ES2643902T3

ES2643902T3 - Forma sólida de un derivado de dihidro-pirido-oxazina

Info

Publication number: ES2643902T3
Application number: ES13824177.3T
Authority: ES
Inventors: Konstanze Hurth; Christoph KALIS; Karen KAMMERTOENS; Nicolas Soldermann; Frédéric ZECRI
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2017-11-27
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: HUE036665T2; LT2928896T; JP2016502531A; HRP20171573T1; MA38100A1; EA028031B1; JP6310474B2; EA201591023A1; SI2928896T1

Abstract

La forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona.

Description

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DESCRIPCION

Forma solida de un derivado de dihidro-pirido-oxazina Campo de la invencion

La invencion se refiere a una nueva forma solida de un derivado de dihidro-pirido-oxazina, a los procesos para su preparacion y su uso en composiciones farmaceuticas.

Antecedentes de la invencion

La solicitud de patente internacional PCT/IB2012/057554, publicada como WO2013/093849 divulga derivados de dihidro-benzo-oxazina y dihidro-pirido-oxazina que son adecuados para el tratamiento de un trastorno o enfermedad que este mediado por la actividad de las enzimas PI3K. El documento PCT/IB2012/057554, divulga (1,1-dioxo- hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7- iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona y metodos de fabricacion de este compuesto.

Estos compuestos son utiles para el tratamiento, ya sea solos o en combinacion con uno o mas de otros compuestos farmacologicamente activos, de las enfermedades relacionadas con PI3K, incluyendo pero no limitado a trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades alergicas, enfermedades de las vlas respiratorias, como el asma y la EPOC, rechazo de trasplantes, canceres, por ejemplo de origen hematopoyetico o tumores solidos.

Estos compuestos tambien son utiles para el tratamiento, ya sea solos o en combinacion con uno o mas de otros compuestos farmacologicamente activos, de afecciones, enfermedades o trastornos, como por ejemplo, trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades alergicas, enfermedades de las vlas respiratorias, como el asma y la EPOC, rechazo de trasplantes; produccion de anticuerpos, presentacion de antlgenos, produccion de citocinas u organogenesis linfoide anormales o indeseables, incluyendo artritis reumatoide, penfigo vulgar, purpura trombocitopenica idiopatica, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, miastenia grave, slndrome de Sjogren, anemia hemolltica autoinmune, vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, urticaria cronica autoinmune, alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), slndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplantes mediado por anticuerpos), rechazo de trasplantes hiperagudo, agudo y cronico mediado por celulas B, y canceres de origen hematopoyetico incluyendo pero no limitado a mieloma multiple; una leucemia, leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide; linfoma no Hodgkin, linfomas; policitemia vera, trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide, y enfermedad de Walden Stroem; mas adecuadamente de artritis reumatoide (RA), penfigo vulgar (PV), purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), purpura trombocitopenica trombotica (TTP), anemia hemolltica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistemico (SLE), esclerosis multiple (MS), miastenia grave (MG), slndrome de Sjogren (SS), vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, urticaria cronica autoinmune (CAU), alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), slndrome de Goodpasture, rechazo de trasplantes y canceres de origen hematopoyetico, as! como en inmunopatologla asociada a enfermedad o infeccion, por ejemplo, en la malaria severa y cerebral, tripanosomiasis, leishmaniosis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.

Sumario de la invencion

La invencion se refiere a una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6- metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona; composiciones farmaceuticas y combinaciones que incluyen esta forma. La invencion se refiere ademas esta forma, incluyendo sus composiciones farmaceuticas y combinaciones para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por la actividad de las enzimas PI3K, preferiblemente por la actividad de la isoforma PI3K5.

Es bien sabido que la forma cristalina del ingrediente farmaceutico activo (API) de un farmaco particular es a menudo un determinante importante de la facilidad de preparacion del farmaco, de su higroscopicidad, estabilidad, solubilidad, estabilidad en almacenamiento, facilidad de formulacion, tasa de disolucion en fluidos gastrointestinales y biodisponibilidad in vivo. Las formas cristalinas se producen donde la misma composicion de la materia se cristaliza en una disposition reticular diferente que resulta en diferentes propiedades termodinamicas y estabilidades especlficas a la forma cristalina particular. Las formas cristalinas tambien pueden incluir diferentes hidratos o solvatos del mismo compuesto. Para decidir que forma es preferible, las numerosas propiedades de las formas se comparan y la forma preferida se elige en base a las muchas variables de las propiedades flsicas. Es totalmente posible que una forma pueda ser preferible en algunas circunstancias en las que ciertos aspectos tales como la facilidad de preparacion, la estabilidad, etc., se consideran crlticos. En otras situaciones, una forma diferente puede ser preferible para una mayor tasa de disolucion y/o biodisponibilidad superior. Aun no es posible predecir si un compuesto particular formara polimorfos, si cualquiera de tales polimorfos seran adecuados para el uso comercial en una composicion terapeutica, o cuales polimorfos mostrarlan tales propiedades deseables.

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Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es el patron de difraccion de rayos X en polvo del Ejemplo F1, forma anhidra cristalina La Figura 2 es el grafico de calorimetrla diferencial de barrido del Ejemplo F1, forma anhidra cristalina Descripcion detallada de la invencion

En una realization, la invencion se refiere a una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-

tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-

metanona.

En otra realizacion, la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi- 5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona se caracteriza por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende los siguientes picos dados en grados 2-teta +/-0,2 grados: 9,1, 10,2, 11,9, 13,0, 17,1, 17,7, 18,7, 20,3, 20,8, 26,0, 26,7, 23,2, 24,1,24,8, 29,3, 27,4, y 21,4.

En otra realizacion, la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi- 5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona tiene un espectro de difraccion de rayos X sustancialmente igual al espectro de difraccion de rayos X de polvo mostrado en la Figura 1.

En otra realizacion, la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi- 5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona es una que tiene un grafico de calorimetrla diferencial de barrido sustancialmente el mismo que aquel mostrado en la Figura 2

A menos que se especifique lo contrario, la frase “forma de la presente invencion” se refiere a una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H- pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona.

Los terminos generales usados anteriormente en el presente documento y en lo sucesivo en el presente documento tienen preferentemente dentro del contexto de esta descripcion los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario:

La invencion puede apreciarse mas completamente por referencia a la siguiente descripcion incluyendo el siguiente glosario de terminos y los ejemplos concluyentes. Como se usan en el presente documento, las frases "que incluye", "que contiene" y "que comprende" se utilizan en el presente documento en su sentido abierto no limitativo.

Como se usa en el presente documento, la frase "vehlculo farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antimicoticos), agentes isotonicos, agentes retardantes de absorcion, sales, conservantes, estabilizadores de farmaco, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegracion, lubricantes, edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, y similares y combinaciones de los mismos, como se conocera por aquellos expertos en la materia (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en lo que respecta a cualquier vehlculo convencional incompatible con el ingrediente activo, su uso se contempla en las composiciones terapeuticas o farmaceuticas.

La frase "una cantidad terapeuticamente efectiva" de un compuesto de la presente invencion se refiere a una cantidad de el compuesto de la presente invencion que producira la respuesta biologica o medica de un sujeto, por ejemplo, reduction o inhibition de una enzima o una actividad proteica, o mejorar slntomas, aliviar afecciones, ralentizar o retrasar la progresion de la enfermedad, o prevenir una enfermedad, etc. En una realizacion no limitante, la frase “una cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a un sujeto, es efectiva para (1) al menos parcialmente aliviar, inhibir, prevenir y/o mejorar una afeccion, o un trastorno o una enfermedad (i) mediada por PI3K, o (ii) asociada a actividad de Pl3K, o (iii) caracterizada por actividad (normal o anormal) de PI3K; o (2) reducir o inhibir la actividad de PI3K; o (3) reducir o inhibir la expresion de PI3K. En otra realizacion no limitante, la frase “una cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la presente invencion que, cuando se administra a una celula, o un tejido, o un material biologico no celular, o un medio, es efectiva para al menos parcialmente reducir o inhibir la actividad de PI3K; o al menos parcialmente reducir o inhibir la expresion de PI3K. El significado del termino “una cantidad terapeuticamente efectiva” como se ilustra en la anterior realizacion para PI3K tambien aplica mediante el mismo medio a cualquier otros protelnas/peptidos/enzimas relevantes.

Como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” se refiere a un animal. Tlpicamente el animal es un mamlfero. Un sujeto tambien se refiere a por ejemplo, primates (por ejemplo, humanos, hombres o mujeres), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y similares. En ciertas realizaciones, el sujeto es un primate. En aun otras realizaciones, el sujeto es un humano.

Como se usa en el presente documento, el termino "inhibir", "inhibicion" o “que inhibe” se refiere a la reduccion o supresion de una afeccion, slntoma, o trastorno, o enfermedad dada, o una disminucion significativa en la actividad basal de una actividad o proceso biologico.

Como se usa en el presente documento, el termino “tratar”, o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se 5 refiere en una realizacion, a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, retrasar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los slntomas cllnicos de la misma). En otra realizacion “tratar” o “tratamiento” se refiere a aliviar o mejorar al menos parametro flsico incluyendo aquellos los cuales pueden ser no discernibles por el paciente. En aun otra realizacion, “tratar” o “tratamiento” se refiere a modular la enfermedad o trastorno, bien sea flsicamente, (por ejemplo, estabilizacion de un slntoma discernible), fisiologicamente, (por ejemplo, estabilizacion de 10 un parametro flsico), o ambos. En aun otra realizacion, “tratar” o “tratamiento” se refiere a prevenir o retrasar el comienzo o desarrollo o progresion de la enfermedad o trastorno.

Como se usa en el presente documento, un sujeto esta “en necesidad de” un tratamiento si tal sujeto se beneficia biologica o medicamente o mejora su calidad de vida a partir de tal tratamiento.

Todos los metodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden apropiado a menos 15 que se indique claramente lo contrario por el contexto. El uso de cualquiera y todos los Ejemplos, o terminologla de ejemplo, por ejemplo, "tal como”, proporcionada en el presente documento pretende solamente ilustrar mejor la invencion y no implica limitacion sobre el alcance de la invencion de otra manera reivindicada.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una forma de la presente invencion y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede formularse para 20 rutas particulares de administracion tales como administracion oral, administracion parenteral, y administracion rectal, etc. Ademas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden integrarse en una forma solida (incluyendo sin limitacion capsulas, comprimidos, plldoras, granulos, polvos o supositorios), o en una forma llquida (incluyendo sin limitacion soluciones, suspensiones o emulsiones). Las composiciones farmaceuticas pueden someterse a operaciones farmaceuticas convencionales tales como esterilizacion y/o pueden contener diluyentes 25 inertes convencionales, agentes lubricantes, o agentes tamponantes, as! como tambien adyuvantes, tales como conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes y tampones, etc.

Tlpicamente, las composiciones farmaceuticas son comprimidos o capsulas de gelatina que comprenden el ingrediente activo junto con

a) diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina;

30 b) lubricantes, por ejemplo, silicio, talco, acido estearico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol; para comprimidos tambien

c) aglutinantes, por ejemplo, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidon, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica y/o polivinilpirrolidona; si se desea

d) desintegrantes, por ejemplo, almidones, agar, acido alglnico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes; y/o

35 e) absorbentes, colorantes, saborizantes y edulcorantes.

Los comprimidos pueden tener revestimiento de pellcula o revestimiento enterico segun metodos conocidos en la tecnica.

Las composiciones adecuadas para administracion oral incluyen una cantidad eficaz de una forma de la presente invencion en forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleaginosas, polvos o granulos 40 dipersables, emulsion, capsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a uso oral se preparan segun cualquier metodo conocido en la tecnica para la fabrication de composiciones farmaceuticas y tales composiciones pueden contener uno o mas agentes seleccionados del grupo que consta de agentes endulzantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el objeto de proporcionar preparaciones farmaceuticamente elegantes y de sabor agradable. Los comprimidos pueden contener el ingrediente activo en 45 mezcla con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos los cuales son apropiados para la fabricacion de comprimidos. Estos excipientes son, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo, almidon de malz, o acido alglnico; agentes aglomerantes, por ejemplo, almidon, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, acido estearico o talco. Los comprimidos son revestidos o no revestidos mediante 50 tecnicas conocidas para retrasar desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal y proporcionar as! una action sostenida durante un periodo mas largo de tiempo. Por ejemplo, puede utilizarse un material retardante tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Las formulaciones para uso oral pueden presentarse como capsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo es mezclado con un diluyente solido inerte, por

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ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolina, o como capsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo es mezclado con agua o un medio de aceite, por ejemplo, aceite de coco, parafina llquida o aceite de oliva.

Ciertas composiciones inyectables son soluciones o suspensiones acuosas isotonicas, y los supositorios se preparan ventajosamente a partir de emulsiones o suspensiones grasas. Dichas composiciones pueden ser esterilizadas y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de solucion, sales para regular la presion osmotica y/o tampones. Ademas, tambien pueden contener otras sustancias terapeuticamente valiosas. Dichas composiciones se preparan segun metodos convencionales de mezclado, granulacion o revestimiento, respectivamente, y contienen aproximadamente un 0,175 %, o contienen aproximadamente un 1-50 % del ingrediente activo.

Las composiciones apropiadas para aplicacion transdermica incluyen una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invencion con un vehlculo apropiado. Los vehlculos apropiados para liberacion transdermica incluyen solvatos farmacologicamente aceptables absorbentes para asistir en el pasaje a traves de la piel del huesped. Por ejemplo, los dispositivos transdermicos estan en forma de un vendaje que comprende un miembro de soporte, un deposito que contiene el compuesto opcionalmente con vehlculos, opcionalmente una barrera controladora de velocidad para liberar el compuesto de la piel del huesped a una velocidad controlada y predeterminada durante un periodo de tiempo prolongado, y medios para asegurar el dispositivo a la piel.

Las composiciones apropiadas para aplicacion topica, por ejemplo, a la piel y ojos, incluyen soluciones acuosas, suspensiones, pomadas, cremas, geles o formulaciones pulverizables, por ejemplo, para liberacion mediante aerosol o similares. Tales sistemas de liberacion topica seran en particular apropiados para aplicacion dermica, por ejemplo, para el tratamiento de cancer de piel, por ejemplo, para uso profilactico en cremas, lociones, atomizadores para el sol y similares. Por lo tanto son particularmente apropiados para utilizar en formulaciones topicas incluyendo formulaciones cosmeticas bien conocidas en la tecnica. Tales pueden contener solubilizantes, estabilizadores, agentes mejoradores de tonicidad, tampones y conservantes.

Como se usa en el presente documento una aplicacion topica tambien se refiere a una inhalacion o a una aplicacion intranasal. Estas pueden ser convenientemente liberadas en forma de un polvo seco (bien sea solo, como una mezcla, por ejemplo una mezcla seca con lactosa, o como partlculas de componentes mixtos, por ejemplo con fosfollpidos) a partir de un inhalador de polvo seco o una presentacion de aerosol a partir de un recipiente presurizado, bomba, atomizador, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor apropiado.

La presente invencion ademas proporciona composiciones farmaceuticas anhldridas y formas de dosificacion que comprenden forma de la presente invencion como ingredientes activos, puesto que el agua puede facilitar la degradacion de ciertos compuestos.

Las composiciones farmaceuticas anhldridas y formas de dosificacion de la invencion pueden prepararse utilizando ingredientes anhidros o que contienen baja humedad y afecciones de baja humedad. Una composicion farmaceutica anhldrida puede prepararse y almacenarse tal que su naturaleza anhldrida sea mantenida. Por consiguiente, composiciones anhldridas se envasan utilizando materiales conocidos para prevenir exposition al agua tal que estas puedan incluirse en kits de formulation apropiados. Los ejemplos de envases apropiados incluyen, pero no estan limitados a aluminios hermeticamente sellados, plasticos, recipientes de dosis unitaria (por ejemplo, viales), envases de burbuja, y envases de tira.

La invencion ademas proporciona composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion que comprenden uno o mas agentes que reducen la velocidad mediante la cual el compuesto de la presente invencion como un ingrediente activo se descompondra. Tales agentes, los cuales se conocen en el presente documento como "estabilizadores,” incluyen, pero no estan limitados a, antioxidantes tales como acido ascorbico, tampones de pH, o tampones de sales, etc.

Una forma de la presente invencion puede ser util en el tratamiento de afecciones, enfermedades o trastornos, incluyendo inmunopatologla asociada a enfermedad o infection en el que una o mas de las funciones de las celulas B tales como production de anticuerpos, presentacion de antlgenos, production de citocinas u organogenesis linfoide, son anormales o son indeseables incluyendo artritis reumatoide, penfigo vulgar y enfermedades relacionadas, purpura trombocitopenica idiopatica, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, miastenia grave, slndrome de Sjogren, anemia hemolltica autoinmune, vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, urticaria cronica autoinmune, alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), slndrome de Goodpasture, AMR (rechazo de trasplantes mediado por anticuerpos), rechazo de trasplantes hiperagudo, agudo y cronico mediado por celulas B y canceres de origen hematopoyetico incluyendo pero no limitado a mieloma multiple; leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide cronica; leucemia linfocltica, leucemia mieloide, linfoma no Hodgkin, linfomas, policitemia vera, trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide, y enfermedad de Walden Stroem.

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La invencion incluye tratar afecciones, enfermedades o trastornos en los que una o mas de las funciones de los neutrofilos, tales como la liberacion de superoxido, exocitosis estimulada, migracion quimiotactica son anormales o no son deseables incluyendo artritis reumatoide, sepsis, trastornos pulmonares o respiratorios, tales como asma, dermatosis inflamatorias tales como psoriasis, as! como en inmunopatologla asociada a enfermedad o infeccion y otros.

La invencion incluye metodos para el tratamiento de afecciones, enfermedades o trastornos en los que una o mas de las funciones de las celulas de basofilos y mastocitos, tales como la migracion quimiotactica o desgranulacion de alergenos mediada por IgE son anormales o no son deseables incluyendo enfermedades alergicas (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), as! como otros trastornos tales como EPOC, asma o enfisema.

La invencion incluye tratar afecciones, enfermedades o trastornos en los que una o mas de las funciones de las celulas T, tales como la produccion de citocinas o la citotoxicidad mediada por celulas son anormales o indeseables incluyendo la artritis reumatoide, esclerosis multiple, rechazo agudo o cronico de tejido celular o injertos de organos o canceres de origen hematopoyetico, as! como en inmunopatologla asociada a enfermedad o infeccion.

Ademas, la invencion incluye tratar enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y agregacion plaquetaria.

Ademas, la invencion incluye metodos para tratar enfermedades de la piel tales como la porfiria cutanea tarda, erupcion polimorfa lumlnica, dermatomiositis, urticaria solar, liquen plano oral, paniculitis, esclerodermia, vasculitis urticaria.

Ademas, la invencion incluye tratar enfermedades inflamatorias cronicas tales como sarcoidosis, granuloma anular.

En otras realizaciones, la afeccion o trastorno (por ejemplo, mediada por PI3K) se selecciona del grupo que consta de: policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, asma, EPOC, ARDS, slndrome de Loffler, neumonla eosinofllica, infestacion parasitaria (en particular metazoos) (incluyendo eosinofilia tropical), aspergilosis broncopulmonar, poliarteritis nodosa (incluyendo slndrome de Churg-Strauss), granuloma eosinofllico, trastornos relacionados con eosinofilos que afectan las vlas respiratorias ocasionados por reaccion a farmacos, psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atopica, alopecia areata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, esclerodermia, vitiligo, vasculitis debida a hipersensibilidad, urticaria, penfigoide ampolloso, lupus eritematoso, penfigo, epidermolisis bullosa adquirida, trastornos autoinmunes hematologicos (por ejemplo, anemia hemolitica, anemia aplasica, anemia pura de los globulos rojos y trombocitopenia idiopatica), lupus eritematoso sistemico, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis cronica activa, miastenia gravis, sindrome de Steven-Johnson, psilosis idiopatica, enfermedad autoinmune inflamatoria del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatia endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, alveolitis, neumonitis cronica por hipersensibilidad, esclerosis multiple, cirrosis biliar primaria, uveitis (anterior y posterior), fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriatica, glomerulonefritis, enfermedades cardiovasculares, arteriosclerosis, hipertension, trombosis venosa profunda, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, angina inestable, tromboembolismo, embolia pulmonar, enfermedades tromboliticas, isquemia arterial aguda, oclusiones tromboticas perifericas, y la enfermedad arterial coronaria, lesiones por reperfusion, retinopatia, tales como retinopatia diabetica o retinopatia hiperbarica inducida por oxigeno, y enfermedades caracterizadas por la presion intraocular elevada o secrecion del humor acuoso ocular, tal como glaucoma.

En otra realizacion, una forma de la presente invencion es util en el tratamiento, prevencion, o mejora de la enfermedad autoinmune y de estados inflamatorios, en particular estados inflamatorios con una etiologla que incluye un componente autoinmune tal como artritis (por ejemplo artritis reumatoide, artritis cronica progresiva y artritis deformante) y enfermedades reumaticas, incluyendo afecciones inflamatorias y enfermedades reumaticas que involucran perdida osea, dolor inflamatorio, espondiloartropatias incluyendo espondilitis anquilosante, slndrome de Reiter, artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis y enterofatica, hipersensibilidad (incluyendo tanto la hipersensibilidad de las vlas respiratorias como hipersensibilidad dermica) y alergias. Enfermedades autoinmunes especificas para las que pueden emplearse formas de la invencion incluyen trastornos hematologicos autoinmunes (incluyendo por ejemplo anemia hemolitica, anemia aplastica, anemia pura de los globulos rojos y trombocitopenia idiopatica), hemofilia A adquirida, enfermedad de aglutinina fria, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, sindrome de Sjogren, lupus eritematoso sistemico, trastornos musculares inflamatorios, policondritis, esclerodoma, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmicos anti-neutrofilos, neuropatla mediada por IgM, slndrome de mioclonla opsoclono, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa cronica, miastenia grave, psoriasis, slndrome de Steven-Johnson, penfigo vulgar, penfigo foliacius, diarrea grasa idiopatica, enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino (incluyendo por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y sindrome de intestino irritable), oftalmopatia endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis multiple, neuromielitis optica, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), uveitis (anterior, intermedia y posterior, as! como panuveltis), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriatica y glomerulonefritis (con y sin slndrome nefrotico, por ejemplo, incluyendo slndrome nefrotico idiopatico o nefropatla de cambio mlnimo), tumores, enfermedad inflamatoria de la piel y la cornea, miositis, aflojamiento de implantes oseos, trastornos metabolicos, tales como aterosclerosis, diabetes, y dislipidemia.

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En otra realizacion, una forma de la presente invencion es util en el tratamiento de afecciones o trastornos seleccionados del grupo que consiste en, linfoma primario cutaneo de celulas B, enfermedad inmunobullosa, penfigo vulgar, penfigo foliaceo, forma endemica de penfigo brasileno (Fogo selvagem), penfigo paraneoplasico, penfigoide ampolloso, penfigoide de la membrana mucosa, epidermolisis ampollosa adquirida, enfermedad cronica de injerto contra huesped, dermatomiositis, lupus eritematoso sistemico, vasculitis, vasculitis de pequenos vasos, vasculitis urticarial hipocomplementemica, vasculitis debida a anticuerpos anticitoplasma de neutrofilos, crioglobulinemia, slndrome de Schnitzler, macroglobulinemia de Waldenstrom, angioedema, vitiligo, lupus eritematoso sistemico, lpurpura trombocitopenica idiopatica, esclerosis multiple, enfermedad por crioaglutininas, anemia hemolltica autoinmune, vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrofilos, enfermedad de injerto contra huesped, crioglobulinemia y trombocitopenica trombotica.

Asl, como una realizacion adicional, la presente invencion proporciona el uso de una forma cristalina anhidra de (1,1- dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4- b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona en terapia. En una realizacion adicional, la terapia se selecciona de una enfermedad que puede ser tratada por la inhibicion de PI3K. En otra realizacion, la enfermedad se selecciona de la lista anteriormente mencionada, adecuadamente de trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades alergicas, enfermedades de las vlas respiratorias, tales como asma y EPOC, rechazo de trasplantes, produccion de anticuerpos, presentacion de antlgenos, produccion de citocinas u organogenesis linfoide son anormal o son indeseables incluyendo la artritis reumatoide, penfigo vulgar, purpura trombocitopenica idiopatica lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, miastenia grave, slndrome de Sjogren, anemia hemolltica autoinmune, vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, urticaria cronica autoinmune, alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), sindrome de Goodpasture, AMR (rechazo del trasplantes mediado por anticuerpos), rechazo de trasplantes hiperagudo, agudo y cronico mediado por celulas B y canceres de origen hematopoyetico incluyendo pero no limitados a mieloma multiple; una leucemia; leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide; linfoma no Hodgkin; linfomas; policitemia vera, trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide, y enfermedad Stroem Walden; mas adecuadamente entre artritis reumatoide (RA), penfigo vulgar (PV), purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), purpura trombocitopenica trombotica (TTP), anemia hemolltica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistemico (SLE), esclerosis multiple (MS), miastenia grave (MG), sindrome de Sjogren (SS), vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, urticaria cronica autoinmune (CAU), alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica ), sindrome de Goodpasture, rechazo de trasplantes y canceres de origen hematopoyetico, asl como en inmunopatologla asociada a enfermedad o infeccion, por ejemplo, en malaria severa y cerebral, tripanosomiasis, leishmaniosis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.

En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo de tratar una enfermedad que es tratada por la inhibicion de PI3K que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente aceptable de una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4- b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona. En otra realizacion, la enfermedad se selecciona de la lista anteriormente mencionada, adecuadamente de trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades alergicas, enfermedades de las vlas respiratorias, tales como asma y EPOC, rechazo de trasplantes, produccion de anticuerpos, presentacion de antigenos, produccion de citocinas u organogenesis linfoide son anormal o son indeseables incluyendo la artritis reumatoide, penfigo vulgar, purpura trombocitopenica idiopatica lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, miastenia grave, sindrome de Sjogren, anemia hemolltica autoinmune, vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, urticaria cronica autoinmune, alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), sindrome de Goodpasture, AMR (rechazo del trasplantes mediado por anticuerpos), rechazo de trasplantes hiperagudo, agudo y cronico mediado por celulas B y canceres de origen hematopoyetico incluyendo pero no limitados a mieloma multiple; una leucemia; leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide; linfoma no Hodgkin; linfomas; policitemia vera, trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide, y enfermedad Stroem Walden; mas adecuadamente entre artritis reumatoide (RA), penfigo vulgar (PV), purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), purpura trombocitopenica trombotica (TTP), anemia hemolltica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistemico (SLE), esclerosis multiple (MS), miastenia grave (MG), slndrome de Sjogren (SS), vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, urticaria cronica autoinmune (CAU), alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), sindrome de Goodpasture, rechazo de trasplantes y canceres de origen hematopoyetico, asi como en inmunopatologia asociada a enfermedad o infeccion, por ejemplo, en malaria severa y cerebral, tripanosomiasis, leishmaniosis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.

Asi, como una realizacion adicional, la presente invencion proporciona el uso de una forma cristalina anhidra de (1,1- dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4- b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona para la fabricacion de un medicamento. En una realizacion adicional, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad que puede ser tratada por la inhibicion de PI3K. En otra realizacion, la enfermedad se selecciona de la lista anteriormente mencionada, adecuadamente de trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades alergicas, enfermedades de las vlas respiratorias, tales como asma y EPOC, rechazo de trasplantes, produccion de anticuerpos, presentacion de antlgenos, produccion de citocinas u organogenesis linfoide son anormal o son indeseables incluyendo la artritis reumatoide, penfigo vulgar, purpura trombocitopenica idiopatica lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, miastenia grave, sindrome de

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Sjogren, anemia hemolltica autoinmune, vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, urticaria cronica autoinmune, alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), slndrome de Goodpasture, AMR (rechazo del trasplantes mediado por anticuerpos), rechazo de trasplantes hiperagudo, agudo y cronico mediado por celulas B y canceres de origen hematopoyetico incluyendo pero no limitados a mieloma multiple; una leucemia; leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide; linfoma no Hodgkin; linfomas; policitemia vera, trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide, y enfermedad Stroem Walden; mas adecuadamente entre artritis reumatoide (RA), penfigo vulgar (PV), purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), purpura trombocitopenica trombotica (TTP), anemia hemolltica autoinmune (AIHA), hemofilia adquirida tipo A (AHA), lupus eritematoso sistemico (SLE), esclerosis multiple (MS), miastenia grave (MS), slndrome de Sjogren (SS), vasculitis asociadas a ANCA, crioglobulinemia, urticaria cronica autoinmune (CAU), alergia (dermatitis atopica, dermatitis de contacto, rinitis alergica), slndrome de Goodpasture, rechazo de trasplantes y canceres de origen hematopoyetico, as! como en inmunopatologla asociada a enfermedad o infeccion, por ejemplo, en malaria severa y cerebral, tripanosomiasis, leishmaniosis, toxoplasmosis y neurocisticercosis.

La composicion farmaceutica o combination de la presente invention puede ser en dosificacion unitaria de 1-1000 mg aproximadamente de ingrediente o ingredientes activos para un sujeto de 50-70 kg aproximadamente, o 1-500 mg aproximadamente o 1-250 mg aproximadamente o 1-150 mg aproximadamente o 0,5-100 mg aproximadamente, o 1-50 mg aproximadamente de ingredientes activos. La dosificacion terapeuticamente efectiva de un compuesto, la composicion farmaceutica, o las combinaciones de los mismos, es dependiente de la especie del sujeto, el peso corporal, edad y afeccion individual, el trastorno o enfermedad o la severidad de la misma. Un medico, medico cllnico o veterinario con experiencia comun puede facilmente determinar la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos necesarios para prevenir, tratar o inhibir el progreso del trastorno o enfermedad.

Las propiedades de dosificacion antes citadas son demostrables en pruebas in vitro e in vivo utilizando de manera ventajosa mamlferos, por ejemplo, ratones, ratas, perros, monos u organos aislados, tejidos y preparaciones de los mismos. Una forma de la presente invencion puede aplicarse in vitro en forma de soluciones, por ejemplo, soluciones acuosas, e in vivo bien sea de manera enterica, parenteral, de manera ventajosa, intravenosamente, por ejemplo, como una suspension o en solution acuosa. La dosificacion in vitro puede estar en el rango entre concentraciones 10'3 molar y 10'9 molar aproximadamente. Una cantidad terapeuticamente efectiva in vivo puede estar en el rango dependiendo de la ruta de administration, entre 0,1-500 mg/kg aproximadamente, o entre 1-100 mg/kg aproximadamente.

Una forma de la presente invencion puede administrarse bien sea simultaneamente con, o antes de o despues de, uno o mas agentes terapeuticos. Una forma de la presente invencion puede administrarse de manera separada, mediante la misma o diferente ruta de administracion, o juntos en la misma composicion farmaceutica como los otros agentes.

En una realization, la invencion proporciona un producto que comprende una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo- hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7- iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona y al menos otro agente terapeutico como una preparation combinada para uso simultaneo, separado o secuencial en terapia. En una realizacion, la terapia es el tratamiento de una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las enzimas PI3K. Los productos proporcionados como una preparacion combinada incluyen una composicion que comprende una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1- lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin- 1-il}-metanona y los otros agentes terapeuticos juntos en la misma composicion farmaceutica, o una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-

pirido[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona y los otros agentes terapeuticos en forma separada, por ejemplo, en forma de un kit.

En una realizacion, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-

pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona y otros agente o agentes terapeuticos. Opcionalmente, la composicion farmaceutica puede comprender un excipiente farmaceuticamente aceptable, como se describio anteriormente.

En una realizacion, la invencion proporciona un kit que comprende dos o mas composiciones farmaceuticas separadas, al menos una de las cuales contiene una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*- tiopi ran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pi rido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}- metanona. En una realizacion, el kit comprende medios para retener de manera separada dichas composiciones, tales como un recipiente, botella dividida, o envase dividido en aluminio. Un ejemplo de tal kit es un envase de burbujas, como el que tlpicamente se utiliza para envasar comprimidos, capsulas y similares.

El kit de la presente invencion puede utilizarse para administrar diferentes formas de dosificacion, por ejemplo, oral y parenteral, para administrar las composiciones separadas a diferentes intervalos de dosificacion, o para titular las composiciones separadas entre si. Para ayudar en el cumplimiento terapeutico, el kit de la presente invencion tlpicamente comprende pautas para administracion. En las terapias de combinacion de la invencion, la forma de la

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invencion y el otro agente terapeutico pueden fabricarse y/o formularse por los mismos o diferentes fabricantes. Ademas, la forma de la invencion y el otro terapeutico seran llevados juntos en una terapia de combinacion: (i) antes de entregar el producto de combinacion a los medicos (por ejemplo en el caso de un kit que comprende la forma de la invencion y el otro agente terapeutico); (ii) por los medicos mismos (o bajo la pauta del medico) poco antes de administracion; (iii) en los pacientes mismos, por ejemplo durante administration secuencial de la forma de la invencion y el otro agente terapeutico.

La invencion tambien proporciona el uso de una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*- tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}- metanona para utilizar como un producto farmaceutico.

Por consiguiente, la invencion proporciona el uso de una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1- lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]- pirrolidin-1-il}-metanona para tratar una enfermedad. La invencion tambien proporciona el uso de una forma cristalina anhidro de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H- pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las enzimas PI3K, en donde el medicamento se prepara para administracion con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona el uso de otro agente terapeutico para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K, en donde el medicamento se administra con una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3- dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]-oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona.

La invencion tambien proporciona una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)- {(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona para uso en un metodo de tratamiento. La invencion tambien proporciona una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo- hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7- iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona para uso en un metodo para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K, en donde la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3- [1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona se prepara para la administracion con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona otro agente terapeutico para uso en un metodo para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K, en donde el otro agente terapeutico se prepara para la administracion con una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro- 1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-pi ridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]- pirrolidin-1-il}-metanona. La invencion tambien proporciona una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1- lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin- 1-il}-metanona para uso en un metodo para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K en donde la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6- metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona se administra con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona otro agente terapeutico para uso en un metodo para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K en donde el otro agente terapeutico se administra con una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5- metil-pi ridin-3-il)-2,3-di hidro-1 H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pi rrolidin-1-il}-metanona.

La invencion tambien proporciona el uso de una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*- tiopi ran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pi rido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}- metanona para tratar una enfermedad. La invencion tambien proporciona el uso de una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopi ran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-pi ridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pi rido[3,4-

b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de 24 horas) con otro agente terapeutico. La invencion tambien proporciona el uso de otro agente terapeutico para tratar una enfermedad o afeccion mediada por la actividad de las Enzimas PI3K, en donde el paciente ha sido tratado previamente (por ejemplo, dentro de 24 horas) con una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)- 3-[1-(6-metoxi-5-metil-pi ridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona.

La forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)- 2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona se puede administrar como el ingrediente activo adicional o en conjunto con, por ejemplo como un adyuvante de, otros farmacos por ejemplo agentes inmunosupresivos o inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo para el tratamiento y la prevention de rechazo agudo o cronico de alo-o xenoinjertos o transtornos inflamatorios o autoinmunes, o un agente quimioterapeutico, por ejemplo un agente antiproliferativo celular maligno. Por ejemplo, la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopi ran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-pi ridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pi rido[3,4- b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona se puede utilizar en combinacion con un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK 506; un inhibidor de mTOR, por ejemplo rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573, TAFA-93, biolimus-7 o biolimus-9; una ascomicina que tiene propiedades inmunosupresoras, por ejemplo ABT-281, ASM981, etc.; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato;

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leflunomida; mizoribina; acido o sal micofenolico; mofetil de micofenolato; 15-deoxispergualina o un homologo inmunosupresivo, analogo o derivado del mismo; un inhibidor de PKC, por ejemplo como se divulga en WO 02/38561 o WO 03/82859, por ejemplo el compuesto del Ejemplo 56 o 70; un inhibidor de quinasa JAK3, por ejemplo N-bencil-3,4-dihidroxi-benciliden-cianoacetamida a-ciano-(3,4-dihidroxi)]N-bencilcinamamida (Tirfostin AG 490), prodigiosin 25-C (PNU156804), [4-(4'-hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina] (WHI-P131), [4-(3'-bromo-4'- hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina] (WHI-P154), [4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-

dimetoxiquinazolina] WHI-P97, KrX-21 1, 3-{(3R,4R)-4-metil-3-[metil-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-amino]-piperidin- 1-il}-3-oxo-propionitrilo, en forma libre o una forma de sal farmaceuticamente aceptable, por ejemplo mono-citrato (tambien llamado CP-690,550), o un compuesto como se divulga en WO 04/052359 o wO 05/066156; anticuerpos monoclonales inmunosupresivos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo una molecula de union recombinante que tiene al menos una porcion del domino extracelular de CTLA4 o un mutante del mismo, por ejemplo un porcion al menos extracelular de CTLA4 o un mutante del mismo unido a secuencia proteica no-CTLA4, por ejemplo CTLA4Ig (por ejemplo ATCC designada 68629) o un mutante del mismo, por ejemplo LEA29Y; inhibidores moleculares de adhesion, por ejemplo LFA-1 antagonistas, ICAM-1 o-3 antagonistas, VCAM-4 antagonistas o VLA-4 antagonistas; o antihistaminas; o antitusivos, o un agente broncodilatorio; o un bloqueador de receptor de angiotensina; o un agente antiinfeccioso.

Donde la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil- piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona se administra en conjunto con otra terapia inmunosupresiva/inmunomodulatoria, antiinflamatoria, quimioterapeutica o anti-infecciosa, la dosis del inmunosupresor, inmunomodulatorio, antiinflamatorio, quimioterapeutico o compuesto antiinfeccioso coadministrado variara desde luego dependiendo del tipo de cofarmaco empleado, por ejemplo si es un esteroide o un inhibidor de calcineurina, en el farmaco especifico empleado, en la afeccion tratada y as! sucesivamente.

Una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona tambien puede utilizarse en combination con otros agentes terapeuticos, especialmente otros agentes antiproliferativos. Tales agentes antiproliferativos incluyen pero no se limitan a inhibidores de aromatasa, antiestrogenos, inhibidores de la toposiomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, agentes activos de microtubulos, agentes alquilantes, inhibidores de la histona deacetilasa, compuestos que inducen procesos de diferenciacion celular, inhibidores de la ciclooxigenasa, inhibidores MMP, inhibidores mTOR, antimetabolitos antineoplasicos, compuestos de platino, compuestos que direccionan/disminuyen una actividad de la quinasa proteica o lipldica y compuestos antiangiogenicos adicionales, compuestos los cuales direccionan, disminuyen o inhiben la actividad de una fosfatasa proteica o lipldica, agonistas de gonadorelina, antiandrogenos, inhibidores de la metionina aminopeptidasa, bisfosfonatos, modificadores de respuesta biologica, anticuerpos antiproliferativos, inhibidores de heparanasa, inhibidores de isoformas oncogenicas Ras, inhibidores de telomerasa, inhibidores de la proteasoma, agentes utilizados en el tratamiento de malignidades hematologicas, compuestos que direccionan, disminuyen o inhiben la actividad de Flt-3, inhibidores de Hsp90, temozolomida (TEMODAL®) y leucovorina.

La frase "inhibidor de la aromatasa" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que inhibe la production de estrogenos, es decir, la conversion de los sustratos androstenediona y testosterona a estrona y estradiol, respectivamente. El termino incluye, pero no se limita a esteroides, especialmente atamestano, exemestano y formestano y, en particular, no esteroides, especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, ketoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol y letrozol. El exemestano se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial AROMASIN. El formestano se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial LENTARON. El fadrozol se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial AFEMA. El anastrozol se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial ARIMIDEX. El letrozol se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca registrada FEMARA o FEMAR. La aminoglutetimida se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial ORIMETEN. Una combinacion de la invention que comprende un agente quimioterapeutico que es un inhibidor de la aromatasa es particularmente util para el tratamiento de tumores con receptores hormonales positivos, por ejemplo, tumores de mama.

El termino "antiestrogeno" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que antagoniza el efecto de los estrogenos en el nivel de receptor de estrogeno. El termino incluye, pero no se limita a tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno y clorhidrato de raloxifeno. El tamoxifeno puede ser administrado, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial NOLVADEX. El clorhidrato de raloxifeno se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial EVISTA. El fulvestrant se puede formular como se describe en la patente de EE.UU. 4.659.516 o se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial FASLODEX. Una combinacion de la invencion que comprende un agente quimioterapeutico que es un antiestrogeno es particularmente util para el tratamiento de tumores con receptores de estrogenos positivos, por ejemplo, tumores de mama.

El termino "antiandrogeno" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sustancia que es capaz de inhibir los efectos biologicos de las hormonas androgenicas e incluye, pero no se limita a, bicalutamida (CASODEX), que se puede formular, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 4.636.505.

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El termino "agonista de gonadorelina" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a abarelix, goserelina y acetato de goserelina. La goserelina se describe en la patente de EE.UU. 4.100.274 y se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial ZOLADEx. Abarelix se puede formular, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 5.843.901. La frase "inhibidor de la topoisomerasa I" tal como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a topotecan, gimatecan, irinotecan, camptotecina y sus analogos, 9-nitrocamptotecina y el conjugado de camptotecina macromolecular PNU- 166148 (compuesto A1 en el documento W099/17804). El irinotecan puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial CAMPT0SAR. El topotecan puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial HYCAMTIN.

La frase "inhibidor de la topoisomerasa ll" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a las antraciclinas tales como doxorrubicina (incluyendo formulacion liposomica, por ejemplo CAELYX), daunorubicina, epirubicina, idarubicina y nemorubicina, las antraquinonas mitoxantrona y losoxantrona, y las podofilotoxinas etoposido y teniposido. El etoposido puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial ET0P0PH0S. El teniposido puede ser administrado, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca VM 26-bRIST0L. La doxorubicina puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial ADRIBLASTiN o ADRIAMYCIN. La epirubicina se puede administrar, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial FARM0RUBICIN. La idarubicina puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo marca comercial ZAVEDOS. La mitoxantrona se puede administrar, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial N0VANTR0N.

La frase "agente activo sobre microtubulos" se refiere a agentes estabilizantes de microtubulos, desestabilizadores de microtubulos e inhibidores de polimerizacion de microtubulos que incluyen, pero no se limitan a taxanos, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel, alcaloides de la vinca, por ejemplo, vinblastina, especialmente sulfato de vinblastina, vincristina especialmente sulfato de vincristina y vinorelbina, discodermolidas, colchicina y epotilonas y sus derivados, por ejemplo, epotilona B o D o derivados de los mismos. El paclitaxel puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo TAX0L. El docetaxel se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial TAX0TERE. El sulfato de vinblastina puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial VINBLASTIN R.P. El sulfato de vincristina puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial FARMISTIN. La discodermolida puede obtenerse, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 5.010.099. Tambien se incluyen los derivados de epotilona que se divulgan en los documentos WO 98/10121, la patente de EE.UU. 6.194.181, WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 y WO 00/31247. Son especialmente preferidos Epotilona A y/o B.

La frase "compuesto alquilante" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan o nitrosourea (BCNU o Gliadel). La ciclofosfamida se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial CICL0STIN. La ifosfamida se puede administrar, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial H0L0XAN.

La frase "inhibidores de histona desacetilasa" o "inhibidores de HDAC" se refiere a compuestos que inhiben la histona desacetilasa y que poseen actividad antiproliferativa. Esto incluye compuestos descritos en el documento WO 02/22577, especialmente N-hidroxi-3-[4-[[(2-hidroxietil)[2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2£-2-propenamida, N-hidroxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2£-2-propenamida y sales farmaceuticamente

aceptables de los mismos. Ademas, incluye especialmente acido suberoilanilida hidroxamico (SAHA).

La frase "antimetabolito antineoplasico" incluye, pero no se limita a, 5-Fluorouracilo o 5-FU, capecitabina, gemcitabina, agentes desmetilantes de ADN, tales como 5-azacitidina y decitabina, metotrexato y edatrexato, y antagonistas del acido folico tales como pemetrexed. La capecitabina puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca registrada XEL0DA. La gemcitabina puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial GEMZAR. Tambien se incluye el anticuerpo monoclonal trastuzumab que puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial HERCEPTIN.

La frase "compuesto de platino" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, carboplatino, cis-platino, cisplatino y oxaliplatino. El carboplatino puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial CARBoPLAT. El oxaliplatino puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial EL0XATIN. La frase “compuestos que actuan sobre/disminuyen una actividad proteica o de quinasa lipldica; o una actividad proteica o de fosfatasa lipldica; o “compuestos anti-angiogenicos adicionales” como se usan en el presente documento incluye, pero no se limita a inhibidores de la protelna tirosina quinasa y/o serina y/o treonina quinasa o inhibidores de la quinasa lipldica, por ejemplo,

a) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores de factor de crecimiento derivados a partir de plaquetas (PDGFR), tal como compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de PDGFR, especialmente compuestos que inhiben el receptor de PDGF, por ejemplo, un derivado de N-fenil-2- pirimidina-amina, por ejemplo imatinib, SU101, SU6668 y GFB-111;

b) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR);

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c) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad del receptor I del factor de crecimiento tipo insulina (IGF-IR), tales como los compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de IGF-IR, especialmente compuestos que inhiben el receptor de IGF-IR, tales como los compuestos dados a conocer en el documento WO 02/092599;

d) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de la familia tirosina quinasa del receptor Trk;

e) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de la familia receptor Axl de la tirosina quinasa;

f) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad del receptor de c-Met;

g) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad del receptor de tirosina quinasa Kit/SCFR, por ejemplo, imatinib;

h) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores de tirosina quinasa C-kit-(parte de la familia PDGFR), tales como compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la familia de receptores de la tirosina quinasa c-Kit, especialmente compuestos que inhiben el receptor c-Kit, por ejemplo, imatinib;

i) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de miembros de la familia c-Abl, sus productos de fusion genica, por ejemplo, BCR-Abl quinasa, tales como compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de miembros de la familia c-AbI y sus productos de fusion genica, por ejemplo, un derivado de N-fenil-2- pirimidina-amina, por ejemplo imatinib, PD180970, AG957, NSC 680410 o PD173955 de ParkeDavis;

j) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de miembros de la protelna quinasa C (PKC) y la familia Raf de serina/treonina quinasas, los miembros de la MEK, SRC, JAK, FAK, PDK y miembros de la familia Ras/MAPK, o la familia de quinasas PI(3), o la familia de quinasas relacionadas con quinasa PI(3) y/o miembros de la familia de quinasas dependientes de ciclina (CDK) y son especialmente aquellos derivados de estaurosporina descritos en EE.UU. 5,093,330, por ejemplo, midostaurina; ejemplos de otros compuestos incluyen por ejemplo, UCN-01, safingol, BAY 43-9006, briostatina 1, Perifosina; Ilmofosina; RO 318220 y rO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531/LY379196; compuestos de isoquinolina tales como los descritos en el documento WO 00/09495; FTIs; PD184352 (un inhibidor de PI3K);

k) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de los inhibidores de la protelna tirosina quinasa, tales como los compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de los inhibidores de la protelna tirosina quinasa incluyen mesilato de imatinib (Gleevec) o tirfostina. Una tirfostina es preferentemente un compuesto de bajo peso molecular (Mr <1500), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, especialmente un compuesto seleccionado de la clase de compuestos bencilidenomalonitrilo o las clases S-arilbencenomalonitrilo o bisubstrato quinolina, mas especialmente cualquier compuesto seleccionado del grupo que consta de Tirfostin A23/RG-50810; Ag 99; Tirfostin AG 213; Tirfostin AG 1748; Tirfostin AG 490; Tirfostin B44; Tirfostin B44 enantiomero (+); Tirfostin AG 555, AG 494; Tirfostin AG 556, AG957 y ester adamantilo del acido adafostina (4-{[(2,5-dihidroxifenil) metil] amino}-benzoico; NSC 680410, adafostina); y

l) compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de la familia de receptores del factor de crecimiento epidermico de tirosina quinasa (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo-o heterodlmeros) y sus mutantes, tales como compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la familia de receptores del factor de crecimiento epidermico, son especialmente compuestos, protelnas o anticuerpos que inhiben los miembros de la familia del receptor EGF de la tirosina quinasa, por ejemplo, el receptor EGF, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 o se unen a EGF o ligandos relacionados con EGF, y son en particular aquellos compuestos, protelnas o anticuerpos monoclonales generica y especlficamente divulgados en el documento WO 97/02266, por ejemplo, el compuesto del ejemplo 39, o en los documentos EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, EE.UU. 5,747,498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 y, especialmente, WO 96/30347 (por ejemplo el compuesto conocido como CP 358774), WO 96/33980 (por ejemplo el compuesto ZD 1839) y WO 95/03283 (por ejemplo compuesto ZM105180); por ejemplo, trastuzumab (HERCEPTiN), Cetuximab, Iressa, Tarceva, OSI-774, IC-1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 o E7.6.3, y

derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina que se describen en el documento WO 03/01354. Los compuestos antiangiogenicos adicionales incluyen compuestos que tienen otro mecanismo para su actividad, por ejemplo, no relacionados con inhibicion de la quinasa proteica o lipldica por ejemplo, talidomina (THALOMID) y TNP-470.

Los compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de una protelna fosfatasa lipldica son por ejemplo inhibidores de la fosfatasa 1, fosfatasa 2A, PTEN o CDC25, por ejemplo, acido okadaico o un derivado del mismo.

Los compuestos que inducen procesos de diferenciacion celular son por ejemplo acido retinoico, a-g-o 8-tocoferol o a-g-o 8-tocotrienol. El termino inhibidor de la ciclooxigenasa como se usa en el presente documento incluye, pero no

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esta limitado a, por ejemplo, inhibidores de la Cox-2, acido 2-arilaminofenilacetico 5-alquilo-sustituido y derivados, tales como celecoxib (CELEBREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib o un acido 5-alquil-2- arilaminofenilacetico, por ejemplo, acido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoroanilino)fenil-acetico o lumiracoxib. La frase "bisfosfonatos", como se usa en el presente documento incluye, pero no esta limitado a, acido etridonico, clodronico, tiludronico, pamidronico, alendronico, ibandronico, risedronico y acido zoledronico. El "acido etridonico" puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial DIDRONEL. El "acido clodronico" puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca BONEFOS. El "acido tiludronico" puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial SKELID. El "acido pamidronico" puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial AREDIA™. El "acido alendronico" puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial FOSAMAX. El "acido ibandronico" puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial BONDRANAT. El "acido risedronico" puede administrarse, por ejemplo, en forma como se comercializa, por ejemplo, bajo la marca comercial ACTONEL. El "acido zoledronico" puede administrarse, por ejemplo en forma como se comercializa, por ejemplo bajo la marca comercial ZOMETA.

La frase "inhibidores de mTOR" se refiere a compuestos que inhiben el objetivo mamlfero de la rapamicina (mTOR) y que poseen actividad antiproliferativa tal como sirolimus (Rapamune®), everolimus (Certican™), CCI-779 y ABT578.

La frase "inhibidor de la heparanasa" como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la degradacion de sulfato de heparina. El termino incluye, pero no esta limitado a, PI-88.

La frase "modificador de la respuesta biologica" como se usa en el presente documento se refiere a una linfocina o interferonas, por ejemplo, interferon g.

La frase "inhibidor de las isoformas oncogenicas Ras", por ejemplo, H-Ras, K-Ras, o N-Ras, como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad oncogenica de Ras por ejemplo, un "inhibidor de la farnesil transferasa", por ejemplo, L-744.832, DK8G557 o R115777 (Zarnestra).

La frase "inhibidor de la telomerasa" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la telomerasa. Los compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la telomerasa son especialmente compuestos que inhiben el receptor de telomerasa, por ejemplo, telomestatina.

La frase "inhibidor de la metionina aminopeptidasa " como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la metionina aminopeptidasa. Los compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la metionina aminopeptidasa son por ejemplo, bengamida o un derivado de la misma.

La frase "inhibidor de proteasoma" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad del proteasoma. Los compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de la proteasoma incluyen por ejemplo, PS-341 y MLN 341.

La frase "inhibidor de metaloproteinasa de la matriz" o “inhibidor MMP” como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a inhibidores peptidomimeticos y no peptidomimeticos de colageno, derivados de la tetraciclina, por ejemplo, el inhibidor peptidomimetico de hidroxamato, batimastat y su analogo oralmente biodisponible, marimastat (BB-2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC 683551) BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211, MMI270B o AAJ996.

La frase "agentes utilizados en el tratamiento de neoplasias hematologicas" como se usa en el presente documento incluye, pero no esta limitado a, inhibidores de la tirosina quinasa tipo FMS por ejemplo, compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de los receptores de la tirosina quinasa tipo FMS (Flt-3R); interferon, 1-b-D- arabinofuransilcitosina (ara-c) y bisulfan; e inhibidores de ALK por ejemplo compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la quinasa del linfoma anaplasico. Los compuestos que actuan sobre, reducen o inhiben la actividad de receptores de la tirosina quinasa tipo FMS (Flt-3R) son especialmente compuestos, protelnas o anticuerpos que inhiben los miembros de la familia del receptor Flt-3R quinasa, por ejemplo, PKC412, midostaurina, un derivado de estaurosporina, SU11248 y MLN518.

La frase "inhibidores de HSP90" como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de ATPasa intrlnseca del HSP90; degradando, actuando sobre, disminuyendo o inhibiendo las protelnas cliente de Hsp90 a traves de la via de la ubiquitina proteosoma. Los compuestos que actuan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de ATPasa intrlnseca de HSP90 son especialmente compuestos, protelnas o anticuerpos que inhiben la actividad de ATPasa intrlnseca de HSP90 por ejemplo, 17- alilamino, 17-dimetoxigeldanamicina (17AAG), un derivado de geldanamicina; otros compuestos relacionados con geldanamicina; radicicol e inhibidores de HDAC.

El termino "anticuerpos antiproliferativos" como se usa en el presente documento incluye, pero no esta limitado a, trastuzumab (Herceptin™), Trastuzumab-DM1, erlotinib (Tarceva™), bevacizumab (Avastin™), Rituximab (Rituxan™), PRO64553 (anti-CD40) y anticuerpo 2C4. Por anticuerpos se entiende, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespeclficos formados a partir de al menos 2 anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biologica deseada.

Para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (AML), la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1- lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin- 1-il}-metanona se puede utilizar en combinacion con terapias de leucemia estandar, especialmente en combinacion

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con terapias utilizadas para el tratamiento de AML. En particular, la forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro- 1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-pi ridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]- pirrolidin-1-il}-metanona se puede administrar en combination con, por ejemplo, inhibidores de transferasa farnesilo y/u otros farmacos utiles para el tratamiento de AML, tales como Daunorubicin, Adriamicina, Ara-C, VP-16, Teniposida, Mitoxantrona, Idarubicin, Carboplatino y PKC412.

Una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona tambien puede utilizarse para aventajar en combinacion con otros agentes terapeuticos, especialmente otros agentes antimalaria. Tales agentes antimalaria incluyen, pero no se limitan a proguanil, clorproguanilo, trimetoprim, cloroquina, mefloquina, lumefantrina, atovaquona, pirimetamina-sulfadoxina, pirimetamina-dapsona, halofantrina, quinina, quinidina, amodiaquina, amopiroquina, sulfonamidas, artemisinina, arteflene, artemeter, artesunato, primaquina, NO inhalado, L-arginina, Dipropilenetriamina NONOato (donador de NO), Rosiglitzone (PPARg agonista), carbon activado, eritropoyetina, levamisol y pironaridina.

Una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona tambien puede utilizarse para aventajar en combinacion con otros agentes terapeuticos, tales como los usados para el tratamiento de Leishmaniosis, Tripanosomiasis, Toxoplasmosis y Neurocisticercosis. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a sulfato de cloroquina, atovacuona-proguanil, artemeterc-lumefantrina, sulfato de quinina, artesunato, quinina, doxiciclina, clindamicina, antimoniato de meglumina, estibogluconato de sodio, miltefosina, ketoconazol, pentamidina, anfotericina B (AmB), AmB liposomal, paromomicina, eflornitina, nifurtimox, suramina, melarsoprol, prednisolona, benznidazol, sulfadiacina, pirimetamina, clindamicina, trimetropim, sulfametoxazol, azitromicina, atovacuona, dexametasona, praziquantel, albendazol, beta-lactamicos, fluoroquinolonas, macrolidos, aminoglucosidos, sulfadiazina y pirimetamina.

La estructura de los agentes activos identificados por numeros de codigo, nombres genericos o comerciales pueden ser tomada de la edition actual del compendio estandar "The Merck Index" o desde bases de datos, por ejemplo, Patents International (por ejemplo, IMS World Publications).

Los compuestos mencionados anteriormente, que se puede utilizar en combinacion con una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4- b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona, se pueden preparar y administrar como se describe en la tecnica, tales como en los documentos citados anteriormente.

Una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona tambien puede utilizarse para aventajar en combinacion con procesos terapeuticos conocidos, por ejemplo, la administration de hormonas o especialmente radiation.

Una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona puede utilizarse en particular como un radio sensibilizador, especialmente para el tratamiento de tumores que exhiben sensibilidad pobre a la radioterapia.

Por "combinacion", se entiende o bien una combinacion fija en una forma de unidad de dosificacion, o un kit de partes para la administracion combinada en donde una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1- lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin- 1-il}-metanona y un socio de combinacion se puede administrar independientemente al mismo tiempo o de manera separada entre intervalos de tiempo que permitan especlficamente que los socios de combinacion muestren un efecto cooperativo, por ejemplo, sinergico, o cualquier combinacion de los mismos. Los terminos "coadministracion" o "administracion combinada" o similares como se usan en el presente documento pretenden abarcar la administracion del socio de combinacion seleccionado a un sujeto individual que lo necesite (por ejemplo, un paciente), y pretenden incluir los reglmenes de tratamiento en los que los agentes no son necesariamente administrados por la misma via de administracion o al mismo tiempo. El termino "combinacion" como se usa en el presente documento significa un producto que resulta de la mezcla o combinacion de mas de un ingrediente activo e incluye combinaciones tanto fijas como no fijas de los ingredientes activos. La frase “combinacion fija” significa que los ingredientes activos, por ejemplo una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)- {(S)-3-[1 -(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1 H-pirido[3,4-b]-[1,4]oxazi n-7-iloxi]-pi rrolidin-1-il}-metanona y un socio de combinacion, se administran ambos a un paciente simultaneamente in la forma de una entidad o dosis individual. La frase “combinacion no fija” significa que los ingredientes activos, por ejemplo una forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H- pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona) y un socio de combinacion, se administran ambos a un paciente como entidades separadas ya sea simultaneamente, concurrentemente o secuencialmente con llmites de tiempo no especlficos, en donde tal administracion proporciona niveles terapeuticamente efectivos de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Este ultimo se aplica tambien a la terapia coctel, por ejemplo la administracion de tres o mas ingredientes activos.

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10

15

20

25

30

35

40

45

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55

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Ejemplos

Detalles Experimentales:

Los siguientes ejemplos tienen el proposito de ilustrar la invencion y no deben interpretarse como limitaciones de la misma. Las temperaturas son dadas en grados centlgrados. Si no se menciona lo contrario, todas las evaporaciones son realizadas bajo presion reducida, preferentemente entre 15 mm Hg y 100 mm Hg aproximadamente (=20-133 mbar). La estructura de los productos finales, intermedios y materiales de inicio es confirmada por metodos anallticos estandar, por ejemplo, microanalisis y caracterlsticas espectroscopicas, por ejemplo, MS, IR, RMN. Las abreviaturas utilizadas son las convencionales en la tecnica.

Todos los materiales de partida, precursores de slntesis, reactivos, acidos, bases, agentes deshidratantes, disolventes y catalizadores utilizados para sintetizar las formas de la presente invencion estan comercialmente disponibles o pueden producirse mediante metodos de slntesis organica conocidos por alguien con habilidad comun en la tecnica (Houben-Weyl 4a Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volumen 21). Ademas, las formas de la presente invencion pueden producirse mediante metodos de slntesis organicas conocidas por un experto en la tecnica como se muestra en los siguientes ejemplos.

Abreviaturas

ACN acetonitrilo

AcOH acido acetico

ac.

Boc

Boc2O

tBu

tBuOH BrettPhos s a

COMU

conc.

acuoso

terc-b utoxicarbonilo dicarbonato de di-terc-butilo terc-butilo terc-butanol

2-(Diciclohexilfosfino)-3,6-dimetoxi-2'-4'-6'-triisopropil-1,1'-bifenilo singlete amplio

Hexafluorofosfato de (1-Ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-

carbenio

concentrado

d

dd

dla o dlas doblete

Doblete de dobletes

dba

dibencilidenacetona

DCM

DEA

DEAD

DEAP

DIPEA

DMF

DMME

DMSO

DPPA

DPPF

EDC

eq.

ESI

Et3N

Et2O

EtOAc

EtOH

H

HATU

HBTU

HMDS

HOBT

HPLC

IPA

CLEM

mCPBA

MeOH

diclorometano

dietilamina

azodicarboxilato de dietilo

dietilaminopiridina

diisopropiletilamina

dimetilformamida

dimetoximetano

dimetilsulfoxido

Azida de difenilfosforilo

1, 1 '-bis(difenilfosfino)ferroceno

Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida

equivalente o equivalentes

lonizacion por electropulverizado

trietilamina

dietileter

acetato de etilo

etanol

Hora u horas

hexafluorofosfato de O-(7 azabenzotriazol-1-il)-W,W,W,W-tetrametiluronio Hexafluorofosfato de O-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio hexametildisilazano 1-hidroxi-benztriazol

Cromatografla llquida de alto rendimiento isopropanol

Cromatografla llquida con espectrometrla de masas

Acido meta-cloroperoxibenzoico

metanol

m multiplo

min minuto o minutos

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10

15

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25

30

35

40

45

50

55

EM: espectrometrla de masas

mw: microondas

RMN: espectrometrla de resonancia magnetica nuclear

NaOtBu: terc-butoxido sodico

NP: Fase normal

OBD: densidad de lecho optima

Pd2(dba)3: tris(dibencilidenoacetona)dipaladio

PL-HCO3 MP SPE: Cartucho de bicarbonato con soporte polimerico para elimination de acido

prep.: preparativa

PPh3: trifenilfosfina

Q: cuarteto

Rac-bINAP: 2,2'-bis(di-p tolilfosfino)-1, 1 -binaftilo racemico

RP: Fase inversa

Rt: tiempo de retention

ta: temperatura ambiente

RuPhos: 2-diciclohexilfosfino-2',6'-di-isopropoxi-1, 1 '-bifenilo

sat.: saturado

SCX-2: Poliestireno macroporoso del acido sulfonico con soporte polimerico

sol.: solution

t: triplete

TBM: Eter terc-butilmetllico

TBA: Ffluoruro de tetrabutilamonio

TBDMSCl: terc-butildimetilsililcloruro

Tetrametil-t-butilo -: -Xphos 2-di-t-butilfosfino-3,4,5,6-tetrametil-2',4',6'-triisopropilbifenilo

TFA: acido trifluoroacetico

THF: tetrahidrofurano

TLC: cromatografia en capa fina

UPLC: Cromatografia liquida de ultra rendimiento

XPhos: 2-dici clohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo

Pd[RuPhos]: (2-diciclohexilfosfino-2','-diisopropil-1,1'-bifenil)(2-(2-aminoetil)fenil)paladio(II)

El equipo de microondas utilizado es un Biotage Initiator®

Todos los compuestos se nombraron utilizando AutoNom. Information de Cromatografia General

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Temperatura de columna HPLC:

Metodo CLEM M1 (RtMi)

2,1 x 50 mm

Acquity UPLC HSS T3, 1,8 pm

A) agua + 0,05 % en vol acido formico + 3,75 mM acetato de amonio B) ACN + 0,04 % en vol acido formico

2-98 % B en 1,4 min, 98 % B 0,45 min, flujo = 1,2 ml/min 50 °C

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Temperatura de columna HPLC:

Metodo CLEM M2 (RtM2)

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

A) agua + 0,05 % en vol acido formico + 3,75 mM acetato de amonio; B) ACN + 0,04 % en vol acido formico

2-98 % B en 1,4 min, 0,75 min 98 % B, flujo = 1,2 ml/min 50 °C

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC

Gradiente HPLC:

Temperatura de columna HPLC:

Metodo CLEM M3 (RtM3)

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

2-98 % B en 8,5 min, 1 min 98 % B, flujo = 1,2 ml/min 50 °C

Metodo CLEM M4 (RtM4)

Dimensiones de columna HPLC: 4,6 x 50 mm Tipo de Columna HPLC: SunFire C18,5 pm

Eluyente HPLC A) agua + 0,1 % en vol TFA; B) ACN + 0,1 % en vol TFA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Gradiente HPLC: 5-100 % B en 8,0 min B, flujo = 2 ml/min

Temperatura de columna HPLC: 40 °C

Metodo CLEM M5 (Rtivis)

Dimensiones de columna HPLC: 0,46x25 cm

Tipo de Columna HPLC: Chiralcel OJ-H (1189)

Eluyente HPLC EtOH/MeOH 60:40

Gradiente HPLC: isocratico, flujo=0,5 ml/min

Detector: UV 220 nm

Metodo CLEM M6 (RtMs)

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC Gradiente HPLC:

Temperatura de columna HPLC:

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

A) agua + 0,05 % TFA, B) ACN + 0,04 % TFA

2-98 % B en 1,4 min, 0,75 min 98 % B, flujo = 1,2 ml/min

50 °C

Dimensiones de columna Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC Gradiente HPLC: Temperatura de columna

Metodo CLEM M7 (RtM7)

HPLC: 2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm A) agua + 0,05 % TFA, B) ACN + 0,04 % TFA 10-95 % B en 3,0 min, 1 min 95 % B, flujo = 1,2 ml/min HPLC: 50 °C

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Metodo CLEM M8 (RtMs)

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

A) agua + 0,05 % acido formico + acetato de amonio 3,75 mM, B) acetonitrilo

+0,04 % acido formico

10-95 % B en 3,0 min, flujo = 1,2 ml/min

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Metodo CLEM M9 (RtMs)

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

A) agua + 0,05 % acido formico + acetato de amonio 3,75 mM, B) acetonitrilo +0,04 % acido formico

10 % B desde 0,0 a 0,5 min luego dese 0,5 min a 3,0 min gradiente 10-95 % B, flujo = 1,2 ml/min

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Metodo CLEM M10 (RtMio)

2,1 x 50 mm

Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm

A) agua + 0,1 % en vol acido formico, B) acetonitrilo

20-25 % B en 1,00 min, luego 25-95 % B en 3,20 min, luego 95-100 % B en 0,10 min, luego 100 % durante 0,20 min, flujo = 0,7 ml/min

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Metodo CLEM M11 (Rtivm)

2,1 x 50 mm

Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm

A) agua + 0,1 % en vol acido formico, B) acetonitrilo

5-10 % B en 1,00 min, luego 10-90 % B en 3,00 min, luego 90-100 % B en 0,10 min, luego 100 % durante 0,40 min, flujo = 0,7 ml/min

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Metodo CLEM M12 (RtMi2)

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

A) agua + 0,1 % en vol TfA, B) acetonitrilo

10-95 % B durante 1,7 min y 1,2 ml/min como flujo de disolvente y luego 95 5 B durante 0,7 min, flujo = 1,4 ml/min.

Metodo CLEM M13 (Rtivna)

Dimensiones de columna HPLC: 2,1 x 30 mm

Tipo de Columna HPLC: Ascentis Express C18, 2,7 pm

Eluyente HPLC: A) agua + 0,05 % acido formico + acetato de amonio 3,75 mM, B)

5

10

15

20

25

30

35

acetonitrilo +0,04 % acido formico

Gradiente HPLC: 10-95 % B en 3,7 min, flujo = 1,2 ml/min

Metodo CLEM M14 (RtMi4)

2,1 x 30 mm

Ascentis Express C18, 2,7 pm

10-95 % B en 1,5 min, 1 min 95 % B, flujo = 1,2 ml/min

Metodo CLEM M15 (RtMis)

Dimensiones de columna HPLC: 0,46x25 cm Tipo de Columna HPLC: Chiralcel OD-H (1194)

Eluyente HPLC Hexano/EtOH 50:50 + 0,05 % DEA

Gradiente HPLC: isocratico, flujo=0,5 ml/min

Detector: UV 220 nm

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC

Gradiente HPLC:

Dimensiones de columna HPLC: Tipo de Columna HPLC: Eluyente HPLC:

Gradiente HPLC:

Temperatura de columna HPLC:

Metodo CLEM M16 (RtMis)

2,1 x 50 mm

Acquity UPLC HSS T3, 1,8 pm

5-98 % B en 1,4 min, 98 % B 0,4 min, flujo = 1,0 ml/min 60 °C

Difraccion de rayos X en polvo

Instrumentacion:

Metodo X1

Instrumento Bruker D8 GADDS Discover

Irradiacion CuKa (40 kV, 40 mA)

Detector Detector de area HI-StAR

Intervalo de barrido 6°-39° (valor 2 teta)

Determinacion de Punto de Fusion

El punto de fusion se determino mediante calorimetrla diferencial de barrido (DSC). DSC fue como se registro en un TA Instruments DSC Q2000 usando una velocidad de calentamiento de 10 ° C/min. Una muestra de 0.6 mg se peso en el recipiente de aluminio estandar (recipiente + tapa, TA 900786.901, 900779.901). El instrumento se hizo funcionar utilizando el software Termal Advantage Q-Series V.2.6.0.367 y el software Thermal Advantage V4.6.9. Los eventos termicos se caracterizaron mediante analisis universal V4.3A Build 4.3.0.6. Las muestras se midieron contra un recipiente de muestras sin orificio de ajuste. La muestra se trato segun el siguiente protocolo:

Etapa 1: EQUILIBRADO A 0°C

Etapa 2: Rampa de 10 °C/min hasta 300 °C

Ejemplo F1: (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro- 1H-pirido[3,4-b]-[1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona

imagen1

a) 7-Cloro-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazina

5 Una solucion de 7-cloro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-2-ona (CAS registro 928118-43-8) (3,70 g, 20 mmol) en THF (63 ml) se trato con BH3*THF (1M en THF, 47 ml, 47 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 75 °C durante 1 h, despues se enfrio a temperatura ambiente y se inactivo con metanol (24 ml, 600 mmol). La mezcla de reaccion se concentro a presion reducida y el residuo se absorbio con EtOAc y se lavo con solucion acuosa saturada NaHCO3, La capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro bajo presion reducida para proporcionar el producto 10 del tftulo como un solido de color amarillo palido (3,3 g, rendimiento del 96 %).

UPLC RTm1 = 0,47 min; ESIMS: 171 [(M+H)+].

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 6 7,53 (s, 1H), 7,11 (s a, 1H), 6,47 (s, 1H), 4,09 (t, 2H), 3,17-3,38 (m, 2H).

b) 2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-ol

Una mezcla de 7-cloro-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazina (1,08 g, 6,33 mmol), solucion acuosa KOH (1,07 g, 19 mmoles de KOH en 5,4 ml de agua), 2-di-t-butilfosfino-3, 4,5,6-tetrametil-2',4',6-tri-i-propilbifenil 98 % (0,30 g, 0,63 mmol) y Pd2(dba)3 (0,29 g, 0,32 mmol) en dioxano (32,5 ml) se desgasifico tres veces con nitrogeno, se sello el tubo 5 y la mezcla de reaccion se agito a 100 °C durante 5 h. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se filtro a traves de Hyflo, se enjuago con EtOAc y metanol. Los filtrados se concentraron y el compuesto del tltulo se obtuvo tras la cromatografla ultra-rapida en gel de sllice (DCM/MeOH, 98:2 a 75:25) como un residuo de color naranja (660 mg, rendimiento del 69 %)

UPLC RTm1 = 0,34 min; ESIMS: 153 [(M+H)+].

10 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 10,33 (s a, 1H), 7,03 (s a, 1H), 6,71 (s, 1H), 5,15 (s, 1H), 3,95 (t, 2H), 3,25 (m, 2H).

c) ester terc-butflico del acido (S)-3-(2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi)-pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo

Una solucion seca de 2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-ol (0,66 g, 4,34 mmol) y ester terc-butllico del acido (R)-3-metanosulfoniloxi-pirrolidin-1-carboxllico (cAs registro 127423-61-4) (1,73 g, 6,51 mmol) en DMF (40 ml) se 15 trato con hidruro de sodio (60 % en aceite mineral, 0,21 g, 8,68 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a 80 °C durante 18 h. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se diluyo con TBME y se lavo con solucion acuosa saturada de NaHCO3, La capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro, se concentro y el compuesto del tltulo se obtuvo tras la cromatografla ultra-rapida en gel de sllice (ciclohexano/EtOAc, 95:5 a 30:70) como un aceite amarillo (1,035 g, 75 % de pureza, 56 % de rendimiento).

20 UPLC RTM1 = 0,65 min; ESIMS: 322 [(M + H) +].

1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 7,54 (s, 1H), 5,86 (s, 1H), 5,42 (s a, 1H), 4,25-4,41 (m, 1H), 4,19 (t, 2H), 3,38-3,66 (m, 6H), 2,00-2,18 (m, 2H), 1,46 (d, 9H).

d) ester terc-butflico del acido(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7- iloxi]-pirrolidin-1-carboxflico

25 Ester de terc-butilo del acido (S)-3-(2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi)-pirrolidin-1-carboxllico (254 mg 0,79 mmol), 5-bromo-2-metoxi-3-metilpiridina (CAS registro 760207-87-2) (208 mg, 1,03 mmol), XPhos (30 mg, 0,06 mmoles), y NaOtBu (167 mg, 1,74 mmol) en dioxano (6 ml) se desgasifico con argon durante 5 min, luego se anadio Pd2(dba)3 (29 mg, 0,03 mmol). El tubo se lleno con argon, sellado y la mezcla de reaccion se agito a 100 °C durante 2 h. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se filtro a traves de Hyflo, se enjuago con 30 EtOAc y los filtrados se lavaron con solucion acuosa satura de NaHCO3, La capa acuosa se volvio a extraer dos veces con EtOAc, las capas organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron y el compuesto del tltulo se obtuvo tras la cromatografla ultra-rapida en gel de sllice (heptano/EtOAc, 100:0 a 50:50) como una goma clara (274 mg, rendimiento del 78 %) UPLC RTM1 = 1,20 min; ESIMS: 443 [(M+H)+].

1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 7,93 (d, 1H), 7,61 (s a, 1H), 7,30-7,35 (m, 1H), 5,71 (s, 1H), 5,34-5,46 (m, 1H), 4,31 (s 35 a, 2H), 3,99 (s, 3H), 3,68 (t, 2H ), 3,34-3,62 (m, 4H), 2,23 (s, 3H), 2,1-2,9 (m, 2H), 1,44 (s, 9H).

e) 1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazina

Una solucion de ester terc-butllico del acido (S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4- b][1,4]oxazin-7-iloxi]pirrolidin-1-carboxllico (364 mg, 0,82 mmol) en DCM (6 ml) se trato con TFA (0,63 ml, 8,23 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 h, despues se inactivo con solucion 40 acuosa saturada de NaHCO3 y se extrajo con DCM. La capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro bajo presion reducida para proporcionar el producto del tltulo como un aceite de color rojo, que se utilizo en la siguiente etapa sin purification adicional (313mg, 90 % de pureza, rendimiento cuantitativo).

UPLC RTM1 = 065 min; ESIMS: 343 [(M+H)+].

1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 7,93 (d, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,32 (d, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,26-5,36 (m, 1H), 4,31 (t, 2H), 45 3,99 (s, 3H), 3,67 (t, 2H), 2,95-3,15 (m, 3H), 2,81-2,92 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 1,98-2,10 (m, 1H ), 1,79-1,90 (m, 1H).

f) (1,1-dioxo-hexahidro-1lamba*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3-il)-2,3-dihidro-1H- pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona

Una solucion de acido 1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda * 6 *-tiopiran-4-carboxllico (CAS 64096-87-3 registro) (106 mg, 0,59 mmol) en DMF (4 ml) se trato con HBTU (225 mg, 0,59 mmol) y DIPEA (0,24 ml, 1,37 mmol). La solucion de 50 color naranja resultante se agito a temperatura ambiente durante 5 min, luego se anadio una solucion de 1-(6- metoxi-5-metil-piridin-3-il)-7-((S)-pirrolidin-3-iloxi)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazina (156 mg, 0,46 mmol) en DMF (2 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h, despues se concentro a presion reducida y el residuo se absorbio con DCM y se lavo con solucion acuosa saturada de NaHCO3, La capa organica se seco haciendola pasar a traves de un cartucho de separation de fases, se concentro y el compuesto del tltulo se 55 obtuvo despues de la cromatografla SFC (columna DEAP (250 mm x 30 mm, 60A, 5 pm) Princeton, gradiente de 11-

16 % de metanol en CO2 supercrltico en 6 min) como un solido ligeramente coloreado (112 mg, rendimiento del 49 %).

UPLC RTm1 = 0,81 min; ESIMS: 503 [(M+H)+].

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,01 (s, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,52 (d, 1H), 5,52 (d, 1H), 5,24-5,43 (m, 1H), 4,26 (s a, 5 2H), 3,89 (s, 3H), 3,59-3,79 (m, 3H), 3,41-3,56 (m, 2H), 3,21-3,39 (m, 1H), 2,98-3,21 (m, 4H), 2,67-2,83 (m, 1H),

1,84-2,20 (m, 9H).

1H RMN (600 MHz,DMSO-d6): 5 8,01 (s, 1H), 7,63-7,59 (m, 1H), 7,55-7,51 (m, 1H), 5,55-5,51 (m, 1H), 5,43-5,24 (m, 1H), 4,29-4,22 (m, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,80-3,60 (m, 2H), 3,56-3,37 (m, 3H), 3,28-2,99 (m, 5H), 2,89-2,66 (m, 1H), 2,19 a 2,9 (m, 4H), 2,08-1,98 (m, 2H), 1,98-1,86 (m, 3H).

10 Cristalizacion del Ejemplo F1 por calentamiento y enfriamiento en isopropanol/eter dietilico

Se suspendieron 474 mg de Ejemplo F1 amorfo en 1,4 ml de isopropanol. La mezcla se calento a 70 °C y se agito a 70 °C para permitir la disolucion completa del Ejemplo F1. La solucion se enfrio a temperatura ambiente, se formo un residuo de pegamento. Se anadieron 2 ml de eter dietilico y la suspension se agito durante 48 h. Se formo una suspension de color blanco. La suspension se filtro y el solido se seco a 40 °C, 15 mbar. Se obtuvo un polvo fino, 15 blanco. El material solo contiene disolvente residual leve (<0,5 %). Se obtuvo una forma cristalina anhidra del Ejemplo F1 con un inicio de fusion 148,77 °C.

Lista de los picos 2-Teta mas significativos a partir del patron de difraccion de polvo de rayos X con tolerancias de ± 0,5 de la forma anhidra del Ejemplo F1 (Metodo M1) (incluyendo los picos bajos/debiles para informacion). Nota: Esta lista de picos no es exhaustiva, sino que son solamente “entre otros”.

2-teta en grados: Intensidad

9,1: Baja

10,2: Media

11,9: Media

13,0: Baja

17,1: Fuerte

17,7: Media, sin resolver

18,7: Media

20,3: Media, sin resolver

20,8: Media, sin resolver

26,0: Media/baja

26,7: Media

23,2: Media/baja

24,1: Media/baja

24,8: Media/baja

29,3: Media/baja

27,4: Media/baja

21,4: Media/baja

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Evaluacion Biologica

La actividad de un compuesto puede evaluarse mediante los siguientes metodos in vitro & in vivo.

Ensayos biologicos

1 Determinacion de la inhibicion enzimatica de la isoforma PI3K alfa y PI3K delta 25 1.1 Prueba de la actividad lfpido quinasa

La eficacia de los compuestos como inhibidores de la PI3 quinasa se puede demostrar como sigue:

La reaccion de la quinasa se lleva a cabo en un volumen final de 50 pl en la mitad de placa COSTAR de 96 pocillos.

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Las concentraciones finales de ATP y fosfatidil inositol en el ensayo son de 5 |jM y 6 |jg/ml respectivamente. La reaccion se inicio mediante la adicion de la PI3-quinasa, por ejemplo, la PI3-quinasa 5.

p1105. Los componentes del ensayo se anaden a cada pocillo de la siguiente manera:

• 10 jl del compuesto de ensayo en DMSO al 5 % por cada pocillo en las columnas 2-1.

• La actividad total se determina mediante la adicion de 10 jl de DMSO al 5 % vol/vol en los primeros 4 pocillos de la columna 1 y los ultimos 4 pocillos de la columna 12.

• El ruido de fondo se determina mediante la adicion de 10 jM del compuesto de control para los ultimos 4 pocillos de la columna 1 y los 4 primeros pocillos de la columna 12.

• Se preparan 2 ml de la “mezcla de Ensayo” por placa:

1,912 ml de amortiguador de ensayo HEPES

8,33 jl de una solucion madre de ATP 3 mM dando una concentracion final de 5 jM por cada pocillo 1 jl de [33P]ATP dando en el dato de actividad 0,05 jCi por cada pocillo

30 jl de una solucion madre de PI de 1 mg/ml dando una concentracion final de 6 jg/ml por cada pocillo 5 jl de una solucion madre de MgCl2 de 1 M dando una concentracion final de 1 mM por cada pocillo

• se anaden 20 jl de la mezcla de ensayo a cada pocillo.

• se preparan 2 ml de la “mezcla de ensayo” por placa (x *jl de quinasa PI3 p110p en 2 ml de tampon de quinasa). La "mezcla de la enzima" se mantiene en hielo durante su adicion a las placas de ensayo.

• se anaden 20 jl de la “mezcla de la enzima” a cada pocillo para iniciar la reaccion.

• La placa se incuba a temperatura ambiente durante 90 minutos.

• La reaccion se termina mediante la adicion de 50 jl de una suspension de esferas de WGA-SPA (cuentas de ensayo de centelleo de proximidad recubiertas con aglutinina de germen de trigo) por cada pocillo.

• La placa de ensayo se sella usando TopSeal-S (sellado termico para microplacas de poliestireno, PerkinElmer LAS [Deutschland] GmbH, Rodgau, Alemania) y se incubo a temperatura ambiente durante al menos 60 minutos.

• La placa de ensayo es centrifugada a 1500 rpm durante 2 minutos usando la centrlfuga top bench de Jouan (Jouan Inc., Nantes, Francia).

• La placa de ensayo se cuenta usando un TopCount Packard, contandose cada pocillo durante 20 segundos.

* El volumen de la enzima es dependiente de la actividad enzimatica del lote en uso.

En un ensayo mas preferido, la reaccion de la quinasa se lleva a cabo en un volumen final de 10 jl por cada pocillo en una placa CORNING negra sin union de volumen bajo, de 384 pocillos (N ° de Cat. 3676). Las concentraciones finales de ATP y fosfatidil inositol (PI) en el ensayo son de 1 jM y 10 jg/ml, respectivamente. La reaccion se inicio mediante la adicion de ATP.

Los componentes del ensayo se anaden por pocillo como sigue:

50 nl de los compuestos de prueba en DMSO al 90 % por cada pocillo, en las columnas 1-20, con 8 concentraciones (paso de dilucion en serie de 1/3 y de 1/3,33) en cada pocillo.

• Control bajo: 50 nl de DMSO al 90 % en la mitad de los pocillos de las columnas 23 a 24 (0,45 % de concentracion final).

• Control alto: 50 nl del compuesto de la referencia (por ejemplo el compuesto del Ejemplo 7 en el documento WO 2006/122806) en la otra mitad de los pocillos de las columnas 23-24 (2,5 jM de concentracion final).

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• Patron: 50 nl del compuesto de la referenda como se acaba de mencionar se diluyen de la misma manera que los compuestos del ensayo en los pocillos de las columnas 21-22.

• Se preparan 20 ml de 'tampon' por ensayo:

200 pl de TRIS HCl 1 M pH 7,5 (10 mM de concentration final)

60 pl de MgCl2 1 M (3 mM de concentracion final)

500 pl de NaCl 2M (50 mM de concentracion final)

100 pl de CHAPS al 10 % (0,05 % de concentracion final)

200 pl de TDT 100 mM (1 mM de concentracion final)

18,94 ml de agua nanopura

• se preparan 10 ml de 'PI' por ensayo:

200 pl de L-alfa-fosfatidilinositol de 1 mg/ml (hlgado bovino, Avanti Polar llpidos N.° de Cat. 840042C PM = 909,12) preparado en octilglucosido al 3 % (10 mg/ml de concentracion final)

9,8 ml de 'tampon'

• se preparan 10 ml de 'ATP' por ensayo:

6,7 pl de una solution madre de ATP 3 mM dando una concentracion final de 1 pM por cada pocillo 10 ml de 'tampon'

• se preparan 2,5 ml de cada constructo de PI3K por cada ensayo en 'PI' con la siguiente concentracion final:

10 nM de PI3K alfa EMV B1075 25 nM de beta EMV BV949 10 nM de delta EMV BV1060 150 nM de gamma EMV BV950

• se anaden 5 pl de “PI/PI3K” por cada pocillo.

• se anaden 5 pl “ATP” por cada pocillo para iniciar la reaction.

• Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos (alfa, beta, delta) o 120 minutos (gamma).

• La reaccion se termino mediante la adicion de 10 pl de Kinase-Glo (Promega N.° de Cat. 6714).

• Las placas de ensayo fueron leldas despues de 10 minutos con un lector Synergy 2 (BioTek, Vermont EE.UU.) con un tiempo de integration de 100 milisegundos y la sensibilidad establecida en 191.

• Salida: El control superior tiene un conteo de alrededor de 60.000 y el control inferior tiene un conteo de 30.000 o menor

• Este ensayo de luminiscencia da una relation util Z ' que tiene valores entre 0,4 y 0,7

El valor de Z 'es una medida universal de la robustez del ensayo. Un valor de Z' entre 0,5 y 1,0 es considerado propio de un ensayo excelente.

Para este ensayo, se preparan los constructos de PI3K mencionados como sigue:

1.2 Generacion de los constructos de genes

Se utilizan dos constructos diferentes, BV 1052 y BV 1075, para generar las protelnas de la quinasa PI3a para la investigation de los compuestos.

PI3Ka BV-1052 conector p85 (ISH2)-Gly-p110A (D20aa)-etiqueta de His del C-terminal

Los productos de PCR para el dominio SH2 entre (ISH2) de la subunidad p85 y para la subunidad p110-a (con una deletion de los primeros 20 aminoacidos) son generados y se fusionados mediante la PCR de superposition.

El producto ISH2 de PCR se genera a partir de una primera hebra de ADNc utilizando inicialmente a los cebadores gwG130-p01 (5' -CGAGAAT ATGATAGATTATATG AAGAAT-3') (SEQ ID NO: 1) y gwG130-p02 (5'-

TGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3') (SEQ ID NO: 2). Posteriormente, en una reaccion secundaria de PCR, Gateway (Invitrogen AG, Basilea, Suiza) mediante una recombination se anadieron los sitios attB1 y las secuencias de enlace al extremo 5' y al extremo 3' del fragmento de p85 de ISH2, respectivamente, utilizando los

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cebadores gwG130-p03 (5'-

GGGACAAGTTTGTACAAAAAAG CAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC GAGAAT ATGATAGATTATATGAAGAA T-3') (SEQ ID NO: 3) y gwG152-p04 (5'-TACCATAATTCCACCACCACCACCGGAAATTCCCCCTGGTTTAATGC TGTTCATACGTTTGTCAAT-3') (SEQ ID NO: 4).

El fragmento p110-a tambien se genera a partir de una primera hebra de ADNc, utilizando inicialmente a los cebadores gwG152-p01 (5'-CTAGTGGAATGTTTACTACCAAATGG-3') (SEQ ID NO: 5) y gwG152-p02 (5'- GTTCAATGCATGCTGTTTAATTGTGT-3') (SEQ ID NO: 6).

En una reaccion posterior de PCR, se anaden la secuencia del conector y la etiqueta de histidina en el extremo 5 'y el extremo 3' del fragmento p110-a respectivamente, utilizando los cebadores gw152-p03 (5'-

GGGGGAATTTCCGGTGGTGGTGGTGGAATTATGGTACTAGTGGAATGTTTACTACCAAATGGA-3') (SEQ ID NO: 7) y gwG152-p06 (5'-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCGTTCAATGCATGCTGTTTAATTGTGT-3') (SEQ ID NO: 8).

La protelna de fusion p85-iSH2/p110-a se ensambla en una tercera reaccion de PCR mediante el solapamiento de los conectores en el extremo 3'del fragmento ISH2 y en el extremo 5' del fragmento p110-a, utilizando el cebador gwG130-p03 anteriormente mencionado y un cebador que contiene una etiqueta de histidina que se superpone y las secuencias de recombinacion AttB2 (5'-

GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT GTGCTCC-3') (SEQ ID NO: 9).

Este producto final se recombina en una reaccion OR (Invitrogen) en el vector donante pDONR201 para generar el clon de entrada ORF318. Este clon se verifica mediante secuenciacion y se utiliza en una reaccion de marco LR de enlace para transferir el inserto en marco de enlace del vector adaptado pBlueBac4.5 (Invitrogen) para la generacion del vector de expresion LR410 del Baculovirus.

PI3Ka BV-1075 conector p85 (ISH2)-12 XGly-p110A (D20aa)-etiqueta de His del C-terminal

Se genera al constructo del Baculovirus BV-1075 mediante una ligacion de tres partes que comprende un fragmento de p85 y un fragmento p110-a clonado en el vector pBlueBac4.5. El fragmento de p85 se deriva del plasmido p16612 digerido con Nhe/SPE. El fragmento p110-a es derivado de LR410 (vease mas arriba) como un fragmento SpeI/HindI 11. El vector de clonacion pBlueBac4.5 (Invitrogen) se digirio con NheI/HindIII. Lo que da como resultado el constructo PED 153.8

El componente p85 (ISH2) se genera mediante PCR utilizando al ORF 318 (descrito anteriormente) como una plantilla y un cebador hacia adelante KAC1028 (5'-GCTAGCATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAG AATATACC) (SEQ ID NO: 10) y dos cebadores inversos, KAC1029 (5'-

GCCTCCACCACCTCCGCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC) (SEQ ID NO: 11) y KAC1039 (5'-

TACTAGTCCGCCTCCACCACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC) (SEQ ID NO: 12).

Los dos cebadores inversos se superponen y se incorporan al conector Gly 12x y la secuencia N-terminal del gen P110A al sitio SpeI. El conector Gly 12x reemplaza el conector en el constructo BV1052. El fragmento de PCR se clono en pCR2.1 TOPO (Invitrogen). De los clones resultantes, se determino que el p1661-2 es el correcto. Este plasmido se digirio con NheI y SpeI y el fragmento resultante es aislado en gel y purificado mediante una subclonacion.

El fragmento p110-a de clonacion es generado mediante una digestion enzimatica del clon LR410 (vease mas arriba) con SpeI y HindIII. El sitio SpeI se encuentra en la region de codificacion del gen P110A.

El fragmento resultante se aislo en gel y se purifico mediante una subclonacion.

El vector de clonacion, pBlueBac4.5 (Invitrogen) se prepara por medio de una digestion enzimatica con NheI y HindIII. El vector de corte se purifica en una columna de Qiagen (Qiagen NV, Venlo, Palses Bajos) y despues se desfosforila con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP) (New England Biolabs, Ipswich, MA). Despues de la termination de la reaccion de CIP el vector de corte es purificada de nuevo en la columna para generar el vector final. La ligacion de las 3 partes se realizo con una ligasa Rapid de Roche siguiendo las especificaciones del proveedor.

PI3KB BV-949 conector p85 (ISH2)-Gly p110b-etiqueta de His del C-terminal

Los productos de PCR para el inter dominio SH2 (ISH2) de la subunidad p85 y de la longitud completa de la subunidad p110-b se generan y se fusionan mediante la PCR de superposition.

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El producto ISH2 PCR es generado a partir de una primera hebra de ADNc utilizando inicialmente a los cebadores gwG130-p01 (5' -CGAGAAT ATGATAGATTATATG AAGAAT-3') (SEQ ID NO: 1) y gwG130-p02 (5'-

TGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3') (SEQ ID NO: 2). Posteriormente, en una reaccion secundaria de PCR de marco de enlace se anaden (Invitrogen) los sitios de recombinacion att B1 y las secuencias de enlace en el extremo 5 'y el extremo 3' del fragmento de ISH2 p85 respectivamente, utilizando los cebadores gwG130-p03 (5'- GGGACAAGTTTGTACAAAAAAG CAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC GAGAAT ATGATAGATTATATGAAGAA T-3') (SEQ ID NO: 3) y gwG130-p05 (5'-

ACTGAAGCATCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3') (SEQ ID NO: 13).

El fragmento p110-b tambien se genera a partir de una primera hebra de ADNc utilizando inicialmente a los cebadores gwG130-p04 (5'-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTTCAGTTTCATAATGCCTCCTGCT-3') (SEQ ID NO: 4) que contienen secuencias de union y el extremo 5' de p110-b y gwG130-p06 (5'- AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATCTGTAGTCTTTCCGAACTGTGTG-3') (SEQ ID NO: 14) que contiene las secuencias del extremo 3' de p110-b fusionadas a una etiqueta de histidina.

La protelna de fusion p85-iSH2/p110-b se ensambla mediante una reaccion de PCR de superposicion de los conectores en el extremo 3'del fragmento de ISH2 y el extremo 5' del fragmento de p110-b, utilizando el cebador gwG130-p03 mencionado y un cebador que contiene una etiqueta de histidina que se superpone y las secuencias de recombinacion AttB2 (5'-

GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3') (SEQ ID NO: 15).

Este producto final se recombina en una reaccion Gateway OR (Invitrogen) en el vector donante pDONR201 para generar el clon de entrada ORF253. Este clon se verifica mediante secuenciacion y se utiliza en una reaccion Gateway LR de enlace para transferir el inserto en el marco del enlace adaptado a vector pBlueBac4.5 (Invitrogen) para la generacion del vector de expresion LR280 del Baculovirus.

PI3K5 BV-1060 conector p85 (ISH2)-Gly (de longitud completa)-etiqueta de His del C-terminal

Los productos de PCR para el dominio SH2 entre (ISH2) de la subunidad p85 y de la longitud completa de la subunidad p110-d se generan y se fusionan mediante la PCR de superposicion.

El producto ISH2 de la PCR se genera a partir de una primera hebra de ADNc utilizando inicialmente a los cebadores gwG130-p01 (5'-CGAGAAT AT GAT AGATT AT AT GAAGAAT-3') (SEQ ID NO: 1) y gwG130-p02 (5'- TGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3') (SEQ ID NO: 2). Posteriormente, en una reaccion secundaria de PCR de marco de enlace se anaden (Invitrogen) los sitios de recombinacion attB1 y las secuencias de enlace en el extremo 5 'y el extremo 3' del fragmento de ISH2 p85 respectivamente, utilizando los cebadores gwG130-p03 (5'- GGGACAAGTTTGTACAAAAAAG CAGGCTACGAAGGAGATATACATATGC GAGAAT ATGATAGATTATATGAAGAA T-3') (SEQ ID NO: 3) y gwG154-p04 (5'-TCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3') (SEQ ID NO: 16).

El fragmento p110-a tambien se genera a partir de una primera hebra de ADNc utilizando inicialmente a los cebadores gwG154-p01 (5'-ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3') (SEQ ID NO: 17) y gwG154-p02 (5'- CTACTGCCTGTTGTCTTTGGACACGT-3') (SEQ ID NO: 18).

En una reaccion de PCR posterior se anaden las secuencias conectoras y una etiqueta de Histidina en el extremo 5' y el extremo 3' del fragmento de p110-d, respectivamente, utilizando a los cebadores gw154-p03 (5'- ATT AAAC CAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGACTGCCCCATGGA-3') (SEQ ID NO: 19) y gwG154-p06 (5'-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3') (SEQ ID NO: 20).

La protelna de fusion p85-iSH2/p110-d es ensamblada en una tercera reaccion de PCR mediante el solapamiento de los conectores en el extremo 3'del fragmento de ISH2 y en el extremo 5' del fragmento de p110-d, usando el gwG130-p03 cebador mencionado y un cebador que contiene una etiqueta de histidina que se superpone y las secuencias AttB2 de recombinacion del marco de enlace (Invitrogen) (5'- GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3') (SEQ ID NO: 21).

Este producto final se recombina en una reaccion Gateway OR (Invitrogen) en el vector donante pDONR201 para generar el clon de entrada ORF319. Este clon se verifica mediante secuenciacion y se utiliza en una reaccion Gateway LR de enlace para transferir el inserto en el marco de enlace del vector pBlueBac4.5 adaptado (Invitrogen) para la generacion del vector LR415 de expresion de Baculovirus.

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PI3K BV-950 p110g (D144aa)-etiqueta de His del C-terminal

Este constructo se obtiene del laboratorio Roger Williams, Laboratorio MRC de Biologia Molecular de Cambridge, Reino Unido (noviembre de 2003). Descripcion del constructo disponible en: Pacold ME et al. (2000) Cell 103, 931943.

1.3 expresion y purificacion de protefnas

Metodos para generar Baculovirus recombinante y la proteina de las isoformas de PI3K:

Los plasmidos pBlue-bac4.5 (para las isoformas a, b, y d) o el pVL1393 (para la isoforma g) que contienen los diferentes genes de la quinasa PI3 se cotransfectan con ADN genomico BaculoGold WT (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), utilizando los metodos recomendados por el fabricante.

Posteriormente, el Baculovirus recombinante obtenido a partir de la transfeccion se purifica en placa en celulas de insecto Sf9 para producir celulas aisladas que expresan la proteina recombinante.

Los clones positivos se seleccionan mediante western anti-HIS o del anticuerpo anti-isoforma. Para las isoformas alfa y delta PI3K, se realiza una segunda purificacion en placa en las primeras cepas clones virales de PI3K. La amplificacion de todos los Baculovirus aislados se lleva a cabo con una baja multiplicidad de infeccion (moi) para generar un titulo alto, un almacen de bajo flujo para la produccion de proteina. Los Baculovirus se designaron como BV1052 (a) y BV1075 (a), BV949 (P), BV1060 (5) y BV950 (y).

La produccion de proteinas implica infeccion (pasaje 3 o inferior) de las celulas suspendidas Tn5 (Trichoplusia ni) o TiniPro (Expression Systems, LlC, Woodland, CA, EE.UU.) en medios libres de proteinas con un moi de 2-10 para 39-48 horas en frascos Erlenmeyer vidrio de 2 l (110 rpm) o en biorreactores de onda (22-25 rpm). Inicialmente, se alimentan los biorreactores de onda con 10 l de volumen de trabajo a una densidad de 3e5 celulas/ml a la mitad de la capacidad (5 l). El reactor se sacude a 15 rpm durante la fase de crecimiento de las celulas durante 72 horas, suplementado con una mezcla de aire 5 % con oxigeno (0,2 l por minuto). Inmediatamente antes de la infeccion, se analizaron los cultivos del reactor de onda para determinar la densidad, la viabilidad y se diluyeron a una densidad de aproximadamente 1,5e6 celulas/ml. Se anaden 100-500 ml de la solucion concentrada, de virus de bajo flujo tras 2-4 horas de cultivo adicional. El oxigeno se incremento hasta una concentracion del 35 % para el periodo de infeccion 39-48 horas y la se aumento la oscilacion de la plataforma a 25 rpm. Durante la infeccion, las celulas son supervisadas con un analizador de viabilidad Vicell (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE.UU.) del bioproceso para determinar la viabilidad, el diametro y la densidad. Las lecturas del Bioanalizador Nova (Nova Biomedical Corp., Waltham, MA, EE.UU.) de diversos parametros y metabolitos (pH, saturacion de O2, glucosa, etc.) se toman cada 12-18 horas hasta la cosecha.

Las celulas del biorreactor de onda se recogen dentro de 40 horas despues de la infeccion. Las celulas se recogieron mediante una centrifugacion (4 grados C a 1500 rpm), y posteriormente se mantuvieron en hielo durante la acumulacion de los sedimentos para la lisis y su purificacion. Los grupos de sedimentos acumulados se hacen con pequenas cantidades de medio de Grace frio, no suplementado (sin inhibidores de la proteasa).

Protocolo de purificacion de la PI3K alfa para HTS (BV1052)

La PI3K alfa se purifica en tres etapas cromatograficas: cromatografia de afinidad con metal inmovilizado en una resina de Sefarosa de Ni (GE Healthcare, perteneciente a General Electric Company, Fairfield, CT, EE.UU.), una filtracion en gel utilizando una columna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare), y finalmente una etapa de intercambio cationico en una columna de SP-XL (GE Healthcare). Todos los tampones se enfrian a 4 °C y la lisis se lleva a cabo enfriando en hielo. El fraccionamiento en columna se realiza rapidamente a temperatura ambiente.

Las celulas de insecto tipicamente congeladas son lisadas en un tampon hipertonico de lisis y se aplican a una columna preparada IMAC. La resina se lava con 3-5 volumenes de columna de tampon de lisis, seguido de 3-5 volumenes de columna de tampon de lavado que contiene imidazol de 45 mM, y la proteina objetivo se eluyo a continuacion con un tampon que contiene imidazol de 250 mM. Las fracciones se analizaron mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y se agruparon las fracciones que contienen a la proteina objetivo y se aplicaron a una columna preparada de GFC. Las fracciones de la columna GFC son analizados mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y las fracciones que contienen a la proteina objetivo se agrupan. El grupo obtenido de la columna de GFC se diluye en un tampon de baja salinidad y se aplica a una columna preparada de SP-XL. La columna se lava con tampon de baja salinidad hasta que se consigue una linea de base estable de absorbancia A280, y se eluye usando un gradiente de volumen de columna de NaCl de 20 mM de 0 a 500 mM de NaCl. Una vez mas, las fracciones de la columna de SP-XL son analizados mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y las fracciones que contenian a la proteina objetivo se agrupan. El grupo final se dializo en un tampon de almacenamiento que contiene 50 % de glicerol y se almaceno a -20° C. El grupo final se ensayo para

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determinar la actividad en un ensayo de la fosfoinosititol quinasa.

Protocolo de purificacion de la PI3K beta para HTS (BV949)

La PI3K beta se purifica en dos etapas cromatograficas: cromatografla de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) en una resina de Sefarosa de Ni (GE Healthcare) y una filtracion en gel (GFC) utilizando una columna Superdex de 200 26/60 (GE Healthcare). Todos los tampones se enfrlan a 4 °C y la lisis se lleva a cabo enfriando en hielo. El fraccionamiento en columna se realiza rapidamente a temperatura ambiente.

Las celulas de insecto tlpicamente congeladas son lisadas en un tampon hipertonico de lisis y se aplican a una columna preparada IMAC. La resina se lava con 3-5 volumenes de columna de tampon de lisis, seguido de 3-5 volumenes de columna de tampon de lavado que contiene imidazol de 45 mM, y la protelna objetivo se eluyo a continuacion con un tampon que contiene imidazol de 250 mM. Las fracciones se analizaron mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y se agruparon las fracciones que contienen a la protelna objetivo y se aplicaron a una columna preparada de GFC. Las fracciones de la columna GFC son analizados mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y las fracciones que contienen a la protelna objetivo se agrupan. El grupo final se dializo en un tampon de almacenamiento que contiene 50 % de glicerol y se almaceno a -20 °C. El grupo final se analizo para determinar la actividad en el ensayo de la fosfoinostitol quinasa.

Protocolo de purificacion de la PI3K gamma para HTS (BV950)

La PI3K gamma se purifica en dos etapas cromatograficas: cromatografla de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) en una resina de Sefarosa de Ni (GE Healthcare) y una filtracion en gel (GFC) utilizando una columna Superdex de 200 26/60 (GE Healthcare). Todos los tampones se enfrlan a 4 ° C y la lisis se lleva a cabo enfriando en hielo. El fraccionamiento en columna se realiza rapidamente a temperatura ambiente. Las celulas de insecto tlpicamente congeladas son lisadas en un tampon hipertonico de lisis y se aplican a una columna preparada IMAC. La resina se lava con 3-5 volumenes de columna de tampon de lisis, seguido de 3-5 volumenes de columna de tampon de lavado que contiene imidazol de 45 mM, y la protelna objetivo se eluyo a continuacion con un tampon que contiene imidazol de 250 mM. Las fracciones se analizaron mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y se agruparon las fracciones que contienen a la protelna objetivo y se aplicaron a una columna preparada de GFC. Las fracciones de la columna GFC son analizados mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y las fracciones que contienen a la protelna objetivo se agrupan. El grupo final se dializo en un tampon de almacenamiento que contiene 50 % de glicerol y se almaceno a -20 °C. El grupo final se analizo para determinar la actividad en el ensayo de la fosfoinostitol quinasa.

Protocolo de purificacion de la PI3K delta para HTS (BV1060)

La PI3K delta se purifico en tres etapas cromatograficas: cromatografla de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) en una resina de Sefarosa de Ni (GE Healthcare), una filtracion en gel (GFC) utilizando una columna Superdex de 200 26/60 (GE Healthcare), y finalmente una etapa de intercambio anionico en una columna de Q-HP (GE Healthcare). Todos los tampones se enfrlan a 4 °C y la lisis se lleva a cabo enfriando en hielo. El fraccionamiento en columna se realiza rapidamente a temperatura ambiente. Las celulas de insecto tlpicamente congeladas son lisadas en un tampon hipertonico de lisis y se aplican a una columna preparada IMAC. La resina se lava con 3-5 volumenes de columna de tampon de lisis, seguido de 3-5 volumenes de columna de tampon de lavado que contiene imidazol de 45 mM, y la protelna objetivo se eluyo a continuacion con un tampon que contiene imidazol de 250 mM. Las fracciones se analizaron mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y se agruparon las fracciones que contienen a la protelna objetivo y se aplicaron a una columna preparada de GFC. Las fracciones de la columna GFC son analizados mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y las fracciones que contienen a la protelna objetivo se agrupan. El grupo de la columna de GFC se diluye en un tampon de baja salinidad y se aplico a una columna preparada de Q-HP. La columna se lava con tampon de baja salinidad hasta que se consigue una llnea de base estable de absorbancia A280, y se eluye usando un gradiente de volumen de columna de NaCl de 20 mM de 0 a 500 mM de NaCl. Una vez mas, las fracciones de la columna de SP-XL son analizados mediante una tincion de Coomassie de los geles SDS-pAGE, y las fracciones que contenlan a la protelna objetivo se agrupan. El grupo final se dializo en un tampon de almacenamiento que contiene 50 % de glicerol y se almaceno a -20 °C. El grupo final se ensayo para determinar la actividad en un ensayo de la fosfoinosititol quinasa.

La CI50 se determina mediante una curva de ajuste de rutina de cuatro parametros que viene junto con "ajuste de Excel". Se utiliza Una ecuacion loglstica de cuatro parametros para calcular los valores de CI50 (IDBS XLfit) del porcentaje de inhibicion de cada compuesto a 8 concentraciones (por lo general 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 y 0,003 M). Alternativamente, los valores de CI50 se calculan utilizando el modelo 204 del idbsXLfit, que es un modelo loglstico de 4 parametros.

Sin embargo, alternativamente, para un ensayo de agotamiento de ATP, los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO y se distribuyen directamente en una placa blanca de 384 pocillos con un volumen de 0,5 gl por pocillo. Para iniciar la reaccion, se anadieron 10 gl de PI3 quinasa 10 nM y 1 alfa-fosfatidilinositol (PI) 5 gg/ml a cada pocillo seguido de 10 gl de ATP 2 mM. La reaccion se lleva a cabo hasta que se agota aproximadamente el 50 % del ATP,

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y luego se detiene mediante la adicion de 20 gl de solucion de Kinase-Glo (Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.). La reaccion detenida se incuba durante 5 minutos y el resto de ATP se detecta a continuacion, a traves de la luminiscencia. Los valores de la CI50 se determinan a continuacion.

En una realization de la presente invention, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una action inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 1 nM y 500 nM.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 1 nM y 100 nM.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 0,5 nM y 10 nM.

En una realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 1 nM y 1000 nM.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 1 nM y 500 nM.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K donde el inhibidor muestra una selectividad para la isoforma delta de PI3K sobre una o mas de las otras isoformas en el que esta selectividad es de al menos 10 veces.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K donde el inhibidor muestra una selectividad para la isoforma delta de PI3K sobre una o mas de las otras isoformas en el que esta selectividad es de al menos 20 veces.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K donde el inhibidor muestra una selectividad para la isoforma delta de PI3K sobre los diferentes paralogos PI3K a y PI3K p en el que esta selectividad es de al menos 10 veces.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K donde el inhibidor muestra una selectividad para la isoforma delta de PI3K sobre los diferentes paralogos PI3K a y PI3K p en el que esta selectividad es de al menos 20 veces.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 1 nM y 500 nM y en el que dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K donde el inhibidor muestra una selectividad para la isoforma delta de PI3K sobre los diferentes paralogos PI3K a y PI3K p en el que esta selectividad es de al menos 10 veces.

En otra realizacion de la presente invencion, el inhibidor de PI3K, en donde dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K, en donde el intervalo de actividad, expresado como IC50, en el ensayo enzimatico de la PI3K delta es de entre 1 nM y 500 nM y en el que dicho inhibidor tiene una accion inhibidora sobre la isoforma delta de la PI3K donde el inhibidor muestra una selectividad para la isoforma delta de PI3K sobre los diferentes paralogos PI3K a y PI3K p en el que esta selectividad es de al menos 20 veces.

2. Ensayos celulares

2.1 Fosforilacion de Akt 1/2 (S473) mediada por la fosfoinositido-3-quinasa (PI3K) en celulas Rat-1

Las celulas Rat-1 que sobreexpresan establemente una forma miristoilada de la subunidad catalltica de la fosfoinositido-3-quinasa (PI3K) alfa, beta o delta humana se sembraron en placas de 384 pocillos a una densidad de 7500 (PI3K alfa), 6200 (PI3K beta), o 4000 (PI3K delta) celulas en 30 gl de medio de crecimiento completo (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM alto en glucosa) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v), MEM aminoacidos no esenciales de 1 % (v/v), HEPES de10 mM, L-glutamina de 2 mM, puromicina 10 mg/ml de y Penicilina/Estreptomicina al 1 % (v/v)) y se incubaron a 37 % de C/CO2 al 5 %/95 % de humedad durante 24 h. Los compuestos se diluyeron en placas de compuestos de 384 pocillos para obtener diluciones en serie de 8 puntos de 40 compuestos de prueba en DMSO al 90 %, as! como 4 compuestos de referencia, 16 controles superiores y 16 controles inferiores (inhibidos). Las placas de predilucion se prepararon por dispensation de pipeteado 250 nl de

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soluciones del compuesto en placas de polipropileno de 384 pocillos utilizando un dispensador de nanolitros Hummingwell. Los compuestos se diluyen previamente mediante la adicion de 49,75 pl medio de crecimiento completo. Se transfirieron 10 pl de la solucion de compuesto prediluida a la placa de las celulas usando un pipeteador de 384 pocillos, lo que resulta en una concentration final de DMSO de 0,11 %.

Las celulas se incubaron durante 1 h a 37 % C/CO2 al 5 %/95 % de humedad. Se retiro el sobrenadante, las celulas se lisaron en 20 pl de tampon de lisis para detection AlphaScreen® SureFire ®.

Para la deteccion del p-AKT (Ser473), se utilizo el Kit de ensayo p-Akt (Ser473) de SureFire® (Perkin Elmer, EE.UU.). Se transfirieron 5 pl de lisado celular a Proxiplacas de 384 pocillos de bajo volumen para la deteccion utilizando una pipeta de 384 pocillos. La adicion de los reactivos AlphaScreen ® SureFire ® se realizo de acuerdo con el protocolo del fabricante. En primer lugar, se anadieron 5 pl del tampon de reaction ademas de la mezcla de tampon de activation que contiene AlphaScreen ® perlas de aceptores, la placa se sello, y se incubaron en un agitador de placas durante 2 horas a temperatura ambiente. En segundo lugar, se anadieron 2pl de dilution de tampon que contiene perlas donantes de AlphaScreen®, y la placa se incubo en un agitador de placas como anteriormente durante 2 horas. La placa se leyo en un lector de placas compatibles con AlphaScreen®, utilizando las configuraciones convencionales de AlphaScreen®.

2.2 Determinacion de la activacion de celulas B murinas

Se ha reconocido a la PI3K5 como agente modulador de la funcion de las celulas B cuando las celulas son estimuladas a traves del receptor de celulas B (BCR) (Okkenhaug et al. Ciencia 297:1031 (2002)). Para la evaluation de la propiedad inhibidora de los compuestos en la activacion de las celulas B, se midio el aumento de la regulation de los marcadores de activacion CD86 y CD69 en las celulas B murinas derivadas de anticuerpo de bazo de raton despues de la estimulacion con anti-IgM. El CD69 es un marcador de activacion bien conocido por las celulas B y T (Sancho et al. Tendencias Immunol. 26:136 (2005). El CD86 (tambien conocido como B7-2) que se expresa principalmente en las celulas presentadoras de antlgeno, incluyendo las celulas B. Las celulas B en reposo expresan CD86 en niveles bajos, pero que aumentan la production despues de la estimulacion de, por ejemplo el receptor BCR o del receptor de IL-4. El CD86 en una celula B interactua con el CD28 en las celulas T. Esta interaction es necesaria para la activacion optima de las celulas T y para la generation de una respuesta optima por parte de IgG1 (Carreno et al. Annu Rev. Immunol. 20:29 (2002)).

Se recogen los bazos de los ratones Balb/c, los esplenocitos se aislaron y se lavaron dos veces con RPMI que contiene 10 % de suero fetal bovino (FBS), HEPES de 10 mM, penicilina/estreptomicina de 100 unidades/ml. Al RPMI suplementado de esta manera se hace referencia en adelante como medio. Las celulas se ajustaron a 2,5 X 106 celulas/ml en medio y) se anaden 200 pl de suspension celular (5 x106 celulas a los pocillos apropiados de las placas de 96 pocillos.

A continuation, las celulas se estimulan mediante la adicion de 50 pl de mAb anti-IgM en el medio (concentracion final: 30 mg/ml). Despues de la incubation durante 24 horas a 37 °C, las celulas se tineron con los siguientes cocteles de anticuerpos: CD86-FITC anti-raton, CD69-perCP-Cy5.5anti-raton, CD19-perCP anti-raton para la evaluacion de las celulas B, y FITC-CD3anti raton, CD69-pE anti raton para la evaluacion de las celulas T (2 pl de cada anticuerpo/pocillo). Despues de una hora a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad, las celulas se transfieren a placas profundas de 96

pocillos. Las celulas se lavaron una vez con 1 ml de PBS que contenla FBS al 2 % y despues de la re-suspension en 200 pl las muestras se analizaron en un citometro de flujo FACS Calibur. Los linfocitos son detectados en el grafico de puntos de FSC/SSC en funcion del tamano y la granularidad y analizados para la expresion de CD19, CD3 y de marcadores de activacion (CD86, CD69). Los datos se calculan a partir de transferencias de puntos como el porcentaje de celulas tenidas positivamente para los marcadores de activacion dentro de la poblacion CD19+ o CD3+ que usa software BD CellQest.

Para la evaluacion de la propiedad inhibidora de los compuestos, los compuestos se disuelven primero y se diluyeron en DMSO seguido de una dilucion 1:50 en medio. Se aislaron los esplenocitos de ratones Balb/c, se volvieron a suspender y se transfieren a placas de 96 pocillos como se describe anteriormente (200 pl/pocillo). El disolvente diluido o los compuestos se anaden a las placas (25 pl) y se incuban a 37 °C durante 1 hora. A continuacion, los cultivos se estimularon con 25 pl de mAb anti-IgM/pocillo (concentracion final 30 mg/ml) durante 24 horas a 37 °C y se tineron con CD86-FITC anti-raton y CD19-perCP anti-raton (2 pl de cada anticuerpo/pocillo). La expresion de CD86 en las celulas CD19 positivas B se cuantifico mediante una citometrla de flujo como se describe anteriormente.

2.3 Determinacion de la activacion de las celulas B de rata

Se ha reconocido a la PI3K5 como agente que modula la funcion de las celulas B cuando las celulas son estimuladas a traves del receptor de celulas B (BCR) (Okkenhaug et al. Ciencia 297:1031 (2002). Para la evaluacion de la propiedad inhibidora de los compuestos en la activacion de las celulas B, se midio el aumento de la regulacion 5 de los marcadores de activacion CD86 en las celulas B de rata derivados de la sangre total despues de la estimulacion con anti-IgM e IL-4 recombinante. La molecula de CD86 (tambien conocido como B7-2) se expresa principalmente en celulas presentadoras de antlgeno, incluyendo las celulas B. Las celulas B en reposo expresan CD86 en niveles bajos, pero aumentan la produccion despues de la estimulacion de, por ejemplo el receptor BCR o el receptor de IL-4. El CD86 en una celula B interactua con El CD28 en las celulas T. Esta interaction es necesaria 10 para la activacion optima de celulas T y para la generation de una respuesta optima por parte de IgG1 (Carreno et al. Annu Rev. Immunol. 20:29 (2002)).

Recoleccion de la sangre de rata

La sangre entera se recogio de la aorta abdominal de adulto ratas Lewis (LEW/HanHsd) adultas de sexo masculino oby usando una jeringa de 10 ml con aguja hipodermica pre-recubierta con heparina sodica. La sangre se transfirio a 15 tubos Falcon de 50 ml y la concentration de anticoagulante se ajusto a 100 U/ml.

Estimulacion de las celulas B de rata y tratamiento con un inhibidor especifico

Para la evaluacion de los efectos in vitro de los farmacos inmunosupresores, la sangre heparinizada se diluyo previamente en un 50 % con medio. Como medio se proporcionaba dMeM alto en glucosa (Animed N.° de cat. 1- 26F01-I) suplementado con penicilina de 100 U/ml, estreptomicina de 100 mg/ml, L-glutamina 2 mM, dextrano 40 de 20 50 mg/ml y suero fetal de ternera al 5 % (FCS, Fetaclone I, Gibco N.° 10270-106). Entonces, se anadieron 190 gl de

sangre prediluida a 10 gl de compuesto de ensayo pre-diluido en placas de microtitulacion de 96 pocillos con fondo en U (Nunc), resultando en una serie de dilucion de 3 veces con un intervalo de concentracion de 20 a 0,0003 gM. Los pocillos de control se trataron previamente con DMSO para obtener una concentracion final de 0,5 % de DMSO. Los cultivos se iniciaron en duplicado, se mezclaron bien por agitation en un agitador de placas (Heidolph Titramax 25 101; 30 s, velocidad de 900), pipeteando arriba y abajo y se agitan as placas en el agitador de placas de nuevo. Los

cultivos se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h. A continuation, se anadieron 20 g l de anticuerpo policlonal de cabra Ab anti-IgM de rata (Serotec, n ° de cat 302001) y 10 gl de rIL-4 recombinante diluida (Immunotools N.° 340085) para obtener las concentraciones finales de 30 mg/ml y 5 ng/ml, respectivamente. Las placas se mezclaron por agitacion en un agitador de placas como anteriormente y se incubaron durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 %.

30 Determinacion de la activacion de las celulas B mediante citometria de flujo

Despues de la incubation, se anadio a cada pocillo 15 gl de una solution de EDTA de 25 mM y se agita durante 15 minutos para separar las celulas adherentes. Para el analisis de los marcadores de activacion de superficie, las muestras fueron tenidas con PE-Cy5-marcado con anti-ratCD45RA (cat. BD N.° 557015) para permitir la recoleccion en las celulas B en el analisis FACS. Ademas, las muestras se tineron con PE marcado con anti-rata CD86 (BD cat 35 N.° 551396). Todos los procedimientos de tincion se realizaron a temperatura ambiente durante 30 minutos en la

oscuridad. Despues de la incubacion, las muestras se transfirieron a placas de microtitulacion con fondo en V de 96 pocillos profundos (Corning N.° 396096) que contienen 2 ml/poso de solucion de lisis BD (BD N.° 349202). Despues de la lisis de los eritrocitos las muestras se lavaron con 2 ml de CellWash (BD N.° 349524). Los datos fueron adquiridos en una LSRII o citometro de flujo FACS calibur (BD Biosciences) utilizando el software Cellquest Plus o 40 DIVA (version 6.1.1), respectivamente. Los linfocitos fueron registrados en el dot blot FSC/SSC en funcion del tamano y la granularidad y analizados para la expresion de CD45RA y de los marcadores de activacion. Los datos se calculan a partir de transferencias de puntos o histogramas como porcentaje de celulas tenidas positivamente para los marcadores de activacion en la poblacion CD45RA+.

Evaluacion estadistica

45 El porcentaje de inhibition de la activacion de celulas B despues de la exposition al farmaco se calculo mediante la siguiente formula:

estimuUicionsm farrrtaco - estimulacion con farmaco

% de inhibicion = 100^ ---------------------------;----------7-----------------------------------------------

estimulacion sm.fsnna.CQ — no estimulado

Se utilizo al software 7de ORIGEN (OriginLab Corporation, Northampton, MA) para ajuste de la curva de regresion no-lineal. La concentracion de farmaco que resulta en una inhibicion del 50 % (CI50) se obtuvo mediante el ajuste de 50 la ecuacion de Hill para los datos de inhibicion.

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2.4 Determinacion de IL-6 inducida por TLR9 en esplenocitos de raton

Preparacion de suspension de celulas individuales a partir de bazo de raton

Los bazos fueron disecados de ratones C57BL/6 inmediatamente despues de la eutanasia. El exceso de grasa se recorto del bazo antes de machacar el bazo a traves de un filtro de celulas de 0.4 gM con el embolo de una jeringa de 5 ml. se preparo una unica suspension de celulas y se ajusto el volumen a 15 ml en un tubo Falcon de 50 ml utilizando PBS frlo. Las celulas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C antes de la remocion del sobrenadante y de la re-suspension en 5 ml de tampon de lisis de globulos rojos por el bazo y la incubacion durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se anadio PBS enfriado con hielo (30 ml) a las celulas antes de la centrifugacion a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante se retiro y las celulas se lavaron dos veces con 40 ml de medio de cultivo de esplenocitos murinos (MSCM). MSCM consistio en RPMI suplementado con penicilina de 100 unidades/ml y estreptomicina 100 gg/ml, aminoacidos no esenciales 1x, piruvato de sodio de 1 mM, p- mercaptoetanol 0.05 mM, y 10 % de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor. Las celulas se resuspendieron en 10 a 20 ml de MSCM y se contaron usando un contador de celulas Countess. Se obtuvieron Aproximadamente 60x106 esplenocitos a partir de un sola de bazo de raton C57BL/6.

Estimulacion de esplenocitos murinos y tratamiento con un inhibidor especifico

Los esplenocitos se cultivaron en placas a una densidad final de 2x105 celulas/pocillo en un volumen de 100 gl en placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron en una incubadora humidificada de 37 °C durante 2-4 horas. Despues, los compuestos a ensayar se dispensaron utilizando una maquina de manipulacion de llquidos automatizada usando placas madre de compuestos previamente preparados. Las Placas Madre consistlan de compuestos (en 90 %/10 % DMSO/ddH20) dispuestos en el punto 8-10 usando diluciones de 2-o 3 veces. La maquina de manipulacion de llquido dispensaba 1 gl de cada dilucion de la placa de compuesto previamente preparado de fuente en el pocillo adecuado en la placa de 96 pocillos. La concentracion final de partida de los compuestos en el cultivo celular fue de 10 gM. La concentracion final de DMSO en los cultivos de celulas fue de 0.5 %. Las celulas se incubaron con los compuestos durante 1 hora antes de la adicion del ligando de TLR. A continuacion, se anadio una concentracion EC80 de CpG1826 10x en un volumen de 20 gl (para un volumen final de cultivo de 200 gl) despues de lo cual se incubaron durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C.

Determinacion de la interleucina-6 mediante ELISA

Despues del cultivo durante la noche, las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se transfirieron 150 gl de cada cultivo a placas de 96 pocillos con fondo en V y se midieron los niveles de IL-6 usando el kit de ELISA comercialmente disponible de IL-6 de raton de tipo sandwich. Brevemente, las placas se recubrieron durante la noche con el anticuerpo de captura antes de bloquear durante 1 hora con PBS/0.1 % de BSA. Las muestras y los patrones se anadieron en un volumen de 50 gl y la placa se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de la eliminacion de los estandares/muestras, se lavo la placa con PBS/0.05 % de Tween antes de la adicion de 50 gl de anticuerpo de deteccion biotinilado despues de lo cual la placa se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente con agitacion. Las placas se lavaron de nuevo antes de la adicion de 50 gl de estreptavidina peroxidasa de rabano picante por pocillo durante 20 minutos. Despues se lava la placa antes de la adicion de 50gl de sustrato TMB a cada pocillo y las placas se incubaron durante 20 minutos antes de adicion de 25 gl/pocillo de solucion de parada. Se midieron los niveles de IL-6 usando un lector de placas SpectraMax 190 (450 nm) y se analizaron usando el software GraphPad Prism SoftMax Pro.

2.5 Determinacion de IFN-alfa en celulas mononucleares de sangre periferica humanas (PBMC) inducida por TLR9

Preparacion de PBMC a partir de sangre humana fresca

La sangre humana (ca. 75 ml) se recogio en tubos de 10 S-Monovette que contienen heparina (S-Monovette 7.5 ml NH Heparina 16 UI/ml de sangre; Starstedt). Se prepararon tubos Leucosep ™ (30 ml N.° 227290; Greiner Bio-One) mediante la adicion de 15 ml de medio de separation de linfocitos LSM1077 ™ por tubo (N.° J15-004; PAA Laboratories) y centrifugacion durante 30 s a 1000 g. Se transfirio algunos de los 25 ml de sangre a tubos Leucosep ™ tras la dilucion con partes iguales de PBS (sin Ca2 +/Mg2 +, N.° 14190-094). Las muestras se centrifugaron a 800 g durante 20 min a 22 °C utilizando una centrlfuga Eppendorf 5810R sin freno. La capa de PBMC se retiro cuidadosamente a partir del plasma: la interfaz del medio de separacion y se transfiere al tubo limpio de 50 ml. Las celulas se lavaron una vez mediante la adicion de PBS (hasta 45 ml) y se centrifugaron (1400 rpm, 10 min a 22 °C) con freno (a velocidad 9) utilizando una Eppendorf 5810R. Las celulas sedimentadas se resuspendieron cuidadosamente en los medios (RPMI 1640 + GlutaMAX-I, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES y 5 % v/v de FCS) y muestras combinadas. Los componentes del medio 2-mercaptoetanol (N.° 31350-010, 50 mM), Hepes (N.° 15630-056, 1M) y RPMI 1640 (1x) + GlutaMAX-I (N.° 61870-010) se obtuvieron de Gibco. El FCS (N.° 2-01F36- 1) se obtuvo de Amimed. El PBMC se conto usando un contador de celulas Countess ® automatizado (muestra fue

de 01:10 de prediluidos en los medios de comunicacion, antes de la adicion de un volumen igual (10 pi) de azul de tripano). Las celulas se diluyeron a 4 x 106 celulas/ml y se sembraron en placas de 384 pocillos (N.° 353962; Becton Dickinson AG) para dar un volumen final de 25 pl (es decir, 1 x 105 celulas/pocillo).

Estimulacion de PBMC y el tratamiento con un inhibidor especifico

5 Los compuestos fueron prediluidos en DMSO 100 al % v/v (N.° 41640-100 ml, Sigma-Aldrich), seguido de transferencia el medio (para lograr una concentracion final de DMSO de 0,25 %). Las celulas fueron tratadas con la dilucion del compuesto apropiado (5 pl) o control de vehlculo (5 pl) y se incubaron durante 30 min a 37 °C en una incubadora humidificada en aire con 5 % (v/v) de CO2. Las celulas se estimularon con CpG2216 (0,3 M; N.° tlrl- Hodna; Invivogen) o control de vehlculo (10 pl/pocillo) y se incubaron durante 20 h. Las placas se centrifugaron 10 brevemente (200 xg durante 2 min a 22 °C) y las muestras de sobrenadante (30 pl) se retiraron para la cuantificacion de los niveles de IFNa.

Cuantificacion de IFNa utilizando la tecnologia AlphaLISA

Para la cuantificacion de IFN alfa se utilizo el Kit AlphaLISA de interferon humano (N.° AL264F) de PerkinElmer. Una mezcla de anticuerpos que contiene perlas aceptor anti-IFNa (5 pg/ml final) y anticuerpo biotinilado anti-IFNa (0.5 nM 15 final) se preparan frescos y se dispensan (5 pl) en OptiPlates™ de 384 pocillos (N.° 6007299; PerkinElmer). La dilucion de los estandares conocidos de IFNa (IFNa B humana (2b)) se prepararon y se anadieron junto con los sobrenadantes de celulas (5 pl) a las placas descritas mas arriba. Las placas se centrifugaron brevemente (pulso a 200 g), cubiertos con la pellcula de sellado adhesiva, se agitaron con vortex y se incubaron 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Las perlas donantes recubiertas de estreptavidina (20 pg/ml final) se prepararon y se 20 anadieron a cada pocillo (5 pl) en una zona oscura iluminada (mezcla sensible a la luz). Las placas se incubaron 30 min a temperatura ambiente (Las placas no deben ser centrifugadas o cubiertos). Despues de la incubacion, las placas se leyeron con un lector multidisco Envision ™equipado con la opcion ALPHA usando los propios ajustes "estandar AlphaScreen" del instrumento (por ejemplo, el tiempo total de medicion: 550 ms, Laser 680 tiempo nm de excitacion: 180 ms, espejo: D640 como, filtro de emision: M570w, centro de la longitud de onda de 570 nm, ancho de 25 banda de 100 nm, la transmitancia 75 %). Los datos fueron recogidos para el analisis y la cuantificacion de los niveles de IFNa.

Evaluacion y analisis de datos

Los datos fueron analizados utilizando el programa Excel XL fit 4.0 (Microsoft) con complemento de XLfit (IDBS; version 4.3.2). Las Concentraciones especlficas de IFNa se determinaron despues de extrapolacion a las curvas de 30 calibracion utilizando IFNa B humana (2b). Los valores individuales de CI50 de los compuestos se determinaron por regresion no lineal despues del montaje de las curvas a los datos experimentales.

3. Determinacion de la produccion de anticuerpos para eritrocitos de oveja (SRBC).

En resumen, las ratas OFA se inyectaron por via intravenosa con eritrocitos de oveja en d0 y se trataron por via oral en cuatro dlas consecutivos (D0 a D3) con los compuestos objeto de la investigation. Las suspensiones de celulas 35 de bazo se prepararon en d4 y los linfocitos se sembraron en agar blando en presencia de celulas indicadoras (SRBC) y complemento. La lisis de las celulas indicadoras, debido a la secretion de anticuerpos especlfica de SRBC (predominantemente de la subclase IgM) y la presencia de complemento produjo placas. El numero de placas por placa se contaron y se expreso como numero de placas por bazo.

Inmunizacion: Fueron inmunizadas grupos de cinco ratas OFA hembras el dla 0 con 2x108/ml de SRBC (obtenido 40 de Laboratorio Animal Services LAS, NovartisPharma AG) en un volumen de 0,5 ml por rata por via intravenosa

por inyeccion.

Tratamiento con el Compuesto: Los animales fueron tratados con el compuesto suspendido en CMC al 0,5 %, Tween ® 80 al 0,5 % por 4 dlas consecutivos (dlas 0, 1, 2 y 3) a partir del dla de la inmunizacion. El compuesto se administra por via oral dos veces al dla con 12 horas caso, los intervalos entre las dosis en un volumen de 45 aplicacion de 5 ml/kg de peso corporal.

Preparation de las suspensiones de celulas de bazo:

En el dla 4, los animales fueron sometidos a eutanasia con CO2. Los bazos se retiraron, se pesaron, y se depositaron en tubos de plastico que contienen 10 ml de solution de sal equilibrada de Hank frlo (4°C) (HBSS; Gibco, pH 7.3, que contiene 1 mg Phenolred/100ml) para cada bazo de rata. Los bazos se homogeneizaron con un 50 agitador de vidrio, se dejo en hielo durante 5 minutos y se transfirio 1 ml de sobrenadante a un nuevo tubo. Las celulas se lavaron una vez en 4 ml de HBSS a continuation, se descartaron los sobrenadantes y los pellets se resuspendieron en 1 ml de HBSS. El numero de linfocitos por el bazo se determino por el contador de celulas automatizado y se ajustaron las suspensiones de celulas de bazo a una concentracion celular de 30x106/ml.

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Ensayo de formacion de placa:

Se prepararon placas de Petri de agar suave con agarosa al 0,7 % (SERVA) en HBSS.

Ademas, se preparo un ml de agarosa al 0,7 % en tubos de plastico y se mantuvo a 48 °C en un bano de agua. En algunos se anadio 50 |jl de una suspension de celulas de bazo 30x106/ml y 50 |jl de SRBC a 40 x 108/ml, se mezcla rapidamente (Vortex) y se vierte sobre las placas preparadas de agarosa. Las placas de Petri fueron ligeramente inclinadas para lograr una distribucion uniforme de la mezcla de celulas en la capa de agarosa. Las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se incubaron a 37 °C durante 60 minutos. A continuacion, se anadio 1,4 ml complemento de cobaya (Harlan; 10 %) y la incubacion continuo durante otros 60 minutos a 37 °C. Los anticuerpos SRBC especlficos liberados por las celulas B fuera de la placa unidos al antlgeno (GRC) en sus proximidades. Estos complejos antlgeno-anticuerpo activan el complemento y condujeron a la lisis de la SRBC dejando un punto brillante (la placa) dentro de la capa roja de eritrocitos. Se contaron las placas con un microscopio.

Se utilizo la siguiente formula para la determinacion de la inhibicion de la formacion de la placa:

% de inhibicion = C * 100/V-100

con: V = numero de placas/bazo para el grupo de vehlculo, C = numero medio de placas/bazo para el grupo de compuestos tratados

Referencias:

N.K. Jerne & A.A. Nordin (1963) Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 140:405. N.K. Jerne, A.A. Nordin & C. Henry (1963) The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells. En: "Cell Bound Antibodies", B. Amos & H. Koprowski, Eds., Wistar Inst. Press, Philadelphia pp.109-125.

Datos bioloaicos

Ensayo enzimatico

Ejemplo: PI3K alfa (jM) PI3K delta (jM)

F1: 0,109 0,003

Ensayos celulares

Ejemplo: Celulas PI3K 5/CI50 [umol l-1] RWB/CI50 CD86 [nmol l-1]

F1: 0,011 7

Claims

REIVINDICACIONES

1. La forma cristalina anhidra de (1,1-dioxo-hexahidro-1-lambda*6*-tiopiran-4-il)-{(S)-3-[1-(6-metoxi-5-metil-piridin-3- il)-2,3-dihidro-1H-pirido[3,4-b][1,4]oxazin-7-iloxi]-pirrolidin-1-il}-metanona.
2. La forma cristalina anhidra de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por un patron de difraccion de rayos 5 X de polvo que comprende los siguientes picos dados en grados 2-teta +/-0,2 grados: 9,1, 10,2, 11,9, 13,0, 17,1,

17,7, 18,7, 20,3, 20,8, 26,0, 26,7, 23,2, 24,1,24,8, 29,3, 27,4 y 21,4.
3. La forma cristalina anhidra de acuerdo con la reivindicacion 1 que tiene un espectro de difraccion de rayos X como se muestra en la Figura 1.
4. La forma cristalina anhidra de acuerdo con la reivindicacion 1 que tiene un grafico de calorimetrla diferencial de 10 barrido como se muestra en muestra en la Figura 2.
5. Una forma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como un producto farmaceutico.
6. Una combinacion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una forma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y uno o mas agentes terapeuticamente activos.

15 7. Una forma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento de

enfermedades o trastornos que estan mediados por la actividad de las enzimas PI3K, preferentemente por la actividad de la isoforma PI3K5.
8. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una forma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y uno o mas vehlculos farmaceuticamente aceptables.

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