ES2643496T3 - Bicelas encapsuladas en liposomas y su aplicación en sistemas diluidos - Google Patents

Abstract

La presente invención tiene como finalidad preservar la morfología de las bicelas en ambientes con alto contenido en agua, por ello, la invención se refiere a un liposoma que comprende, en su solución acuosa interna, al menos, una bicela. La concentración de bicelas en dicha solución es de entre el 5 y 25% en peso seco con respecto al liposoma final. La invención también se refiere al uso de dichos liposomas para el encapsulado de principios activos, así como a su uso como medicamento o para la elaboración de un producto cosmético. Además, la presente invención se refiere al método de obtención de dichos liposomas.

Description

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Bicelas encapsuladas en liposomas y su aplicacion en sistemas diluidos.

La presente invencion tiene como finalidad preservar la morfologfa de las bicelas en ambientes con alto contenido en agua, por ello, la invencion se refiere a un liposoma que comprende, en su solucion acuosa interna, al menos, una bicela. La concentracion de bicelas en dicha solucion es de entre el 5 y 25% en peso seco con respecto al liposoma final. La invencion tambien se refiere al uso de dichos liposomas para el encapsulado de principios activos, asf como a su uso como medicamento o para la elaboracion de un producto cosmetico. Ademas, la presente invencion se refiere al metodo de obtencion de dichos liposomas.

ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR

Los liposomas han sido objeto de numerosos estudios debido a su potencial uso para micro-encapsular medicamentos y sus aplicaciones en cosmetica y clmica (Teschke, O.; de Souza, E. F. Langmuir 2002, 18, 6513).

Un liposoma es una vesfcula esferica y hueca compuesta principalmente por fosfolfpidos que constan de una cabeza hidrosoluble y de una cola liposoluble, organizados en bicapas. Las colas lipofflicas de los fosfolfpidos entran en contacto entre ellas formando una membrana de doble capa que es hidrofila en sus partes exteriores y lipofila en su interior, esta membrana encierra un interior acuoso.

Actualmente, se utilizan como transportadores de diversas sustancias entre el exterior y el interior de la celula debido a que son los transportadores mas eficaces para introducir sustancias en las celulas, con un amplio campo de aplicacion. Algunas de estas sustancias son medicamentos o cosmeticos, e incluso se utilizan en biotecnologfa, en algunos casos de terapia genetica, para introducir genes de un organismo en otro diferente.

El uso de estas estructuras como transportadores tiene la ventaja de que se pueden programar para que el medicamento pueda liberarse durante largo tiempo. Ademas, poseen una tendencia natural a ligarse a celulas y tejidos, logrando la maxima eficacia terapeutica y minimizando los efectos secundarios no deseados, asf, los liposomas conjugados con anticuerpos se unen a celulas diana con mas facilidad que las formas solubles de los anticuerpos. Desde el punto de vista qumico, son similares a celulas que circulan en la sangre con las que son compatibles y, por otra parte, son un metodo util de proteccion de productos labiles debido a que no sufren degradacion y actuan eficazmente.

Otras aplicaciones que se atribuyen a estas estructuras son: dirigir inmunomoduladores a las celulas del sistema inmunitario, liberacion controlada de medicamentos frente a infecciones de tipo sistemico, reducir los efectos secundarios de algunos medicamentos, en metodos de diagnostico o como sustitutivos de celulas en sangre.

Pero el uso de liposomas como transportadores no estana limitado solo al campo sanitario, en la industria textil la microencapsulacion es una tecnologfa novedosa que permite sustituir las dispersiones o emulsiones de determinadas sustancias por fluidos similares en donde dichos compuestos se encuentran dispersos en el interior de microcapsulas de sustancias inertes, que se fijan al textil por un sistema efectivo. Las propiedades finales conferidas al textil, provienen del tipo de encapsulado realizado y del mecanismo de liberacion conseguido. Hasta ahora a nivel industrial, la produccion de tejidos biofuncionales (tejidos inteligentes) ha seguido una vi'a de desarrollo empfrica basada en el sistema "ensayo-error". Sin embargo, este proceso requiere de un conocimiento ffsico-qmmico eficaz de las interacciones existentes a nivel fibra-microcapsula. En caso contrario, no es posible optimizar ni la tecnologfa de aplicacion ni controlar la liberacion del principio activo. En este sentido, los liposomas se estan utilizando como microencapsulantes en procesos industriales de tintura de la lana (Marti, M. et al. Textile Res. J. 2001, 71 (8), 678682; Marti, M. et al. Inter. Textile Bull. 2003, 2, 60-64; Marti, M. et al. Text. Res. J. 2004, 74(11), 961 -966).

Estas estructuras con diametros comprendidos entre 100nm. a 1 pm. poseen el inconveniente de que son demasiado grandes para pasar a traves de la piel en aplicaciones transdermicas.

Por otro lado, las bicelas son nano-estructuras discoidales compuestas por un fosfolfpido de cadena larga situado en el centro de una zona bilaminar plana y un fosfolfpido de cadena corta situada en los bordes (Sanders, C. R.; Hare, B. J.; Howard, K. P.; Prestegard, J. H. Prog. NMR Spectroscopy 1994, 26, 421). La caractenstica de estos sistemas, constituidos solo por lfpidos, de organizarse en bicapas y su propiedad de alinearse en un campo magnetico, ha permitido su amplia utilizacion como modelos de membranas en diversos estudios estructurales de membranas de protemas y peptidos (Sanders, C. R.; Prestegard, J. H. Biophys J. 1990, 58, 447).

Recientemente se ha propuesto el uso de bicelas en aplicaciones dermatologicas debido a su pequeno tamano, suficiente para pasar a traves de la piel. Estos estudios han demostrado que la accion de las bicelas sobre la barrera de la piel depende de diferentes variables de composicion actuando como agentes permeabilizantes de la piel o como agentes de refuerzo de sus estructuras lipfdicas (Barbosa-Barros, L; Barba, C; Cocera, M.; Coderch, L; Lopez- lglesias, C; de la Maza, A; Lopez, O. Inter. J. Pharmaceut 2008, 352, 263). Ademas de la utilizacion de bicelas para

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la mejora de la piel se esta estudiando la posibilidad de que las bicelas incorporen medicamentos y otros compuestos bioactivos. El estado del arte relevante tambien incluye WO02/32395.

El problema que se presenta cuando se trabaja con bicelas es que adquieren diferentes morfologfas dependiendo de la razon molar entre el fosfolfpido de cadena larga y el de cadena corta, de la concentracion total de fosfolfpidos y de la temperatura. Asf, por ejemplo, en condiciones de alta dilucion las pequenas bicelas discoidales se convierten en estructuras grandes, tales como vesfculas, laminas, micelas en forma de varilla, etc. Este comportamiento podrfa dificultar la aplicacion de estos sistemas por via sistemica debido a que las propiedades de las bicelas se verfan afectadas por la dilucion, y el dano que estas estructuras podrfan comportar no esta bien definido.

Un metodo para estabilizar la estructura de las bicelas en condiciones de alta dilucion serfa desarrollarlas a partir de mezclas de lfpidos conjugados con polietilenglicol (PEG-lfpidos). El problema de este metodo es que las bicelas obtenidas pierden algunas de sus propiedades, como por ejemplo, la capacidad de potenciar la permeabilidad.

Por tanto, persiste el problema de estabilizar la estructura de las bicelas en ambientes diluidos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Con el fin de mantener el tamano y la forma de las pequenas bicelas discoidales, la presente invencion proporciona un metodo para encapsularlas en vesfculas lipfdicas o liposomas.

En condiciones de alta dilucion, las nanoestructuras bicelares pierden su morfologfa convirtiendose en vesfculas esfericas con tamanos muy superiores, comportamiento que podrfa dificultar el uso de estos compuestos a traves de la ruta sistemica donde el contenido de agua es muy alto.

Sin embargo, en ambientes diluidos, los liposomas son morfologicamente estables, lo que les hace buenos transportadores para aplicaciones sistemicas, presentandose como un metodo util para estabilizar la morfologfa de las bicelas.

Por tanto, la presente invencion se refiere a unas nuevas estructuras lipfdicas que combinan las propiedades de sus elementos constituyentes: los liposomas y las bicelas. Se trata de sistemas lipidicos formados por una membrana fosfolipfdica exterior que forma una vesfcula y que contiene en su interior estructuras discoidales tambien lipfdicas.

En este sentido, un aspecto de la presente invencion se refiere a un liposoma que comprende en su solucion acuosa interna al menos una bicela.

En una realizacion preferida de la presente invencion, el liposoma comprende una concentracion de bicelas de entre el 5 y el 25% en peso seco respecto al liposoma final. La concentracion de bicelas se expresa como tanto por ciento en peso seco con respecto al peso seco del liposoma final, es decir, del liposoma que comprende dicha bicela.

El liposoma estarfa formado por una vesfcula exterior (estructuralmente muy resistente frente a cambios del medio) que tiene como funcion aislar y proteger a las bicelas que contiene en su interior (estructuras discoidales, muy versatiles y modulables), permitiendo de esta manera mantener su forma y tamano para que puedan ser usadas en aplicaciones que conlleven su administracion a traves de distintas vfas donde el contenido en agua es muy alto, como por ejemplo, pero sin limitarse a, via digestiva, via parenteral, via respiratoria y via topica.

Las bicelas son estructuras muy sensibles a los cambios del medio donde se encuentran, por lo que el aislamiento de estas estructuras las protege de posibles variaciones. Este aislamiento se lleva a cabo mediante la encapsulacion de dichas bicelas en el interior de vesfculas lipfdicas o liposomas, donde la membrana lipfdica exterior del liposoma asegura el aislamiento y estabilidad de la bicela capturada en su interior. Es decir, dentro de la vesfcula lipfdica se crea el microambiente perfecto para que la bicela pueda conservar su morfologfa en todo momento. Ademas, los liposomas ofrecen la ventaja de ser estables con la temperatura y la dilucion a diferencia de las bicelas sin encapsular.

Una de las propiedades mas interesantes que poseen las bicelas es la capacidad de potenciar la permeabilidad para poder atravesar las distintas barreras fisiologicas como son la barrera hematoencefalica, la barrera del estrato corneo de la piel, diferentes membranas mucosas como por ejemplo, pero sin limitarse a, la oral, gastrica, intestinal, nasal, conjuntival, pulmonar, y otras barreras fis iologicas.

Este efecto permeabilizador que presentan es debido a su pequeno tamano y a su composicion (fosfolfpidos de cadena larga y fosfolfpidos de cadena corta con efecto activador de superficie o tensioactivo) y se origina porque los lfpidos de las bicelas se mezclan con los lfpidos de las membranas de los tejidos modificando su fluidez y permeabilidad.

La capacidad de potenciar la permeabilidad de diferentes barreras biologicas (como son la barrera hematoencefalica, la barrera del estrato corneo de la piel, diferentes membranas mucosas como por ejemplo, pero

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sin limitarse a, la oral, gastrica, intestinal, nasal, conjuntival, pulmonar, y otras barreras fisiologicas) y, por tanto, el paso a traves de estas barreras proporciona a las bicelas una gran ventaja para su aplicacion en el campo de la medicina y la farmacia.

La temperatura junto con la hidratacion son parametros clave en la estructura que va a adoptar una bicela y, por tanto, muy importantes para que tenga lugar la correcta formacion del liposoma descrito en el aspecto anterior.

Cuando se modifica la concentracion total de lfpidos se inducen cambios morfologicos en la estructura de la bicela causados por la variacion en el contenido de agua. Cuando la cantidad de agua se incrementa, la concentracion de fosfolfpido en agua decrece por lo que es eliminado de la estructura de las bicelas (principalmente de los extremos) para liberarse en el agua en forma de monomeros. Este hecho y la alta hidrofobicidad de las moleculas de fosfolfpido de cadena larga que componen la bicela inducen un incremento en la razon molar (q) entre el fosfolfpido de cadena larga y el de cadena corta y, como consecuencia, un aumento en el diametro de las bicelas.

A una concentracion del 20% en contenido lipfdico, las bicelas son estructuras discoidales pequenas (menores de 10 nm) mientras que al aumentar el agua en el sistema las estructuras pequenas se van transform ando en agregados de mayor tamano de forma que a concentraciones del 0,62% en lfpido ya se empiezan a detectar estructuras con tamanos de 500 nm mezcladas con agregados mas pequenos y a concentraciones lipfdicas del 0,15% solo se detectan estructuras muy grandes mayores de 500nm, por lo que preferiblemente, la bicela se encuentra a una concentracion del 20% en contenido lipfdico total.

Segun otra realizacion preferida, la temperatura de transicion media de los lfpidos del liposoma descrito en el aspecto anterior es de entre 4 y 40 °C.

En la presente invencion el termino "temperatura de transicion de fase", Tm, hace referencia a la temperatura en la que el sistema pasa de la fase gel a la fase cristal lfquido. Se tendran que tener en cuenta dos Tm distintas, la Tm de los lfpidos que forman el liposoma y la Tm de los lfpidos que forman la bicela. Aunque las bicelas estan formadas por una mezcla de dos tipos de lfpidos, se considerara como la temperatura de transicion de fase de las bicelas aquella correspondiente con el fosfolfpido de cadena larga, ya que este es el responsable de que se forme la bicapa de la estructura y la transicion de fase a la que nos referimos esta obligatoriamente ligada a la formacion de bicapas. El termino "temperatura de transicion media" hace referencia al intervalo de temperaturas en el que la Tm de la bicela y la Tm del liposoma coinciden, y por tanto, el intervalo de temperaturas en el que el liposoma descrito en el aspecto anterior se mantiene estable.

Teniendo en cuenta que la Tm de los lfpidos del liposoma es de entre -20 y 40°C y que la Tm de los lfpidos de la bicela es de entre 4 y 60°C, la temperatura de transicion media del liposoma descrito en el aspecto anterior esta en el intervalo comprendido entre 4 y 40°C.

En otra realizacion preferida, la bicela contenida en el liposoma comprende fosfolfpidos de cadena larga en su region central plana y fosfolfpidos de cadena corta en las regiones de los extremos.

Cada fosfolfpido contenido en la bicela esta formado por glicerol, al que se le unen dos acidos grasos y un grupo fosfato. Como hemos dicho, segun donde se situe el fosfolfpidos en la bicela encontraremos que la cadena de acidos grasos sera mayor o menor. Asf, los fosfolfpidos situados en la region central plana deben poseer una cadena de acido graso de como mfnimo 12 carbonos, preferiblemente de como mfnimo 15 carbonos, y mas preferiblemente aun de - como mfnimo 18 carbonos; mientras que la cadena de acido graso de los fosfolfpidos situados en los extremos tendra una longitud de, como maximo, 8 atomos de carbono, preferiblemente de - como maximo - 7 carbonos, y mas preferiblemente aun de - como maximo - 5 carbonos.

En la figura 1 puede observarse como se van situando los fosfolfpidos en la bicela segun la longitud de su cadena hidrocarbonada.

En una realizacion mas preferida, la razon de las concentraciones molares de los fosfolfpidos de cadena larga y de cadena corta de la bicela es de entre 1 y 10, preferiblemente entre 1 ,5 y 9, y mas preferiblemente entre 2 y 8. En otra realizacion mas preferida, la diferencia entre el numero de carbonos entre los fosfolfpidos de cadena larga y cadena corta de la bicela es de entre 5 y 25, preferiblemente entre 7 y 22, y mas preferiblemente entre 8 y 20.

Como se ha mencionado anteriormente, una diferencia significativa entre el numero de carbonos de los distintos fosfolfpidos que componen la bicela proporciona a esta estructura la capacidad de incrementar la permeabilidad para atravesar distintas barreras fisiologicas como podrfan ser la barrera del estrato corneo de la piel o la barrera hematoencefalica.

Debido a que la composicion de la bicapa fosfolipfdica condiciona muchos parametros a tener en cuenta como la densidad de empaquetamiento, flexibilidad, resistencia osmotica, estabilidad "in vivo" e "in vitro", permeabilidad, carga electrica, capacidad antigenica, etc., los fosfolfpidos de cadena larga, empleados en el desarrollo y produccion

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de bicelas, se pueden seleccionar, sin ser limitante, de la lista que comprende dilauril-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diestearil-fosfatidilcolina (DSPC) y diaraquidonil- fosfatidilcolina (DAPC), preferiblemente son DMPC y DPPC y aun mas preferiblemente DPPC. De igual manera, el fosfolfpido de cadena corta empleado en el desarrollo y produccion de bicelas se puede seleccionar, sin ser limitante, de la lista que comprende dipentanoil-fosfatidilcolina (DPePC), dihexanoil-fosfatidilcolina (DHPC), diheptanoil-fosfatidilcolina (DHpPC) y dioctanoil-fosfatidilcolina (DOcPC), siendo preferiblemente dihexanoil- fosfatidilcolina (DHPC).

En una realizacion preferida, la bicela tiene una longitud de eje mayor entre 10 y 80 nm, mas preferiblemente incluso entre 15 y 75 nm y, en otra realizacion preferida, el liposoma tiene un diametro de entre 200 y 1000 nm mas preferiblemente incluso entre 220 y 900 nm.

De aquf en adelante, para hacer referenda a cualquier liposoma descrito en parrafos anteriores se puede emplear el termino "liposoma de la invencion".

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a la composicion que comprende el liposoma de la invencion, de aquf en adelante" composiaon de la invencion".

Los resultados de la invencion confirman que la encapsulacion de las bicelas formando el liposoma de la invencion preserva su estructura bajo diluaon, por lo que, si a esto anadimos las propiedades que presentan estas estructuras, el uso de liposomas de la invencion serfa una buena estrategia tanto para asegurar la estabilidad de las bicelas en todos los tejidos biologicos debido a que en la mayorfa el contenido en agua es elevado, como para introducir bicelas a traves de fluidos biologicos con alto contenido en agua como, por ejemplo, pero sin limitarse a, el fluido cerebroespinal, la sangre y/o la saliva.

Por otro lado, los liposomas de la invencion tienen la capacidad de encapsular diferentes sustancias de un modo similar a como lo hacen los liposomas, pero con la ventaja de que una vez transportado el farmaco, la penetracion de este en un tejido concreto estara favorecida por el efecto de la estructura discoidal interna de la bicela. Ademas, la encapsulacion y transporte de sustancias hidrofobicas en los liposomas de la invencion esta mas favorecida por el hecho de que estas estructuras contienen una proporcion mayor de bicapa que los liposomas. Asf, pueden ser incorporadas sustancias en el interior de las bicelas de forma que estas estructuras se utilicen como transportadores, marcadores, o para cualquier aplicacion que considere apropiada un experto en la materia.

Asf, como se ha descrito anteriormente, la microencapsulacion en el campo textil es una tecnologfa novedosa que permite sustituir las dispersiones o emulsiones de determinadas sustancias por fluidos similares en donde dichos compuestos se encuentran dispersos en el interior de microcapsulas de sustancias inertes, que se fijan al textil por un sistema efectivo. Los liposomas ya han sido ensayados como agentes microencapsulantes, pero debido a que este proceso requiere de un conocimiento ffsico-qufmico eficaz de las interacciones existentes a nivel fibra- microcapsula, los liposomas de la invencion pueden mejorar de forma significativa las actuales aplicaciones de liposomas en los procesos industriales de tintura de la lana o de cualquier otro material textil aumentando la adsorcion, penetracion y fijacion tanto de colorantes, pigmentos como de otras sustancias utilizadas en este campo de la tecnica, y conocidas por cualquier experto en la materia, y que permitan obtener tejidos capaces de realizar diversas funciones, conocidos en la actualidad como "tejidos polifuncionales" o "smart textiles".

Por tanto, otro aspecto de la presente invencion se refiere al liposoma de la invencion que ademas contiene un colorante y/o un pigmento, asf como a su uso para el encapsulado de colorantes, pigmentos u otras sustancias utilizadas en este campo de la tecnica, y conocidas por cualquier experto en la materia, y que permitan obtener tejidos capaces de realizar diversas funciones, conoddos en la actualidad como "tejidos polifuncionales" o "smart textiles". Estos liposomas de la invencion que pueden contener ademas colorantes y/o pigmentos se pueden utilizar para el tintado de materiales textiles, o pueden contener tambien otras sustancias utilizadas en la industria textil aumentando asf la eficacia de los procesos de tintado de estos materiales textiles.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al liposoma de la invencion que ademas comprende un principio activo, asf como a su uso para el encapsulado de al menos un principio activo.

El termino "principio activo" hace referencia a cualquier sustancia capaz de provocar un efecto sobre el organismo o a cualquier sustancia capaz de utilizarse para identificacion o diagnostico. La actividad de un principio activo varfa debido a la naturaleza de estos, pero siempre esta relacionada con la cantidad ingerida o absorbida.

Asf, el principio activo se puede seleccionar de entre la lista que comprende, pero sin limitarse a, agentes marcadores utiles para el diagnostico como derivados del gadolinio (acido gadopentetico, gadodiamina, acido gadoterico y gadoteridol), derivados de hierro (hierro III amonio citrato, ferumoxido y hierro III oxido) o derivados de magnesio; agentes antiinflamatorios como diclofenaco, acetaminofeno o acido flufenamico; antioxidantes como polifenoles (flavonoides), vitaminas (A E, C), oligoelementos (selenio, zinc), carotenoides (lutefna), aminoacidos (teanina) o cafefna; filtros solares como aminobenzoatos, salicilatos, benzofenonas, derivados del dibenzoilmetano,

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cinamatos o acrilatos; agentes citotoxicos como agentes alquilantes, metotrexato, 6-mercaptopurina, 5-fluoracilo, antibioticos antitumorales o cisplatino y derivados; agentes inmunogenicos; sustancias que signifiquen un aporte exogeno para situaciones patologicas de carencia como vitaminas, hierro, calcio; lfpidos epidermicos de especial importancia para la funcion barrera de la piel como ceramidas, sulfato de colesterol o acidos grasos libres; acidos nucleicos o drogas hidrofobicas, o mezclas de cualquiera de los anteriores.

En una realizacion preferida el principio activo se puede seleccionar entre diclofenaco, hierro, gadodiamida, acido flufenamico, cafefna, ceramidas, sulfato de colesterol o mezclas de ellos.

En esta invencion se demuestra que sustancias como la gadodiamida (util como marcador en resonancia magnetica de imagen que permite el seguimiento en todo momento del recorrido de los liposomas de la invencion en el interior del organismo), el diclofenaco y el acido flufenamico (antinflamatorios de alto espectro), el hierro (habitualmente utilizado para el tratamiento de anemias), la cafefna (usado como antioxdante) y, las ceramidas y el sulfato de colesterol (lfpidos responsables de la correcta funcion barrera de la piel e implicados en diversos mecanismos biologicos) son encapsuladas de forma eficaz en el interior de las bicelas contenidas en los liposomas de la invencion.

Esta capacidad de utilizar los liposomas de la invencion como vehfculos farmacologicamente activos conducirfa al uso de estas estructuras para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sustancia que se esta transportando, tratando entre otras, patologfas relacionadas con procesos inflamatorios (cuando se encapsulan antiinflamatorios como diclofenaco y acido flufenamico), enfermedades relacionadas con la deficiencia de hierro y/o vitamina B12 como son la anemia y la enfermedad de Crohn entre otras, lesiones (por regulacion de la adhesion plaquetaria), cancer (cuando se encapsulan agentes citotoxicos), etc. Ademas, los liposomas de la invencion tambien podrfan ser utilizados en terapia genica dirigiendo el gen defectivo o ausente que esta encapsulado a las celulas diana del paciente.

La alta capacidad permeabilizadora que presentan las bicelas las hace estructuras adecuadas como cosmeticos por sus ya probadas propiedades dermatologicas debido a que promueven un refuerzo de los lfpidos presentes en el estrato corneo, dando como resultado un aumento de los valores de elasticidad y una mejora de las caracterfsticas del tejido biologico (Barbosa-Barros, L; Barba, C; Cocera, M.; Coderch, L; Lopez-lglesias, C; de la Maza, A.; Lopez, O. Inter. J. Pharmaceut. 2008, 352, 263) siendo utiles para potenciar la reparacion de tejidos danados por envejecimiento cutaneo, eczemas, sequedad, quemaduras, grietas, manchas y todas aquellas patologfas relacionadas con la falta de lfpidos en las celulas del estrato corneo.

Ademas el encapsulamiento, en el interior de los liposomas de la invencion, de agentes cutaneos reparadores, vitaminas, filtros solares u otros principios activos potenciarfa las acciones cosmeticas de los liposomas.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invencion se refiere al uso del liposoma de la invencion, o la composicion de la invencion, o dicha composicion que ademas comprende un principio activo para la elaboracion de un producto cosmetico, donde el cosmetico se administra por vfa topica.

Se entendera por "producto cosmetico" toda sustancia o formulacion de aplicacion local a ser usada en las diversas partes superficiales del cuerpo humano: como, pero sin limitarse, a epidermis, sistema piloso y capilar, unas, labios y organos genitales externos o en los dientes y las mucosas bucales, con el fin de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto y protegerios o mantenerlos en buen estado y prevenir o corregir los olores corporales. La via topica utiliza la piel y las mucosas para la administracion del cosmetico, lo que incluye las mucosa conjuntival, nasal, oral y urogenital, y ademas el sistema piloso y capilar, unas, labios y dientes.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso del liposoma de la invencion, o la composicion de la invencion, o dicha composicion que ademas comprende un principio activo para su uso como medicamento.

El liposoma de la invencion asf como la composicion de la invencion, conteniendo o no un principio activo, puede usarse para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de, pero sin limitarse a, enfermedades de la piel, hepaticas, renales, cardiovasculares, cerebrales, oseas, musculares, tejidos asociados al tracto gastrointestinal, urinario, sistema respiratorio, endocrino, nervioso o tejido auditivo u ocular.

Una realizacion preferida se refiere al uso del liposoma de la invencion, o la composicion de la invencion, o dicha composicion que ademas comprende un principio activo, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de la piel, tejido nervioso o tejido ocular. En una realizacion mas preferida el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administracion por via raqufdea o por via topica a traves de la mucosa conjuntival.

El termino "forma adaptada" hace referenda al modo de adecuar el medicamento de la presente invencion para que pueda ser administrado por vfa raqufdea o por via topica a traves de la mucosa conjuntival.

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Otra posibilidad es que el medicamento se presente en una forma adaptada a la administracion parenteral, cutanea, oral, epidural, sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfatica, rectal, transdermica o inhalada. La forma adaptada a la administradon parenteral se refiere a un estado ffsico que pueda permitir su administracion inyectable, es decir, preferiblemente en estado lfquido. La administracion parenteral se puede llevar a cabo por via de administracion intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradermica, subcutanea o intraosea, pero sin limitarse unicamente a estos tipos de vfas de administracion parenteral. La forma adaptada a la administracion oral se seleccona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspension, suspension extern porane a, vial bebible, comprimido, capsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. La forma adaptada a la administracion rectal se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, capsula rectal, dispersion rectal o pomada rectal. La forma adaptada a la administracion transdermica se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, parche transdermico o iontoforesis.

Asf se abren un gran numero de aplicaciones en distintos campos para estas nanoestructuras bicelares.

Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el liposoma de la invencion, o que comprende la composicion de la invencion, o que comprende dicha composicion que ademas comprende un principio activo. En una realizacion preferida, la composiaon farmaceutica ademas comprende al menos un excipiente farmacologicamente aceptable.

El termino "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion del liposoma de la invencion o la composiaon de la invencion, estabiliza dicho compuesto o ayuda a la preparacion de la composiaon farmaceutica en el sentido de darle consistenaa o aportar sabores, aromas, texturas y proteccion que lo hagan mas agradable. Asf pues, los excipientes podrfan tener la funcion de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azucares o celulosas, funcion de endulzar, funcion de colorante, funcion de proteccion del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentacon como por ejemplo el fosfato de calcio dibasico, funcion desintegradora para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo.

El termino "farmacologicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia este permitido y evaluado de modo que no cause dano a los organismos a los que se administra.

Dentro de las sustancas activas estan, por ejemplo, las descritas anteriormente, tanto en una composicion junto con los liposomas de la invencion o encapsuladas dentro de los liposomas de la invencion.

Otro aspecto de la invencion se refiere al metodo para obtener el liposoma de la invencion, que comprende:

a. obtener un film lipfdico desecado y una solucion acuosa de bicelas, b. hidratar el film lipfdico obtenido en el paso (a) con la solucion acuosa de bicelas obtenidas en el paso (a),

c. aislar y/o purificar el producto obtenido en el paso (b).

En una realizacion mas preferida, la obtencion del film lipfdico desecado del paso (a) comprende:

i. disolver lfpidos en un solvente organico a concentraciones entre 5 y 30 mg/ml, y

ii. eliminar el solvente organico del paso anterior.

En una realizacion mas preferida, la obtencion de la soluaon acuosa de bicelas del paso (a) comprende:

i. disolver en un solvente organico fosfolfpidos de cadena larga y fosfolfpidos de cadena corta cuya razon de las concentraaones molares es de entre 1 y l0,

ii. eliminar el solvente organico del paso anterior y rehidratar el producto obtenido con solucion acuosa hasta conseguir una concentracion de lfpidos de entre 15 y 25% peso/volumen.

En una realizacion aun mas preferida el fosfolfpido de cadena larga es dimiristoil-fosfatidilcolina o dipalmitoil- fosfatidilcolina y el fosfolfpido de cadena corta es dihexanoil- fosfatidilcolina.

La solucion final debe ser transparente, para ello, la metodologfa de preparacion requiere la consecucion de una serie de pasos que han sido optimizados, los cuales incluyen tratamientos con ultrasonidos durante tiempos que osalan entre 5 minutos y 5 horas, a temperaturas entre 5-60°C y potencias entre 100 y 600W y un especffico proceso de centrifugacion tal como se describe en el siguiente parrafo, con el fin de separar/purificar los liposomas de la invencion de otros agregados lipfdicos que hayan podido formarse.

Un paso importante una vez se obtienen el film lipfdico desecado, la solucion acuosa de bicelas y se hidrata el film lipfdico con la solucion de bicelas, es la purificacion, de las estructuras obtenidas, por centrifugacion entre 15000xg y

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30000xg preferiblemente 20000xg durante periodos entre 120 y 15 min mas preferiblemente 45 min. Condiciones mas o menos drasticas conducirfan a sistemas formados por mezclas de agregados. Otros sistemas de purificadon/separadon que impliquen diluciones, como son las resinas de exclusion de tamano podrfan provocar la transicion de bicelas no encapsuladas, a vesfculas.

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterfsticas tecnicas tales como morfologfa, topologfa, fluidez, viscosidad, heterogeneidad de las estructuras resultantes, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterfsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS FIG. 1. Estructura de una bicela.

Muestra los dos tipos de fosfolfpidos que debe poseer una bicela en cada una de sus zonas diferenciando para ello la zona de los extremos de la zona central plana. En la zona designada (1) y en su extremo opuesto, hay una tasa mas alta de acidos grasos de cadena corta en comparacion con los de cadena larga. En la zona designada (2) y sus alrededores, hay una mayor concentracion de acidos grasos de cadena larga en comparacion con los de cadena corta.

FIG. 2. Microfotograffas representativas de muestras bicelares antes (A) y despues (B) de la dilucion.

En la Figura 2A (bicelas) las bicelas se muestran en todas las proyecciones: de frente (flecha blanca) y lateralmente (flecha negra).

En la Figura 2B (bicelas diluidas) se observan vesfculas esfericas unilamelares que muestran una gran variedad de tamanos (de 30 a 250 nm).

FIG. 3. Micrograffas obtenidas por cryo-TEM de liposomas de la invencion (liposomas y bicelas).

En la Figura 3 se observaron dos tipos de estructuras: estructuras pequenas de aproximadamente 20 nm, y otras mayores de tamano entre 100 y 200 nm.

La Figura 3A muestra una vista general de la muestra de liposomas de la invencion en la cual se ven una gran cantidad de bicelas. Es de resaltar la gran adherencia de la mayorfa de las bicelas sobre el carbono (zona senalada en la Fig. 3A con un asterisco). Estas bicelas mostraron principalmente la proyeccion lateral.

La Figura 3B muestra bicelas encapsuladas, en sus dos proyecciones (flechas blancas) y bicelas no encapsuladas (flechas negras). Algunas de las bicelas encapsuladas mostraron un aumento de tamano (alrededor de 100 nm) con respecto a las no encapsuladas (20 nm), ver Figura. 3A

La Figura 3C muestra bicelas apiladas cara a cara dentro de los liposomas.

FIG. 4. Micrograffas obtenidas por cryo-TEM de liposomas de la invencion diluidos (liposomas y bicelas).

La Figura 4A muestra una alta variabilidad de vesfculas en la muestra diluida: liposomas vacfos (flechas negras); liposomas dentro de otros liposomas llamados vesfculas oligo-lamelares (punta de flecha blanca); vesfculas

multilamelares (flechas en blanco) y liposomas con bicelas dentro o liposomas de la invencion (punta de flecha negra).

La Figura 4B muestra liposomas multilamelares.

La Figura 4C muestra acumulaciones de bicelas dentro de liposomas como en las muestras tras la dilucion (Fig. 3C). La Figura 4D muestra en detalle bicelas apiladas dentro de los liposomas multilamelares.

FIG 5. Visualizacion por MRI de inyeccion intra-cerebro-ventricular de bicelas conteniendo gadodiamida.

La Figura 5A muestra la vision coronal del cerebro de rata sano.

La Figura 5B muestra la vision coronal del cerebro de rata inyectado con la muestra de bicelas conteniendo gadodiamida.

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FIG. 6. Visualizacion por MRI de inyeccion intra-cerebro-ventricular de bicelas conteniendo gadodiamida encapsuladas en liposomas.

La Figura 6A muestra una vista sagital de cerebro de rata sana (primera imagen) e inyectada con la muestra de liposomas de la invencion (liposomas que contenfan en su interior bicelas de Gadodiamida) a las Oh, 4h, 8h y 24 horas despues de la inyeccion (cuatro imagenes siguientes).

La Figura 6B muestra la hiper-intensidad inducida por gadodiamida que se cuantifico dibujando un entorno de una zona anatomica que contenfa fluido cerebroespinal (CSF) a distintos tiempos. Detalle de la region de interes.

La Figura 6C muestra la intensidad de senal del LCR (normalizada frente a intensidad muscular) para una rata de control (barra blanca) y la rata inyectada con liposomas que contenfan bicelas con gadodiamida (barras negro) en diferentes tiempos despues de la inyeccion. Representacion para observer la evolucion de la hiper-intensidad en el tiempo.

FIG. 7. Micrograffas obtenidas con TEM (microscopio electronico de transmision) de mucosa oral porcina.

La figura 7A muestra una imagen de la mucosa sin tratar y la figura 7B muestra el tejido despues del tratamiento con los liposomas de la invencion que contienen nistatina. No se observan cambios estructurales que puedan asociarse al deterioro del tejido.

EJEMPLOS

A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la preparacion de los liposomas de la invencion, su caracterizacion mediante espectroscopia de correlacion fotonica (DLS) y crio-microscopfa electronica de transmision (Cryo-TEM) y el efecto de la introduccion de estos sistemas en dos ratas Wistar por inyeccion intracerebroventricular por visualizacion MRI. En todos los ensayos se pone a prueba la estabilidad de la bicelas en ambientes diluidos a fin de utilizar estas nano-estructuras a traves de vfas sistemicas que impliquen un alto contenido en agua.

En estos ejemplos el termino "sistema" se refiere a las propias bicelas o a los liposomas que comprenden bicelas en su interior.

EJEMPLO 1. Preparacion de sistemas.

1 .1 Bicelas.

Se eligio para su preparacion la mezcla compuesta por DPPC/DHPC. La razon de esta eleccion es debida a que en los intervalos de temperatura de trabajo (de 25 a 37 °C) las bicelas compuestas por DPPC/DHPC no experimentan los cambios observados en las bicelas compuestas por DHPC en combinacion con otro fosfolfpido de cadena larga. Este hecho encuentra su explicacion en que el DPPC posee una Tm de 41 °C, temperatura significativamente superior a la temperatura de trabajo usada en la presente invencion, con lo que se confirma que la transicion en la estructura de una bicela ocurre a temperaturas superiores a la temperatura de transicion de los lfpidos que la forman.

Las muestras se prepararon mezclando cantidades apropiadas de DPPC en polvo y una solucion cloroformica de DHPC hasta alcanzar una razon molar DPPC/DHPC de q = 3.5. Una vez mezclados los componentes, el cloroformo se elimino por medio de un rotavapor y los sistemas resultantes se hidrataron con una solucion del marcador paramagnetico gadodiamida hasta alcanzar el 20% (peso/volumen) de la concentracion total de lfpido. Las soluciones bicelares se prepararon sometiendo a las muestras a varios ciclos de sonicacion y congelacion hasta que las muestras llegaron a ser transparentes.

1 .2 Bicelas encapsuladas en liposomas: Liposomas de la invencion.

La composicion de los liposomas utilizados fue de 80% Lipoid S-100 y del 20% de colesterol. Estos dos componentes se mezclaron en cloroformo y a continuacion se formo un film lipfdico eliminando el cloroformo con rotavapor. El film formado se hidrato con la solucion bicelar previamente formada. Esta solucion se extruyo tres veces a traves de una membrana de policarbonato de 800 nm. La solucion de liposomas se centrifugo durante 45 minutos a 20000 x g en una centrffuga Heareus con un rotor JA-20. El sobrenadante se separo y el pelet, se resuspendio hasta obtener el volumen inicial con NaCI 0.9% a fin de mantener la misma concentracion de lfpido. Este procedimiento se repitio 3 veces. Asf fue posible separar las gadodiamida encapsulada de la no encapsulada en el sistema lipfdico.

EJEMPLO 2. Caracterizacion de los sistemas.

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A fin de evaluar el efecto de la dilucion en los sistemas, las muestras se analizaron utilizando las tecnicas de espectroscopia DLS y Cryo-TEM antes y despues de la dilucion. La primera tecnica se utilizo para determinar el tamano medio de los sistemas, mientras que la segunda fue muy util para la caracterizacion de aspectos dimensionales y morfologicos de las nano-estructuras y para proporcionar una visualizacion directa de las muestras de los l ipidos.

2.1 Espectroscopia de correlacion fotonica (DLS)

El diametro hidrodinamico (HD) y el fndice de polidispersidad (Pl) se determinaron usando el aparato Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Systems, Southborough, MA).

Las medidas de DLS consideran el movimiento Browniano de las partfculas y correlaciona esta lectura con los tamanos de partfcula. La relacion entre el tamano de partfcula y su velocidad debida al movimiento Browniano se define en la ecuacion de Stokes-Einstein:

HD = kT/3 nq D

donde:

HD es el diametro hidrodinamico, D es el coeficiente de difusion translacional (m2/s), k es la constante de Boltzmann (1 .3806503 x 10 23 m2 kg s 2 k1), T es la temperature absoluta (K) y q es la viscosidad (mPa.s). Los diferentes tamanos de los sistemas se determinaron por deteccion y analisis de la luz dispersada cuando el rayo laser de He/Ne de 632 nm atraviesa la muestra.

La interpretacion de los datos se realizo considerando la distribucion de tamanos por intensidad y por volumen de la luz dispersada. El uso de esta metodologfa, que considera que partfculas con diferentes tamanos difunden diferente intensidad de luz, es especialmente util en muestras que presentan alta heterogeneidad de tamanos. Las medidas por DLS se realizaron a 25 y 37° C a fin de observer las caracterfsticas de los sistemas a temperaturas ambiente y fis iologica.

Los datos obtenidos a temperatura ambiente se indican en la Tabla 1 .

Tabla 1. HD y proporcion de las poblaciones de partfculas analizadas por intensidad y volumen de luz dispersada

INTENSIDAD VOLUMEN

HD (nm) % imens idad HD(nm) % Volumen

Bice

Pico 1 19,5 91,3 16,3 93,9

Lipo Inv

Pioo 1 92 100 11.9 10O

Bice Dil

Pico 1 255 66.4 256 3 6

Pico 2

266 11.6 26.6 96.4

Lipo lov

Pico 1 800 863 850 598

Dil

Pico 2 72,4 13,7 63.7 402

Datos obtenidos con el software proporcionado por la empresa Malvern Instruments.

Los HDs para bicelas DPPC/DHPC (Bice) fueron de 19.5 nm y 16.3 nm estimados por intensidad y por volumen respectivamente, con una proporcion de luz dispersada superior al 90% en ambos analisis.

La muestra conteniendo bicelas se diluyo del 20% (concentracion inicial) al 0.07 % (concentracion final) para saber el efecto de la dilucion sobre la estructura bicelar. Al diluir la muestra (Bice Dil) se observaron en ambos analisis (por intensidad y por volumen), dos poblaciones de partfculas una de un tamano alrededor de 26 nm y la otra alrededor de 255 nm. Las proporciones de luz dispersada analizadas por intensidad y por volumen fueron diferentes. Esto es debido a que las partfculas grandes y pequenas contribuyen de forma diferente a la intensidad de la luz dispersada. Asf, las partfculas grandes dispersan mayor intensidad de luz que las pequenas. Por esta razon en los sistemas de tamanos heterogeneos el analisis por intensidad dio lugar a una proporcion mayor de partfculas grandes, como puede apreciarse en la Tabla 1. El analisis simultaneo por volumen indico mayor proporcion de partfculas pequenas (96,4%) que de partfculas grandes (3,6%), indicando la presencia predominante de partfculas pequenas en el

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sistema, aunque la intensidad de luz dispersada para partfculas grandes (88,4%) fuera mayor que para las pequenas (1 1 ,6%).

Los valores de Pl para los sistemas bicelares fueron respectivamente 0.452 y 0.714, antes y despues de la dilucion. Asf, al diluir la muestra el tamano de las poblaciones aumento y las muestras fueron mas heterogeneas.

Con todo, es necesario considerar que en esta tecnica, el tamano de las partfculas se aproxima al de una hipotetica esfera que difunde con la misma velocidad que la partfcula del experimento. Como la estructura bicelar tiene forma de disco, el tamano de las partfculas obtenidas por el DSL proporciona una medicion relative de las dimensiones de la estructura. Por lo tanto, estos datos deben interpretarse teniendo en cuenta tambien las imagenes de cryo-TEM que se analizan en el apartado 2.2.

Los resultados obtenidos por DSL para bicelas encapsuladas en liposomas, (liposomas de la invencion, Lipo Inv) se muestran en la Tabla 1. El analisis por intensidad y por volumen (ambos con una proporcion de la luz dispersada de 100%) solo mostro un pico. El HD analizado por intensidad fue de 92 nm y el de volumen 1 1 ,9 nm. Como ya se ha mencionado, estas diferencias se deben a que las partfculas grandes (92 nm) dispersaron mucha mas intensidad de luz que las partfculas pequenas (1 1 ,9 nm). Por esta razon en el analisis de intensidad solo se observo el pico que se corresponde con las partfculas grandes. Al analizar las muestras por volumen, se observo una gran contribucion de las partfculas pequenas que podia ocultar la pequena contribucion al volumen de las partfculas de gran tamano con lo que se vio solo un pico, que correspondfa con la contribucion de las pequenas partfculas. Por lo tanto, dos tipos de estructuras estuvieron presentes, aunque solo se observo un pico para cada analisis. Se describen a continuacion (apartado 2.2) los resultados obtenidos por microscopfa a fin de aclarar esta interpretacion.

Cuando se diluyo la muestra de liposomas de la invencion (Lipo Inv Dil.) se observaron claramente dos picos (Tabla 1 ). En general, las estructuras se hicieron mas grandes con diametros de 800 nm (86,3%) y 72,4 nm (13,7%) por intensidad y 850 nm (59,8%) y 68,7 nm (40,2%) por volumen. Los valores de Pl tambien aumentaron de 0,420 a 0,612 antes y despues de la dilucion, respectivamente.

Los datos de DLS a 37 0 C no mostraron cambios en comparacion con los resultados a temperatura ambiente.

2.2 Crio-microscopfa electronica de transmision (Crvo-TEM)

Los liposomas y bicelas se visualizaron por el metodo de Cryo-TEM. Se formo una fina pelfcula acuosa por extraccion de la muestra de la suspension colocada sobre una rejilla. Para ello se utilizaron rejillas de carbono Despues de retirar parte de la suspension de la rejilla se seco con papel de filtro, quedando una pelfcula de muestra sobre la rejilla. Estas pelfculas fueron vitrificadas sumergiendo la rejilla en etano, que se mantuvo en su punto de fusion con nitrogeno lfquido (segun tecnica descrita en Honeywell-Nguyen, P. L.; Frederik, P. M.; Bomans, P. H.; Junginger, H. E.; Bouwstra, J. A Pharm Res 2002, 19, 991) con un Vitrobot (FEI Company, Eindhoven, Holanda) y manteniendo las muestras antes de la congeladon a 100% de humedad. La temperatura a la que se inicio la vtrificacion de las pelfculas delgadas fue temperatura ambiente. Las muestras vftreas fueron trasladadas a un microscopio Tecnai F20 (FEI Company, Eindhoven, Holanda) con un cryotransfert Gatan (Barcelona, Espana). La visualizacion fue realizada a 200 kV, a una temperatura de entre -170 0 C y -175 0 C usando las condiciones para baja densidad de imagen

En las imagenes se obtiene una visualizacion directa de la estructura bicelar. Todas las mediciones se obtuvieron por DLS a temperaturas ambiente y fisiologica, (25°C y 37°C) y no se detecto ninguna modificacion en el tamano por causa de la temperatura. Dado que la temperatura no tuvo efecto sobre estos sistemas, los experimentos de cryo- TEM solo se realizaron para muestras crio-fijadas desde la temperatura ambiente. Agunas micrograffas representativas de las muestras antes (muestra de bicelas) y despues (muestra de bicelas diluidas) de la diludon se muestran en las Figuras 2A y B, respectivamente.

Las imagenes confirmaron los resultados obtenidos por DLS, demostrando que el tamano de las estructuras en la muestra de bicelas, alrededor en todos los casos de 20 nm., fue menor que el tamano de las estructuras en la muestra de bicelas diluidas, que mostraron tamanos que iban desde 30 nm. a 250 nm. Ademas, la morfologfa de las partfculas tambien cambio con la dilucion (ver Figura 2). Este hecho coinade con los valores de Pl altos (0,714) observados por DLS. Asf, el DLS y la microscopfa muestran una transicion del sistema de discos bicelares a vesfculas, transicion causada por el efecto de la dilucion.

A fin de investigar la morfologfa de estos sistemas, las muestras de liposomas de la invencion y de liposomas de la invencion diluidos se analizaron por cryo-TEM. Tambien en este caso las muestras para observacion microscopica solamente se crio-fijaron a temperatura ambiente. Micrograffas obtenidas por cryo-TEM se muestran en las Figuras 3 y 4.

La variedad de tamanos, entre 70 nm y 600 nm, presente en estas imagenes confirma la alta Pl (0.612) en la muestra de liposomas de la invencion diluidos. Mientras que las estructuras pequenas corresponden a bicelas

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discoidales, las mayores corresponden a liposomas unilamelares. Estas micrograffas confiriman la interpretacion de los resultados de DLS para muestras de los liposomas de la invencion debido a que, aunque solo se detecto un pico por analisis de volumen e intensidad (Tabla 1 ), se observaron dos tipos de estructuras. Sin embargo, los resultados tambien indicaron una alta conservacion estructural de las bicelas encapsuladas independientemente del proceso de dilucion debido a que las muestras de liposomas de la invencion diluidos solo se observaron dentro de los liposomas, no son visualizadas bicelas libres (ver Figura 4).

EJEMPLO 3: Incorporacion de diferentes sustancias en los sistemas

Las sustancias que se incorporaron en los sistemas fueron: hierro (como cloruro de hierro a una concentracion del 50%), ceramidas (10 y 20%), cafefna (10%), gadodiamida (60%), sulfato de colesterol (20%), diclofenaco (1 .16%) y acido flufenamico 1 %). La incorporacion se hizo en la fase de realizacion de las bicelas. Dependiendo del caracter hidrofilo o lipofilo de la sustancia, esta se anadio junto con los lfpidos formadores de la bicela en la fase cloroformica o junto con el agua de hidratacion. Se eligieron para estas preparaciones las mezclas compuestas por DPPC/DHPC, DMPC/DHPC y DOPC/DHPC. El DOPC es dioleoilfosfatidilcolina. Se trabajo con razones molares de concentraciones de los dos lfpidos de 2 a 3.5.

Las muestras se sometieron a entre 10 y 50 ciclos de sonicacion en bano de ultrasonidos 5 minutos y congelacion 5 minutos hasta que llegaron a ser transparentes. Estas bicelas con las sustancias contenidas en su interior, se encapsularon en liposomas de la manera descrita en el ejemplo 1 y se caracterizaron siguiendo los metodos descritos en el ejemplo 2.

EJEMPLO 4: Uso de los sistemas de la invencion para su uso en productos de aplicacion ocular.

Un compuesto con efecto terapeutico en el tratamiento de sensibilizaciones de la mucosa conjuntival, fue incorporado en los sistemas de la invencion como describe el ejemplo 3. Se comprobo mediante microscopfa optica que este compuesto, que habfa sido imposible de dispersar utilizando otros sistemas de emulsion (siempre cristalizaba formando estructuras muy grandes), se mantenfa disperso sin formar ningun agregado cuando era incorporado en los sistemas de la invencion. Este hecho resulto ser todo un exito, ya que la formacion de cristales siempre impedfa su uso para aplicacion ocular. Los sistemas de la invencion conteniendo dicho compuesto fueron aplicados en ojos de animales de experimentacion y se comprobo por microscopfa optica que los cristales tampoco se formaban al entrar en contacto con el entorno acuoso del ojo.

Ademas se realizaron ensayos de estabilidad y de actividad del citado compuesto, y se verifico que este se mantenfa estable y activo despues de su incorporacion a los sistemas de la invencion.

EJEMPLO 5. Experimentos "in vivo": Agente de visualizacion de contraste por Resonancia Magnetica de Imagen (MRI)

Ademas, se realizaron experimentos "in vivo" para conocer la estabilidad de estas nuevas estructuras. Se incluyo en estos sistemas el agente de contraste paramagnetico gadodiamida. Este agente fue inyectado en el sistema ventricular del cerebro de rata y se visualizo por resonancia magnetica (MRI). Indujo una hiper-intensidad que fue cuantificada mediante la definicion de una region de interes (ROI) en el compartimento de lfquido cefalorraqufdeo (LCR).

3.1 Animales

Los experimentos de MRI se realizaron en dos ratas Wistar (machos adultos de peso 250-275 g.) Las ratas se acondicionaron a temperatura (21 ±1 °C) y humedad (55±10%) controladas, con ciclos de 12-h de luz/12-h de oscuridad (luz entre 6:00 AM y 6:00 PM). Se les suministro alimento y agua ad libitum durante el acondicionamiento. Todos los experimentos se realizaron siguiendo las normas de la "National Institute of Health Animal Protection Guidelines" y fueron aprobadas por las autoridades del Comite Local de Bioetica.

3.2 Inyecciones Stereotaxias.

Los animales fueron previamente anestesiados con 4% isofluorano en O2:N2O (3:7, cantidad que se redujo al 1 % de isofluorano durante el mantenimiento, y se colocaron en un aparato estereotactico (Stoelting, EE.UU.). La sutura sagital, y la superficie del cerebro fueron utilizadas como referencias para las coordenadas anteroposteriores (AP), medio4aterales (ML), y dorso-ventrales (DV), respectivamente. Se practico un agujero en el craneo de la rata para inyectar la solucion en el ventrfculo lateral en las siguientes coordenadas estereotaxicas: AP: -0,04 mm; ML: -0,12 mm; DV: -0,37 mm de la Bregma. Cantidades de 50 pi de una soluon acuosa conteniendo dos preparaciones diferentes de bicelas (una formada por bicelas libres y otra formada por los liposomas de la invencion) mezcladas con gadodiamida fueron inyectadas con una jeringa de 100 pi Hamilton equipada con una aguja de 32G, a un ritmo de inyeccion de 2 pi /min.

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Despues de la inyeccion, la aguja se dejo en el lugar durante 5 minutos para evitar fugas. Al final de la cirugfa, la piel se suturo y el animal fue trasladado a la base del escaner para la obtencion de imagenes de RM. La gadodiamida se inyecto tanto en la solucion de bicelas como en la de liposomas de la invencion. La concentraaon de bicelas que se utilizo para la inyeccion fue de 200 mg/ml. El investigador que llevo a cabo la administracion estereotaxica posefa una gran experiencia en este procedimiento.

3.3 Resonancia Magnetica de Imagen (MRI) "in vivo".

Se realizaron barridos de RM bajo anestesia con isofluorano en un escaner 70/30 BioSpec horizontal para animales (Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania), equipado con un diametro interior de 12 cm activamente blindado y con un sistema de gradiente (400 mT/m). El anillo de configuracion consistio en una bobina de transmision/recepcion. Los animales fueron colocados en posicion supina en un soporte de plexiglas con un cono nasal para la administracion de gases anestesicos, fijada con una barra a los dientes, tapones para los ofdos y cinta adhesiva. Las exploraciones Tripilot se utilizaron para la colocacion exacta de la cabeza del animal en el interior del iman. La cabeza del animal fue colocada de tal forma que aproximadamente el centro del cerebro coincidiera con el isocentro del iman. Se realizo una secuencia de imagenes T1 -ponderadas axiales sagitales con un flash convencional (Fast Low Angle Shot imagenes). Los parametros de exploracion de las imagenes sagitales fueron: tiempo de repeticion (TR) = 350 ms, tiempo de eco (TE) = 5,4 ms, 2 medias, el grosor de corte = 1 mm, el numero de cortes contiguos = 15, campo de vision (FOV) = 4 x 4 cm2, y la matriz = 256 x 256 x 15 pfxeles, resultando en una resolucion espacial de 0,156 x 0,156 mm en 1 mm de espesor del corte. Ademas, los mapas T1 con orientacion axial fueron realizados con RAREVTR (adquisicion rapida con el mejoramiento de la relajacion y el tiempo variable de repeticion) de secuencia. Los parametros de exploracion fueron: Tr=182,412 ms, 200 ms, 500 ms, 700 ms, 1000 ms, 1400 ms, 2000 ms, 3000 ms, 6000 ms, TE = 10 ms, con un grosor de corte = 1 mm, el numero de cortes contiguos = 12, FOV = 3 x 3 cm2, y la matriz = 128 x 128 x 12 pfxeles, resultando en una resolucion espacial de 0,234 x 0,234 mm en 1 mm de espesor del corte. La toma de imagenes se realizo justo despues de la inyeccion y a 4,8 y 24 horas mas tarde.

3.4 Analisis de imagenes.

Se determino una region de interes (ROI) que se delimito en el compartimento lfquido cefalorraqufdeo (LCR) de cada imagen para evaluar el aumento de la senal producida por la gadodiamida. Se normalizo la senal y se realizo el analisis estadfstico mediante la prueba t de Student emparejado (un valor de p <0,05 fue considerado significative).

Cuando lo que se inyecto fueron bicelas libres, cinco minutos despues del final de la infusion de las bicelas ambos animales murieron, debido a la drastica expansion a las que se vieron sometidas las bicelas en todo el sistema cerebro-ventricular de la rata, y el analisis de MRI se realizo "post-mortem". La Figura 5 muestra la vision coronal del cerebro de rata sano (A) y el inyectado con la muestra de bicelas (B). Puede observarse que las bicelas libres cursaron con una drastica expansion en todo el sistema cerebro-ventricular de la rata lo que le produjo la muerte despues de la inyeccion.

En el caso de inyectar bicelas encapsuladas, se aplicaron inyecciones intracerebroventriculares (i.c.v) en ratas a fin de observar el aumento de la intensidad de la senal de gadodiamida en el CSF por administracion de muestras de liposomas de la invencion. La rata se inyecto utilizando el mismo procedimiento experimental. El animal se escaneo inmediatamente y transcurridas 4h, 8h y 24h. En contraste con la administracion de la muestra bicelar, el animal que recibio la muestra de bicelas encapsuladas o liposomas de la invencion sobrevivio. Dicha preparacion no presento ningun efecto aparentemente toxico observandose un efecto dependiente del tiempo con una hiperintensidad maxima de la senal en el CSF en el analisis realizado inmediatamente despues de la infusion de la preparacion de liposomas de la invencion y una disminucion progresiva de la senal con el tiempo. A las 24 horas la intensidad fue similar a la que se encontro en animales sanos (control) (ver Figura 6).

Teniendo en cuenta que los liposomas de la invencion tienen un mayor tamano que las bicelas en ambientes diluidos y aun asf permitieron la supervivencia de los animales, el hecho de que la inyeccion intracerebroventricular de bicelas libres resultara letal para las ratas se explica debido a los rapidos e incontrolados cambios morfologicos que experimentan estas estructuras en contacto con ambientes diluidos como es el fluido cerebroespinal. Estas repentinas transiciones morfologicas son, por tanto, la causa de que cambie la composicion en el fluido cerebroespinal y se promueva la expansion del sistema cerebroventricular.

EJEMPLO 6: Uso de los sistemas de la invencion para su uso en tratamientos antimicoticos de la mucosa oral.

La molecula nistatina fue incorporada en los sistemas de la invencion como describe el ejemplo 3. Concretamente en los sistemas que contenfan DPPC/DHPC. La composicion tambien inclufa, una mezcla de fosfolfpidos de Lipoid S-100 y colesterol al 20%. La nistatina tiene actividad antibiotica antifungica y es utilizado frecuentemente en infecciones cutaneas y mucosas originadas por la especie de hongo Candida albicans. La cantidad de nistatina incorporada en el sistema de la invencion fue del mismo orden que la presente en los productos que contienen nistatina en suspension actualmente comercializados, unos 15,75 mg/ml. Este hecho resulto ser todo un exito, ya

que los sistemas de la invencion tienen un alto contenido en agua y se conoce la dificultad de incorporar la nistatina en sistemas de estas caracterfsticas (alto contenido en agua).

Los sistemas de la invencion conteniendo nistatina fueron aplicados en mucosa oral porcina realizando experimentos in Vitro de absorcion utilizando celulas de Franz y tras un periodo de contacto con la mucosa de tres 5 horas

se determino mediante cromatograffa lfquida de alto desarrollo (HPLC) la cantidad de nistatina retenida en el tejido. Se vio que toda la nistatina aplicada (629 microgramos) estaba incorporada en el tejido, hecho muy conveniente cuando el objetivo es tratar afecciones provocadas por hongos.

Ademas, se verifico mediante microscopfa electronica de transmision que el tejido de la mucosa oral no habfa sido 10 danado significativamente por efecto del tratamiento (FIGURA 7).

Tambien se determino que la actividad microbiologica de la nistatina no quedaba afectada por el hecho de ser incorporada en los liposomas de la invencion siendo la concentracion minima inhibitoria (MIC) de 16 pg/ml

Claims (17)

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   1. Liposoma caracterizado porque comprende, en su solucion acuosa interna, al menos una bicela.
2. 2. Liposoma segun la reivindicacion 1, caracterizado porque comprende bicelas en una concentracion de entre el 5 y 25 % en peso seco con respecto al liposoma final.
3. 3. Liposoma segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque comprende lfpidos que tienen una temperatura de transicion media de entre 4 y 40 °C.
4. 4. Liposoma segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las bicelas comprenden fosfolfpidos de cadena larga en su region central y fosfolfpidos de cadena corta en las regiones de los extremos, donde las bicelas comprenden fosfolfpidos con una razon de concentraciones molares entre los fosfolfpidos de cadena larga y los de cadena corta de entre 1 y 10.
5. 5. Liposoma segun la reivindicacion 4, caracterizado porque los fosfolfpidos comprenden cadenas con una diferencia entre el numero de carbonos entre cualquier cadena larga y cualquier cadena corta de entre 5 y 25.
6. 6. Liposoma segun cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado porque el fosfolfpido de cadena larga es dimiristoil-fosfatidilcolina o dipalmitoil-fosfatidilcolina y el fosfolfpido de cadena corta es dihexanoil -fos fatidilcolina.
7. 7. Liposoma segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el liposoma tiene un diametro de entre 200 y 1000 nm y la bicela tiene una longitud de eje mayor de entre 10 y 80 nm.
8. 8. Liposoma segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque ademas comprende al menos un principio activo.
9. 9. Liposoma segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que ademas contiene un colorante y/o un pigmento para el tintado de materiales textiles.
10. 10. Composicion caracterizada porque comprende el liposoma definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. Uso del liposoma definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o de la composicion definida en la reivindicacion 10 para la elaboracion de un producto cosmetico.
12. 12. Liposoma definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composicion definida en la reivindicacion 10 para su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades de la piel, tejido nervioso o tejido ocular.
13. 13. Liposoma para su uso segun la reivindicacion 12, caracterizado porque el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administracion por via raqufdea o por vfa topica a traves de la mucosa conjuntival.
14. 14. Composicion farmaceutica caracterizada porque comprende el liposoma definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composicion segun la reivindicacion 10 junto con un excipiente farmacologicamente aceptable.
15. 15. Metodo para la obtencion del liposoma definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende:

    a. obtener un film lipfdico desecado y una dispersion acuosa de bicelas,

    b. hidratar el film lipfdico obtenido en el paso (a) con la dispersion acuosa de bicelas obtenida en el paso (a),

    c. aislar y/o purificar el producto obtenido en el paso (b).
16. 16. Metodo para la obtencion del liposoma definido en la reivindicacion 15, caracterizado porque la obtencion del film lipfdico desecado del paso (a) comprende:

    i. disolver lfpidos en un solvente organico, a concentraciones entre 5- 30mg/ml y

    ii. eliminar el solvente organico del paso anterior.
17. 17. Metodo para la obtencion del liposoma segun la reivindicacion 15 caracterizado porque la obtencion de la dispersion acuosa de bicelas del paso (a) comprende:

    i. disolver en un solvente organico fosfolfpidos de cadena larga y fosfolfpidos de cadena corta cuya razon de las concentraciones molares es de entre 1 y 10,

    ii. eliminar el solvente organico del paso anterior y rehidratar el producto obtenido con solucion acuosa hasta conseguir una concentracion de lfpidos de entre 15 y 25% peso/volumen.