ES2643268T3 - Métodos para identificar anticuerpos neutralizantes contra VIH - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para determinar anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra, que comprende: (i) poner en contacto una célula que comprende el sitio de unión a CD4 de gp120 en su superficie con dicha muestra y con una proteína de fusión que comprende (i) una proteína capaz de unirse al sitio de unión a CD4 de gp120 y (ii) una región Fc de un anticuerpo primario, y (ii) medir la eficacia de unión de dicha proteína de fusión al sitio de unión CD4 de gp120, en el que los anticuerpos neutralizantes de VIH se determinan en dicha muestra si dicha unión se inhibe en presencia de la muestra.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para identificar anticuerpos neutralizantes contra VIH Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo in vitro para identificar anticuerpos neutralizantes contra VIH en una muestra. La invencion tambien se refiere a una protema de fusion para su uso en dicho metodo y al acido nucleico que codifica dicha protema de fusion.

Antecedentes de la invencion

Durante el transcurso de un proceso de infeccion el organismo desarrolla una amplia respuesta humoral dirigida contra diferentes antfgenos del patogeno que, junto con las respuestas innata y de linfocitos T, controla la infeccion y conserva la integridad del organismo. En el marco de una infeccion por VIH-1, esta respuesta humoral puede detectarse pronto durante la infeccion pero se sabe que es ineficaz, principalmente porque los anticuerpos producidos por la mayona de los pacientes reconocen epftopos vfticos que no pueden interferir con el ciclo de replicacion del virus. Vease Tomaras G, et al., J. Virol. 2008; 82:12449-12463. De hecho, pueden identificarse anticuerpos con la capacidad de neutralizar el virus autologo despues de unos pocos meses solamente en algunos pacientes; y se requieren varios anos para desarrollar anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAb, por sus siglas en ingles). Vease, Mascola J, et al., Annu. Rev. Immunol. 2010; 28:413-444. Hasta la fecha, solo se han identificado unos pocos anticuerpos ampliamente neutralizantes y todos ellos reconocen un conjunto de epftopos conservados en la protema de la envuelta con un papel importante en la aptitud vftica. Estos anticuerpos incluyen anticuerpos anti-sitio de union de CD4 (CD4bs) (IgGb12 y VCR01), anticuerpos anti-epftopos inducidos por CD4 (X5), anticuerpos anti-gp41 (2F5 y 4E10), anticuerpos anti-carbohidratos (2G12), anti-epftopos cuaternarios glucosilados (PG9 y Pg16) y anticuerpos anti-nucleo. Vease, Barbas C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1992; 89:9339-9343, Wu X, et al., Science 2010; 329: 856-861, Moulard M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:6913-6918, Muster T, et al., J. Virol. 1993; 67:6642-6647, Zwick M, et al., J. Virol. 2001; 75:10892-10905, Scanlan C, et al., J. Virol. 2002; 76:7306-7321, Walker L, et al., Science 2009; 326:285-289 y Pietzsch J, et al., J. Exp. Med. 2010; 207:1995-2002. Entre ellos, los anticuerpos que pueden bloquear la interaccion de gp120/CD4 tales como los anticuerpos anti- CD4bs pueden subrayarse por varias razones: 1) reconocen una region conservada de gp120, 2) pueden neutralizar un amplio numero de aislados vfticos y 3) pueden prevenir o controlar la infeccion como se ha mostrado en modelos animales de infeccion por VIH-1. Vease, Hessell A, et al., Nat. Med. 2009; 15:951-954, Hessell A, et al., Nature 2007; 449:101-104, y Veazey R, et al., Nat. Med. 2003; 9:343-346. Por tanto, la induccion de este tipo de bnAb es un fin interesante para cualquier estrategia de vacunacion. Sin embargo, uno de los principales impedimentos en el estudio de estos anticuerpos es su identificacion. Los anticuerpos ampliamente neutralizantes en general, y los anticuerpos CD4bs en particular, reconocen epftopos conformacionales que son difmiles de imitar in vitro. Hasta la fecha, se han seguido diversas estrategias para estudiar los anticuerpos contra CD4bs, incluyendo el uso de protemas recombinantes y variantes mutantes que son reconocidas diferencialmente por estos anticuerpos. Vease, Li Y, et al., Nat. Med. 2007; 13:1032-1034, and Lynch R, et al., J. Virol. 2012; 86(4):7588-7595, y Wu, 2010, anteriormente. Ademas, recientemente se ha desarrollado un ensayo de transferencia vmca de celula a celula que permite detectar la presencia de anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120 en muestras de plasma. Este ensayo se basa en el proceso de entrada del virus, que se inhibe por completo en presencia de anticuerpos que bloquean la interaccion gp120/CD4 como los anticuerpos contra CD4bs o anti-CD4. Por definicion cualquier anticuerpo que sea capaz de bloquear la interaccion entre gp120 y el receptor CD4 podna ser un anticuerpo neutralizante. Ademas, este planteamiento mostro una fuerte correlacion entre la presencia de anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4 y la capacidad neutralizante del plasma. Vease, Sanchez-Palomino S, et al., Vaccine 2011; 29:5250-5259. Mas recientemente, se ha mostrado que mas del 80 % de los pacientes infectados por VIH-1 pueden desarrollar anticuerpos contra CD4bs, lo que indica que esta reactividad podna ser mas frecuente de lo que se habfa descrito previamente. Vease, Lynch, 2012, anteriormente.

Sin embargo, no se pudo establecer en este caso una correlacion clara entre la presencia de estos anticuerpos y la capacidad neutralizante de las muestras de plasma. Estas discrepancias indican que la metodologfa es un punto importante a considerar antes de planificar el analisis de los anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4. Hay una necesidad en la tecnica de metodos mas rapidos y fiables para identificar anticuerpos neutralizantes de VIH.

Sumario de la invencion

En un primer aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro para determinar los anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra, que comprende:

(i) poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con dicha muestra y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario, y

(ii) medir la eficacia de union de dicha protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120,

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en el que los anticuerpos neutralizantes de VIH se determinan en dicha muestra si dicha union se inhibe en presencia de la muestra.

En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario.

En un tercer aspecto, la invencion se refiere a un acido nucleico que codifica la protema de fusion del segundo

aspecto y a una casete de expresion, o un vector que comprende dicho acido nucleico.

En un cuarto aspecto, se desvela en el presente documento un kit que comprende la (i) protema de fusion del

segundo aspecto, el acido nucleico, el vector o el linfocito Transgenica del tercer aspecto y (ii) un indicador capaz de unirse a dicha protema de fusion.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro para la identificacion de una celula productora de anticuerpos que expresa anticuerpos neutralizantes de VIH, que comprende:

(i) poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con un sobrenadante de un cultivo de dicha celula productora de anticuerpos y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario, y

(ii) medir la eficacia de union de dicha protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120,

en el que la celula productora de anticuerpos se determina como que expresa anticuerpos neutralizantes de VIH si dicha union se inhibe en presencia de dicho sobrenadante.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para producir anticuerpos neutralizantes de VIH, que comprende:

(i) cultivar celulas productoras de anticuerpos aisladas de acuerdo con el metodo de la invencion, y

(ii) aislar los anticuerpos expresados por dichas celulas productoras de anticuerpos.

En aun otro aspecto, se desvelan en el presente documento anticuerpos neutralizantes de VIH producidos usando un metodo de acuerdo con la invencion o por celulas productoras de anticuerpos identificadas por un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones para su uso en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad asociada a una infeccion por VIH.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Diagramas del plasmido de expresion pcDNA3.1huCD4mIgG1. Se muestran las caractensticas principales del plasmido, tales como el marcador de seleccion y el marco abierto de lectura. Se uso el programa PlasMapper (
http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper/ Agosto 2012) para dibujar el diagrama.

Figura 2. Titulacion del sobrenadante de HEK 293 que contiene la protema de fusion huCD4mIgG1. A. Se uso el sobrenadante de una lmea celular HEK 293 transfectada con el plasmido pcDNA3.1huCD4mIgG1 para tenir NL4.3 en una lmea celular MOLT cronicamente infectada. La protema huCD4mIgG1 unida a gp120 en la superficie celular se identifico usando una IgG de cabra anti-raton conjugada a DyLight-649. Como control negativo se uso una lmea celular MOLT sin infectar. B. Titulacion del sobrenadante usado para tenir la lmea celular MOLT NL4.3.

Figura 3. Actividad bloqueante de CD4/gp120 del CD4bs-bNAb IgGb12. Se determino la titulacion de la actividad bloqueante de CD4/gp120 del anticuerpo IgGb12 empezando a 48 pg/ml. Se muestra una representacion esquematica del mecanismo de accion de IgGb12 bloqueando la interaccion entre CD4 y gp120.

Figura 4. Relacion entre la especificidad de anticuerpos y la actividad bloqueante de CD4-gp120. Las especificidades implicadas en la actividad bloqueante de CD4-gp120 se ensayaron utilizando varios anticuerpos que reconodan un conjunto conocido de epftopos en la glucoprotema env. Solo los anticuerpos que reconodan el CD4bs en gp120 (IgGb12, VRC01 y vRc03) o el gp120bs en CD4 (Leu3a) bloquearon la interaccion entre gp120 y CD4, haciendo el ensayo altamente espedfico para este tipo de reactividades.

Figura 5. Cuantificacion de los anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120 en muestras de plasma. Para determinar la presencia de anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120, tal como IgGb12, en muestras de plasma, se determino la actividad bloqueante de CD4/gp120 por citometna de flujo. Se incluyo una curva patron con IgGb12 para cuantificar la presencia de anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120. Los plasmas ampliamente neutralizantes (plasmas aN) mostraron una presencia principal de anticuerpos bloqueantes de gp120-CD4 que los plasmas no aN.

Figura 6. Cuantificacion de los anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120 en muestras de plasma de pacientes infectados con VIH-1 sin tratamiento previo con TAR (VIH-1) e individuos control sin infectar (HC). Se probo la presencia de anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120 en 72 muestras de plasma de pacientes infectados con VIH-1 (drculos rojos) y 10 controles sin infectar (cuadrados azules). Los datos muestran el porcentaje de inhibicion de CD4/gp120. Se fijo como lfmite positivo la mediana mas dos veces la desviacion convencional de

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los valores obtenidos con individuos controles sin infectar. Segun este criterio de positividad (lmea de puntos), el 43 % de las muestras de VIH-1 (31 de 72) y el 10 % de los controles sin infectar (1 de 10) se consideraron positivos (p=0,0034, prueba de Mann-Whitney).

Figura 7. Cuantificacion de anticuerpos bloqueantes CD4/gp120 en muestras de plasma de pacientes infectados con VIH-1 sin tratamiento previo con TAR (VIH-1) e individuos control sin infectar (HC) usando el aislado de VIH- 1 BaL.7.A) La presencia de anticuerpos bloqueantes CD4/gp120 se probo en 72 muestras de plasma de pacientes infectados con VIH-1 (drculos rojos) y 9 controles sin infectar (cuadrados azules). Los datos muestran el porcentaje de inhibicion de CD4/gp120. Como lfmite positivo se fijo la mediana mas dos veces la desviacion convencional de los individuos control sin infectar. Segun este criterio de positividad (lmea de puntos), el 97 % de las muestras de VIH-1 (70 de 72) y el 0 % de los controles sin infectar se consideraron positivos (p=0,0034, prueba de Mann-Whitney). 7.B) el porcentaje de inhibicion de huCD4mIgG1 tanto en aislados de NL4-3 como de BaL obtenidos para cada muestra de plasma mostro una fuerte correlacion (p<0,0001, prueba de correlacion de Pearson).

Deposito de microorganismos

El plasmido pcDNA3.1huCD4mIgG1 se deposito el 25 de julio, 2012 en la DSMZ (Coleccion Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH), InhoffenstraUe 7 B, D-38124 Braunschweig, Republica Federal de Alemania con el numero de acceso DSM 26215.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un ensayo para la identificacion y semicuantificacion de anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra. La prueba se basa en el reconocimiento de la glucoprotema Env en la superficie de una celula infectada por VIH por una protema de fusion huCD4/IgG1 murina, aunque puede llevarse a cabo igualmente en diferentes marcos sobre los que se proporcionan detalles en el presente documento. Un anticuerpo se considerara neutralizante si es capaz de prevenir la union de la protema de fusion huCD4/IgG1 a la gp120 en la superficie de una celula infectada. Este nuevo enfoque ofrece varias ventajas: 1) las celulas infectadas con VIH expresan en su superficie la glucoprotema Env con una conformacion funcional y nativa, 2) el uso de una protema de fusion huCD4/IgG1 murina mimetiza la interaccion natural entre gp120 y CD4, 3) el diseno citometrico hace este ensayo reproducible y rapido y 4) es semicuantitativo y altamente espedfico.

1. Definiciones de terminos y expresiones generales

El termino “celula productora de anticuerpos”, como se usa en el presente documento, se refiere a una celula capaz de producir o secretar un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo, o que es capaz de desarrollarse en una celula que es capaz de producir o secretar un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo. Una celula productora de anticuerpos de acuerdo con la invencion es preferentemente una celula productora que esta adaptada a la produccion comercial de anticuerpos. Mas preferentemente, dicha celula productora es adecuada para la produccion de anticuerpos para su uso en seres humanos.

El termino “linfocito B”, como se usa en el presente documento, se refiere a un tipo de linfocito que desempena un gran papel en la respuesta inmune humoral (opuesto a la respuesta inmune celular, que esta dirigida por los linfocitos T). Las funciones principales de los linfocitos B son producir anticuerpos contra antfgenos, realizar el papel de celulas presentadoras de antfgenos (CPA) y finalmente desarrollarse a linfocitos B de memoria despues de la activacion mediante la interaccion con el antfgeno. Los linfocitos B son un componente esencial del sistema inmune adaptativo.

El termino “eficacia de union”, como se usa en el presente documento, se refiere a la afinidad de un compuesto, preferentemente un anticuerpo, al sitio de union a CD4 de gp120. “Afinidad” significa la fuerza con la que dicho compuesto se une al sitio de union a CD4 de gp120. Esta determinada por interacciones no covalentes tales como interacciones ionicas como atraccion de cargas opuestas en aminoacidos, puentes de hidrogeno o interacciones hidrofobas. Como se usa en el presente documento, el termino “union” o “union espedfica”, se refiere a la interaccion entre pares de union (por ejemplo dos protemas o compuestos, preferentemente el dominio de union a CD4 de gp120 y CD4 o un compuesto, preferentemente un anticuerpo, espedfico para este sitio de union). En algunas realizaciones, la interaccion tiene una constante de afinidad de como maximo 10-6 moles/litro, como maximo 10-7 moles/litro, o como maximo 10-8 moles/litro. En general, la frase “que se une” o “que se une espedficamente” se refiere a la union espedfica de un compuesto a otro, en el que el nivel de union, medido por cualquier ensayo convencional, es estadfsticamente significativamente mayor que el control de fondo para el ensayo.

El termino “CD4”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de diferenciacion 4, una glucoprotema expresada en la superficie de los linfocitos T auxiliares, monocitos, macrofagos y celulas dendnticas. CD4 es un correceptor que ayuda al receptor de linfocitos T (TCR) con una celula presentadora de antfgenos. Usando su parte que reside dentro del linfocito T, CD4 amplifica la senal generada por el TCR reclutando una enzima, conocida como la tirosina quinasa lck, que es esencial para la activacion de muchas moleculas implicadas en la cascada de senalizacion de un linfocito T activado. La secuencia de protema completa para CD4 humana tiene

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el numero de acceso de UniProt P01730 (18 de junio, 2012).

El termino “codon optimizado”, como se usa en el presente documento, se refiere al cambio de codones en moleculas de acido nucleico para reflejar el uso de codones tipico del organismo huesped sin cambiar el polipeptido codificado por el ADN, para mejorar la expresion. Se conocen en la tecnica varios metodos y herramientas de software para la optimizacion de codones. Vease, Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12):7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409, y Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-264.

El termino “comprender” o “comprende”, como se usa en el presente documento, desvela tambien “consistir en” segun la practica de patente generalmente aceptada.

El termino “FACS” o “separacion celular activada por fluorescencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a un metodo para separar una mezcla heterogenea de celulas en uno o mas envases, una celula cada vez, basado en la dispersion espedfica de la luz y las caractensticas fluorescentes de cada celula.

El termino “region del fragmento cristalizable” o “region Fc”, como se usa en el presente documento, se refiere a la region de la cola de un anticuerpo que interacciona con los receptores de la superficie celular denominados receptores de Fc y algunas protemas del sistema del complemento.

El termino “protema de fusion”, como se usa en el presente documento, se refiere a protemas generadas por tecnologfa genica que consisten en dos o mas dominios funcionales derivados de diferentes protemas. Se puede obtener una protema de fusion por medios convencionales (por ejemplo, mediante expresion genica de la secuencia de nucleotidos que codifica dicha protema de fusion en una celula adecuada).

El termino “gp120”, como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoprotema que tiene la especificidad antigenica o la funcion biologica de la protema de la envuelta externa (env) del VlH. Una “protema gp120” es una molecula derivada de una region gp120 de un polipeptido Env. Los polipeptidos tipo silvestre gp120 maduros tienen aproximadamente 500 aminoacidos en su secuencia primaria. Gp120 esta altamente N-glicosilada dando lugar a un peso molecular aparente de 120 kD. La secuencia de aminoacidos de gp120 tiene aproximadamente 511 aminoacidos. Gp120 contiene cinco dominios relativamente conservados (C1-C5) entremezclados con cinco dominios variables (V1-V5). Los dominios variables contienen extensas sustituciones, inserciones y deleciones de aminoacidos. Un “polipeptido gp120” incluye tanto subunidades unicas como multfmeros. La porcion gp41 esta anclada en (y atraviesa) la bicapa de membrana del virion, mientras que el segmento gp120 sobresale en el entorno circundante. El dominio de union al receptor de gp120 esta localizado en la mitad N-terminal de la protema. Este esta seguido por una region rica en prolina (PRR), que se propone que se comporta como una bisagra o un gatillo para comunicar la union al receptor a la maquinaria de fusion. El extremo C de gp120 esta muy conservado e interacciona con gp41. Estan disponibles secuencias ejemplares de polipeptidos gp160 salvajes. Veanse los numeros de acceso de GenBank AAB05604 y AAD12142. Preferentemente, el polipeptido gp120 deriva de Env de VIH.

Ademas, un “polipeptido gp120”, como se define en el presente documento, no se limita a un polipeptido que tiene la secuencia exacta descrita en el presente documento. De hecho, el genoma de VIH esta en un estado de flujo constante y contiene varios dominios variables que muestran grados relativamente altos de variabilidad entre aislados. Es aparente de inmediato que los terminos abarcan polipeptidos gp120 de cualquiera de los aislados de VIH identificados, asf como de aislados recien identificados, y subtipos de estos aislados. Las descripciones de las caractensticas estructurales se dan en el presente documento con referencia a HXB-2. El experto en la materia a la vista de las ensenanzas de la presente divulgacion y la tecnica puede determinar las regiones correspondientes en otras variantes de VIH (por ejemplo aislados VIH IIIb, VIH SF2, VIH-1 SF162, VIH-1 SF170, VIH LAV, VIH LAI, VIH MN, VIH-1 CM235, VIH-1 US4, otras cepas de VIH-1 de diversos subtipos (por ejemplo, subtipos de A hasta G, y O), cepas de VIH-2 y diversos subtipos (por ejemplo, VIH-2 UC1 y VIH-2 UC2) y virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS). Vease, Joklik W, Ed., “Virology”, 3a Ed. (Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, EE UU, 1988), Fields B, et al., Eds., “Fundamental Virology”, 3a Ed. (Raven Press, Nueva York, NY, EE UU, 1995), y Knipe D, et al., Eds., Fields Virology, 5a Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, Nueva York, NY, EE UU, 2006). Pueden usarse programas de comparacion de secuencias (por ejemplo, BLAST y otros descritos en el presente documento) o programas de identificacion y alineamiento de caractensticas estructurales (por ejemplo, el programa “ALB” para identificar regiones de lamina p) para comparar la secuencia de las secuencias polipeptfdicas de Env nativa y modificada. Las secuencias reales de aminoacido de los polipeptidos Env modificados se pueden basar en cualquier variante de VIH. Ademas, el termino polipeptido gp120 abarca protemas que incluyen modificaciones adicionales a la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones internas adicionales. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales, tal como mediante sucesos mutacionales naturales.

El termino “VIH”, como se usa en el presente documento, se refiere al virus de la inmunodeficiencia humana. Incluye VIH-1 y VIH-2 y VIS; preferentemente se refiere a VIH-1 y/o VIH-2. “VIH-1” significa el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1. VIH-1 incluye, pero no esta limitado a, partmulas vmcas extracelulares y formas de VIH-1

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asociadas a celulas infectadas por VIH-1. El virus VIH-1 puede representar cualquiera de los subtipos principales conocidos (clases A, B, C, D, E, F, G y H) o subtipo atipico (grupo O) incluyendo cepas de laboratorio y aislados primarios. “VIH-2” significa el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2. VIH-2 incluye, pero no esta limitado a, partmulas vmcas extracelulares y formas de VIH-2 asociadas a celulas infectadas por VIH-2. El termino “VIS” se refiere al virus de la inmunodeficiencia simia que es un virus similar a VIH que infecta monos, chimpances y otros primates no humanos. VIS incluye pero no esta limitado a, partmulas vmcas extracelulares y formas de VIS asociadas con celulas infectadas por VIS.

Los terminos “identico” o “porcentaje de identidad”, en el contexto de dos o mas acidos nucleicos o polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para la maxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitucion conservadora de aminoacidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse usando software o algoritmos de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. Se conocen en la tecnica varios algoritmos y software que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos. Los ejemplos de algoritmos adecuados para determinar la similitud de secuencia incluyen, pero no estan limitados a, los algoritmos BLAST, Gapped BLAST y BLAST 2.0, WU-BLAST-2, ALIGN y ALIGN-2. Vease, Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402, Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410, Altschul S, et al., Meth. Enzymol. 1996; 266:460480, Karlin S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87:2264-2268, Karlin S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5877, Genentech Corp, South San Francisco, CA, EE UU,
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, Agosto 2012. Los metodos de alineamiento de secuencia para comparacion pueden realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith-Waterman, mediante el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman- Wunsch, mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson-Lipman, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos o mediante alineamiento manual e inspeccion visual. Vease, Smith T, Waterman M., Adv. Appl. Math. 1981; 2:482-489; Needleman S, Wunsch C, J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453; Pearson W, Lipman D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444-2448; los programas GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, EE UU; Ausubel F, et al., Eds., “Short Protocols in Molecular Biology”, 5a Ed. (John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY, EE UU, 2002).

El termino “hibridoma”, como se usa en el presente documento, se refiere a una celula que se crea mediante fusion de dos celulas, una celula secretora de anticuerpos del sistema inmune, tal como un linfocito B, y una celula inmortal, tal como un mieloma, dentro de una unica membrana.

El termino “kit”, como se usa en el presente documento, se refiere a un producto que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los metodos de la invencion, envasados de forma que permite su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para embalar los componentes del kit incluyen cristal, plastico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, policarbonato), botellas, viales, papel o sobres. El kit de la invencion puede contener ademas instrucciones para el uso de los componentes contenidos en el mismo.

El termino “anticuerpos neutralizantes de VIH conocidos”, como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos neutralizantes de VIH conocidos en la tecnica. Preferentemente, un anticuerpo neutralizante de VIH conocido se selecciona del grupo que consiste en IgGb12, VRC01, VRC03, VRC-PG04, 3BNC60, HJ16, 3BNC117, NIH45-46, 8ANC131, y 12A12. Vease, Waker L, et al., Nature 2011; 477(7365):466-470 y Scheid J, et al., Science 2011; 33(6049):1633-1637. Otros anticuerpos neutralizantes de VIH incluyen, pero no estan limitados a, 2F5, 4E10, PG9, PG16 y 2G12.

El termino “anticuerpo neutralizante”, como se usa en el presente documento, es cualquier anticuerpo o fragmento de union al antfgeno del mismo que se une a un patogeno e interfiere con la capacidad del patogeno de infectar una celula o producir una enfermedad en un sujeto. Tfpicamente, los anticuerpos neutralizantes usados en el metodo de la presente invencion pueden unirse a la superficie del patogeno y son capaces de inhibir o reducir la infeccion por el patogeno en al menos el 99 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % o el 10 % relativo a la infeccion por el patogeno en ausencia de dicho anticuerpo o anticuerpos o en presencia de un control negativo. Los metodos para confirmar si un anticuerpo es un nAc se han descrito en la tecnica. Vease, Li M, et al., J. Virol. 2005; 79:10108-10125, Wei X, et al., Nature 2003; 422:307-312, y Montefiori D, Curr. Protoc. Immunol. 2005; Enero, Capftulo 12: Unidad 12.11. Estos metodos se basan en la determinacion de la reduccion en expresion de un gen indicador despues de una unica ronda de infeccion vmca usando una lmea celular receptiva usando un virus que codifica el gen indicador. En el contexto de la invencion, este antfgeno es preferentemente gp120 y este cuerpo infeccioso es preferentemente VIH. En particular, el termino “anticuerpo neutralizante de VIH” se refiere a un anticuerpo con afinidad por el sitio de union a CD4 de gp120. El termino “anticuerpos neutralizantes” incluye la subclase de los bnAb. Como se usa en el presente documento, “anticuerpo ampliamente neutralizante” o “bnAb” se entiende como un anticuerpo obtenido por cualquier metodo que cuando se administra a una dosis eficaz puede usarse como un agente terapeutico para la prevencion o tratamiento de infecciones por VIH o SIDA contra mas de 7 cepas de VIH, preferentemente mas de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas cepas de VIH. La capacidad neutralizante de los anticuerpos puede caracterizarse por la CI50 (es decir, la concentracion de anticuerpo que produce una reduccion del 50 % en la infeccion de una celula diana). Preferentemente, los anticuerpos neutralizantes para su uso segun la presente invencion tienen una CI50 de 2 pg/ml o menor (menos de

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0,15 |jg/ml, menos de 0,125 jig/ml, menos de 0,10 |jg/ml, menos de 0,075 |jg/ml, menos de 0,05 jig/ml, menos de 0,025 jig/ml, menos de 0,02 jig/ml, menos de 0,015 jig/ml, menos de 0,0125 jig/ml, menos de 0,01 jig/ml, menos de 0,0075 jig/ml, menos de 0,005 jig/ml o menos de 0,004 jig/ml (una concentracion de anticuerpo de 10-8 o menor, preferentemente 10-9 M o menor, preferentemente 10-10 M o menor, es decir, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M o menor). Esto significa que solo se requieren concentraciones muy bajas de anticuerpo para la neutralizacion al 50 por ciento de un asilado clmico de VIH in vitro. Se puede medir la potencia usando un ensayo de neutralizacion convencional como se describe en la tecnica.

La frase “operativamente unido”, como se usa en el presente documento, significa que la secuencia de nucleotidos de interes esta unida a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula hospedadora cuando el vector se introduce en la celula hospedadora). Vease, Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.

Los terminos “polinucleotido” y “acido nucleico”, como se usan en el presente documento, se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud y formada por ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos. El termino incluye polinucleotidos tanto mono como bicatenarios, asf como polinucleotidos modificados (por ejemplo, metilados, protegidos y similares).

Los terminos “prevenir” y “prevencion”, como se usan en el presente documento, se refieren a inhibir el origen o disminuir la aparicion de una enfermedad en un sujeto. La prevencion puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de celulas patologicas en un sujeto) o parcial. La prevencion tambien se refiere a una susceptibilidad reducida a un estado clmico.

Los terminos “anticuerpo primario” y “anticuerpo secundario”, como se usan en el presente documento, se refieren en general a dos grupos de anticuerpos basados en si se dirigen a una diana de interes directamente o se dirigen a otro anticuerpo (primario) que, a su vez, esta unido a una diana de interes. En el contexto de la presente invencion, el anticuerpo primario no se dirige a una diana, ya que solo se usa su region Fc, que se fusiona a la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120. El anticuerpo secundario se dirige a la region Fc.

El termino “muestra”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra, preferentemente una muestra biologica, que puede contener anticuerpos. Por ejemplo, puede ser el sobrenadante de un cultivo celular (por ejemplo, un cultivo de linfocitos B, en particular un hibridoma de linfocitos B). Ademas, puede ser una muestra recogida de un sujeto. Las muestras adecuadas recogidas de un sujeto para su uso en la presente invencion incluyen cualquier biofluido y, en particular, sangre, suero, plasma, linfa, saliva, celulas de sangre periferica o suero de celulas tisulares, saliva, semen, esputo, lfquido cefalorraqrndeo (LCR), lagrimas, moco, sudor, leche o extractos cerebrales. El tejido corporal puede comprender timo, ganglio linfatico, bazo, medula osea o tejido amigdalino. Las muestras preferidas son plasma o suero. La frase “muestra control” se refiere a una muestra que no comprende ningun compuesto que se une al sitio de union a CD4 de gp120.

El termino “sujeto”, como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, en particular a un vertebrado, tal como un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpances y otras especies simios y monos), animales de granja, tales como, aves, peces, vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mairnferos domesticos, tales como, perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores, tales como ratones, ratas y cobayas. El termino no indica una edad o sexo particulares. El termino “sujeto” abarca un embrion y un feto.

El termino “superficie”, como se usa en el presente documento, se refiere a la membrana externa de una celula, por lo cual “en su superficie” puede significar integrado en o unido a la superficie o membrana. En cualquier caso, el sitio de union a CD4 de gp120 esta fuera de la celula y expuesto de modo que se puede producir tal union.

El termino “tratar” o “tratamiento”, como se usa en el presente documento, se refiere a la administracion de un compuesto de la invencion o de una composicion o medicamento que lo contiene para controlar la evolucion de una enfermedad despues de que hayan aparecido los signos clmicos. Se entiende que el control de la evolucion de la enfermedad significa los resultados clmicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no estan limitados a, reduccion de los smtomas, reduccion de la duracion de la enfermedad, estabilizacion de los estados patologicos (espedficamente para evitar deterioro adicional), retraso en el progreso de la enfermedad, mejora del estado patologico y remision (tanto parcial como total). El control de la evolucion de la enfermedad tambien implica una extension de la supervivencia, comparada con la supervivencia esperada si no se aplicara tratamiento.

El termino “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de acido nucleico, lineal o circular, que comprende un segmento de acuerdo con el acido nucleico de interes operativamente unido a segmentos adicionales que proporcionan su replicacion autonoma en una celula hospedadora de interes o de acuerdo con la casete de expresion de interes.

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2. Metodo para determinar anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra

En un primer aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro para determinar anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra, que comprende:

a) poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con dicha

muestra y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de

gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario, y

b) medir la eficacia de union de dicha protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120,

en el que los anticuerpos neutralizantes de VIH se determinan en dicha muestra si dicha eficacia de union es menor que la eficacia de union determinada en ausencia de cualquier anticuerpo neutralizante.

En una primera etapa, el metodo para determinar anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra comprende poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con dicha muestra y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario.

En una realizacion preferida, la muestra puede ser un sobrenadante de un cultivo celular, por ejemplo, un cultivo de linfocitos B, en particular un hibridoma de linfocitos B. Ademas, puede ser una muestra recogida de un sujeto. En una realizacion mas preferida, la muestra es una muestra de plasma o una muestra de suero.

El poner en contacto se lleva a cabo mediante al menos un instante de exposicion de dicha celula, dicha muestra y dicha protema de fusion. En una realizacion preferida, la exposicion es prolongada (es decir, una incubacion en condiciones adecuadas para que la celula sobreviva y para la union espedfica del sitio de union a CD4 de gp120 y la protema de fusion de la invencion). Las condiciones durante la etapa de poner en contacto las puede determinar de una manera rutinaria el experto en la materia. Los tampones adecuados que pueden usarse en la etapa de poner en contacto incluyen tampones fisiologicos que no interfieran con el ensayo que se va a realizar. Por ejemplo, puede emplearse un tampon Tris o trietanolamina (TEA). El pH del tampon (y el reactivo de lisis resultante incluyendo la solucion tampon) puede variar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, opcionalmente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 9,0, preferentemente de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5, incluso mas preferentemente de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0, o aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0 o aproximadamente 8,5. Las condiciones de “poner en contacto” ejemplares pueden comprender incubacion durante 15 minutos a 4 horas (por ejemplo, una hora, a 4 °C, 37 °C o a temperatura ambiente). Sin embargo, estas pueden variar segun, por ejemplo, la naturaleza de las moleculas que interaccionan. La muestra se puede someter opcionalmente a agitacion, mezcla o rotacion suaves. Ademas, se pueden anadir otros reactivos apropiados tales como agentes bloqueantes para reducir la union no espedfica. Por ejemplo, puede usarse BSA al 1-4 por ciento u otro agente bloqueante (por ejemplo, leche). Las condiciones de contacto pueden variar y adaptarse dependiendo del fin del metodo de cribado. Por ejemplo, si la temperatura de incubacion es, por ejemplo, temperatura ambiente o 37 °C, esto puede aumentar la posibilidad de identificar conectores que sean estables en estas condiciones (por ejemplo, en el caso de incubacion a 37 °C, conectores que sean estables en las condiciones encontradas en el cuerpo humano). Tal propiedad podna ser extremadamente ventajosa si una o ambas de las moleculas que participan en la union fuera un candidato a usarse en algun tipo de aplicacion terapeutica (por ejemplo, un anticuerpo).

La celula que va a usarse puede ser de cualquier tipo, incluyendo tanto celulas eucariotas como celulas procariotas. Preferentemente, la celula es una celula eucariota cultivada, mas preferentemente, una celula de mamffero cultivada (por ejemplo, una celula humana cultivada). Los ejemplos preferidos de celulas de mamffero son, por ejemplo, celulas hEK-293, celulas MOLT-3, celulas COS, celulas HeLa, celulas 293T y celulas de cualquier otra lmea celular establecida. Ademas, preferentemente las celulas deben ser capaces de expresar la protema de fusion de la invencion en un estado nativo funcional y conformacional. En una realizacion, dicha celula es una celula infectada por VIH. Preferentemente, dicha celula infectada por VIH esta cronicamente infectada. En una realizacion espedfica, dicha celula cronicamente infectada por VIH se selecciona del grupo que consiste en una celula MOLT cronicamente infectada por NL4.3, una celula H9 y una celula HuT-78. Vease, Blanco J, et al., Leukoc. Biol. 2004; 76(4):804-811 y Blanco J, et al., Virology 2003; 305(2):318-329.

El orden en que los diferentes componentes del ensayo se ponen en contacto no es particularmente limitante. Por tanto, en una realizacion, las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se ponen en contacto primero con la protema de fusion y despues con la muestra. En otra realizacion, las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se ponen en contacto primero con la muestra y despues con la protema de fusion. En aun otra realizacion, la protema de fusion y la muestra se mezclan y la mezcla se anade entonces a las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie. En otra realizacion, la protema de fusion, la muestra y las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se ponen en contacto al mismo tiempo.

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El “sitio de union a CD4 de gp120” esta determinado por la secuencia y conformacion de gp120. Aunque la region principal de gp120 implicada en la union a CD4 es el bucle de union a CD4 364-SSGGDPEIVTH-374 (numeracion de HXB2 P04578), el CD4bs conformacional en gp120 implica otros restos de la cuarta region constante de esta protema. En particular, D368 (numeracion de HXB2) es un resto clave, ya que su mutacion anula la union a CD4. La caracterizacion del CD4bs se ha publicado previamente. Vease, Sterjovski J, et al., Virology 2011; 410(2):418-428. Se prefiere que el sitio de union a CD4 de gp120 tenga una conformacion funcional y nativa. Una forma de proporcionar tal sitio de union a CD4 de gp120 es usar la protema gp120, la protema Env o fragmentos de las mismas que comprendan dicho sitio de union.

En una realizacion preferida, la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 se selecciona preferentemente de CD4 o una variante funcionalmente equivalente del mismo. En una realizacion preferida, la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 es CD4. Dicha CD4 preferentemente deriva de un animal, en particular un vertebrado, tal como un ser humano (por ejemplo, numero de acceso de la base de datos UniProtKB P01730), un primate no humano (por ejemplo, chimpances y otras especies de simios y monos); animales de granja, tales como, aves, peces, vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mairnferos domesticos, tales como, perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores, tales como ratones, ratas y cobayas. En otra realizacion preferida, la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 es una variante funcionalmente equivalente de CD4.

Las variantes de CD4 pueden ser tanto naturales como artificiales. La expresion “variante natural” se refiere a todas esas variantes de CD4 humana mencionadas anteriormente que aparecen de forma natural en otras especies (es decir, ortologos de CD4). Dichas variantes naturales incluyen, sin limitacion, ortologos de raton o pollo de CD4 (numeros de acceso a la base de datos del NCBI NP_038516,1 y NP_989980,1, respectivamente). Las variantes naturales de CD4 adecuadas para su uso en la presente invencion tambien pueden derivar de dichas secuencias por insercion, sustitucion o delecion de uno o mas aminoacidos e incluyen alelos naturales, variantes resultantes de procesamiento alternativo y formas secretadas y truncadas que aparecen de forma natural.

Una variante funcionalmente equivalente de CD4, como se usa en la presente invencion, se refiere a un polipeptido resultante de la modificacion, delecion o insercion de uno o mas aminoacidos y que conserva sustancialmente la actividad de CD4. Los ensayos adecuados para determinar si un polipeptido se puede ver como una variante funcionalmente equivalente de CD4 incluyen el ensayo mostrado en el ejemplo 3 de la presente invencion, basado en la capacidad del polipeptido de unirse a una celula que expresa gp120 en su superficie. El ensayo se puede llevar a cabo poniendo en contacto una celula que expresa gp120 con una protema de fusion que comprende un fragmento Fc de anticuerpo y la variante supuesta. Se puede ver un polipeptido como una variante funcionalmente equivalente de CD4 si muestra al menos el 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 % o menos de la eficacia de union de la CD4 humana mencionada anteriormente.

Las variantes funcionalmente equivalentes de CD4 contempladas en el contexto de la presente invencion, incluyen polipeptidos que muestran al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 %, 99 % de similitud o identidad con las diferentes variantes naturales de CD4 mencionadas anteriormente. El porcentaje de identidad entre dos secuencias indica la proporcion de aminoacidos identicos que comparten las dos secuencias que se comparan, mientras que el porcentaje de similitud indica la proporcion de residuos de aminoacidos similares (considerando equivalentes a los residuos de aminoacidos como arginina y lisina, o bien acido aspartico y acido glutamico). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se calcula comparando dos secuencias alineadas sobre una region particular, determinando el numero de posiciones en las que hay aminoacidos identicos en ambas secuencias para obtener el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de tales posiciones por el numero total de posiciones en el segmento que se compara y multiplicando el resultado por 100. El grado de identidad y similitud entre dos polipeptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y metodos que conocen ampliamente los expertos en la materia. La identidad y similitud entre dos secuencias de aminoacidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP. Vease, Altschul, S. et al., “BLAST Manual” (NCBI NLM NIH Bethesda, MD, EE UU, 2001).

En otra realizacion, la variante funcionalmente equivalente de CD4 es un fragmento de CD4 que comprende al menos los dominios N-terminales D1-D2 de CD4. El dominio D1 de CD4 (tambien conocido como tipo V similar a Ig) comprende los aminoacidos 26-125 de CD4 segun la numeracion de la CD4 humana (es decir, numero de acceso a la base de datos UniProtKB P01730). El dominio D2 de CD4 (tambien conocido como C2 de tipo 1 similar a Ig) comprende los aminoacidos 126-203 de CD4 segun la numeracion de CD4 humana. En una realizacion diferente, se usa un fragmento mayor de CD4 (D1-D4). Vease, Chen W, et al., J. Virol. 2011; 85(18):9395-9405. El dominio D2 de CD4 incluye un sitio de restriccion NheI. El sitio se localiza en el extremo C-terminal (603-608 pb). En otra realizacion, se usa en su lugar una variante del fragmento de CD4 que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de similitud al fragmento de CD4, en donde dicha variante se puede unir al sitio de union a CD de gp120. Preferentemente, el fragmento de CD4 comprende una secuencia de SEQ ID NO: 8.

En una realizacion, dicho anticuerpo primario se selecciona del grupo que consiste en IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), e IgM y preferentemente es IgG, mas preferentemente IgG1. Se prefiere que dicho anticuerpo primario sea de una especie diferente que la especie de la que deriva dicha

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muestra biologica. Dicho anticuerpo primario puede ser cualquier anticuerpo de vertebrado, preferentemente cualquier anticuerpo mairnfero y, mas preferentemente, cualquier anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo de conejo, raton, rata, cabra, caballo, oveja o burro). En una realizacion, dicho anticuerpo primario es IgG murina, preferentemente IgG1 murina.

En otra realizacion, se usa una variante de la region Fc en su lugar que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de similitud a la region Fc, en donde dicha variante se puede unir al correspondiente anticuerpo secundario de dicha region Fc. Preferentemente, la region Fc tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9.

En una realizacion mas preferida, dicha protema de fusion capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 comprende o consiste en los dominios N-terminales D1-D2 de CD4 humana y dicha (ii) region Fc de un anticuerpo primario es la region Fc de IgG1 murina. En una realizacion mas preferida, dicha protema de fusion tiene la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO: 7 o una variante al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % identica a la misma, en donde preferentemente dicha variante puede unirse a un anticuerpo secundario correspondiente a dicha region Fc. “Anticuerpo secundario correspondiente a dicha region Fc” significa que el fragmento Fab del anticuerpo secundario se une a la region Fc del anticuerpo primario (es decir, es espedfico para la especie del anticuerpo primario). En otra realizacion, la protema de fusion capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 esta codificada por el polinucleotido segun SEQ ID NO: 10.

Dicha protema de fusion tambien puede contener un conector que une (i) dicha protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) dicha region Fc de un anticuerpo primario. Tal conector puede facilitar la flexibilidad mejorada de la protema de fusion, y tambien puede reducir el impedimento esterico entre los dos fragmentos, y permitir interacciones de union apropiadas. El conector tambien puede facilitar que se produzca el plegamiento adecuado de cada fragmento. El conector puede ser de origen natural, tal como una secuencia determinada para que exista en ovillo aleatorio entre dos dominios de una protema. Una secuencia conectora ejemplar es el conector encontrado entre los dominios C-terminal y N-terminal de la subunidad a de la ARN polimerasa. Otros ejemplos de conectores naturales incluyen conectores encontrados en las protemas AcI y LexA. De forma alternativa, el conector puede ser de origen sintetico. Por ejemplo, puede usarse la secuencia (Gly4Ser)3 como un conector no estructurado sintetico. Vease, Huston J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:4879-4887 y Huston J, et al., US 5.091.513. Otra realizacion ejemplar incluye una secuencia de polialanina (por ejemplo (Ala)3).

En otra realizacion, la protema de fusion es un homodfmero unido por disulfuro.

En una segunda etapa, el metodo para determinar anticuerpos neutralizantes de VIH segun la invencion comprende medir la eficiencia de union de dicha protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120.

Preferentemente, dichos anticuerpos neutralizantes de VIH pueden unirse a la superficie de la celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 y reducir la union de la protema de fusion de la invencion, preferentemente en al menos el 99 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, o 10 % comparado con un control negativo. Mas preferentemente, dichos anticuerpos neutralizantes de VIH son anticuerpos que tienen una afinidad hacia el sitio de union a CD4 de gp120 que es al menos tan alto como la de CD4.

Los estudios de union apropiados dependen de la naturaleza de las moleculas que participan en la union, e incluyen, pero no estan limitados a, inmunoensayos (por ejemplo, ELISA), ensayos de cribado en filtro, FACS, o ensayos de inmunofluorescencia u otros metodos para cuantificar constantes de union, tenir cortes de tejido o celulas y otros metodos inmunohistoqmmicos. Tales metodos se conocen bien en la tecnica y pueden usarse para medir dicha eficiencia de union.

Preferentemente, dicha medida se realiza mediante citometna de flujo (por ejemplo, FACS). Como se usa en el presente documento, el termino “citometna de flujo” se refiere a un ensayo en el que se determina la proporcion de un material en una muestra marcando el material (por ejemplo, uniendo un anticuerpo marcado al material), produciendo que una corriente de fluido que contiene el material pase a traves de un haz de luz, separando la luz emitida de la muestra en longitudes de onda constituyentes mediante una serie de filtros y espejos, y detectando la luz. La citometna de flujo permite la deteccion sensible y la cuantificacion rapida de algunas caractensticas de celulas unicas, tales como la complejidad del tamano relativo y la fluorescencia endogena, asf como el analisis cualitativo de cualquier compuesto celular que se pueda marcar con un fluorocromo. Vease, Melamed M, et al., “Flow Cytometry and Cell Sorting”, 2a Ed. (Wiley-Liss, Nueva York, NY, EE UU, 1990). Una de las principales ventajas de la citometna de flujo es la cuantificacion rapida de analitos en un gran numero de partmulas o celulas. En general, los fluorocromos seleccionados para su uso como marcadores detectables se seleccionan basandose en la capacidad del fluorocromo de fluorescer cuando se excita por la luz con la longitud de onda usa por el laser. Cuando el fluorocromo se excita por el haz del laser, emite luz que se evalua entonces por los tubos fotomultiplicadores del citometro de flujo. Esta tecnica es capaz de analizar 10.000 celulas/partmulas en 1 a 2 minutos. Los citometros de flujo tienen filtros para detectar la emision de varios fluorocromos que fluorescen a diferentes longitudes de onda, y permite que se usen cuatro o mas fluorocromos diferentes lo que significa que actualmente se pueden detectar al menos 4 moleculas diferentes simultaneamente. Estos metodos y aparatos para analizar celulas estan comercialmente disponibles y se conocen bien en la tecnica (por ejemplo, citometro de flujo

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FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE UU).

En una realizacion, dicha medida comprende la deteccion de la protema de fusion unida a dicha celula usando un indicador capaz de unirse a dicha protema de fusion, preferentemente a la region Fc de dicha protema de fusion.

En una realizacion preferida, dicha medida comprende analizar dicha celula, preferentemente por citometna de flujo, usando un indicador capaz de unirse a dicha protema de fusion, preferentemente a la region Fc de dicha protema de fusion. Dicho indicador preferentemente comprende un grupo detectable y, mas preferentemente, es un anticuerpo secundario espedfico de Fc acoplado a un grupo detectable.

Los grupos detectables utiles incluyen fluoroforos. Por “fluoroforo” (o “fluorocromo” o “cromoforo”) es un compuesto fluorescente que puede reemitir luz tras excitacion lummica. Los fluoroforos que pueden usarse incluyen fluoroforos biologicos (por ejemplo, protemas) y qmmicos. Los fluoroforos biologicos ejemplares comprenden T-zafiro, Cerulean, mCFPm, CyPet, EGFP, PA-EGFp, Emerald, EYFP, Venus, mCitrine, mKO, mOrange, DSRed, JRed, mStrawberry, mCherry, PA-mCherry, mRuby, Tomato, mPlum, mKate, mKatushka, Kaede, Halotag y fluor supereclfptico. Los fluoroforos qmmicos ejemplares comprenden Alexafluor, rodamina, BODIPY, tetrametilrodamina, colorantes de cianina, fluorescema, puntos cuanticos, colorantes IR, colorantes FM, colorante ATTO. Tambien se puede marcar un anticuerpo secundario con enzimas que son utiles para la deteccion, tal como, por ejemplo, peroxidasa de rabano, p- galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina o glucosa oxidasa. Cuando se marca un anticuerpo con una enzima detectable, se puede detectar anadiendo reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reaccion que se pueda percibir. Por ejemplo, cuando esta presente el agente peroxidasa de rabano, la adicion de peroxido de hidrogeno y diaminobencidina da lugar a un producto de reaccion coloreado, que es visualmente detectable. Un anticuerpo tambien se puede marcar con biotina, y detectar mediante la medida indirecta de la union de avidina o estreptavidina. Notese que la avidina misma se puede marcar con una enzima o un marcador fluorescente.

Preferentemente, dicho anticuerpo secundario espedfico de Fc es espedfico para la especie de la que deriva dicho anticuerpo primario. En una realizacion, dicho anticuerpo secundario espedfico de Fc se selecciona del grupo que consiste en IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e IgM. Preferentemente, el anticuerpo secundario es IgG. Dicho anticuerpo secundario espedfico de Fc puede ser cualquier anticuerpo de vertebrado, preferentemente cualquier anticuerpo de marnffero, y mas preferentemente cualquier anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo de conejo, raton, rata, cabra, caballo, oveja o burro).

En otra realizacion del metodo del primer aspecto, la etapa (i) esta precedida por una o mas etapas de lavado que retiran la protema de fusion sin unir. Las etapas de lavado pueden llevarse a cabo de una forma cualquiera apropiada dependiendo de la celula y de la naturaleza de las moleculas utilizadas para el estudio del sitio de union a CD4 de gp120. La celula puede lavarse con cualquier medio adecuado, por ejemplo, un medio de cultivo celular o un tampon tal como PBS. El medio puede contener un detergente tal como Tween20. Puede lavarse cualquier tiempo adecuado, por ejemplo, de 1 a 30 minutos o de 3 a 10 minutos para cada lavado. El lavado puede incluir la agitacion o balanceo suave del soporte de dicha celula. La temperatura de lavado es tal que la celula pueda sobrevivir y no se altere la union. Por ejemplo, puede estar entre 20 y 45 °C o entre 30 y 40 °C. Tfpicamente, es aproximadamente 37 °C o temperatura ambiente. Los protocolos para el lavado de la protema de fusion se conocen bien en la tecnica.

Una vez se determina la eficacia de union de la protema de fusion a la celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie, el metodo de la invencion comprende determinar los anticuerpos neutralizantes de VIH en la muestra si dicha union se inhibe en presencia de la muestra.

Una inhibicion de la union se refiere a una union que es al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % con respecto a la union en presencia de una muestra control.

En una realizacion preferida, se determina una inhibicion de la union evaluando la eficacia de union en la muestra en presencia de la protema de fusion mencionada anteriormente y en una reaccion paralela en ausencia de la protema de fusion y en ausencia de cualquier compuesto capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120. En esta situacion, se determina que la muestra contiene Ac neutralizantes si la union de la protema de fusion a la celula es menor cuando se compara a la union de la protema de fusion a la celula en presencia de una muestra que no contiene ningun otro compuesto capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120. Las muestras adecuadas que pueden usarse para llevar a cabo el metodo de la invencion incluyen muestras de la misma naturaleza que la muestra en estudio y que se sabe que no contienen ningun Ac neutralizante. En una realizacion, cuando la muestra que se analiza es una muestra de un paciente, la muestra control puede ser una muestra de la misma naturaleza de un paciente que no tiene antecedentes conocidos de infeccion por VIH o que ha sido infectado con VIH pero no ha desarrollado Ac neutralizante. En otra realizacion, cuando la muestra que se analiza es el sobrenadante de un cultivo tisular, la muestra control puede ser un sobrenadante de cultivo de celulas que se sabe que no producen ningun Ac neutralizante o de celulas que expresan Ac que no tienen afinidad hacia gp120.

El metodo del primer aspecto puede usarse para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo neutralizante de VIH en una muestra. Para este fin, se toma un valor como referencia. La frase “valor de referenda” es un valor

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umbral usado para determinar si estan presentes o no anticuerpos neutralizantes. Si la cantidad de anticuerpos neutralizantes determinada en una muestra supera la cantidad de referencia, los anticuerpos neutralizantes estan presentes; si la cantidad de anticuerpos neutralizantes determinada en una muestra es igual o menor que el valor de referencia, los anticuerpos neutralizantes estan ausentes. Asimismo, si la union de la protema de fusion a la celula supera la cantidad de referencia, los anticuerpos neutralizantes estan ausentes; si la union de la protema de fusion a la celula es igual o menor que la cantidad de referencia, los anticuerpos neutralizantes estan presentes. El valor de referencia se puede establecer, por ejemplo, cuantificando la cantidad de anticuerpos neutralizantes en un conjunto representativo de muestras de sujetos que no estan infectados ni inmunizados contra VIH y analizando estadfsticamente los resultados obtenidos para determinar la cantidad de referencia. Se debe entender que la cantidad de referencia puede ser, preferentemente, cero o por debajo del lfmite detectable del ensayo usado para determinar la actividad del gen indicador. Por tanto, la cantidad de referencia se puede obtener, preferentemente, de una celula como se ha definido anteriormente que se ha puesto en contacto con una muestra que se sabe no comprende anticuerpos neutralizantes.

El metodo del primer aspecto puede usarse para determinar la presencia de un anticuerpo neutralizante de VIH, pero tambien para cuantificar un anticuerpo neutralizante de VlH. Segun esto, la invencion tambien se refiere al metodo del primer aspecto, en donde dicha determinacion es una determinacion cuantitativa. El termino “determinacion cuantitativa” comprende una determinacion semicuantitativa (es decir, una aproximacion de la cantidad). En ella, se prefiere que en el metodo del primer aspecto, dicho al menos un control sea un control positivo. Preferentemente, se usan al menos 2, 3, 5, 10, 15 o 20 controles positivos, cada uno comprende una cantidad unica del compuesto que se une al sitio de union a CD4 de gp120. En otras palabras, se usa un control positivo como un patron en concentraciones diferentes del compuesto que se une al sitio de union a CD4 de gp120. Los valores de la eficacia de union obtenidos pueden usarse para dibujar una curva patron que puede usarse luego para derivar la cantidad del anticuerpo neutralizante de VIH que se va a determinar cuantitativamente.

Preferentemente, determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes a que se hace referencia en esta invencion se refiere a determinar la presencia de dichos anticuerpos o a medir su cantidad o concentracion, preferentemente de forma semicuantitativa o cuantitativa. Lo mas preferentemente, la cantidad se mide como un tttulo (es decir, la dilucion maxima de una muestra que aun afecta un grado predeterminado de eficacia de union). Preferentemente, la determinacion incluye una etapa de normalizacion para la cuantificacion de los anticuerpos neutralizantes. La normalizacion, y por tanto la cuantificacion preferentemente, se alcanza anadiendo una cantidad predefinida de anticuerpos neutralizantes caracterizados a una mezcla de reaccion. Preferentemente, dichos anticuerpos neutralizantes caracterizados son anticuerpos donde la cantidad requerida para lograr un cierto nivel de neutralizacion se ha predeterminado. El principio de la normalizacion es determinar la cantidad o dilucion de la muestra requerida para alcanzar el mismo nivel de neutralizacion (por ejemplo, el 50 % de inhibicion de la union comparado con la inhibicion por una cantidad predefinida de anticuerpos neutralizantes caracterizados). Para la cuantificacion, se puede comparar la neutralizacion con una curva patron usando anticuerpos neutralizantes caracterizados o a otro material de referencia adecuado segun protocolos bien conocidos en la tecnica. El metodo cuantitativo puede incluir los estudios de union anteriormente mencionados, tales como, por ejemplo, inmunoensayos (por ejemplo, ELISA), ensayos de cribado en filtro, FACS o ensayos de inmunofluorescencia, u otros metodos para cuantificar constantes de union, tincion de cortes de tejido o celulas y otros metodos inmunohistoqmmicos.

3. Protema de fusion y acido nucleico de la invencion

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario.

En una realizacion preferida, la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 es CD4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. En una realizacion mas preferida, la variante funcionalmente equivalente de CD4 es un fragmento de CD4 que comprende al menos los dominios N-terminales D1-D2 de CD4.

En otra realizacion, la region Fc deriva de un anticuerpo primario seleccionado del grupo que consiste en IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), e IgM. Preferentemente, el anticuerpo es IgG. Mas preferentemente, es IgGl. Dicho anticuerpo primario puede ser cualquier anticuerpo de vertebrado, preferentemente cualquier anticuerpo mairnfero y mas preferentemente, cualquier anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo de conejo, raton, rata, cabra, caballo, oveja o burro). En una realizacion, dicho anticuerpo primario es IgG murina, preferentemente IgG1 murina.

Dicha protema de fusion tambien puede contener un conector que une (i) dicha protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) dicha region Fc de un anticuerpo primario. Tal conector puede facilitar la flexibilidad mejorada de la protema de fusion, y tambien puede reducir el impedimento esterico entre los dos fragmentos, y permitir interacciones de union apropiadas. El conector tambien puede facilitar que se produzca el plegamiento adecuado de cada fragmento. El conector puede ser de origen natural, tal como una secuencia determinada para que exista en ovillo aleatorio entre dos dominios de una protema. Una secuencia conectora ejemplar es el conector encontrado entre los dominios C-terminal y N-terminal de la subunidad a de la ARN polimerasa. Otros ejemplos de

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conectores de origen natural incluyen conectores encontrados en las protemas AcI y LexA. De forma alternativa, el conector puede ser de origen sintetico. Por ejemplo, puede usarse la secuencia (Gly4Ser)3 como un conector no estructurado sintetico. Vease, Huston, 1988, anteriormente. Otra realizacion ejemplar incluye una secuencia de polialanina (por ejemplo (Ala)3).

En otro aspecto, la invencion se refiere a un acido nucleico que codifica la protema de fusion del segundo aspecto y a una casete de expresion, o un vector que comprende dicho acido nucleico.

Preferentemente, dicho acido nucleico es un polinucleotido, refiriendose a polfmeros monocatenarios o bicatenarios de monomeros nucleotidos (acidos nucleicos), incluyendo, pero no limitados a, 2'-desoxirribonucleotidos (ADN) y ribonucleotidos (ARN) unidos por enlaces fosfodiester internucleotidicos.

De forma alternativa, los polinucleotidos que codifican una variante funcionalmente equivalente de CD4 incluyen polinucleotidos capaces codificar una variante de los polipeptidos con actividad cD4, como se han definido anteriormente por sus secuencias espedficas. Dichos polinucleotidos resultan de polinucleotidos previamente definidos mediante insercion, delecion o sustitucion de uno o varios nucleotidos con respecto a las secuencias anteriormente mencionadas. Preferentemente, los polinucleotidos que codifican variantes funcionalmente equivalentes de CD4 son polinucleotidos cuyas secuencias les permiten hibridar en condiciones muy restrictivas con los polinucleotidos anteriormente mencionados. Las condiciones tfpicas de la hibridacion muy restrictiva incluyen incubacion en SSC 6X (SSC 1X: NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M) y formamida al 40 % a 42 °C durante 14 horas, seguido por uno o varios ciclos de lavado usando SSC 0,5X, SDS al 0,1 % a 60 °C. Alternativamente, las condiciones muy restrictivas incluyen las que comprenden una hibridacion a una temperatura de aproximadamente 50-55 °C en SSC 6X y un lavado final a una temperatura de 68 °C en SSC de 1-3X. Las condiciones restrictivas moderadas comprenden la hibridacion a una temperatura de aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 65 °C en NaCl 0,2 o 0,3 M, seguido por lavado a aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 55 °C en SSC 0,2X, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1 %. En una realizacion adicional, dicho acido nucleico tiene codones optimizados.

En otra realizacion, se usa en su lugar una variante del acido nucleico que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de similitud al acido nucleico, en la que dicha variante codifica la protema de fusion de la invencion.

El acido nucleico del segundo aspecto puede requerir que se corte con enzimas de restriccion para ligarse en un vector (es decir, se pueden eliminar algunos nucleotidos terminales, por ejemplo, 1, 2 o 3). Como tal, en una realizacion, la invencion se refiere a dicho acido nucleico, en donde se ha cortado en cada extremo con una enzima de restriccion.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un casete de expresion que comprende el acido nucleico del segundo aspecto, una secuencia promotora y una 3'-UTR y opcionalmente un marcador de seleccion. En aun otra realizacion, la presente invencion se refiere a un vector de expresion que comprende el acido nucleico o el casete de expresion del segundo aspecto. Los vectores adecuados segun la presente invencion incluyen vectores de expresion procariotas, tales como los plasmidos pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, como los plasmidos mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCR1, Rp4; fagos y vectores lanzadera tales como, los vectores pSA3 y pAT28; vectores de expresion en levaduras, tales como vectores del tipo de plasmidos de 2 micras; plasmidos de integracion; vectores YEP; plasmidos centromericos y analogos; vectores de expresion en celulas de insecto, tales como vectores de la serie pAC y la serie pVL; vectores de expresion en plantas, tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y analogos; y vectores de expresion en celulas eucariotas superiores, basados en vectores virales (por ejemplo adenovirus, virus asociados a adenovirus, retrovirus y lentivirus), asf como vectores no virales, tales como los vectores pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, EE UU), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl. En una realizacion, el vector es un vector de expresion.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a una celula transgenica que comprende el acido nucleico, la casete de expresion o el vector de expresion del segundo aspecto. Las celulas transgenicas que van a usarse pueden ser de cualquier tipo celular, incluyendo tanto celulas eucariotas como celulas procariotas. Preferentemente, las celulas incluyen celulas procariotas, celulas de levadura o celulas de mairnfero.

4. Kits

En otro aspecto, se divulga en el presente documento un kit que comprende la (i) protema de fusion del segundo aspecto, el acido nucleico, el vector o la celula transgenica del tercer aspecto y (ii) un indicador capaz de unirse a dicha protema de fusion. En una realizacion, dicho kit puede comprender ademas una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie. Dicha celula es una celula como se ha definido en el metodo del primer aspecto.

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5. Metodo para la identificacion de linfocitos B que expresan anticuerpos neutralizantes de VIH

El ensayo de la presente invencion tambien puede usarse para detectar celulas productoras de anticuerpos que pueden expresar anticuerpos neutralizantes aplicando el ensayo a un sobrenadante de un cultivo de las celulas que expresan anticuerpos. Por tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro para la identificacion de celulas productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos neutralizantes de VIH, que comprende:

(i) poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con un

sobrenadante de un cultivo celular de dichas celulas productoras de anticuerpos con una protema de fusion que

comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un

anticuerpo primario, y

(ii) medir la eficacia de union de dicha protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120

en el que las celulas productoras de anticuerpos se determina que expresan anticuerpos neutralizantes de VIH si dicha eficiencia de union es diferente de la de al menos un control.

En una primera etapa, una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se pone en contacto con un sobrenadante de un cultivo de dichas celulas productoras de anticuerpos y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario. Las condiciones para la etapa de poner en contacto son esencialmente como se han descrito anteriormente para poner en contacto una muestra. En una realizacion preferida, las celulas productoras de anticuerpos son linfocitos B, que habitualmente no son inmortales. En otra realizacion, las celulas productoras de anticuerpos son celulas de hibridoma, que habitualmente son inmortales.

En una realizacion preferida, la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 se selecciona de CD4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. En una realizacion aun mas preferida, el equivalente funcional de CD4 es un fragmento de CD4 que comprende al menos los dominios N-terminales D1-D2 de CD4. En una realizacion, CD4 preferentemente deriva de un animal, en particular un vertebrado, tal como un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpances y otras especies simios y monos), animales de granja (aves, peces, vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos), mairnferos domesticos (por ejemplo, perros y gatos), animales de laboratorio (por ejemplo, roedores, tales como ratones, ratas y cobayas). En otra realizacion, la region Fc de un anticuerpo primario es la region Fc de IgG1 murina.

El orden en que los diferentes componentes del ensayo se ponen en contacto no es particularmente limitante. Por tanto, en una realizacion, las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se ponen en contacto primero con la protema de fusion y despues con el sobrenadante del cultivo. En otra realizacion, las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se ponen en contacto primero con el sobrenadante del cultivo y despues con la protema de fusion. En aun otra realizacion, la protema de fusion y el sobrenadante del cultivo se mezclan y la mezcla se anade entonces a las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie. En otra realizacion, la protema de fusion, el sobrenadante del cultivo y las celulas que expresan el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie se ponen en contacto al mismo tiempo.

En una segunda etapa, se determina la eficiencia de union de la protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120 en la celula. Los metodos adecuados para determinar la union de la protema de fusion a la celula que expresa gp120 se han descrito en detalle anteriormente en el contexto del metodo para determinar los anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra. En una realizacion, dicha medida comprende la deteccion de protema de fusion unida a dicha celula usando un indicador capaz de unirse a dicha protema de fusion, preferentemente a la region Fc de dicha protema de fusion. En una realizacion preferida, dicha medida comprende analizar dicha celula, preferentemente por citometna de flujo, usando un indicador capaz de unirse a dicha protema de fusion, preferentemente a la region Fc de dicha protema de fusion. Dicho indicador preferentemente comprende un grupo detectable y, mas preferentemente, es un anticuerpo secundario espedfico para Fc acoplado a un resto detectable

Una vez se determina la eficacia de union de la protema de fusion a la celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie, el metodo de la invencion comprende determinar la celula productora de anticuerpos como productora de anticuerpos neutralizantes de VIH si dicha union se inhibe en presencia de la muestra. Una inhibicion de la union se refiere a una union que es al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % con respecto a la union en presencia de una muestra control.

Si las celulas productoras de anticuerpos son una poblacion no homogenea, las celulas se pueden clonar y seleccionar adicionalmente basandose en la produccion de anticuerpos neutralizantes para obtener una poblacion celular homogenea. Los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilucion limitante y cultivar por metodos convencionales. Vease, Goding J, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, 3a Ed. (Academic Press, Waltham, MA, EE UU, 1996). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Si las celulas productoras de anticuerpos son celulas de hibridoma, las celulas se pueden cultivar in vivo como celulas tumorales de ascitis en un animal.

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6. Metodos para obtener anticuerpos neutralizantes

En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para producir anticuerpos neutralizantes de VIH, que comprende:

a) cultivar un hibridoma que comprende un linfocito B aislada segun el metodo para el aislamiento de linfocitos B

que expresan anticuerpos neutralizantes y

b) aislar los anticuerpos neutralizantes de VIH expresados por dicho hibridoma.

Las celulas productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos neutralizantes, una vez seleccionadas segun los metodos definidos anteriormente, se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las celulas de mieloma parentales sin fusionar. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultico para los hibridomas tipicamente incluira hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de las celulas deficientes en HGPRT.

Los anticuerpos se pueden aislar de las celulas o se pueden obtener por medios recombinantes expresando las regiones relevantes de los genes de la inmunoglobulina de las celulas que son responsables para la especificidad al antigeno en celulas adecuadas.

Los anticuerpos se pueden purificar del sobrenadante del cultivo de las celulas productoras de anticuerpos por metodos conocidos en la tecnica tales como intercambio anion/cation, exclusion molecular/filtracion en gel, precipitaciones y el uso de ligandos de afinidad espedficos. Los ligandos de afinidad comunmente usados son protema A y protema G derivadas de bacterias, anticuerpos monoclonales y anticuerpos camelidos o fragmentos de union derivados de los mismos que unen una o mas de las cuatro subclases de IgG humanas o humanizadas.

En el caso de que los anticuerpos se produzcan por medios recombinantes, se afslan los polinucleotidos que codifican las regiones relevantes de la molecula de inmunoglobulina. Una fuente para acidos nucleicos de anticuerpos es un hibridoma producido obteniendo un linfocito B de un animal inmunizado con el antfgeno de interes y fusionandola con una celula inmortal. De forma alternativa, se pueden aislar acidos nucleicos de los linfocitos B (o bazo entero) del animal inmunizado. Aun otra fuente de acidos nucleicos que codifican anticuerpos es una genoteca de tales acidos nucleicos generada, por ejemplo, mediante tecnologfa de presentacion en fagos. Se pueden identificar los polinucleotidos que codifican los peptidos de interes (por ejemplo, peptidos de las regiones variables con las caractensticas de union deseadas) por metodos convencional conocidos en la tecnica (por ejemplo, adsorcion).

Se pueden determinar las secuencias de aminoacidos relevantes de una inmunoglobulina o polipeptido de interes mediante secuenciacion directa de la protema, y se pueden disenar secuencias de nucleotidos codificantes adecuadas segun un cuadro de codones universal. Alternativamente, se puede aislar y secuenciar el ADN genomico o ADNc que codifica los anticuerpos monoclonales de celulas que producen tales anticuerpos usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotfdicas que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Vease, Brown T, “Gene Cloning” (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., “Recombinant DNA”, 2a Ed. (Scientific American Books, Nueva York, NY, US, 1992); Alberts B, et al., “Molecular Biology of the Cell” (Garland Publishing Inc., Nueva York, NY, US, 2008); Innis M, et al., Eds., “PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications” (Academic Press Inc., San Diego, CA, US, 1990); Erlich H, Ed., “PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification” (Stockton Press, Nueva York, NY, US, 1989); Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989); Bishop T, et al., “Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed., “Maximizing Gene Expression” (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, US, 1987); Davis L, et al., “Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing Co., Nueva York, NY, US, 1986), Schleef M, Ed., “Plasmid for Therapy and Vaccination” (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, DE, 2001).

Se puede determinar la secuencia que codifica una region variable entera del polipeptido inmunoglobulina; sin embargo, algunas veces sera adecuado secuenciar solo una parte de una region variable, por ejemplo la parte codificante de CDR. La secuenciacion se lleva a cabo usando tecnicas convencionales. Vease, Sambrook, 1989, anteriormente y Sanger F, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977; 74:5463-5467. Comparando la secuencia del acido nucleico clonado con secuencias publicadas de genes y ADNc de inmunoglobulinas humanas, el experto en la materia podra determinar facilmente, dependiendo de la region secuenciada, (i) el uso del segmento de la lmea germinal del polipeptido de inmunoglobulina del hibridoma (incluyendo el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de la cadena pesada y ligera, incluyendo las secuencias resultantes de la adicion en la region N y el proceso de maduracion somatica. Una fuente de informacion de secuencias de genes de inmunoglobulinas es el Centro Nacional para Informacion de Biotecnologfa, Biblioteca Nacional de Medicina, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE UU.

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7. Metodos terapeuticos

En otro aspecto, se divulga en el presente documento un metodo para el tratamiento o prevencion de VIH o SIDA en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la administracion a dicho sujeto de los anticuerpos neutralizantes aislados con el metodo del quinto aspecto de la invencion.

Los efectos preventivos o de tratamiento beneficiosos de los anticuerpos neutralizantes de VIH respecto a la infeccion por VIH o smtomas del SIDA incluyen, por ejemplo, prevenir o retrasar la infeccion inicial de un individuo expuesto a VIH; reducir la carga vmca en un individuo infectado con VIH; prolongar la fase asintomatica de infeccion por VIH; mantener cargas vmcas bajas en pacientes infectados con VIH cuyos niveles de virus se han bajado a traves de terapia antirretrovmca (TAR); aumentar los niveles de linfocitos T CD4 o reducir el descenso en linfocitos T CD4, tanto espedficas como no espedficas para VIH-1, en pacientes sin tratamiento previo con farmacos y en pacientes tratados con ART, aumentar en conjunto la salud o calidad de vida de un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un medico puede comparar el efecto de inmunizacion con el estado del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz en inhibir el SIDA. En una realizacion preferida, las composiciones inmunogenicas de la invencion son composiciones preventivas.

Los anticuerpos neutralizantes de la invencion pueden ser utiles para la terapia de una infeccion por VIH-1. Mientras que todos los animales que puedan estar afectados con VIH-1 o sus equivalentes se pueden tratar de esta manera (por ejemplo, chimpances, macacos, babuinos o seres humanos), las composiciones inmunogenicas de la invencion se dirigen particularmente a sus usos terapeuticos en seres humanos. Con frecuencia, se puede requerir mas de una administracion para producir el efecto terapeutico deseado; el protocolo exacto (dosis y frecuencia) se puede establecer por procedimientos clmicos convencional.

La presente invencion se refiere ademas a prevenir o reducir los smtomas asociados con la infeccion por VIH. Estos incluyen smtomas asociados con la fase sintomatica menor de la infeccion por VIH, incluyendo, por ejemplo, zoster, erupcion cutanea e infeccion de las unas, llagas bucales, infeccion recurrente de nariz y garganta, y perdida de peso. Ademas, smtomas adicionales asociados con la fase sintomatica principal de la infeccion por VIH incluyen, por ejemplo candidiasis bucal o vaginal (Candida), diarrea persistente, perdida de peso, tos persistente y tuberculosis reactivada o infecciones recurrentes por herpes, tal como herpes labial (herpes simple). Otros smtomas de SIDA en estado mas avanzado que se pueden tratar segun la presente invencion, incluyen, por ejemplo, diarrea, nausea y vomitos, candidiasis y llagas bucales, infecciones vaginales persistentes, recurrentes y cancer cervical, linfadenopatfa generalizada persistente (PGL), infecciones cutaneas graves, verrugas y tina, infecciones respiratorias, neumoma, en especial neumoma por Pneumocystis carinii (PCP), herpes zoster (o culebrilla), problemas del sistema nervioso, tales como dolores, entumecimiento u “hormigueo” en las manos y los pies, anormalidades neurologicas, sarcoma de Kaposi, linfoma, tuberculosis y otras infecciones oportunistas.

En otra realizacion preferida, el sujeto al que se administran los anticuerpos neutralizantes esta en terapia antirretrovmca (TAR), preferentemente terapia antirretrovmca altamente activa (TARGA).

Mientras que la invencion anterior se ha descrito en algun detalle para fines de claridad y entendimiento, el experto en la materia apreciara de una lectura de esta divulgacion que se pueden hacer varios cambios en forma y detalle sin separarse del verdadero ambito de la invencion y reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Construccion del plasmido pcDNA3.1huCD4mIgG1

Los dominios N-terminales D1-D2 de CD4 humana se amplificaron mediante RT-PCR convencional usando el sistema de RT-PCR SuperScript III One-Step con Platinum Taq ADN Pol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE UU) y los siguientes cebadores:

1) CD4 L sentido (SEQ ID NO: 1):

5'-CACCATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAG-3'

2) CD4L AS NheI (SEQ ID NO: 2):

5'-TATTAGCTAGCACCACGATGTCTATTTTG-3'

El ARN extrafdo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humanas se uso como molde. El plasmido pcDNA3.1huCD4 se genero despues de clonar el amplfmero CD4 usando el kit pcDNA3.1 Directional V5-His-TOPO y siguiendo las instrucciones del fabricante.

La region Fc que contema bisagra/CH2/CH3 de una IgG1 murina se amplifico como se ha descrito anteriormente usando los cebadores:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

3) MPER-mIgG1-S (SEQ ID NO: 3).

5'-GAATAGAGCTGGTGGGCTAGCTGTGCCCAGGGATTGTGGT-3'

4) mIgG1-AS (SEQ ID NO: 4):

5'-TTATTCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3'

Como molde, se uso ARN extrafdo de la lmea celular murina NS1.

El ampUmero se purifico, se digirio con las enzimas de restriccion FastDigest NheI y FastDigest XhoI (Fermentas International Inc., Glen Burnie, MD, EE UU) y se ligo en pcDNA3.1huCD4 (previamente linealizado con las mismas enzimas de restriccion) usando ADN ligasa de T4 (Fermentas International Inc., Glen Burnie, MD, EE UU). Por ultimo, se confirmo la integridad de la construccion de ADN mediante secuenciacion usando el kit de secuenciacion en ciclo BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems®, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, EE UU). Vease, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 y la Figura 1.

Ejemplo 2

Produccion de la prote^na recombinante huCD4mIgG1

Se transfectaron celulas HEK 293 con el plasmido pcDNA3.1huCD4mIgG1 usando el kit de transfeccion Calphos (Clontech®, Takara Bio Inc., Otsu, JP) segun las instrucciones del fabricante. Despues de 48 horas, se recogio el sobrenadante, se clarifico por filtracion a traves de filtro de 0,45 pm (EMD Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, DE) y se almaceno a -20 °C hasta su uso.

Ejemplo 3

Titulacion del sobrenadante que contiene la protena recombinante huCD4mIgG1

Se incubo la lmea celular MOLT cronicamente infectada con NL4.3 con diluciones en serie del sobrenadante que contema CD4mIgG1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Vease, Blanco J, et al., J. Leukoc. Biol. 2004; 76(4):804-811. Despues de lavar con PBS se detecto la CD4mIgG1 unida a gp120 en la superficie celular mediante citometna de flujo usando DyLight 649-F(ab)2 de cabra anti-IgG de raton espedfico (Jackson ImmunoResearch, Inc., West Grove, PA, EE UU). Vease, la Figura 2.

Ejemplo 4

identificacion de anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4 usando un ensayo citometrico competitivo

Para determinar si la actividad bloqueante de gp120/CD4 de los anticuerpos se puede determinar por citometna de flujo, se preincubaron celulas MOLT cronicamente infectadas con NL4.3 a temperatura ambiente durante 25 minutos con diluciones en serie (3 veces) del anticuerpo IgGb12, que reconoce el CD4bs de gp120, empezando a 48 pg/ml. A continuacion, se anadio el sobrenadante que contiene huCD4mIgG1 a la concentracion CI50 y la incubacion se extendio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues de dos lavados con PBS, se anadio el anticuerpo secundario DyLight 649-F(ab)2 de cabra anti-IgG de raton espedfico de Fc (Jackson ImmunoResearch, Inc., West Grove, PA, EE UU) y se incubo de nuevo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las muestras celulares se lavaron con PBS y se analizaron por citometna de flujo. IgGb12 bloqueo la interaccion gp120/CD4 con una cinetica cuantificable dependiente de la concentracion. Vease la Figura 3.

Ejemplo 5

Determinacion de la especificidad de bloqueo de gp120/CD4

Para evaluar la especificidad del ensayo, se usaron anticuerpos que reconodan regiones en la glucoprotema Env diferentes del CD4bs en las mismas condiciones descritas anteriormente. Vease la tabla 1. Solo los anticuerpos que reconodan el sitio de union a CD4 en gp120 (IgGb12, VRC01 y VRC03) o el sitio de union a gp120 en CD4 (Leu3a) fueron capaces de bloquear la interaccion gp120/CD4, lo que indica que el ensayo descrito es altamente espedfico. Vease la Figura 4.

Tabla 1

Descripcion de los anticuerpos usados para determinar la especificidad asociada con los anticuerpos bloqueantes de ______________________________________gp120/CD4 ________________________________

Nombre del Ac

Especificidad Fuente Descripcion

IgGb12 (b12)

sitio de union a CD4 en gp120 1 Ac ampliamente neutralizante humano

VRC01

sitio de union a CD4 en gp120 2 Ac ampliamente neutralizante humano

VRC03

sitio de union a CD4 en gp120 2 Ac ampliamente neutralizante humano

Leu3a

sitio de union a gp120 en CD4 3 Ac de raton

IgG2G12 (2G12)

epftopo glicosilado en gp120 1 Ac ampliamente neutralizante humano

5

10

15

20

25

30

Nombre del Ac

Especificidad Fuente Descripcion

2F5

region MPER en gp41 1 Ac ampliamente neutralizante humano

4E10

region MPER en gp41 1 Ac ampliamente neutralizante humano

anti-gp120 de cabra

gp120 4 Ac policlonal de cabra no neutralizante

1 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH, Klosterneuburg, AT

2 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Bethesda, MD, EE UU

3 BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU

4 Abcam plc, Cambridge, MA, EE UU

Ejemplo 6

Cuantificacion de los anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4 en muestras de plasma

Para identificar y cuantificar los anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4 en muestras de plasma y para validar el ensayo, se usaron varias muestras de plasma de pacientes infectados por VIH-1. Estas muestras se habfan descrito previamente y analizado su capacidad de neutralizacion y la presencia de anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4 usando un ensayo de celula a celula. Vease, Sanchez-Palomino S, et al., Vaccine 2011; 29:5250-5259. Se analizaron un conjunto de cuatro muestras de plasma con anticuerpos ampliamente neutralizantes, que conteman Ac bloqueantes de gp120/CD4, y seis plasmas poco neutralizantes, como sigue: se preincubaron celulas MOLT NL4.3 con diluciones en serie (3 veces, empezando a 1/10) de muestras de plasma durante 25 minutos a temperatura ambiente. Como patron se usaron diluciones en serie de 3 veces de anticuerpo b12, empezando a 48 |jg/ml. Posteriormente, se anadio el sobrenadante de huCD4mIgG1 a concentracion de CI50 y el periodo de incubacion se extendio durante 30 minutos. Despues de lavar, se detectaron las protemas huCD4mIgG1 unidas a gp120 en la superficie de las celulas con el DyLight 649-F(ab)2 de cabra anti-IgG de raton espedfico de Fc (Jackson ImmunoResearch, Inc., West Grove, PA, EE UU). Por ultimo, las muestras se lavaron con PBS y se analizaron por citometna de flujo y la presencia de anticuerpos bloqueantes de gp120/CD4 se cuantifico como unidades arbitrarias (UA) referidas al anticuerpo b12 usado como patron. Vease la Figura 5.

Siguiendo la metodologfa descrita anteriormente, se probo la presencia de anticuerpos bloqueantes de CD4/gp120 en una cohorte de muestras de plasma de pacientes infectados por VIH-1 sin tratamiento previo con aRt e individuos sin infectar que se usaron como control negativo. En este caso, las muestras de plasma se probaron a una dilucion 1/5. Los resultados se muestran como porcentaje de inhibicion de gp120/CD4. Vease la Figura 6.

Se obtuvo confirmacion adicional del ensayo usando una glucoprotema de envuelta de una aislado de VIH-1 diferente. El mismo conjunto de muestras de plasma probado en la figura 6 se analizo usando celulas MOLT que expresan la envuelta del aislado Bal de VIH-1. Los resultados se muestran en la figura 7 y confirman la presencia de anticuerpos cuantificables contra el sitio de union de CD4 en plasma de individuos VIH+. Ademas, el porcentaje de inhibicion de la union de huCD4mIgG1 tanto a aislados de NL4-3 como BaL obtenidos para muestra de plasma mostro una fuerte correlacion (p<0,0001, prueba de correlacion de Pearson).

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo in vitro para determinar anticuerpos neutralizantes de VIH en una muestra, que comprende:

   (i) poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con dicha muestra y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario, y

   (ii) medir la eficacia de union de dicha protema de fusion al sitio de union CD4 de gp120,

   en el que los anticuerpos neutralizantes de VIH se determinan en dicha muestra si dicha union se inhibe en presencia de la muestra.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 es CD4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la variante funcionalmente equivalente de CD4 es un fragmento de CD4 que comprende al menos los dominios N-terminales D1-D2 de CD4.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha medida comprende usar un indicador que se une a dicha protema de fusion.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (ii) esta precedida por al menos una etapa de lavado que retira la protema de fusion no unida.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la muestra es una muestra de plasma.
7. 7. Una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de una IgG murina.
8. 8. La protema de fusion de la reivindicacion 7, en la que la protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 es CD4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
9. 9. La protema de fusion de la reivindicacion 8, en la que la variante funcionalmente equivalente de CD4 es un fragmento de la misma que comprende al menos los dominios N-terminales D1-D2 de CD4.
10. 10. La protema de fusion de la reivindicacion 7, en la que la IgG murina es IgG1 murina o una variante funcionalmente equivalente.
11. 11. Un acido nucleico que codifica la protema de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, una casete de expresion, un vector o una celula transgenica que comprende dicho acido nucleico.
12. 12. Un metodo in vitro para la identificacion de una celula productora de anticuerpos que expresa anticuerpos neutralizantes de VIH, que comprende:

    (i) poner en contacto una celula que comprende el sitio de union a CD4 de gp120 en su superficie con un sobrenadante de un cultivo de dicha celula productora de anticuerpos y con una protema de fusion que comprende (i) una protema capaz de unirse al sitio de union a CD4 de gp120 y (ii) una region Fc de un anticuerpo primario, y

    (ii) medir la eficiencia de union de dicha protema de fusion al sitio de union a CD4 de gp120,

    en el que se determina que la celula productora de anticuerpo expresa anticuerpos neutralizantes de VIH si dicha union se inhibe en presencia de dicho sobrenadante.
13. 13. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 12 en el que las celulas productoras de anticuerpos son linfocitos B o celulas de hibridoma.
14. 14. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 que comprende ademas la clonacion de la celula que expresa los anticuerpos neutralizantes.
15. 15. Un metodo para producir anticuerpos neutralizantes contra VIH, que comprende:

    (i) cultivar celulas productoras de anticuerpo aisladas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 y

    (ii) aislar los anticuerpos expresados por dichas celulas productoras de anticuerpos.