ES2643214T3

ES2643214T3 - Procedimiento de detección para Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis

Info

Publication number: ES2643214T3
Application number: ES13718341.4T
Authority: ES
Inventors: Claus-Peter CZERNY; Pia MÜNSTER
Original assignee: Georg August Universitaet Goettingen
Current assignee: Georg August Universitaet Goettingen
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: CN104685068A; DE102012103730A1; CA2871683A1; PL2841596T3; DK2841596T3; WO2013160434A1; US20150111206A1; CN104685068B; US10151004B2; EP2841596B1; EP2841596A1

Abstract

Procedimiento para la detección específica y opcionalmente la cuantificación de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) en una muestra de un individuo que comprende la etapa de: - detectar la región IS900 de un genoma de MAP en una muestra de un individuo con la ayuda de una amplificación de ácido nucleico, en donde esa amplificación se efectúa con oligonucleótidos específicos que consisten respectivamente en al menos 15 nucleótidos consecutivos de las secuencias según Seq. ID nº 1 y Seq. ID nº 2 en donde la detección de la región IS900 de al menos un genoma de MAP indica la presencia de MAP en el individuo.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de deteccion para Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis

La presente solicitud se refiere a un procedimiento para la deteccion espedfica y opcionalmente para la cuantificacion de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) en una muestra de un individuo. Para ello, de acuerdo con el procedimiento segun la invencion, la deteccion de la presencia de la region IS900 en una muestra se lleva a cabo por medio de una amplificacion de acidos nucleicos y oligonucleotidos espedficos. En un aspecto adicional, se proporciona un kit de ensayo para la deteccion espedfica de MAP en una muestra mediante procedimientos de amplificacion. Por ultimo, se describen oligonucleotidos espedficos que son adecuados para la deteccion espedfica de MAP.

Estado de la tecnica

Mycobacterium avium es un tipo de micobacteria, que tiene una amplia variedad de hospedadores. Mycobacterium avium por un lado puede causar tuberculosis en las aves de corral, y por otra parte tambien aparece en los seres humanos y otros mairnferos como agente patogeno. Una de estas especies es Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), una bacteria patogena estricta del genero Mycobacterium. MAP es considerada como la causa de la paratuberculosis (enfermedad de Johne), una enfermedad que se presenta en particular en los rumiantes. La subespecie MAP tambien se ha podido detectar, ademas de en los rumiantes y los seres humanos, en otras especies animales, especialmente en animales silvestres, entre otros en conejos, aves, gatos salvajes, mapaches y ratas. Tambien se esta debatiendo una posible implicacion de este agente patogeno en el cuadro clmico "enfermedad de Crohn" del hombre.

El agente patogeno MAP se conoce desde principios del siglo 19 como causante de la paratuberculosis. La paratuberculosis es una enfermedad intestinal cronica que conduce a una perdida de peso continua durante un penodo de semanas. En la etapa final, esta enfermedad tiene un resultado fatal. Predominantemente, estan infectados los rumiantes domesticos adultos, como las vacas, las ovejas y las cabras, pero tambien los rumiantes silvestres y los animales de zoologico. Por lo general, la transmision del agente patogeno tiene lugar principalmente en terneros recien nacidos y terneros hasta una edad de 6 meses. En este caso, la infeccion tiene lugar principalmente de forma desapercibida y no es reconocida por la via oral-fecal, e incluso la leche del calostro de las vacas enfermas puede contener el agente patogeno. Despues de un penodo de latencia de varios anos con una excrecion de los agentes patogenos que es irregular e incontrolable, la enfermedad aparece tfpicamente por primera vez en las vacas de edad avanzada. En la actualidad no existe ninguna terapia. En el pasado, las vacunas mostraron un exito dudoso, por lo que actualmente no se utilizan en Alemania. Frecuentemente, la compra de animales infectados de forma subclmica o persistente es responsable de las nuevas infecciones dentro de un rebano. Son precisamente los portadores clmicamente inadvertidos asf como los excretores no reconocidos los que son la causa mas importante de continuas infecciones permanentes de la poblacion. Precisamente debido a la amplia distribucion de la paratuberculosis y las perdidas economicas, existe actualmente una demanda de metodos diagnosticos mejorados y de desarrollo de programas de control. En Alemania, la paratuberculosis es de reporte obligatorio segun el §78a Art. 2 de la Ley de Epizootias.

El diagnostico de la paratuberculosis es un elemento significativo en la lucha y el reconocimiento precoz de la paratuberculosis. Existen ya varios procedimientos de ensayo y de diagnostico que se basan en ensayos basados en anticuerpos, por ejemplo. Sin embargo, un problema de los ensayos comercialmente disponibles es la falta de sensibilidad y de especificidad. Ademas, los ensayos basados en anticuerpos no son tampoco adecuados, ya que los excretores serologicamente negativos pueden permanecer en los rebanos debido a la falta de sensibilidad de estos ensayos y, de este modo, se puede continuar propagando la enfermedad.

Para poder implementar en el futuro un programa efectivo de erradicacion, es necesaria una deteccion fiable de los agentes patogenos. Se han debatido frecuentemente procedimientos biologicos moleculares, en particular procedimientos basados en una amplificacion de los acidos nucleicos. En particular, los procedimientos de biologfa molecular basados en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se consideran muy prometedores. La PCR es un metodo rapido y fiable para confirmar el ADN de MAP en muestras sospechosas. Como regiones particularmente adecuadas del genoma de MAP, se han identificado la secuencia de insercion IS900, pero tambien regiones de ISMav2, hspX y F57. El elemento de insercion IS900 en particular destaca como una region adecuada para el diagnostico molecular, en particular con ayuda de metodos de PCR.

IS900 es un fragmento de 1451 pb que tiene 17 copias dentro del genoma de la cepa de referencia MAP-K10. Debido a este alto numero de copias, se puede conseguir una mayor sensibilidad en el procedimiento de deteccion y hace que IS900 sea una region diana adecuada. Se han descrito PCRs convencionales y en tiempo real (PCR en tiempo real) para la deteccion de MAP, basandose en la secuencia diana IS900.

De este modo, el documento DE102007015775A1 contiene oligonucleotidos adecuados para la deteccion espedfica de MAP. Ademas, este documento describe procedimientos y kits de ensayo correspondientes para la deteccion de MAP. A partir del documento EP 2 009 118 A2, se conoce a su vez un procedimiento para la deteccion y la cuantificacion de MAP basandose en cebadores espedficos de IS900 y F57.

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Sin embargo, los procedimientos descritos es ese documento todavfa siguen teniendo una falta de sensibilidad en caso de una especificidad elevada.

Bull et al., 2007, PlosOne, 11, e1229, describen un ensayo de PCR en tiempo real para detectar MAP. Munster P. et al., 2011, Vet Microbiol, 154(1-2), 197-201, describen una PCR semianidada (snPCR, del ingles “semi-nested) para detectar MAP. Se describe una sensibilidad elevada. Sin embargo, una snPCR requiere la realizacion de dos rondas de PCR. La snPCR es conocida como un procedimiento en el que existe un alto riesgo de contaminacion y, por lo tanto, no es adecuada para un uso rutinario con un alto rendimiento de muestras.

Sin embargo, es necesario detectar individuos infectados con alta sensibilidad y gran especificidad para llevar a cabo un programa de erradicacion apropiado. En particular, este procedimiento tambien se debe poder llevar a cabo en muestras biologicas como heces, organos, leche y tejidos sin tener que realizar un cultivo previo extensivo, el cual requiere hasta 16 semanas, o llevar a cabo unas etapas de preparacion.

Ademas, este procedimiento debe ser adecuado para permitir una automatizacion apropiada. Los procedimientos descritos en el estado de la tecnica no lo permiten.

Descripcion de la invencion

En un primer aspecto, la presente solicitud se refiere a un procedimiento para la deteccion espedfica, opcionalmente, para la cuantificacion de Mycobacterium avium spp. paratuberculosis (MAP) en una muestra de un individuo. Para ello, el procedimiento de acuerdo con la invencion comprende la etapa de detectar la region IS900 de un genoma de MAP en una muestra mediante una amplificacion del acido nucleico, en donde esta amplificacion se realiza con los oligonucleotidos espedficos que comprenden respectivamente al menos 15 nucleotidos consecutivos de las secuencias de acuerdo con Seq. ID n° 1 y Seq. ID n° 2, y una deteccion de la region IS900 en al menos un genoma de MAP indica la presencia de MAP en la muestra.

Se descubrio entonces que los oligonucleotidos espedficos, tal como se usan en esta memoria, a saber, los oligonucleotidos que tienen respectivamente al menos 15 nucleotidos consecutivos de las secuencias de acuerdo con Seq. ID n° 1 y Seq. ID n° 2, permiten una especificidad y sensibilidad destacadas frente a MAP en procedimientos de diagnostico basados en una amplificacion del acido nucleico.

Para ello es preferible que los oligonucleotidos de acuerdo con Seq. ID n° 1 y/o Seq. ID n° 2, independientemente entre sf, tengan al menos 16, tal como 17 o 18, nucleotidos consecutivos, y en particular, al menos 19 nucleotidos de estas dos secuencias. Es mas preferible que al menos uno de los oligonucleotidos espedficos de acuerdo con Seq. ID n° 1 y/o Seq. ID n° 2 tenga al menos 11, 12, 13, 14, 15, en particular al menos 16, 17, 18, 19 nucleotidos o todos los nucleotidos de las secuencias mencionadas. Esta claro que tambien se incluyen realizaciones en las que un oligonucleotido, por ejemplo, tiene al menos 18 nucleotidos de la secuencia de acuerdo con Seq. ID n° 1 y al menos 19 nucleotidos de la secuencia de acuerdo con Seq. ID n° 2. Cada variacion esta incluida en el alcance de esta invencion.

El procedimiento para la amplificacion del acido nucleico es preferiblemente una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Esta puede ser en particular una PCR en tiempo real (en ingles, “real-time PCR”). La PCR, por ejemplo en forma de una PCR en tiempo real, es en particular una PCR cuantitativa.

En contraste con procedimientos conocidos que tambien estan basados en una PCR, ahora es posible con los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion como pareja de cebadores, obtener resultados significativos en un ciclo de amplificacion. Los procedimientos conocidos hasta la fecha, usualmente se basan en los procedimientos denominados "PCR anidada" o "PCR semianidada". En estos casos, la amplificacion tiene lugar en dos etapas, es decir, el procedimiento dura mas y es mas caro que un procedimiento de una sola etapa. Otras ventajas de la PCR en tiempo real son la posibilidad de una cuantificacion del ADN de MAP, una implementacion rapida con bajo riesgo de contaminacion y la garantfa de una sensibilidad y especificidad elevadas.

Es especialmente preferible que en la amplificacion del acido nucleico, tal como con la PCR, en particular la PCR en tiempo real y especialmente preferente en la PCR cuantitativa, la deteccion de la region IS900 se efectue por medio de una sonda de acido nucleico. Esta sonda de acido nucleico es un oligonucleotido marcado usualmente con una etiqueta o un marcador que se hibrida con la region IS900 del genoma de MAP y/o con un acido nucleico complementario a la region IS900 del genoma de MAP.

En el presente documento, se entiende por hibridacion que una molecula de acido nucleico, tal como la sonda de acido nucleico, se une al menos a otra molecula de acido nucleico, en este caso un fragmento genico amplificado, en donde en la region de union, las dos hebras individuales de los acidos nucleicos son en esencia totalmente complementarias. Tambien se pueden formar helices triples entre la sonda de acido nucleico y el ADN de cadena doble existente. Los procedimientos de hibridacion habituales son conocidos por el experto en la tecnica. En particular, las regiones que se van a hibridar son al menos 70% complementarias, tal como al menos 75%, en particular al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, tal como al menos 95%, en particular al menos 99%, tal como totalmente complementarias.

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En una realizacion preferida, el acido nucleico es un oligonucleotido con al menos 15 nucleotidos consecutivos de acuerdo con Seq. ID n° 3. Es preferible que la sonda sea una con al menos 16, 17 o 18 nucleotidos consecutivos de acuerdo con Seq. ID n° 3, preferiblemente 19 nucleotidos, tal como mismamente la secuencia Seq. ID n° 3 con 20 nucleotidos.

Para ello, la sonda se marca de una manera usual con una etiqueta o un marcador que permite una deteccion sencilla con procedimientos conocidos. Las etiquetas o marcadores usuales son conocidos por el experto en la tecnica, tales como colorantes fluorescentes, por ejemplo, FAM (5 o 6 carboxifluorescema), VIC, NID, fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluorescema (HEX), colorantes de cianina tales como Cy3, Cy5, etc., colorantes de rodamina, colorantes de fenantridina y otros colorantes bien conocidos por el experto en la tecnica. Particularmente adecuados para la deteccion de sondas son FAM y Black-Hole-Quencher-1 (BHQ1).

Para cada protocolo de amplificacion de acido nucleico, tal como PCR, PCR en tiempo real y en particular para PCR cuantitativa, los colorantes adecuados en combinacion con los sistemas de amplificacion adecuados son conocidos por el experto en la tecnica.

En el caso de PCR en tiempo real, se mezclan por adicion de forma alterna los colorantes fluorescentes inactivos, por ejemplo, extinguidos, que se activan mediante la produccion de ADN. Los colorantes habituales que pueden estar intercalados con el ADN de hebra doble sintetizado, son, por ejemplo, bromuro de etidio o verde SYBR. Cuando se utiliza el sistema TaqMan para la amplificacion de acidos nucleicos, las sondas de acido nucleico son aquellas que son detectables por hidrolisis, por ejemplo, mediante la determinacion de la fluorescencia correspondiente. Otros sistemas adecuados que se basan y son conocidos por el experto en la tecnica son, por ejemplo, sondas LightCycler, sondas FRET, balizas moleculares o cebadores de escorpion. Para el procedimiento de amplificacion de acido nucleico es especialmente preferible una PCR cuantitativa en tiempo real con cebadores de acuerdo con Seq. ID n° 1 y Seq. ID n° 2 y una sonda de acido nucleico de acuerdo con Seq. ID n° 3.

En el procedimiento de acuerdo con la invencion y tambien en los kits de ensayo de acuerdo con la invencion, tambien pueden estar presentes controles apropiados. Estos controles incluyen controles para la amplificacion y/o controles para la purificacion. Estos controles pueden estar presentes, por ejemplo, en la propia muestra o se realizan en una preparacion paralela. De este modo, por ejemplo, la sonda en la PCR en tiempo real puede estar equipada con un colorante desactivado tal como FAM. Al mismo tiempo, la sonda esta equipada con un segundo marcador que se puede detectar en una region diferente a la del colorante inactivado, por ejemplo, emite luz en una region diferente y no esta inactivado. De este modo, es posible un control de la PCR. Ademas, un control positivo tal como p-actina se puede amplificar en la muestra o de forma paralela a la misma. Su deteccion se efectua con un marcador que es diferente del primer y segundo marcadores, por ejemplo, un colorante Cy5. De este modo, se puede controlar la reaccion y se puede mejorar la validez del procedimiento. Para el control de la amplificacion, que excluye el efecto inhibidor de una muestra clmica, se puede integrar un segundo colorante fluorescente (por ejemplo, HEX, medido a 533-580 nm) para la sonda.

Ademas, para la cuantificacion se pueden usar controles positivos adecuados para MAP en concentraciones predeterminadas en preparaciones paralelas. Las preparaciones experimentales apropiadas son conocidas por el experto en la tecnica.

La amplificacion del acido nucleico se efectua preferiblemente a partir de una muestra de un individuo. En este caso, la muestra sometida a amplificacion del acido nucleico puede ser una muestra que comprende un gran numero de muestras agrupadas, con el fin de permitir asf una prueba eficaz de MAP. Normalmente, una muestra agrupada puede ser una mezcla de, por ejemplo, 10 a 20 muestras individuales de diferentes individuos. Alternativamente, la muestra es una muestra de un solo individuo.

En la presente se entiende particularmente por individuo, un individuo seleccionado a partir de animales rumiantes, en particular vacas, ovejas y cabras o tambien rumiantes silvestres, tales como la cebra, etc. En este caso tambien se puede tratar, por ejemplo, de animales de zoologico. A traves de la expresion individuo tambien se entiende personas. Por lo tanto, el procedimiento se puede usar, por ejemplo, para someter a ensayo una infeccion con MAP en una persona, por ejemplo, en relacion con el diagnostico de la enfermedad de Crohn.

La muestra misma se puede seleccionar a partir de una muestra de heces, leche, sangre, esperma, tejidos u organos. Alternativamente, tambien son posibles muestras ambientales, por ejemplo muestras vegetales o muestras de instalaciones de biogas y aguas.

La muestra es preferiblemente una muestra de heces o una muestra de leche de un rumiante, en particular de una vaca.

Tambien, de acuerdo con la invencion, la muestra se puede procesar por procedimientos adecuados. Los procedimientos usuales incluyen el procesamiento de la muestra. Los procedimientos adecuados son conocidos por el experto en la tecnica. En particular, el procesamiento se puede efectuar mediante metodos conocidos de extraccion de ADN. Estos incluyen el uso de kits conocidos basados en tensioactivos y sales. Ademas, son posibles metodos de extraccion mecanica de ADN, incluyendo un procesamiento usando homogeneizadores, etc. En

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particular, son adecuados los procedimientos que incluyen el uso de tensioactivos para la extraccion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a kits de ensayo para la deteccion espedfica de MAP en una muestra mediante procedimientos de amplificacion, en particular mediante PCR. Estos kits de ensayo incluyen oligonucleotidos para la amplificacion de la region IS900 de MAP con al menos 15 nucleotidos consecutivos de acuerdo con Seq. ID n° 1 y 2, respectivamente. Este kit de ensayo es preferiblemente uno para la amplificacion de acido nucleico con PCR, en particular uno para la PCR en tiempo real. En una realizacion especialmente preferida, el kit de ensayo es uno adecuado para la PCR cuantitativa, tal como la PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion, el kit de ensayo incluye ademas un oligonucleotido con al menos 15 nucleotidos consecutivos de la sonda de acido nucleico de acuerdo con Seq. ID n° 3. Este kit de ensayo es particularmente adecuado para el analisis cuantitativo, por ejemplo, basandose en la PCR TaqMan. El kit de ensayo de acuerdo con la invencion puede contener ademas componentes adicionales para realizar la amplificacion del acido nucleico, en particular las enzimas, nucleotidos y tampones necesarios. Ademas, tambien puede estar incluido preferentemente un control positivo y/o instrucciones para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la invencion.

Por ultimo, el kit de ensayo puede contener reactivos y medios correspondientes que son apropiados para la extraccion de ADN genomico a partir de las muestras, en particular muestras de heces, leche, sangre, esperma, organos, tejidos y entorno, y/o medios para realizar la PCR, en particular una PCR en tiempo real.

Los reactivos y los medios adecuados son conocidos por el experto en la tecnica.

Finalmente, la solicitud se refiere a oligonucleotidos para una deteccion espedfica y, opcionalmente, una cuantificacion de MAP en una muestra de un individuo, en donde al menos 15 nucleotidos consecutivos de la secuencia Seq. ID n° 1 y al menos 15 nucleotidos consecutivos de la secuencia Seq. ID n° 2 estan presentes y, opcionalmente, al menos 15 nucleotidos consecutivos de la secuencia Seq. ID n° 3.

Estos oligonucleotidos son particularmente adecuados en el uso para la deteccion espedfica y opcionalmente para la cuantificacion de MAP, en particular mediante una PCR cuantitativa en tiempo real. Los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion son aquellos como los mencionados anteriormente.

La invencion se explica con mas detalle a continuacion, por medio de ejemplos, sin estar limitada a los mismos. Ejemplo de realizacion

Para comprobar la especificidad de los cebadores de acuerdo con la invencion (MAP523-542f/MAP661-642r) y la sonda TaqMan (MAP617-636p) de acuerdo con la Tabla 1, 14 especies de micobacterias asf como 14 especies de no micobacterias que se presentan frecuentemente en la agricultura y en el medio ambiente, se sometieron a ensayo tanto en la PCR clasica como en la PCR en tiempo real y se confirmo la especificidad (Tabla 2). La Figura 1 muestra la posicion de los cebadores de acuerdo con la invencion frente a los cebadores del estado de la tecnica.

Tabla 1: Secuencias de acidos nucleicos del cebador y de la sonda TaqMan para la deteccion del ADN de MAP en la PCR en tiempo real.

Cebador/ sonda: Secuencia (5'-3') Localizacion/ Seq.ID.No*

MAP523-542f MAP661-642r MAP617-636p: TACCGCGGCGAAGGCAAGAC CGGAACGTCGGCTGGTCAGG ATGACATCGCAGTCGAGCTG 523-542/ 1 661-642/ 2 617-636/ 3

* De acuerdo con la secuencia publicada de IS900, MAP K-10 (GenBank: AF416985), Seq. ID No. 4.

TABLA 2: Cepas de referencia utilizadas para la deteccion de la especificidad de la PCR en tiempo real TaqMan.

Especies bacterianas Nombre/Fuente

Especies de micobacterias

M. avium ssp. paratuberculosis: ATCC 19698

M. avium ssp. avium: ATCC 15769

M. avium ssp. avium: ATCC 19421

M. avium ssp. avium: ATCC 25291

M. avium ssp. silvaticum: ATCC 49884

M. bovis: ATCC 27289

M. fortuitum: ATCC 6841

Especies bacterianas: Nombre/Fuente

Especies de micobacterias

M. gordonae: ATCC 14470

M. intracellulare: ATCC 13950

M. kansasii: ATCC 12478

M. marinum: ATCC 927

M. phlei: ATCC 354

M. scrofulaceum: ATCC 19981

M. smegmatis: ATCC 19420

Otras especies bacterianas

Campylobacter jejuni: ATCC 33560

Clostridium perfringens: Vaca

Clostridium sordellii: Vaca

Escherichia coli 0101:K28: Vaca

Escherichia coli 0149:K91: Cerdo

Escherichia coli 0157:H7: ATCC 700927

Enterococcus faecalis: ATCC 19433

Enterococcus hirae: ATCC 10541

Rhodococcus equi: ATCC 25694

Salmonella cholerasuis: Vaca

Salmonella typhimurium: Vaca

Staphylococcus aureus: Vaca

Streptococcus dysgalactiae: Vaca

Streptococcus uberis: Vaca

El ADN utilizado de las cepas de referencia se extrajo de los cultivos mediante el kit QIAamp Blood (Quiagen, Hilden, Alemania) y se midio mediante Nano-Drop® (Espectrofotometro ND-1000, peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen). El ADN se ajusto a 1 ng/pl. El ADN espedfico de especie de las cepas de referencia se confirmo 5 mediante el uso de procedimientos de PCR publicados. Se utilizo agua destilada, esteril como control negativo.

En todos los casos, los productos de la PCR que se esperaban de la PCR espedfica de genero se podfan reconocer claramente en el gel de agarosa.

Para clarificar la especificidad, se sometio a ensayo la reactividad cruzada de ambos cebadores (MAP523-542f/MAP661- 642r) con otras especies bacterianas en la PCR clasica (Figura 2). Para la preparacion de la PCR, se utilizaron 10 "perlas" de PCR "Ready-To-Go®" (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Friburgo). Las mezclas de reaccion y las condiciones de la PCR utilizadas eran las siguientes:

Perlas de PCR Ready-To-Go® 1 perla

Agua dest. 21 pl

Cebador MAP-directo (10 pmol/pl) 1 pl

Cebador MAP-inverso (10 pmol/pl) 1 pl

Molde 2 pl

A la PCR precede una etapa de desnaturalizacion a 95°C durante 4 minutos.

Desnaturalizacion:: 95°C, 30

Reasociacion:: 58-70°C, 30

Elongacion:: 72°C, 60

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La prolongacion de la elongacion a 72°C durante 7 minutes constituye el final de la PCR.

Los productos de la PCR de 139 pb esperados se pueden reconocer claramente sobre el gel de agarosa y solo con la muestra de ADN de MAP (ATCC 19698). No se observaron productos de amplificacion en la region de 139 pb en otras especies bacterianas (n = 14). Por lo tanto, los cebadores utilizados (MAP523-542f/MAP661-642r) se pueden considerar espedficos de MAP.

Ademas, la especificidad se confirmo secuenciando el producto de 139 pb de longitud. Para ello, se clonaron los productos de la PCR en el vector plasirndico pCR ® 2.1-TOPO® (Invitrogen, Groningen, Pafses Bajos), se multiplicaron en bacterias E. coli y se purificaron con el Sistema de Purificacion Wizard® Plus SV Minipreps (Promega, Mannheim). Las secuencias de nucleotidos se compararon con la secuencia de la cepa de referencia de MAP K-10 (numero de orden AE16958) por medio de MegAlign. Se secuencio y se evaluo un total de 15 clones en ambas direcciones. Las secuencias de IS900 de los productos de amplificacion coincidieron en un 100% con la secuencia de MAP K-10 bovina publicada.

Despues de que la especificidad de los cebadores (MAP523-542f/MAP661-642r) se habfa comprobado en la PCR clasica, basandose en las cepas de referencia (n = 14), la especificidad de la sonda (MAP617-636p) tema que confirmarse en combinacion con los cebadores en la PCR en tiempo real. Como control negativo, se utilizo agua destilada, esteril. La mezcla de reaccion asf como las condiciones de reaccion de la PCR en tiempo real con la sonda TaqMan en el LightCycler® 480 (Roche Diagnostics, Mannheim) fueron las siguientes:

Light Cycler® DNA 480 Master 10 pl

Cebador MAP-directo (10 pmol/pl) 0,5 pl

Cebador MAP-inverso (10 pmol/pl) 0,5 pl

Sonda (10 pmol/pl) 1 pl

Agua dest. 3 pl

Molde 5 pl

95°C 10 min

95°C 15 s

60°C 30 s 45 ciclos

72°C 35 s

La Figura 3 muestra la deteccion de MAP mediante la sonda TaqMan (MAP617-636p).

La especificidad para MAP de los cebadores (MAP523-542f/MAP661-642r) y de la sonda TaqMan (MAP617-636p) se pudo justificar adecuadamente. Solo era visible una senal con la cepa de referencia MAP (ATCC 19698). La reaccion de las otras especies bacterianas era comparable con el control negativo.

Para una mayor claridad de la especificidad, se sometieron a ensayo los cebadores (MAP523-542f/MAP661-642r) asf como la sonda TaqMan (MAP617-636p) con respecto a la reactividad cruzada con otras especies de micobacterias (n = 13).

El ADN empleado de las cepas de micobacterias de referencia se purifico a partir de cultivos como se ha descrito anteriormente y se sometio a ensayo mediante Nano-Drop®. El ADN se ajusto a una concentracion de 1 ng/pl. El ADN espedfico de especie de las cepas de referencia se confirmo mediante el uso de un procedimiento publicado de PCR "multiplexada" (Shin et al., 2010, Journal of Clinical Microbiology 48 (11), 4057-4062). Como control negativo, se utilizo agua destilada, esteril. La mezcla de reaccion y las condiciones de reaccion fueron como las indicadas en la bibliograffa.

Los productos de la PCR que se esperaban de las diversas especies de micobacterias se podfan reconocer claramente sobre el gel de agarosa. Para una mayor clarificacion de la especificidad de los cebadores (MAP523- 542f/MAP661 -642r), se sometio a ensayo en los mismos la reactividad cruzada con otras especies de micobacterias en la PCR clasica (Figura 4).

Los productos de la PCR de 139 pb esperados se podfan reconocer claramente sobre el gel de agarosa solo en el caso del ADN de MAP (ATCC 19698). Los productos de la amplificacion en la region de 139 pb no se presentaban con otras especies de micobacterias (n = 13). Por lo tanto, los cebadores utilizados (MAP523-542f/MAP661-642r) se pueden considerar espedficos de MAP en relacion con otras especies de micobacterias.

Despues de que la especificidad de los cebadores (MAP523-542f/MAP661-642r) se habfa comprobado en la PCR clasica, basandose en cepas de micobacterias de referencia (n = 13), se tema que confirmar la especificidad de la sonda

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(MAP6i7-636p) en combinacion con los cebadores en la PCR en tiempo real. Como control negativo, se utilizo agua destilada, esteril. La mezcla de reaccion as^ como las condiciones de reaccion para la PCR en tiempo real con la sonda TaqMan en el LightCycler® 480 fueron como ya se han definido anteriormente.

La especificidad para MAP de los cebadores (MAP523-542f/MAP66i-642r) y de la sonda TaqMan (MAP6i7-636p) tambien se pod^a justificar adecuadamente frente a otras especies de micobacterias. Solo era visible una senal con la cepa de referencia de MAP (ATCC 19698). La reaccion de las otras cepas de micobacterias era comparable con el control negativo.

El lfmite de deteccion o la sensibilidad de la PCR en tiempo real TaqMan se desarrollo mediante una serie de titulaciones desde 1 ng/pl a 1 fg/pl de ADN plasmfdico y ADN de MAP (aTcC 19698) del cultivo (Figura 5).

Para la preparacion del ADN plasirndico, se clonaron productos de la PCR (139 pb) y se purificaron como se ha descrito anteriormente. A continuacion, se determino el contenido en acido nucleico del ADN plasirndico por medio de NanoDrop® y se preparo una serie de diluciones desde 1 ng/pl a 1 fg/pl.

Cuando se empleaba ADN de MAP obtenido a partir de un cultivo, se alcanzaba un lfmite de deteccion de 10 fg/pl. El genoma de MAP tiene una longitud de 4,7 106 pb (Cocito et al., 1994, Clinical Microbiology Reviews 7 (3), 328345). Utilizando la constante de Avogadro 6,022 1023 mol-1 y el peso molecular de una pareja de bases de 660 g * mol-1, se podfa calcular que 5,15 fg se corresponden con una unidad genomica (Munster et al., 2011, Veterinary Microbiology 154, 197-201, Munster et al., 2012). De acuerdo con este calculo, el lfmite de deteccion con 10 fg/pl era de aprox. 2 unidades genomicas.

Despues de comprobar la especificidad y la sensibilidad, se sometio a ensayo la eficacia de la PCR en tiempo real. La eficacia representa una caractenstica de la calidad de una PCR cuantitativa en tiempo real. Comparando los valores de Cp obtenidos y de la concentracion de ADN de MAP, se creo una curva estandar. Una curva estandar proporciona la concentracion logantmica del ADN aislado del agente patogeno en los respectivos grados de dilucion. La pendiente de la recta era de -3,42 ± 0,23, el error de 0,04 ± 0,02 y la eficacia de 1,97 ± 0,08 (valoracion por el metodo "del maximo de la 2a derivada"). De este modo, se demostro que la curva estandar lineal era adecuada para un uso cuantitativo de la PCR en tiempo real TaqMan.

La capacidad de reproduccion de la PCR en tiempo real se determino a partir de 9 repeticiones en el LightCycler® 480 (3 * 3 ejecuciones) y se evaluo mediante el metodo "del maximo de la 2a derivada" y el metodo de "punto de ajuste". Para la visualizacion, el valor medio respectivo y la desviacion estandar de los "puntos de cruce" (Cp), es decir, el numero de ciclos en los que la fluorescencia se eleva por encima de la fluorescencia de fondo, se calcularon y se representaron como un diagrama de barras (Figuras 6 y 7).

Se pudo mostrar que la PCR en tiempo real produda resultados reproducibles. Las nueve repeticiones proporcionaron valores medios similares de los valores de Cp, mientras que la desviacion estandar era estadfsticamente baja (maximo ± 0,73).

Una valoracion por el metodo del "punto de ajuste" tambien obtuvo resultados reproducibles con una sensibilidad constante de 10 fg/pl.

Para comprobar la capacidad de cuantificacion de la PCR en tiempo real TaqMan y para ilustrar la concordancia de la concentracion de ADN de MAP calculada con la conocida, estas se calcularon y se compararon en la Tabla 3. Las concentraciones de ADN se calcularon tanto con el metodo "del maximo de la 2a derivada" como con el del "punto de ajuste". Con este ultimo, la "banda de ruido de fondo" se fijo manualmente en 6,00 y el "umbral" en 3,00.

TABLA 3 Cuantificacion del ADN de MAP a partir de un cultivo con grados de dilucion logantmica mediante PCR en tiempo real TaqMan sobre la base de 9 repeticiones (3 x 3 ejecuciones). La valoracion se realizo mediante metodos "del maximo de la 2a derivada" y de "punto de ajuste".

Muestra: Maximo de la 2a derivada Conc. conocida Conc. calculada valor de Cp Punto de ajuste Conc. calculada valor de Cp

1 ng/pl: 10-9 9,17 x 10-10 22,79 ± 0,65 1,10x 10'9 21,00 ± 0,62

100 pg/pl: 10-10 1,25 x 10-10 25,76 ± 0,07 1,33 x 10'10 23,94 ± 0,34

10 pg/pl: 10-11 9,12 x 10-12 29,61 ± 0,38 7,62 x 10'12 27,88 ± 0,52

1 pg/pl: 10-12 8,19 x 10'13 32,82 ± 0,39 7,46 x 10'13 31,11 ± 0,54

100 fg/pl: 10'13 1,29 x 10-13 35,18 ± 0,36 1,14 x 10'13 33,73 ± 0,35

10 fg/pl: 10-14 1,05 x 10-14 37,61 ± 0,73 1,26 x 10'14 36,80 ± 0,94

1 fg/pl: 10-15 - - - -

NTC: - - - - -

Valores similares de las concentraciones de ADN conocidas y calculadas indicaban una capacidad de cuantificacion basica del ADN de MAP mediante PCR en tiempo real TaqMan. Incluso cuando se evaluaron las mezclas de reaccion de la serie de diluciones del ADN de MAP mediante el metodo de "punto de ajuste" ("banda de ruido de 5 fondo" 6,00, "umbral" 3,00), con una sensibilidad que permaneda igual, los resultados de las concentraciones calculadas de ADN no se falsificaron.

La estabilidad o la sensibilidad de una PCR puede estar afectada en condiciones de campo cuando el ADN se extrae de heces o de tejidos. La posible accion inhibidora se excluyo por medio de una serie de diluciones del ADN plasirndico (de 1 ng/pl a 1 fg/pl) que se hada mezclado con ADN procedente de heces negativas (Figura 8).

10 Incluso cuando se presentaron mezclas de reaccion de la serie de diluciones de ADN plasirndico con ADN procedente de heces negativas para MAP, con una sensibilidad que permaneda igual, el resultado no estaba falsificado. Para ilustrar la coincidencia de las concentraciones calculadas de ADN de MAP con las conocidas, estas se calcularon y se compararon en la Tabla 4.

Tabla 4: Concentraciones calculadas y valores de Cp hallados de ADN plasirndico en series de diluciones en 15 diluciones logantmicas en base 10 (de 1 ng/pl a 1 fg/pl) a traves de PCR en tiempo real TaqMan.

H2O ADN fecal

Muestra: Conc. conocida Conc. calculada Punto de cruce Conc. calculada Punto de cruce

1 ng/pl: 10-9 9 ,63 x 10'10 11 ,61 ± 0 07 9 ,97 x 10'10 13,53 ± 0 12

100 pg/pl: 10'10 1 ,08 x 10'10 15 ,27 ± 0 22 1 ,05 x 10'10 CO CO co~ ± 0 02

10 pg/pl: 10'11 9 ,67 x 10'12 19 ,22 ± 0 11 9 ,42 x 10'12 20,47 ± 0 14

1 pg/pl: 10'12 7 ,51 x 10'13 23 ,33 ± 0 24 9 ,89 x 10'13 CO CO co~ CM ± 0 03

100 fg/pl: 10'13 9 ,00 x 10'14 26 ,63 ± 0 15 1 CO O x 10'13 27,20 ± 0 07

10 fg/pl: 10'14 1 ,14 x 10'14 29 ,75 ± 0 CD O 9 ,83 x 10'15 30,13 ± 0 17

1 fg/pl: 10'15 9 ,85 x 10'16 33 ,33 ± 0 07 1 ,01 x 10'15 32,34 ± 0 03

NTC: - - - - -

A pesar de la mezcla con ADN de heces negativas para MAP, no se reconoce ningun desplazamiento grave de los valores. Valores similares de las concentraciones de ADN conocidas y calculadas indican una capacidad de uso basica de la PCR en tiempo real TaqMan para cuantificar el ADN de MAP independientemente de las heces de la 20 matriz.

Para tener una amplia capacidad de aplicacion de la PCR en tiempo real en el diagnostico de rutina asf como en la investigacion, debe estar garantizada la deteccion del ADN de MAP en diferentes matrices. Para demostrar su uso universal, las muestras tomadas del archivo de diagnostico de rutina y que ya hadan dado como positivas en la PCR "semianidada", se comprobaron dos veces en el LightCycler® 480. Se seleccionaron muestras de heces, leche, 25 esperma, sangre, tejidos y entorno (Figura 9).

El ADN de MAP se podfa detectar de forma fiable en todas las matrices en ambas ejecuciones. Los valores de Cp para ambas ejecuciones y los valores medios (MW) y la desviacion estandar (STBW) se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Valores de Cp calculados de las diferentes matrices en el LightCycler® 480 con sonda TaqMan.

: Heces Leche Esperma Sangre Tejidos Entorno

Ejecucion 1: 25,07 33,53 27,83 30,00 33,26 29,33

Ejecucion 2: 26,28 33,34 27,85 29,97 31,88 29,30

MW: 25,68 ± 33,44 ± 27, 84 ± 29,99 ± 32, 57 ± 29,32 ±

STBW: 0,86 0,13 0,01 0,02 0,98 0,02

30 Las muestras de heces, leche, esperma, sangre, tejidos y entorno sometidas a ensayo dieron una senal fluorescente clara con valores de Cp entre 25,07 y 33,53. El resultado era reproducible con desviaciones estandar de 0,02 a 0,98.

Para el uso de la PCR en tiempo real para la deteccion de paratuberculosis en rumiantes, se pueden utilizar tambien sistemas de control para la amplificacion (por ejemplo, canal HEX) o extraccion (por ejemplo, canal Cy5) que se pueden detectar independientemente a traves de otras etiquetas o marcadores. Al mismo tiempo, la extraccion 35 exitosa de acido nucleico se puede detectar, por ejemplo, mediante una amplificacion del gen diana p-actina. Otros

sistemas de control para la amplificacion o la extraccion son conocidos por el experto en la tecnica. El protocolo final para la PCR en tiempo real TaqMan de MAP es el siguiente:

95°C: 10 min

95°C: 15 s

60°C: 30 s 40 ciclos

72°C: 35 s

En el analisis con un sistema de control para la amplificacion y la extraccion en el canal FAM (465-510 nm), las 5 muestras tomadas del archivo tambien proporcionaron una senal fluorescente clara y reproducible con valores medios de Cp entre 23,58 y 33,29 asf como desviaciones estandar de 0,02 a 0,98.

El ensayo descrito se evaluo con 13 vacas que habfan dado positivo para MAP. Para ello, se extrajo ADN de las muestras fecales y MAP se sometio a ensayo con la PCR en tiempo real descrita. Aqu se mostraba que la prueba podfa detectar MAP en muestras fecales.

10 Por ultimo, para confirmar la solidez de la prueba, se analizaron muestras de organos procedentes de diferentes areas intestinales de dos vacas. Como se puede observar en las tablas siguientes, el ensayo de acuerdo con la invencion es adecuado para la deteccion de MAP.

Tabla 7: Uso cuantitativo de la PCR en tiempo real TaqMan de IS900 para la deteccion de MAP en muestras de tejidos de dos vacas que padecen paratuberculosis. Se muestran los valores de Cp medidos tres veces en el canal 15 FAM (465-510 nm).

Animal Muestra Canal FAM (465-510 nm)

Animal A: duodeno 32,68 ± 0,21

: yeyuno 28,00 ± 0,12

: fleon 27,09 ± 0,08

: ciego 25,06 ± 0,04

: Ln cecal 33,00 ± 0,23

Animal B: duodeno 33,79 ± 0,69

: yeyuno 34,33 ± 0,61

: fleon 25,52 ± 0,03

: ciego 24,53 ± 0,03

: Ln cecal 28,86 ± 0,11

Todas las muestras mostraban una curva de amplificacion en el canal FAM con valores de Cp de 24,53 a 34,33 y desviaciones estandar de 0,03 a 0,69.

Para una valoracion cuantitativa, como ya se ha descrito anteriormente, se calculo la concentracion de ADN asf 20 como las unidades genomicas de MAP por gramo de tejido (Tabla 8) y se presentaron en forma de grafico (Figura 10).

TABLA 8: Uso cuantitativo de la PCR en tiempo real TaqMan de IS900 para la deteccion de MAP en muestras de tejidos de dos vacas que padecen paratuberculosis. Para la cuantificacion de MAP en los tejidos, se calculo la concentracion de ADN y el numero de unidades genomicas por gramo de tejido.

Animal: Muestra Concentracion de ADN MAP / g de tejido

Animal A: duodeno 7,99 x 10'14 6,21 x 103

: yeyuno 4,04 x 10'12 3,14 x 105

: fleon 8,13 x 10'12 6,32 x 105

: ciego 3,57 x 10'11 2,77 x 106

: Ln cecal 5,96 x 10'14 4,63 x 103

5

10

15

20

25

30

Animal: Muestra Concentracion de ADN MAP / g de tejido

Animal B: duodeno 3,27 x 10'14 2,54 x 103

: yeyuno 1,91 x 10'14 1,48 x 103

: fleon 2,57 x 10'11 2,00 x 106

: ciego 5,17 x 10'11 4,02 x 106

: Ln cecal 2,05 x 10'12 1,59 x 105

En un estudio de validacion, los kits comercialmente disponibles para la PCR de MAP de Adiavet (Adiavet ParaTB Realtime), AB-TaqMan (Applied Biosystems Taq-ManMAP) y Vetmax (Applied Biosystems VetMax MAP Real Time PCR Screening Kit), asf como un ensayo de PCR publicado en Bull et al. (Tim J. Bull et al., 2007, PloS One 2007(11), e1229), se sometieron a un ensayo comparativo con la PCR en tiempo real descrita en este documento. Esto se realizo con los kits comercialmente disponibles, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como referencia, se utilizo una PCR semianidada (snPCR) (Munster P. et al., Vet Microbiol. 2011: 154(1-2): 197-201). Con la deteccion de 1 unidad genomica, posee la sensibilidad mas alta y es superior a todos los procedimientos "en tiempo real" en cuanto a sensibilidad. Sin embargo, a partir del estado de la tecnica general es sabido que tales snPCRs no son adecuadas para aplicaciones rutinarias debido al riesgo de contaminacion extremadamente alto por rendimiento de masa.

Las ejecuciones de la PCR se llevaron a cabo en un aparato Roche LightCycler 480. La snPCR se realizo de forma convencional en un termociclador convencional (Biometra "Trio").

Como muestras del ensayo, estaban disponibles 14 muestras fecales que dieron negativo por medio de una PCR semianidada (sn-PCR) y 35 muestras fecales que dieron positivo a partir de un diagnostico de rutina (N = 49).

Los resultados de la prueba se resumen en la Tabla 9 para las muestras fecales que dieron positivo. Se promediaron los valores de Cp de dos pruebas. Si estaban disponibles los resultados de una sola prueba, estos se utilizaron para los analisis posteriores. La validacion en la Tabla 9 muestra la diferencia entre los valores de Cp. En primer lugar, la PCR en tiempo real TaqMan se comprobo en comparacion con todas las PCRs comercialmente disponibles. Para ello, en cada caso, se resto el “valor de Cp de las muestras de PCR TaqMan" correspondiente del “valor de Cp de las muestras de PCR comparativa" correspondiente. Un valor positivo en la columna correspondiente indica que el valor de Cp de las muestras de PCR TaqMan era mayor que el valor comparativo restado. Por consiguiente, la PCR tema una sensibilidad peor que la PCR comparativa, ya que segun la definicion, cuanto menor es el valor de Cp, mayor es la sensibilidad. De forma similar, se realizo una comparacion entre la PCR TaqMan y la PCR publicada de Bull et al., en donde el volumen final en la PCR en tiempo real TaqMan se correspondfa con la PCR descrita por Bull et al. (en cada caso, 50 pl en lugar de 20 pl).

El estudio comparativo llega a la conclusion de que las PCRs en tiempo real recien desarrolladas eran todas superiores a las PCRs comparativas. [La PCR en tiempo real TaqMan Plus en la version clasica (5 pl de molde) gano a todas las PCR comparativas. Tambien era escasamente superior a su propia modificacion con 8 pl de molde].

Tabla 9:

Resultados del estudio de validacion

N° de ejec.: snPCR Taq-Man TaqMan Taq-Man Taq-Man

Adiavet: ABTaqMan Vetmax Bull et al.

1: + -7,55 -2,92 -2,06 -5,31

2: + -7,44 -2,91 -2,00 -5,59

3: + -2,73 -1,54 -1,02 -4,62

4: + -2,67 -1,23 -0,79 -4,30

5: + -6,95 -2,42 -1,23 -4,57

6: + -3,65 -1,61 -0,47 -3,37

7: + -10,07 -1,39 0,74 -2,32

8: + -6,49 -2,31 -1,37 -4,44

9: + -7,95 -8,10 -10,97 -4,89

5

Resultados del estudio de validacion

N° de ejec.: snPCR Taq-Man TaqMan Taq-Man Taq-Man

Adiavet: ABTaqMan Vetmax Bull et al.

10: + -2,19 -1,82 -6,31 -0,27

11: + -4,85 -10,82 -13,86 -8,96

12: + -2,56 -7,86 -13,82 -7,72

13: + -9,21 -9,43 -12,34 -3,61

14: + + 0,41 2,75 1,73 -2,59

15: + + -3,85 -0,28 -1,40 -4,75

16: + -11,20 -11,20 -11,20 -4,39

17: + -11,95 -11,95 -11,95 -4,36

18: + 3,59 9,85 8,76 5,59

19: + -10,11 -10,11 -10,11 -2,92

20: + -12,24 -12,24 -12,24 -5,77

21: + -12,34 -13,03 -13,03 -3,17

22: + -6,48 -6,48 -6,48 -6,48

23: + 0,00 8,07 6,93 4,29

24: + 2,94 2,81 0,00 0,73

25: + -8,91 -9,15 -11,62 -9,78

26: + 0,00 0,00 0,00 5,98

27: + 3,05 2,88 0,00 5,21

28: + -12,30 -12,30 -12,30 -4,65

29: + 0,00 0,00 0,00 1,63

30: + 0,00 0,00 0,00 1,91

31: + -13,52 -13,52 -13,52 /

32: + -11,59 -11,59 -11,59 /

33: + -10,40 -10,40 -10,40 -10,40

34: + 0,00 0,00 0,00 0,00

35: + 0,00 0,00 0,00 0,00

I------------------------------1--------------------1-------------------------1-------------------------------1-------------------------1--------------------------

: mejor 25/35 25/35 24/35 24/33

: igual 6/35 5/35 7/35 2/33

: peor 4/35 5/35 4/35 7/33

La comparacion anterior muestra claramente que el procedimiento de acuerdo con la invencion con los cebadores de acuerdo con la invencion, es superior en la sensibilidad a los procedimientos descritos en el estado de la tecnica y a los kits de ensayo comercialmente disponibles.

Breve descripcion de las Figuras

Figura 1: Representacion grafica de los cebadores utilizados (MAP523-542f/MAP66i-642r) as^ como de documentos de patente de IS900.

Figura 2: Aclaracion de la especificidad de los cebadores (MAP523-542f/MAP66i-642r) con especies no micobacterianas. Para este proposito, se separaron productos de PCR amplificados mediante electroforesis en gel (1,5% de gel de agarosa).

10

15

20

Figura 3: Determinacion de la especificidad de la PCR en tiempo real TaqMan en el Light Cycler® 480 utilizando cepas de referencia (n = 14).

Figura 4: Aclaracion de la especificidad de los cebadores (MAP523-542f/MAP66i-642r) con otras especies de micobacterias. Para este proposito, se separaron productos de PCR amplificados mediante electroforesis en gel (1,5% de gel de agarosa).

Figura 5: Determinacion de la especificidad de la PCR en tiempo real mediante el ADN de MAP de ATCC 19698. A: 1 ng/pl, B: 100 pg/pl, C: 10 pg/pl, D: 1 pg/pl, E: 100 fg/pl, F: 10 fg/pl, G: 1 fg/pl, NTC: agua esteril.

Figura 6: Capacidad de reproduccion de la PCR en tiempo real TaqMan basandose en 9 repeticiones (3x3 ejecuciones) (eficacia = 1,97 ± 0,08; error = 0,04 ± 0,02). La valoracion se llevo a cabo por el metodo "del maximo de la 2a derivada".

Figura 7: Capacidad de reproduccion de la PCR en tiempo real TaqMan basandose en 9 repeticiones (3x3 ejecuciones) (eficacia = 2,07 ± 0,09; error = 0,18 ± 0,03). La valoracion se llevo a cabo por el metodo de “punto de ajuste”.

Figura 8: Representacion grafica de las curvas de amplificacion de las series de diluciones de ADN plasmfdico (de 1 ng/pl a 1 fg/pl) mezclado con H2O (A) y ADN fecal (B) en el LightCycler® 480 con una sonda TaqMan. Curvas de izquierda a derecha: 1 ng/pl, 100 pg/pl, 10 pg/pl, 1 pg/pl, 100 fg/pl, 10 fg/pl, 1 fg/pl, agua esteril (NTC).

Figura 9: Representacion grafica de las curvas de amplificacion para la deteccion de ADN de MAP procedente de diferentes matrices en el LightCycler® 480 con una sonda TaqMan.

Figura 10: Aplicacion cuantitativa de la PCR en tiempo real TaqMan de IS900 para la deteccion de MAP en muestras de tejido. Comparacion del animal A y del animal B. Las barras representan el valor medio y la desviacion estandar (3 repeticiones) de la concentracion de MAP calculada en diversos tejidos.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la deteccion espedfica y opcionalmente la cuantificacion de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) en una muestra de un individuo que comprende la etapa de:

- detectar la region IS900 de un genoma de MAP en una muestra de un individuo con la ayuda de una amplificacion de acido nucleico, en donde esa amplificacion se efectua con oligonucleotidos espedficos que consisten respectivamente en al menos 15 nucleotidos consecutivos de las secuencias segun Seq. ID n° 1 y Seq. ID n° 2

en donde la deteccion de la region IS900 de al menos un genoma de MAP indica la presencia de MAP en el individuo.
2. Procedimiento para la deteccion espedfica de MAP segun la reivindicacion 1, en el que la deteccion se lleva a cabo mediante una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
3. Procedimiento para la deteccion espedfica de MAP segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la deteccion se lleva a cabo mediante una PCR en tiempo real, preferiblemente como una PCR cuantitativa.
4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque especialmente en el caso de la PCR, la deteccion de la region IS900 comprende el uso de una sonda de acido nucleico que se hibrida con la region IS900 del genoma de MAP y/o con un acido nucleico complementario a la region IS900 del genoma de MAP.
5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la deteccion mediante una PCR cuantitativa en tiempo real se lleva a cabo mediante el uso de una sonda procedente de un oligonucleotido con al menos 15 nucleotidos consecutivos segun Seq. ID n° 3.
6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra es una procedente de muestras de heces, leche, sangre, esperma, tejidos, organos y entorno.
7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra procede de animales rumiantes, en particular de vacas, ovejas y cabras, o de seres humanos.
8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, en el que la deteccion espedfica de MAP se lleva a cabo mediante una PCR en tiempo real, y el empleo de los oligonucleotidos segun Seq. ID n° 1, Seq. ID n° 2 y Seq. ID n° 3.
9. Kit de ensayo para la deteccion espedfica de MAP en una muestra mediante un procedimiento de amplificacion, en particular por medio de PCR, caracterizado porque el kit de ensayo comprende oligonucleotidos para la amplificacion de la region IS900 de MAP con al menos 15 nucleotidos consecutivos segun Seq. ID n° 1 y 2, respectivamente.
10. Kit de ensayo segun la reivindicacion 9, caracterizado porque comprende ademas una sonda con al menos 15 nucleotidos consecutivos segun Seq. ID n° 3.
11. Kit de ensayo segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizado porque presenta ademas medios para la obtencion de ADN genomico a partir de muestras, en particular muestras de heces, leche, sangre, esperma, organos, tejidos y entorno.
12. Kit de ensayo segun una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque presenta ademas medios para la realizacion de una PCR, particularmente una PCR en tiempo real.
13. Uso de un kit de ensayo segun una de las reivindicaciones 9 a 12, para la deteccion espedfica de IS900 de MAP en muestras, en particular muestras de heces, leche, sangre, esperma, tejidos, organos y entorno en un individuo.
14. Oligonucleotidos para la deteccion espedfica y, opcionalmente, para la cuantificacion de MAP en una muestra de un individuo, caracterizados porque los oligonucleotidos tienen las siguientes secuencias de nucleotidos: un oligonucleotido con al menos 15 nucleotidos consecutivos de Seq. ID n° 1, un oligonucleotido con al menos 15 nucleotidos consecutivos de Seq. ID n° 2 y, opcionalmente, un oligonucleotido con al menos 15 nucleotidos consecutivos de Seq. ID n° 3, preferiblemente, los oligonucleotidos segun Seq. ID n° 1, Seq. ID n° 2 y Seq. ID n° 3.
15. Uso de los oligonucleotidos segun la reivindicacion 14, para la deteccion espedfica y, opcionalmente, para la cuantificacion de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), en particular por medio de una PCR cuantitativa en tiempo real.