ES2643059T3

ES2643059T3 - Sustrato de cultivo para células madre pluripotentes humanas y uso del mismo

Info

Publication number: ES2643059T3
Application number: ES14187130.1T
Authority: ES
Inventors: Kiyotoshi Sekiguchi; Sugiko Futaki; Yukimasa Taniguchi; Maria Hayashi; Norio Nakatsuji; Takamichi Miyazaki; Eihachiro Kawase; Hirofumi Suemori
Original assignee: Osaka University NUC; Kyoto University NUC
Current assignee: Kyoto University NUC; University of Osaka NUC
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2030-10-07
Also published as: EP2487236B1; US8877493B2; EP2487236A1; EP2487236A4; DK2821480T3; WO2011043405A1; ES2615555T3; CN104498430A; EP2821480A1; DK2487236T3; CN102597217A; EP2821480B1; US20120220031A1; JP2011078370A; CN102597217B; JP5590646B2

Abstract

Un sustrato de cultivo para el cultivo de células madre pluripotentes humanas, estando recubierto el sustrato de cultivo con fragmento E8 de laminina humana α5β1γ1 o fragmento E8 de laminina humana α3β3γ2, en el que la concentración de recubrimiento de fragmento E8 de laminina humana α5β1γ1 o fragmento E8 de laminina humana α3β3γ2 es de 0,5 a 25 μg/cm2.

Description

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DESCRIPCION

Sustrato de cultivo para celulas madre pluripotentes humanas y uso del mismo Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un sustrato de cultivo para celulas madre pluripotentes humanas.

Antecedentes de la tecnica

Las celulas madre pluripotentes humanas, tales como las celulas ES humanas y las celulas iPS humanas, han atrafdo la atencion mundial por su aplicacion potencial en medicina regenerativa. Para el cultivo y el mantenimiento de celulas madre pluripotentes humanas en un estado pluripotente, por lo general se emplea el co-cultivo con celulas alimentadoras tales como fibroblastos de raton o humanos, pero el uso de celulas alimentadoras es una gran restriccion a la aplicacion clmica de celulas madre pluripotentes humanas. Con el fin de resolver este problema, se han probado diversas protemas de adhesion en lugar de celulas alimentadoras para su uso como una matriz extracelular para las celulas ES humanas y se notifico que el Matrigel (nombre comercial), que se compone de componentes de la membrana basal extrafdos y purificados de sarcoma EHS de raton, conocido por producir componentes de la membrana basal en exceso, es muy eficaz en el mantenimiento de la pluripotencia. Sin embargo, puesto que el Matrigel es un producto derivado de raton y una mezcla compleja de protemas y polisacaridos xenogenos, no es adecuado para el cultivo de celulas madre pluripotentes humanas en medicina regenerativa.

Para la aplicacion de las celulas madre pluripotentes humanas en medicina regenerativa, el cultivo celular debe realizarse en condiciones sin xenogenos, en las que el sistema de cultivo no contenga ningun componente xenogeno y en condiciones sin celulas alimentadoras, en las que no se utilizan celulas alimentadoras. Sobre la base de estos requisitos, se ha probado la vitronectina humana o la fibronectina humana para su uso como una matriz extracelular humana, pero en comparacion con el Matrigel, ninguna de las dos es superior en el mantenimiento del estado indiferenciado de las celulas ES humanas o en la eficiencia de union de las mismas y son insatisfactorias en terminos de calidad, disponibilidad de material de origen, seguridad, etc. Por tanto, en el desarrollo de matrices extracelulares adecuadas para el cultivo de mantenimiento de celulas madre pluripotentes humanas, hay mucho que mejorar, y se desea fuertemente el desarrollo de una nueva tecnologfa de cultivo de celulas madre pluripotentes humanas utilizando una matriz extracelular humana que tenga una composicion qmmica uniforme.

La laminina es una protema de adhesion celular de gran importancia presente en la membrana basal. La laminina es una glicoprotema heterotrimerica grande que consiste en tres subunidades denominadas cadenas a, p y y y tiene un peso molecular de 800.000 Da. Las tres subunidades se asocian entre sf a traves de sus dominios de superenrollamiento en las regiones C-terminales y se ensamblan en un heterotnmero que se estabiliza mediante enlaces disulfuro dentro del mismo. Los presentes inventores examinaron el tipo de integrinas expresadas en las celulas ES humanas e informaron que la integrina a6p1 es un receptor de adhesion de gran importancia de celulas ES humanas y que las lamininas humanas recombinantes (en particular, la laminina 332, compuesta de cadenas a3, p3 y y2, y la laminina 511, compuesta de cadenas a5, pi y y1) son eficaces para el mantenimiento de la pluripotencia de las celulas ES humanas (vease la Literatura no de patente 1). Los presentes inventores tambien informaron que la laminina 511 tiene una afinidad muy alta por la integrina a6p1 y que el fragmento E8 de la laminina 511 tiene una actividad de union a la integrina a6p1 equivalente a la de la laminina 511 de longitud completa (vease no la Literatura no de patente 2).

Sin embargo, puesto que la laminina se une a diversas moleculas de la superficie celular y moleculas de la matriz extracelular, deben ser superarse muchos problemas tecnicos para la preparacion de una laminina pura y homogenea sin impurezas. Ademas, puesto que cada una de las tres subunidades de la laminina tiene un peso molecular tan grande como de 200.000 a 400.000 Da, la molecula heterotrimerica ensamblada a partir de estas subunidades no es facil de expresar como una protema recombinante y su rendimiento es bajo.

[Lista de citas]

[Literatura no de patente]

Literatura no de patente 1:

Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi M, Kawase E, Sekiguchi K, Nakatsuji N, Suemori H.

Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.

Literatura no de patente 2:

Taniguchi Y, Ido H, Sanzen N, Hayashi M, Sato-Nishiuchi R, Futaki S, Sekiguchi K.

The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins.

J. Biol. Chem. 284:7820-7831,2009.

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Sumario de la invencion

Problema tecnico

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un sustrato de cultivo que permita el cultivo de mantenimiento de celulas madre pluripotentes humanas en un estado pluripotente en un ambiente de cultivo sin celulas alimentadoras.

Solucion al problema

La presente invencion incluye lo siguiente como solucion a los problemas mencionados anteriormente.

(1) Un sustrato de cultivo para el cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, estando el sustrato de cultivo recubierto con fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1 o fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2, en el que la concentracion de recubrimiento de fragmento E8 de laminina humana a5plYl o de fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2 es de 0,5 a 25 pg/cm2.

(2) El sustrato de cultivo de acuerdo con el punto (1) anterior, en el que el sustrato de cultivo se selecciona entre el grupo que consiste en una cubeta de vidrio o de plastico, un matraz de vidrio o de plastico, una placa de multiples pocillos de vidrio o de plastico, un portaobjetos de cultivo de vidrio o de plastico, un micro-soporte y una membrana polimerica.

(3) El sustrato de cultivo de acuerdo con los puntos (1) o (2) anteriores, en el que la celula madre pluripotente humana es una celula ES humana o una celula iPS humana.

Efectos ventajosos de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un sustrato de cultivo que permite el cultivo de mantenimiento de celulas madre pluripotentes humanas en un estado pluripotente en un ambiente de cultivo sin celulas alimentadoras. En el caso en el que se utilice adicionalmente un medio de cultivo sin xenogenos en la presente invencion, las celulas madre pluripotentes humanas pueden cultivarse en condiciones sin xenogenos y sin celulas alimentadoras y de este modo pueden proporcionarse celulas madre pluripotentes humanas muy seguras. Adicionalmente, el sustrato de cultivo de la presente invencion permite la expansion y la proliferacion rapidas de las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales, la separacion de clones derivados de celulas individuales y el mantenimiento del estado de celulas individuales. Ademas, el fragmento E8 de laminina humana a5plYl y el fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2 utilizados para recubrir el sustrato de cultivo pueden producirse como una protema recombinante con un alto rendimiento y de este modo puede producirse un sustrato de cultivo recubierto con una protema humana muy pura y homogenea con una de alta calidad y bajo coste.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra los resultados comparativos de diferentes matrices extracelulares en la eficiencia de union, dependiente de la concentracion de recubrimiento, de las celulas ES humanas.

La Fig. 2 muestra los resultados en la eficiencia de union, dependiente de la densidad de siembra, de las celulas ES humanas disociadas en celulas individuales en el sustrato de cultivo recubierto con Matrigel o con fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1.

La Fig. 3 muestra la morfologfa de las celulas ES humanas en el sustrato de cultivo recubierto con fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2.

La Fig. 4 muestra la morfologfa de las celulas ES humanas en el sustrato de cultivo recubierto con fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1.

La Fig. 5 muestra los resultados del analisis por citometna de flujo de los antfgenos de superficie en las celulas ES humanas cultivadas en el sustrato de cultivo recubierto con Matrigel, con fragmento e8 de laminina humana a3p3Y2 o con fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1.

Descripcion de las realizaciones

La presente invencion proporciona un sustrato de cultivo para el cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, estando el sustrato de cultivo recubierto con fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1 o fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2 en el que la concentracion de recubrimiento del fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1 o fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2 es de 0,5 a 25 pg/cm2. Los ejemplos de las celulas madre pluripotentes incluyen las celulas ES (celulas madre embrionarias, del ingles embryonic stem cells), las celulas iPS (celulas madre pluripotentes inducidas, del ingles induced pluripotent stem cells), celulas mGS (celulas madre germinales multipotentes, del ingles multipotent germ stem cells) e hibridomas de celulas ES humanas y celulas somaticas.

El fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1 (denominado en lo sucesivo en el presente documento "laminina humana 511E8") significa un fragmento de laminina humana a5p1Y1 (denominada en lo sucesivo en el presente documento "laminina humana 511") correspondiente al fragmento e8 de laminina de raton a1p1Y1 (denominado en lo sucesivo en el presente documento "laminina de raton 111E8") y el fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2 (denominado en lo sucesivo en el presente documento "laminina humana 332E8") significa un fragmento de laminina

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humana a3p3Y2 (denominada en lo sucesivo en el presente documento "laminina humana 332") correspondiente a la laminina de raton 111E8.

Entre los fragmentos obtenidos por digestion con elastasa de la laminina de raton a1p1Y1 (denominada en lo sucesivo en el presente documento "laminina de raton 111"), el fragmento E8 de laminina se identifico como un fragmento que tiene la actividad de adhesion celular mas fuerte (Edgar D., Timpl R., Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984; y Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K. Two distinct cellbinding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987). Por tanto, se presume que la digestion por elastasa de la laminina humana 511 y de la laminina humana 332 podna producir un fragmento correspondiente a la laminina de raton 111E8, pero no ha habido ningun informe acerca del aislamiento o la identificacion de un fragmento de este tipo hasta ahora. Por tanto, la laminina humana 511E8 y la laminina humana 332E8 utilizadas en la presente invencion no tienen que ser un producto digerido por elastasa de la laminina humana 511 o la laminina humana 332 y pueden ser cualquier fragmento de laminina humana 511 o laminina humana 332, a condicion de que el fragmento tenga una actividad de la adhesion celular, estructura y peso molecular equivalentes a los de la laminina de raton 111E8.

El procedimiento para la produccion de laminina humana 511E8 o la laminina humana 332E8 no esta particularmente limitado. La laminina humana 511E8 y la laminina humana 332E8 pueden producirse mediante, por ejemplo, la digestion de la laminina humana 511 o la laminina humana 332 de longitud completa con una proteasa, tal como la elastasa, seguida del aislamiento y la purificacion del fragmento objetivo. Como alternativa, la laminina humana 511E8 y la laminina humana 332E8 pueden producirse como una protema recombinante. Esta ultima es de preferencia en terminos de cantidad de produccion, uniformidad de la calidad, costes de produccion, etc.

La laminina humana 511E8 recombinante y la laminina humana 332E8 recombinante pueden producirse mediante una tecnica recombinante apropiada conocida. La laminina humana 511E8 recombinante puede producirse mediante, por ejemplo, la preparacion de ADN que codifiquen las cadenas a, p y y de la laminina humana 511E8, la insercion de los ADN en vectores de expresion separados, la cointroduccion de los tres vectores de expresion resultantes en una celula hospedadora apropiada para su expresion y la purificacion de la protema trimerica objetivo mediante un procedimiento conocido. Los presentes inventores produjeron la laminina humana 511E8 recombinante de acuerdo con el procedimiento de Ido y col. (Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki y Kiyotoshi Sekiguchi, "The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin y chains in integrin binding by laminins" The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007) (veanse los Ejemplos), pero el procedimiento de produccion de la laminina humana 511E8 recombinante de la presente invencion no se limita al mismo. La laminina humana 332E8 recombinante puede producirse de forma similar (veanse los Ejemplos). Con respecto a las subunidades de la laminina humana 511, a saber, las cadenas a5, p1 y y1 y las subunidades de la laminina humana 332, a saber, las cadenas a3, p3 y y2, los datos acerca la secuencia de bases de un gen (ADNc) que codifica cada cadena y acerca de la secuencia de aminoacidos de cada cadena pueden obtenerse a partir de una base de datos conocida (GenBank etc.) mediante el uso de cada numero de referencia mostrado en la Tabla 1.

Tabla 1

Datos de secuencias de laminina humana (numero de referencia)

: Secuencia de aminoacidos Secuencia de bases

Cadena a5: NP 005551 NM 005560

Cadena p1: NP 002282 NM 002291

Cadena y1: NP 002284 NM 002293

Cadena a3: NP 000218 NM 000227

Cadena p2: NP 000219 NM 000228

Cadena y2: NP 005553 NM 005562

Mediante la dilucion de la laminina humana 511E8 o la laminina humana 332E8 preparadas con un disolvente adecuado, tal como PBS, solucion salina fisiologica y una solucion salina fisiologica ajustada a un pH neutro con tris(hidroximetil)aminometano o acido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina etanosulfonico, la adicion de la solucion diluida a un sustrato de cultivo adecuado y dejando el sustrato de cultivo en reposo a temperatura ambiente hasta aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 1 a 12 horas, la superficie del sustrato de cultivo puede recubrirse con laminina humana 511E8 o laminina humana 332E8. De esta manera, puede producirse el sustrato de cultivo de la presente invencion. El sustrato de cultivo que se recubre no esta limitado a condicion de que pueda

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utilizarse para el cultivo de celulas madre pluripotentes humanas y los ejemplos del mismo incluyen cubetas de vidrio o de plastico, matraces, placas de multiples pocillos y portaobjetos de cultivo, micro-soportes y membranas polimericas tales como una membrana de fluoruro de polivinilideno.

La concentracion de recubrimiento de la laminina humana 511E8 o la laminina humana 332E8 es de 0,5 a 25 pg/cm1 2 3 4 5 y preferentemente de aproximadamente 1,5 a 10|jg/cm2. Incluso a una concentracion de recubrimiento tan baja, tanto la laminina humana 511E8 como la laminina humana 332E8 permiten la union y la proliferacion de un mayor numero de celulas madre pluripotentes humanas en comparacion con cualquiera de entre Matrigel, la laminina humana 511 y la laminina humana 332, utilizados convencionalmente.

El sustrato de cultivo de la presente invencion esta recubierto con una o ambas laminina humana 511E8 y laminina humana 332E8. El substrato de cultivo puede recubrirse con, ademas de la laminina humana 511E8 y/o la laminina humana 332E8, otros componentes de origen humano. Los ejemplos de dichos otros componentes de origen humano incluyen componentes del suero, moleculas de la matriz extracelular, factores de crecimiento, factores inductores de la diferenciacion y factores morfogenicos (morfogenos). El substrato de cultivo tambien puede recubrirse con componentes no biologicos, tales como gel polimerico sintetico (polfmero sintetico).

El sustrato de cultivo de la presente invencion, que se recubre con laminina humana 511E8 o laminina humana 332E8, permite el cultivo de mantenimiento de las celulas madre pluripotentes humanas en un estado pluripotente en un ambiente de cultivo desprovisto de celulas alimentadoras (ambiente de cultivo sin celulas alimentadoras), que por lo general se utilizan para el cultivo de celulas madre. Para el mantenimiento del crecimiento clonal y del estado indiferenciado, las celulas madre pluripotentes por lo general se cultivan en un sistema de co-cultivo en el que las celulas madre pluripotentes se cultivan sobre celulas alimentadoras, tales como fibroblastos embrionarios de raton (MEF, del ingles mouse embryonic fibroblasts) cuya proliferacion se ha detenido mediante radiacion de rayos X o tratamiento con mitomicina-C. Un sistema de cultivo que no utiliza este tipo de celulas alimentadoras se denomina sistema de cultivo sin celulas alimentadoras.

Adicionalmente, mediante el uso de un medio de cultivo sin componentes xenogenos, las celulas madre pluripotentes humanas pueden cultivarse en condiciones de cultivo completamente desprovistas de componentes xenogenos (condiciones de cultivo sin xenogenos) y de este modo pueden proporcionarse celulas madre pluripotentes humanas muy seguras con un riesgo extremadamente bajo de desarrollar inmunogenia para los seres humanos.

Adicionalmente, el sustrato de cultivo de la presente invencion permite el cultivo de celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales, lo que no habfa sido factible en sistemas de cultivo convencionales. Por tanto, las celulas madre pluripotentes humanas pueden expandirse y proliferar significativamente mas rapido en comparacion con los sistemas de cultivo convencionales. Adicionalmente, los clones de celulas madre pluripotentes humanas derivados de celulas individuales pueden separarse facilmente y mantenerse en un estado de celulas individuales.

En el presente documento se describe un procedimiento de cultivo de celulas madre pluripotentes humanas utilizando el sustrato de cultivo anteriormente mencionado de la presente invencion. El procedimiento de cultivo de la presente divulgacion se utiliza preferentemente en el caso del cultivo de celulas madre pluripotentes humanas en condiciones de cultivo sin celulas alimentadoras y en particular se utiliza preferentemente en el caso del cultivo de celulas madre pluripotentes humanas en condiciones de cultivo sin celulas alimentadoras y sin xenogenos.

El medio de cultivo utilizado en el procedimiento de cultivo de la presente divulgacion no esta particularmente limitado, pero es de preferencia un medio sintetico y es de particular preferencia un medio sintetico sin componentes xenogenos (medio sintetico sin xenogenos). Los ejemplos del medio sintetico que esta o estara disponible en el mercado incluyen mTeSRI (nombre comercial, StemCell Technologies), TeSR2 (nombre comercial, StemCell Technologies), StemPro hESC SFM (nombre comercial, Invitrogen) y hESF-GRO (nombre comercial, Cell Science & Technology Institute, Inc.). Entre estos, TeSR2 es un medio de cultivo sin componentes xenogenos. Ademas, pueden utilizarse preferentemente los medios de cultivo descritos en las siguientes Referencias (1) a (5).

(1) Liu, Y. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.

(2) Vallier, L. y col., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.

(3) Li, Y. y col., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.

(4) Yao, S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.

(5) Lu, J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.

(1) Recogida de celulas ES humanas de sistema de co-cultivo con celulas alimentadoras

Se recogieron celulas ES humanas de un sistema de co-cultivo con celulas alimentadoras de acuerdo con el siguiente procedimiento 1 o 2.

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Procedimiento 1:

A una cubeta de cultivo en la que se habfan co-cultivado celulas ES humanas con celulas alimentadoras (por ejemplo, MEF) (del dfa 3 al d^a 5), se le anadio tripsina al 0,25 %/DMEM-F12 (por ejemplo, 1 ml/cubeta de 60 mm) y el tratamiento con tripsina se realizo a 37 °C durante 2 a 3 minutos. La cubeta de cultivo se lavo con DMEM-F12 y de esta manera se retiraron las celulas alimentadoras. Despues, se anadio un medio de cultivo a la cubeta de cultivo y las celulas enteras en la cubeta de cultivo se desprendieron ffsicamente. La suspension de celulas resultante se filtro a traves de una criba de celulas BD Falcon 100-pm (BD Falcon n.° 352460), la criba se lavo y de este modo solo se separaron y recogieron colonias de celulas ES humanas.

Procedimiento 2:

A una cubeta de cultivo en la que se habfan co-cultivado celulas ES humanas con celulas alimentadoras (por ejemplo, MEF) (del dfa 3 al dfa 5), se le anadieron una solucion de desprendimiento de celulas ES humanas (por ejemplo, Solucion de Disociacion para Celulas ES de Primate (RCHETP0O2 fabricada por ReproCELL Inc.), Dispasa 1 mg/ml/DMEM-F12, colagenasa IV 10 mg/ml/DMEM-F12, etc.) (por ejemplo, 1 ml/cubeta de 60 mm) y el tratamiento de desprendimiento se realizo a 37 °C durante 5 minutos. Como resultado, las celulas ES humanas y los MEF se desprendieron de la cubeta de cultivo. Despues, las celulas desprendidas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 15 ml. A este tubo, se le anadieron aproximadamente 10 ml de un medio de cultivo, las celulas se suspendieron, el tubo se dejo en reposo durante 5 minutos para permitir que solo precipitaran las colonias y despues se retiro el sobrenadante. Mediante la repeticion de este procedimiento dos veces o mas, solo se recogieron las colonias de celulas ES humanas.

(2) Transferencia de celulas ES humanas al sustrato de cultivo de la presente invencion

Las colonias de celulas ES humanas recogidas se disociaron en celulas individuales. El procedimiento para la disociacion de las colonias en celulas individuales no esta particularmente limitado y, por ejemplo, las colonias pueden disociarse mediante el lavado abundante con un medio de cultivo varias veces utilizando un Pipetman P1000 o similar. Las celulas disociadas en celulas individuales se resuspendieron en un medio de cultivo adecuado (por ejemplo, TeSR2 etc.) y se sembraron en un sustrato de cultivo de la presente invencion (por ejemplo, una cubeta de cultivo recubierta con laminina humana 511E8 (1,5 pg/cm2)). El cultivo se realizo en una condicion de concentracion de CO2 adecuada para el medio de cultivo utilizado y el medio de cultivo se cambio a diario.

(3) Cultivo por pase

El pase se realizo en el momento en el que se hicieron visibles la falta de espacio para una expansion adicional o celulas muertas en las colonias. En el procedimiento de cultivo de la presente divulgacion, el pase puede realizarse mediante la siembra de celulas ES humanas mantenidas como colonias de tamano moderado, como en los procedimientos convencionales. Como alternativa, el pase puede realizarse mediante la siembra de celulas ES humanas disociadas en celulas individuales. En este caso, el estado "disociado en celulas individuales" no solo significa un estado en el que todas las celulas en una suspension de celulas estan presentes como una sola celula, sino que incluye un estado en el que algunas celulas en una suspension de celulas estan presentes como una sola celula y otras celulas estan presentes en la misma en una forma agregada de aproximadamente varias a poco mas de diez celulas.

En el caso de celulas disociadas en celulas individuales:

A un sustrato de cultivo de la presente invencion (por ejemplo, una cubeta de cultivo recubierta con laminina humana 511E8 (1,5 pg/cm2)) en el que se habfan cultivado celulas ES humanas, se le anadio TrypLE Select (nombre comercial, Invitrogen n.° 12563011) (por ejemplo, se anadio 1 ml/cubeta de 60 mm) y las celulas ES humanas se trataron con el mismo a 37 °C durante 5 minutos. Las colonias de celulas ES humanas se disociaron en celulas individuales mediante, por ejemplo, el lavado abundante con un medio de cultivo varias veces utilizando un Pipetman P-1000 o similar. Despues de la adicion de un medio de cultivo, las celulas ES humanas se suspendieron y despues se recogieron en un tubo de centnfuga. Despues de que una etapa de centrifugacion (200xg, 3 minutos) y una etapa posterior de lavado con un medio de cultivo se repitieran dos veces, las celulas ES humanas se volvieron a suspender en un medio de cultivo recien preparado y se sembraron en un estado de celulas individuales a una densidad celular de, por ejemplo, aproximadamente 40.000 celulas/cm2 en un sustrato de cultivo de la presente invencion (por ejemplo, una cubeta de cultivo recubierta con laminina humana 511E8 (1,5 pg/cm2)). El cultivo se realizo en una condicion de concentracion de CO2 adecuada para el medio de cultivo utilizado y el medio de cultivo se cambio a diario.

En el caso de celulas no disociadas en celulas individuales:

En este caso, se utilizaron enzimas, tales como colagenasa IV, Dispasa y Accutasa, para el desprendimiento de celulas. A un sustrato de cultivo de la presente invencion en el que se habfan cultivado celulas Es humanas, se le anadieron colagenasa 10 mg/ml/DMEM-F12, Dispasa 2 mg/ml/DMEM-F12 o Accutasa (Millipore n.° SCR005) (por ejemplo, 1 ml/cubeta de 60 mm) y las celulas ES humanas se tratan con la misma a 37 °C durante 5 minutos. Despues de la retirada de la solucion de enzima, se anadio un medio de cultivo y las colonias de celulas ES humanas se dividieron en colonias de menor tamano compuestas por aproximadamente 50 a 100 celulas

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mediante, por ejemplo, el lavado abundante con un medio de cultivo varias veces utilizando un Pipetman P-1000 o similar. La suspension de celulas se recogio en un tubo de centnfuga. Despues de que una etapa de centrifugacion (200xg, 3 minutos) y una posterior etapa de lavado con un medio de cultivo se repitieran dos veces, las celulas ES humanas se volvieron a suspender en un medio de cultivo recien preparado y se sembraron en una dilucion con factor de dilucion de 2 a 4 en un sustrato de cultivo de la presente invencion (por ejemplo, una cubeta de cultivo recubierta con laminina humana 511E8 (1,5 |jg/cm2)). El cultivo se realizo en una condicion de concentracion de CO2 adecuada para el medio de cultivo utilizado y el medio de cultivo se cambio a diario.

En el presente documento se describe un procedimiento para la expansion rapida de celulas madre pluripotentes humanas. El procedimiento de expansion rapida de la presente divulgacion comprende las etapas de: disociar las celulas madre pluripotentes humanas en celulas individuales y cultivar las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales utilizando el sustrato de cultivo anteriormente mencionado de la presente invencion, cultivandose las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales a una densidad celular de aproximadamente 2 * 104 a 20 * 104 celulas/cm2. La densidad de siembra es mas preferentemente de aproximadamente 3 * 104 a 10 * 104 celulas/cm2 y mas preferentemente de aproximadamente 4 x 104 a 5 * 104 celulas/cm2. A una densidad de siembra de este tipo, la eficiencia de union de las celulas ES humanas disociadas en celulas individuales en los sistemas de cultivo convencionales es inferior al 10%, pero el procedimiento de expansion rapida de la presente divulgacion puede conseguir una eficiencia de union significativamente mayor y permite la proliferacion vigorosa posterior, permitiendo de este modo que las celulas madre pluripotentes humanas proliferen a una velocidad notablemente mas alta que la de los procedimientos convencionales.

En la etapa de disociacion de celulas madre pluripotentes humanas en celulas individuales, como en la anteriormente mencionada "En el caso de celulas disociadas en celulas individuales", las colonias de celulas madre pluripotentes humanas se desprendieron y recogieron de una cubeta de cultivo y estas colonias se disociaron en celulas individuales mediante, por ejemplo, el lavado abundante con un medio de cultivo varias veces utilizando un Pipetman P-1000 o similar. Despues, el numero de celulas se conto mediante un procedimiento de recuento de celulas conocido y la concentracion de celulas de la suspension de celulas se ajusto adecuadamente para proporcionar la densidad de siembra anteriormente mencionada. La etapa de cultivo puede realizarse de acuerdo con la descripcion del procedimiento de cultivo anterior de la presente divulgacion.

En el presente documento se describe un procedimiento de separacion de clones derivados de celulas individuales de celulas madre pluripotentes humanas. El procedimiento de separacion de la presente divulgacion comprende las etapas de: disociar las celulas madre pluripotentes humanas en celulas individuales y cultivar las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales utilizando el sustrato de cultivo anteriormente mencionado de la presente invencion y el procedimiento se caracteriza por la formacion de colonias derivadas de celulas individuales. De acuerdo con el procedimiento de separacion de la presente divulgacion, a diferencia de los sistemas de cultivo convencionales, los clones de celulas madre pluripotentes humanas derivados de celulas individuales pueden formarse y separarse facilmente y de este modo pueden obtenerse celulas madre pluripotentes humanas homogeneas facilmente.

Para la formacion de colonias derivadas de celulas individuales y la separacion de clones derivados de celulas individuales, puede utilizarse cualquier procedimiento sin ninguna limitacion particular y, por ejemplo, puede utilizarse preferentemente una dilucion limitante conocida etc. Dependiendo del procedimiento utilizado, se seleccionan apropiadamente la densidad celular y el sustrato de cultivo de la presente invencion que se utilizan y, en las condiciones seleccionadas, se siembran y se cultivan las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales. La etapa de cultivo puede realizarse de acuerdo con la descripcion del procedimiento de cultivo anterior de la presente divulgacion.

En el presente documento se describe un procedimiento de cultivo de celulas individuales de celulas madre pluripotentes humanas. El procedimiento de cultivo de celulas individuales de la presente divulgacion comprende las etapas de: disociar las celulas madre pluripotentes humanas en celulas individuales y cultivar las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales utilizando el sustrato de cultivo anteriormente mencionado de la presente invencion y el procedimiento se caracteriza por el mantenimiento de las celulas madre pluripotentes humanas en un estado de celulas individuales sin proliferacion. En general, en la colonia formada por celulas madre pluripotentes humanas, las celulas en el borde de la colonia pueden ser diferentes en la condicion de la celula de aquellas dentro de la colonia, pero de acuerdo con el procedimiento de cultivo de celulas individuales de la presente divulgacion, las celulas madre pluripotentes humanas no forman colonias y de este modo pueden obtenerse en una condicion uniforme y puede esperarse una potenciacion en la eficiencia de la induccion de la diferenciacion.

Para el mantenimiento de las celulas madre pluripotentes humanas en un estado de celulas individuales sin proliferacion, es de preferencia que las celulas madre pluripotentes humanas disociadas en celulas individuales se siembren a una densidad celular apropiada seleccionada dependiendo del sustrato de cultivo de la presente invencion que se utilice, y despues se utilicen para otras aplicaciones antes de que las celulas proliferan. Ademas, 5 es posible que se utilice, por ejemplo, un medio de cultivo con menos o sin factor de crecimiento para el mantenimiento prolongado de las celulas en un estado de celulas individuales.

Ejemplos

A continuacion en el presente documento, la presente invencion se ilustrara en detalle mediante Ejemplos, pero no se limita a los mismos.

10 <Materiales para los experimented

(1) Matrices extracelulares

Se utilizaron laminina humana 511E8 recombinante (denominada en lo sucesivo en el presente documento "rhLM511E8"), laminina humana 332E8 recombinante (denominada en lo sucesivo en el presente documento "rhLM332E8"), laminina humana 511 recombinante (denominada en lo sucesivo en el presente documento 15 "rhLM511"), laminina humana 332 recombinante (denominada en lo sucesivo en el presente documento "rhLM332"),

laminina humana 111 recombinante (denominada en lo sucesivo en el presente documento "rhLM111"), Matrigel (BD Bioscience n.° 354230), fibronectina humana (purificada utilizando una columna de afinidad de gelatina de acuerdo con el procedimiento de Sekiguchi y col. (Sekiguchi K. y Hakomori S.: Domain structure of human plasma fibronectin. Differences and similarities between human and hamster fibronectins. The Journal of Biological Chemistry, 258, 20 3967-3973, 2003)) y vitronectina (purificada utilizando una la columna de afinidad de heparina de acuerdo con el

procedimiento de Yatohgo y col. (Yatohgo T., Izumi, M., Kashiwagi, H. y Hayashi, M. Novel purification of vitronectin from human plasma by heparin affinity chromatography. Cell Structure and Function, 13, 281-292, 1988)).

(2) Celulas utilizadas para los experimentos

Como celula ES humana, se utilizaron cepas establecidas en el Instituto para las Ciencias Medicas Aplicadas 25 (Institute for Frontier Medical Sciences) de la Universidad de Kioto (KhES-1 [ejemplo de referencia], KhES-2 [ejemplo de referencia], KhES-3 [ejemplo de referencia]) y cepas adquiridas del Banco Nacional de Celulas Madre (National Stem Cell Bank) (H1 [ejemplo de referencia], H9 [ejemplo de referencia]). Como celula iPS humana, se utilizaron cepas adquiridas del Banco Nacional de Celulas Madre (National Stem Cell Bank) (nombre del clon: iPS(IMR90)-1- DL-1, iPS(IMR90)-4-MCB-1, iPS(prepucio)-1-DL-1).

30 El cultivo de mantenimiento de estas celulas se realizo de acuerdo con los procedimientos de cultivo respectivos que recomiendan las organizaciones. Por ejemplo, las celulas ES humanas H9 (ejemplo de referencia) se mantuvieron mediante co-cultivo con celulas alimentadoras de raton de acuerdo con un procedimiento recomendado por Banco Nacional de Celulas Madre (National Stem Cell Bank). Despues de que se anadiera tripsina al 0,25 %/DMEM-F12 a la cubeta de co-cultivo y se retiraran las celulas alimentadoras de raton, la suspension de celulas se filtro a traves de 35 una criba de celulas BD Falcon 100-pm (BD Falcon n.° 352460), la criba se lavo y de este modo se separaron colonias de celulas ES humanas H9 (ejemplo de referencia). Las colonias de la criba se recogieron en un medio de cultivo de celulas ES humanas y se dividieron en colonias mas pequenas mediante el uso de un Pipetman P-1000. Despues, las colonias mas pequenas se volvieron a suspender en mTeSR1 (StemCell Technologies) y se sembraron en un sustrato de cultivo recubierto con Matrigel. El numero de pases de las celulas recien sembradas se 40 designo como P1. El cultivo de expansion se realizo en una atmosfera de CO2 al 5 %/aire al 95 % y continuo hasta el dfa 4. Durante el cultivo de expansion, el medio se reemplazo a diario con la comprobacion de la contaminacion con celulas alimentadoras de raton. Se utilizaron en los experimentos celulas que se confirmo que no estaban contaminadas con celulas alimentadoras de raton. El cultivo de mantenimiento y el cultivo de expansion de los otros tipos celulares se realizaron de manera similar y despues estas celulas se utilizaron en experimentos. En los 45 siguientes ejemplos, solo se muestran los resultados de celulas ES humanas H9 [ejemplo de referencia], pero se obtuvieron resultados similares con respecto a los otros tipos celulares.

(3) Procedimiento de preparacion de rhLM511E8

Se preparo rhLM511E8 de la siguiente manera de acuerdo con el procedimiento de Ido y col. (Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki y Kiyotoshi Sekiguchi, "The requirement of 50 the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin y chains in integrin binding by laminins" The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007).

En primer lugar, mediante PCR utilizando un plasmido de clonacion pBluescript KS(+) (Stratagene) como molde, se prepararon tres tipos de pBluescript KS(+) que conteman un ADN que codificaba un marcador 6xHis (HHHHHH), un ADN que codificaba un marcador HA (hemaglutinina) (YPYDVPDYA) o un ADN que codificaba un marcador FLAG 55 (DYKDDDDK) insertado en el extremo 5' del sitio EcoRV en el sitio de multiclonacion. Los pares de cebadores utilizados para la PCR fueron los siguientes.

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(i) Cebadores para la insercion del marcador 6xHis 5'-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3' (directo, SEQ ID NO: 1) 5'-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3' (inverso, SEQ ID NO: 2)

(ii) Cebadores para la insercion del marcador HA

5'-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3' (directo, SEQ ID NO: 3) 5'-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3' (inverso, SEQ ID NO: 4)

(iii) Cebadores para la insercion del marcador FLAG 5'-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3' (directo, SEQ ID NO: 5) 5'-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3' (inverso, SEQ ID NO: 4)

A continuacion, mediante PCR utilizando plasmidos que conteman las secuencias de bases de longitud completa de las cadenas a5, p1 y y1 (Ido y col., J. Biol. Chem., 279, 10946-10954, 2004) como plantillas, se amplificaron las regiones correspondientes a a5 (Ala2534-Ala3327), pi (Leu1561-Leu1786) y y1 (Asn1362-Pro1608), respectivamente. Los cebadores utilizados para la PCR fueron los siguientes.

(iv) Cebadores para la amplificacion del fragmento E8 de la cadena a5 5'-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3' (directo, SEQ ID NO: 6) 5'-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3' (inverso, SEQ ID NO: 7)

(v) Cebadores para la amplificacion del fragmento E8 de la cadena pi 5'-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3' (directo, SEQ ID NO: 8) 5'-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3' (inverso, SEQ ID NO: 9)

(vi) Cebadores para la amplificacion del fragmento E8 de la cadena y1 5'-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3' (directo, SEQ ID NO: 10)

5'-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3' (inverso, SEQ ID NO: 11)

Los ADNc amplificados se insertaron por separado en el sitio EcoRV en el sitio de multiclonacion de los pBluescript KS(+) preparados anteriormente que conteman una secuencia de marcador. Despues, la region que contema el ADNc amplificado y la secuencia que codificaba el marcador 5'-terminal se digirio con las enzimas de restriccion EcoRI y HindIII y se inserto en el sitio de restriccion correspondiente de pSecTag2B, un vector de expresion disenado para celulas de mairnferos (Invitrogen). De esta manera, se prepararon vectores de expresion para el fragmento E8 de la cadena a5 humana (que contema el marcador 6xHis en la region N-terminal), el fragmento E8 de la cadena p1 humana (que contema el marcador HA en la region N-terminal) y el fragmento E8 de la cadena y1 humana (que contema el marcador FLAG en la region N-terminal).

Para la expresion de rhLM511E8, los tres vectores de expresion se introdujeron en celulas 293F derivadas de rinon embrionario humano (adquirido de Invitrogen). Se co-transfectaron 180 |jg cada uno de estos vectores de expresion en 300 ml de celulas 293F (1,0 * 106 celulas/ml) mediante el uso de un reactivo de transfeccion 293fectin (nombre comercial, Invitrogen) y Opti-MEM (nombre comercial, Invitrogen) y las celulas se cultivaron durante 72 horas. Despues de esto, se recogio el medio de cultivo. El medio de cultivo recogido se centrifugo a 1.000*g durante 10 minutos y el sobrenadante resultante se centrifugo adicionalmente a 15.000*g durante 30 minutos para retirar la materia insoluble y las celulas restantes. Al sobrenadante resultante, se le anadieron 5 ml de agarosa Ni-NTA (QIAGEN) y se dejo que la protema objetivo se uniera a la misma mediante incubacion durante la noche. La agarosa Ni-NTA se recogio y se lavo sucesivamente con TBS(-) (solucion salina tris-tamponada sin Ca o Mg) e imidazol 10 mM/TBS(-) y las protemas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM/TBS(-). La rhLM511E8 eluida de este modo se confirmo mediante SDS-PAGE seguido de tincion con plata. A la fraccion que contema rhLM511E8, se le anadieron 2 ml Gel de afinidad ANTI-FLAG M2 (Sigma) y la mezcla se hizo girar a 4 °C durante la noche. El gel de afinidad se transfirio a una columna Econo, que despues se lavo con PMSF 1 mM que contema TBS(-). Despues, la elucion se realizo con peptido FLAG 100 jg/ml que contema TBS(-) (Sigma). Despues de que las fracciones eluidas se sometieran a la tincion con plata, las fracciones que conteman rhLM511E8 se combinaron y se dializaron frente a TBS(-).

(4) Procedimiento de preparacion de rhLM332E8

(4-1) Preparacion del vector de expresion para el fragmento E8 de la cadena a3 de laminina humana

En primer lugar, mediante PCR utilizando un plasmido de clonacion pBluescript KS(+) (Stratagene) como molde, se preparo un pBluescript KS(+) que contema la secuencia de reconocimiento de la enzima de restriccion AscI (GGCGCGCC) y un ADN que codificaba un marcador 6xHis (HHHHHH) insertado en el extremo 5' del sitio EcoRV en el sitio de multiclonacion. El par de cebadores utilizado para la PCR era el siguiente.

(vii) Cebadores para la insercion del marcador 6xHis

5'-ATGATGATGGGCGCGCCAAGCTTATCGATACCGT-3' (directo, SEQ ID NO: 12) 5'-CATCATCATGATATCGAATTCCTGC-3' (inverso, SEQ ID NO: 13)

A continuacion, mediante PCR utilizando un plasmido que contema la secuencia de ADNc de la cadena a3 de laminina humana (que carecfa de los dominios globulares de laminina 4° y 5°) (Ido y col., J. Biol. Chem., 282, 1114411154, 2007) como molde, se amplifico la region correspondiente a a3 (Ala579-Ala1364). Los cebadores utilizados para

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la PCR fueron los siguientes. El cebador inverso contema la secuencia de reconocimiento de Xbal (TCTAGA) en la region 5'-terminal.

(viii) Cebadores para la amplificacion del fragmento E8 de la cadena a3 5'-GCGGCCGAGGACGCAGCCAACAGG-3' (directo, SEQ ID NO: 14) 5'-GGTCTAGACTAAGCATCTTGCCACACC-3' (inverso, SEQ ID NO: 15)

El ADNc amplificado se inserto en el sitio EcoRV-Xbal en el sitio de multiclonacion del pBluescript KS(+)preparado anteriormente que contema la secuencia de reconocimiento de Ascl y la secuencia que codificaba el marcador 6xHis. Despues, el ADNc que contema la secuencia que codificaba el fragmento E8 de la cadena a3 y la secuencia que codificaba el marcador 6xHis 5'-terminal se digirio con las enzimas de restriccion Ascl y Notl y se inserto en el sitio de restriccion correspondiente de pSecTag2A, un vector de expresion disenado para celulas de mairnfero (Invitrogen). De esta manera, se preparo un vector de expresion para el fragmento E8 de la cadena a3 humana (que contema el marcador 6xHis en la region N-terminal).

(4-2) Preparacion del vector de expresion para el fragmento E8 de la cadena p3 de laminina humana

Para la preparacion de un fragmento de ADNc que codificaba un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton, un marcador HA y fragmento E8 de la cadena p3, en este orden desde el extremo 5', se obtuvieron por separado un fragmento de ADNc que codificaba un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton y un marcador HA y un fragmento de ADNc que codificaba E8 de la cadena p3 y estos dos fragmentos se ligaron y se amplificaron mediante PCR de extension.

En primer lugar, mediante PCR utilizando un vector de expresion de E8 de cadena pi de laminina humana (Ido y col., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007) como molde, se amplifico la region correspondiente a un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton y un marcador HA. Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes. El cebador inverso contema una secuencia utilizada para la PCR de extension en la region 5'-terminal.

(ix) Cebadores para la amplificacion de la secuencia del peptido senal y la secuencia del marcador HA 5'-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3' (directo, SEQ ID NO: 16)

5'-TCTGGGACAGATCTGCATAATCTGGCAC-3' (inverso, SEQ ID NO: 17)

A continuacion, mediante PCR utilizando un plasmido que contema la secuencia de ADNc de la cadena p3 de laminina humana (Ido y col., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007) como molde, se amplifico la region correspondiente a p3 (Leu949-Lys1172). Los cebadores utilizados para la PCR fueron los siguientes. El cebador directo contema una secuencia utilizada para la PCR de extension en la region 5' terminal y el cebador inverso contema la secuencia de reconocimiento de EcoRI (GAATTC) en la region 5'-terminal.

(x) Cebadores para la amplificacion del fragmento E8 de la cadena p3 5'-AGATTATGCAGATCTGTCCCAGACCAAG-3' (directo, SEQ ID NO: 18) 5'-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3' (inverso, SEQ ID NO: 19)

Las dos clases de fragmentos de ADNc resultantes se ligaron y se amplificaron mediante PCR de extension utilizando los cebadores que se describen a continuacion, para proporcionar un fragmento de ADNc que codificaba un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton, un marcador HA y E8 de la cadena p3. Despues, el ADNc amplificado se digirio con las enzimas de restriccion NheI y EcoRI y se inserto en el sitio de restriccion correspondiente de pSecTag2B, un vector de expresion disenado para celulas de marnfferos (Invitrogen). De esta manera, se preparo un vector de expresion para el fragmento E8 de la cadena p3 humana (que contema el marcador hA en la region N-terminal). La secuencia de reconocimiento NheI (GCTAGC) estaba situada en el extremo 5' inmediato del codon de iniciacion.

(xi) Cebadores para la amplificacion de peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton, marcador HA y E8 de la cadena p3

5'-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3' (directo, SEQ ID NO: 16)

5'-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3' (inverso, SEQ ID NO: 19)

(4-3) Preparacion del vector de expresion para el fragmento E8 de la cadena y2 de laminina humana

Para la preparacion de un fragmento de ADNc que codificaba un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton, un marcador FLAG y fragmento E8 de la cadena y2, en este orden desde el extremo 5', se obtuvieron por separado un fragmento de ADNc que codificaba un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton y un marcador FLAG y un fragmento de ADNc que codificaba E8 de la cadena y2 y estos dos fragmentos se ligaron y se amplificaron mediante PCR de extension.

En primer lugar, mediante PCR utilizando un vector de expresion de E8 de cadena y1 de laminina humana (Ido y col., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007) como molde, se amplifico la region correspondiente a un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton y un marcador FLAG. Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes. El cebador inverso contema una secuencia utilizada para la PCR de extension en la region 5'-terminal.

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(xii) Cebadores para la amplificacion de la secuencia del peptido senal y la secuencia del marcador FLAG 5'-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3' (directo, SEQ ID NO: 16)

5'-GGATGCTCTCATCCTTATCATCATCATCC-3' (inverso, SEQ ID NO: 20)

A continuacion, mediante PCR utilizando un plasmido que contema la secuencia de ADNc de la cadena y2 de laminina humana (Ido y col., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007) como molde, se amplifico la region correspondiente a y2 (Glu949-Gln1172). Los cebadores utilizados para la PCR fueron los siguientes. El cebador directo contema una secuencia utilizada para la PCR de extension en la region 5' terminal y el cebador inverso contema la secuencia de reconocimiento de EcoRI (GAATTC) en la region 5-terminal.

(xiii) Cebadores para la amplificacion del fragmento E8 de la cadena y2 5'-GATGATGATAAGGATGAGAGCATCCTTAAAAAC-3' (directo, SEQ ID NO: 21) 5'-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3' (inverso, SEQ ID NO: 22)

Las dos clases de fragmentos de ADNc resultantes se ligaron y se amplificaron mediante PCR de extension utilizando los cebadores que se describen a continuacion, para proporcionar fragmento de ADNc que codificaba un peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton, un marcador FLAG y E8 de la cadena y2. Despues, el ADNc amplificado se digirio con enzimas de restriccion NheI y EcoRI y se inserto en el sitio de restriccion correspondiente de pSecTag2B, un vector de expresion disenado para celulas de mairnferos (Invitrogen). De esta manera, se preparo un vector de expresion para el fragmento e8 de la cadena y2 humana (que contema el marcador FLAG en la region N-terminal).

(xiv) Cebadores para la amplificacion de peptido senal V-J2-C de la cadena k de Ig de raton, marcador FLAG y E8 de la cadena y2

5'-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3' (directo, SEQ ID NO: 16)

5'-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3' (inverso, SEQ ID NO: 22)

(4-4) Expresion y purificacion de rhLM332E8

Para la expresion de rhLM332E8, los tres vectores de expresion se introdujeron en celulas 293F derivadas de rinon embrionario humano (Invitrogen). Se co-transfectaron 70 |jg cada uno de estos vectores de expresion en 300 ml de celulas 293F (1,0 * 106 celulas/ml) mediante el uso de un reactivo de transfeccion 293fectin (nombre comercial, Invitrogen) y Opti-MEM (nombre comercial, Invitrogen) y las celulas se cultivaron durante 72 horas. Despues de esto, se recogio el medio de cultivo. El medio de cultivo recogido se centrifugo a 1.000*g durante 10 minutos y el sobrenadante resultante se centrifugo adicionalmente a 15.000*g durante 30 minutos para retirar la materia insoluble y las celulas restantes. Al sobrenadante resultante se le anadio imidazol de modo que la concentracion final fuera 10 mM y la mezcla se agito bien. A esto, se le anadieron 40 ml de agarosa Ni-NTA al 50% (v/v) (QIAGEN) y se dejo que la protema objetivo se uniera a la misma en un procedimiento discontinuo a 4 °C durante la noche. La agarosa Ni-NTA se recogio y se lavo con TBS(-) y se realizo una elucion con imidazol 200 mM/TBS(-). La fraccion que contema rhLM332E8 se identifico basandose en la absorbancia a 280 nm. A la fraccion eluida objetivo, se le anadieron 2 ml de Gel de afinidad ANTI-FLAG M2 (Sigma) y se dejo que la protema objetivo se uniera al mismo en un procedimiento discontinuo a 4 °C durante la noche. El gel de afinidad se transfirio a una columna Econo (fabricada por Bio-Rad Laboratories, Inc.), que despues se lavo con TBS(-). Despues, se realizo una elucion con peptido FLAG 100 jg/ml que contema TBS(-) (Sigma). Despues de que las fracciones eluidas se sometieran a la tincion con plata, la fraccion que contema rhLM332E8 se dializo (corte de 20 kDa) frente a TBS(-).

(5) Procedimientos de preparacion de lamininas humanas recombinantes (rhLM511, rhLM332, rhLM111)

Se preparo rhLM511 de acuerdo con el procedimiento de Ido y col. (Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C. Combs, James M. Ervasti y Kiyotoshi Sekiguchi, "Molecular dissection of the a-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10' The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004).

Se preparo rhLM332 de acuerdo con el procedimiento de Ido y col. (Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki y Kiyotoshi Sekiguchi, "The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin y chains in integrin binding by laminins" The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007).

Se preparo rhLM111 de acuerdo con el procedimiento de Ido y col. (Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiki Yagi y Kiyotoshi Sekiguchi, "Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the functionblocking monoclonal antibody 4C7 Matrix Biology, 25, 112-117, 2006) y el procedimiento de Taniguchi y col. (Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen, Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiuchi, Sugiko Futaki y Kiyotoshi Sekiguchi, "The Cterminal region of laminin 5 chains modulates the integrin binding affinities of laminins" The Journal of Biological Chemistry, 284, 7820-7831, 2009).

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Se diluyeron por separado rhLM511E8, rhLM332E8, rhLM511, rhLM332, rhLM111, Matrigel, fibronectina y vitronectina con PBS de Dulbecco (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. n.° 045-29795) o DMEM-F12 (Sigma n.° D6241) y despues se anadieron a placas de microtitulacion de 96 pocillos separadas (BD Bioscience n.° 351172) a concentraciones finales que variaban de 0 a 25 |jg/cm2 Las placas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 2 horas y de este modo se recubrieron con las matrices extracelulares anteriores.

Las celulas ES humanas cultivadas con mTeSRI (P1) se trataron con TrypLE Select (Invitrogen n.° 12563011) a 37 °C durante 3 minutos y de esta manera se disociaron en celulas individuales. Despues de que se contase el numero de celulas, las celulas se sembraron a una densidad celular de 5* 104 celulas/pocillo en las placas. A las 6 horas despues de la siembra, los sobrenadantes se retiraron, los pocillos se lavaron una vez con DMEM-F12 y las celulas se fijaron con formol al 10% tamponado neutro durante 10 minutos. El formol tamponado neutro se reemplazo por etanol al 100 % y, 5 minutos mas tarde, las celulas se tineron con una solucion de cristal violeta al 4 %/metanol al 100 % durante 5 minutos. Las placas se sumergieron en una gran cantidad de agua destilada para la retirada del exceso de solucion de tincion y despues se secaron al aire. Las celulas se lisaron con SDS al 1 % y se midio la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm con un lector multiplaca.

Los resultados se muestran en la Fig. 1. Como se desprende de la Fig. 1, el numero de celulas ES humanas unidas a las placas recubiertas con rhLM511E8 o rhLM332E8 fue significativamente mayor incluso a bajas concentraciones de recubrimiento. El numero de celulas ES humanas unidas a las placas recubiertas con rhLM511E8 era mayor en cada concentracion de recubrimiento que el numero de celulas ES humanas unidas a las placas recubiertas con Matrigel, que habfan sido considerado el mas efectivo para la union de las celulas ES humanas entre las protemas de matriz extracelular conocidas. Sobre las placas recubiertas con rhLM511E8 o rhLM332E8, se unio un mayor numero de celulas ES humanas incluso a una concentracion de recubrimiento inferior a la de la correspondiente laminina de longitud completa (rhLM511 y rhLM332). Estos resultados demuestran que las concentraciones de recubrimiento optimas de rhLM511E8 y rhLM332E8 son aproximadamente de 1,0 a 20 jg/cm2.

En el pase de celulas ES humanas, puesto que la disociacion de las celulas en celulas individuales con tripsina/EDTA etc. provoca una notable disminucion de la viabilidad, las celulas por lo general se someten a pases en forma de colonia. En este ejemplo, la eficiencia de union de celulas ES humanas disociadas en celulas individuales en un sustrato de cultivo recubierto con rhLM511E8 se comparo con la de celulas ES humanas disociadas en celulas individuales en un sustrato de cultivo recubierto con Matrigel.

Se diluyo rhLM511E8 con PBS de Dulbecco de forma que la concentracion final fuera de 1,5 jg/cm2. Se diluyo Matrigel con DMEM-F12 de forma que la concentracion final fuera de 25 jg/cm2. Las dos soluciones diluidas se anadieron a placas de multiples pocillos de 48 pocillos separadas (BD Bioscience n.° 351178) y las placas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 2 horas y de este modo se recubrieron con rhLM511E8 o Matrigel.

Las celulas ES humanas cultivadas con mTeSR1 (P1) se trataron con TrypLE Select a 37 °C durante 3 minutos y de esta manera se disociaron en celulas individuales. Las celulas se sembraron a densidades celulares que variaban de 1 * 103 a 5 * 105 celulas/cm2 en pocillos por triplicado de la placa de pocillos multiples de 48 pocillos recubierta con rhLM511E8 o Matrigel. A las 6 horas despues de la siembra, los sobrenadantes se retiraron, los pocillos se lavaron con PBS y las celulas se desprendieron con tripsina al 0,25 %/EDTA. Se conto el numero de celulas y se determino la relacion entre el numero de celulas unidas con respecto al de las celulas sembradas en cada densidad celular.

Los resultados se muestran en la Fig. 2. Como se desprende de la Fig. 2, la eficiencia de union de las celulas ES humanas disociadas en celulas individuales sembradas en la placa recubierta con Matrigel fue extremadamente baja como de costumbre, mientras que la eficiencia de union asf como la viabilidad de las celulas ES humanas disociadas en celulas individuales sembradas en la placa recubierta con rhLM511E8 eran tan altas como aproximadamente el 50 % a una densidad de siembra de 5 * 104 celulas/cm2. Estos resultados demuestran que la densidad de siembra apropiada en un sustrato de cultivo recubierto con rhLM511E8 es de aproximadamente 5 * 104 a 10 * 104 celulas/cm2.

Se diluyeron por separado rhLM511E8 y rhLM332E8 con PBS de Dulbecco de forma que la concentracion final fuera de 1,5 jg/cm2. Se diluyo Matrigel con DMEM-F12 de forma que la concentracion final fuera de 25 jg/cm2. Las tres soluciones diluidas se anadieron a Cubetas de Cultivo Celular Easy-Grip de 35-mm (BD Falcon n.° 353001) separadas y las cubetas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 2 horas y de este modo se recubrieron con rhLM511E8, rhLM332E8 o Matrigel.

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Las celulas ES humanas cultivadas con mTeSRI (P1) se trataron con TrypLE Select a 37 °C durante 3 minutos y de esta manera se disociaron en celulas individuales. Las celulas se sembraron a una densidad celular de 5 * 104 celulas/cm2 en las Cubetas de Cultivo Celular Easy-Grip de 35-mm recubiertas con rhLM511E8, rhLM332E8 o Matrigel. Despues de la siembra, las celulas se registraron fotograficamente a diario.

Para el analisis de antigenos de superficie, a los 5 dfas despues de la siembra, las celulas se disociaron en celulas individuales mediante un tratamiento de 3 minutos con TrypLE Select y se lavaron con Solucion de Trabajo (BSA al 0,1 %/PBS). Se anadio anticuerpo anti-SSEA-1, anticuerpo anti-SSEA-4, anticuerpo anti-Tra-1-60, anticuerpo anti- Tra-1-81, anticuerpo anti-Tra-2-54 (todos los anteriores, Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidad de Iowa) o anticuerpo anti-GCTM-2 (Invitrogen) como anticuerpo primario y las celulas se tineron con el mismo a 4°C durante 30 minutos. Despues, las celulas se lavaron con Solucion de Trabajo. A continuacion, las celulas se tineron con un anticuerpo secundario (Beckman Coulter n.° 731735) a 4 °C durante 30 minutos. Despues, las celulas se lavaron dos veces con Solucion de Trabajo y la intensidad de fluorescencia se midio con BD FACS Calibur HG.

Los resultados de la observacion morfologica de las celulas ES humanas cultivadas en la cubeta recubierta con rhLM332E8 se muestran en la Fig. 3. Los resultados de la observacion morfologica de las celulas ES humanas cultivadas en la cubeta recubierta con rhLM511E8 se muestran en la Fig. 4. Como se desprende de las Figuras 3 y 4, en la cubeta recubierta con rhLM332E8 o rhLM511E8, las celulas ES humanas disociadas en celulas individuales se unieron individualmente o como una colonia vuelta a formar con las celulas adyacentes (veanse las secciones superiores del Dfa 1 de las Figuras 3 y 4) y despues proliferaron vigorosamente (veanse las secciones inferiores del Dfa 3 de las Figuras 3 y 4). Estos resultados demuestran que un sustrato de cultivo recubierto con rhLM332E8 o rhLM511E8 permite el cultivo por pase de celulas individuales de las celulas ES humanas, anteriormente inviable.

Los resultados del analisis por citometna de flujo de antfgenos de superficie de las celulas ES humanas se muestran en la Fig. 5. En la Fig. 5, los resultados de las celulas cultivadas en la cubeta recubierta con Matrigel se muestran en la columna de la izquierda, los resultados de las celulas cultivadas en la cubeta recubierta con rhLM332E8 se muestran en la columna central y los resultados de las celulas cultivadas en la cubeta recubierta con rhLM511E8 se muestran en la columna de la derecha. Como se desprende de la Fig. 5, los resultados del analisis por citometna de flujo de antfgenos de superficie no mostraron ninguna diferencia entre las celulas cultivadas en los tres tipos de cubetas: las celulas de cualquiera de estas cubetas fueron altamente positivas para los marcadores de indiferenciacion (SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, Tra-2-54, GCTM2), pero negativas para un marcador de diferenciacion (SSEA-1). Estos resultados demuestran que un sustrato de cultivo recubierto con rhLM332E8 o rhLM511E8 puede mantener el estado indiferenciado de las celulas ES humanas en un nivel equivalente al de los procedimientos convencionales utilizando Matrigel.

La presente invencion no se limita a las realizaciones y ejemplos mencionados anteriormente y pueden hacerse diversas modificaciones dentro del ambito de las reivindicaciones adjuntas. Otras realizaciones que puedan obtenerse mediante la combinacion adecuada de medios tecnicos desvelados en diferentes realizaciones de la presente invencion tambien se incluyen en el ambito tecnico de la presente invencion.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Osaka University Kyoto University

<120> Sustrato de cultivo para celula madre pluripotente humana y utilizacion del mismo

<130> 011F3566

<150> JP 2009-234583 <151> 2009-10-08

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 1

atgatgatga agcttatcga taccgt 26

<210>2 <211> 26

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<212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 2

catcatcatg atatcgaatt cctgca 26

<210>3 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 3

atcatatgga taaagcttat cgataccgt 29

<210> 4 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 4

gtgccagatt atgcagatat cgaattcct 29

<210> 5 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 5

atccttgtaa tcaagcttat cgataccgt 29

<210> 6 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 6

gctgccgagg atgctgctgg ccagg 25

<210>7 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 7

ctaggcagga tgccgggcgg gctga 25

<210>8 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<220>

<223> Secuencia de cebador <400>8

cttcagcata gtgctgctga cattg 25

<210>9 <211> 27 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 9

ttacaagcat gtgctataca cagcaac 27

<210> 10 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 10

aatgacattc tcaacaacct gaaag 25

<210> 11 <211> 25 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 11

ctagggcttt tcaatggacg gggtg 25

<210> 12 <211> 34 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 12

atgatgatgg gcgcgccaag cttatcgata ccgt 34

<210> 13 <211> 25 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 13

catcatcatg atatcgaatt cctgc 25

<210> 14 <211> 24 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador

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<400> 14

gcggccgagg acgcagccaa cagg 24

<210> 15 <211> 27 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 15

ggtctagact aagcatcttg ccacacc 27

<210> 16 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 16

tgggcgtgga tagcggtttg 20

<210> 17 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 17

tctgggacag atctgcataa tctggcac 28

<210> 18 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 18

agattatgca gatctgtccc agaccaag 28

<210> 19 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 19

gcgaattctc acttgcaggt ggcata 26

<210> 20 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 20

ggatgctctc atccttatca tcatcatcc 29

10

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<210> 21 <211> 33 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 21

gatgatgata aggatgagag catccttaaa aac 33

<210> 22 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de cebador <400> 22

gcgaattctc actgttgctc aagagcctg 29

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sustrato de cultivo para el cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, estando recubierto el sustrato de cultivo con fragmento E8 de laminina humana a5p1Y1 o fragmento E8 de laminina humana a3p3Y2, en el que la concentracion de recubrimiento de fragmento E8 de laminina humana a5plYl o fragmento E8 de laminina humana

5 a3p3Y2 es de 0,5 a 25 pg/cm2.
2. El sustrato de cultivo de acuerdo con la Reivindicacion 1, en el que el sustrato de cultivo se selecciona entre el grupo que consiste en una cubeta de vidrio o de plastico, un matraz de vidrio o de plastico, una placa de multiples pocillos de vidrio o de plastico, un portaobjetos de cultivo de vidrio o de plastico, un micro-soporte y una membrana polimerica.

10 3. El sustrato de cultivo de acuerdo con las Reivindicaciones 1 o 2, en el que la celula madre pluripotente humana es

una celula ES humana o una celula iPS humana.