ES2642390T3 - Nuevas cepas de levadura para la producción de alcohol - Google Patents

Nuevas cepas de levadura para la producción de alcohol Download PDF

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ES2642390T3 ES10808994.7T ES10808994T ES2642390T3 ES 2642390 T3 ES2642390 T3 ES 2642390T3 ES 10808994 T ES10808994 T ES 10808994T ES 2642390 T3 ES2642390 T3 ES 2642390T3
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Jean-Michel Bavouzet
Jean-Marc Ladriere
Annie Tbaikhi
William Wyme
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Lesaffre et Cie SA
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Description

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DESCRIPCION
Nuevas cepas de levadura para la produccion de alcohol Campo tecnico
La presente invencion se refiere a nuevas cepas de levadura y a levaduras derivadas de estas nuevas cepas destinadas a la produccion de alcohol en medios toxicos, a un procedimiento de seleccion de dichas cepas, as^ como a un procedimiento de produccion de alcohol, en particular en medios toxicos.
Antecedentes tecnologicos
Es conveniente para un industrial reciclar las aguas derivadas de fermentaciones para utilizarlas en un nuevo medio de fermentacion. Esto permite, entre otras cosas, reducir las entradas y salidas de aguas de los fermentadores.
El reciclaje de aguas se realiza de forma tradicional despues de la fermentacion en medios que contienen fuentes de azucares derivados de la remolacha o cana, tales como los medios EP2 (Egout Pauvre derivado de la 2a cristalizacidn del azucar), pero tambien despues de la fermentacion en medios que contienen azucares derivados del trigo o del mafz.
Las aguas de reciclaje permiten proporcionar elementos nutricionales para la levadura, pero presentan sobre todo una toxicidad para la levadura, toxicidad que va a aumentar a medida que aumenta la tasa de reciclaje.
Por otra parte, ciertas materias primas utilizadas en los medios de fermentacion son en sf mismas toxicas para la levadura. Es por ejemplo el caso de las melazas (llamadas tambien EP3 o Egout Pauvre derivado de la 3a cristalizacidn del azucar).
La toxicidad de las aguas de reciclaje y de estas materias primas toxicas resulta en particular de la presencia de acidos organicos y de sales.
En un medio toxico que contiene, parcial o totalmente, aguas de reciclaje y/o materias primas toxicas, las levaduras conocidas utilizadas en fermentacion alcoholica tienen una cinetica de produccion de alcohol menos rapida que en un medio no toxico. Ademas, la cantidad maxima de alcohol producido por las levaduras conocidas en fermentacion en un medio toxico es menor que en un medio no toxico.
Cuando las materias primas utilizadas son toxicas en sf mismas, su dilucion en el medio de fermentacion permite limitar su efecto toxico. Sin embargo, esta dilucion genera costes adicionales muy importantes, ligados en particular a una menor productividad en volumen y a costes de enfriamiento y de destilacion mayores.
Los intentos de resolver el problema de los medios toxicos se han enfocado hasta ahora en hacer el medio de fermentacion menos toxico. Sin embargo, no se ha encontrado ninguna solucion realmente satisfactoria a este problema. Otro enfoque ha sido seleccionar cepas de levadura resistentes a un medio toxico por un procedimiento de aclimatacion de la levadura (documento WO 2009/137804).
Por tanto, existe una necesidad real de proporcionar una solucion alternativa para mejorar la produccion de alcohol por las levaduras en medios de fermentacion toxicos.
Por “mejora de la produccion de alcohol” se entiende una mejora de la cinetica de produccion de alcohol en un medio de fermentacion toxico, al tiempo que se mantiene una cantidad aceptable de alcohol producido.
Compendio de la invencion
Un primer objetivo de la invencion es proporcionar una cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada entre la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4264, la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4265, la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4411 y la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4412.
Otro objetivo de la invencion concierne a un procedimiento de seleccion de una cepa resistente a un medio toxico que comprende:
- una etapa de preseleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad maxima de alcohol producido, en un medio de seleccion no toxico en condiciones de azucar no limitante, es superior o igual a 92% de la cantidad maxima de alcohol producido, en el medio de seleccion no toxico, por la cepa de referencia depositada el 4 de septiembre de 2008 en la CNCM con el numero I-4071,
- una etapa de fermentacion en un medio de seleccion toxico y en un medio de seleccion no toxico, de al menos una cepa de levadura preseleccionada, siendo la composicion inicial del medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado seleccionado de acido acetico, acido lactico, acido formico, acido levulmico o una mezcla de estos, y siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de
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seleccion no toxico, en donde la concentracion de acido organico no ionizado en el medio de seleccion toxico es una concentracion que conlleva una disminucion de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de referencia numero I-4071 de 25% a 75%, preferiblemente una disminucion de 40% a 75%, respecto a la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de numero referencia I- 4071 en el instante tmax ref en el medio de seleccion no toxico, en donde el instante tmax ref es el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de numero de referencia I-4071 en el medio de seleccion no toxico,
- una etapa de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido en el instante tmax en el medio de seleccion toxico es superior o igual a 65% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en el medio de seleccion no toxico, en donde el instante tmax es el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de levadura en el medio de seleccion no toxico, y
- una etapa suplementaria de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico es superior a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura de numero referencia I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado.
Otro objetivo de la invencion es una cepa obtenida por el procedimiento tal como se ha definido anteriormente. Tambien se describen en la presente memoria cepas de Saccharomyces cerevisiae derivadas de una cepa tal como se ha definido anteriormente.
Otro objetivo de la invencion es una levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente.
Otro objetivo de la invencion se refiere a la utilizacion de una levadura tal como se ha definido anteriormente para la produccion de alcohol.
Otro objetivo de la invencion es un procedimiento de produccion de alcohol que comprende una etapa de fermentacion de al menos una levadura tal como se ha definido anteriormente, en un medio de fermentacion.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: cantidad maxima de alcohol producido al final de una fermentacion en un medio de seleccion no toxico (fermentacion en azucares no limitantes).
La cantidad maxima de alcohol producido (en g/kg de medio inicial) se indica en ordenadas para cada uno de los hforidos 1 a 13 probados (eje de abscisas). “T” corresponde a la cepa de referencia I-4071.
Figura 2: impacto de un medio de seleccion toxico sobre la cantidad de alcohol producido en el instante tmax (fermentacion en azucares limitantes).
El eje de ordenadas indica la cantidad de alcohol producido en el instante tmax en un medio de seleccion toxico como porcentaje de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax en un medio de seleccion no toxico.
El eje de abscisas indica los hfbridos probados (1, 2, 8 y 11).
Figura 3: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de seleccion sintetico toxico (3,6 g/kg de acetato a pH 4,5, fermentacion en azucares limitantes).
El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas indica el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 (hfbrido 1) por la curva con los triangulos, la cepa de levadura I-4265 (hfbrido 2) por la curva con los cuadrados, el hfbrido 8 por la curva con los drculos y el hfbrido 11 por la curva con los rombos grises.
Figura 4: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de aplicacion sintetico toxico (5 g/kg de acetato a pH 4,5, fermentacion en azucares no limitantes).
El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 (hfbrido 1) por la curva con los triangulos, la cepa de levadura I-4265 (hfbrido 2) por la curva con los cuadrados, el hfbrido 8 por la curva con los drculos y el hfbrido 11 por la curva con los rombos grises.
Figura 5: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de aplicacion toxico A que contiene vinaza (fermentacion en azucares no limitantes).
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El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 por la curva con los triangulos y la cepa de levadura I-4265 por la curva con los cuadrados.
Figura 6: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de aplicacion toxico B que contiene vinaza (fermentacion en azucares no limitantes).
El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 por la curva con los triangulos y la cepa de levadura I-4265 por la curva con los cuadrados.
Figura 7: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de aplicacion toxico C que contiene melaza de remolacha poco diluida (fermentacion en azucares no limitantes).
El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 por la curva con los triangulos y la cepa de levadura I-4265 por la curva con los cuadrados.
Figura 8: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de aplicacion toxico D que contiene melaza de cana poco diluida (fermentacion en azucares no limitantes).
El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 por la curva con los triangulos y la cepa de levadura I-4265 por la curva con los cuadrados.
Figura 9: cinetica de produccion de alcohol en fermentacion en un medio de aplicacion toxico E que contiene melaza de la vinaza (fermentacion en azucares no limitantes).
El eje de ordenadas indica la perdida de masa (en g/kg de medio inicial) y el eje de abscisas el tiempo en horas.
La cepa de referencia I-4071 esta representada por la curva de puntos con los rombos negros, la cepa de levadura I- 4264 por la curva con los triangulos y la cepa de levadura I-4265 30 por la curva con los cuadrados.
Descripcion detallada de la invencion
Los inventores han desarrollado una solucion alternativa original para mejorar la produccion de alcohol por las levaduras en medios de fermentacion toxicos. Esta solucion alternativa consiste en seleccionar nuevas cepas de levadura resistentes a un medio de fermentacion toxico por medio de un procedimiento original de seleccion de cepas. Por tanto, al proporcionar una cepa de levadura resistente a un medio de fermentacion toxico se obtiene una levadura resistente a un medio de fermentacion toxico.
Un medio de fermentacion toxico es un medio de fermentacion que comprende al menos un factor de estres.
Un factor de estres es por ejemplo un estres ligado a la presencia de acidos organicos, un estres ligado a la presencia de sales, un estres ligado a la presencia de otras moleculas organicas inhibidoras, o un estres ligado a la presion osmotica.
Por “otras moleculas organicas inhibidoras” se entiende por ejemplo los compuestos aromaticos bencenicos y furanicos.
Un factor de estres particular es la presencia de al menos un acido organico no ionizado a una concentracion total toxica.
La expresion “concentracion total” indica la concentracion correspondiente a todos los acidos organicos no ionizados presentes en el medio de fermentacion.
Un “acido organico no ionizado” o “acido organico en forma no ionizada” es un acido carboxflico en forma protonada.
Se puede definir una concentracion toxica de acido(s) organico(s) no ionizado(s) en relacion con su efecto toxico sobre la produccion de alcohol de una cepa de levadura de referencia. Una cepa de levadura de referencia del Solicitante para la produccion de alcohol es la cepa de levadura depositada el 4 de septiembre de 2008 en la CNCM con el numero I-4071.
Con el fin de evaluar la toxicidad de una concentracion dada de acido(s) organico(s) no ionizado(s), se compara:
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- la cantidad de alcohol producido por la cepa de referencia I-4071, medida en el instante tmax, en un medio de fermentacion en azucares limitantes y que contiene el o los acidos organicos no ionizados, y
- la cantidad de alcohol producido por dicha cepa de referencia, medida en el instante tmax, en un medio de fermentacion de la misma composicion, excepto que esencialmente no comprende acido organico no ionizado.
Una concentracion toxica de acido(s) organico(s) no ionizado(s) es entonces, por ejemplo, una concentracion que comporta una disminucion de 25% a 75% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por la cepa de levadura numero I-4071 con relacion a la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa en el instante tmax, en un medio de la misma composicion pero que esencialmente no comprende acido organico no ionizado, preferiblemente de 40% a 75%.
Dicho “medio de fermentacion que contiene el o los acidos organicos no ionizados” se llama medio de seleccion toxico mas adelante.
Dicho “medio de fermentacion de la misma composicion excepto que esencialmente no comprende acido organico no ionizado” se llama medio de seleccion no toxico mas adelante.
El medio de seleccion no toxico comprende el conjunto de los nutrientes necesarios para permitir un crecimiento celular de al menos 5 g de equivalente de levadura seca por kg de medio.
Por “instante tmax” se indica el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por una cepa de levadura en un medio de seleccion no toxico.
La curva de fermentacion alcoholica que representa la cantidad de alcohol producido en funcion del tiempo comprende generalmente tres fases:
- una fase de latencia, durante la cual no hay produccion de etanol,
- una fase de produccion de alcohol, y
- una fase de meseta, que corresponde al final de la fermentacion.
La cantidad maxima de alcohol producido corresponde a la cantidad de alcohol producido cuando se alcanza la fase de meseta de una fermentacion alcoholica.
Mas adelante se utilizan indistintamente los terminos “alcohol” y “etanol”.
Las expresiones “en azucares limitantes” o “azucares que son el factor limitante de la fermentacion” significan que la fermentacion se para cuando los azucares fermentables se consumen totalmente en el medio de fermentacion.
Las expresiones “en azucares no limitantes” o “azucares que no son el factor limitante de la fermentacion” significan que la fermentacion se para cuando los azucares fermentables no se consumen totalmente en el medio de fermentacion.
Un medio que esencialmente no comprende acidos organicos no ionizados es un medio en el que la cantidad de alcohol producido por la cepa de levadura numero I-4071 no se modifica significativamente a lo largo de toda la duracion de la fermentacion con respecto a la cantidad de alcohol producido por dicha cepa en un medio de la misma composicion, excepto que no contiene ningun acido organico no ionizado.
Por ejemplo, un medio que comprende una concentracion inferior o igual a 100 mM de acido cttrico a un pH de 4,5 a 5,5 es un medio que esencialmente no comprende acido organico en forma no ionizada.
La expresion “cepa de levadura” indica una poblacion relativamente homogenea de celulas de levadura.
Una cepa de levadura se obtiene a partir del aislamiento de un clon, siendo un clon una poblacion de celulas obtenida a partir de una unica celula de levadura.
Una cepa de levadura segun la invencion es preferiblemente una cepa de levadura no modificada geneticamente.
Por “cepa de levadura resistente a un medio toxico” se indica una cepa de levadura cuya cinetica de produccion de alcohol no se ralentiza demasiado en un medio de fermentacion toxico.
Preferiblemente, una cepa de levadura resistente a un medio toxico tiene una cinetica de produccion de alcohol menos ralentizada que la de una cepa clasica destinada a la produccion de alcohol, por ejemplo tal como la cepa de levadura depositada en la CNCM con el numero I-4071.
Con el fin de seleccionar nuevas cepas de levadura resistentes a un medio toxico, los inventores han desarrollado un nuevo procedimiento original de seleccion de cepas de levadura. La implementacion de este procedimiento ha
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permitido en particular obtener las 2 nuevas cepas de Saccharomyces cerivisiae depositadas el 2 de diciembre de 2009 en virtud del tratado de Budapest ante la CNCM (Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia) con los numeros I-4264 e I-4265.
Normalmente, cuando se evaluan cepas de levadura destinadas a la produccion de alcohol, se utiliza como criterio de seleccion la cantidad maxima de alcohol producido al final de una fermentacion.
El procedimiento de seleccion de cepas de levadura resistentes a un medio toxico descrito en esta memoria utiliza como criterio de seleccion la cinetica de produccion de alcohol.
Asf, el procedimiento de seleccion comprende una etapa de seleccion de cepas de levadura sobre la base de su cinetica de produccion de alcohol en un medio de seleccion toxico en azucares limitantes con respecto a su cinetica de produccion de alcohol en un medio de seleccion no toxico en azucares limitantes.
El procedimiento de seleccion comprende una etapa adicional de seleccion de las cepas de levadura sobre la base de su cinetica de produccion de alcohol en un medio de seleccion toxico en azucares limitantes con respecto a la cinetica de produccion de alcohol de una cepa de levadura de referencia en ese mismo medio de seleccion toxico.
El procedimiento de seleccion comprende tambien una etapa adicional de seleccion de las cepas de levadura sobre la base de su cantidad maxima de alcohol producido en un medio de seleccion no toxico en azucares no limitantes con respecto a la cantidad maxima de alcohol producido por una cepa de levadura de referencia en el mismo medio de seleccion no toxico. Cuando el procedimiento comprende las dos etapas adicionales de seleccion, las diversas etapas de seleccion se llevan a cabo en cualquier orden.
El procedimiento de seleccion puede comprender ademas una etapa previa de obtencion de cepas de levadura por cruce y/o mutagenesis.
En la presente memoria se describe un procedimiento de seleccion de una cepa de levadura resistente a un medio toxico que comprende:
- una etapa de fermentacion de al menos una cepa de levadura en un medio de seleccion toxico y en un medio de seleccion no toxico,
siendo la composicion inicial del medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica y
siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico, y
- una etapa de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido en el instante tmax en el medio de seleccion toxico es superior o igual a 65% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax, por dicha cepa en el medio de seleccion no toxico.
Por “composicion inicial” se indica la composicion del medio de seleccion cuando comienza la fermentacion.
Cuando el medio de seleccion comprende mas de un acido organico no ionizado, la concentracion toxica es la concentracion toxica total de acidos organicos no ionizados. Situandose “en azucares limitantes”, esto permite estar en condiciones favorables para evaluar la cinetica de produccion de alcohol, sin sesgo ligado a la tolerancia de la cepa al alcohol y sin sesgo ligado a la presion osmotica inicial relacionada con los azucares.
La fermentacion se realiza en ausencia de aireacion.
La fermentacion se realiza preferiblemente con agitacion.
El pH inicial de los medios de seleccion toxico y no toxico son identicos.
El pH de los medios de seleccion toxico y no toxico es tal que no inhibe el metabolismo de la cepa de levadura.
Por ejemplo, el pH de los medios de seleccion toxico y no toxico es superior a 3,5 a lo largo de la duracion de la fermentacion.
En un modo de realizacion conveniente del procedimiento de seleccion, la etapa de fermentacion se lleva a cabo a pH constante.
La siembra del medio de seleccion es identica en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico.
Preferiblemente, la siembra es baja, con el fin de no favorecer cepas de levadura sobre el medio de seleccion toxico, debido a la siembra.
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La siembra esta comprendida, por ejemplo, entre 0,100 g y 0,200 g de celulas de la cepa de levadura (en equivalente de materia seca) por kg de medio.
La fermentacion de la cepa de levadura se lleva a cabo generalmente a una temperatura comprendida entre 28°C y 37°C, preferiblemente entre 30°C y 33°C.
Preferiblemente, la fermentacion de la cepa de levadura se lleva a cabo a una temperatura de 32°C.
Preferiblemente, el medio de seleccion toxico y el medio de seleccion no toxico no contiene pentosas, sustrato lignocelulosico, hidrolizado o mosto de cereales, compuestos aromaticos bencenicos, compuestos aromaticos furanicos y/o melaza.
Preferiblemente, la presencia de al menos un acido organico no ionizado a una concentracion total toxica es el unico factor de estres en el medio de seleccion toxico utilizado. En particular, los medios de seleccion toxico y no toxico no presentan estres ligado a la presencia de sales, estres ligado a la presencia de otras moleculas organicas inhibidoras y/o estres ligado a la presion osmotica.
La cantidad de alcohol producido se mide por cualquier medio apropiado conocido por el experto en la tecnica.
Se puede tratar de una medida directa del alcohol producido o de una medida indirecta a traves de un parametro correlacionado con la produccion de alcohol.
Por ejemplo, la produccion de alcohol se puede medir por cromatograffa, en particular por CLHP (Cromatografia en fase L^quida de Alta Resolucion), CPG (Cromatografia en Fase Gaseosa), densimetna, estuche enzimatico (por ejemplo, estuche de dosificacion del etanol de Boehringer-Mannheim R-Biopharm, Cat n° 10 176 290 035) o una dosificacion por dicromato potasico.
La produccion de alcohol se puede medir tambien de manera indirecta en una prueba de fermentacion alcoholica por medida de la perdida de masa.
El instante tmax es el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de levadura en dicho medio de seleccion no toxico.
En esta memoria se describe un procedimiento de seleccion tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por que comprende:
- una etapa de fermentacion de al menos una cepa de levadura en un medio de seleccion toxico y en un medio de seleccion no toxico,
siendo la composicion inicial del medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica y
siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico, y
- una etapa de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido en el instante tmax en el medio de seleccion toxico es superior o igual a 70%, preferiblemente superior o igual a 75%, de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en el medio de seleccion no toxico.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por que el medio de seleccion toxico y el medio de seleccion no toxico son medios sinteticos.
Un medio sintetico es un medio cuya composicion qmmica exacta se conoce.
Un medio sintetico comprende una fuente de carbono unica, una fuente de nitrogeno, una fuente de fosforo, asf como las vitaminas y minerales esenciales para el crecimiento de una cepa de levadura.
La fuente de carbono del medio sintetico es un azucar fermentable, preferiblemente un azucar suministrado en forma de glucosa o sacarosa.
Las fuentes de nitrogeno y de fosforo son, por ejemplo, proporcionadas por DAP (fosfato di-amonico o (NH4)2HPO4).
El medio sintetico puede estar tamponado a un pH dado, preferiblemente a un pH superior a 3,5. Por ejemplo, el medio sintetico puede comprender acido cftrico como tampon. Como excepcion a la definicion de un medio sintetico, el medio sintetico puede comprender un extracto de levadura.
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Medios sinteticos apropiados para la utilizacion del procedimiento de seleccion seleccion toxico y no toxico, en azucares limitantes, descritos en el ejemplo 1.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido que el acido organico no ionizado se selecciona entre acido acetico, acido lactico, una mezcla de estos.
Preferiblemente, un procedimiento de seleccion tal como se ha definido anteriormente se caracteriza por que el acido organico no ionizado es acido acetico.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento de seleccion que comprende tambien una etapa de seleccion de las cepas de levadura sobre la base de su cinetica de produccion de alcohol en el medio de seleccion toxico con relacion a la cinetica de produccion de alcohol de una cepa de levadura de referencia en este mismo medio de seleccion toxico.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por que comprende una etapa adicional de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico es superior a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado.
El instante tmax ref es el instante tmax de la cepa de referencia I-4071, es decir, el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por la cepa de referencia I-4071 en el medio de seleccion no toxico.
El medio de seleccion toxico y el medio de seleccion no toxico son tales como se han definido anteriormente, en particular los medios de seleccion toxico y no toxico estan en la condicion de azucares limitantes.
La cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico por la cepa de levadura seleccionada se incrementa preferiblemente en al menos 15%, preferiblemente al menos 20%, mas preferiblemente al menos 25% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I- 4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento de seleccion que comprende una etapa adicional de seleccion de las cepas de levadura sobre la base de su cantidad maxima de alcohol producido en un medio de seleccion no toxico en azucares no limitantes con relacion a la cantidad maxima de alcohol producido por una cepa de levadura de referencia en el mismo medio de seleccion no toxico.
Con el fin de comparar las cepas de levadura sobre la base de su cantidad maxima de alcohol producido, el azucar no es entonces el factor limitante de la fermentacion. En este caso, es la concentracion de alcohol en el medio de seleccion no toxico la que se convierte en el factor limitante de la fermentacion.
Cuando mayor es la cantidad de alcohol producido al final de la fermentacion, mas tolerante al alcohol es la cepa de levadura.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por que comprende una etapa adicional de seleccion, en un medio de seleccion no toxico en el que el azucar no es el factor limitante de la fermentacion, de al menos una cepa de levadura cuya cantidad maxima de alcohol producido es superior o igual a 90% de la de la cepa numero I-4071, preferiblemente superior o igual a 92% de la de la cepa numero I-407 en el mismo medio de seleccion no toxico mencionado. El procedimiento comprende de manera conveniente las tres etapas de seleccion tales como se han definido anteriormente.
Un ejemplo de procedimiento de seleccion segun la invencion se detalla en el ejemplo 1.
De manera sorprendente e inesperada, el procedimiento de seleccion de cepas resistentes segun la invencion ha permitido obtener cepas de levadura resistentes a un medio toxico que presentan a la vez una cinetica de produccion de alcohol mejorada en un medio toxico, y una elevada cantidad maxima de alcohol producido en un medio no toxico en azucares no limitantes.
Ahora bien, las cepas de levadura presentan generalmente ya sea una buena cinetica de produccion de alcohol en un medio toxico, o una elevada cantidad maxima de alcohol producido en un medio no toxico en azucares no limitantes, siendo mejorado uno de estos dos parametros en detrimento del otro.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por que comprende una etapa previa de obtencion de cepas de levadura por cruce y/o mutagenesis.
El cruce de cepas de levadura se realiza segun las tecnicas clasicas, como las que se ensenan en el capftulo 7 “Esporulacion e Hibridacion de Levadura” por RR. Fowell, del libro de referencia “Las Levaduras”, volumen 1, editado por A.H. Rose y J.S. Harrison, 1969-Academic Press.
Una tecnica convencional de cruce comprende:
son por ejemplo los medios de
anteriormente, caracterizado por acido formico, acido levulmico o
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- una etapa de esporulacion de levaduras para obtener segregantes,
- una etapa opcional de seleccion de segregantes procedentes de al menos uno de los dos padres sobre la base de la cantidad maxima de alcohol producido, y
- una etapa de cruce de segregantes, para obtener hforidos.
Los hforidos constituyen nuevas cepas de levadura utilizadas para seleccionar cepas de levadura resistentes a un medio toxico.
Por el termino “mutagenesis” se indica a la vez la mutagenesis convencional obtenida por radiacion o por agentes qmmicos mutagenicos y la mutagenesis por insercion mediante transposicion o por integracion de un fragmento de ADN exogeno.
La mutagenesis por radiacion implica la utilizacion de radiacion UV, X, o gamma. Los agentes qmmicos mutagenicos son por ejemplo el EMS (metilsulfonato de etilo), EES (etilsulfonato de etilo), nitrosoguanidina, acido nitroso, aflatoxina B1, hidroxilamina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina, proflavina, naranja de acridina. En un modo de realizacion conveniente, la etapa de obtencion de cepas de levadura comprende una etapa de mutagenesis convencional, opcionalmente seguida por un enriquecimiento, por ejemplo en un medio toxico.
La resistencia de las cepas de levadura I-4264 e I-4265 segun la invencion se ha verificado en un medio sintetico toxico que presenta una toxicidad mas alta ligada al acido acetico (5 g/kg a pH 4,5) y que presenta ademas una toxicidad ligada al alcohol, ya que el azucar no es el factor limitante de la fermentacion.
El azucar se suministra entonces preferiblemente en forma de dextrina para evitar un estres osmotico ligado al azucar.
Las cepas de levadura I-4264 e I-4265 han mostrado una ventaja cinetica sobre la cepa de levadura de referencia I- 4071 en este medio sintetico toxico (ver ejemplo 1 y 10 figura 4).
De manera sorprendente e inesperada, el procedimiento de seleccion segun la invencion permite obtener cepas de levadura cuya cinetica de produccion de alcohol es mas rapida que la de la cepa de referencia numero I-4071 en un medio de aplicacion industrial toxico que comprende varios factores de estres, entre ellos al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica.
Asf, las cepas de levadura I-4264 e I-4265 segun la invencion tienen una cinetica de produccion de alcohol mas rapida que la de la cepa de levadura de referencia I-4071 en medios de fermentacion toxicos que contienen vinaza (ver el ejemplo 2 y las figuras 5 y 6) y en medios de fermentacion toxicos que contienen melazas poco diluidas (ver el ejemplo 2 y las figuras 7 y 8).
Las cepas de levadura I-4264 e I-4265 presentan por tanto una verdadera ventaja industrial en el uso de fermentaciones alcoholicas en medios toxicos. En efecto, la cinetica de produccion de alcohol mas rapida permite obtener una productividad en volumen por hora mas importante de las cubas de fermentacion.
Ademas, otra ventaja de las cepas de levadura segun la invencion reside en la reduccion de la duracion de la fase de latencia durante una fermentacion en un medio toxico, lo que limita la contaminacion del medio por otros microorganismos.
Un medio de fermentacion toxico es, por ejemplo, un medio que contiene 9% a 11% de no azucares (con relacion a la materia seca total del medio), siendo los no azucares proporcionados por ejemplo por la vinaza y/o melaza.
Por “vinaza” se indica las aguas residuales de la destilacion de los lfquidos alcoholicos.
Los “no azucares” comprenden sales minerales, moleculas organicas no consumidas durante una fermentacion y moleculas organicas producidas durante una fermentacion.
Tambien se describe en esta memoria una cepa de levadura susceptible de obtenerse por el procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
La cepa de levadura obtenida o susceptible de obtenerse por el procedimiento tal como se ha definido anteriormente es preferiblemente una cepa de levadura no modificada geneticamente.
Tambien se describen en esta memoria todas las cepas derivadas de las cepas de levadura resistentes a un medio toxico segun la invencion y que comparten las mismas propiedades.
Una cepa de levadura resistente a un medio toxico segun la invencion es mas concretamente una cepa destinada a la produccion de levaduras utilizadas en destilena y/o en vinificacion y/o en cervecena y/o para la produccion de bebidas fermentadas y/o para la produccion de alcohol industrial destinado por ejemplo a los biocombustibles o a las industrias qmmicas.
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Una cepa de levadura resistente a un medio toxico segun la invencion es preferiblemente una cepa de Saccharomyces, en particular una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
Por tanto la presente invencion tiene por objetivo una cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada entre la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4264 y la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4265.
La cepa de levadura I-4264 se ha obtenido mediante cruce de cepas de levadura.
La cepa de levadura I-4264 produce une cantidad de alcohol en el instante tmax en un medio de seleccion toxico superior o igual a 90% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en un medio de seleccion no toxico, siendo la composicion inicial de dicho medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica y siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4264 produce una cantidad de alcohol en el instante tmaxref en dicho medio de seleccion toxico que se incrementa en al menos 50% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4264 produce una cantidad maxima de alcohol, en un medio de seleccion no toxico en azucares no limitantes, superior o igual a 92% de la de la cepa numero I-4071 en el mismo medio de seleccion no toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4265 se ha obtenido por cruce de cepas de levadura.
La cepa de levadura I-4265 produce una cantidad de alcohol en el instante tmax, en un medio de seleccion toxico, superior o igual a 75% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en un medio de seleccion no toxico, siendo la composicion inicial de dicho medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica y siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y el medio de seleccion no toxico (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4265 produce una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico que se incrementa en al menos 25% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4265 produce una cantidad maxima de alcohol, en un medio de seleccion no toxico en azucares no limitantes, superior o igual a 92% de la de la cepa numero I-4071 en el mismo medio de seleccion no toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
Por tanto la presente invencion tiene por objetivo las dos cepas descritas anteriormente.
Tambien se describe en esta memoria una cepa de levadura derivada de una cepa tal como se ha definido anteriormente, caracterizada por que la cantidad de alcohol producido por dicha cepa derivada en el instante tmax en un medio de seleccion toxico es superior o igual a 65% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en un medio de seleccion no toxico, siendo la composicion inicial del medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con la adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica, y siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y el medio de seleccion no toxico.
Una cepa de Saccharomyces cerevisiae derivada tal como se ha definido anteriormente, se caracteriza por que su cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico es superior a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado.
Una cepa de Saccharomyces cerevisiae derivada tal como se ha definido anteriormente, se caracteriza por que en un medio de seleccion no toxico en el que el azucar no es el factor limitante de la fermentacion, su cantidad maxima de alcohol producido es superior o igual a 90% de la de la cepa numero I-4071 en el mismo medio de seleccion no toxico mencionado.
Por la expresion “cepa derivada” se indica una cepa derivada por cualquier transformacion, sea cual fuere, como por ejemplo uno o varios cruces y/o una o varias mutaciones y/o una o varias transformaciones geneticas.
Una cepa derivada por cruce se puede obtener por cruce de una cepa segun la invencion con la misma cepa, u otra cepa segun la invencion, u otra cepa cualquiera.
Una cepa derivada por mutacion puede ser una cepa que ha sufrido al menos una mutacion espontanea en su genoma o al menos una mutacion inducida, por ejemplo por mutagenesis. La o las mutaciones de la cepa derivada son silenciosas o no.
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Una cepa derivada por transformacion genetica es una cepa en la que se ha introducido un ADN exogeno.
Dicho ADN exogeno puede proporcionarse mediante un plasmido.
Dicho ADN exogeno esta preferiblemente integrado en el genoma de la levadura.
Una cepa derivada puede ser tambien un clon aislado a partir de un cultivo de una cepa de levadura segun la invencion.
Por tanto la presente invencion tiene por objetivo las cepas de Saccharomyces cerevisiae depositadas el 8 de diciembre de 2010 en virtud del tratado de Budapest en la CNCM (Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia) con los numeros I- 4411 e I-4412.
La cepa de levadura I-4411 se ha obtenido por aislamiento de un clon a partir de un cultivo de la cepa I-4264.
La cepa de levadura I-4411 produce una cantidad de alcohol, en el instante tmax en un medio de seleccion toxico,
superior o igual a 95% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por la cepa en un medio de seleccion
no toxico, siendo la composicion inicial de dicho medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica y siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico (ver el ejemplo 1).
Sorprendentemente, la cinetica de produccion de alcohol de la cepa de levadura I-4411 no se altera en un medio de seleccion toxico con respecto al medio de seleccion no toxico.
La cepa de levadura I-4411 produce una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico que se incrementa en al menos 12% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4411 produce una cantidad de alcohol, en un medio de seleccion no toxico en azucares no
limitantes, superior o igual a 95% de la de la cepa numero I-4071 en el mismo medio de seleccion no toxico
mencionado (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4412 se ha obtenido por aislamiento de un clon a partir de un cultivo de la cepa I-4264.
La cepa de levadura I-4412 produce una cantidad de alcohol, en el instante tmax en un medio de seleccion toxico, superior o igual a 72% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en un medio de seleccion no toxico, siendo la composicion inicial de dicho medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado en una concentracion toxica y siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4412 produce una cantidad de alcohol, en el instante tmax ref en dicho medio de seleccion toxico, superior o igual a 90% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
La cepa de levadura I-4412 produce una cantidad maxima de alcohol, en un medio de seleccion no toxico en azucares no limitantes, superior o igual a 95% de la de la cepa numero I-4071 en el mismo medio de seleccion no toxico mencionado (ver el ejemplo 1).
Ademas, las cepas de levadura I-4411 e I-4412 tienen una cinetica de produccion de alcohol mas rapida que la de la cepa de levadura de referencia I-4071 en medios de fermentacion toxicos que contienen vinaza (ver el ejemplo 2 y la figura 9).
Las cepas de levadura I-4411 e I-4412 presentan por tanto una verdadera ventaja industrial en la utilizacion de fermentaciones alcoholicas en medios toxicos.
Tambien se describe en esta memoria un procedimiento de transformacion de una cepa de levadura resistente a un medio toxico, para obtener una cepa derivada tal como se ha definido anteriormente, comprendiendo dicho procedimiento de transformacion una etapa de transformacion de dicha cepa por al menos un cruce y/o al menos una mutacion y/o al menos una transformacion genetica.
La presente invencion tiene por objetivo particularmente una levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente.
Las levaduras segun la invencion son particularmente interesantes en las aplicaciones siguientes:
- alcohol llamado “de boca”, destinado a la fabricacion de bebidas alcoholicas, y/o
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- alcohol industrial, destinado por ejemplo a los biocombustibles o a las industrias qmmicas.
Las levaduras se producen a partir de cepas de levadura resistentes a un medio toxico segun la invencion, en particular como se describe en el libro de referencia “Tecnologfa de las Levaduras”, 2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
La multiplicacion de las levaduras, a escala industrial, comprende en general al menos las dos primeras etapas del conjunto de las etapas siguientes:
- multiplicacion de una cepa de levadura en varios estadios, primero en semianaerobiosis, despues en aerobiosis,
- separacion por centrifugacion de la levadura asf producida de su medio de cultivo, para obtener una crema de levadura lfquida que contiene aproximadamente entre 12 y 25% de materia seca, incluso una cantidad mas elevada de materia seca si la crema de levadura se mezcla con productos osmolitos,
- filtracion de la crema de levadura lfquida asf obtenida, en general sobre un filtro rotatorio a vacfo, para obtener una levadura fresca deshidratada que contiene de 26% a 35% de materia seca,
- mezclar dicha levadura fresca deshidratada para obtener una masa homogenea,
- extrusion de la levadura asf obtenida, para obtener
• una levadura prensada en forma de panes de levadura fresca o de levadura fresca desmenuzada, que contiene aproximadamente 30% de materia seca, o
• una levadura en forma de partfculas, en general de granulos, si la levadura se va a secar,
- eventualmente, secado de manera cuidadosa en una corriente de aire caliente, por ejemplo por fluidizacion, de las partfculas de levaduras obtenidas por extrusion para obtener levadura seca.
La etapa de secado es preferiblemente un secado rapido controlado en presencia de un emulsionante.
Entre los emulsionantes que se pueden utilizar durante la etapa de secado se puede seleccionar monoestearato de sorbitan, utilizado por ejemplo a una concentracion de aproximadamente 1,0% (en peso respecto al peso de levadura seca).
Las levaduras segun la invencion son levaduras resistentes a un medio toxico.
Las levaduras segun la invencion se pueden utilizar en cualquier forma posible.
Por ejemplo, una levadura tal como se ha definido anteriormente se puede caracterizar por que esta en forma de crema de levadura, levadura prensada, levadura seca o levadura congelada.
La presente invencion tiene tambien por objetivo la utilizacion de una levadura tal como se ha definido anteriormente para la produccion de alcohol.
La produccion de alcohol se obtiene por fermentacion alcoholica.
Las condiciones de fermentacion alcoholica dependen del tipo de aplicacion buscado, por ejemplo segun se trate de una fermentacion de tipo cervecena, vinificacion o destilena.
El experto en la tecnica sabe como determinar las condiciones apropiadas para una fermentacion alcoholica.
El medio de fermentacion alcoholica comprende los elementos siguientes: al menos una fuente de carbono fermentable, al menos una fuente de nitrogeno, al menos una fuente de azufre, al menos una fuente de fosforo, al menos una fuente de vitaminas y/o al menos una fuente de minerales.
La fuente de carbono se suministra, por ejemplo, en forma de un azucar inmediatamente asimilable por la levadura, glicerol, etanol y/o una mezcla de estos.
La fuente de carbono es preferiblemente un azucar inmediatamente asimilable por la levadura, por ejemplo un azucar simple de tipo glucosa o fructosa, o un disacarido de tipo sacarosa y/o una mezcla de estos azucares.
El azucar se puede suministrar en forma de jarabes de glucosa y/o jarabes de fructosa y/o hidrolizados de almidon y/o en forma de melazas y/o en forma de EP2 (Egout Pauvre derivado de la 2a cristalizacidn del azucar) y/o en forma de una sustancia capaz de dar azucares asimilables por la cepa de levadura y/o en forma de una mezcla de estos.
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La fuente de nitrogeno se suministra, por ejemplo, en forma de sulfato amonico, hidroxido amonico, fosfato diamonico, amomaco, urea y/o una combinacion de estos. La fuente de azufre se suministra, por ejemplo, en forma de sulfato amonico, sulfato magnesico, acido sulfurico y/o una combinacion de estos.
La fuente de fosforo se suministra, por ejemplo, en forma de acido fosforico, fosfato potasico, fosfato diamonico, fosfato monoamonico, y/o una combinacion de estos.
La fuente de vitaminas se suministra, por ejemplo, en forma de melaza, hidrolizado de levadura, disolucion de vitamina pura o de una mezcla de vitaminas puras y/o una combinacion de estos.
La fuente de vitaminas proporciona a la levadura todas las vitaminas en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en los libros de referencia. Se pueden asociar varias fuentes de vitaminas.
La fuente de minerales se suministra, por ejemplo, en forma de melaza, una mezcla de sales minerales y/o su combinacion.
La fuente de minerales proporciona a la levadura todos los macroelementos y oligoelementos en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en los trabajos de referencia. Se pueden asociar varias fuentes de minerales. Una misma sustancia puede proporcionar varios elementos diferentes.
A modo de ejemplo, se puede hacer referencia a las condiciones de fermentacion alcoholica descritas en el libro de referencia “Tecnologfa de las Levaduras”, 2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. 10 Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
En particular se describe en esta memoria la utilizacion de una levadura tal como se ha definido anteriormente para la produccion de alcohol en un medio de fermentacion toxico.
Un procedimiento de produccion de alcohol tal como se describe en esta memoria comprende generalmente una etapa de fermentacion de al menos una levadura tal como se ha definido anteriormente, en un medio de fermentacion.
El medio de fermentacion es tal como se ha definido anteriormente.
El procedimiento de produccion de alcohol tal como se ha definido anteriormente, se caracteriza por que dicho medio de fermentacion es un medio de fermentacion toxico.
En particular, el procedimiento de produccion de alcohol tal como se ha definido anteriormente se caracteriza por que dicho medio de fermentacion toxico comprende un agua reciclada y/o melaza.
Un agua reciclada es por ejemplo la vinaza, un agua de remojo de granos, flegmasa, un agua de condensacion de los gases de fermentacion, o un agua resultante de la concentracion de vinaza.
El porcentaje de agua reciclada, vinaza y/o melaza en el medio de fermentacion toxico depende de las condiciones de fermentacion.
El medio de fermentacion comprende por ejemplo de 20% a 40% de vinaza.
El procedimiento de produccion de tal alcohol comprende generalmente une etapa de reciclaje parcial o total del medio de fermentacion.
El reciclaje del medio de fermentacion puede realizarse de forma continua o en diferentes intervalos de tiempo durante la fermentacion.
Durante un procedimiento de produccion de alcohol de forma continua con cascada de fermentadores, el reciclaje del medio de fermentacion se puede realizar en la o las primeras cubas de fermentacion.
La presente invencion se ilustrara a continuacion por medio de los siguientes ejemplos que se dan a modo de ilustracion y que no son en modo alguno limitativos. Los ejemplos describen en particular un procedimiento de seleccion de cepas de levadura segun la invencion, resistentes a un medio toxico, y sus caractensticas.
Ejemplo 1: Seleccion de cepas de levadura resistentes a un medio toxico
Materiales y metodos
1. Medios
Glucosa Extracto de levadura Agar Agua
Medio YEG 20 g 5 g 30 g cantidad suficiente para 1 l
Medio de seleccion toxico
Medio de seleccion no toxico
(azucares limitantes)
(azucares limitantes)
Glucosa
150 g Glucosa 150 g
Extracto de levadura
5 g Extracto de levadura 5 g
(NH4)2 HPO4
4,70 (NH4)2 HPO4 4,70
Acido acetico
2,52 g Acido cftrico 11,40 g
Acetato sodico
2,08 g Citrato sodico 13,50 g
Acido cftrico
11,40 g Vitaminas
Citrato sodico
13,50 g Sales minerales
Vitaminas
Agua cantidad suficiente para 1 kg
Sales minerales
pH 4,5 pH 4,5
Agua
cantidad suficiente para 1 kg
pH 4,5
Medio de aplicacion sintetico toxico
Medio de seleccion no toxico
(azucares no limitantes)
(azucares no limitantes)
Dextrina
307,3 g Glucosa 300 g
Extracto de levadura
5 g Extracto de levadura 5 g
KH2PO4
1 g KH2PO4 1 g
Urea
2,5 g Urea 2,5 g
Acido cftrico
0,36 g Acido cftrico 0,36 g
Citrato
0,53 g Citrato 0,53 g
Acido acetico
5 g Acido acetico 2,50 g
Vitaminas
Vitaminas
Sales minerales
Sales minerales
Agua
cantidad suficiente para 1 kg Agua cantidad suficiente para 1 kg
pH 4,5
pH 5,5
+ amiloglucosidasa anadida extemporaneamente
Medio de precultivo
Medio de esporulacion
Sacarosa
100 g Acetato sodico 6,5 g
Extracto de levadura
20 g Agar 15 g
Sales minerales
Agua cantidad suficiente para 1 L
Agua
cantidad suficiente para 1 l pH 6,5
Todos los medios utilizados estan esterilizados.
2. Cruce para la obtencion de hforidos
Las cepas de levadura se ponen a esporular en el medio de esporulacion durante 3 a 5 dfas a 30°C. Las celulas de 5 levadura se recuperan en agua esteril. A continuacion se digieren por una 13-glucanasa preparada extemporaneamente a 20 mg/ml, durante 30 min, a 30°C y con agitacion.
Las celulas de levadura se extienden a continuacion sobre un agar de medio YEG. Las esporas se disecan a continuacion mediante un micromanipulador. Las esporas se cultivan a 30°C durante 2 horas.
Las esporas de las cepas parentales se mezclan sobre un agar de medio YEG. La hibridacion se realiza durante 3 a 10 5 dfas a 30°C. Las mezclas se extienden a continuacion sobre un agar de medio YEG. Despues de 48 h de
incubacion a 30°C, aparecen colonias y se realizan PCR sobre estas colonias para identificar los hforidos (Huxley et al., 1990).
3. Fermentacion
Las celulas de levadura se precultivan en 10 ml de medio de precultivo ajustado a pH 4,7 durante 24 h a 30°C.
15 Se inoculan 2 ml de este precultivo en 200 ml de medio de precultivo durante 20 h a 26°C con agitacion.
A continuacion las celulas de levadura se recuperan por centrifugacion durante 5 min a 4500 rpm y a 4°C. Las celulas de levadura se lavan con agua fna y se centrifugan de nuevo en las mismas condiciones. Las celulas de levadura se recuperan en 40 ml de agua fna. Se mide la materia seca obtenida.
5
10
15
20
25
30
35
40
La fermentacion se realiza a 32°C, en ausencia de aireacion, con agitacion (95 rpm).
El medio de fermentacion (medio de seleccion toxico o medio de seleccion no toxico) se siembra con 0,125 g de levaduras (en equivalente de materia seca) por kg de medio.
4. Medida de la cantidad de alcohol producido - Metodo directo
La cantidad de etanol se determina por cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) 15 (Shimadzu®) utilizando una columna Aminex HPX 87H (Biorad®), resina intercambiadora de protones, elmda por una disolucion de acido sulfurico 5 mM.
5. Evaluacion de la cantidad de alcohol producido - Metodo indirecto
Al estar la cantidad de alcohol producido correlacionada con la perdida de masa del medio de fermentacion, la cantidad de alcohol producido se evalua por la perdida de masa del medio de fermentacion. Tras el calculo, se obtiene la cantidad de alcohol producido (en g/kg de medio inicial).
Resultados
1. Cruce
Varias cepas de levadura de la coleccion de cultivo del Solicitante se utilizan como cepas parentales para los cruces.
2. Preseleccion de los hforidos sobre la cantidad maxima de alcohol producido en un medio de seleccion no toxico
Entre los hfbridos obtenidos en la etapa de cruce, se prueban despues 59 hfbridos sobre la base de la concentracion maxima de alcohol producido en un medio de seleccion no toxico, en condiciones de azucar no limitante.
La figura 1 muestra la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico (en g/kg) al final de la fermentacion para los 13 hfbridos mejores.
La cantidad final de alcohol producido por los hfbridos se compara con la de la cepa de referencia I-4071 (denominada T en la figura 1).
Se preseleccionan los hfbridos cuya cantidad maxima de alcohol producido es superior o igual a 92% de la de la cepa de referencia I-4071. Se trata de los hfbridos 1, 2, 4, 8 y 11.
3. Seleccion de los hfbridos basada en su cinetica de produccion de alcohol en un medio de seleccion toxico con relacion a un medio de seleccion no toxico
Los hfbridos 1, 2, 4 y 8 se prueban a continuacion sobre la base de su cinetica de produccion de alcohol en el medio de seleccion toxico con relacion al medio de seleccion no toxico. Los resultados se presentan en la figura 2 para los hfbridos 1, 2, 8 y 11.
Al presentar el hfbrido 4 un problema de crecimiento en el medio de seleccion toxico, no se representa en la figura 2.
En su instante tmax, el hfbrido 1 produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion toxico que es superior o igual a 90% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico.
En su instante tmax, el hfbrido 2 produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion toxico que es superior o igual a 75% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico.
En su instante tmax, el hfbrido 8 produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion toxico que es superior o igual a 70% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico.
En su instante tmax, el hfbrido 11 produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion toxico que es superior o igual a 65% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico.
Por comparacion, en su instante tmax, la cepa de levadura de referencia I-4071 produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion igual a 60% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico.
Los hfbridos 1, 2, 8 y 11 se seleccionan durante esta etapa.
4. Seleccion de los hfbridos basada en su cinetica de produccion de alcohol en un medio de seleccion toxico con relacion a la cepa de referencia I-4071
Los hfbridos 1,2, 8 y 11 se prueban despues en fermentacion en el medio de seleccion toxico con relacion a la cepa de levadura de referencia I-4071.
5
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40
La figura 3 muestra que la cinetica de produccion de alcohol de los hforidos 1, 2 y 8 es mas rapida que la de la cepa I-4071.
La cinetica de produccion de alcohol del hforido 11 es proxima a la de la cepa de referencia I-4071.
Ademas, el hforido 1 produce una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en el medio de seleccion toxico que se incrementa en el menos 50% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en este medio de seleccion toxico.
Con respecto al hforido 2, este produce una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en el medio de seleccion toxico que se incrementa en al menos 25% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en este medio de seleccion toxico.
En lo que respecta al hforido 8, este produce una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en el medio de seleccion toxico que se incrementa en al menos 20% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en este medio de seleccion toxico.
La resistencia de los hfbridos 1, 2, 8 y 11 se prueba entonces en el medio de aplicacion sintetico toxico que presenta una toxicidad mas alta ligada al acido acetico (5 g/kg a pH 4,5) y que presenta ademas una toxicidad ligada al alcohol, ya que el azucar se anade en cantidad no limitante de la fermentacion.
El azucar se proporciona en forma en forma de dextrinas para evitar un estres osmotico ligado al azucar.
Como se indica en la figura 4, solo las cepas de levadura I-4264 e I-4265 han mostrado una ventaja cinetica con respecto a la cepa de levadura de referencia I-4071 en este medio de aplicacion sintetico toxico.
En conclusion, los hfbridos 1 y 2 tienen una ventaja cinetica sobre la cepa de referencia I-4071 durante la produccion de alcohol en el medio de seleccion sintetico toxico. Los hfbridos 1 y 2 corresponden respectivamente a la cepa de levadura I-4264 e I-4265 segun la invencion.
5. Aislamiento de clones a partir de un cultivo de la cepa de levadura I-4264 Se realiza un cultivo de la cepa de levadura I-4264 en el medio YEG.
Despues se lleva a cabo una extension sobre el plato de cultivo. Se seleccionan varios clones y se evalua su cinetica de produccion de alcohol, asf como la cantidad maxima de alcohol producida en el medio de seleccion no toxico en azucares no limitantes.
Los resultados obtenidos concernientes a los clones A y C se indican en la tabla 1
Tabla 1
Clon
Cantidad de alcohol producido en el instante tmax en el medio toxico/medio no toxico (azucares limitantes) Cantidad de alcohol producido con relacion a la cepa I-407 en el instante tmax ref en el medio toxico (azucares imitantes) Cantidad maxima de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico con relacion a la cepa I-4071 (azucares no limitantes)
Clon A
99% + 15% 98,6%
Clon C
76% -10% 98,7%
Los clones A y C tienen una cantidad maxima de alcohol producido superior o igual al 95% de la de la cepa de referencia I-4071 en un medio de seleccion no toxico, en condiciones de azucares no limitantes.
En su instante tmax, el clon A produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion toxico que es superior o igual a 95% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico (en azucares limitantes).
En su instante tmax, el clon C produce una cantidad de alcohol en el medio de seleccion toxico que es superior o igual a 72% de la cantidad de alcohol producido en el medio de seleccion no toxico (en azucares limitantes).
Los clones se evaluan despues en fermentacion en el medio de seleccion toxico (en azucares limitantes) con relacion a la cepa de levadura de referencia I-4071.
La cinetica de produccion de alcohol del clon A es mas rapida que la de la cepa I-4071. El clon A produce asf una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en el medio de seleccion toxico que se incrementa en al menos 12% con relacion a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en este medio de seleccion toxico. El clon A presenta una verdadera ventaja cinetica sobre la cepa de referencia I-4071 durante la produccion de alcohol en el medio de seleccion sintetico toxico.
5
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20
25
La cinetica de produccion de alcohol del clon C es ligeramente menor con respecto a la de la cepa de referencia I- 4071.
El clon C produce una cantidad de alcohol en el instante tmax ref en el medio de seleccion toxico superior o igual a 90% de la cantidad de alcohol producida en el instante tmax ref por la cepa de levadura numero I-4071 en este medio de seleccion toxico.
Los clones A y C corresponden respectivamente a las cepas de levadura I-4411 e I-4412.
Ejemplo 2: Utilizacion de las cepas de levadura segun la invencion en medio de aplicacion toxico Material y metodos 1. Medios
Medio A Medio B
- EP2 de remolacha
416,2 g - EP2 de remolacha 373,1 g
- vinaza
118,1 g - vinaza 572,9 g
- urea
1,6 g - urea 1,6 g
- MgSO4 7H2O al
0,1 g - MgSO4 7H2O al 9,5% 0,1 g
9,5%
0,5 g - H3PO4 al 75% 0,5 g
- H3PO4 al 75%
cantidad suficiente para 1 kg - Bifluoruro amonico 1,4 g
- agua
al 3,5%
- pH inicial 5
- agua - pH inicial 5 cantidad suficiente para 1 kg
Medio C Medio D
- Melaza de remolacha 394,7 g
- Melaza de cana 315,2 g
- (NH4)2 HPO4
4,7 g - glucosa 68,4 g
- vitaminas
- (NH4)2 HPO4 4,7 g
- agua
cantidad suficiente para 1 kg - vitaminas
- pH inicial 5,3
- agua - pH inicial 5,3 cantidad suficiente para 1 kg
Medio E
- EP2 de remolacha
353,1 g
- vinaza
413,2 g
- urea
0,39 g
- (NH4)2 HPO4
0,13 g
- magnesio y zinc - agua de proceso* - pH inicial 5
233,6 g
*mezcla que comprende agua procedente de los ciclos de limpieza, de los condensados de fermentacion y de
destilacion.
El medio A contiene 9% de no azucares (con relacion a la materia seca total del medio), siendo los no azucares en su mayor parte proporcionados por la vinaza.
El medio B contiene 9% de no azucares (con relacion a la materia seca total del medio), siendo los no azucares en su mayor parte proporcionados por la vinaza.
El medio C contiene 10,8% de no azucares (con relacion a la materia seca total del medio), siendo los no azucares proporcionados por la melaza (EP3) de remolacha que se diluye debilmente.
El medio D contiene 10,8% de no azucares (con relacion a la materia seca total del medio), siendo los no azucares proporcionados por la melaza (EP3) de cana que se diluye debilmente.
El medio E contiene 11% de no azucares (con relacion a la materia seca total del medio), siendo los no azucares en su mayor parte proporcionados por la vinaza.
2. Fermentacion y medida del alcohol
Las condiciones de fermentacion son las mismas que en el ejemplo 1, excepto que el medio de fermentacion contiene azucar en cantidad no limitante.
La cantidad de alcohol producido se mide por perdida de peso, como se detalla en el ejemplo 1.
Resultados
5
10
15
20
25
Los hforidos 1 y 2 seleccionados y que corresponden respectivamente a las cepas de levadura I-4264 e I-4265 se prueban despues en medios de aplicacion toxicos.
Los medios de aplicacion toxicos probados son los siguientes:
- los medios A y B que contienen una cantidad importante de vinaza, y
- los medios C y D que contienen melaza debilmente diluida, de remolacha y de cana respectivamente.
Los clones A y C correspondientes respectivamente a las cepas de levadura I-4411 e I-4412 se prueban en el medio de aplicacion toxico E.
Las figuras 5 a 8 muestran la cinetica de produccion de alcohol de las cepas de levadura I-4264 e I-4265 segun la invencion y de la cepa de referencia I-4071, en los medios A, B, C y D, respectivamente.
La figura 9 muestra la cinetica de produccion de alcohol de las cepas de levadura I-4411 e I-4412 y de la cepa de referencia I-4071 en el medio de aplicacion toxico E.
Como se indica en la figura 5, la cinetica de produccion de alcohol de las cepas de levadura I-4264 e I-4265 segun la invencion es mas rapida que la de la cepa de referencia I-4071 despues de 20 h de fermentacion. La diferencia entre la cantidad de alcohol producido por los hforidos y la cantidad de alcohol producido por la cepa de referencia se acentua a partir de 20 h hasta el final de la fermentacion.
Como se indica en la figura 6, la cinetica de produccion de alcohol de las cepas de levadura I-4264 e I-4265 es mas rapida que la de la cepa de referencia I-4071, despues de 20 h de fermentacion y despues de 30 horas de fermentacion respectivamente. La fase de latencia de la cepa l-4264 es muy corta en comparacion con las otras 2 cepas. La diferencia entre la cantidad de alcohol producido por los hfbridos y la cantidad de alcohol producido por la cepa de referencia aumenta a partir de 20 h y 30 h respectivamente hasta el final de la fermentacion.
Como se indica en las figuras 7 y 8, la cinetica de produccion de alcohol de las cepas de levadura I-4264 e I-4265 es mas rapida que la de la cepa de referencia I-4071 durante todo el tiempo de fermentacion.
Como se indica en la figura 9, la cinetica de produccion de alcohol de las cepas de levadura I-4411 e I-4412 es mas rapida que la de la cepa de referencia I-4071 durante todo el tiempo de fermentacion en el medio de aplicacion E.
En conclusion, la cepa de referencia I-4071 esta mas afectada por la toxicidad de los medios de aplicacion probados que las cepas de levadura I-4264, I-4265, I-4411 e I-4412 segun la invencion.
Las cepas de levadura I-4264, I-4265, I-4411 e I-4412 segun la invencion proporcionan una ventaja cinetica para la produccion de alcohol en medio toxico.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de seleccion de una cepa de levadura resistente a un medio toxico que comprende:
    - una etapa de preseleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad maxima de alcohol producido, en un
    medio de seleccion no toxico en condiciones de azucar no limitante, es superior o igual a 92% de la cantidad maxima de alcohol producido, en el medio de seleccion no toxico, por la cepa de referencia depositada el 4 de septiembre de 2008 en la CNCM con el numero I-4071.
    - una etapa de fermentacion, en un medio de seleccion toxico y en un medio de seleccion no toxico, de al menos
    una cepa de levadura preseleccionada,
    siendo la composicion inicial del medio de seleccion toxico la composicion inicial del medio de seleccion no toxico con adicion de al menos un acido organico no ionizado seleccionado entre acido acetico, acido lactico, acido formico, acido levulmico o una mezcla de estos, y
    siendo el azucar el factor limitante de la fermentacion en el medio de seleccion toxico y en el medio de seleccion no toxico,
    en donde la concentracion del acido organico no ionizado en el medio de seleccion toxico es una concentracion que conlleva una disminucion de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax ref por la cepa de referencia numero I-4071 de 25% a 75%, preferiblemente una disminucion de 40% a 75%, con relacion a la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de referencia numero I-4071 en el instante tmax ref en el medio de seleccion no toxico, en donde el instante tmax ref es el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de referencia numero I-4071 en el medio de seleccion no toxico,
    - una etapa de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido en el instante tmax
    en el medio de seleccion toxico es superior o igual a 65% de la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por dicha cepa en el medio de seleccion no toxico, en donde el instante tmax es el instante en el que se alcanza la cantidad maxima de alcohol producido por dicha cepa de levadura en el medio de seleccion no toxico, y
    - una etapa suplementaria de seleccion de al menos una cepa de levadura cuya cantidad de alcohol producido, en
    el instante tmax en dicho medio de seleccion toxico, es superior a la cantidad de alcohol producido en el instante tmax por la cepa de levadura de referencia I-4071 en el mismo medio de seleccion toxico mencionado.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el medio de seleccion toxico y el medio de seleccion no toxico son medios sinteticos.
  3. 3. Cepa de levadura obtenida por el procedimiento segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 y seleccionada entre la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la CNCM con el numero I-4264, la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la CNCM con el numero I-4265, la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la CNCM con el numero I-4411 y la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la CNCM con el numero I-4412.
  4. 4. Levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura segun la reivindicacion 3.
  5. 5. Utilizacion de una levadura segun la reivindicacion 4, para la produccion de alcohol.
  6. 6. Procedimiento de produccion de alcohol que comprende una etapa de fermentacion de al menos una levadura segun la reivindicacion 4 en un medio de fermentacion.
  7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, caracterizado por que dicho medio de fermentacion es un medio de fermentacion toxico.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, caracterizado por que dicho medio de fermentacion toxico comprende un agua reciclada y/o melaza.
  9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, que comprende una etapa de reciclaje parcial o total del medio de fermentacion.
    imagen1
    Figura 2
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    Figura 3
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    Figura 7
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