a las HSC en animales RAG2'/'yc'/', trasplantamos HSC GFP+ en ratones RAG2'/_, los cuales tienen una expresion de yc normal, as! como en ratones RAG2'/'yc'/.

Se observaron niveles similares de contribution de granulocitos del donante en ratones RAG2'/_ y RAG2'/'yc'/', excluyendo probablemente un papel directo para yc en el mantenimiento de las HSC del hospedador en sus nichos. Sin embargo, se ha observado la expresion de yc en HSC normales, lo que sugiere que puede haber una ligera ventaja competitiva para las HSC con expresion adecuada de yc. Los datos tambien sugieren que los linfocitos NK, que estan presentes en numeros normales en ratones RAG2'/_ pero ausentes en ratones RAG2'/'yc'/', no estan mediando el rechazo de las HSC en este sistema H2 identico. La elimination de los linfocitos NK del hospedador es necesaria para la aceptacion del injerto de HSC que llevan uno o mas haplotipos H2 no compartidos. Curiosamente, las frecuencias de los linfocitos derivados de donantes se redujeron significativamente en los receptores RAG2'/_ en los puntos temporales iniciales (Fig. 7B), tal vez como resultado de la ocupacion de los entornos estromales especlficos de la etapa linfoide por los progenitores linfoides RAG2'/_. El numero de linfocitos B derivados del donante en receptores RAG2'/_ se redujo mas de 10 veces con respecto a los receptores RAG2'/_ yc"/- a las 4 semanas tras el trasplante y los linfocitos T perifericas no se observaron hasta las 8 semanas despues del trasplante. Sin embargo, a las 16 semanas tras el trasplante, el numero de linfocitos B y T en los receptores RAG2'/_ alcanzo los niveles observados en sus homologos RAG2'/'yc'/'.

Dado que los ratones RAG2'a carecen de linfocitos B y T maduros, se intento determinar cual de estos tipos de celulas era el principal responsable de mediar el rechazo de los injertos de HSC de donantes trasplantados. Por lo tanto, se trasplantaron HSC purificadas de ratones donantes GFP en ratones TCR°'/'s'/' y Cp'/_ no irradiados. En estos experimentos, existen diferencias antigenicas conocidas entre las HSC del donante y los ratones receptores en los loci GFP, CD45 y Thy1. Se observo aceptacion del injerto multilinaje en ratones deficientes en linfocitos T, pero no en ratones deficientes en linfocitos B. Estos experimentos demuestran que se requieren linfocitos T ap del hospedador para el rechazo de injertos de HSC con esta incompatibilidad en el complejo de histocompatibilidad

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menor. Para determinar que clase de linfocitos T es esencial para esta inmunovigilancia, trasplantamos HSC en ratones IA-/- no acondicionados, los cuales carecen de linfocitos T CD4+ restringidos por el MHC II y ratones microglobulina G2-/" (G2m-/"), que son deficientes en linfocitos T CD8+ restringidos por el MHC I. Los ratones IA-/- trasplantados con HSC mostraron quimerismo sostenido hasta al menos 16 semanas, mientras que los ratones receptores G2m-/" no mostraron quimerismo en ningun punto temporal, lo que demuestra que los linfocitos T CD4+ son esenciales para el rechazo de injertos de HSC con incompatibilidad en el complejo de histocompatibilidad menor en nuestro sistema. Las LT-HSC expresan MHC II y la molecula coestimuladora CD86, lo que sugiere que los linfocitos T CD4+ del hospedador pueden reconocer directamente las HSC con ligeras desigualdades antigenicas. Aunque parece que los linfocitos T CD8+ no son necesarios para este rechazo, no podemos excluir la posibilidad de que linfocitos T restringidos por MHC I hiperreactivos residuales pudieran contribuir tambien al rechazo del injerto de las HSC en ratones G2m-/". De acuerdo con el papel de los linfocitos T CD8 en la mediacion del rechazo del injerto de medula osea, Xu et al. han demostrado que la deficiencia de CD8 en el hospedador, mejora la aceptacion del injerto.

Curiosamente, el quimerismo de granulocitos en los receptores RAG2-/- fue indistinguible del observado en experimentos previos en los cuales se trasplantaron 3.000 HSC en lugar de 1.000. Por el contrario, aunque el trasplante de 20 HSC llevo a la deteccion de la produccion de linfocitos B y T en estos ratones inmunodeficientes, el quimerismo de los granulocitos apenas era detectable. Por lo tanto, nuestros experimentos sugieren que la aceptacion del injerto de HSC y el quimerismo se acercan asintoticamente a un maximo de ~ 0,5 % en una manera dependiente de la dosis de las celulas. Los datos muestran que a diferencia de las especulaciones anteriores, las HSC endogenas no pueden desplazarse de los nichos que ocupan al aumentar los numeros de HSC trasplantadas por encima de un nivel umbral. Sin embargo, en ratones repetidamente trasplantados, hemos observado pequenos aumentos en el quimerismo de los granulocitos respecto al de los ratones que fueron trasplantados con HSC solo una vez con dosis por encima de este umbral. Esto proporciona evidencia de que el trasplante de un exceso de HSC no impide que los nichos adicionales queden vacantes en el futuro.

Para determinar si la eliminacion transitoria de linfocitos T CD4+ permitirla el acceso de HSC trasplantadas a nichos adecuados, tratamos ratones Cg-/- con un anticuerpo empobrecedor de CD4 que condujo a ~ 95 % de empobrecimiento de linfocitos T CD4+ de la sangre periferica. Los ratones con empobrecimiento de CD4 se trasplantaron a continuation con 800 HSC y se analizo en diversos puntos temporales el quimerismo del donante. Todos los ratones que recibieron tratamiento anti-CD4 mostraron quimerismo de los granulocitos del donante, mientras que ninguno de los ratones no tratados mostraron celulas detectables del donante a las 8 semanas despues del trasplante. Se observaron numeros significativos de linfocitos B del donante en los ratones tratados a las 6-8 semanas tras el trasplante, lo que nuevamente demuestra la capacidad de un pequeno numero de HSC injertadas productivamente para restaurar el numero de linfocitos en ratones inmunodeficientes. Dado que se observo que los niveles de linfocitos T CD4+ del hospedador se recuperaban despues del inmunoempobrecimiento, estos experimentos demuestran que el empobrecimiento transitorio de estas celulas antes del trasplante es suficiente para permitir un injerto productivo a corto plazo de las celulas madre sin necesidad de los farmacos citorreductores toxicos habituales utilizados para los pacientes sin SCID B(-)antes del trasplante de medula osea. Sin embargo, a las 12 semanas tras el trasplante de HSC, se perdio el quimerismo de los linfocitos B, los linfocitos T y el quimerismo mieloide en todos los ratones receptores. Estos datos sugieren que el empobrecimiento mediado por a-CD4 de los linfocitos T maduros era incompleto, o que no se generaron suficientes numeros de celulas dendrlticas derivadas de donantes para mediar la tolerancia duradera a traves de la selection negativa en el timo.

Reconstitucion a corto plazo en receptores de edad avanzada sin acondicionamiento. Los individuos envejecidos muestran reducciones notables en el tamano del timo y en la funcion de los linfocitos T. Para determinar si la funcion linfoide reducida en ratones envejecidos permitirla la aceptacion de trasplantes sin acondicionamiento, se trasplantaron repetidamente HSC de ratones transgenicos GFP en receptores de edad avanzada (22 meses) y jovenes (2 meses). Se observo quimerismo mieloide a corto plazo a corto plazo en todos los receptores de edad avanzada en comparacion con los receptores jovenes donde no se observo aceptacion del injerto. Sin embargo, con el tiempo, las celulas derivadas del donante disminuyeron hasta niveles indetectables en todos menos en uno de los receptores, lo que sugiere que se produjo rechazo de los trasplantes, pero con una cinetica significativamente reducida en relation con los animales mas jovenes. El nivel de quimerismo de los granulocitos en este experimento fue similar a los bajos niveles observados en los trasplantes de ratones jovenes, geneticamente no reactivos o inmunodeficientes, lo que sugiere que las HSC mas antiguas no pueden ser desplazadas de sus nichos endogenos. Esto contrasta con los estudios previos realizados con trasplantes de medula osea no fraccionada y sugiere que la reduction de la capacidad inmunitaria es responsable de la aceptacion del injerto a corto plazo de las HSC de los donantes.

La notable capacidad de las HSC para sostener la hematopoyesis multilinaje durante la vida de un individuo constituye la base para su uso rutinario en varias aplicaciones cllnicas, incluyendo el tratamiento de inmunodeficiencias primarias, tumores malignos, como acondicionadores para la tolerancia a trasplantes de injertos de tejidos u organos de donantes y como un metodo para revertir algunos tipos de autoinmunidad. El exito de estas terapias se basa en la capacidad de las HSC para albergar nichos unicos que conducen a una hematopoyesis sostenida de multilinaje.

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Los estudios presentados aqul han cuantificado el numero de estos nichos de HSC que estan disponibles para el injerto en cualquier punto dado en animales no acondicionados como ~ 0,1-1,0 % de todos los nichos de HSC. Suponiendo una celularidad de medula osea de murino adulto total de 5 x 108 y una frecuencia de HSC endogenas de 0,01 %, el numero de nichos de HSC abiertos puede estimarse en 50-500. Esto es sorprendentemente similar al numero estimado de HSC que estan en la circulation en cualquier punto dado. Los datos sugieren que las HSC que circulan normalmente han salido y han dejado vacante su nicho previo de HSC. Por lo tanto, puede estar ocurriendo un intercambio constante entre HSC endogenas en circunstancias normales, tal vez para mantener el equilibrio hematopoyetico entre y dentro de cada compartimiento de la medula osea.

Como apoyo de esto, hemos encontrado poca diferencia en las tasas de quimerismo de los granulocitos entre experimentos cuando se realiza un unico trasplante de HSC en dosis que van de 800 a 4.000 celulas. Aunque los trabajos anteriores han sugerido que las dosis celulares de la medula osea trasplantada se correlacionan con el quimerismo total de forma lineal, estos datos muestran a lo sumo la sustitucion de medula osea y celulas maduras en masa y no reflejan la sustitucion de HSC, lo que representa solo 0,01 % de medula no fraccionada. Sin embargo, cuando las HSC son repetidamente trasplantadas, hemos observado aumentos en el quimerismo de los granulocitos. Por lo tanto, la ocupacion de nichos HSC disponibles despues del trasplante de un exceso de HSC exogenas, que permanecen en la circulacion durante ~ 1 - 5 min despues del trasplante, no impide que posteriormente queden disponibles nichos adicionales. Cabe pensar que la transfusion continua de un numero bajo de HSC serla superior a los bolos administrados individualmente, ya que la velocidad de vaciado y llenado del nicho es alta. Debido a que no parece haber un aumento evidente en el quimerismo de granulocitos con el tiempo o dosis de celulas por encima de un nivel umbral, los datos tambien sugieren que las HSC trasplantadas deben encontrar su camino rapidamente a un nicho adecuado y no pueden recircular indefinidamente en busca de nichos vaclos sin la perdida del potencial hematopoyetico.

La capacidad de las HSC trasplantadas para auto-renovarse durante toda la vida del organismo asegura una production constante de celulas linfoides normales a traves de cada etapa del desarrollo. En los mutantes geneticos utilizados en nuestro trabajo, el desarrollo de linfocitos en el hospedador esta bloqueado o alterado en etapas definidas del desarrollo. En cada etapa del desarrollo o despues, las celulas donantes de tipo silvestre tienen una ventaja competitiva y pueden expandirse o acumularse oportunamente para dar lugar en ultima instancia a un gran numero de linfocitos maduros normales. Varios factores han sido implicados en la expansion de los primeros linajes de linfocitos B y timocitos, incluyendo IL-7, factor de celulas madre, ligando Flt3 y, recientemente, varias vlas Wnt/Frizzled. En el caso de los animales yc-/", la poblacion pro-B-B parece tener defectos en la expansion dependiente de IL-7, proporcionando una ventaja proliferativa a las celulas donantes de tipo silvestre en estas etapas. Los ratones RAG2'/' probablemente se reconstituyen mas lentamente debido a que sus linfocitos pueden desarrollarse normalmente a traves de las etapas de celulas pro-B, as! como de los timocitos DN3 y ocupan los microambientes estromales apropiados. Sin embargo, debido a que los linfocitos RAG2'/_ no pueden avanzar mas alla de estas etapas, un numero pequeno de celulas derivadas de donantes en desarrollo puede expandirse y acumularse sin competencia en los estadios de celulas pre-B, as! como timocitos DN4 y todas las etapas de desarrollo posteriores. No hemos observado ninguna disminucion significativa en el quimerismo de granulocitos o linfocitos en ningun momento hasta 30 semanas tras el trasplante de los receptores primarios.

Tambien se demuestra de manera concluyente que la aceptacion del injerto estable dentro de estos nichos raros por HSC con incompatibilidades en el complejo menor de histocompatibilidad esta estrechamente regulada por los linfocitos TCD4+ del hospedador. Las HSC de ratones CD45.1 no pueden injertar productivamente ratones CD45.2 congenicos no irradiados, sin embargo, rutinariamente se injertan la F1 (CD45.1 x CD45.2) geneticamente no reactiva. Hasta donde sabemos, la unica diferencia antigenica entre estas llneas es el alelo CD45, que normalmente se considera un marcador congenico relativamente inocuo. De manera similar, las HSC aisladas de ratones GFP transgenicos retrocruzados para la constitution genetica de C57BL/Ka no pueden injertar productivamente ratones C57BL/Ka de tipo silvestre. La unica diferencia antigenica entre estas llneas es segun entendemos el producto genico de GFP.

Sin embargo, afortunadamente, la elimination de la funcion de los linfocitos T CD4+ permite el injerto funcional y sostenido de HSC con incompatibilidades en el complejo menor de histocompatibilidad en nuestro sistema. Demostramos que solo el empobrecimiento transitorio de linfocitos T CD4+ mediado por anticuerpos, es suficiente para permitir la aceptacion del injerto a corto plazo de HSC de donantes de tipo silvestre y la restauracion de linfocitos B en un modelo de raton no SCID. Un empobrecimiento de linfocitos T CD4+ mas completo y/o mejores metodos para aumentar la contribution de las celulas dendrlticas tlmicas derivadas de los donantes podrlan permitir una hematopoyesis duradera del donante.

Incluso en ausencia de mutaciones geneticas heredadas, tanto los ratones como los seres humanos desarrollan una disminucion de la capacidad inmunitaria con la edad. Esta perdida progresiva de la funcion inmunitaria se ha atribuido recientemente a defectos intrlnsecos de las HSC en la diferenciacion a los progenitores comprometidos al linaje linfoide. Dado que hemos demostrado que un numero muy pequeno de HSC que funcionan adecuadamente pueden enmascarar los defectos en un grupo mucho mas grande de HSC, es tentador especular que los defectos inmunologicos relacionados con la edad no se hacen evidentes hasta que casi todos las HSC totalmente “jovenes” se empobrecen. La reintroduccion de HSC completamente multipotentes, tal vez obtenida como una muestra

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autologa en una etapa previa de la vida, podrla retrasar significativamente el declive inmunitario relacionado con la edad.

El mecanismo mediante el cual las HSC trasplantadas corrigen las deficiencias hematopoyeticas en nuestros receptores no acondicionados es aplicable a la correccion de muchos tipos de inmunodeficiencias tanto SCID como no SCID, pero estos estudios demuestran al mismo tiempo claramente que diferencias sutiles en el complejo de histocompatibilidad menor pueden mediar en el rechazo de injertos de HSC cuando hay linfocitos T del hospedador presentes. Nuestros datos sugieren que el trasplante de HSC purificadas, en combinacion, dado el caso, con tratamientos linfoablativos altamente especlficos, puede corregir las deficiencias linfoides en pacientes inmunodeficientes sin los efectos secundarios indeseados, como el acondicionamiento toxico y la GVHD, frecuentemente asociados con los reglmenes actuales de acondicionamiento y trasplante.

MATERIALES Y METODOS

Animates. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comite Internacional de Cuidado y Uso de Animales. Las llneas C57BL/Ka-Thy1.1 CD45.2+ (HZ) y C57BL/Ka-Thy1.1 CD45.1 (BA) fueron derivadas y mantenidas en nuestro laboratorio. Los ratones transgenicos eGFP usados en estos estudios fueron retrocruzados al menos 20 generaciones a la llnea BA o HZ. Los ratones C57BI6/Harland utilizados para los estudios de envejecimiento se obtuvieron del Instituto Nacional del Envejecimiento. Los ratones RAG2-/-, RAG2-/-yc-/-, I-A-/- y 132m' /- se han descrito anteriormente y se han cruzado al menos 20 generaciones para las constituciones C57BL/Ka- Thy1.2 CD45.1+, C57BL/Ka-Thy1.2 CD45.2+ y C57BL/Ka-Thy1.1 CD45.2. Los ratones TCRa'V' fueron proporcionados por J. Campbell y M. Davis (Universidad de Stanford, Stanford, CA). Los ratones Cp'/_ fueron proporcionados por J. Tung y L. Herzenberg (Universidad de Stanford). Se tomaron muestras de sangre periferica de la vena de la cola y todos los trasplantes de HSC se realizaron por inyeccion en el seno retroorbital de ratones anestesiados con isoflurano. Para los trasplantes repetidos, se trasplantaron entre 1.750 y 4.000 HSC semanalmente durante 6 semanas. Los ratones donantes tenlan 4-6 semanas de edad, y los ratones receptores oscilaban tenlan de 4-12 semanas de edad, a menos que se indique lo contrario.

Anticuerpos. Los siguientes anticuerpos monoclonales fueron purificados y conjugados usando hibridomas mantenidos en nuestro laboratorio: 19XE5 (anti-Thy1.1), 2C11 (anti-CD3), GK1.5 (anti-CD4), 53-7.3 (anti-CD5), 536.7 (anti-CD8), 6B2 (anti-B220), 8C5 (anti-Gr-1), M1/70 (anti-Mac-1), TER119 (anti-Ter119), A20.1.7 (anti-CD45.1), AL1-4A2 (anti-CD45.2), 2B8 (anti-c-kit), E13-161-7 (anti-Sca-1), anti-CD16/CD32 (2.4G2) y A7R34 (anti-receptor a de IL-7). Los anticuerpos se conjugaron con biotina, PE, aloficocianina (APC), Alexa 405, Alexa 430 o Alexa 488 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los siguientes fueron adquiridos en eBiosciences: anticuerpos contra CD3, CD4, CD8, B220, Mac-1, Ter119 y Gr-1 conjugado con PE-Cy5; anti-c-kit y anti-Mac-1 conjugado con PE-Cy7; anti-Sca-1 conjugado con PE-Cy5.5; anti-CD45.1 y anti-CD45.2 (104) conjugado con APC- Cy5.5; anti-B220 conjugado con APC-Cy7; anti-Flk2 (A2F10) conjugado con PE o biotina y estreptavidina conjugada con APC. Anti-CD34 (RAM34) conjugado con FITC o biotina, anti-TCRI3 (H57-597) conjugado con APC, anti-CD43 (1B11) conjugado con PE, anti-I-A/I-E (M5.114.15.2) conjugado con PE y anti-Ly51 (6C3) conjugated con biotina fueron adquiridos en BD Biosciences. La estreptavidina conjugada con APC-Cy7 fue adquirida en Caltag.

FACS y analisis. Todas las celulas se clasificaron en un FACSVantage o un FACS Aria (Becton Dickinson). Todos los analisis de sangre periferica se realizaron en un LSR-Scan (Becton Dickinson). Se obtuvo sangre periferica a partir de la vena de la cola, los eritrocitos se sedimentaron con dextrano al 2 % y los eritrocitos restantes se lisaron con una solucion de cloruro de amonio. Los leucocitos restantes se tineron con anti-CD45.2-Alexa 488, anti-CD45.1- PE, anti-Ter119-PE-Cy5, anti-Mac-1-PE-Cy7, anti-TCRI3-APC y Anti-B220-APC-Cy7. Cuando se analizo la sangre periferica que contenla celulas eGFP+, se omitio anti-CD45.1-Alexa-488 y se utilizo anti-Gr-1-PE en lugar de anti- CD45.2-PE si estaba justificado por el experimento. Para el aislamiento de HSC, la medula osea fue primero enriquecida usando perlas anti-c-kit y la seleccion inmunomagnetica se realizo en un instrumento AutoMACS (Miltenyi Biotec). Las celulas enriquecidas se tineron con anti-CD34-FITC, anti-FIk2-PE, anti-linaje (CD3, CD4, CD8, B220, Ter119, Mac-1, Gr-1)-PE-Cy5, anti-Sca-1-PE-Cy5.5 y anti-c-kit-PE-Cy7 y las celulas se clasificaron dos veces antes del trasplante. Para el analisis del quimerismo de las HSC, se incluyo CD45.1-APC-Cy5.5 y la tincion de CD34 tincion se logro con anti-CD34-biotina seguido de estreptavidina-APC. Para el aislamiento de las HSC de ratones transgenicos eGFP, las celulas se tineron con anti-linhaje-Cy5-PE, anti-Sca-1-PE-Cy5.5, anti-c-kit-PE-Cy7, anti-FIk2- PE y anti-CD34-biotina seguido de estreptavidina-APC. Para el analisis del quimerismo de HSC eGFP, se incluyo anti-CD45.1 -APC-Cy5.5.

Inmunizaciones. Los ratones se inmunizaron por via intraperitoneal con 100 pg de NP conjugado a Y-globulina de pollo (Biosearch Technologies) precipitado en sulfato de potasio y aluminio al 10 % (Sigma-Aldrich). Se realizaron ensayos de inmunoabsorcion enzimatica ligada a NP especlficos con suero obtenido 1 semana despues de la inmunizacion en placas de 96 pocillos de alta union a protelnas con 5 pg de NP-BSA (Biosearch Technologies). Los pocillos se desarrollaron con anti-IgG de raton-peroxidasa de rabano picante (Southern Biotechnology Associates, Inc.) seguido de 1 mg/ml de reactivo ABTS (Sigma-Aldrich) y las reacciones se detuvieron mediante la adicion de azida sodica al 0,1 % (Sigma-Aldrich). La absorbancia se leyo a una longitud de onda de 405 nm.

Empobrecimiento in vivo de linfocitos T CD4+. Los ratones se trataron consecutivamente durante 3 d con 500 pg de

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anticuerpo anti-CD4 purificado inyectado por via intravenosa (GK1.5). Se analizo la sangre periferica para la expresion de TCRI3 y CD8 para evaluar cuantitativamente el empobrecimiento de linfocitos T CD4+ en relacion con los animales no tratados. A continuation se trasplanto a estos ratones 800 HSC GFP+ 1 d despues de la tercera inyeccion. A los ratones se les administraron a continuacion inyecciones semanales de anti-CD4 durante las primeras 3 semanas despues del trasplante de HSC y no se trataron despues.

Ejemplo 4 (Ejemplo de referenda)

Empobrecimiento del nicho de HSC con imatinib

Los animales se ensayan inicialmente por administration intravenosa de una dosis unica de 10-200 mg/kg de imatinib a ratones inmunodeficientes Rag2-/-yc-/- y el suero se ensaya cada dos dlas para detectar la presencia de imatinib. El punto en el que no se detecta imatinib en el suero se utiliza como punto de partida para la infusion de HSC in vivo. Para determinar si la administracion de imatinib empobrece las HSC in vivo, los numeros de HSC y las frecuencias en la medula osea de ratones tratados se cuantifican en el momento de la elimination de imatinib. Las HSC identificables fenotlpicamente se identifican como celulas KLS CD135- CD150+. Las HSC de la medula osea tambien se identifican utilizando la expresion de Sca-1 y CD150, junto con la falta de expresion de CD34, CD135, CD244, CD48 y CD41 y otros antlgenos asociados con el compromiso de linaje.

Se acondicionan ratones RAG2-/" (CD45.1) con 100 mg/kg de imatinib y en el momento de la eliminacion del farmaco, se introducen 5000 - 10.000 HSC c-kit+ linaje" Sca-1 + (KLS) CD34"CD150+ purificadas de CD45.2 de tipo silvestre en los receptores acondicionados con imatinib. Se obtiene sangre periferica de los receptores cada cuatro semanas despues del trasplante y se cuantifica el quimerismo de granulocitos y linfocitos.

Con el fin de determinar los efectos de la dosis celular en este sistema, se acondicionan ratones receptores RAG2-/- Yc/- (CD45.2) con 100 mg/kg de imatinib como antes y se trasplantan con dosis variables de LT-HSc de CD45.1 doblemente clasificados. La sangre periferica se ensaya cada cuatro semanas para determinar el quimerismo de los granulocitos del donante hasta 24 semanas despues del trasplante.

Ratones. Los ratones receptores son ratones deficientes en el gen de activation de la recombinasa 2 (RAG2-/-), deficientes en la cadena gamma comun de la interleucina 2 RAG2-/- (RAG2"/"Yc"/") o ratones pMT de 4-8 semanas de edad. Los ratones donantes son ratones transgenicos GFP de 8-12 semanas que expresan GFP del promotor de p- actina de pollo, o ratones C57BI/Ka CD45.1 o CD45.2 congenicamente distinguibles.

Trasplante de HSC. Se cosecho medula osea de ratones donantes triturando huesos, lisando eritrocitos con tampon de lisis de ACK (NH4O 150 mM, KHCO3 1 mM y EDTA 0,1 mM) y la eliminacion de residuos en gradiente de densidad utilizando Histopaque 1119 (Sigma, St. Louis, MO). La medula osea se enriquece en c-kit+ usando microesferas CD117+ (AutoMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las celulas se tineron con anticuerpos descritos a continuacion y se aislaron HSC mediante FACS simple o doble basandose en la reactividad definida previamente para marcadores de superficie celular particulares (c-kit+ linaje-Sca-1+ CD34- CD150+) en el BD FACS-Aria (BD Biosciences, San Jose, CA). Las celulas fueron trasplantadas por inyeccion retro-orbital.

Analisis de la aceptacion del injerto. La sangre se obtiene de la vena de la cola de ratones trasplantados en varios puntos temporales. Se separo usando dextrano al 2 % a 37 °C durante 30 min y posteriormente se liso usando tampon de lisis de ACK (NH4O 150 mM, KHCO3 1 mM y EDTA 0,1 mM) durante 5 minutos. Las celulas se tinen con los anticuerpos descritos anteriormente y se analizan en el BD FACS-Aria. El quimerismo de los granulocitos de los donantes se determina analizando el porcentaje de celulas Ter119-CD3- B220"Mac1alt°dispersi0n lateralalto que son tambien donante+.

Se establece un modelo animal SCID-hu para la medula osea humana. Las HSC humanas se ensayan acondicionando con imatinib para el empobrecimiento del nicho como se ha descrito anteriormente y para el quimerismo despues del trasplante.

Modelo de medula osea Scid-hu. Femures y tibias fetales humanos (1-2 cm) de 17-22 semanas gestacional (g.w.), que se sabe que son activos en la hematopoyesis, se cortan a lo largo de un eje longitudinal de modo que quede expuesta la corteza osea, as! como las regiones intramedulares. Estos fragmentos son a continuacion implantados quirurgicamente por via subcutanea en ratones SCID. Se cruzan ratones homocigotos CB-17 scid/scid, se tratan con antibioticos como se describe (McCune et al., Science (1988) 241:1632) y se utilizan cuando tienen 6-8 semanas de edad. Se aplica anestesia con metoxiflurano durante todos los procedimientos quirurgicos. Los cortes de tejidos tenidos con hematoxilina-eosina se preparan a partir de injertos oseos 2 semanas y 8 semanas despues de la implantation. Los tejidos se fijan en formalina al 20 %, se descalcifican con EDTA (1,7 mM) en solution de HCl, se incluyen en parafina y se cortan en cortes con un grosor de 4 pm y se tinen con hematoxilina y eosina. Los injertos se eliminan a intervalos variables despues de la implantacion y se analizan para detectar la presencia de actividad hematopoyetica humana.

Las suspensiones celulares se preparan a partir de tejidos de medula osea implantados o normales, se tratan con

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cloruro de amonio al 0,83 % durante 5-10 minutos a temperatura ambiente para lisar los eritrocitos y se lavan con PBS. Las celulas se incuban con anticuerpos MEM-43 biotinilados, Ly5.1 biotinilados o anticuerpos de control biotinilados durante 45 minutos en hielo, se lavan a traves de un cojln de suero bovino fetal (FBS) y luego se tinen con avidina conjugada con fluorescelna (FITC-) (Caltag Laboratories Inc.) durante 45 min. Antes de la citometrla de flujo, se anade yoduro de propidio (PI) a una concentration final de 10 gg/ml para eliminar las celulas muertas. Los patrones de dispersion frontal y lateral de las celulas positivas para MEM-43 se obtienen mediante citometrla de flujo de cuatro parametros usando un unico FACScan con laser (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

El origen humano de las celulas hematopoyeticas dentro de los injertos se confirma por citometrla de flujo con MEM- 43 (un anticuerpo especlfico de un antlgeno comun de celulas humanas) o Ly5.1 (reactivo con antlgeno pan- leucocito de raton). La sustitucion de la medula osea humana por celulas hematopoyeticas de raton se observa en algunos de los injertos incubados in vivo durante mas de 20 semanas.

Las caracterlsticas de las poblaciones de celulas hematopoyeticas en la medula osea se analizan mediante perfiles de dispersion de luz utilizando citometrla de flujo. Cuatro grupos distintivos de celulas hematopoyeticas, es decir, las poblaciones linfoides (RI), blastoides (R2), mieloides (R3) y granulocitos maduros (R4) se revelan en la medula osea fetal normal mediante distribuciones de dispersion frontal y lateral. Se llevan a cabo analisis similares con celulas humanas positivas para MEM-43 recuperadas de los implantes oseos en diferentes puntos temporales despues de la implantation. Las celulas recuperadas 2 semanas despues de la implantation no muestran formation clara de agrupamientos, lo que indica que estas celulas no son de origen hematopoyetico, mientras que las celulas humanas de injertos incubados durante mas de 4 semanas mostraron perfiles de dispersion similares a los de las celulas normales de medula osea fetal. Por lo tanto, se observa que la cinetica de la aparicion de celulas hematopoyeticas humanas en el hueso implantado detectado por analisis de dispersion concuerda con las observaciones histologicas.

La presencia de celulas humanas en la circulation periferica de ratones SCID-hu con injertos oseos se examina mediante analisis FACS, usando la combination de anticuerpo FITC-HLe1 (el antlgeno leucocitario humano comun, CD45) y el anticuerpo PE-W6/32 (un determinante monomorfico del MHC-Clase I). Las celulas humanas se detectan a una frecuencia significativa en la sangre periferica de los ratones SCID-hu examinados despues de 9 semanas de implantacion.

Debe entenderse que esta invention no se limita a la metodologla, protocolos, llneas celulares, especies o generos animales y reactivos particulares descritos, que como tales pueden variar. Tambien se debe entender que la terminologla utilizada en la presente memoria es con el proposito de describir unicamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invencion, la cual estara limitada solamente por las reivindicaciones adjuntas

Tal como se usa en este documento, las formas singulares “uno”, “una”, y “el”, “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asl, por ejemplo, la referencia a “una celula” incluye una pluralidad de tales celulas y la referencia a “el cultivo” incluye referencia a uno o mas cultivos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, etc. Todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comunmente entienden los expertos en la materia a los que pertenece esta invencion a menos que se indique claramente lo contrario.

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a c-kit e interfiere con la senalizacion de un factor de crecimiento esencial para el crecimiento o el mantenimiento de celulas madre hematopoyeticas para su uso en un metodo de injerto de celulas madre en un mamlfero, en donde el metodo comprende:

   poner en contacto dicho mamlfero con dicha composicion para extirpar selectivamente celulas madre endogenas en dicho tejido diana e

   introducir celulas madre exogenas a dicho mamlfero despues de un perlodo de tiempo suficiente para eliminar sustancialmente dicho anticuerpo de la circulacion del paciente.
2. 2. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho perlodo de tiempo suficiente para eliminar sustancialmente dicho anticuerpo es tal que el anticuerpo esta presente a una concentracion de menos de 10 ng/ml en la corriente sangulnea.
3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho tejido diana es medula osea.
5. 5. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas celulas madre son celulas madre hematopoyeticas.
6. 6. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho mamlfero es un ser humano.
7. 7. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas celulas madre exogenas son celulas madre modificadas geneticamente.
8. 8. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas celulas madre exogenas son celulas madre alogenicas.
9. 9. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicho ser humano padece un trastorno genetico de la sangre, incluida una hemoglobinopatla.
10. 10. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho anticuerpo que se une selectivamente a c-kit es administrado sistemicamente.
11. 11. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el anticuerpo que se une selectivamente a c-kit es suministrado directamente al tejido diana.
12. 12. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde, antes de la perfusion de celulas madre exogenas, se administra un agente acondicionador, seleccionado de un anticuerpo especlfico de uno o mas de CD4, una especificidad para linfocitos NK, una especificidad para macrofagos y CD8.