ES2642867T3 - Proceso de elaboración de cerveza mejorado - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de cerveza que comprende fermentar un mosto en presencia de una proteasa específica de prolina, seguido de una fase de maduración y fase de estabilización, en el que la fase de estabilización tiene una duración inferior a 5 días.
Description
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DESCRIPCION
Proceso de elaboracion de cerveza mejorado Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo de elaboracion de cerveza. En particular, se refiere a un metodo acelerado de elaboracion de cerveza que implica una proteasa espedfica de prolina.
Antecedentes de la invencion
En el proceso de elaboracion de cerveza tradicional, el mosto obtenido extrayendo malta se inocula con levadura de cerveza y se deja que avance la fermentacion durante aproximadamente 7 dfas con una temperature maxima entre 8-15 °C dependiendo de si se usa un proceso de fermentacion en fno o en caliente. Esta fermentacion tambien se conoce como fermentacion primaria. Una vez se completa la fermentacion y la mayona de los azucares fermentables han sido convertidos en alcohol, se sedimentan las levaduras. En el caso de la cerveza de fermentacion baja, las levaduras se recogen en el fondo de la fermentacion, en otras cervezas se recogen en la parte superior de la fermentacion. La cerveza "verde" resultante de esta fermentacion primaria todavfa contiene algunas levaduras no sedimentadas, ademas de niveles relativamente altos de componentes de aroma no deseables, en particular dicetonas, tales como diacetilo y acetil aldehndo.
La conversion de estos ultimos componentes de aroma no deseables en compuestos de sabor soso es un aspecto importante de la posterior fase de maduracion de la cerveza. Especialmente la reduccion de diacetilo, un compuesto con un sabor extrano mantecoso, en acetorna insfpida es un proceso que requiere tiempo, pero de suma importancia. En el proceso de cerveza convencional, esta etapa de maduracion tiene lugar durante aproximadamente una semana. En la fase posterior de la elaboracion de la cerveza, la llamada fase de estabilizacion, la cerveza es retenida para promover la formacion de agregados de protema-polifenol, seguido de la eliminacion de los agregados precipitados. Estos agregados de protema-polifenol consisten en polifenoles y protemas ricas en prolina, las denominadas protemas que activan la turbidez, de la malta. La agregacion y posterior precipitacion de estos agregados se facilita durante la fase de estabilizacion enfriando la cerveza a 0 o incluso -2 °C durante aproximadamente 7 a 10 dfas. Segun Narziss (Narziss, L. 1990 Ferment. 3, 54-62), el ultimo periodo de estabilizacion en fno es indispensable. Despues de eliminar la materia precipitada, los polifenoles y/o protemas que activan la turbidez no precipitados son normalmente eliminados para prevenir la formacion de una "turbidez en fno" en el producto envasado. Para este fin, los polifenoles residuales no precipitados pueden ser eliminados por absorcion a polivinilpolipirrolidona (PVPP) y/o las protemas que activan la turbidez restantes pueden ser eliminadas por absorcion a gel de sflice. Mas adelante, la PVPP y/o gel de sflice, que comprenden respectivamente los polifenoles y/o protemas que activan la turbidez absorbidos, pueden eliminarse junto con la eliminacion de cualquier levadura residual, por filtracion en tierra de diatomeas.
En general, el proceso de produccion de cerveza convencional anteriormente descrito dura aproximadamente 20 dfas. El producto resultante es completamente claro y estable de manera que no se producen cambios visibles durante su estabilidad en anaquel comercial.
Para aumentar la flexibilidad de la fabrica de cerveza y para ahorrar costes de capital, con los anos se ha trabajado mucho para minimizar las fases de fermentacion, maduracion y de estabilizacion en el proceso de elaboracion de cerveza (Narziss, L. 1990 Ferment, 3, 54-62). Por ejemplo, en el proceso de "fermentacion a presion", la fermentacion y maduracion son aceleradas aumentando las temperaturas de fermentacion y maduracion: normalmente a temperaturas de aproximadamente 14-18 °C. En este enfoque, la fermentacion mas maduracion se completan en el plazo de un periodo de 7 dfas. El proceso de produccion completo, es decir, que incluye la estabilizacion, es considerablemente acortado a ligeramente mas de 2 semanas. Sin embargo, las cervezas resultantes pueden desarrollar un sabor ligeramente a levadura y en general una clasificacion de aroma menos favorable.
En la alternativa popular, el denominado proceso de "fermentacion en fno-maduracion en caliente", se obtienen cervezas con un sabor superior que se adhieren al proceso de fermentacion a baja temperatura convencional. El tiempo de procesamiento mas corto deseado se logra elevando la temperatura de la fase de maduracion a 18 a 22 °C. Como resultado, el sabor verde de la cerveza fresca se supera en el plazo de un periodo de 2 a 3 dfas. La estabilizacion de la cerveza se logra por metodos convencionales. Aunque las cervezas obtenidas tienen una calidad excelente, los costes de energfa de este proceso son relativamente altos.
En otro enfoque mas para acelerar la maduracion de la cerveza, la cerveza verde es minuciosamente centrifugada para eliminar levaduras y entonces se pasa a traves de biorreactores que contienen altas densidades de levaduras inmovilizadas. En combinacion con una etapa de calentamiento anaerobia a 90 °C, todo el diacetilo se reduce a acetorna en el plazo de un periodo de 1-2 horas. Tambien se estabiliza esta cerveza rapidamente madurada con el periodo de almacenamiento en fno usual y tratamiento con PVPP o gel de sflice. Este enfoque de biorreactor es, sin embargo, propenso a generar aromas extranos a levadura y es probable que los gastos de capital sean altos debido a que se requiere equipo tecnologico avanzado.
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Ademas, la introduccion de enzimas recientemente desarrolladas que se anaden durante la fase de fermentacion de la cerveza esta empezando a tener un impacto sobre la fabricacion de la cerveza. En un enfoque muy reciente, se usa una endoproteasa espedfica de prolina como una alternativa al tratamiento con PVPP o gel de sflice para prevenir la formacion de turbidez en fno (documento EP 1 326 957). Durante la fermentacion de la cerveza, la enzima hidroliza selectivamente las protemas ricas en prolina que activan la turbidez, previniendo asf la precipitacion de complejos de protema-polifenol. Ventajas informadas de este metodo son el hecho de que la PVPp o el gel de sflice son redundantes debido a que la turbidez en fno es eficazmente prevenida por la enzima. Ademas, el metodo da una etapa de procesamiento considerablemente simplificada durante esta etapa final y la mas vulnerable en el procesamiento de la cerveza, pero no tiene efecto significativo sobre la duracion del proceso de elaboracion de cerveza. En la practica, las reacciones entre PVPP y los polifenoles y/o entre el gel de sflice y las protemas que activan la turbidez son casi instantaneas. La eliminacion del tratamiento con PVPP o gel de sflice, por tanto, no da un proceso de elaboracion de cerveza mas corto. En otro enfoque enzimatico, una enzima adicional tal como una carboxipeptidasa que escinde prolina y/o una endoproteasa que escinde glicina puede anadirse a un proceso de produccion de cerveza, ademas de endoproteasa espedfica de prolina para disminuir adicionalmente la formacion de turbidez (vease el documento WO3/104382).
En otro enfoque enzimatico mas, la enzima alfa-acetolactato descarboxilasa se anade al mosto con posos. Esta adicion previene la formacion de diacetilo durante la fermentacion de la cerveza de manera que el periodo de maduracion, que pretende principalmente reducir los niveles de diacetilo, puede reducirse 2 a 3 dfas (veanse los documentos US 5.108.925 y US 4.708.875).
Aunque existen muchos informes sobre el acortamiento de la fase de maduracion de la produccion de cerveza, hasta la fecha no estan disponibles informes sobre los metodos viables para acelerar la fase de estabilizacion de la cerveza. Sin embargo, este periodo de estabilizacion normalmente dura aproximadamente una semana a temperaturas de aproximadamente 0 °C interrumpiendo capacidad considerable y requiriendo entrada de energfa considerable. El documento WO2005/027953, por ejemplo, desvela un proceso para la produccion de cerveza en el que se anade una endoproteasa espedfica de prolilo para reducir los niveles de epitopes de gluten. La fermentacion de la cerveza fue seguida de una maduracion en fno de 5 dfas.
Obviamente, sena de gran importancia economica acortar y simplificar adicionalmente el proceso de produccion de cerveza. Un proceso de produccion acortado y simplificado tal se anadina a la flexibilidad de las plantas de elaboracion de cerveza, reduciendo asf los costes fijos, ademas de los laborales.
Sumario de la invencion
Segun la invencion, se proporciona el uso de una proteasa espedfica de prolina para la aceleracion de un proceso de elaboracion de cerveza, preferentemente acortando el periodo de fermentacion baja.
La invencion tambien proporciona:
- un metodo de aceleracion de un proceso de elaboracion de cerveza que comprende preparar una cerveza en presencia de una proteasa espedfica de prolina, en el que se acorta el periodo de fermentacion baja; y
- un metodo para la produccion de cerveza que comprende fermentar un mosto en presencia de una proteasa espedfica de prolina, seguido de una fase de maduracion y fase de estabilizacion, en el que la fase de estabilizacion tiene una duracion inferior a 5 dfas.
Ademas, la invencion proporciona una cerveza obtenible por un metodo de la invencion y una botella, barril o lata que comprende una cerveza tal.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 muestra la intensidad de dispersion normalizada acumulada en funcion del tamano de partmula medido por PCS en cervezas de diez meses de la planta piloto de IFBM.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de una proteasa espedfica de prolina para acelerar el proceso de elaboracion de cerveza. En particular, se refiere al uso de una proteasa espedfica de prolina para acelerar el proceso de elaboracion de cerveza acortando y simplificando la fase de estabilizacion de la produccion de cerveza.
La fase de estabilizacion tambien puede ser llevada a cabo a una temperatura mas alta que en procesos de elaboracion de cerveza convencionales. En efecto, por tanto, la invencion se refiere a un proceso en el que la fase de post-fermentacion del proceso de elaboracion de cerveza se acorta en comparacion con los procesos del estado de la tecnica y/o a una temperatura mas alta que los procesos del estado de la tecnica. Por consiguiente, la invencion tambien se refiere a un metodo de aceleracion del proceso de elaboracion de cerveza que comprende llevar a cabo el proceso en presencia de una proteasa espedfica de prolina. En un proceso tal, la fase de
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estabilizacion puede ser mas corta y/o llevarse a cabo a una temperatura mas alta en comparacion con los procesos de elaboracion de cerveza convencionales.
Se usan una gran variedad de procesos de elaboracion de cervezas en el mundo. Normalmente, sin embargo, todos estos procesos comprenden basicamente al menos las siguientes etapas, o estadios correspondientes a las mismas:
• Fermentacion
• Maduracion
• Estabilizacion
• Filtracion (sin embargo, algunos procesos no usan filtracion)
El proceso comprende opcionalmente una etapa o etapas adicionales para aumentar adicionalmente la estabilidad, por ejemplo la estabilidad en anaquel. A este respecto, puede usarse cualquier tecnica conocida, por ejemplo, el uso de un tratamiento de polivinilpolipirrolidona (PVPP) y/o gel de sflice. Normalmente, una etapa adicional tal puede llevarse a cabo entre la fase de estabilizacion y de filtracion final, aunque una etapa tal podna llevarse a cabo en alguna otra parte del proceso.
Los detalles de cada etapa de proceso podnan diferir considerablemente en los diferentes procesos, y al llevar a cabo un proceso de elaboracion de cerveza, el experto en la materia tendra sus propias definiciones para cada fase. Para evitar cualquier falta de claridad, en el contexto de la presente invencion, los terminos fermentacion, maduracion, estabilizacion, tratamiento con PVPP y con gel de sflice y filtracion pretenden ser los mismos que los desvelados en la descripcion. Observese que en algunos procesos la fermentacion tambien se conoce como fermentacion primaria. La fase de fermentacion es la fase en la elaboracion de la cerveza prevista para fermentar los azucares disponibles en alcohol por las levaduras anadidas. La fase de maduracion tambien se conoce como fermentacion secundaria y esta prevista para convertir los componentes de aroma no deseables tales como dicetonas en componentes de mejor sabor. La fase de estabilizacion pretende promover la formacion de agregados de polifenol-protema y permitir su precipitacion. El tratamiento con PVPP y/o con gel de sflice, si se usa, pretende eliminar respectivamente polifenoles y protemas que activan la turbidez no precipitados para convertir el producto envasado en mas estable en anaquel. Finalmente, la etapa de filtracion, si se usa, pretende eliminar polifenoles y protemas que activan la turbidez precipitados, cualquier levadura residual, el PVPp y/o gel de sflice antes del envasado.
Generalmente, durante la elaboracion de la cerveza pueden comprobarse varios parametros. El fin de la fase de fermentacion puede, por ejemplo, determinarse midiendo la densidad de la cerveza que se prepara, para determinar la reduccion en el extracto fermentable, tal como la cantidad de glucosa. El fin de la fase de fermentacion se considera generalmente el comienzo de la fase de maduracion. El fin de la fase de maduracion, y asf el comienzo de la fase de estabilizacion, pueden normalmente determinarse midiendo la cantidad de diacetilo presente en la cerveza. Sin embargo, en la practica, esto puede variar dependiendo del tipo de cerveza deseado. Por ejemplo, en algunas fabricas de cerveza la fase de maduracion se considera terminada una vez el nivel de dicetonas vecinales esta por debajo de aproximadamente 0,10 mg/l y en otras una vez el nivel de dicetonas vecinales esta por debajo de aproximadamente 0,05 mg/l. Por consiguiente, un experto sera capaz de definir el fin de la fase de maduracion y el comienzo de la fase de estabilizacion segun un nivel de dicetonas vecinales deseado.
En el contexto de la presente invencion, el comienzo de la fase de estabilizacion puede definirse como el momento donde los niveles de diacetilo han sido reducidos a menos de aproximadamente 0,10 mg/ litro si se miden segun el metodo de EBC 9.24.1 Dicetonas vecinales en la cerveza: Metodo espectrofotometrico. En el contexto de la presente invencion, el fin del periodo de estabilizacion se define como el momento donde la cerveza se somete a su etapa de filtracion final, o en el supuesto caso de que un tratamiento con PVPP y/o con gel de sflice sea parte del proceso de elaboracion de la cerveza, una vez la cerveza se pone en contacto con PVPP y/o gel de sflice. Si el proceso es uno en el que no se lleva a cabo filtracion, el fin del periodo de estabilizacion se define como el momento en el que la cerveza se envasa.
Segun una realizacion de la presente invencion, el tiempo necesario para la estabilizacion puede ser acortado a menos de aproximadamente 5 dfas. Preferentemente, es menos de 4 o 3 dfas. Mas preferentemente, se acorta a menos de 2 o 1 dfas. Lo mas preferentemente, se acorta a un grado tal que en la escala de produccion, la duracion de la estabilizacion se reduce al equivalente del periodo requerido para enfriar la cerveza desde la fase de maduracion hasta la temperatura deseada, por ejemplo la temperatura deseada para la filtracion y/o el envasado de la cerveza. Este periodo se denomina convencionalmente el periodo de enfriamiento. Acortar el periodo de estabilizacion al tiempo necesario para enfriar la cerveza hasta la temperatura deseada es altamente ventajoso, ya que entonces la duracion de la fase de estabilizacion solo depende de la capacidad de enfriamiento disponible.
La cerveza de la fase de maduracion se enfna tradicionalmente a una temperatura de aproximadamente -2 °C hasta e incluyendo aproximadamente 0 °C. Sorprendentemente, se ha encontrado que, tras el uso de una proteasa espedfica de prolina segun la invencion, la fase de estabilizacion puede no solo ser acortada, sino que tambien
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puede realizarse a una temperature mas alta que la convencionalmente usada. Tradicionalmente, hay procesos de estabilizacion que se llevan a cabo a temperatures mas altas, pero estos procesos necesitan mucho mas tiempo, por ejemplo 6 semanas y mas. Por tanto, en otra realizacion de la invencion, el periodo de estabilizacion, que puede normalmente ser un periodo de estabilizacion acortado como se ha definido anteriormente, se realiza en una cerveza preferiblemente enfriada a como maximo aproximadamente 2 °C, mas preferentemente a como maximo aproximadamente 3 °C, 4 °C, 5 °C o 6°C o incluso mas preferentemente a como maximo aproximadamente 7°C o aproximadamente 8 °C, y lo mas preferentemente a la temperatura deseada usada para el envasado, es decir, para el llenado de botellas o barriles.
La temperatura deseada para el envasado puede diferenciarse de proceso a proceso, pero se lleva a cabo preferentemente a una temperatura hasta e incluyendo 8 °C, preferentemente aproximadamente 7 °C, con el fin de obtener el nivel deseado de dioxido de carbono disuelto en la cerveza. En un proceso donde la cerveza solo se enfna a la temperatura requerida para el envasado, se requiere considerablemente menos energfa que en los procesos conocidos en la tecnica.
En una realizacion preferida segun la invencion, la fase de estabilizacion se reduce al periodo requerido para enfriar la cerveza desde la temperatura al final de la fase de maduracion hasta la temperatura deseada para el envasado, omitiendo asf el periodo de estabilizacion en frio convencional.
Segun la invencion, por tanto, la cerveza puede enfriarse a como maximo aproximadamente 2 °C, mas preferentemente a como maximo aproximadamente 3 °C, 4 °C, 5°C o 6 °C, incluso mas preferentemente a como maximo aproximadamente 7 °C o 8 °C y lo mas preferentemente a la temperatura deseada usada para el envasado. La cerveza puede entonces envasarse directamente, es decir, en esta realizacion, la cerveza no se mantiene durante ningun periodo de tiempo a la temperatura a la que se ha enfriado.
En la invencion, pueden llevarse a cabo etapas de procesamiento adicionales para lograr la clarificacion y/o estabilidad adicionales, si se requiere. De hecho, si se usa una fase de estabilizacion acortada que se corresponde con el periodo requerido para enfriar la cerveza a la temperatura deseada para el envasado, puede desearse tratar la cerveza con PVPP y/o gel de sflice, por ejemplo. Esto puede ayudar a garantizar la estabilidad en anaquel prolongada.
La cerveza estabilizada segun la presente invencion puede ser adicionalmente procesada para lograr un nivel de clarificacion y estabilidad que hace el producto aceptable para venta. Esto se logra generalmente usando una etapa de tratamiento adicional. Tambien puede usarse una etapa de filtracion. Esta es normalmente la etapa final en el proceso de elaboracion de la cerveza antes del envasado.
Puede usarse cualquier tecnica conocida a este respecto. Por ejemplo, tal tratamiento de clarificacion y/o estabilidad adicional puede lograrse usando un tratamiento adsorbente adecuado, tal como tratamiento con PVPP, gel de sflice, galotaninos o agarosa insoluble reticulada inmovilizada. El uso de estos tratamientos y su aplicacion a la elaboracion de cerveza es bien conocido para aquellos expertos en la materia. La PVPP normalmente se anade a una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 g/hl. El gel de sflice normalmente se anade a una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 g/hl.
Ejemplos de agarosas insolubles reticuladas inmovilizadas incluyen los sistemas de estabilizacion combinados descritos en los documentos WO97/43401 y US 6.001.406 y la resina del sistema de estabilizacion combinado fabricada por GE Health Care Bioscience AB (vease Taylor et al. 2006, Use of the Combined Stabilisation System and its impact on beer composition, Proceedings of the Institute of Brewing and Distilling, Asia Pacific Section, Hobart, Australia). Alternativamente, o ademas, podna usarse un tratamiento enzimatico, tal como tratamiento con papama, para lograr estabilidad y/o claridad adicionales.
Los tratamientos descritos anteriormente pueden usarse en una forma inmovilizada, por ejemplo partfculas de PVPP inmovilizadas.
Todos los tratamientos adicionales explicados anteriormente pueden usarse conjuntamente con el procedimiento de estabilizacion de la invencion. Puede usarse una combinacion de los tratamientos adicionales, por ejemplo dos, tres, cuatro o todos de tales tratamientos adicionales, conjuntamente con el procedimiento de estabilizacion de la invencion.
Convenientemente, tal tratamiento de clarificacion y/o estabilidad adicional puede llevarse a cabo una vez una cerveza ha sido estabilizada segun la invencion. La invencion tambien se refiere, sin embargo, a procesos en los que un tratamiento de clarificacion y/o estabilidad adicional se lleva a cabo en algun otro punto en el proceso o simultaneamente con estabilizacion segun la invencion.
En una realizacion preferida de la invencion, se usa la endoproteasa espedfica de prolina como se desvela en el documento EPA-1326957, haciendo asf opcionalmente el tratamiento con PVPP y de sflice superfluos y haciendo redundantes los costes inherentes para equipo para la regeneracion de PVPP y los costes laborales asociados a la operacion de este equipo. Adicionalmente, se aumenta el potencial antioxidante natural de la cerveza y mejora la
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estabilidad coloidal marginal de muchas cervezas tratadas con PVPP o gel de s^lice. Ademas, se reduce drasticamente el riesgo de exposicion a ox^geno de la bebida y se minimizan las corrientes residuales.
En una realizacion preferida de la presente invencion, este acortamiento de la fase de estabilizacion se combina con un acortamiento de la fase de maduracion (la fase que principalmente pretende convertir el diacetilo en acetoma). En el contexto de la presente invencion, el comienzo de la fase de maduracion se define en lo sucesivo como el momento donde el grado de atenuacion aparente alcanza de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 90 %, mas preferentemente de aproximadamente el 77 a aproximadamente el 84 %, como se estima usando una medicion de densidad de la cerveza. La densidad de la cerveza puede medirse por un picnometro o un medidor de densidad (metodos de EBC 8.2.1 y 8.2.2 respectivamente) y el lfmite de atenuacion se determina segun el metodo de EBC 8.6.1 u 8.6.2 (Fermentabilidad, lfmite de atenuacion del mosto). En el contexto de la presente invencion, el fin de la fase de maduracion puede definirse como el momento donde los niveles de diacetilo han sido reducidos a menos de aproximadamente 0,10 mg/litro si se miden segun el metodo de EBC 9.24.1 Dicetonas vecinales en la cerveza: Metodo espectrofotometrico. La fase de maduracion puede ser acortada por metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la maduracion puede ser acelerada usando temperaturas altas como se describe para los procesos de "fermentacion a presion" y de "fermentacion en fno-maduracion en caliente" (Narziss, L. 1990 Ferment, 3, 54-62). La maduracion tambien puede ser acortada usando levaduras inmovilizadas en un enfoque de biorreactor o empleando actividad de acetolactato descarboxilasa (ALDC: EC 4.1.15.; veanse, por ejemplo, los documentos US 5.108.925 o US 4.708.875). Usando uno o una combinacion de estos metodos, la maduracion puede limitarse a dos dfas, un dfa o incluso menos de un dfa como sea factible usando un biorreactor operado a una temperatura alta.
En el contexto de la presente invencion, la fase que incorpora tanto las fases de maduracion como de estabilizacion de la produccion de cerveza se llama el periodo de fermentacion baja.
Por consiguiente, la invencion proporciona el uso de una proteasa espedfica de prolina para acelerar un proceso de elaboracion de cerveza. Normalmente, la aceleracion se produce a modo de un acortamiento del periodo post- fermentacion, por ejemplo por acortamiento de la duracion del periodo de fermentacion baja, preferentemente reduciendo el periodo de estabilizacion.
Los terminos "acelerar" y "acortar" en este contexto estan previstos para indicar un proceso de elaboracion de cerveza que necesita menos tiempo para ser llevado a cabo en comparacion con un proceso equivalente donde no se usa una proteasa espedfica de prolina. La aceleracion generalmente se produce como consecuencia de un periodo de post-fermentacion acortado, es decir, ese periodo puede llevarse a cabo durante menos tiempo si se usa una proteasa espedfica de prolina en comparacion con un proceso equivalente que no usa una enzima tal.
Si el uso de la invencion se combina con medidas para acortar la fase de maduracion, el periodo de fermentacion baja completo puede ser restringido a menos de 8, 7 o 6 dfas. Preferentemente, se restringe a menos de 5, 4 o 3 dfas. Mas preferentemente, se restringe a menos de 2 dfas. Incluso mas preferentemente, el periodo de fermentacion baja completo se restringe a menos de 24 horas.
En una realizacion preferida de la presente invencion, un periodo de fermentacion baja que se restringe a 4 dfas o menos puede lograrse combinando una proteasa espedfica de prolina con una acetolactato descarboxilasa, por ejemplo una alfa-acetolactato descarboxilasa.
En una realizacion preferida, la proteasa espedfica de prolina y, opcionalmente, la acetolactato descarboxilasa, se anaden a la fermentacion primaria. Despues de esta fermentacion primaria, la cerveza verde puede someterse a un procedimiento de maduracion rapida y entonces, despues de que los niveles de diacetilo se hayan reducido a menos de aproximadamente 0,10 mg/litro, la cerveza puede ser inmediatamente enfriada a aproximadamente 2 °C, preferentemente a aproximadamente 5 °C, mas preferentemente a aproximadamente 7 °C, y lo mas preferentemente a una temperatura adecuada para el envasado y entonces, opcionalmente, filtrarse para obtener una cerveza clarificada, lista para el embotellado. De esta forma, puede lograrse una aceleracion de la fase de post-fermentacion, y tambien del proceso de elaboracion de cerveza global.
Las ventajas del proceso segun la invencion se aplican a cervezas de fermentacion baja fermentadas en la parte superior, ademas de a las fermentadas en la parte inferior. Las cervezas fermentadas en la parte superior fermentan y maduran muy rapidamente pero, al igual que las cervezas fermentadas en la parte inferior, requieren largos periodos de almacenamiento en frio para eliminar los complejos de polifenol-protema. Las ventajas del proceso segun la invencion se aplican particularmente a cervezas de fermentacion baja fermentadas en la parte inferior. El uso y metodo de la invencion tambien pueden aplicarse a cervezas en las que ha tenido lugar fermentacion espontanea.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo en el que la proteasa espedfica de prolina se usa segun la invencion. Es decir, la invencion proporciona un metodo de aceleracion de un proceso de elaboracion de cerveza, preferentemente reduciendo la duracion del periodo de fermentacion baja (tal como reduciendo la duracion del periodo de estabilizacion), metodo que comprende llevar a cabo dicho proceso de elaboracion de cerveza en presencia de una proteasa espedfica de prolina. La fase de fermentacion baja, por ejemplo la fase de estabilizacion, puede llevarse a cabo a temperatura superior a la normalmente usada en los procesos de elaboracion de cerveza
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convencionales. Normalmente, la duracion de la fase de estabilizacion sera el tiempo requerido para enfriar la cerveza desde la fase de maduracion hasta la temperatura de envasado.
En el contexto de la presente invencion, las palabras peptido y protema se usan indistintamente. En el contexto de la presente invencion, las palabras "niebla", "opacidad" y "turbidez" tambien se usan indistintamente.
Para determinar el momento donde el grado aparente de atenuacion alcanza de aproximadamente el 77 a aproximadamente el 84%, se usa la medicion de densidad de la cerveza. Se usa el metodo de EBC 9.24.1 Dicetonas vecinales en la cerveza: Metodo espectrofotometrico para cuantificar los niveles de diacetilo. Observese que el metodo de EBC 9.24.1 se disena para medir dicetonas en general, sin embargo como el diacetilo es con creces el principal componente de las dicetonas, por tanto en el contexto de la presente invencion el resultado de este metodo de medicion se considera indicativo del nivel de diacetilo. El nivel de diacetilo puede medirse alternativamente con un cromatograma de gases usando el metodo de EBC 9.24.2 Dicetonas vecinales en la cerveza. Para cuantificar la cantidad de turbidez en una bebida, puede usarse un turbidfmetro. En un turbidfmetro se mide la cantidad de luz que es dispersada a un angulo prescrito con respecto a la direccion del haz de luz incidente. Se sabe que las mediciones de turbidez son muy adecuadas para la medicion de turbidez formada como resultado de las interacciones protema-polifenol.
Un polifenol se define como un compuesto que tiene una estructura qmmica cuya estructura contiene al menos dos anillos aromaticos sustituidos con al menos un grupo hidroxilo o que tiene una estructura qmmica que contiene al menos un anillo aromatico sustituido con al menos dos grupos hidroxilo. Ejemplos de polifenoles son taninos y flavonoides, que incluyen, por ejemplo, catequinas, flavonoles y antocianinas.
El termino "cerveza", como se usa en el presente documento, pretende cubrir al menos la cerveza preparada a partir de mezclas preparadas a partir de cereales no malteados, ademas de todas las mezclas preparadas a partir de cereales malteados, y todas las mezclas preparadas a partir de una mezcla de cereales malteados y no malteados. El termino "cerveza" cubre las cervezas fermentadas en la parte inferior, pero tambien las fermentadas en la parte superior, ademas de las cervezas preparadas con auxiliares, y cervezas con todos los posibles contenidos de alcohol.
La cantidad de proteasa espedfica de prolina que se anade durante la fermentacion puede variar dependiendo de los niveles de malta usados y el tipo de fermentacion llevada a cabo. En una realizacion preferida del uso y/o metodo segun la invencion, se anaden de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 15 unidades (PPU), por ejemplo de aproximadamente 10 a aproximadamente 12,5 unidades (PPU) de actividad de endoproteasa espedfica de prolina, por hectolitro de una cerveza 100% malta a, por ejemplo, aproximadamente 12 grados Plato. No puede especificarse una cantidad maxima de actividad de proteasa espedfica de prolina que va a anadirse. La cantidad maxima es, por ejemplo, dependiente de la cantidad deseada de reduccion o prevencion de turbidez, la composicion de la cerveza en el pH al que la proteasa tiene su actividad maxima. La definicion de unidad de la enzima se proporciona en la seccion Materiales y metodos de la presente solicitud.
La proteasa espedfica de prolina puede anadirse a diferentes estadios durante la preparacion de una cerveza. La adicion de la enzima al principio de la fermentacion da los mejores resultados posibles. Sin embargo, la enzima puede anadirse a una mezcla o a una cerveza fermentada antes de que se haya formado la turbidez.
En este texto, los terminos proteasa espedfica de prolilo, proteasa espedfica de prolina, endoproteasa espedfica de prolina, endopeptidasa espedfica de prolina y proteasa que tiene una actividad espedfica de prolilo o expresiones similares se usan indistintamente.
La proteasa espedfica de prolina puede usarse en la invencion en una forma aislada o purificada. Por "aislada" o "purificada" esta prevista una proteasa espedfica de prolina eliminada de su entorno nativo. Por ejemplo, la proteasa espedfica de prolina recombinantemente producida expresada en celulas hospedadoras se considera aislada con el fin de la invencion, ya que son polipeptidos nativos o recombinantes que han sido sustancialmente purificados por cualquier tecnica adecuada tal como, por ejemplo, el metodo de purificacion de una unica etapa desvelado en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Una proteasa espedfica de prolina adecuada para su uso en la invencion puede recuperarse de cultivos celulares recombinantes por metodos muy conocidos para aquellos expertos en la materia, que incluyen, por ejemplo, precipitacion con sulfato de amonio o etanol, extraccion con acido y metodos cromatograficos tales como cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC).
Una proteasa espedfica de prolina adecuada para su uso en la invencion puede ser un producto naturalmente purificado, un producto o una smtesis qmmica, un producto producido por una tecnica recombinante a partir de un hospedador procariota o eucariota, que incluye, por ejemplo, celulas bacterianas, de levadura, fungicas, de plantas superiores, de insecto y de mairnfero.
Se entendera, sin embargo, que la proteasa puede ser mezclada con veldculos o diluyentes que no interferiran con el fin previsto de la enzima y todavfa se considerara como aislada. Una proteasa espedfica de prolina adecuada para su uso en la invencion tambien puede estar en una forma mas sustancialmente purificada. Por consiguiente, la
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proteasa espedfica de prolina puede estar comprendida en una preparacion en la que mas del 70 %, por ejemplo mas del 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, de las protemas en la preparacion es una proteasa espedfica de prolina.
Normalmente, la proteasa espedfica de prolina puede estar en una forma libre de o sustancialmente libre de cualquier otra proteasa.
Una proteasa espedfica de prolina adecuada para su uso en la invencion puede usarse en una forma inmovilizada de manera que puedan tratarse grandes cantidades de protema que contienen lfquidos. Las formas para seleccionar materiales de soporte apropiados y metodos de inmovilizacion adecuados han sido ampliamente descritas en la bibliograffa, por ejemplo en "Immobilization of Enzymes and Cells" (ed. Gordon F. Bickerstaff; ISBN 0-89603-386-4).
En el contexto de la presente invencion, una proteasa espedfica de prolina se define como una proteasa que corta protemas o peptidos en sitios donde la protema o peptido contiene un resto de prolina en su cadena. Preferentemente, una proteasa espedfica de prolina es una endoproteasa que "corta" (hidroliza) protemas o peptidos en sitios donde la protema o peptido contiene un resto de prolina. En el metodo segun la invencion, se usa preferentemente una endoproteasa espedfica de prolina que hidroliza el enlace peptfdico en el extremo carboxi de restos de prolina. Ejemplos de tales enzimas son prolil oligopeptidasas (EC 3.4.21.26), ademas de la prolil endoproteasa derivada de Aspergillus niger informada en J. Agric Food Chem, Vol 53 (20), 7950-7957, 2005) y las dipeptidil peptidasas espedficas de prolina tales como DPP IV (EC 3.4.14.5). Una endoproteasa espedfica de prolina que corta restos de prolina en su extremo NH2 se describe, por ejemplo, en una publicacion en Nature del 15 de enero de 1998, Vol. 391, p. 301-304.
Como es tfpico para actividades de enzima, la actividad de endoproteasas espedficas de prolina depende del pH. Normalmente, se usa en la invencion una endoproteasa espedfica de prolina que tiene una actividad espedfica de prolilo maxima a un pH que se corresponde con el pH de la cerveza (o mezcla o mosto, etc.) a la que se anade. En una realizacion preferida del metodo segun la invencion, una proteasa con un optimo de pH acido, es decir, con un optimo de pH de 6,0 o mas bajo - por ejemplo pH 5, 4, o 3 - se anade a la fermentacion primaria de la cerveza. En una realizacion mas preferida del uso y/o metodo segun la invencion, se anade una proteasa con un optimo de pH acido y que es secretada activamente por un microorganismo de calidad alimentaria en el caldo de fermentacion a la fermentacion de la cerveza.
Las proteasas espedficas de prolina se encontraron ampliamente en animales y plantas, pero su presencia en microorganismos parece estar limitada. Hasta la fecha, se han identificado proteasas espedficas de prolina en especies de Aspergillus (documento EP 0 522 428), Flavobacterium (documento EP 0 967 285) y Aeromonas (J. Biochem, 113, 790-796), Xanthomonas y Bacteroides. Aunque las enzimas espedficas de prolina de la mayona de estos organismos son activas a aproximadamente pH 8, la enzima de Aspergillus es optimamente activa a aproximadamente pH 5. La proteasa espedfica de prolina de la invencion puede aislarse de una de las especies microbianas anteriormente mencionadas, particularmente de una especie de Aspergillus. Preferentemente, la endoproteasa espedfica de prolina se afsla de una cepa de Aspergillus niger. Mas preferentemente, la endoproteasa espedfica de prolina se afsla de un hospedador de Aspergillus niger manipulado para expresar en exceso un gen que codifica una endoproteasa espedfica de prolina, aunque otros hospedadores, tales como E. coli, son vectores de expresion adecuados. Por ejemplo, la clonacion y produccion en exceso de la endoproteasa espedfica de prolina derivada de Flavobacterium en, entre otros, E. coli, ha proporcionado ciertas endoproteasas espedficas de prolina en una forma pura. Un ejemplo de una construccion de produccion en exceso tal se proporciona en World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp 209-212. Se usa preferentemente un hospedador de Aspergillus niger para producir una auto-construccion no recombinante que utiliza promotores de A. niger para accionar la expresion de un gen que codifica una endoproteasa espedfica de prolina de A. niger.
Lo mas preferentemente, la endoproteasa espedfica de prolina es la endoproteasa como se desvela en el documento EPA-1326957, proteasa que se incorpora en el presente documento por referencia. En el documento EPA-1326957, tambien se desvela el uso de la endoproteasa espedfica de prolina en la elaboracion de cerveza. En ese documento, sin embargo, solo se desvela el uso para reducir la turbidez en bebidas. No se ha desvelado que la endoproteasa espedfica de prolina pudiera usarse para acelerar el proceso de elaboracion de cerveza como tal. Ademas, para el experto en la materia, el tratamiento con PVPP y/o con gel de sflice es conocido por ser instantaneo. No se han desvelado metodos en los que se acorto el periodo de fermentacion baja o el periodo de estabilizacion. En caso de que se usara un proceso convencional sin una fase de estabilizacion apropiada, sena evidente para el experto en la materia que esto producina cervezas de mala calidad, por ejemplo con respecto a la estabilidad coloidal y claridad. Fue, por tanto, sorprendente que, tras el uso de una endoproteasa espedfica de prolina en la elaboracion de cerveza, el proceso pudiera ser acortado sin efectos perjudiciales sobre la calidad de la cerveza.
La actividad de acetolactato descarboxilasa anadida durante la fermentacion puede variar entre lfmites conocidos para el experto en la materia. Una indicacion de las actividades requeridas se proporciona en un documento por Hannemann (MBAA TQ, Vol 39, no 3, 2002, 149-155).
Las modernas fabricas de cerveza se esfuerzan por eliminar todos los polvos a granel como PVPP, gel de sflice o tierra de diatomeas del proceso de elaboracion de cerveza. En este enfoque, la filtracion de la tierra de diatomeas
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final se sustituye por una filtracion en membrana o filtracion de flujo cruzado. Segun otra realizacion de la invencion, el proceso de produccion de cerveza segun la invencion puede llevarse a cabo sin el uso de ningun polvo a granel como PVPP o hidrogel de s^lice o tierra de diatomeas para la filtracion. Por consiguiente, la cerveza preparada segun el uso y/o metodo de la invencion puede estar libre de, o sustancialmente libre de, PVPP y/o hidrogel de sflice y/o tierra de diatomeas.
Usando el metodo segun la invencion, la cerveza puede ser clarificada usando tecnicas de filtracion tales como filtracion de flujo cruzado. Por consiguiente, la invencion cubre un proceso en el que una cerveza se prepara usando una proteasa espedfica de prolina en combinacion con un filtro de membrana de flujo cruzado.
La presente invencion se refiere a un metodo de elaboracion de cerveza, por el cual se usa una proteasa espedfica de prolina, por el cual el periodo de estabilizacion puede ser acortado con respecto a un proceso de elaboracion de cerveza en el que no se usa proteasa espedfica de prolina, mientras que se mantienen al menos las mismas propiedades con respecto a la claridad visual de la cerveza segun la terminologfa de EBC 9.29 para la determinacion visual.
La invencion tambien se refiere a cerveza obtenida por el metodo segun la invencion. Normalmente, la claridad de las cervezas puede ser juzgada de diversas formas. El metodo de EBC 9.29 describe como se mide la turbidez en las cervezas. Las unidades de EBC se miden en turbidfmetros con un angulo de 90 grados. Alternativamente, puede hacerse evaluacion visual. Segun el metodo de EBC 9.29, es decir, cuando se miden las unidades de EBC con un angulo de dispersion de 90 grados, la cerveza que tiene una turbidez inferior a 0,5 unidades de EBC sera visualmente evaluada como "brillante". En caso de que la turbidez de la cerveza este entre aproximadamente 0,5 y 1,0 unidades de EBC, la cerveza se evaluara visualmente como "muy clara", entre 2 y 1 unidades de EBC "muy ligeramente turbia", entre 2 y 4 unidades de EBC "turbia" y por encima de 8 unidades de EBC "muy turbia". Por supuesto, no debe esperarse equivalencia exacta entre las diferentes escalas de turbidez o entre observaciones visuales hechas en diferentes laboratorios, pero no puede esperarse una gran discrepancia. Ademas, finalmente, la inspeccion visual como se hace por el consumidor sera importante desde un punto de vista comercial. Por tanto, se acepta generalmente que una cerveza debe ser (casi) brillante para ser comercialmente aceptable, es decir, tener un valor de unidades de EBC medido con dispersion a 90 grados de como maximo 1.
Sorprendentemente, se ha encontrado que para la cerveza preparada con el metodo segun la invencion, el valor de unidades de EBC no se correspondio con la evaluacion visual por un panel entrenado. Se supuso que las cantidades mas altas de protema y polifenoles todavfa presentes en la cerveza produdan valores de dispersion a 90 grados mas altos, pero no pueden detectarse a simple vista. Como se muestra en los ejemplos, se ha encontrado posible tener una evaluacion visual de "brillante" para una cerveza que tiene un valor de unidades de EBC superior a 1 y tambien una evaluacion visual de "casi brillante" para una cerveza que tiene un valor de unidades de EBC superior a 2, que oscila hasta incluso a 8. Es decir, la cerveza obtenida segun el metodo de la invencion tiene una composicion (fisico)qmmica diferente a las cervezas convencionalmente elaboradas.
Esto ha sido confirmado usando analisis de partfculas de cervezas estabilizadas por diferentes metodos. Esto mostro que las cervezas estabilizadas segun la invencion comprenden partfculas que son mas pequenas en promedio que aquellas identificadas en cervezas estabilizadas usando PVPP o hidrogel de sflice.
Por tanto, otro aspecto de la invencion es una cerveza que tiene una turbidez superior a 1 unidad de EBC, preferentemente igual o superior a 1,25, y lo mas preferentemente igual o superior a 1,5, mientras que la evaluacion visual por un panel entrenado usando terminologfa de EBC clasificara la cerveza como "brillante" inmediatamente despues de la elaboracion de la cerveza y medida a 1 °C. En otra realizacion, la invencion se refiere a una cerveza que tiene una turbidez superior a 2 unidades de EBC, preferentemente superior a 3, mas preferentemente superior a 4, incluso mas preferentemente superior a 6, y lo mas preferentemente superior a 8 unidades de EBC, mientras que la evaluacion visual por un panel entrenado usando terminologfa de EBC clasificara la cerveza como "casi brillante" medida a 1 °C despues de al menos 3 meses de almacenamiento de la cerveza a temperatura ambiente, preferentemente al menos 6 meses de almacenamiento de la cerveza o lo mas preferentemente 9 meses de almacenamiento de la cerveza a temperatura ambiente.
La cerveza obtenida segun el uso y/o metodo de la invencion normalmente se envasara. Puede usarse cualquier envase adecuado, por ejemplo una botella, un barril o una lata. La cerveza preparada segun el uso y/o metodo de la invencion tambien puede envasarse en un tanque a granel. Por consiguiente, la invencion proporciona un envase que comprende la cerveza obtenida segun el uso y/o metodo de la invencion, por ejemplo una botella, un barril o una lata que comprende una cerveza tal.
En lo sucesivo, la invencion se ilustra por los siguientes ejemplos no limitantes.
MATERIALES Y METODOS
Mediciones de actividad de enzimas especificas de prolina
Se prueba la actividad de endoproteasas espedficas de prolina que tienen optimos de pH por debajo de pH 6,0 en el peptido sintetico Z-Gly-Pro-pNA a 37 °C en un tampon citrato/difosfato de sodio a pH 4,6. La actividad de
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endoproteasas espedficas de prolina que tienen optimos de pH neutro se prueban en el peptido sintetico Z-Gly-Pro- pNA a 37 °C en un tampon fosfato a pH 7,0.
La actividad de dipeptidil dipeptidasas que tienen un optimo de pH por debajo de pH 6,0 se prueban en el peptido sintetico Gly-Pro-pNA a 37 °C en un tampon citrato/difosfato de sodio a pH 4,6.
La actividad de dipeptidil dipeptidasas que tienen optimo de pH por debajo de pH 6,0 se prueban en el peptido sintetico Gly-Pro-pNA a 37 °C en un tampon fosfato a pH 7,0.
Los productos de reaccion de todas las proteasas espedficas de prolina se monitorizan espectrofotometricamente a 405 nM. Una unidad (1 PPU) se define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de p-nitroanilida por minuto bajo estas condiciones de ensayo.
Analisis durante el proceso de elaboracion de cerveza
Los diversos analisis se llevaron a cabo segun la edicion de 2004 de "Analytica - EBC" (Fachverlag Hans Carl, Nuremberg, Alemania), a menos que se indique lo contrario. Los analisis de la malta se llevaron a cabo segun los siguientes metodos de EBC 4-2, 4-5-1, 4-9-1, 4-3-1, 4-18, 8-13-2, 4-8, 4-15 y 4-14. La maceracion se monitorizo midiendo la tasa de sacarificacion y la filtracion de masa de malta. Los mostos se analizaron segun EBC 4-5-1, 4-72, 4-11, ademas de nitrogeno de amino libre (metodo de EBC 8.10), nitrogeno total (bien por el metodo de EBC 8.9.1 - Kjeldahl - o bien por 8.9.2 - Metodo de combustion de Dumas), pH y polifenol de mosto total (metodo de EBC 8.12). Los diversos experimentos de fermentacion fueron seguidos de temperatura, disminucion del extracto y presion. La poblacion de levadura se determino en la inoculacion, primer dfa de fermentacion y antes de la filtracion de la cerveza. El diacetilo se midio por cromatograffa de gases durante la fermentacion, maduracion y justo antes de la filtracion. La filtracion de la cerveza se monitorizo por recuentos de levadura antes y despues de la filtracion, por las disminuciones de presion relevantes y caudales. El oxfgeno disuelto se midio en agua carbonatada, en cerveza la entrada y salida de filtracion y en la cerveza embotellada. Los diversos analisis de cerveza incluyeron los metodos de EBC 9.4, 9.6, 9.7, 9.8, 9.11, 9.24.1, 9.24.2, 9.29, 9.30, 9.35, 9.37, Ross & Clark y NIBEM (9.42) para los valores de retencion de cabeza, trans-2-nonenal, y potencia reductora. El desarrollo de turbidez fue seguido usando diversas mediciones de turbidez a diversas temperaturas (vease el Ejemplo 2) a angulos de dispersion de 25 y 90 grados usando el medidor de turbidez VOS ROTA 90/25 (Haffmans, Venlo, Los Pafses Bajos). Las pruebas de caducidad se llevaron a cabo segun la prueba de estabilidad en anaquel predictiva de EBC 9.30.
El proceso de elaboracion de cerveza
Todos los experimentos de elaboracion de cerveza se llevaron a cabo a una escala de 20 hl con 300 kg de malta pilsen (tipo Heineken A) y 950 I de agua para la maceracion. La elaboracion de cerveza incorporo un proceso de maceracion con el siguiente regimen de temperaturas: 45 °C durante 20 minutos, 45 a 64 °C en 20 minutos, a 64 °C durante 15 minutos, de 64 a 76 °C en 12 minutos, a 76 °C durante 25 minutos y finalmente de 76 a 78 °C en 5 minutos, seguido de filtracion de la masa de malta. Para el burbujeo se uso agua caliente. La coccion fue durante 90 minutos y se anadio lupulo en forma de granulos de lupulo. Se llevo a cabo estabilizacion en frio en condiciones como se especificaron en los ejemplos individuales. La cerveza se filtro usando un filtro de placa recubierto con un pre-recubrimiento de grado grueso y uno de grado fino. El pre-recubrimiento de grado fino tambien se uso como auxiliar filtrante. Para el embotellado se uso una envasadora Carbofill. Las botellas se pasteurizaron durante 15 minutos a 60 °C.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 (comparativo)
Produccion de cerveza a escala piloto
En la fabrica de cerveza piloto semi-industrial de 20 hl en IFBM (Institute Frangais de la Brasserie et de la Malterie, Vandoeuvre-les-Nancy, Francia) se elaboraron dos mostos de malta puros en condiciones identicas. Durante la fermentacion, a uno de estos mostos se anadio una proteasa espedfica de prolina (Brewers Clarex de DSM Food Specialities, Delft, Los Pafses Bajos, que contema 5 PPU/gramo de producto) en una concentracion de 10 PPU/hectolitro de mosto, ademas de acetolactato descarboxilasa (Maturex L de NOVO, Bagsvaerd, Dinamarca, que contema 1.500 ADU/gramo de producto) en una concentracion de 4500 ADU/ hectolitro de mosto al principio de la fermentacion. Esta fermentacion se designo "fermentacion de ensayo". El otro mosto se fermento como tal, y se designo la "fermentacion de control".
Elaboracion de cerveza
Las cervezas se produjeron a partir de 300 kg de malta de cebada y granulos de lupulo. Las condiciones de maceracion fueron una relacion de agua:molienda de 4:1 (vol/peso), pH 5,6. El diagrama de maceracion incluyo una primera etapa a 45 °C durante 20 minutos, una segunda etapa a 64 °C durante 15 minutos, una tercera etapa a 74 °C durante 30 minutos, y finalmente un trasvase del mosto a la cuba a 78 °C durante 5 minutos. Las velocidades de calentamiento fueron 1 °C/minuto cada vez. Despues del trasvase del mosto a la cuba, la mezcla de malta se
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filtro en una cuba de filtracion; primero se aplicaron recirculacion del mosto y burbujeos en caliente (78 °C) a pH 5,6. Los mostos resultantes se cocieron durante 90 minutes, despues de lo cual se realizaron buenas separaciones de precipitados con un remolino.
Fermentacion
Las fermentaciones se llevaron a cabo con la cepa de levadura de la parte inferior Rh como se compro de VLB (Berlin, Alemania) inoculando con 17.106 celulas viables/ml del mosto de 12 °C Plato. El proceso de fermentacion se realizo a 12 °C hasta 5 °C Plato (3 d^as) y luego continuo a 14 °C hasta el fin de la fermentacion (3 dfas).
Post-fermentacion
Al final de la fermentacion, la fermentacion de control se mantuvo a 14 °C durante tres dfas mas para reducir los niveles de diacetilo. Despues de este periodo de maduracion, la cerveza se enfrio a 0 °C en un dfa y la cerveza se estabilizo durante 5 dfas a 0 °C antes del tratamiento con PVPP de un solo uso a una dosificacion 30 g/hl, filtracion de cerveza con tierra de diatomeas y embotellado.
Para la fermentacion de ensayo, sin embargo, no se aplico periodo de maduracion. Ademas, el periodo de estabilizacion se restringio al periodo requerido para enfriar la cerveza a 4 °C. Directamente despues del fin de la fermentacion, la cerveza se enfrio a 4°C durante un periodo de 4 dfas, siguiendo una disminucion de temperatura lineal. Debido a que se uso Brewers Clarex durante la fermentacion, no se anadieron agentes estabilizantes de la cerveza (tales como PVPP o gel de sflice). En su lugar, despues de enfriarse las cervezas, se filtraron directamente con tierra de diatomeas, y posteriormente se embotellaron. Se ensayaron parametros de cerveza estandar (por ejemplo, pH, color, amargor, etanol, etc.) segun los metodos establecidos por la Convencion cervecera europea (EBC), que se describen en su "Analytica - EBC".
Resultados
Generalmente, el analisis de cervezas estandar indica que los parametros de la cerveza fueron similares para tanto la fermentacion de control como de ensayo. Los niveles de oxfgeno disueltos fueron comparables en ambos ensayos e inferiores a 0,2 mg/l. Los niveles de turbidez iniciales fueron comparables para ambas cervezas, mientras que la cerveza de ensayo tiene valores significativamente mas bajos en la prueba de turbidez fria del alcohol segun L. Chapon (metodo de EBC 9.41). Adicionalmente, durante la prueba de caducidad de la cerveza "Prediccion de la estabilidad en anaquel de la cerveza" (metodo de EBC 9.30), la cerveza de ensayo rindio mejor que la cerveza de la fermentacion de control.
El nivel de dicetonas vecinales de las cervezas de tanto las fermentaciones de ensayo como de control estuvo por debajo de 0,10 mg/litro (medido con el metodo de EBC 9.24.1 Dicetonas vecinales en la cerveza: Metodo espectrofotometrico). Se realizo el analisis sensorial por un panel entrenado (que consiste en ocho personas) en IFBM (Vandoeuvre-les-Nancy, Francia) en un procedimiento normalizado, en el que despues de probar la muestra, los peritos asignaron una puntuacion de intensidad para los atributos de sabor. Los resultados se recogieron para formar un perfil sensorial de la muestra. Las pruebas se hicieron segun las pautas para el analisis sensorial, descritas en el Capftulo 13 de la edicion de 2004 "Analytica - EBC". No pudieron observarse diferencias de sabor significativas para el panel de sabor entre la cerveza de la fermentacion de control y de ensayo.
Conclusion
Este ejemplo demuestra que por la aplicacion de una proteasa espedfica de prolina y acetolactato descarboxilasa podna producirse una cerveza que tiene parametros de cerveza estandar (medidos con metodos establecidos por la Convencion cervecera europea (EBC)) que son similares a los parametros de la cerveza de referencia y que no muestra diferencias de sabor significativas en comparacion con la cerveza de referencia. Ademas, el uso segun la invencion conduce a un proceso que ahorra tiempo, debido a que un periodo de fermentacion baja de 9 dfas (control) podna reducirse a 4 dfas. Ademas, podnan lograrse ahorros de energfa significativos, enfriando a 4°C durante 4 dfas, en lugar de enfriar a 0 °C en un dfa y manteniendo esta temperatura durante otros 5 dfas.
Ejemplo 2
Acortamiento del periodo de estabilizacion en fro y sus efectos sobre la claridad de enzima estabilizada, cervezas 100 % malta
Se llevaron a cabo ensayos de elaboracion de cerveza para evaluar el efecto de una endoproteasa espedfica de prolina en cervezas 100% malta tras el uso de periodos de estabilizacion en frte acortados. Para este fin, se prepararon seis mostos diferentes y se fermentaron segun exactamente el mismo protocolo (vease Materiales y metodos). A cinco fermentadores, la proteasa espedfica de prolina de Aspergillus niger se anadio a una concentracion de 0,125 PPU/litro (vease Materiales y metodos para la definicion de actividad) y en las cinco fermentaciones, la enzima se anadio al mosto frte, antes de la inoculacion. La sexta fermentacion sirvio de referencia y no se anadio enzima espedfica de prolina. Todos los fermentadores se inocularon con levadura de fermentacion baja fresca (aprox. 17 millones de celulas/ ml de mosto) y la fermentacion tuvo lugar a 12 °C hasta 5 plato seguido
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de un aumento de temperatura hasta 14 °C para la eliminacion de dicetonas vecinales tales como diacetilo. Al final de la maduracion (en este caso nueve dfas despues del comienzo de la fermentacion), la cerveza se enfrio a menos 1 °C. La cerveza madurada de todos los fermentadores con la enzima anadida se mantuvo durante diversos periodos a menos 1 °C y luego se filtro a traves de tierra de diatomeas. Cuatro lotes a los que la enzima espedfica de prolina se habfa anadido se filtraron como tales. El quinto lote con proteasa espedfica de prolina anadida se trato en lmea con PVPP de uso unico (40 g/hl; inyectado al filtro de cerveza) y entonces se filtro.
La cerveza madurada del fermentador sin enzima anadida tambien se enfrio a menos 1 °C y se sometio a un protocolo de estabilizacion 'clasica', es decir, la cerveza se mantuvo a menos 1 °C durante 9 dfas seguido del mismo tratamiento en lmea con 40 g/hl de PVPP de uso unico y, posteriormente, se filtro con tierra de diatomeas. Despues de envasar, las botellas se pasteurizaron a 15 PU y se guardaron a 20 °C.
Despues de un periodo de almacenamiento de seis semanas, las diversas cervezas se sometieron a mediciones de turbidez a 20 °C y a 1 °C. Para este fin, la cerveza se preincubo durante 24 horas a la temperatura de medicion, es decir, o bien 1 o bien 20 °C y luego se midio la turbidez de la cerveza a esta temperatura. Las lecturas de turbidez se registraron usando un turbidfmetro que media una dispersion a 90 y 25 grados. Los datos de dispersion a 90 y 25 grados obtenidos con este turbidfmetro (un Haffmans VOS ROTA 90/25) se muestran en la Tabla 1 como valores de "H90" y "H25", respectivamente, junto con la temperatura de medicion relevante. Antes de estas mediciones de turbidez, las botellas se agitaron para homogeneizar y se dejaron tiempo suficiente para que desaparecieran las burbujas de gas. Se llevaron a cabo multiples mediciones para garantizar que las burbujas de gas no influyeran en la lectura. Aparte de estas mediciones de turbidez, se llevaron a cabo evaluaciones visuales y de sabor usando un panel entrenado (n=5).
Tabla 1.
- Lote 1 comparativo Lote 2 Lote 3 Lote 4 comparativo Lote 5 comparativo Referencia
- Numero de dfas de estabilizacion a -1 °C
- 0 1 3 5 0 9
- Enzima espec de prol
- sf sf sf sf sf no
- PVPP (40 g/hl)
- no no no no sf sf
- Turbidez real (H25) a 20 °C
- 0,30 0,31 0,32 0,28 0,28 0,27
- Turbidez real (H25) a 1 °C
- 0,34 0,34 0,37 0,32 0,30 0,28
- Turbidez real (H90) a 20 °C
- 0,48 0,59 1,06 0,83 0,48 0,48
- Turbidez real (H90) a 1 °C
- 0,52 0,66 1,17 0,90 0,53 0,49
- Prueba de caducidad segun EBC 9.30 (H25)
- 0,70 0,35 0,33 0,27 0,22 0,22
- Prueba de caducidad EBC 9.30 (H90)
- 1,0 0,75 1,26 0,92 0,52 0,48
- Evaluacion visual a 8 °C a las seis semanas despues del embotellado (terminologfa de EBC 9.29)
- brillante brillante brillante brillante brillante brillante
- Sabor (3 semanas despues del embotellado)
- bueno bueno bueno bueno bueno bueno
Segun una inspeccion visual, todas las cervezas embotelladas, es decir, que incluyen la cerveza tratada con enzimas que no se sometio a ningun periodo de estabilizacion en frio, fueron completamente claras despues de enfriarse durante 24 horas a 8 °C despues de un periodo de almacenamiento de seis semanas a 20 °C.
Bastante sorprendentemente, estas evaluaciones de turbidez visual no estuvieron completamente en lmea con las diferentes lecturas de turbidez obtenidas. Segun la norma de EBC, las cervezas medidas segun el metodo de EBC 9.29 (medidas a angulo de dispersion de 90 grados) y que dan valores entre 1,0 y 2,0 EBC son "muy ligeramente turbias". Por encima de 2,0 EBC, las cervezas empiezan a ser "ligeramente turbias". Las lecturas de dispersion a 90 grados dieron valores de hasta 1,26 EBC (vease la Tabla 1), y todas estas cervezas fueron evaluadas visualmente como "brillantes". Esta discrepancia se trata en el Ejemplo 3.
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Tambien es considerable que, segun el panel de sabor de expertos, ninguna de las cervezas producidas mostro un perfil de sabor anormal.
Ejemplo 3 (comparativo)
Mediciones de turbidez y formacion de turbidez
Se realizaron tres fermentaciones de 20 hl segun el protocolo descrito en el Ejemplo 2 para un mosto 100 % malta de 12 Plato. La primera fermentacion (referencia) se llevo a cabo sin la adicion de una proteasa espedfica de prolina durante la fermentacion. A las dos otras fermentaciones, la proteasa espedfica de prolina de A. niger se anadio en la inoculacion en concentraciones de 0,125 y 0,20 PPU/I respectivamente. Al final de la maduracion (en este caso nueve dfas despues del comienzo de la fermentacion), las tres cervezas se estabilizaron en fno durante 5 dfas a 1 °C, despues de lo cual se eliminaron la levadura y los precipitados fnos. En ningun caso se aplico un tratamiento con PVPp o con gel de sflice. Las tres cervezas se filtraron sobre un filtro de tierra de diatomeas, que tema un pre- recubrimiento de grado grueso y uno de grado fino. Finalmente, las cervezas se embotellaron y se pasteurizaron a 15 PU y luego se guardaron a temperatura ambiente para estudios de estabilidad en anaquel.
Despues de diversos periodos de almacenamiento, la cerveza se preincubo durante 24 horas a 1 °C y luego se midio la turbidez de la cerveza a esta temperatura al angulo de dispersion de 90 grados. Antes de la medicion, las botellas se agitaron para homogeneizar y se dejaron tiempo suficiente para que desaparecieran las burbujas de gas. Se llevaron a cabo multiples mediciones para garantizar que las burbujas de gas no influyeran en la lectura. Los datos obtenidos se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2.
- Meses de almacenamiento a 20 °C
- 0 3 6 9
- Valores de H90 (EBC) medidos a 1 °C
- Referencia (sin enzima)
- 7,2 24,8 20,7 21,8
- Fermentacion + enzima (0,125 PPU/I)
- 1,5 4,6 7,5 6,9
- Fermentacion + enzima (0,20 PPU/I)
- 1,3 4,0 6,9 5,2
Junto con las mediciones de turbidez, las cervezas fueron visualmente inspeccionadas por un panel entrenado (n=5) y se juzgaron usando la terminologfa de EBC 9.29.
Como era de esperar, las cervezas de referencia no tratadas con enzima mostraron altos valores de EBC H90. En lmea con estos altos valores de H90, la inspeccion visual clasifico todas las muestras a t= 0, 3, 6 y 9 meses como "muy turbias" (las clasificaciones usaron la terminologfa especificada en el metodo de EBC 9.29).
De las cervezas tratadas con enzima, solo las muestras frescas (t=0) mostraron bajos valores de H90 (1,5 y 1,3 EBC respectivamente). A diferencia de las expectativas de los inventores, las lecturas del panel visual para las cervezas tratadas con enzima frescas (t=0 meses) fueron "brillantes" mientras que, basandose en los valores de H90 como se obtuvieron, se espero una clasificacion de "muy ligeramente turbias".
Las muestras tratadas con enzima almacenadas durante periodos mas largos mostraron todas valores de H90 de 4 EBC o mas altos. Sorprendentemente, las clasificaciones visuales obtenidas a partir de las dos cervezas tratadas con enzima despues de 3, 6 y 9 meses de almacenamiento se clasificaron como "casi brillantes" en vez de "turbias", como era de esperar a partir de sus valores de H90.
Por tanto, los presentes inventores llegan a la conclusion de que, como resultado del uso de la proteasa espedfica de prolina en el proceso de fermentacion de la cerveza, los valores de dispersion de H90 instrumentales no son indicativos de la percepcion de turbidez visual, ni de la estabilidad coloidal de la cerveza envasada segun la invencion. Ademas, los presentes inventores llegan a la conclusion de que la cerveza segun la invencion es diferente de las cervezas conocidas en la tecnica.
Ejemplo 4 (comparativo)
Analisis del tamano de partcula de las cervezas estabilizadas por diferentes metodos
En la fabrica de cerveza piloto semi-industrial del IFBM (Institute Frangais de la Brasserie et de la Malterie, Vandoeuvre-les-Nancy, Francia), se realizaron cuatro fermentaciones segun el protocolo descrito en el Ejemplo 2 para un mosto 100 malta de 12 Plato. A una de las fermentaciones se anadio la proteasa espedfica de prolina de A. niger en la inoculacion a una concentracion 0,125 PPU/I. A las otras tres fermentaciones no se anadio proteasa espedfica de prolina. Al final de la maduracion (en este caso nueve dfas despues del comienzo de la fermentacion),
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todas las cervezas se estabilizaron en fno durante 5 dfas a 1 °C, despues de que se eliminaran la levadura y los precipitados fnos. Una de las tres cervezas que no se estabilizo con la proteasa espedfica de prolina se estabilizo entonces con 30 g/hl de PVPP de uso unico (inyectada en lmea de la filtracion de cerveza). Otra cerveza a la que no se anadio proteasa espedfica de prolina se estabilizo con 30 g/hl de hidrogel de sflice (inyectado en lmea a la filtracion de cerveza). La cerveza tratada con la proteasa espedfica de prolina de A. niger y la cerveza de control "no tratada" restante se filtraron como tales, es decir, sin la adicion de PVPP o hidrogel de sflice. Las cuatro cervezas se filtraron sobre un filtro de tierra de diatomeas, que tema un pre-recubrimiento de grado grueso y uno de grado fino, y se anadio un auxiliar filtrante de tierra de diatomeas durante la filtracion en todos los casos. Finalmente, las cervezas se embotellaron y se pasteurizaron a 15 PU y luego se guardaron a temperatura ambiente. Durante el proceso, los niveles de oxfgeno se minimizaron cuidadosamente, y se encontro que eran comparables para las cuatro cervezas.
Despues de aproximadamente 10 meses de almacenamiento a temperatura ambiente, la distribucion del tamano de partmula de las cuatro cervezas se estudio en Brewing Investigacion International (BRI, Nutfield, Reino Unido) usando espectroscopfa de correlacion fotonica (PCS) a 6 °C. Esta tecnica no cuenta partfculas como tales, sino que proporciona una lectura de dispersion de la luz y es capaz de atribuir proporciones de esa dispersion a clases de partmulas de tamano espedfico, permitiendo por este documento la comparacion de las distribuciones del tamano de partmula de las cuatro muestras de cerveza.
La intensidad de dispersion normalizada acumulada se representa en la Figura 1. La Figura 1 indica que en la cerveza de control "no tratada" toda la luz dispersada resulta de las partmulas mas pequenas de 2000 nanometros. Para las cervezas estabilizadas con PVPP e hidrogel de sflice, todas las partmulas que dispersan luz son mas pequenas de aproximadamente 1250 y 750 nm, respectivamente. Sin embargo, las partmulas en la cerveza tratada con proteasa espedfica de prolina son mucho mas pequenas en promedio: no se encontraron partmulas mas grandes de 385 nm. Para la comparacion, los graficos en la Figura 1 se cuantificaron por dos variables:
• d50, el diametro de partmula al que el 50 % de la dispersion de luz es de partmulas mas pequenas que el diametro, y:
• d90, el diametro de partmula al que el 90 % de la dispersion de luz es de partmulas mas pequenas que el diametro.
Los ultimos datos se proporcionan en la Tabla 3.
Tabla 3: valores de d50 y d90 (vease el texto para la explicacion) para las muestras de cerveza del IFBM con estabilizacion diferente. NT: No tratadas, PVPP: poKmero de polivinilpirrolidona, SHG: hidrogel de sflice,
PSP: proteasa espedfica de prolina.
- Tratamiento
- Temperatura (°C) d50 (nm) dgo (nm)
- NT-control
- 6 895 1073
- 30 g/hl de PVPP
- 6 556 1141
- 30 g/hl de SHG
- 6 537 629
- 0,125 PPU/I de PSP
- 6 325 361
Ambos de los valores de d50 y d90 en la Tabla 3 indican que las partmulas que generan dispersion en la cerveza con la proteasa espedfica de prolina son sustancialmente mas pequenas que en las cervezas estabilizadas con PVPP o hidrogel de sflice. Esto esta en lmea con la hipotesis de los presentes inventores, que la hidrolisis de las protemas que activan la turbidez por la proteasa espedfica de prolina previene o reduce la formacion de complejos de protema-polifenol durante el envejecimiento. Los presentes inventores llegan a la conclusion de que, como resultado de la accion de la proteasa espedfica de prolina, las protemas que activan la turbidez se hidrolizan de manera que los complejos entre protemas y polifenoles siguen siendo mas pequenos durante el almacenamiento, conduciendo asf a la discrepancia observada entre la evaluacion de turbidez visual por paneles de experto y las lecturas de dispersion a 90 grados instrumentales relativamente altas. Otra vez, los presentes inventores llegan a la conclusion de que la cerveza obtenible usando el metodo de la invencion es diferente de las cervezas conocidas en la tecnica.
Ejemplo 5
Acortamiento del periodo de estabilizacion en frio y sus efectos sobre el desarrollo de turbidez en cervezas 100 % malta despues del almacenamiento de 4 y 6 meses a temperatura ambiente
En este ejemplo se proporcionan los datos sobre la estabilidad a largo plazo de las cervezas descritas en el Ejemplo 2. Las cervezas embotelladas y pasteurizadas se almacenaron a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C)
durante un periodo de hasta 6 meses. Despues de 4 y 6 meses de almacenamiento, las cervezas (Lotes 1, 2, 3, 4 y 5 mas la Referencia como se enumera en la Tabla 1) se analizaron usando mediciones de turbidez y la evaluacion visual tambien se describio en el Ejemplo 2. Los datos obtenidos se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4
- Lote 1 comparativo Lote 2 Lote 3 Lote 4 comparativo Lote 5 comparativo Referencia
- Numero de dfas de estabilizacion a -1 °C
- 0 1 3 5 0 9
- Enzima espec de prol
- sf sf sf sf Si no
- PVPP (40 g/hl)
- no no no no Si sf
- Datos obtenidos despues de 4 meses de almacenamiento a temperatura ambiente
- Turbidez real (H25) a 20 °C
- 0,60 0,58 0,51 0,38 0,36 0,36
- Turbidez real (H25) a 1 °C
- 1,69 1,25 0,87 0,61 0,57 0,55
- Turbidez real (H90) a 20 °C
- 0,82 0,87 1,32 0,96 0,65 0,51
- Turbidez real (H90) a 1 °C
- 2,76 1,96 2,17 1,44 0,68 0,69
- Evaluacion visual a 8 °C
- Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio brillante brillante brillante brillante
- Evaluacion visual a 1 °C
- Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio brillante Brillante
- Datos obtenidos despues de 6 meses de almacenamiento a temperatura ambiente
- Turbidez real (H25) a 20 °C
- 1,78 1,64 1,56 1,40 1,34 1,35
- Turbidez real (H25) a 1 °C
- 2,17 1,74 1,38 1,12 1,10 1,04
- Turbidez real (H90) a 20 °C
- 1,59 1,49 2,11 1,52 1,07 1,04
- Turbidez real (H90) a 1 °C
- 4,24 3,10 2,97 1,94 1,11 1,00
- Evaluacion visual a 8 °C
- Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio brillante brillante
- Evaluacion visual a 1 °C
- Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio Muy ligeramente turbio brillante brillante
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Los datos proporcionados en la Tabla 1 del Ejemplo 2 muestran que despues de 6 semanas de almacenamiento a temperatura ambientes, tras la evaluacion visual segun EBC 9.29, todas las cervezas embotelladas y pasteurizadas se clasifican como "brillantes". Segun estos datos, el uso de la proteasa espedfica de prolina sola garantiza las excelentes cervezas, aunque el periodo de estabilizacion en fno se reduce al periodo requerido para enfriar la 10 cerveza madurada a menos 1 ° C, es decir, esencialmente sin un periodo de mantenimiento a esta baja temperatura. Sin embargo, como se muestra en la Tabla 4, la estabilidad de la turbidez de las cervezas cambia cuando las cervezas se almacenan durante periodos mas largos. Despues de cuatro meses de almacenamiento a ambiente,
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todas las cervezas tratadas con enzima que reciben una estabilizacion en fno de 0 hasta 5 d^as desarrollan una turbidez muy leve. Por tanto, los presentes inventores llegan a la conclusion de que si la proteasa espedfica de prolina se usa en combinacion con un periodo de estabilizacion en fno mmimo, las cervezas 100 % malta siguen siendo visualmente estables durante un periodo de al menos hasta 6 semanas. La cerveza del Lote 5, tratada con la proteasa espedfica de prolina mas PVPP, sigue siendo "brillante" aun cuando se sometio al periodo de estabilizacion sub-cero irnnimo. Asf, el ultimo hallazgo indica que el usar una proteasa espedfica de prolina en combinacion con PVPP permite un espectacular acortamiento del periodo de estabilizacion en fno sin ningun efecto perjudicial en la estabilidad de la turbidez a largo plazo de la cerveza. El hecho de que los presentes inventores esten tratando con cervezas 100 % malta, hace este hallazgo incluso mas sorprendente.
Ejemplo 6
Combinacion del tratamiento enzimatico con periodos de estabilizacion cortos a temperaturas elevadas
Aparte de la duracion del periodo de estabilizacion en fno, tambien la energfa requerida para enfriar la cerveza a por debajo de 0 °C anade coste muy significativo al proceso de produccion de cerveza. Por tanto, los beneficios de uso de una proteasa espedfica de prolina deben idealmente no estar limitados a los periodos de estabilizacion en fno mucho mas cortos, sino que deben hacer redundantes las temperaturas de estabilizacion sub-cero. Para probar la ultima opcion, los presentes inventores iniciaron un nuevo conjunto de experimentos de elaboracion de cerveza a escala piloto. Se llevaron a cabo seis ensayos de elaboracion de cerveza a escala de 20 hl, esencialmente en las condiciones descritas en la seccion de Materiales y metodos y en el Ejemplo 2 de la presente solicitud. Otra vez, los efectos de uso de una proteasa espedfica de prolina se compararon con el uso de PVPP y sflice. Se usaron diversos protocolos de estabilizacion en fno que oscilaban de algunas horas a 4 dfas a 0 y 7 °C. Debido a que la proteasa espedfica de prolina mas PVPP parece presentar una potente combinacion estabilizadora de cerveza, se repitieron las condiciones del Lote 5 del experimento descritas en el Ejemplo 2. Sin embargo, en el presente experimento, la cerveza no se enfrio a menos 1 °C sino a 7 °C solo. La ultima temperatura proporcionana una opcion conveniente, ya que representa una temperatura maxima normalmente usada para el envasado de botellas o barril.
En la primera fermentacion de 20 hl, la cerveza madurada se sometio a un periodo de estabilizacion en fno que implico 1 dfa de enfriamiento a 0 °C, seguido de un periodo de almacenamiento de 4 dfas a 0 °C. Entonces, la cerveza se filtro con tierra de diatomeas y se dividio en 2 partes durante la filtracion de cerveza: los primeros 7 hl se trataron por PVPP 30 g/hl mezclada con tierra de diatomeas (auxiliar filtrante) y los ultimos 7 hl se trataron con Siligel S (Spindal, Armainvilliers, Francia; 40 g/hl) tambien mezclado con tierra de diatomeas (auxiliar filtrante). Despues de la filtracion, las cervezas se embotellaron y se pasteurizaron. En la Tabla 5, estos dos productos se denominan Lote 1 (con PVPP) y Lote 2 (con gel de sflice).
La segunda fermentacion de 20 hl se llevo a cabo de exactamente la misma forma que la primera fermentacion. Sin embargo, en este caso, la cerveza se sometio a un periodo de estabilizacion en fno que implico 1 dfa de enfriamiento a 7 °C seguido de un periodo de almacenamiento de 4 dfas a 7 °C. Estos dos productos se denominan Lote 3 (con PVPP) y Lote 4 (con gel de sflice).
Tanto la tercera como la cuarta fermentacion de 20 hl se llevaron a cabo anadiendo la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger en el mosto fno antes de la inoculacion a una concentracion de 0,125 PPU/I. La cerveza resultante de esta tercera fermentacion se sometio a un periodo de estabilizacion en fno que implica 1 dfa de enfriamiento a 0 °C seguido de un periodo de almacenamiento de 4 dfas a 0 °C, seguido de filtracion en tierra de diatomeas (sin adicion de ni PVPP ni gel de sflice), embotellamiento y pasteurizacion (Lote 5). La cerveza de la cuarta fermentacion se sometio a un periodo de estabilizacion en fno que implico 1 dfa de enfriamiento a 7°C seguido de un periodo de almacenamiento de 4 dfas a 7 °C. Otra vez seguido de filtracion en tierra de diatomeas (sin adicion ni de PVPP ni de gel de sflice), embotellamiento y pasteurizacion (Lote 6).
En la quinta fermentacion, la estabilizacion en fno se llevo a cabo precisamente enfriando la cerveza madurada a 0 °C (que dura menos de un dfa), despues de que la cerveza se filtrara con tierra de diatomeas. Entonces, la cerveza resultante se dividio otra vez en 2 partes durante la filtracion de la cerveza: los primeros 7 hl se trataron con PVPP 30 g/hl mezclada con tierra de diatomeas (Lote 7). Los ultimos 7 hl de esta cerveza se trataron con Siligel S 40 g/hl, tambien mezclado con tierra de diatomeas (auxiliar filtrante), se embotellaron y pasteurizaron (Lote 8).
En la sexta fermentacion, otra vez se anadio la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger en el mosto fno, antes de la inoculacion a una concentracion de (0,125 PPU/l). Despues de la maduracion, la cerveza se enfrio directamente a 7 °C y se trato con PVPP 30 g/hl mezclada con tierra de diatomeas. Despues de la filtracion, tambien esta cerveza se embotello y pasteurizo directamente. En la Tabla 5 la cerveza resultante se denomina Lote 9.
Poco despues del embotellado, todas las cervezas se sometieron a un gran numero de analisis de cervezas estandar tales como niveles de alcohol, amargor, diacetilo, polifenol y nonenal. Ademas, se determinaron los valores de retencion de cabeza (NIBEM y Ross & Clark). Los datos obtenidos mostraron que las cualidades de las diversas cervezas obtenidas son similares y no podnan mostrarse diferencias inesperadas. Los analisis sensoriales tambien mostraron solo diferencias menores. Como era de esperar, las diferencias mas grandes se encontraron en el rendimiento de las cervezas en diversas pruebas de caducidad. Por ejemplo, datos de caducidad segun EBC 9.30 y
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turbidez final despues de una prueba de envejecimiento acelerada a 60 °C de 6 dfas se determinaron poco despues del embotellado de las diversas cervezas. Los resultados de estas mediciones se muestran en la Tabla 5 (vease "Caducidad" ademas de "6 dfas 60 °C). La Tabla 5 tambien proporciona los diversos datos de turbidez H90 y evaluaciones visuales de la cerveza embotellada como se registro despues de un periodo de almacenamiento de 8 semanas a temperatura ambiente. La medicion de estos datos de H90 se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 2.
Tabla 5
- Lote 1 comparativo Lote 2 comparativo Lote 3 comparativo Lote 4 comparativo Lote 5 comparativo Lote 6 comparativo Lote 7 comparativo Lote 8 comparativo Lote 9
- Dias a 0°C
- 4 4 4 Enfriar solo 0 Enfriar solo 0
- Dias a 7 °C
- 4 4 4 Enfriar solo 0
- + enzima prol
- No no no no si Si no no si
- + PVPP
- 30 g/hl no 30 g/hl no no No 30 g/hl no 30 g/hl
- + Silice
- No 40 g/hl no 40 g/hl no No no 40 g/hl no
- Prueba de caducidad: EBC 9.30 Turbidez final a 1 °C (H90)
- 1,70 5,07 3,57 11,4 1,62 1,58 1,85 6,30 0,68
- Prueba de caducidad: 6 dias 60 °C 24 h a 1 °C (H90)
- 7,41 14,15 11,48 38,82 3,22 4,02 7,60 15,18 2,09
- Datos obtenidos despues de 8 semanas de almacenamiento a temperatura ambiente
- (H90) a 1 °C
- 0,62 2,97 1,13 6,71 0,97 1,74 1,14 3,31 0,63
- (H90) a 20 °C
- 0,69 0,71 0,50 0,58 0,82 1,50 1,08 0,60 0,54
- Visual a 8 °C
- Brill. Brill. Brill. Vsh Brill. Brill. Vsh Vsh Brill.
- Visual a 1 °C
- Brill. Sh Vsh Turbias Brill. Brill. Vsh Sh Brill.
- "Brill".: Brillante, "Vsh": Muy ligeramente turbia, "Sh": Ligeramente turbia. Todos tras la evaluacion visual segun EBC 9.29 despues del almacenamiento durante 24 horas. "Enfriar solo 0" se refiere a un enfriamiento a la temperatura indicada sin un periodo de mantenimiento posterior a esa temperatura.
Los datos proporcionados en la Tabla 5 demuestran una vez mas que el uso de la proteasa espedfica de prolina sola permite periodos de estabilizacion en fno espectacularmente acortados (vease el Lote 5). Adicionalmente, los datos en la Tabla 5 demuestran que un periodo de estabilizacion corto tal tambien es factible a temperaturas elevadas (vease el Lote 6). Como tal, este hallazgo es economicamente altamente relevante para una categona espedfica de cerveceros. Los datos presentados en el Ejemplo 5 en combinacion con los valores de caducidad de EBC 9.30 relativamente altos para las cervezas estabilizadas sin usar la proteasa espedfica de prolina como se muestra en la Tabla 5 del presente ejemplo tambien sugieren que estas condiciones de estabilizacion pueden no ser adecuadas para garantizar cervezas visualmente brillantes despues de periodos de almacenamiento prolongados. Si se preven periodos en anaquel de largo plazo, los datos presentados aqu (Lote 9) sugieren que un protocolo de "Enfriar a la temperatura de embotellamiento solo", que es un enfriamiento rapido a aproximadamente 7 °C, es adecuado a condicion de que una proteasa espedfica de prolina se combine con un tratamiento con PVPP. Asf, el hallazgo mas sorprendente del presente ejemplo es que combinar la proteasa espedfica de prolina (opcionalmente en combinacion con PVPP si se esperan periodos en anaquel de largo plazo) parece permitir una omision completa del periodo de estabilizacion en fno. La implicacion es un atajo de procesamiento muy significativo: de la maduracion directamente al llenado de botellas e incluso generar cervezas visualmente brillantes estables en anaquel.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES1. Metodo para la produccion de cerveza que comprende fermentar un mosto en presencia de una proteasa espedfica de prolina, seguido de una fase de maduracion y fase de estabilizacion, en el que la fase de estabilizacion tiene una duracion inferior a 5 dfas.5 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la duracion de la fase de estabilizacion se reduce al tiempo requeridopara enfriar la cerveza a la temperature final deseada para la filtracion y/o envasado.
- 3. Metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, por el cual la fase de estabilizacion tiene lugar a una temperature adecuada para el envasado de la cerveza, preferentemente a aproximadamente 7 °C.
- 4. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una alfa-acetolactato descarboxilasa 10 tambien esta presente durante la fermentacion.
- 5. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la duracion del periodo de fermentacion baja es inferior a 8 dfas.
- 6. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se usa PVPP.
- 7. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una etapa de filtracion, en el que se 15 usa un filtro de membrana de flujo cruzado.
- 8. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteasa espedfica de prolina es una proteasa espedfica de prolina con un optimo de pH acido.
- 9. Cerveza obtenible por el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
- 10. Una botella, lata o barril que comprende cerveza segun la reivindicacion 9.20
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