ES2642963T3 - Nucleótidos marcados - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Nucleotidos marcados Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a nucleotidos marcados. Particularmente, esta invencion describe nucleotidos que tienen un marcador removible y su uso en metodos de secuenciacion de polinucleotidos.

Antecedentes

Los avances en el estudio de las moleculas se han conducido, en parte, por la mejora de las tecnologfas usadas para caracterizar las moleculas o sus reacciones biologicas. Particularmente, el estudio de los acidos nucleicos ADN y ARN se ha beneficiado a partir de las tecnologfas en desarrollo usadas para el analisis de secuencias y el estudio de eventos de hibridacion.

Un ejemplo de las tecnologfas que han mejorado el estudio de los acidos nucleicos, es el desarrollo de matrices fabricadas de acidos nucleicos inmovilizados. Estas matrices consisten tfpicamente en una matriz de alta densidad de polinucleotidos inmovilizados sobre un material de soporte solido. Ver, por ejemplo, Fodor y otros, Trends Biotech. 12:1926, 1994, que describe las formas de ensamblar los acidos nucleicos usando una superficie de vidrio sensibilizada qufmicamente protegida por una mascara, pero expuesta en areas definidas para permitir la union de fosforamiditas de nucleotidos modificados adecuadamente. Las matrices fabricadas pueden producirse ademas mediante la tecnica de "punteo" de polinucleotidos conocidos sobre un soporte solido en posiciones predeterminadas (por ejemplo, Stimpson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383, 1995).

Un desarrollo adicional en la tecnologfa de matrices es la union de los polinucleotidos al material de soporte solido para formar matrices de molecula unica. Las matrices de este tipo se describen en la solicitud internacional de patente num. WO 00/06770.La ventaja de estas matrices es que las reacciones pueden monitorearse a nivel de una molecula unica y la informacion sobre un gran numero de moleculas unicas puede recopilarse a partir de una sola reaccion.

Para que las matrices de ADN sean utiles, las secuencias de las moleculas deben determinarse. La patente de los EE. UU. num. 5,302,509 describe un metodo para secuenciar polinucleotidos inmovilizados sobre un soporte solido. El metodo es en base a la incorporacion de bases A, G, C y T bloqueadas en 3' que tienen un marcador fluorescente diferente al polinucleotido inmovilizado, en presencia del ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleotido objetivo, pero se impide ademas la adicion por el grupo 3' de bloqueo. El marcaje de la base incorporada puede determinarse y el grupo de bloqueo se elimina por escision qufmica para permitir que se produzca la polimerizacion adicional.

Welch y otros (Chem. Eur. J. 5(3) :951-960, 1999) describe la sfntesis de nucleotidos trifosfatos modificados con un grupo de bloqueo 3'-O- que es fotolabil y fluorescente. Los nucleotidos modificados pretenden usarse en experimentos de secuenciacion de ADN. Sin embargo, estos nucleotidos demostraron ser diffciles de incorporarse a un polinucleotido existente, debido a la incapacidad de colocarse en el sitio activo de la enzima polimerasa.

Zhu y otros (Cytometry 28:206-211, 1997) describe ademas el uso de marcadores fluorescentes unidos a un nucleotido a traves del grupo base. Los nucleotidos marcados pretenden usarse en experimentos de hibridacion in situ por fluorescencia (FlSH), donde se requiere una serie de nucleotidos marcados incorporados para producir un "codigo de barras" fluorescente.

Los documentos WO00/15844, WO96/11937 y Prober JM et al.; Science (1987); Vol 238, no 4825 paginas 336-341 describen variantes en los terminadores de didesoxinucleotidos usados en la secuenciacion electroforetica 'Sanger'. Los nucleotidos descritos tienen ambas posiciones 2' y 3' como hidrogeno.

El documento WO99/57321 divulga un metodo de secuenciacion en donde se cuenta el numero de nucleotidos incorporados. Con el fin de ser contado, el nucleotido debe tener una porcion 3'hidroxilo libre para permitir que se produzcan eventos de incorporacion multiples.

El documento US6136543 divulga un nucleotido con un enlazador fotolabil entre la base y el marcador y un 3'-hidroxilo libre. D5 tambien divulga por separado un nucleotido con una etiqueta unida a la posicion 3' a traves de una porcion de bloqueo.

Resumen de la invencion

En la presente invencion, una molecula de nucleosido o nucleotido se enlaza a un marcador detectable a traves de un grupo enlazante escindible unido a la base, lo que hace que la molecula sea util en tecnicas que usan nucleosidos o nucleotidos marcados, por ejemplo, reacciones de secuenciacion, sfntesis de polinucleotidos, amplificacion de acidos nucleicos, ensayos de hibridacion de acidos nucleicos, estudios de polimorfismo de nucleotido unico y otras tecnicas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

que usan enzimas tales como polimerasas, transcriptasas inversas, transferasas terminales, u otras enzimas modificadoras del ADN. La invencion es especialmente util en tecnicas que usan dNTPs marcados, tales como traduccion de nick, marcaje de cebadores aleatorios, marcaje final (por ejemplo, con desoxinucleotidiltransferasa terminal), transcripcion inversa o amplificacion de acido nucleico. Las moleculas de la presente invencion son a diferencia de la tecnica anterior, donde el marcador esta unido a la ribosa o azucar desoxirribosa, o donde el marcador esta unido a traves de un enlazador no escindible.

De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, una molecula de nucleotido o nucleosido, o un analogo de esta, tiene una base que esta unida a un marcador detectable a traves de un enlazador escindible.

La invencion caracteriza una molecula de nucleotido o nucleosido, que tiene una base que esta unida a un marcador detectable a traves de un enlazador escindible. La base puede ser una purina, o una pirimidina. La base puede ser una desazapurina. La molecula puede tener una porcion de azucar ribosa o desoxirribosa. El azucar ribosa o desoxirribosa puede incluir un grupo protector unido a traves del atomo de oxfgeno 2' o 3'. El grupo protector puede eliminarse para exponer un 3'-OH. La molecula puede ser un desoxirribonucleotido trifosfato. El marcador detectable puede ser un fluoroforo. El enlazador puede contener un enlace disulfuro.

La invencion caracteriza ademas un metodo de marcaje de una molecula de acido nucleico, donde el metodo incluye incorporar en la molecula de acido nucleico una molecula de nucleotido o nucleosido, donde la molecula de nucleotido o nucleosido tiene una base que esta unida a un marcador detectable a traves de un enlazador escindible. La etapa de incorporacion puede lograrse a traves de una transferasa terminal, una polimerasa o una transcriptasa inversa. La base puede ser una purina, o una pirimidina. La base puede ser una desazapurina. La molecula de nucleotido o nucleosido puede tener una porcion de azucar ribosa o desoxirribosa. El azucar ribosa o desoxirribosa puede incluir un grupo protector unido a traves del atomo de oxfgeno 2' o 3'. El grupo protector puede eliminarse para exponer un grupo 3'-OH. La molecula puede ser un desoxirribonucleotido trifosfato. El marcador detectable puede ser un fluoroforo. El enlazador puede contener un enlace disulfuro. El marcador detectable y/o el enlazador escindible pueden ser de un tamano suficiente para evitar la incorporacion de un segundo nucleotido o nucleosido en la molecula de acido nucleico.

En otro aspecto, la invencion caracteriza un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido objetivo de cadena simple, donde el metodo incluye el monitoreo de la incorporacion secuencial de nucleotidos complementarios, donde cada nucleotido tiene una base que esta unida a un marcador detectable a traves de un enlazador escindible, y donde la identidad de cada nucleotido incorporado se determina mediante la deteccion del marcador unido a la base, y posterior eliminacion del marcador.

La invencion ademas caracteriza un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido objetivo de cadena simple, donde el metodo incluye:(a) proporcionar nucleotidos, donde los nucleotidos tienen una base que esta unida a un marcador detectable a traves de un enlazador escindible, y donde el marcador detectable unido a cada tipo de nucleotido puede distinguirse por la deteccion del marcador detectable usado para otros tipos de nucleotidos; (b) incorporar un nucleotido en el complemento del polinucleotido objetivo de cadena simple; (c) detectar el marcador del nucleotido de (b), de ese modo determinar el tipo de nucleotido incorporado; (d) eliminar el marcador del nucleotido de (b); y (e) repetir opcionalmente las etapas (b) - (d) una o mas veces, y de ese modo determinar la secuencia del polinucleotido objetivo de cadena simple.

En los metodos descritos en la presente descripcion, cada uno de los nucleotidos puede ponerse en contacto con el objetivo secuencialmente, con la eliminacion de los nucleotidos no incorporados antes de la adicion del siguiente nucleotido, donde la deteccion y eliminacion del marcador y del grupo de bloqueo se lleva a cabo despues de la adicion de cada nucleotido o despues de la adicion de los cuatro nucleotidos.

En los metodos, todos los nucleotidos pueden ponerse en contacto con el objetivo simultaneamente, es decir, una composicion que comprende todos los nucleotidos diferentes que se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y posterior a la eliminacion del marcador.

Los metodos pueden comprender una primera etapa y una segunda etapa, donde en la primera etapa, una primera composicion que comprende dos de los cuatro tipos de nucleotidos se pone en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y posterior a la eliminacion del marcador, y donde en la segunda etapa, una segunda composicion que comprende los dos nucleotidos no incluidos en la primera composicion se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y posterior a la eliminacion del marcador, y donde la primera etapa y la segunda etapa pueden repetirse opcionalmente una o mas veces.

Los metodos descritos en la presente descripcion pueden comprender ademas una primera etapa y una segunda etapa, donde en la primera etapa, una composicion que comprende uno de los cuatro nucleotidos se pone en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y posterior a la eliminacion del marcador, y donde en la segunda etapa, una segunda composicion que comprende los tres nucleotidos no incluidos en la primera composicion se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

posterior a la eliminacion del marcador, y donde la primera etapa y la segunda etapa pueden repetirse opcionalmente una o mas veces.

Los metodos descritos en la presente descripcion pueden comprender ademas una primera etapa y una segunda etapa, donde en la primera etapa, una primera composicion que comprende tres de los cuatro nucleotidos se pone en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y posterior a la eliminacion del marcador, y donde en la segunda etapa, una composicion que comprende el nucleotido no incluido en la primera composicion se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleotidos no incorporados se eliminan antes de la deteccion y posterior a la eliminacion del marcador, y donde la primera etapa y la segunda etapa pueden repetirse opcionalmente una o mas veces.

En un aspecto adicional, la invencion caracteriza un estuche, donde el estuche incluye: (a) los nucleotidos individuales, donde cada nucleotido tiene una base que esta unida a un marcador detectable a traves de un enlazador escindible, y donde el marcador detectable unido a cada nucleotido puede distinguirse con la deteccion del marcador detectable usado para los otros tres nucleotidos, y (b) materiales de envase para estos. El estuche puede incluir ademas una enzima y los amortiguadores apropiados para la accion de la enzima.

Los nucleotidos/nucleosidos son adecuados para usar en muchas metodologfas diferentes basadas en el ADN, que incluyen la sfntesis de ADN y los protocolos de secuenciacion de ADN.

De acuerdo con otro aspecto de la invencion, un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido objetivo comprende monitorear la incorporacion secuencial de nucleotidos complementarios, en donde los nucleotidos comprenden un marcador detectable unido a la porcion de la base del nucleotido a traves de un enlazador escindible, detectar la incorporacion mediante el monitoreo del marcador y retirar el marcador para permitir que se produzca la incorporacion del nucleotido adicional.

Descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra la estructura de un nucleotido ejemplar util en la invencion. Para cada estructura, X puede ser H, fosfato, difosfato o trifosfato. Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes, y pueden seleccionarse de H, OH, o cualquier grupo que puede transformarse en un OH.

La Figura 2 muestra estructuras de enlazadores utiles en la invencion, que incluyen (1) enlazadores de disulfuro ademas de una definicion general de los enlazadores que pueden usarse.

La Figura 3 muestra algunas moleculas funcionales utiles en la invencion, que incluyen algunos enlazadores escindibles. En estas estructuras, R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes, y pueden ser H, OH, o cualquier grupo que puede transformarse en un grupo OH, incluyendo un grupo carbonilo. R3 representa uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados de grupos alquilo, alcoxilo, amino o halogeno.

La Figura 4 muestra un gel desnaturalizante que muestra la incorporacion del trifosfato del Ejemplo 1 usando polimerasa Klenow.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a nucleotidos y nucleosidos que se modifican mediante la union de un marcador a traves de un enlazador escindible, lo que hace que la molecula sea util en tecnicas donde la molecula marcada interactua con una enzima, tales como reacciones de secuenciacion, sfntesis de polinucleotidos, amplificacion de acidos nucleicos, ensayos de hibridacion de acidos nucleicos, estudios de polimorfismo de nucleotido unico, tecnicas que usan enzimas tales como polimerasa, transcriptasa inversa, transferasa terminal, tecnicas que usan dNTPs marcados (por ejemplo, traduccion de nick, marcaje de cebadores aleatorios, marcaje final (por ejemplo, con desoxinucleotidiltransferasa terminal), transcripcion inversa o amplificacion de acido nucleico).

Como se conoce en la tecnica, un "nucleotido" consiste en una base nitrogenada, un azucar, y uno o mas grupos fosfato. En el ARN, el azucar es una ribosa, y en el ADN una desoxirribosa, es decir, un azucar que carece de un grupo hidroxilo que esta presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas son adenosina (A) y guanidina (G), y las pirimidinas son citidina (C) y timidina (T) (o en el contexto del ARN, uracilo (U)). El atomo C-1 de la desoxirribosa esta unido al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleotido es ademas un ester de fosfato de un nucleosido, donde la esterificacion se produce en el grupo hidroxilo unido al C-5 del azucar. Los nucleotidos son usualmente mono, di o trifosfatos.

Un "nucleosido" es estructuralmente similar a un nucleotido, pero carece de las porciones fosfato. Un ejemplo de un analogo de nucleosido serfa uno en donde se une el marcador a la base y no hay ningun grupo fosfato unido a la molecula de azucar.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Aunque la base se menciona normalmente como una purina o pirimidina, el experto apreciara que los derivados y analogos estan disponibles los cuales no alteran la capacidad de experimentar el apareamiento de bases de nucleotido o nucleosido de Watson-Crick. "Derivado" o "analogo" significa un compuesto o molecula cuya estructura central es la misma que, o se parece mucho a la de un compuesto parental, pero que tiene una modificacion qufmica o ffsica, como un grupo lateral diferente o adicional, lo que permite que el derivado de nucleotido o nucleosido se una a otra molecula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. Los derivados deben ser capaces de experimentar apareamiento de Watson-Crick. "Derivado" y "analogo" significan ademas un derivado sintetico de nucleotido o nucleosido que tiene porciones de base modificadas y/o porciones de azucar modificadas. Tales derivados y analogos se discuten en, por ejemplo, Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) y Uhlman y otros, Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los analogos de nucleotidos pueden comprender ademas enlaces fosfodiester modificados, que incluyen enlaces fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, fosforanilidato y fosforamidato. Los analogos deben ser capaces de experimentar el apareamiento de bases de Watson-Crick. "Derivado" y "analogo", como se usa en la presente descripcion, pueden usarse indistintamente, y son abarcados por los terminos "nucleotido" y "nucleosido" como se definen en la presente descripcion.

La presente invencion puede hacer uso de los marcadores detectables convencionales. La deteccion puede llevarse a cabo por cualquier metodo adecuado, que incluyen espectroscopfa de fluorescencia o mediante otros medios opticos. El marcador preferido es un fluoroforo, el cual, despues de la absorcion de energfa, emite radiacion a una longitud de onda definida. Se conocen muchos marcadores fluorescentes adecuados. Por ejemplo, Welch y otros (Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999) describe porciones fluorescentes dansil funcionalizadas que pueden usarse en la presente invencion. Zhu y otros (Cytometry 28:206-211, 1997) describe el uso de los marcadores fluorescentes Cy3 y Cy5, los cuales pueden usarse ademas en la presente invencion. Marcadores adecuados para usar se describen ademas en Prober y otros (Science 238:336-341,1987); Connell y otros (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge y otros (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) y Smith y otros (Nature 321:674, 1986). Otros marcadores fluorescentes disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, fluorescefna, rodamina (que incluye TMR, texas red y Rox), alexa, bodipy, acridina, cumarina, pireno, benzantraceno y las cianinas.

Los marcadores multiples pueden usarse ademas en la invencion. Por ejemplo, casetes FRET bifluoroforo (Tet. Letts.46:8867-8871, 2000) son bien conocidos en la tecnica y pueden usarse en la presente invencion. Los sistemas dendrimericos multi fluor (J. Amer. Chem. Soc.123:8101-8108, 2001) pueden usarse tambien.

Aunque se prefieren los marcadores fluorescentes, otras formas de marcadores detectables resultaran utiles para aquellos con experiencia en la tecnica. Por ejemplo, las micropartfculas, que incluyen puntos cuanticos (Empodocles, y otros, Nature 399:126-130, 1999), nanopartfculas de oro (Reichert y otros, Anal. Chem.72:6025-6029, 2000), microperlas (Lacoste y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 97 (17):9461-9466, 2000), y marcadores detectables por espectrometrfa de masas, pueden usarse.

Los marcadores de componentes multiples pueden usarse ademas en la invencion. Un marcador de componentes multiples es uno que es dependiente de la interaccion con un compuesto adicional para la deteccion. El marcador de componentes multiples mas comun que se usa en biologfa es el sistema biotina estreptavidina. La biotina se usa como el marcador unido a la base del nucleotido. La estreptavidina se anade despues por separado para permitir que se produzca la deteccion. Otros sistemas de componentes multiples estan disponibles. Por ejemplo, el dinitrofenol tiene un anticuerpo fluorescente disponible comercialmente que puede usarse para la deteccion.

El marcador (o el marcador y la construccion del enlazador) puede ser de un tamano o estructura suficiente para actuar como un bloque para la incorporacion de otro nucleotido sobre el nucleotido de la invencion. Esto permite que se lleve a cabo la polimerizacion controlada. El bloque puede deberse al impedimento esterico, o puede deberse a una combinacion de tamano, carga y estructura.

La invencion sera descrita adicionalmente con referencia a los nucleotidos. Sin embargo, a menos que se indique lo contrario, se pretende que la referencia a los nucleotidos se aplique ademas a los nucleosidos. La invencion se describira adicionalmente con referencia al ADN, aunque la descripcion sera aplicable ademas al ARN, PNA y otros acidos nucleicos, a menos que se indique lo contrario.

Los nucleotidos modificados de la invencion usan un enlazador escindible para unir el marcador al nucleotido. El uso de un enlazador escindible asegura que el marcador puede, si se requiere, retirarse despues de la deteccion, evitando cualquier senal de interferencia con cualquier nucleotido marcado incorporado posteriormente.

Los enlazadores escindibles se conocen en la tecnica, y puede aplicarse la qufmica convencional para unir un enlazador a una base de nucleotido y un marcador. El enlazador puede escindirse por la exposicion a radicales, metales, agentes reductores o de oxidacion. Los enlazadores adecuados pueden adaptarse de los grupos de bloqueo qufmicos estandar, como se describe en Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Los enlazadores de escision adicionales adecuados que se usan en la sfntesis de fase solida se describen en Guillier y otros (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El uso del termino "enlazador escindible" no pretende implicar que se requiere el enlazador completo para eliminarse de la base del nucleotido. El sitio de escision puede situarse en una posicion en el enlazador que asegura que parte del enlazador permanece unido a la base del nucleotido despues de la escision.

El enlazador puede unirse en cualquier posicion en la base del nucleotido siempre y cuando el apareamiento de base de Watson-Crick aun pueda llevarse a cabo. En el contexto de las bases purinas, se prefiere que el enlazador se una a traves de la posicion 7 de la purina o el analogo desazapurina preferido, a traves de una purina modificada en 8, a traves de una adenosina modificada en N-6 o una guanina modificada en N-2. Para las pirimidinas, la union es preferentemente a traves de la posicion 5 en la citosina, timidina o el uracilo y la posicion N-4 en la citosina. Las estructuras de nucleotidos adecuados se muestran en la Figura 1. Para cada estructura en la Figura 1, X puede ser H, fosfato, difosfato o trifosfato. R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes, y pueden seleccionarse de H, OH, o cualquier grupo que puede transformarse en un OH, que incluye, pero no se limita al, carbonilo.

Los enlazadores adecuados se muestran generalmente en la Figura 2 e incluyen, pero no se limitan a, enlazadores disulfuro (1), escision bajo condiciones reductoras, condiciones oxidativas, escision a traves del uso de enlazadores de captura de seguridad y la escision por mecanismos de eliminacion.

D. Escision bajo condiciones reductoras

Existen muchos enlazadores conocidos que son susceptibles a la escision reductora. La hidrogenacion catalftica usando los catalizadores basados en paladio se han usado para escindir el bencilo y los grupos benciloxicarbonilo. La reduccion de enlaces disulfuro se conoce ademas en la tecnica.

E. Escision bajo condiciones oxidativas

Los enfoques basados en la oxidacion son bien conocidos en la tecnica. Estos incluyen la oxidacion de grupos p- alcoxibencilo y la oxidacion de los enlazadores de azufre y selenio. El uso de yodo acuoso para escindir disulfuros y otros enlazadores basados en selenio o azufre estan tambien dentro del alcance de la invencion.

F. Enlazadores de captura de seguridad

Los enlazadores de captura de seguridad son aquellos que se escinden en dos etapas. En un sistema preferido, la primera etapa es la generacion de un centro nucleofflico reactivo, a continuacion de una segunda etapa que implica una ciclacion intramolecular que resulta en la escision. Por ejemplo, los enlaces ester levulfnico pueden tratarse con hidracina o fotoqufmica para liberar una amina activa, que puede ciclarse despues para escindir un ester en otra parte de la molecula (Burgess y otros, J. Org. Chem. 62:5165-5168, 1997).

G. Escision por mecanismos de eliminacion

Las reacciones de eliminacion pueden usarse tambien. Por ejemplo, puede usarse la eliminacion catalizada por bases de grupos tales como Fmoc y cianoetilo, y la eliminacion reductora catalizada por paladio de los sistemas alflicos.

Asf como el sitio de escision, el enlazador puede comprender una unidad espaciadora. El espaciador separa la base del nucleotido del sitio de escision o el marcador. La longitud del enlazador no es importante siempre que el marcador se mantenga a una distancia suficiente del nucleotido para no interferir con ninguna interaccion entre el nucleotido y una enzima.

Los nucleotidos modificados pueden comprender ademas grupos adicionales o modificaciones en el grupo azucar. Por ejemplo, se puede preparar un derivado de didesoxirribosa, que carece de dos oxfgenos en la estructura de anillo de ribosa (en las posiciones 2' y 3'), y puede usarse como un bloque para la incorporacion adicional de nucleotidos en una cadena de oligonucleotido en crecimiento. El grupo protector esta destinado a prevenir la incorporacion de nucleotidos en una cadena de polinucleotidos naciente, y puede eliminarse bajo condiciones definidas para permitir que se produzca la polimerizacion. A diferencia de la tecnica anterior, no hay un marcador detectable unido en la posicion 3' de la ribosa. Esto asegura que el impedimento esterico con la enzima polimerasa se reduzca, aunque permite aun el control de la incorporacion usando el grupo protector.

El experto apreciara como unir un grupo protector adecuado al anillo de ribosa para bloquear las interacciones con el 3'- OH. El grupo protector puede unirse directamente en la posicion 3', o puede unirse en la posicion 2' (el grupo protector es de tamano o carga suficientes para bloquear las interacciones en la posicion 3'). Como alternativa, el grupo protector puede unirse en ambas posiciones 3' y 2', y puede escindirse para exponer el grupo 3'OH.

Los grupos protectores adecuados resultaran evidentes para el experto, y pueden formarse de cualquier grupo protector adecuado descrito en Green y Wuts, supra. El grupo protector debe eliminarse (o modificarse) para producir un grupo 3' OH. El proceso que se usa para obtener el grupo 3' OH puede ser cualquier reaccion qufmica o enzimatica adecuada.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El enlazador labil puede consistir en funcionalidad escindible bajo condiciones identicas para el bloqueo. Esto hara mas eficiente el proceso de desproteccion ya que solo se necesitara un solo tratamiento para escindir tanto el marcador como el bloque. De este modo, el enlazador puede contener grupos funcionales como se describio en la Figura 3, los que podrfan escindirse con la funcionalidad hidroxilo ya sea en el nucleosido residual o en el marcador eliminado. El enlazador puede consistir ademas en una funcionalidad qufmica completamente diferente que resulta ser labil a las condiciones que se usan para escindir el bloque.

El termino "alquilo" cubre los grupos alquilo de ambas, la cadena recta y la cadena ramificada. A menos que el contexto indique lo contrario, el termino "alquilo" se refiere a grupos que tienen de 1 a 8 atomos de carbono, y tfpicamente de 1 a 6 atomos de carbono, por ejemplo de 1 a 4 atomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil butilo, 3-metil butilo, y n-hexilo y sus isomeros.

Los ejemplos de grupos cicloalquilo son aquellos que tienen de 3 a 10 atomos del anillo, los ejemplos particulares incluyen aquellos derivados del ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano y cicloheptano, bicicloheptano y decalina.

Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etenil (vinil), 1-propenilo, 2-propenilo (alilo), isopropenilo, butenilo, buta-1,4-dienilo, pentenilo, y hexenilo.

Los ejemplos de grupos cicloalquenilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclopentadienilo y ciclohexenilo.

El termino alcoxi se refiere a un alcoxi de C1-6 a menos que se indique lo contrario:-OR, en donde R es un grupo alquilo de C1-6.Los ejemplos de grupos alcoxi de C1-6 incluyen, pero no se limitan a, -OMe (metoxi), -OEt (etoxi), -O(nPr) (n- propoxi), -O(iPr) (isopropoxi), -O(nBu) (n-butoxi), -O(sBu) (sec-butoxi), -O(iBu) (isobutoxi), y -O(tBu) (terc-butoxi).

El termino amino se refiere a grupos del tipo NR1R2, en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de hidrogeno, un grupo alquilo de C1-6 (referido ademas como alquilamino de C1-6 o di alquilamino de C1-6).

El termino "halogeno" como se usa en la presente descripcion incluye el fluor, cloro, bromo y yodo.

Las moleculas de nucleotidos de la presente invencion son adecuadas para usar en muchos metodos diferentes donde se requiere la deteccion de nucleotidos.

Los metodos de secuenciacion de ADN, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos num.5,302,509 pueden llevarse a cabo usando los nucleotidos.

Un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido objetivo puede llevarse a cabo al contactar el polinucleotido objetivo por separado con los diferentes nucleotidos para formar el complemento al aquel del polinucleotido objetivo y detectar la incorporacion de los nucleotidos. Tal metodo usa la polimerizacion, en la cual una enzima polimerasa extiende la cadena complementaria incorporando el nucleotido correcto complementario al del objetivo. La reaccion de polimerizacion requiere ademas un cebador especffico para iniciar la polimerizacion.

Para cada ciclo, la incorporacion del nucleotido marcado se lleva a cabo por la enzima polimerasa, y despues se determina el evento de incorporacion. Existen muchas enzimas polimerasa diferentes, y sera evidente para la persona con experiencia en la tecnica, cual es la mas apropiada para usar. Las enzimas preferidas incluyen la aDn polimerasa I, el fragmento Klenow, ADN polimerasa III, ADN polimerasa T4 o T7, Taq polimerasa o vent polimerasa. Ademas, puede usarse una polimerasa disenada mediante ingenierfa para tener propiedades especfficas.

Los metodos de secuenciacion se llevan a cabo preferentemente con el polinucleotido objetivo dispuesto en un soporte solido. Los polinucleotidos objetivo multiples pueden inmovilizarse sobre el soporte solido a traves de moleculas enlazantes, o pueden unirse a partfculas, por ejemplo, microesferas, que pueden unirse ademas a un material de soporte solido.

Los polinucleotidos pueden unirse al soporte solido por una serie de medios, que incluyen el uso de interacciones biotina-avidina. Los metodos para la inmovilizacion de polinucleotidos sobre un soporte solido son bien conocidos en la tecnica, e incluyen tecnicas litograficas y "punteo" de polinucleotidos individuales en posiciones definidas sobre un soporte solido. Los soportes solidos adecuados son conocidos en la tecnica, e incluyen portaobjetos de vidrio y perlas, superficies de silicio y ceramica y materiales plasticos. El soporte es normalmente una superficie plana aunque pueden usarse ademas perlas microscopicas (microesferas) y a su vez, pueden unirse a otro soporte solido por medios conocidos. Las microesferas pueden ser de cualquier tamano adecuado, tfpicamente en el intervalo de 10 nm a 100 nm de diametro. En una modalidad preferida, los polinucleotidos se adhieren directamente sobre una superficie plana, preferentemente una superficie de vidrio plana. La union sera preferentemente por medio de un enlace covalente. Preferentemente, las matrices que se usan son matrices de una sola molecula que comprenden polinucleotidos en distintas areas opticamente resueltas, por ejemplo, como se describe en la solicitud internacional num. WO 00/06770.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El metodo de secuenciacion puede llevarse a cabo en ambas matrices de una sola molecula de polinucleotido y moleculas de multiples polinucleotidos, es decir, matrices de distintas moleculas de polinucleotido individuales y matrices de regiones distintas que comprenden copias multiples de una molecula de polinucleotido individual. Las matrices de una sola molecula permiten que cada polinucleotido individual se resuelva por separado. Se prefiere el uso de matrices de una sola molecula. La secuenciacion de matrices de una sola molecula permite que se forme una matriz espacialmente direccional no destructiva.

El metodo hace uso de la reaccion de polimerizacion para generar la secuencia complementaria del objetivo. Las condiciones necesarias para que se produzca la polimerizacion seran evidentes para el experto.

Para llevar a cabo la reaccion de la polimerasa normalmente sera necesario hibridar primero una secuencia del cebador con el polinucleotido objetivo, la secuencia del cebador es reconocida por la enzima polimerasa y actua como un sitio de iniciacion para la extension posterior de la cadena complementaria. La secuencia del cebador puede anadirse como un componente separado con respecto al polinucleotido objetivo. Como alternativa, el cebador y el polinucleotido objetivo pueden ser cada uno parte de una molecula de cadena simple, donde la porcion del cebador forma un duplex intramolecular con una parte del objetivo, es decir, una estructura de lazo en horquilla. Esta estructura puede inmovilizarse en el soporte solido en cualquier punto de la molecula. Otras condiciones necesarias para llevar a cabo la reaccion de la polimerasa, que incluyen temperatura, pH, composiciones amortiguadoras, etc., resultaran evidentes para aquellos con experiencia en la tecnica.

Los nucleotidos modificados de la invencion se ponen en contacto despues con el polinucleotido objetivo, para permitir que se produzca la polimerizacion. Los nucleotidos pueden anadirse secuencialmente, es decir, la adicion por separado de cada tipo de nucleotido (A, T, G o C) o anadirse juntos. Si se anaden juntos, se prefiere que cada tipo de nucleotidos se marque con un marcador diferente.

Esta etapa de polimerizacion se deja proceder durante un tiempo suficiente para permitir la incorporacion de un nucleotido.

Los nucleotidos que no se incorporan se eliminan a continuacion, por ejemplo, sometiendo la matriz a una etapa de lavado, y a continuacion se puede llevar a cabo la deteccion de los marcadores incorporados.

La deteccion puede ser por medios convencionales, por ejemplo, si el marcador es una porcion fluorescente, la deteccion de una base incorporada puede llevarse a cabo mediante el uso de un microscopio de barrido confocal para explorar la superficie de la matriz con un laser, para representar la imagen de un fluoroforo unido directamente a la base incorporada. Como alternativa, un detector 2-D sensible, tal como un detector de carga acoplado (CCD), puede usarse para visualizar las senales individuales generadas. Sin embargo, otras tecnicas tales como la microscopfa optica de barrido en campo cercano (SNOM) estan disponibles, y pueden usarse cuando se forman las imagenes de las matrices densas. Por ejemplo, usando SNOM, los polinucleotidos individuales pueden distinguirse cuando se separan una distancia de menos de 100 nm, por ejemplo, 10 nm a 10pm. Para una descripcion de la microscopfa optica de barrido de campo cercano, ver Moyer y otros, Laser Focus World 29:10, 1993.Un aparato adecuado usado para formar las imagenes de las matrices de polinucleotidos se conocen y el establecimiento de la tecnica sera evidente para el experto.

Despues de la deteccion, el marcador puede eliminarse usando condiciones adecuadas que escinden el enlazador.

El uso de los nucleotidos modificados no se limita a las tecnicas de secuenciacion del ADN, y otras tecnicas, que incluyen la sfntesis de polinucleotidos, ensayos de hibridacion de ADN y estudios de polimorfismo de un solo nucleotido pueden llevarse a cabo usando los nucleotidos de la invencion. Cualquier tecnica que implique la interaccion entre un nucleotido y una enzima puede hacer uso de las moleculas de la invencion. Por ejemplo, la molecula puede usarse como sustrato para una transcriptasa inversa o una enzima transferasa terminal.

Las estructuras adecuadas se describen en los siguientes Ejemplos y se muestran en las figuras adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Sfntesis de un Enlace Disulfuro.

5

10

15

20

25

imagen1

tButil-N-(2-mercaptoetil) carbamato (3 mmol, 0.5 mL) se anadio gota a gota a una solucion de 1.32g (6.0 mmol) de aldritiol en 15 mL de MeOH. Despues de 1.5 h la reaccion se habia completado y el disolvente se evaporo. El producto bruto se purifico por cromatografia sobre silice con acetato de etilo: eter de petroleo (1:4). El producto 1a se obtuvo como un aceite ligeramente amarillo (0.76 g, 2.67 mmol, 89%). 1H NMR (500 Mhz, D6-DMSO): d=1.38 (s, 9 H, tBu), 2.88 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, SCH2) 3.20 (q, J = 6.6 Hz, 2 H, CH2NH) , 7.02 (bs, 1 H, NH), 7.24 (ddd, J = 7.3 Hz, J = 4.9 Hz, J = 1.0 Hz, 1 H, H-5), 7.77 (dt, J = 8.1 Hz, J = 1.0 Hz, 1 H, H-3), 7.82 (ddd, J = 8.1 Hz, J = 7.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H, H-4), 8.46 (ddd, J = 4.9 Hz, J = 1.8 Hz, J = 1.0 Hz, 1 H, H-6).

imagen2

Para desproteger la amina de 1a, se disolvieron 17 mg de 1a (60 pmol) en una mezcla de 0.5 mL de DCM y 0.5 mL de acido trifluoracetico. Esta mezcla se agito durante 2.5 h a temperatura ambiente y despues se eliminaron los disolventes bajo presion reducida. El residuo se disolvio tres veces nuevamente en 2 mL de DCM y se evaporo hasta secarse. El producto desprotegido se seco a alto vacio durante 3 h y despues se disolvio en 1 mL de DMF seco. Se asumio que la desproteccion se habia completado.

A una solucion de 15 mg de 5-carboxi tetrametil rodamina (35 pmol) en 2 mL de DMF se anadieron 8.0 mg de N-hidroxi succinimida (70 pmol) y 7.8 mg DCC (38 pmol). La mezcla se agito durante 6 h en la oscuridad. Despues se anadieron 22 pL de DIPEA (126 pmol) y la solucion de desproteccion 1a en 1 mL de DMF. Despues de agitar la mezcla de reaccion toda la noche en la oscuridad, se elimino el disolvente bajo presion reducida. El residuo se disolvio en DCM y se lavo con solucion saturada de NaCl. Despues de secar sobre MgSo4 la mezcla en bruto se purifico sobre silice con CHCl3:MeOH (3:1) como solvente. Se aislo 1b como un solido de color rojo oscuro con un rendimiento del 90% (19.2 mg, 31.4 pmol). 1H NMR (500 MHz, D6-DMSO) : 5 = 3.09 (t, J = 6.7 Hz, 2 H, SCH2), 3.63 (q, J = 6.2 Hz, 2 H, CH2NH), 6.48 - 6.53 (m, 6 H, H-Antraceno), 7.23-7.26 [m, 1 H, H-5 (piridina)], 7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1 Hz, H-3), 7.81 - 7.82 [m, 2 H,

5

10

15

20

25

30

35

40

H-3 +H-4 (piridina)], 8.21 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, H-4), 8.43 (s, 1 H, H-6), 8.47 [dt, J = 4.7 Hz, J= 1.3 Hz, 1 H, H-6 (piridina)], 9.03 (t, J = 5.2 Hz, 1 H, NH).

imagen3

Se anadio acido mercaptopropionico (20.6pmol, 1.8 mL), a una solucion de 19.6 mg de 1b (32.7 pmol) en 2 mL de MeOH. La mezcla se agito durante 2.5 h en la oscuridad. El solvente se elimino bajo presion reducida. El producto crudo se purifico por cromatografla sobre sllice con CHCl3:MeOH:AcOH 15:1:0.5 como la mezcla del solvente. Se pudo aislar 15.5 mg (26 pmol, 80 %) de cristales de color rojo oscuro de 1c. 1H NMR (500 MHz, D2O): 5 = 2.53 (t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH2COOH), 2.88 (t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH2CH2COOH), 2.96 - 2.99 (m, 2 H, CH2CH2NH), 3.73 (t, J = 6.3 Hz, 2 H, CH2NH), 6.53 (d, J = 2.4 Hz, 2 H, H-Antraceno), 6.81 (dd, J = 9.5 Hz, J = 4.5 Hz, 2 H, H-Antraceno), 7.12 (d, J = 9.5 Hz, 2 H, H- Antraceno), 7.48 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, H-3), 7.95 (dd, J = 8.1 Hz, J = 1.9 Hz, 1 H, H-2) 8.13 (d, J = 1.9 Hz, 1 H, H-1).+ve electro pulverization (C30H31N3O6S2): esperado 593.17; encontrado 594.3 [M+H], 616.2 [M+Na].

imagen4

A una solucion de 25.8 mg de 1c (43.4 pmol) en 3 mL de DMF (seco) se anadio 9.9 mg N-hidroxi succinimida (86.8 pmol) y 9.7 mg de DCC (47.1 pmol). La mezcla se agito durante 5 h en la oscuridad a temperatura ambiente y despues se puso en la nevera durante toda la noche. La mezcla se filtro a traves de un tapon de algodon en un nuevo matraz y a esto se anadio una solucion de 865 pL de propargilamino dUTP (14.7 pmol, 17 pmol en 1 mL de H2O) y 3 mL de amortiguador borato sodico (solucion 0.1 M, pH 9). La mezcla se agito toda la noche. Despues de la elimination de los disolventes el residuo se disolvio en tan poca agua como fue posible y se purifico mediante HPLC. Se uso una columna Zorbax C18 con bicarbonato de trietilamonio 0.1 M (TEAB) y acetonitrilo como amortiguadores. 31P NMR (400 MHz, D2O) : 5 = -4.73 (d), -9.93 (d), 19.03 (t).-ve electro pulverizacion (C42H47N6O19P3S2 asumiendo 4 H+ contra iones): esperado 1096.16; encontrado 1092.9.UV en Agua: A(max) = 555 nm A(555) = 0.885 (c = 0.036 pmol).

Se incorporo satisfactoriamente trifosfato (1) usando ADN polimerasa de Klenow. La reaction se realizo en las siguientes condiciones:50 mM Tris. HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCh, 2pM compuesto 3, 100 nM DNA molde (marcado previamente con P32 y T4 polinucleotido quinasa) y 10 unidades de exo-Klenow comercial (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, uSa). Los moldes de ADN fueron horquillas auto complementarias (5'-TACCgTCgACgTCgACgCT ggCg-AgCgT gCT gCggTTTTT (C6-

amino)TTACCgCAgCACgCTCgCCAgCg; Sec. con num. de ident:1). La reaccion se realizo en un volumen de 100 pL a 37 °C con puntos de tiempo tomados a 0, 1, 3, 5 y 10 min. Los productos de reaccion se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (8 M de urea) al 20 % y se formaron imagenes en un Phosphorlmager para Typhoon. Se observo una extension de una sola base completa en 1 minuto que indica una incorporation eficiente de la polimerasa (gel de enlace disulfuro Figura. 4). Un segundo conjunto de carriles se muestra en donde el material se expone al DTT despues de la incorporacion. Un cambio de banda diferente puede observarse el cual muestra la eliminacion del colorante del constructo de ADN, de este modo se ha mostrado un ciclo de incorporacion de la polimerasa y de escision que usa este compuesto de disulfuro.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para detectar la extension de un cebador hibridado a un polinucleotido objetivo, que comprende:

   (a) proporcionar al menos un nucleotido que comprende

   (1) un marcador fluorescente unido mediante un enlazador a la base de nucleotido, y

   (2) un grupo protector Unido al oxfgeno 2' o 3' del azucar nucleotido,

   en donde el enlazador puede ser escindido por exposicion a radicales, metales, agentes reductores o agentes oxidantes;

   (b) extender el cebador hibridado con el nucleotido solamente si la base de nucleotidos es complementaria a la base en la posicion correspondiente del polinucleotido objetivo; y

   (c) detectar la presencia del marcador en el cebador extendido; detectando asf la extension del cebador.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la etapa (a) proporciona cuatro nucleotidos diferentes.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas:

   (d) exponer el cebador extendido a radicales, metales, agentes reductores o agentes oxidantes para escindir el marcador fluorescente.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el enlazador y el grupo protector son escindibles bajo condiciones identicas.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, que comprende ademas:

   (d) exponer el cebador extendido a un unico conjunto de condiciones de escision para eliminar el enlazador y el grupo protector.
6. 6. El metodo de las reivindicaciones 1-5, en donde la base es una purina, pirimidina o deazapurina.
7. 7. El metodo de las reivindicaciones 1-6, en donde el enlazador escindible comprende una funcionalidad hidroxilo protegida.
8. 8. El metodo de las reivindicaciones 1-7 en donde el enlazador comprende un sistema alflico escindible.
9. 9. El metodo de las reivindicaciones 1-8 en donde el polinucleotido esta unido a un soporte solido.
10. 10. Un cebador extendido que comprende un nucleotido que tiene una base que esta enlazada a un marcador fluorescente a traves de un enlazador escindible, en donde la molecula tiene una porcion de azucar ribosa o desoxirribosa que comprende un grupo protector unido a traves del atomo de oxfgeno 2' o 3' en donde el enlazador comprende un sistema alflico escindible.
11. 11. Una matriz de cebadores extendidos que comprenden cada uno un nucleotido que tiene una base que esta enlazada a un marcador fluorescente a traves de un enlazador escindible, en donde la molecula tiene una porcion de azucar ribosa o desoxirribosa que comprende un grupo protector unido a traves del atomo de oxfgeno 2' o 3' en donde el enlazador comprende un sistema alflico escindible, conteniendo la matriz cuatro nucleotidos diferentes.
12. 12. El cebador extendido de la reivindicacion 10 o la matriz de la reivindicacion 11, en donde el enlazador y el grupo protector son escindibles bajo condiciones identicas.