ES2642276T3 - Vectores lentivirales pseudotipados con glicoproteínas de envoltura BaEV mutantes - Google Patents

Vectores lentivirales pseudotipados con glicoproteínas de envoltura BaEV mutantes Download PDF

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Description

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[0058] Por lo tanto, en un aspecto particular de la descripción, la célula hematopoyética diana es un linfocito T, preferiblemente un linfocito T sin tratar o de memoria.
5 [0059] Las partículas de vector lentiviral pseudotipado con BaEV/TR y BaEVRLess también permitieron una transducción altamente eficiente del 20-30 % de los linfocitos B en reposo y, por lo tanto, superaron con mucho a las partículas de vector lentiviral pseudotipado con VSV-G o RD114/TR que no permitieron la transducción o permitieron una transducción muy baja de linfocitos B humanos en reposo. Además, tras la estimulación del receptor de linfocitos B (BCR), las partículas de vector lentiviral pseudotipadas de BaEV/TR y BaEVRLess transdujeron hasta el
10 70 % de los linfocitos B mientras que las partículas de vector lentiviral pseudotipado con eficiencia de transducción de VSV-G no supera el 5 %. De forma importante, los linfocitos B de memoria así como sin tratar se transdujeron eficientemente por partículas de vector lentiviral pseudotipado con BaEV/TR y BaEVRLess.
[0060] Por lo tanto, en una realización particular, la célula hematopoyética diana es un linfocito B, en
15 particular un linfocito B en reposo, preferiblemente un linfocito B se sin tratar o de memoria. También puede ser un linfocito B de cáncer, en particular una célula de leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (BCLL) o un linfocito B de linfoma de zona marginal (MZL).
[0061] Debido al valor potencial de la transferencia génica de timocitos para la modulación inmune, los
20 inventores evaluaron el rendimiento de los BaEVgp-LV en comparación con los otros pseudotipos de LV para la transducción de diferentes subpoblaciones de timocitos. Tras el aislamiento de los timocitos de un timo humano, los transdujeron en presencia de la citocina de supervivencia IL-7 con VSV-G-, RD114/TR-, BaEV/TR-y BaEVRLess-LV que codifican el indicador de GFP en un MOI de 10. Los inventores demostraron que los RD114/TR-LV, BaEV/TR-LV y BaEVRLess-LV permiten la transducción preferencial de los timocitos en las primeras etapas de desarrollo
25 (células dobles negativas e individuales positivas inmaduras CD4), mientras que aún transducen los más maduros hasta un nivel inferior. Como ya se detectó para los linfocitos T humanos adultos, los BaEVgp LV transdujeron todas las diferentes subpoblaciones de timocitos más eficientemente que los RD114/TR-LV. Además, la transducción con los diferentes pseudotipos de vectores lentivirales no tuvo ningún efecto sobre la distribución de diferentes subpoblaciones de timocitos. Por lo tanto, los inventores demostraron que los BaEVgp-LV son excelentes
30 herramientas para la transducción de timocitos y que son especialmente superiores a VSV-G-y RD114/TR-LV para la transducción de las subpoblaciones de timocitos de células negativas dobles inmaduras (DN) y positivas individuales inmaduras CD4 (ISP).
[0062] Por lo tanto, en una realización particular, la célula hematopoyética diana es un timocito.
35 [0063] Finalmente, los inventores pre-estimularon linfocitos T CB totales recién aislados con la citocina de supervivencia de linfocitos T IL-7 para conservar el fenotipo sin tratar de linfocitos T, y posteriormente se transdujeron con los diferentes vectores: Los VSV-G-, RD114/TR-, BaEV/TR -y BaEVRLess-LV que codificaron el indicador de GFP en un MOI de 10 o 20, o en un MOI de 50 para VSV-G-LV. Demostraron que los BaEV/TR-y
40 BaEVRLess-LV presentan una eficiencia de transducción muy superior (40-50 % de transducción) a un MOI = 10 en comparación con VSV-G o RD114/TR-LV. Es importante destacar que los BaEV/TR-y BaEVRLess-LV alcanzaron fácilmente el 65 % de transducción cuando la dosis vectorial fue 2 veces mayor (MOI = 20). En todos los casos, los emigrantes de timocitos recientes sin tratar (CD69L+ CD45RA+ CD31+) se transdujeron en la misma medida que los linfocitos T CB sin tratar más maduros (CD69L+ CD45RA+ CD31-). Además, la transducción no tuvo ningún efecto
45 sobre la distribución de estas dos poblaciones de linfocitos T CB sin tratar.
[0064] Por lo tanto, en un aspecto particular de la descripción, la célula hematopoyética diana es una célula sin tratar. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula sin tratar" se refiere a una célula que todavía no ha sido sometida a activación celular en respuesta a un estímulo. En particular, una "célula sin tratar" puede ser
50 una célula que todavía no ha sido expuesta a un antígeno.
[0065] Puesto que una fuerte estimulación con un cóctel de citocinas induce la diferenciación de HSC y su pérdida de capacidad de auto-renovación, es de particular interés pre-estimular las células lo menos posible, evitar su diferenciación tanto como sea posible y mantener elevadas sus "características de células madre".
55 [0066] Los inventores aplicaron los vectores virales pseudotipados de la invención a un MOI fijo (número de partículas infecciosas por célula) de 10 y diferentes protocolos de pre-estimulación de citocinas en células progenitoras tempranas CD34+ humanas: 1) ninguna estimulación; 2) estimulación con SCF o TPO; 3) estimulación con SCF y TPO; 4) estimulación con SCF, TPO y FIt3-L. Es importante destacar que, el cóctel de pre-estimulación
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una transcriptasa inversa, es decir, un miembro de la familia de Retroviridae. Los retrovirus se dividen en Oncovirus, Lentivirus y Spumavirus. Preferiblemente, dicho retrovirus es un oncovirus, por ejemplo, MLV, ALV, RSV, o MPMV, un lentivirus, por ejemplo, VIH-1, VIH-2, SIV, EIAV, o CAEV, o un spumavirus tal como HFV. Los genomas de estos retrovirus están fácilmente disponibles en bancos de datos. Más preferiblemente, dicho retrovirus es un lentivirus, en
5 particular VIH-1, VIH-2 o SIV.
[0073] En el contexto de la invención, "una secuencia nucleica que comprende un genoma derivado de retrovirus capaz de encapsidarse" está destinada a una secuencia que comprende las secuencias de ácido nucleico retrovírico conocidas como secuencias "de actuación en cis". Estas incluyen las repeticiones terminales largas (LTR)
10 para el control de la transcripción e integración, la secuencia psi necesaria para la encapsidación, y las secuencias del sitio de unión al cebador (PBS) y de seguimiento de polipurina (PPT) necesarias para la transcripción inversa del genoma retroviral. Ventajosamente, dicha secuencia de ácido nucleico que comprende un genoma derivado de retrovirus capaz de encapsidarse comprende además un transgén.
15 [0074] Dicho genoma retroviral puede ser defectuoso para la replicación o capaz de replicarse, en ausencia de cualquier función de complementación de trans. Un genoma competente para la replicación comprenderá además los genes retrovirales gag, pol y env. En un genoma defectuoso para la replicación, se suprimen los genes virales gag, pol y env. Sin embargo, el ensamblaje de las partículas de vectores virales de la invención puede conseguirse proporcionando en trans otro plásmido que codifica la glicoproteína gag, pol y/o env pero que es defectuosa para las
20 secuencias "cis". Su expresión permite la encapsidación del transgén, excluyendo los genes necesarios para la multiplicación del genoma viral y para la formación de partículas virales completas.
[0075] La "proteína central de un retrovirus" se refiere a proteínas codificadas por los genes gag y pol. El gen gag codifica una poliproteína que es procesada adicionalmente por la proteasa retroviral en proteínas estructurales
25 que comprenden el núcleo. El gen pol codifica la proteasa retroviral, la transcriptasa inversa y la integrasa.
[0076] Con el propósito de la transfección, dichas primera, segunda y tercera secuencias de ácido nucleico pueden transportarse en un mismo vector, o en dos o tres vectores separados. Generalmente, un plásmido codifica el componente retroviral de núcleo de la partícula del vector viral. El origen de los genes gag y pol da su nombre a la
30 partícula del vector viral. Por ejemplo, la expresión "partícula de vector derivada de VIH-1" indica usualmente que los genes gag y pol de la partícula de vector son los de VIH-1.
[0077] El término "transfección" se refiere a la introducción de un ácido nucleico extraño (ADN, ADNc o ARN) en una célula de manera que la célula huésped expresará el gen o secuencia introducida para producir una
35 sustancia deseada, típicamente una proteína codificada por el gen o la secuencia introducida. El gen introducido puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como de inicio, parada, promotora, de señal, de secreción u otras secuencias utilizadas por la maquinaria genética de una célula. Se ha "transfectado" una célula huésped que recibe y expresa ADN o ARN introducido.
40 [0078] Para la producción de partículas de vector, se puede emplear cualquier célula que sea compatible con la expresión de genes Gag y Pol lentivirales, o cualquier célula que pueda ser diseñada para soportar tal expresión. Por ejemplo, pueden usarse células productoras tales como células 293T y células de insecto (en particular para vectores derivados de VIH), TE 671 y HT1080 (en particular para vectores derivados de MLV).
45 Aplicaciones terapéuticas
[0079] La presente invención también se refiere a un medicamento que comprende una partícula de vector viral pseudotipado como se ha definido anteriormente como principio activo, en particular una partícula de vector viral pseudotipado como se ha definido anteriormente, que comprende además un material biológico que es
50 preferiblemente uno o más ácidos nucleicos. La descripción también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una partícula de vectores virales pseudotipados como se ha definido anteriormente, en particular una partícula de vectores virales pseudotipados como se ha definido anteriormente que comprende además un material biológico que es preferiblemente uno o más ácidos nucleicos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
55 [0080] La presente descripción también se refiere a un método para tratar un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de vector viral pseudotipado como se ha definido anteriormente, en particular una partícula de vector viral pseudotipado como se ha definido anteriormente que comprende además un material biológico que es preferiblemente uno o más ácidos nucleicos, al sujeto que lo necesite.
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[0081] En el contexto de la presente descripción, un "sujeto" representa un mamífero humano o no humano, tal como un roedor (rata, ratón, conejo), un primate (chimpancé), un felino (gato), un canino (perro). Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
5 [0082] Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que se puede administrar a un paciente, junto con un vector viral de esta invención, y no destruye su actividad farmacológica y es no tóxico al administrarse en dosis suficientes para administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz del vector viral.
10 [0083] Los portadores y vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero sin limitación, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS) tal como d-α-tocoferol polietilenglicol 1000 succinato, tensioactivos utilizados en formas de dosificación farmacéuticas tales como Tweens u
15 otras matrices de administración poliméricas similares, proteínas de suero, tal como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras,
20 polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. También se pueden utilizar ventajosamente ciclodextrinas tales como α, β y γ-ciclodextrina, o derivados modificados químicamente tales como hidroxialquilciclodextrinas, incluyendo 2 y 3-hidroxipropil-β-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados para mejorar la administración de composiciones de acuerdo con la descripción. Puede utilizarse cualquier método de administración adecuado conocido por un experto en la técnica. En particular, la partícula de vector viral
25 pseudotipado de acuerdo con la invención puede administrarse, por ejemplo, por vía oral o por vía parenteral (en particular por inyección intravenosa e inyección intrafemoral (cavidad de la médula ósea). Cuando se selecciona la ruta parenteral, las partículas de vectores virales pseudotipados pueden estar en forma de soluciones inyectables y suspensiones, acondicionadas en ampollas o matraces. Las formas para administración parenteral se obtienen convencionalmente mezclando las partículas de vectores virales pseudotipados de acuerdo con la invención con
30 tampones, estabilizadores, conservantes, agentes solubilizantes, agentes isotónicos y agentes de suspensión. De acuerdo con técnicas conocidas, estas mezclas pueden esterilizarse entonces y acondicionarse en forma de inyecciones intravenosas. Un experto en la técnica puede usar tampones a base de sales de fosfato orgánicas como tampón. Los ejemplos de agentes de suspensión incluyen metilcelulosa, goma arábiga y carboximetilcelulosa sódica. Los ejemplos de estabilizantes incluyen sulfito de sodio y metasulfito de sodio, y los ejemplos de conservantes
35 incluyen p-hidroxibenzoato de sodio, ácido sórbico, cresol y clorocresol.
[0084] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un vector viral que confiere un efecto terapéutico al sujeto tratado. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto). Como se conoce por el experto en la
40 técnica, las dosis eficaces variarán dependiendo de la vía de administración, el tamaño y/o peso del sujeto, así como de la posibilidad de uso concomitante con otros agentes.
[0085] Cuando se utiliza la partícula del vector viral pseudotipado como medicamento y se administra a un sujeto en un método terapéutico, se prefiere la administración a través de la vía intravenosa o por la vía medular, en
45 particular la vía medular del fémur o húmero. Para la administración intravenosa se puede usar una dosis unitaria de aproximadamente 5.108 a aproximadamente 109 partículas de vectores virales pseudotipados como se ha definido anteriormente, mientras que para la administración medular puede usarse una dosis unitaria de aproximadamente 108 a aproximadamente 5.108 partículas de vector viral pseudotipado como se ha definido anteriormente.
50 [0086] En una realización particular, la partícula de vector viral pseudotipado de la invención es para su uso en el tratamiento de un trastorno hematopoyético o una enfermedad autoinmune.
[0087] La presente descripción también se refiere al uso de una partícula de vectores virales pseudotipados como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno
55 hematopoyético o una enfermedad autoinmune. También se refiere a un método para tratar un trastorno hematopoyético o una enfermedad autoinmune, en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de vector viral pseudotipado de la invención en un sujeto que lo necesite.
[0088] Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno hematopoyético" se refiere a una
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enfermedad de la sangre, en particular a una enfermedad que afecta a las células hematopoyéticas. Preferiblemente, dicho trastorno hematopoyético es una enfermedad hematopoyética monogénica.
[0089] Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad hematopoyética monogénica" se 5 refiere a una enfermedad hematopoyética genética, que se debe a la mutación de un único gen.
[0090] Los ejemplos de trastornos hematopoyéticos incluyen mielodisplasia, anemia aplásica, anemia de Fanconi, hemoglobinuria nocturna paroxística, anemia de células falciformes, anemia de Diamond Blackfan, trastorno de Schachman Diamond, síndrome de Kostmann, enfermedad granulomatosa crónica, 10 adrenoleucodistrofia, deficiencia de adhesión leucocitaria, hemofilia, talasemia, beta-talasemia, leucemia tal como leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (mieloide) (AML), leucemia linfoblástica adulta, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (B-CLL), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mielógena crónica juvenil (CML), y leucemia mielomonocítica juvenil (JMML), enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), inmunodeficiencia combinada grave ligada a X, síndrome de Wiskott
15 Aldrich (WAS), deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA), enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de Chediak-Higashi, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL) y sida.
[0091] Preferiblemente, el trastorno hematopoyético se selecciona del grupo que consiste en anemia de Fanconi, hemofilia, beta-talasemia, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada grave unida al 20 cromosoma, deficiencia de adenosina-desaminasa, enfermedad granulomatosa crónica y adrenoleucodistrofia.
[0092] Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad autoinmune" se refiere a una enfermedad debida a una respuesta inmune hiperactiva del cuerpo frente a sustancias y tejidos normalmente presentes en el cuerpo. Por consiguiente, al dirigir específicamente las células inmunes (hematopoyéticas)
25 implicadas en esta respuesta inmune hiperactiva, las partículas de vector de la invención podrían ser herramientas útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
[0093] Las enfermedades autoinmunes incluyen en particular la encefalomielitis aguda diseminada, la leucoencefalitis aguda hemorrágica, la enfermedad de Addison, la agammaglobulinemia, la alopecia areata, la 30 esclerosis lateral amiotrófica, la espondilitis anquilosante, el síndrome antifosfolipídico, el síndrome antisintetasa, la alergia atópica, la anemia aplásica autoinmune, la miocardiopatía autoinmune, la enteropatía autoinmune, la anemia hemolítica autoinmune, la hepatitis autoinmune, la enfermedad del oído interno autoinmune, el síndrome linfoproliferativo autoinmune, la neuropatía periférica autoinmune, la pancreatitis autoinmune, el síndrome poliendrocrino autoinmune, dermatitis autoinmune por progesterona, la púrpura trombocitopénica autoinmune, la 35 urticaria autoinmune, la uveítis autoinmune, la enfermedad de Balo, la esclerosis de Balo, el síndrome de Bechets, la enfermedad de Berger, la encefalitis de Bickerstaff, síndrome de Blau, penfigoide ampolloso, cáncer, enfermedad de Castleman, enfermedad celíaca, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, osteomielitis multifocal recurrente crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de Cogan, enfermedad aglutinina fría, deficiencia del componente 2 del complemento, arteritis craneal, síndrome de CREST, enfermedad de Crohn, 40 síndrome de Cushing, angiitis leucocitoclástica cutánea, enfermedad de Dego, enfermedad de Dercum, dermatitis herpetiformis, dermatomiositis, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis sistémica cutánea difusa, síndrome de Dressler, lupus eritematoso discoide, eccema, artritis relacionada con entesitis, fascitis eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, epidermólisis ampollosa adquirida, eritema nodoso, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Evan, fibrodisplasia osificante progresiva, alveolitis fibrosante, gastritis, penfigoide gastrointestinal, arteritis de células gigantes, 45 glomerulonefritis, síndrome de goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barré (GBS), encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestationis, hipogammaglobulinemia, enfermedad desmielinizante inflamatoria idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, nefropatía por IgA, miositis por cuerpos de inclusión, polineuropatía desmielinizante inflamatoria, cistitis intersticial, artritis idiopática juvenil, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Kawasaki, 50 síndrome miasténico de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, enfermedad por IgA lineal (LAD), enfermedad de Lou Gehrig, hepatitis lupoide, lupus eritematoso, síndrome de Majeed, enfermedad de Ménière, poliangiitis microscópica, síndrome de Miller-Fisher, enfermedad del tejido conectivo mixto, morfea, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miositis, neuropielitis óptica, neuromiotonia, penfigoide cicatricial ocular, síndrome de opsoclono-mioclono, tiroiditis de ord, reumatismo palindrómico, 55 degeneración cerebelar paraneoplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars planitis, pénfigo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, encefalomielitis perivenosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, polimialgia reumática, polimiositis, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, neuropatía inflamatoria progresiva, psoriasis, artritis psoriásica, pioderma gangrenosa, aplasia pura de células rojas, encefalitis de Rasmussen, fenómeno de Raynaud, policondritis
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BaEVRLess-LV = 45-70 %, VSV-G-LV = 25-50 %). A la misma dosis de vector utilizada para los LV pseudotipados con BaEV/TR y BaEVRLess, sólo el 10-35 % de progenitores clonogénicos fueron transducidos con pseudotipos de RD114/TR LV. No hubo diferencias significativas entre la proporción de células CD34+ transducidas por RD114/TR-, BaEV/TR-, BaEVRLess LV después de una pre-estimulación con rCOF + rTPO y los progenitores clonogénicos
5 derivados de ellas lo que indicaba que la transducción de células hCD34+ fue estable (Figura 8). Por el contrario, para los VSV-G LV, la proporción de progenitores clonogénicos transducidos fue significativamente menor que la tasa de células CD34+ transducidas de las que se obtuvieron (Figura 8), lo que sugería que los vectores pseudotipados con VSV-G transdujeron más células CD34+ diferenciadas o eran más tóxicas que otros vectores ensayados.
10 [0128] Estos resultados mostraron que los pseudotipos de BaEV/TR y BaEVRLess-LV se transducen de forma estable a una alta tasa células progenitoras de repoblación a corto plazo.
Los LV pseudotipados con BaEV transducen a una alta eficiencia progenitores hematopoyéticos de repoblación en 15 ratones inmunodeficientes
[0129] Para determinar la eficacia de transducción de ambos vectores pseudotipados mutantes de BaEV en progenitores hematopoyéticos de repoblación, se preestimularon durante 16 h células CD34+ de sangre de cordón con rSCF, rTPO y FLk-3L y luego se transdujeron con vectores pseudotipados con RD114/TR, BaEV/TR y
20 BaEVRLess a un MOI de 10 o con LV pseudotipados con VSV-G a un MOI de 100 y se trasplantaron en ratones , γc-/
recién nacidos irradiados subletalmente inmunodeficientes Balbc, Rag2-/-o ratones NOD/SCID/γc-/-(NSG) (Tabla 1). Ambos modelos de ratones permiten el injerto de un sistema completo de sangre humana ya que carecen de linfocitos T, B y células NK.
25 [0130] Después de 8-10 semanas, los animales se sacrificaron y el porcentaje de células nucleadas de sangre humana total (CD45+) en la médula ósea se determinó mediante análisis FACS (Tabla 1).
Tabla 1. Los BaEV/TR-y BaEVRLess-LV permiten una transducción eficiente de células de repoblación de SCID
Médula ósea
Bazo Timo
Pseudotipo
Injerto de médula ósea (%) CD45+ GFP+ (%) CD34+ GFP+ (%) CD19+ GFP+ (%) CD13+ GFP+ (%) CD14+ GFP+ (%) CD45+ GFP+ (%) CD45+ GFP+ (%)
VSV-G
1(*)
22,1 32,0 18,3 41,0 5,7 7,7 NA NA
2(*)
2,2 6,8 27,7 15,5 9,6 4,0 NA NA
3(*)
57,3 5,7 17,7 12,5 22,3 19,2 NA NA
RD114/TR
1(*)
32 3,2 2,9 2,8 4 7 NA NA
2(*)
15,3 39,0 33,8 38,6 34,2 35,0 NA NA
3(*)
2,3 17,6 16,5 21,8 11,3 13,5 NA NA
4(*)
34,0 27,2 40,1 27,1 24,1 18,7 NA NA
5(°)
30,6 76,5 64,5 78,8 57,4 45,2 37,0 41,2
6(°)
25,3 12,6 13,8 10,0 11,1 4,8 20,5 15,8
BaEV/TR
1(*)
23,6 36,0 41,4 39,1 37,4 56,6 NA NA
2(*)
21,6 69,7 78,9 68,0 73,7 68,7 NA NA
3(°)
27,6 92,0 91,7 89,7 82,5 72,7 84,2 84,3
4(°)
36,4 59,3 40,0 59,8 68,0 33,3 69,4 65,5
BaEVRLess
1(*)
23,8 33,9 35,7 38,7 35,6 38,6 NA NA
2(*)
10,0 56,2 70,2 66,1 59,3 65,5 NA NA
4(*)
17,6 70,5 64,4 76,2 67,9 67,6 NA NA
5(°)
64,1 55,5 51,5 56,0 56,9 59,4 52,0 76,9
6(°)
52,8 52,8 56,0 46,6 61,1 60,0 42,5 4,1
7(°)
89,5 87,5 83,8 86,7 83,1 83,9 69,4 74,8
(*) Ratones Balbc, Rag2-/-, γc-/(°) Ratones NOD/SCID/γc-/
[0131] Se detectó un alto nivel comparable de injerto con células humanas para todas las condiciones de 22
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más eficientemente que los RD114/TR-LV. Además, la transducción con los diferentes pseudotipos de vectores lentivirales no tuvo ningún efecto sobre la distribución de diferentes subpoblaciones de timocitos (Figura 22C). Esto indica que los BaEVgp-LV son excelentes herramientas para la transducción de timocitos y que son especialmente superiores a VSV-G-y RD114/TR-LV para la transducción de las subpoblaciones de timocitos DN e ISP inmaduros.
5
Los BaEVgp-LV permiten una transducción de alto nivel de emigrantes de timocitos recientes de sangre de cordón
[0152] Puede ser de gran interés para la terapia génica de linfocitos T o la inmunoterapia modificar genéticamente verdaderamente linfocitos T verdaderamente sin tratar, que se entiende que son las células que
10 persisten durante toda la vida de un individuo. Por lo tanto, los inventores se centraron en linfocitos T de sangre de cordón umbilical (CB) ya que están ganando importancia en el contexto de trasplantes alogénicos de CB. La mayoría de los linfocitos T CB están sin tratar y proporcionan la ventaja de que representan un riesgo reducido de enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), un efecto secundario común que se observa en el trasplante alogénico de médula ósea, incluyendo los linfocitos T adultos alógenos. Sin embargo, a diferencia de los linfocitos T
15 adultas, los linfocitos T CB ejercen un efecto reducido de injerto contra leucemia. La mayoría de los linfocitos T CB (70-80 %) se identifican por tinción positiva a CD31, CD62L y CD45RA, que es una población de linfocitos T sin tratar muy inmaduros y se llaman emigrantes timocitos recientes (RTE). La modificación genética de estas células en el contexto del trasplante alogénico para aumentar su efecto de injerto contra leucemia sin aumentar la GVHD será beneficiosa (Micklethwaite et al. (2010) Blood 115: 2695-703). Por lo tanto, los
20 inventores ensayaron varios pseudotipos del vector lentiviral para su eficacia de transducción de RTE CB.
[0153] Para conservar el fenotipo sin tratar de linfocitos T, se pre-estimularon linfocitos T CB totales recién aislados con la citocina de supervivencia de linfocitos T, IL-7, y posteriormente se les transdujo con los diferentes vectores: VSV-G-, RD114/TR-, BaEV/TR-y BaEVRLess-LV que codifican el indicador de GFP a un MOI de 10 o 20,
25 excepto para VSV-G-LV para los que se aplicó una dosis vectorial más alta (MOI de 50). La Figura 23A muestra que los BaEV/TR-y BaEVRLess-LV muestran una eficiencia de transducción altamente superior (transducción al 40-50 %) a un MOI = 10 en comparación con VSV-G o RD114/TR-LV (Figura 23A). Es importante destacar que los BaEV/TR-y BaEVRLess-LV alcanzaron fácilmente el 65 % de transducción cuando la dosis vectorial fue 2 veces mayor (MOI = 20; Figura 23A). En todos los casos, los emigrantes de timocitos recientes sin tratar (CD69L+
30 CD45RA+ CD31+) se transdujeron en la misma medida que los linfocitos T CB sin tratar más maduros (CD69L+ CD45RA+ CD31-; Figura 23A). Además, la transducción no tuvo ningún efecto sobre la distribución de estas dos poblaciones de linfocitos T CB sin tratar (Figura 23B).
Análisis
35 [0154] En este ejemplo, los inventores describieron el pseudotipaje eficiente de vectores lentivirales usando una nueva glicoproteína de envoltura BaEV derivada del virus endógeno de babuino. Dos mutantes de esta glicoproteína: la glicoproteína quimérica BaEV/TR y la glicoproteína BaEVRLess, permitieron una mejor incorporación en la superficie del LV en comparación con la glicoproteína BaEVwt. Los LV pseudotipados por estas
40 envolturas puede producirse a altos títulos (1.107 IU/ml). Al igual que los pseudotipos RD114/TR-LV, eran estables en sueros humanos y de macaco, lo que permite perspectivas clínicas potenciales para la administración in vivo de transgenes.
[0155] En cuanto a la transducción de células hCD34+, los pseudotipos de LV mutante de BaEV fueron
45 superiores a VSV-G y RD114/TR. En primer lugar, fueron capaces de transducir células hCD34+ tras protocolos de muy baja pre-estimulación. De hecho, actualmente se usan cócteles de citocinas que contienen rSCF, rTPO, rFlt3-L e IL-3 pero se notificó que cuantas más células hCD34+ sean estimuladas, más se diferencian y pierden su capacidad de reconstitución hematopoyética a largo plazo. Además, se pensó que IL-3 aumentaba notablemente la diferenciación de CD34+. Aquí, los inventores mostraron que los BaEV/TR-y BaEVRLess-LV alcanzaron altas tasas
50 de transducción de células hCD34+ cuando se pre-estimularon con rSCF, rTPO o rSCF y la co-estimulación con rTPO durante un corto tiempo de 16 h. Estos protocolos de estimulación de citocinas suaves redujeron en gran medida el riesgo de diferenciación de HSC presentes en la población de células hCD34+. Es de gran importancia que, estos resultados indicaron que los pseudotipos de BaEV/TR-LV pueden transducir el 10-20 % de las células hCD34+ no estimuladas mientras que los VSV-G-LV y RD114/TR-LV permanecieron ineficientes. Por lo tanto, puesto
55 que no se necesita estimulación con citocinas para lograr una transducción eficiente de células hCD34+ con BaEV/TR o BaEVRLess-LV, posiblemente permiten conservar mejor el carácter de células madre de las células hCD34+.
[0156] Otra observación importante fue que a bajos MOI (5 y 10), el vector lentiviral pseudotipado con
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