ES2644055T3 - Moléculas terapéuticas y de diagnóstico - Google Patents

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Mathew Vadas
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Jennifer Young
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Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biology
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Centenary Inst Of Cancer Medicine And Cell Biology
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Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biology
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Abstract

Un miARN que comprende una región semilla que comprende la secuencia UCACAGU (SEQ ID NO: 37), o uno de sus precursores o una de sus variantes, para su uso en el tratamiento de una afección asociada a una angiogénesis excesiva o no regulada, necesitando dicha afección la inhibición de la angiogénesis en un sujeto.

Description

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Se entenderá que, como se usa en el presente documento, el término "expresión" puede referirse a la expresión de un polipéptido o de una proteína, o a la expresión de un polinucleótido o de gen, dependiendo del contexto. El polinucleótido puede ser codificante o no codificante (por ejemplo, miARN). La expresión de un polinucleótido se puede determinar, por ejemplo, midiendo la producción de niveles de transcripción de ARN. La expresión de una proteína o de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, mediante inmunoensayo usando uno o varios anticuerpos que se une/n con el polipéptido.
Como se usa en el presente documento, la expresión "especies de miARN" se refiere a un microARN de una secuencia de nucleótidos específica. Las expresiones "especies de miARN", "miARN" y "molécula de miARN" se pueden usar indistintamente en el presente documento. Los expertos en la materia reconocerán que la referencia a un miARN o a una molécula de miARN no significa una sola molécula (numérica), sino más bien un solo tipo o especie de molécula.
Como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia monocatenaria de bases ribonucleotídicas o desoxirribonucleotídicas, análogos conocidos de nucleótidos naturales o mezclas de los mismos. Un "oligonucleótido" comprende una molécula basada en ácido nucleico que incluye ADN, ARN, PNA, LNA
o cualquier combinación de los mismos. Un oligonucleótido que comprende predominantemente bases ribonucleotídicas, naturales o no naturales, se puede denominar un oligonucleótido de ARN. Los oligonucleótidos son normalmente secuencias cortas (por ejemplo, menos de 50 nucleótidos de longitud) que pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, síntesis química directa o clonación y restricción de secuencias apropiadas. Los "oligonucleótidos antisentido" son oligonucleótidos complementarios a una secuencia específica de ADN o ARN. Por lo general, en el contexto de la presente invención, un oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido de ARN complementario a un miARN específico. El oligonucleótido antisentido se une y silencia o reprime, parcial o completamente, la actividad de su miARN complementario. No todas las bases de un oligonucleótido antisentido necesitan ser complementarias a la secuencia “diana” o de miARN; el oligonucleótido solo necesita contener suficientes bases complementarias para permitir que el oligonucleótido reconozca la diana.
Un oligonucleótido también puede incluir bases adicionales. La secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser una secuencia ribonucleotídica sin modificar o puede modificarse químicamente o conjugarse mediante una variedad de medios como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas, ribonucleotídicas o análogos conocidos de nucleótidos naturales o mezclas de los mismos. Un "polinucleótido" comprende una molécula basada en ácido nucleico que incluye ADN, ARN, PNA, LNA o cualquier combinación de los mismos. El término incluye la referencia a la secuencia especificada, así como a la secuencia complementaria a la misma, a menos que se indique lo contrario. Los polinucleótidos pueden modificarse químicamente mediante una variedad de medios conocidos por los expertos en la materia. Así pues, un "polinucleótido" comprende una molécula basada en ácido nucleico que incluye ADN, ARN, PNA, LNA o cualquier combinación de los mismos.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a mamíferos e incluye seres humanos, primates, animales de ganado (por ejemplo, ovejas, cerdos, ganado, caballos, burros), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayas) animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) y animales salvajes en cautiverio (por ejemplo, zorros, canguros, ciervos). Preferentemente, el mamífero es un ser humano o un animal de ensayo de laboratorio. Incluso más preferentemente, el mamífero es un ser humano.
Como se usan en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", "prevenir" y "prevención" se refieren a todos y cada uno de los usos que remedian una afección o sus síntomas, previenen el establecimiento de una afección o enfermedad, o previenen, obstaculizan, retardan o revierten la progresión de una afección o enfermedad u otros síntomas no deseados de cualquier manera. Por lo tanto, los términos "tratar" y "prevenir" y similares deben considerarse en su contexto más amplio. Por ejemplo, el tratamiento no implica necesariamente que un paciente sea tratado hasta su recuperación total. En las afecciones que presentan o se caracterizan por múltiples síntomas, el tratamiento o la prevención no necesariamente tiene que remediar, prevenir, obstaculizar, retardar o revertir la totalidad de dichos síntomas, sino que puede prevenir, obstaculizar, retrasar o revertir uno o más de dichos síntomas.
Como se ilustra en el presente documento, los inventores han determinado que el nivel de expresión de un grupo de miARN específicos se regula negativamente de forma rápida y significativa tras la inducción de condiciones angiogénicas en cultivo celular. En el presente documento, se demuestra que la sobreexpresión de al menos uno de estos miARN inhibe la formación de vasos sanguíneos. Los hallazgos descritos en el presente documento ofrecen nuevas dianas terapéuticas para la modulación de la angiogénesis y vías para el tratamiento, la prevención y el diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis anómala.
El miARN descrito en el presente documento como regulado negativamente durante la angiogénesis incluye: miR_27a, miR_27b, miR_24, miR_23a, miR_23b, miR_20a, miR_21, miR_29a, miR_29b, miR_29c, miR_106a, miR_126, miR_193a, miR_195, miR_197, miR_221, miR_347 y miR_126*.
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que son capaces de escindir productos de la transcripción de miARN. Las ribozimas, por ejemplo, están dirigidas a,
o se hibridan con, una determinada secuencia, en virtud de dos regiones de complementariedad de secuencia con la diana que flanquea el sitio catalítico de ribozima. Tras la unión, la ribozima escinde la diana de una manera específica del sitio. El diseño y ensayo de ribozimas que reconocen y escinden específicamente las secuencias de miARN se pueden realizar mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, Lieber y Strauss, (1995) Mol. Cell. Biol. 15:540-551).
Los expertos en la materia también reconocerán que un antagonista de acuerdo con realizaciones de la invención puede efectuar un modulador o regulador de la expresión o actividad de un miARN desvelado en el presente documento. De forma similar, el antagonista puede efectuar una diana de un miARN desvelado en el presente documento. De este modo, los antagonistas pueden adoptar cualquier forma adecuada, dependiendo de la naturaleza e identidad de la/s molécula/s que se van a afectar, tales como, por ejemplo, un inhibidor de molécula pequeña, un inhibidor de péptido o un anticuerpo.
Las realizaciones de la presente invención se refieren a métodos y a composiciones para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis anómala, como se define en el presente documento. La angiogénesis anómala puede ser excesiva o no regulada, o puede ser alterada o suprimida. Por lo tanto, dichos tratamientos normalmente se diseñan para modular la angiogénesis con el fin de normalizar el nivel, el tiempo y/o la ubicación de la angiogénesis y así tratar o retrasar la progresión de la enfermedad o afección. Las realizaciones de la invención también contemplan métodos para la prevención de enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis anómala, normalmente en un sujeto predispuesto a dicha enfermedad o afección, o, de otro modo, en riesgo de desarrollar dicha enfermedad o afección.
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente el alcance completo de enfermedades y afecciones que pueden estar asociadas con la angiogénesis anómala y a las que pueden dirigirse las realizaciones de la invención. A modo de ejemplo no limitante, las enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis excesiva o regulada positivamente, y por lo tanto, en las que se puede desear la inhibición de la angiogénesis de acuerdo con realizaciones de la invención, incluyen cáncer (tumores sólidos y hematológicos), enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis y restenosis, trastornos inflamatorios crónicos tales como artritis reumatoide y enfermedad de Crohn, trastornos oculares tales como retinopatía diabética, glaucoma y degeneración macular (incluyendo degeneración macular relacionada con la edad), endometriosis, soriasis y adiposidad. De igual manera, como ejemplo no limitante, las circunstancias en las que se pueda desear la potenciación de la angiogénesis de acuerdo con realizaciones de la invención incluyen la cicatrización de heridas, tal como el tratamiento de heridas isquémicas, en el tratamiento de algunos trastornos ginecológicos e infertilidad, en el tratamiento de la enfermedad de las arterias coronarias, en la prevención de ictus, en la reparación o regeneración de tejidos y en la ingeniería de tejidos.
En el caso de la ingeniería de tejidos, la generación de grandes volúmenes de tejido requiere una vascularización rápida de construcciones de armazón tridimensionales. El papel de miR_27a en la angiogénesis en un medio tridimensional, como se ilustra en el presente documento, sugiere la posible aplicación de la inhibición de miARN tal como miR_27a en la potenciación de la angiogénesis en armazones de obtención de tejido mediante ingeniería genética.
De acuerdo con realizaciones de la invención, el miARN y sus antagonistas administrados para conseguir la inhibición o potenciación de la angiogénesis pueden administrarse en cualquier forma adecuada. Por lo general, se administrarán como composiciones farmacéuticas, cuyas composiciones pueden comprender uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden administrarse en cualquier vía conveniente o adecuada, tal como a través de la vía parenteral, oral, nasal o tópica. Así pues, las composiciones se pueden formular en una variedad de formas adecuadas para la vía de administración escogida, por ejemplo, como cápsulas, comprimidos, comprimidos oblongos, elixires para la ingestión oral, en forma de aerosol adecuada para la administración por inhalación (tal como por inhalación intranasal o inhalación oral), pomada, crema o loción adecuada para la administración tópica, o en una formulación inyectable adecuada para la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa. La vía de administración preferida dependerá de una serie de factores que incluyen la afección que se vaya a tratar y el resultado deseado. La vía más ventajosa para cualquier circunstancia dada puede ser determinada por los expertos en la materia.
Se entenderá que el nivel de dosis específico de una composición para cualquier individuo en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen, por ejemplo, la actividad de los agentes específicos empleados, la edad, el peso corporal, la salud general y la dieta del individuo que se vaya a tratar, el momento de la administración, la tasa de excreción y la combinación con cualquier otro tratamiento o terapia. Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples con niveles de dosis y patrón seleccionados por el médico tratante.
Los ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables son agua desmineralizada o destilada; solución salina; aceites de base vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceites de sésamo tales como aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo, aceite de cacahuete o aceite de coco; aceites de silicona, incluyendo polisiloxanos, tales como metil-polisiloxano, fenil-polisiloxano y metilfenil
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polisolpoxano; siliconas volátiles; aceites minerales tales como parafina líquida, parafina blanda o escualano; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo, etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; ésteres de ácidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpiridona; agar; carragenano; goma de tragacanto o goma arábiga y vaselina. Por lo general, el vehículo o los vehículos formarán del 10 % al 99,9 % en peso de las composiciones.
Las composiciones pueden estar en una forma adecuada para la administración parenteral o en forma de una formulación adecuada para la ingestión oral (tales como cápsulas, comprimidos, comprimidos oblongos, elixires, por ejemplo).
Algunos ejemplos de vehículos, diluyentes, excipientes y adyuvantes adecuados para un uso oral incluyen aceite de cacahuete, parafina líquida, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato sódico, goma arábiga, goma tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, gelatina y lecitina. Además, estas formulaciones orales pueden contener agentes aromatizantes y colorantes adecuados. Cuando se usan en forma de cápsulas, las cápsulas pueden recubrirse con compuestos tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, que retardan la desintegración. Los adyuvantes normalmente incluyen emolientes, emulsionantes, agentes espesantes, conservantes, bactericidas y agentes de tamponamiento. Para la administración como una solución o suspensión inyectable, los diluyentes o vehículos no tóxicos aceptables por vía parenteral pueden incluir solución de Ringer, solución salina isotónica, solución salina tamponada con fosfato, etanol y 1,2-propilenglicol.
Las formas sólidas para la administración oral pueden contener aglutinantes aceptables en la práctica farmacéutica humana y veterinaria, edulcorantes, agentes desintegrantes, diluyentes, aromatizantes, agentes de recubrimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes retardantes en el tiempo. Los aglutinantes adecuados incluyen goma arábiga, gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa o polietilenglicol. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo o sacarina. Los agentes desintegrantes adecuados incluyen almidón de maíz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma de guar, goma de xantano, bentonita, ácido algínico o agar. Los diluyentes adecuados incluyen lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato cálcico, silicato cálcico o fosfato dicálcico. Los agentes aromatizantes adecuados incluyen aceite de menta, aceite de gaulteria, y aroma de cereza, naranja o frambuesa. Los agentes de recubrimiento adecuados incluyen polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zeína, goma laca o gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato de sodio, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabeno, propilparabeno o bisulfito sódico. Los lubricantes adecuados incluyen estearato de magnesio, ácido esteárico, oleato sódico, cloruro sódico o talco. Los agentes retardantes en el tiempo adecuados incluyen monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formas líquidas para la administración oral pueden contener, además de los agentes anteriores, un vehículo líquido. Los vehículos líquidos adecuados incluyen agua, aceites tales como aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de cacahuete, aceite de coco, parafina líquida, etilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, triglicéridos o mezclas de los mismos.
Las suspensiones para la administración oral pueden comprender además agentes dispersantes y/o agentes de suspensión. Los agentes de suspensión adecuados incluyen carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, alginato sódico o alcohol acetílico. Los agentes dispersantes adecuados incluyen lecitina, ésteres de polioxietileno de ácidos grasos tales como ácido esteárico, mono-o dioleato, -estearato o -laurato de polioxietilen-sorbitol, mono-o di-oleato, -estearato o -laurato de polioxietilensorbitano, y similares.
Las emulsiones para la administración oral pueden comprender además uno o más agentes emulsionantes. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen agentes dispersantes como los ilustrados anteriormente o gomas naturales tales como goma guar, goma arábiga o goma tragacanto.
Los métodos de preparación de composiciones administrables por vía parenteral son evidentes para los expertos en la materia, y se describen con más detalle en, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science”, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.
La composición puede incorporar cualquier tensioactivo adecuado tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como ésteres de sorbitano o derivados de polioxietileno de los mismos. También se pueden incluir agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silícicas y otros ingredientes tales como lanolina.
Los miARN y sus antagonistas se pueden administrar en forma de liposomas. En general, los liposomas se derivan de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas, y están formados por cristales líquidos hidratados mono-o multilamelares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lípido no tóxico, fisiológicamente aceptable y
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metabolizable capaz de formar liposomas. Las composiciones en forma de liposomas pueden contener estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticas. Los métodos de formación de liposomas son conocidos en la técnica, y en relación con los mismos, se hace referencia específica a: Prescott, Ed., “Methods in Cell Biology”, volumen XIV, Academic Press, Nueva York, N.Y. (1976), pág. 33 y siguientes. Los agentes también se pueden administrar en forma de micropartículas. Por ejemplo, pueden usarse micropartículas biodegradables formadas a partir de polilactida (PLA), polilactida-co-glicolida (PLGA) y épsilon-caprolactona (ε-caprolactona).
La solicitud también describe formulaciones encapsuladas para proteger agentes polinucleotídicos y oligonucleotídicos contra la eliminación rápida del organismo, tal como a través de formulaciones de liberación controlada y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia.
Se pueden administrar miARN y construcciones antisentido tales como oligonucleótidos antisentido a un sujeto en un vector. El vector puede ser un vector plasmídico, un vector viral o cualquier otro vehículo adecuado adaptado para la inserción y secuencias foráneas y la introducción en células eucariotas. Preferentemente, el vector es un vector de expresión capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN de una molécula antisentido de la invención al ARN. Los vectores de expresión víricos preferidos incluyen, por ejemplo, vectores basados en el virus de Epstein-Barr, virus del papiloma bovino, adenovirus y adeno-asociados. En una realización particular, el vector es episomal. El uso de un vector episomal adecuado proporciona un medio de mantenimiento de la molécula antisentido en las células diana requeridas en alto número de copias a nivel extracromosómico, eliminando así los posibles efectos de la integración cromosómica.
En el tratamiento o en la prevención de enfermedades y afecciones, la presente invención contempla la administración de múltiples miARN y/o múltiples antagonistas de miARN. Los expertos en la materia pueden determinar si es adecuado o deseable administrar uno o más miARN, uno o más antagonistas de miARN u, opcionalmente, tanto miARN como antagonistas de miARN caso por caso. La invención también contempla terapias de combinación, en las que los agentes descritos en el presente documento se administran junto con otros agentes adecuados que pueden facilitar el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Por ejemplo, en el contexto del cáncer, se puede tratar de mantener terapias anticancerígenas en curso tales como quimioterapia y/o radioterapia, con el fin de tratar la afección del paciente, mejorar el control local del tumor y/o reducir el riesgo de metástasis, empleando a la vez agentes de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Por "administración conjunta" se entiende la administración simultánea en la misma formulación o en dos formulaciones diferentes a través de las mismas o diferentes vías, o la administración secuencial por las mismas o diferentes vías. Por administración "secuencial" se entiende una diferencia en el tiempo, por ejemplo, de segundos, minutos, horas, días, semanas o meses entre la administración de las dos formulaciones o terapias. Las formulaciones o terapias se pueden administrar en cualquier orden.
El solicitante también describe el uso de miARN desvelados en el presente documento para el diagnóstico o la determinación de la predisposición a enfermedades y afecciones asociadas con la angiogénesis anómala. Dicho método de diagnóstico de una enfermedad o afección asociada a una angiogénesis anómala en un sujeto, o de determinación de la predisposición de un sujeto a dicha enfermedad o afección comprende:
(a)
obtener una muestra biológica del sujeto; y
(b)
determinar el nivel de expresión de al menos un miARN, o uno de sus precursores o variantes en la muestra, miARN
(i)
que comprende una región semilla que comprende la secuencia UCACAGU (SEQ ID NO: 37), o
(ii)
que se selecciona del grupo que consiste en miR_27a, miR_27b, miR_24, miR_23a, miR_23b, miR_20a, miR_21, miR_29a, miR_29b, miR_29c, miR_106a, miR_126, miR_193a, miR_195, miR_197, miR_221, miR_347 y miR_126*,
en el que el nivel de expresión de al menos un miARN es indicativo de una enfermedad o afección asociada a una angiogénesis anómala, o una predisposición a la misma, en el sujeto.
El miARN y los antagonistas del mismo descritos en el presente documento también se pueden usar para la detección e identificación de moléculas y compuestos que interactúan con el miARN desvelado en el presente documento, incluyendo dianas de ácidos nucleicos y polipéptidos endógenos de estos miARN. Dichas dianas pueden ser reguladas por el miARN, pueden regular el miARN y/o pueden ejercer un efecto sobre otras moléculas celulares o procesos implicados en la angiogénesis. Así pues, dichas moléculas y compuestos pueden ofrecer nuevas dianas terapéuticas. Por "regular" se entiende regulación o modulación (bien positiva o negativa) de la actividad o la expresión. Así pues, por ejemplo, una molécula o un compuesto puede inducir, potenciar, activar, aumentar, inhibir o prevenir la actividad o la expresión de otra/s molécula/s o compuesto/s. Las moléculas y los compuestos adecuados pueden ejercer su efecto en virtud de una interacción directa (por ejemplo, de unión) o
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el tiempo cero). Se observó que un conjunto de 18 miARN se regularon negativamente de manera significativa, como se indica en la siguiente Tabla 2.
Tabla 2. miARN regulado diferencialmente
miARN
A1 t2 SEQ ID NO:
hsa_miR_27a
10,76 -24,09 1
hsa_miR_27b
9,327 -31,61 2
hsa_miR_24
11,62 -9,765 3
hsa_miR_23a
11,15 -10,38 4
hsa_miR_23b
10,62 -18,43 5
hsa_miR_20a
10 -15,73 6
hsa_miR_21
9,317 -36,25 7
hsa_miR_29a
9,769 -28,74 8
hsa_miR_29b
11,23 -21,49 9
hsa_miR_29c
9,223 -19,09 10
hsa_miR_106a
10,56 -7,238 11
hsa_miR_126
11,06 -20,89 12
hsa_miR_193a
9,953 -14,48 13
hsa_miR_195
9,424 -17,54 14
hsa_miR_197
9,467 -11,93 15
hsa_miR_221
10,12 -15,16 16
rno_miR_347
9,357 -15,02 17
hsa_miR_126*
9,886 -11,81 18
1 A = intensidad de la mancha en la micromatriz 2 t = valor de probabilidad
En la Figura 1B, se muestra la cuantificación de los niveles de expresión de uno de estos miARN, hsa_miR_27a. Se recogieron las HUVEC y bien se lisaron (t-0 sin estimulación) o se estimularon con PMA y AC11 y se lisaron (t-0 con estimulación) o se volvieron a sembrar después de la estimulación con PMA y AC11 en un gel de colágeno 3D durante 15 o 30 minutos. La regulación negativa de la expresión de miR_27a fue evidente en comparación con los niveles observados en las células que se separaron, pero no se estimularon o a los niveles en las células que se separaron, se estimularon, pero no se sembraron en el gel de colágeno. Sorprendentemente, como se muestra en la Figura 2, la regulación negativa de los niveles de expresión de hsa_miR_27a endógeno se observan solamente en un medio de cultivo celular tridimensional angiogénico inductor de la diferenciación en lugar de en un sistema de cultivo celular bidimensional convencional en las mismas condiciones.
Ejemplo 2 -La sobreexpresión de hsa_miR_27a inhibe la formación de vasos
Se investigó el efecto de la expresión de hsa_miR_27a en la formación de vasos en modelos de angiogénesis tanto in vitro como in vivo.
Métodos generales
Transfección con moléculas de precursor de miARN pre-miR™
Se sembraron HUVEC a 6 x 105 células por matraz de 25 cm2, y 24 h después se transfectaron con microARN sintéticos (moléculas de precursor de miARN Pre-miR™, Ambion) a una concentración final de 15 nM usando reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen). Se recogieron el ARN total y la proteína bien a las 24 horas o 48 horas de la transfección. Se sembraron células HEK293 a 5 x 104 células en una placa de 24 pocillos y se transfectaron 24 horas más tarde con 50 ng de plásmido además de moléculas de microARN sintético a una concentración final de 15 nM. Los lisados celulares se prepararon 24 horas después de la transfección.
Extracción de ARN o PCR en tiempo real
Se aisló ARN total de HUVEC mediante extracción de Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se cuantificó posteriormente usando el espectrofotómetro NanoDrop a 260 nm. Para el análisis del ARNm, con el fin de eliminar el ADN residual del ARN aislado, se realizó el tratamiento con DNasa (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cebó aleatoriamente el ADN complementario (ADNc) a partir de 1 ug de ARN total usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems).
Entonces, se llevó a cabo la PCR en tiempo real por triplicado con una dilución 1:4 del ADNc, usando Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) en una máquina de PCR de la serie Rotorgene 6000 (Corbett Research). El análisis de los datos se realizó usando el software que acompaña a la máquina de PCR y los datos se normalizaron con respecto a la β-actina. Para el análisis de la expresión de miARN, se realizó la síntesis de ADNc usando el kit de transcripción inversa de microARN TaqMan® (Applied Biosystems) usando los ensayos de microARN TaqMan® de
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protocolo de extracción fue el recomendado por el fabricante. Se ajustó el diámetro del láser a 7,5 μM y el pulso láser se ajustó a 0,2 segundos. Las células endoteliales se transfirieron a tapones de LCM CapSure Macro, lo que permite la extracción precisa y rápida de poblaciones de células puras de vénulas y neovasos mediante microdisección por captura láser (LCM). Aproximadamente, se recogieron de 5 a 10 tapones de LCM para las dos poblaciones de células endoteliales. Las imágenes se adquirieron a temperatura ambiente usando los objetivos UPIanFI x4/0,13, UPIanFI x10/0,30, LCPIanFI x20/0,40 de un microscopio Arcturus PixCell lIe (Molecular Devices) y se adquirieron en una cámara a color de un solo chip CCD de 1/2 pulgada (Hitachi). Se ajustó el brillo y el contraste de las imágenes usando el software LCM versión 2.0.
Se realizó el aislamiento del ARN total usando TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de miARN se realizó usando matrices humanas de baja densidad de TaqMan (Applied Biosystems). Se obtuvieron valores de ciclo umbral (Ct) sin procesar para cada miARN y se extrajeron para el análisis de la expresión. Los niveles de miR_27a se midieron mediante Q-PCR.
Los datos obtenidos usando células endoteliales neoangiogénicas y células endoteliales de las vénulas de una muestra de paciente con carcinoma hepatocelular se muestran en la Figura 5A. Se puede observar que la expresión de miR_27a se reduce casi el doble en las células neoangiogénicas en comparación con las células venulares. Se obtuvieron resultados similares para una segunda muestra de paciente con carcinoma hepatocelular (datos no mostrados). En los cortes hepáticos de los tres pacientes con cirrosis, hubo una disminución muy significativa de la expresión de miR_27a en los neovasos en comparación con las vénulas (Figura 5B). Los resultados se normalizaron con respecto a miR-520d* (un miARN confirmó no ser regulado entre las dos poblaciones de células endoteliales).
Ejemplo 4 -La sobreexpresión de miR_27a reduce la formación in vivo de tubos capilares
Se usó un ensayo de tapón de Matrigel murino para confirmar que miR_27a es fundamental para la regulación de la angiogénesis in vivo.
El ensayo se realizó como se ha descrito previamente (Zhang et al., 2006, J Cell Sci 119:3219). Se inyectaron a ratones C57BL/6 hembra de seis a ocho semanas de vida por vía subcutánea (ijadas derechas) 50 ul de Matrigel que contenía FGF-2 (0,5 ug, (Sigma, Ml), 90 ug de control o mimético de miR-27a, o no mimético, y FuGENE6 (2,5 ml). 14 días después, se extrajeron los tapones y se fijaron en paraformaldehído al 10 %. Se tiñeron cortes transversales de 5 um con hematoxilina-eosina. Se cuantificaron los vasos que contenían eritrocitos de los tapones mediante microscopía óptica a un aumento x 100 y se expresaron como la media de tres campos aleatorios. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de cuidado y ética de los animales de la Universidad de New South Wales. Las imágenes se adquirieron a temperatura ambiente usando un objetivo UplanFI x20/0,50 para el panel A y un objetivo UPIanFI x40/0,77 para el panel B en un microscopio BX51 de una cámara DP70 usando el software DPC Controller 3.1.1.267 (todos de Olympus). Tras la adquisición de los datos, se usó ImageJ (NIH) para realizar los ajustes de luminosidad y contraste.
Los cortes transversales teñidos con hematoxilina y eosina de la superficie de contacto de Matrigel/piel mostraron vasos que contenían eritrocitos o vasos maduros en crecimiento. El desarrollo estromal inducido, la infiltración celular y los vasos sanguíneos luminales capilares eran visibles en los controles, pero no en la misma medida en el implante de miR_27a (Figura 6A y B). Además, esta reducción significativa en el número de vasos también fue detectable cuando se tiñeron los cortes para CD31 (PECAM) (Figura 6C y 7D). Por lo tanto, la sobreexpresión de miR_27a inhibe la invasión de los vasos sanguíneos en el tapón de Matrigel, lo que sugiere que miR_27a es antiangiogénico.
Ejemplo 5 -Efecto de miR_27a sobre la expresión de VE-cadherina
Usando los algoritmos de predicción de dianas basados en la Web, incluyendo TargetScan, PicTar y miRanda, se predijo que miR_27a se dirigía a la VE-cadherina, la molécula de adhesión celular dependiente del calcio específica endotelial, responsable de las interacciones célula-célula y la adhesión en tejidos sólidos. La UTR de 3’ de la VEcadherina contiene un único sitio 8-mero previsto para miR-27 con una coincidencia exacta en las posiciones 2-8 del miARN maduro seguido de un 'A' (la región semilla + la posición 8).
Para determinar si miR_27a regula la expresión de VE-cadherina, se midieron los niveles de proteínas de VEcadherina en células con sobreexpresión de miR_27a. Para estos experimentos, se sembraron HUVEC a 4 x 105 células por matraz de 25 cm2, y 24 horas más tarde se transfectaron con miméticos de microARN (moléculas de precursor de miARN Pre-miR™, Ambion) o LNA (Exiqon) a una concentración final de 15 nM usando reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen). En cinco estirpes de HUVEC independientes ensayadas, hubo una disminución significativa (25 % ± 4 %) en la expresión de la proteína VE-cadherina a las 48 horas después de la transfección. El aumento de la dosis de mimético de miARN no alteró significativamente los efectos sobre la VE-cadherina observados (datos no mostrados). Se midió el nivel de ARNm de VE-cadherina usando Q-PCR. Se observó una disminución (31 % ± 7 %) en los niveles de ARNm de VE-cadherina observados en las células con sobreexpresión de miR_27a en cinco estirpes de HUVEC independientes ensayadas. Por el contrario, la desactivación de miR_27a

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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2886745A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-10 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Modulation of rna activity and vascular permeability
JPWO2015133637A1 (ja) * 2014-03-07 2017-04-06 国立大学法人京都大学 マイクロｒｎａ封入ナノ粒子及びその医薬用途
CN105861728B (zh) * 2016-06-12 2024-11-19 上海市第十人民医院 循环miRNA作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用
ES2659845B1 (es) 2016-09-19 2019-01-04 Univ Valencia Modulación de microRNAs contra la distrofia miotónica tipo 1 y antagonistas de microRNAs para ello
CN111166748B (zh) * 2019-12-14 2022-06-21 深圳先进技术研究院 吡非尼酮在制备促血管生成药物中的应用
WO2021178344A1 (en) * 2020-03-04 2021-09-10 The Trustees Of Indiana University Methods to re-engage a fetal wound healing pathway for adult skin repair
FR3150413A1 (fr) * 2023-06-30 2025-01-03 Universite Paris-Saclay Utilisation d’un mimique du miR-27-5p pour traiter les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101818145A (zh) 1998-03-20 2010-09-01 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
KR20020097198A (ko) 2000-03-17 2002-12-31 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 사일런싱
US7683036B2 (en) * 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US20060185027A1 (en) * 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
EP2026773A4 (en) 2006-05-26 2010-11-03 Medvet Science Pty Ltd METHOD OF MODULATING THE EPITHELIC MESENCHYN TRANSITION AND THE MESENCHYM EPITHELIC TRANSITION IN CELLS AND USES THEREOF
WO2008063318A2 (en) * 2006-10-12 2008-05-29 The Texas A & M University System And Safe Et Al Betulinic acid, derivatives and analogs thereof and uses therefor
US7812003B2 (en) 2007-08-02 2010-10-12 Safe Stephen H Antisense microRNA and uses therefor

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