ES2643994T3 - Método para la determinación de la presencia de un antibiótico en un líquido - Google Patents

Método para la determinación de la presencia de un antibiótico en un líquido Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Metodo para la determinacion de la presencia de un antibiotico en un Ifquido Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un ensayo nuevo y mejorado de inhibicion del crecimiento microbiano para la determinacion de la presencia o la ausencia de un antibiotico en una muestra tal como leche.
Antecedentes de la invencion
Actualmente, los antibioticos se usan frecuentemente en la practica veterinaria no solamente para el tratamiento de infecciones bacterianas, sino con fines profilacticos para mejorar la productividad de los productos alimenticios. En los ultimos anos, este abuso irresponsable de los antibioticos como medida preventiva ha sido un factor decisivo para favorecer el crecimiento de resistencia bacteriana.
Se sabe que los restos de antibioticos estan entre los contaminantes mas frecuentemente detectados en la leche y en los productos lacteos y causan problemas importantes en este sector industrial a nivel economico.
Para evitar el efecto negativo de los restos de antibiotico en la salud humana y en el ecosistema completo, se han establecido lfmites maximos de residuos (MRL) para antimicrobianos en productos alimenticios de origen animal por diversos legisladores (tal como la UE). El MRL es la concentracion maxima de residuos de una sustancia farmacologicamente activa que puede permitirse en alimentos u origen animal.
Se han desarrollado ensayos de inhibicion del crecimiento microbiano para la determinacion de la presencia o la ausencia de residuos de antibioticos en una muestra. Los ejemplos de dichos ensayos se han descrito en, por ejemplo, el documento EP 0 005 891 A y el documento EP 0 285 792A. Estos ensayos descritos en los mismos son ensayos listos para su uso para hacer uso de un organismo de ensayo y una molecula indicadora, por ejemplo, un indicador de pH y/u oxidorreduccion. El principio general de este ensayo es que, cuando un antibiotico esta presente en una muestra en una concentracion suficiente para inhibir el crecimiento del organismo de ensayo, el color del indicador permanecera igual, mientras que cuando no se produce inhibicion, el crecimiento del organismo de ensayo viene acompanado por la formacion de acido o de metabolitos reducidos u otros fenomenos que induciran una senal indiciadora.
En general, un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano tiene que cumplir las siguientes especificaciones legislativas basicas e identificar de forma fiable la presencia de residuos de antimicrobianos en las muestras examinadas en concentraciones iguales a los MRL. Sin embargo, existen ensayos de inhibicion del crecimiento microbiano que son incapaces de detectar algunos residuos de antimicrobianos en sus respectivos MRL, es decir, tienen una sensibilidad limitada por ciertos antibioticos. En particular, los ensayos de inhibicion del crecimiento microbiano actualmente comercializados tienen una sensibilidad limitada por antibioticos de aminoglucosido.
En el documento EP 1 639 122A se ha descrito que la sensibilidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano puede aumentarse usando el indiciador azul de bromotimol. Sin embargo, el uso de este indiciador cambia predominantemente la sensibilidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano por los antibioticos de beta-lactama.
El documento WO 2005/005655 divulga un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano que ensaya la presencia de un antibiotico en una muestra, cuya sensibilidad se aumenta anadiendo indicadores espedficos al ensayo.
En vista de ello, aun existe la necesidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano con una sensibilidad aumentada por, por ejemplo, antibioticos de aminoglucosido.
Sumario de la invencion
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano simple, barato y facil de usar, ampliamente aplicable para la determinacion de la presencia o la ausencia de un antibiotico en una muestra tal como leche. Sorprendentemente, se ha descubierto que la sensibilidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano para antibioticos de aminoglucosido puede aumentarse cuando se anade un antibiotico de aminoglucosido tal como estreptomicina al ensayo.
Descripcion detallada de la invencion
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para detectar la presencia de un antibiotico en una muestra, comprendiendo el metodo las etapas de (a) poner en contacto la muestra con un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo, un indicador y un antibiotico de aminoglucosido, (b) cultivar el organismo de ensayo y (c) detectar la cantidad de crecimiento del
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organismo de ensayo, donde la ausencia de crecimiento refleja la presencia de un antibiotico en la muestra.
Opcionalmente, el metodo comprende la etapa de preparar el organismo de ensayo antes de poner en contacto el organismo de ensayo con la muestra. Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a un metodo para detectar la presencia o la ausencia de un antibiotico en una muestra, comprendiendo el metodo las etapas de (a) preparar un organismo de ensayo, (b) poner en contacto la muestra con un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo, un indicador y un antibiotico de aminoglucosido, (c) cultivar el organismo de ensayo y (d) detectar la cantidad de crecimiento del organismo de ensayo, donde la ausencia de crecimiento refleja la presencia de un antibiotico en la muestra.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere al uso de un antibiotico de aminoglucosido para aumentar la sensibilidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano para la determinacion de la presencia de un antibiotico en una muestra. En una realizacion, el antibiotico en la muestra es un antibiotico de aminoglucosido.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un envase cerrado que comprende al menos un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo, un indiciador y un antibiotico de aminoglucosido, donde la concentracion del antibiotico de aminoglucosido en el ensayo es de 10 ppmm a 10 000 ppmm.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un kit que comprende un antibiotico de aminoglucosido y un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo y un indiciador.
Las siguientes realizaciones son aplicables a todos los aspectos de la invencion.
En una realizacion de la invencion, el antibiotico de aminoglucosido se anade al ensayo antes de cultivar el organismo de ensayo, es decir, antes de iniciar el ensayo. Tambien puede anadirse despues del inicio del ensayo, pero esto es menos preferido. En una realizacion, el antibiotico de aminoglucosido se anade a la muestra. Esto puede hacerse antes, durante o despues de poner en contacto la muestra con el ensayo. En una realizacion preferida, el antibiotico de aminoglucosido se anade al ensayo, es decir, es parte del medio de ensayo. Preferiblemente, el antibiotico de aminoglucosido esta presente en el ensayo, es decir, en el medio de ensayo, antes de poner en contacto el ensayo con la muestra. En otras palabras, el ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano comprende el antibiotico de aminoglucosido en ausencia de muestra. Aun en otras palabras, el medio de ensayo del ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano comprende el antibiotico de aminoglucosido antes de que la muestra se anada al medio de ensayo.
El ensayo es capaz de determinar la presencia de un antibiotico en una muestra. El antibiotico a determinar puede ser un antibiotico de una familia de antibioticos que se selecciona del grupo que consiste en la familia de antibioticos de beta-lactama, la familia de antibioticos de tetraciclina, la familia de antibioticos de sulfonamida, la familia de antibioticos de aminoglucosido, la familia de antibioticos de macrolido, la familia de lincosamidas y la familia de antibioticos de quinolona. Sin embargo, el ensayo tambien puede usarse para detectar otros antibioticos diferentes a los mencionados anteriormente.
Debido a la presencia de un antibiotico de aminoglucosido en el ensayo, la sensibilidad del ensayo por antibioticos de aminoglucosido tal como estreptomicina y dihidroestreptomicina aumenta. Sorprendentemente, se descubrio que la presencia del antibiotico de aminoglucosido en el ensayo no tema efecto sobre la sensibilidad del ensayo por otras clases de antibioticos tales como beta-lactamas (por ejemplo, penicilina G) y tetraciclinas (por ejemplo, oxitetraciclina). La presencia de un antibiotico de aminoglucosido en el ensayo, por tanto, aumenta espedficamente la sensibilidad del ensayo por antibioticos de aminoglucosido.
En una realizacion, el antibiotico de aminoglucosido se selecciona del grupo que consiste en estreptomicina, dihidroestreptomicina, amikacina, apramicina, arbekacina, astromicina, bekanamicina, dibekacina, framicetina, gentamicina, higromicina B, isepamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, rodoestreptomicina, riboestamicina, sisomicina, espectinomicina, tobramicina y verdamicina. La expresion "antibiotico de aminoglucosido" tambien incluye mezclas de dos o mas antibioticos diferentes de aminoglucosido. Por ejemplo, puede usarse cualquier combinacion de dos o mas antibioticos del grupo mencionado anteriormente. En una realizacion preferida, el antibiotico de aminoglucosido usado en los diversos aspectos de la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en estreptomicina y dihidroestreptomicina.
En una realizacion, la concentracion del antibiotico de aminoglucosido es entre 10 ppmm y 10 000 ppmm, preferiblemente entre 100 ppmm y 10 000 ppmm y mas preferiblemente entre 500 ppmm y 5 000 ppmm. A efectos de clarificacion exclusivamente, los intervalos de concentracion mencionados se refieren a la concentracion de antibiotico de aminoglucosido en el ensayo en ausencia de muestra.
En una realizacion, el ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano comprende un indicador. En otras palabras, el indicador esta presente en el medio de ensayo. El termino "indiciador" se refiere a una sustancia usada para medir
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(por ejemplo, por cambio de color o por fluorescencia) el estado de un medio de ensayo con respecto a la presencia de un componente particular (por ejemplo, un acido, una base, agentes oxidantes o reductores). Son particularmente utiles indicadores que, tras cambiar de un estado a otro, proporcionan una senal visualmente detectable tal como un cambio en el color o fluorescencia. La cantidad de indicador en el medio de ensayo es generalmente entre 0,01 y 50 g/l de medio de ensayo, preferiblemente de entre 0,1 y 10 g/l, mas preferiblemente de entre 0,5 y 5 g/l, mucho mas preferiblemente de entre 1 y 3 g/l. El indicador puede ser un indicador de pH, un indicador de oxidorreduccion o una combinacion de los mismos. El termino tambien puede hacer referencia a dos o mas indicadores. Los expertos en la materia apreciaran que son adecuados muchos indicadores para el proposito de la presente invencion. Los ejemplos de indicadores adecuados pueden encontrarse en el manual H.J. Conn's Biological Stains, R.D. Lillie ed., Baltimore, 1969.
El ensayo puede tener la forma de un lfquido, un solido o una matriz de tipo gel. En una realizacion de la invencion, el ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano comprende ademas un agente gelificante. La expresion "agente gelificante", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto que ayuda a cambiar una mezcla en un gel o a adoptar la forma de un gel. Los ejemplos de agentes gelificantes adecuados en los diversos aspectos de la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, agar, gelatina, acido algmico y sales del mismo, carragenina, algarrobina (goma de algarrobo) hidroxipropil guar y derivados de la misma, alga Eucheuma procesada y similares. el agar es el agente gelificante preferido. En una realizacion, se introduce un organismo de ensayo y un indicador y opcionalmente otros ingredientes adicionales tales como el antibiotico de aminoglucosido en una solucion de agar. La solucion de agar se deja solidificar para formar el medio de ensayo de modo que el organismo de ensayo permanezca vivo, pero no pueda multiplicarse a causa de, por ejemplo, la baja temperatura. En general, el agente gelificante constituira una gran parte del medio de ensayo. La cantidad de agente gelificante en el ensayo es generalmente entre 1 y 200 g/l de medio de ensayo, preferiblemente de entre 2 y 50 g/l, mas preferiblemente de entre 5 y 20 g/l, mucho mas preferiblemente de entre 7 y 15 g/l.
Cuando el medio de ensayo tiene la forma de una matriz solida, puede comprender un material de vetnculo tal como ceramica, algodon, vidrio, una partfcula metalica, un polfmero de cualquier condicion o forma, un silicato, una esponja, lana y similares. Como alternativa, el ensayo puede tener la forma de un comprimido, disco o filtro de papel que comprende el organismo de ensayo, el indicador y opcionalmente nutrientes. Los tres constituyentes pueden estar presentes en un unico comprimido, pero tambien en dos o mas comprimidos. Por supuesto, pueden usarse los sistemas de ensayo que combinan medios de ensayo en forma solida, lfquida y/o de tipo gel.
Opcionalmente, el ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano tambien puede contener nutrientes, estabilizantes, sales, tampones y/o agentes que aumentan la viscosidad. El termino "nutriente" como se usa en este documento se refiere a una sustancia nutritiva o un ingrediente que promueve y/o es necesario para el crecimiento del organismo de ensayo. Los nutrientes adecuados dependen del microorganismo usado en el sistema de ensayo. El medio de ensayo puede comprender dos o mas nutrientes diferentes. Incluyen, aunque sin limitacion, fuentes de carbono asimilables tales como carbohidratos tales como, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa y dextrosa; fuentes de nitrogeno asimilables tales como aminoacidos tales como, por ejemplo, peptona o triptona; fuentes de vitaminas y factores de crecimiento tales como extracto de ternera o levaduras; y fuentes de minerales tales como sales de metales alcalinoterreos tales como sales de, por ejemplo, bario o calcio. Los ingredientes adicionales adecuados que pueden estar presentes en el ensayo de acuerdo con la presente invencion son conocidos para los expertos en la materia e incluyen, aunque sin limitacion, otros agentes (diferentes de un antibiotico de aminoglucosido) que aumentan o disminuyen la sensibilidad del ensayo por antibioticos.
En una realizacion de la invencion, el organismo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en una especie de Bacillus, una especie de Escherichia y una especie de Streptococcus. "Organismo de ensayo" como se usa en este documento tambien incluye esporas, por ejemplo, esporas de cualquiera de estas especies. En una realizacion preferida de la invencion, el organismo de ensayo es termofilo. Los ejemplos son Bacillus stearothermophilus o Streptococcus thermophilus, siendo preferido Bacillus stearothermophilus. Estas especies pueden introducirse en el ensayo como unidades capaces de producir colonias o unidades formadoras de colonias (UFC). El termino "UFC" como se usa en este documento se refiere a la cantidad de organismos de ensayo, esporas de organismo de ensayo, esporas parcialmente germinadas de organismos de ensayo, celulas vegetativas o cualquier mezcla de las mismas capaces de producir colonias de organismos. La concentracion de dichas UFC se expresa como unidades formadoras de colonia por ml de medio de ensayo (UFC/ml) y esta habitualmente en el intervalo de 1 x 105 a 1 x 1012 UFC/ml, preferiblemente de 1 x 106 a 1 x 1010 UFC/ml, mas preferiblemente de 2 x 106 a 1 x 10g UFC/ml, mucho mas preferiblemente de 5 x 106 a 1 x 108 UFC/ml o aun mas preferiblemente de 5 x 106 a 2 x 107 UFC/ml.
En una realizacion de la invencion, la muestra puede obtenerse de un lfquido corporal, de un organo, de carne o de huevos. Los antibioticos tambien podnan estar presentes en productos alimenticios en que se anaden estos productos animales como ingrediente. Los ejemplos de productos alimenticios son leche, productos lacteos procesados (por ejemplo, nata, yogur); carne de vaca, de cerdo, de aves de corral y de pescado; mariscos tales como langostinos; tngado; productos carnicos procesados tales como salchichas; comidas listas para comer y alimentos para bebes. Los antibioticos tambien podnan estar presentes en lfquidos corporales o en tejidos animales, que son adecuados para examen por, por ejemplo, autoridades de inspeccion alimentaria. Los ejemplos son sangre, tejido renal o preorina obtenidos del rinon y de la orina. La orina y la sangre son adecuados para examen antes del
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sacrificio del animal. Los antibioticos tambien pueden estar presentes en agua residual, en agua de cualquier tipo de industria, etc. En una realizacion preferida, la muestra es orina, sangre, huevo, miel, rinon, carne, tngado, pescado, langostino, pienso y/o leche, siendo la leche la mas preferida. la leche puede obtenerse de vacas, pero tambien de ovejas, cabras, yaks, bufalo de agua, caballos, renos y camellos. En una realizacion preferida, la muestra es una muestra lfquida. En una realizacion, la muestra podna no ser lfquida y un lfquido que comprende el antibiotico o antibioticos tiene que extraerse de la muestra.
Preferiblemente, hay minima o ninguna germinacion y crecimiento del organismo de ensayo antes de la adicion de la muestra lfquida. Esto se consigue clasificando y manteniendo el ensayo en condiciones que comprenden una temperatura desfavorable y/o un valor de pH desfavorable y/o la ausencia de nutrientes esenciales para la germinacion y el crecimiento del organismo de ensayo. Por supuesto, las condiciones no deben causar dano irreversible a todas las UFC presentes en el ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano.
Despues de poner en contacto la muestra con el organismo de ensayo, se permite que tenga lugar el crecimiento del organismo de ensayo durante un periodo suficientemente largo para que los organismos de ensayo crezcan en caso de que no haya antibiotico presente. El periodo puede determinarse incluyendo una muestra de control, es decir, una muestra que esta libre de antibioticos, y finalizando la incubacion de todas las muestras ensayadas cuando el ensayo que mide la muestra de control ha cambiado de color. Tambien puede decidirse incubar todas las muestras durante un periodo fijo de tiempo. El crecimiento se induce anadiendo nutrientes, opcionalmente antes de poner en contacto dicha muestra, y/o elevando la temperatura y/o proporcionando un valor de pH en que el organismo de ensayo sea capaz de crecer. Como alternativa, estas condiciones pueden establecerse antes del contacto de la muestra lfquida con el organismo de ensayo. Por ejemplo, el crecimiento del organismo de ensayo puede tener lugar cuando el organismo de ensayo se incuba a una temperatura que conduce al crecimiento del organismo de ensayo.
La ausencia del crecimiento refleja la presencia de un antibiotico en la muestra, mientras que el crecimiento refleja la ausencia de un antibiotico en una muestra. Como se indica anteriormente, la presencia de un antibiotico se determina por un cambio del indicador o de los indicadores usados. Habitualmente, cuando hay un antibiotico presente en una muestra, no hay cambio en el indiciador. Cuando no hay antibiotico presente en una muestra, se producira crecimiento microbiano produciendo un cambio de indicador. Cuando, por ejemplo, dicho cambio es un cambio de color, dicho cambio de color puede observarse visualmente. Sin embargo, dicho cambio de color tambien puede determinarse usando una disposicion que genera datos de imagen digital o una disposicion que genera datos de imagen analogica y convierte dichos datos de imagen analogica en datos de imagen digital seguido por interpretacion de dichos datos de imagen digital por un procesador informatico. Un ejemplo de dicha disposicion, es decir, un dispositivo de lectura de muestras tal como un escaner acoplado a un ordenador personal, se describe en el documento WO 03/033728. Otro ejemplo de dicha disposicion, es decir, un dispositivo combinado de incubacion de la muestra y lectura de la muestra (tal como un escaner combinado con una incubadora) acoplado a un ordenador personal se describe en el documento WO 2007/090683.
Opcionalmente, ciertos ingredientes de ensayo se esterilizan y habitualmente el pH del ensayo se ajusta al valor requerido. Opcionalmente, las muestras pueden mezclarse (por ejemplo, con otras muestras, pero tambien con sales, compuestos tamponantes, nutrientes, estabilizantes, enzimas y similares), concentradas y/o diluidas (por ejemplo, con lfquidos de dilucion tales como agua, disolventes y similares) antes de la adicion al organismo de ensayo.
En una realizacion de la invencion, el organismo de ensayo se cultiva incubandolo durante un periodo predeterminado, preferiblemente en un marco de tiempo de 0,5 a 6 horas, mas preferiblemente entre 0,75 a 5 horas, mucho mas preferiblemente entre 1,0 a 4 horas y en particular entre 2 y 3,5 horas. Preferiblemente, el organismo de ensayo se incuba a una temperatura predeterminada, preferiblemente la temperatura optima de crecimiento del organismo de ensayo. Cuando, por ejemplo, se usan organismos de ensayo termofilos, dicha temperatura es preferiblemente entre 40 y 70°C, mas preferiblemente entre 50 y 65°C, mucho mas preferiblemente entre 60 y 64°C. Opcionalmente, dicha reaccion puede realizarse con la ayuda de un dispositivo termostatico. Como alternativa, el tiempo necesario para el crecimiento del organismo de ensayo es igual al tiempo que se requiere para que una muestra de calibracion con una cantidad conocida de antibiotico induzca un cambio en el indicador o el tiempo es necesario para que una muestra de control sin antibiotico induzca un cambio en el indicador.
En una realizacion de la invencion, hay al menos un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano presente en un envase. El ensayo comprende al menos un organismo de ensayo, un indicador y un antibiotico de aminoglucosido, donde la concentracion del antibiotico de aminoglucosido en el ensayo es de 10 ppmm a 10 000 ppmm.
En una realizacion preferida, el envase esta cerrado. "Cerrado" como se usa en este documento significa que el ensayo o los ensayos que estan presentes dentro del envase no han estado aun en contacto con una muestra. El envase puede ser una caja o cualquier otra unidad de envasado adecuada. Puede fabricarse de cualquier material adecuado para fabricar unidades de envasado. Preferiblemente, el envase comprende mas de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano. El ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano puede estar presente en un recipiente. El recipiente puede tener cualquier forma y tamano y puede ser de cualquier material disponible, con la condicion de que sea posible la observacion de los cambios del indicador. El recipiente puede ser un tubo (por
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ejemplo, una ampolla), pero tambien puede ser un pocillo tal como un pocillo que es parte de una placa, por ejemplo, una placa de microvaloracion, es decir, una placa plana con multiples pocillos. El envase cerrado puede comprender, por ejemplo, 5 placas, 10 placas o 20 placas y/o 25 tubos o 100 tubos.
El envase puede comprender ademas un dispositivo de muestreo. Un dispositivo de muestreo es un dispositivo con la ayuda del cual puede anadirse lfquido al ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitacion, una jeringa, una pipeta o un sistema automatizado de pipeteo. Dicha jeringa o pipeta puede estar disenada de tal manera que con solamente un modo de operacion pueda extraerse un volumen predeterminado de la muestra de lfquido a analizar. Opcionalmente, pueden aplicarse sistemas conocidos en la tecnica con los que puede manejarse mas de una jeringa o pipeta con una unica manipulacion. Opcionalmente, el envase comprende ademas un medio para precintar los recipientes despues de haber anadido la muestra a los recipientes y/o durante la incubacion de los recipientes. Ademas, el envase puede comprender un adjunto con instrucciones para su uso y/o un medio para establecer el tiempo necesario para la incubacion.
La invencion tambien se refiere a un kit que comprende (a) un antibiotico de aminoglucosido y (b) un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano. Como se indica anteriormente, el ensayo puede estar presente en un recipiente. El antibiotico de aminoglucosido tambien puede estar presente en un recipiente. El antibiotico de aminoglucosido puede anadirse al ensayo poco antes de usar el ensayo.
Opcionalmente, la relacion de la muestra al medio de ensayo excede 2:3 (0,68:1) (v/v). Preferiblemente, dicha relacion es de al menos 20:27 (0,74:1) (v/v), mas preferiblemente dicha relacion es de al menos 25:27 (0,93:1) (v/v); mucho mas preferiblemente dicha relacion es de al menos 2:1 (v/v). Se ha descubierto que no hay razones tecnicas para un lfmite superior a la cantidad de muestra. En la practica, este volumen no debe exceder el contenido maximo del recipiente que aloja el medio de ensayo. Por ejemplo, en un recipiente de 2 ml que tiene 0,2 ml de medio de ensayo, no debe anadirse mas de 1,8 ml de muestra de lfquido. En la practica, los recipientes para realizar el metodo de la presente invencion tienen un volumen que pocas veces excede de 50 ml y, por tanto, la cantidad de muestra de lfquido a anadir no debe exceder 50 ml, preferiblemente 10 ml, mas preferiblemente 5 ml, aun mas preferiblemente 2 ml, mucho mas preferiblemente 1 ml. Por tanto, en general, el lfmite superior de la relacion del volumen de muestra de lfquido a volumen de medio de ensayo es 250:1 (v/v), preferiblemente 50:1 (v/v), mas preferiblemente 25:1 (v/v), aun mas preferiblemente 10:1 (v/v), mucho mas preferiblemente 5:1 (v/v). En una realizacion preferida, el volumen de la dilucion/muestra es mayor que el volumen del medio de ensayo.
Opcionalmente, el envase puede comprender ademas un dispositivo termostatico, con la ayuda del cual las muestras pueden mantenerse a una temperatura prestablecida, tal como la temperatura a la el organismo de ensayo muestra suficiente crecimiento. Preferiblemente, dicho dispositivo termostatico se disena de tal manera que puede alojar los recipientes. Opcionalmente, el dispositivo termostatico esta acoplado a un medio para establecer el tiempo necesario para la incubacion, de modo que se detiene el calentamiento y/o la refrigeracion una vez transcurrido un periodo preestablecido.
Opcionalmente, el envase comprende ademas un soporte de datos cargado con un programa informatico adecuado para dar instrucciones a un ordenador para analizar los datos digitales obtenidos de un dispositivo de lectura de muestra. Dicho soporte de datos puede ser cualquier soporte adecuado para el almacenamiento de informacion digital tal como un CD-ROM, un disquete, un DVD, una tarjeta de memoria extrafble, una cinta magnetica o similares. De forma ventajosa, dicho soporte de datos cargado con un programa informatico proporciona acceso facil a los ultimos programas informaticos disponibles adecuados para su uso en el metodo de la presente invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1
Efecto de un antibiotico de aminoglucosido en el medio de ensayo sobre el limite de deteccion de antibioticos de aminoglucosido en un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano
Para establecer el efecto de un antibiotico de aminoglucosido sobre la sensibilidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano por antibioticos de aminoglucosido, se realizo la siguiente serie de experimentos.
Como referencia, se uso un sistema de ensayo disponible en el mercado sin ningun antibiotico de aminoglucosido anadido (DSM Delvotest® SP-NT, placas que contienen 8 x 12 pocillos de ensayo). Ademas, se prepararon dos sistemas de ensayo diferentes modificando el ensayo de referencia anadiendo el antibiotico de aminoglucosido estreptomicina al medio de ensayo en una concentracion final de 100 ppmm o de 1000 ppmm.
Se midieron los lfmites de deteccion de cuatro antibioticos diferentes en el ensayo de referencia y en los ensayos con medio modificado que contiene diferentes concentraciones de estreptomicina. Los antibioticos que se midieron fueron estreptomicina y dihidroestreptomicina (DH-estreptomicina) (ambos pertenecientes a la familia de antibioticos de aminoglucosido), penicilina G (perteneciente a la familia de antibioticos de beta-lactama) y oxitetraciclina (perteneciente a la familia de antibioticos de tetraciclina). Se midieron cinco concentraciones diferentes de cada
5
10
15
20
25
antibiotico (vease la tabla 1). Se anadieron cien microlitros de leche sin antibiotico o cien microlitros de leche con adiciones de las concentraciones respectivas de antibiotico al medio de ensayo (170 jl) y se incubaron a 64°C en un bano de agua.
Los ensayos se determinaron visualmente en el punto en el tiempo en que una muestra sin antibiotico habfa cambiado de color de purpura a amarillo. En este punto, las placas se refrigeraron en un bano de hielo durante 5 minutos. Las placas enfriadas se exploraron en un escaner Delvo®. El color de cada pocillo se expreso como un valor Z; un color purpura da lugar a un valor Z positivo, mientras que un color amarillo tiene un valor Z negativo. El valor Z de los resultados de ensayo con muestras sin antibiotico es tfpicamente -5 < Z < -10. La descripcion detallada de la tecnologfa de exploracion y la expresion del color en valores Z se describen en el documento WO 03/033728.
Para la determinacion del lfmite de deteccion para cada antibiotico, se construyo una funcion de respuesta a dosis (valor Z frente a la concentracion de antibiotico). El lfmite de deteccion se define como la concentracion de antibiotico en la que la funcion de respuesta a dosis con forma de S tiene un valor Z igual al valor de corte. Para Delvotest® SP-NT se uso un valor Z de corte de 0. Los lfmites de deteccion calculados se resumen en la tabla 2.
Los resultados muestran claramente que la adicion de un antibiotico de aminoglucosido al medio de ensayo provoca que el sistema de ensayo tenga una sensibilidad fuertemente aumentada por antibioticos de aminoglucosido, mientras que la sensibilidad por antibioticos de beta-lactama y antibioticos de tetraciclina permanece inalterada.
Tabla 1: concentracion de antibiotico de las muestras de leche con adiciones
Estreptomicina (en ppmm)
DH-estreptomicina (en ppmm) Penicilina G (en ppmm) Oxitetraciclina (en ppmm)
0
0
0
0
100
100
0,3 50
200
200
1,0 100
500
500
2,0 200
1000
1000
3,0 300
2500
2500
4,0 500
Tabla 2: lfmite de deteccion de diferentes antibioticos en Delvotest® SP-NT que contienen diferentes
concentraciones de estreptomicina
Concentracion de estreptomicina en el ensayo (en ppmm)
Lfmite de deteccion (en ppmm)
Estreptomicina
DH-estreptomicina Penicilina G Oxitetraciclina
0
2005 1471 1,04 264
100
1186 982 0,96 239
1000
676 445 1,07 343

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar la presencia de un antibiotico en una muestra, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) poner en contacto la muestra con un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo, un indicador y un antibiotico de aminoglucosido,
    (b) cultivar el organismo de ensayo, y
    (c) detectar la cantidad de crecimiento del organismo de ensayo, en el que la ausencia de crecimiento refleja la presencia de un antibiotico en la muestra,
    en el que el medio de ensayo del ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano comprende el antibiotico de aminoglucosido antes de anadir la muestra al medio de ensayo.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el antibiotico de aminoglucosido se selecciona del grupo que consiste en estreptomicina, dihidroestreptomicina, amikacina, apramicina, arbekacina, astromicina, bekanamicina, dibekacina, framicetina, gentamicina, higromicina B, isepamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, rodoestreptomicina, riboestamicina, sisomicina, espectinomicina, tobramicina y verdamicina.
  3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el indicador es un indicador de pH y/o un indicador de oxidorreduccion.
  4. 4. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el organismo de ensayo se selecciona del grupo que consiste en una especie de Bacillus, una especie de Escherichia y una especie de Streptococcus.
  5. 5. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la muestra es una muestra de lfquido.
  6. 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la muestra es leche.
  7. 7. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el organismo de ensayo es termofilo.
  8. 8. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ensayo comprende ademas un agente gelificante.
  9. 9. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la concentracion del antibiotico de aminoglucosido es de 10 ppmm a 10 000 ppmm.
  10. 10. Uso de un antibiotico de aminoglucosido para aumentar la sensibilidad de un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano para la determinacion de la presencia de un antibiotico en una muestra.
  11. 11. Uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el antibiotico en la muestra es un antibiotico de aminoglucosido.
  12. 12. Un envase cerrado que comprende al menos un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo, un indicador y un aminoglucosido, en el que la concentracion del antibiotico de aminoglucosido en el ensayo es de 10 ppmm a 10 000 ppmm.
  13. 13. Un envase cerrado de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que el ensayo esta presente en un tubo o en un pocillo de una placa.
  14. 14. Un kit que comprende:
    a) un antibiotico de aminoglucosido, y
    b) un ensayo de inhibicion del crecimiento microbiano, comprendiendo dicho ensayo al menos un organismo de ensayo y un indicador.
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