ES2644061T3 - Procedimiento de detección y cuantificación de microorganismos - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de detección de al menos un microorganismo presente en una muestra, que comprende: - el cultivo en medio líquido de la muestra en presencia de al menos un ligando específico del microorganismo y de al menos un sensor no específico del microorganismo, produciendo la unión del microorganismo al ligando una primera señal medible y produciendo la unión del microorganismo al sensor una segunda señal medible; - la determinación de valores de la primera y de la segunda señal para al menos un periodo de cultivo; en el que se deduce que la muestra comprende el microorganismo cuando los valores de la primera señal y de la segunda señal para un mismo periodo de cultivo son diferentes.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de deteccion y cuantificacion de microorganismos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento de deteccion y cuantificacion de microorganismos en una muestra.
Antecedentes de la invencion
La deteccion de microorganismos vivos en ciertas muestras es de una importancia crucial, particularmente en el campo medico y en la industria agroalimentaria.
El metodo de deteccion estandar sigue siendo el cultivo microbiano, que a menudo requiere varios dfas para la obtencion de un numero suficiente de microorganismos para identificar el germen buscado. En el caso de una busqueda a partir de una muestra obtenida de un paciente, esta demora antes de la obtencion de resultados, implica a menudo una administracion preventiva al paciente de antibioticos de amplio espectro. Para las bacterias patogenas, el aumento del numero de cepas resistentes a los antibioticos es, por lo tanto, una posible consecuencia de este protocolo de medicacion que no esta dirigido a una bacteria particular sino a muchas otras especies bacterianas.
El diagnostico bacteriologico se realiza convencionalmente en dos tiempos:
- una primera fase de crecimiento, generalmente en medio solido, de bacterias para tener un numero suficiente de ellas y aislar la bacteria sospechosa; en esta fase, el estudio en medio de cultivo solido, de la forma de las colonias permite una identificacion preliminar de las bacterias; ademas esta fase esta frecuentemente acoplada a una deteccion no espedfica de las bacterias, por cultivo en medio lfquido basado en la acidificacion del medio de cultivo o variaciones de las propiedades opticas del medio, por ejemplo por difusion de la luz, lo que da una idea de la eventual presencia de bacterias en la muestra;
- una segunda fase de identificacion de la bacteria por crecimiento en medio selectivo, a continuacion de estudio de los caracteres bioqmmicos e inmunologicos, siguiendo una clave dicotomica, que va de los caracteres mas amplios a los mas precisos, para llegar a una especie bacteriana particular.
En las aplicaciones medicas, una etapa suplementaria antes del tratamiento terapeutico es, a menudo, necesaria, esta consiste en realizar un antibiograma para ensayar el nivel de resistencia de la bacteria frente a diferentes antibioticos de la farmacopea.
Este metodo necesita al menos 24 h de crecimiento y, para ciertas especies bacterianas, hasta varios dfas de cultivo antes de la identificacion visual. En todos los casos, el periodo de analisis es crucial, y las etapas de enriquecimiento y a continuacion de analisis son muy largas (de uno a varios dfas).
A fin de reducir este plazo, se han desarrollado metodos mas rapidos de deteccion in vitro del crecimiento bacteriano. Sin embargo, todos estos enfoques se basan en sistemas multietapa que implican, en primer lugar, una fase de cultivo para aumentar el numero de bacterias presentes en la muestra, y a continuacion, al menos una fase de identificacion y de caracterizacion.
Recientemente se han introducido en el mercado robots de seguimiento del crecimiento bacteriano, por ejemplo, el BACTEC 9000 de Becton-Dickinson y BacT/ALTER de BioMerieux. Estos robots recurren a la dosis de CO2 liberado durante la proliferacion bacteriana. La utilizacion de estos robots para hemocultivo permitio aumentar la sensibilidad de los ensayos, en particular, durante hemocultivo y, por consiguiente, disminuir los plazos de respuesta (Lamy y col. (2005) Biotribune 16: 37-39; Croizet y col. (2007) Spectra Biologie 160: 45-51). Estos robots no permiten, sin embargo, identificar espedficamente los generos y especies de bacterias.
Mas recientemente, la compama Accelr8 ha comercializado un dispositivo de concentracion microflmdica que adsorbe, de forma no espedfica, las bacterias sobre una superficie de polfmero qmmicamente funcionalizada. En este caso, la deteccion del crecimiento de un microorganismo precede a su identificacion. En efecto, las bacterias se multiplican en primer lugar sobre un soporte y a continuacion se identifican gracias a un procedimiento de inmunofluorescencia seguido por un analisis por microscopfa. Debe observarse que este procedimiento sigue siendo relativamente laborioso ya que las dos etapas de cultivo y a continuacion de deteccion se realizan sucesivamente.
Procedimientos bastante similares que implican un sistema de impulsos electricos para concentrar las esporas de Bacillus subtilis para detectarlas mediante un sistema optico asociado han sido desarrollados por Zourob y col. (2005) Lab Chip 5: 1350-1365. Este procedimiento no implica cultivo y detecta directamente las esporas presentes en una muestra. Necesita, sin embargo, la utilizacion de microsistemas bastante complejos.
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Tambien se han propuesto tecnicas que utilizan procedimientos de deteccion electroqmmicos. Las mas eficaces estan basadas en principios impedimetricos (Yang y col. (2004) Anal. Chem.76: 1107-13; Huang y col. (2010) Biosensors & Bioelectronics 25: 1204-11). Estos procedimientos implican a menudo la utilizacion de un mediador redox utilizado como sonda. En este caso, el medio de medida debe estar suplementado con mediador, normalmente hexacianoferrato, utilizado a concentraciones del orden de 1 a 10 mM. Esto sigue siendo un inconveniente fundamental, ya que el efecto de concentraciones relativamente elevadas (mM) de este tipo de compuestos sobre los microorganismos a detectar sigue siendo poco conocido y puede ser una fuente de interferencias con el medio biologico.
Las tecnicas opticas sin trazador pueden, en principio, prescindir de la adicion de compuestos exogenos y son, por lo tanto, mas directas. La tecnica de resonancia de plasmon superficial (SPR, por sus siglas en ingles surface plasmon resonance) ha sido aplicada a la deteccion de lisados bacterianos por Taylor y col. (2006) Biosensors and Bioelectronics 22: 752-758. En este caso, la deteccion viene precedida por una lisis bacteriana y a continuacion, la senal es amplificada por una union con un anticuerpo secundario espedfico. Se alcanzan lfmites de deteccion situados entre 104 y 106 bacterias/ml. Por lo tanto, este procedimiento requiere o muestras muy contaminadas o bien un cultivo previo para alcanzar estos umbrales. Ademas, dado que la deteccion se realiza en lisado bacteriano, el metodo no es adecuado para la identificacion de bacterias vivas. Del mismo modo, en la solicitud WO 2008/106048, que propone una deteccion multiple de microorganismos por SPR, como analitos se utilizan lisados bacterianos.
La solicitud US 2008/0096241 divulga un metodo para determinar la sensibilidad de un microorganismo a un antibiotico, con ayuda de un dispositivo de SPR. De acuerdo con este metodo, las bacterias cuya sensibilidad a un antibiotico se desea conocer son adsorbidas a una superficie adecuada para la SPR y funcionalizada por un ligando no espedfico, antes de anadir el antibiotico a ensayar; durante esta etapa, se mide la senal SPR, que refleja la presencia y el estado de las bacterias adsorbidas. La comparacion de las curvas obtenidas con la muestra a ensayar y una muestra de control cuya sensibilidad al antibiotico ensayado se conoce, da la informacion buscada.
La solicitud WO 2008/106048 se refiere a un aparato para medir la actividad celular inducida por un ligando, comprendiendo el aparato un biosensor optico que tiene una superficie de contacto, que comprende una zona de agentes de compatibilidad, conectada de manera directa o indirecta a la superficie del biosensor, asf como una zona celular, que comprende al menos una celula asociada a al menos un agente de compatibilidad. Este dispositivo no tiene por objeto detectar celulas en una muestra, y no permite medir simultaneamente la senal proveniente de un ligando espedfico de los microorganismos y la proveniente de un sensor no espedfico.
Finalmente, se han descrito otros trabajos, que permiten detectar la germinacion de las esporas de Aspergillus niger y de Candida albicans con ayuda de micro-palancas (Nugaeva y col. (2007) Microsc. Microanal. 13: 13-17; Nugaeva y col. (2005) Biasensors and Bioelectronics 21: 89-856). Este tipo de deteccion se desarrolla en el aire, en camara humeda y presente el inconveniente de no poder realizarse en medio lfquido. Por otro lado, solamente es aplicable a la deteccion de la germinacion de esporas fungicas, previamente capturadas.
Resumen de la invencion
La presente invencion se obtiene del descubrimiento realizado por los inventores, de que el acoplamiento del cultivo de un microorganismo y de la medida de una senal diferencial generada por la fijacion espedfica del microorganismo por un ligando, es decir que el cultivo y la medida de la senal diferencial se realizan de manera simultanea, permitfa rebajar el umbral de deteccion del microorganismo y disminuir significativamente los tiempos de analisis, con respecto a las tecnicas habituales.
En consecuencia, la presente invencion se refiere a un procedimiento de deteccion de al menos un microorganismo, presente en una muestra, que comprende:
- el cultivo en medio lfquido de la muestra en presencia de al menos un ligando espedfico del microorganismo y de al menos un sensor no espedfico del microorganismo, produciendo la union del microorganismo al ligando una primera senal medible y produciendo la union del microorganismo al sensor una segunda senal medible;
- la determinacion de valores de la primera y de la segunda senal para al menos un periodo de cultivo;
en el que se deduce que la muestra comprende el microorganismo cuando los valores de la primera senal y de la segunda senal para un mismo periodo de cultivo son diferentes.
En una realizacion particular del procedimiento de acuerdo con la invencion, cuando la muestra comprende un microorganismo, se determina ademas la cantidad de microorganismos presentes en la muestra al comienzo del cultivo a partir de la evolucion del valor de la primera senal en funcion del periodo de cultivo.
En otra realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, cuando la muestra comprende un microorganismo, se determina la sensibilidad del microorganismo a al menos un antimicrobiano a partir de la evolucion del valor de la primera senal en funcion del periodo de cultivo despues de la introduccion del antimicrobiano en el cultivo.
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La presente invencion tambien se refiere a un dispositivo adecuado para la implementacion de un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, que comprende al menos una camara adecuada para el cultivo en medio Ifquido de un microorganismo, comprendiendo la camara al menos un ligando espedfico del microorganismo y al menos un sensor no espedfico del microorganismo, produciendo la union del microorganismo al ligando una primera senal medible y produciendo la union del microorganismo al sensor una segunda senal medible, estando el ligando y el sensor fijados sobre un soporte para estar en contacto con el medio lfquido a estudiar.
Descripcion detallada de la invencion
Como se entiende en el presente documento, un microorganismo es, preferentemente, un organismo procariota o eucariota, unicelular o pluricelular. Sin embargo, cuando el microorganismo es pluricelular, se prefiere que las celulas que constituyen el microorganismo pluricelular sean homogeneas en terminos de diferenciacion, es decir que el microorganismo no comprenda celulas que tienen diferentes especializaciones. Preferentemente, el microorganismo de acuerdo con la invencion esta vivo, es decir que es capaz de multiplicarse. Por otro lado, el microorganismo de acuerdo con la invencion es preferentemente unicelular. A este respecto, el microorganismo de acuerdo con la invencion puede ser una forma unicelular de un organismo pluricelular de acuerdo con su fase de desarrollo o de reproduccion. Ademas, un microorganismo de acuerdo con la invencion tambien puede estar constituido por celulas aisladas o por fragmentos de tejidos aislados de un metazoo. De este modo, el microorganismo de acuerdo con la invencion tambien puede ser una celula de mamffero, particularmente ser humano, tal como una celula tumoral o una celula sangumea, por ejemplo un linfocito o una celula mononuclear de la sangre periferica. Preferentemente, el microorganismo de acuerdo con la invencion es, por lo tanto, un microorganismo, en particular unicelular, seleccionado entre el grupo constituido por una bacteria, un hongo, una levadura, un alga, un protozoo y por una celula aislada de metazoo. De manera particularmente preferida, el microorganismo de acuerdo con la invencion es una bacteria, en particular del genero Streptococcus o Escherichia.
La muestra de acuerdo con la invencion puede ser de cualquier tipo, en la medida en que pueda comprender un microorganismo. Preferentemente, la muestra de acuerdo con la invencion se selecciona entre el grupo constituido por una muestra biologica, una muestra alimentaria, una muestra de agua, particularmente de agua residual, de agua dulce o marina, una muestra de suelo, una muestra de lodo y una muestra de aire. Las muestras biologicas de acuerdo con la invencion provienen de organismos vivos o que han estado vivos, particularmente de animales o de plantas. Las muestras que provienen de animales, particularmente de mairnferos, pueden ser lfquidas o solidas, y comprenden, particularmente, sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, orina, heces, lfquido sinovial, esperma, secreciones vaginales, secreciones bucales, muestras respiratorias, que provienen en particular de los pulmones, de la nariz o de la garganta, pus, fluido asdtico, o muestras de serosidades cutaneas o conjuntivales.
Preferentemente, las muestras alimentarias de acuerdo con la invencion provienen particularmente de alimentos, que pueden ser crudos, cocidos o cocinados, de ingredientes alimentarios, de especias o de platos preparados. Tambien preferentemente, la muestra de acuerdo con la invencion no se purifica o se concentra antes de cultivarla de acuerdo con la invencion.
Como sera claramente evidente para el experto en la materia, el cultivo en medio lfquido de acuerdo con la invencion se lleva a cabo para obtener una multiplicacion del microorganismo eventualmente presente en la muestra cultivada y que se busca detectar. Las tecnicas y las condiciones de cultivo de microorganismos en medio lfquido son bien conocidas por el experto en la materia, que sabe particularmente definir, para cada microorganismo, el medio nutriente adecuado, la temperatura de crecimiento optima, por ejemplo 37 °C para numerosas bacterias patogenas de los mamfferos, asf como la atmosfera necesaria para la multiplicacion de un microorganismo de acuerdo con la invencion. Por otro lado, se utilizaran preferentemente medios de cultivo poco selectivos, es decir que permiten el crecimiento de un gran numero de microorganismos de tipos diferentes. El periodo de cultivo es tambien adaptable para cada microorganismo, en funcion de su velocidad de crecimiento o de su tiempo de generacion, es decir el tiempo necesario para la division del microorganismo en dos microorganismos hijos.
Preferentemente, el periodo de cultivo de acuerdo con la invencion es superior o igual al tiempo necesario para la produccion de al menos dos generaciones sucesivas de microorganismos hijos que permite, por lo tanto, al menos una cuadruplicacion, es decir una multiplicacion por 4, del numero de microorganismos a detectar. El experto en la materia comprendera facilmente que no es necesario observar efectivamente la cuadruplicacion del numero de microorganismos en cultivo, en la medida en que el microorganismo a detectar puede estar ausente de la muestra de acuerdo con la invencion, sino que el periodo de cultivo corresponde, como mmimo, al que permite obtener una cuadruplicacion del numero de microorganismos en un cultivo que contiene efectivamente el microorganismo y que se lleva a cabo en las mismas condiciones que las del procedimiento de la invencion. De este modo, se prefiere tambien que el periodo de cultivo de acuerdo con la invencion sea al menos igual a dos veces el tiempo de generacion o el tiempo de duplicacion del microorganismo a detectar. Como el experto en la materia entendera bien, el tiempo de generacion o de duplicacion de acuerdo con la invencion es el que puede obtenerse en las condiciones de cultivo de acuerdo con la invencion. Generalmente, el periodo de cultivo sera inferior a 72 h, 48 h o 24 h. Ademas, el cultivo podra detenerse en cuando se haya podido obtener la informacion buscada, deteccion, determinacion de la cantidad, o sensibilidad a los antimicrobianos.
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Ventajosamente, el procedimiento de la invencion es sensible y permite detectar la presencia de microorganismos en muestras que contienen concentraciones bajas de microorganismo, por ejemplo iguales a 1 o inferiores a 10, 102 o 103 microorganismos/ml, que son habitualmente indetectables directamente, particularmente con ayuda de un biosensor. De este modo, se prefiere que el procedimiento de la invencion se aplique a muestras que se sospecha que contienen un microorganismo a detectar a una concentracion inferior o igual a 106, 105, 104, 103, 102 o 10 microorganismos/ml, o igual a 1 microorganismo/ml.
El ligando de acuerdo con la invencion es de cualquier tipo que permita unirse espedficamente a un microorganismo o a varios microorganismos emparentados. Puede tratarse particularmente:
- de un receptor natural del microorganismo, tal como un azucar polisacandico o un lfpido complejo, es decir un lfpido que comprende al menos un grupo alipfdico, particularmente de tipo proteico, gluddico, fosforado, o nitrogenado; de una protema o de una glucoprotema, tal como plasminogeno por ejemplo, que se une a varias especies bacterianas del genero Streptococcus; de bacteriofagos o de virus completos, eventualmente inactivados, de fragmentos de bacteriofagos o de virus o de protemas de bacteriofagos o de virus;
- de inmunoglobulinas, tales como los anticuerpos y sus fragmentos que comprenden la parte variable, dirigidos espedficamente a un antfgeno, o constante, al que pueden unirse las bacterias del genero Staphylococcus que comprenden la protema A, o los fragmentos de receptores de celulas T (TCR), que comprenden particularmente la parte variable;
- de compuestos sinteticos, particularmente:
• pequenas moleculas organicas que comprenden en particular de 1 a 100 atomos de carbono,
• compuestos de naturaleza peptfdica, tales como scFv (single chain variable fragment),
• compuestos de naturaleza polinucleotfdica, tales como aptameros, o
• compuestos de naturaleza polisacandica;
- materiales triturados, lisados o extractos de organismos o de tejidos vivos;
- materiales sinteticos que presentan una superficie de adsorcion de microorganismos; o
- mezclas que comprenden dos, o mas, de los ligandos definidos anteriormente.
De este modo, el ligando de acuerdo con la invencion se selecciona preferentemente entre el grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un scFv, un aptamero, una protema o una glucoprotema, bacteriofagos completos, eventualmente inactivados, fragmentos de bacteriofagos y protemas de bacteriofagos.
El sensor de acuerdo con la invencion sirve de control negativo. En consecuencia, es preferentemente de una naturaleza semejante a la del ligando. Por otro lado, el sensor de acuerdo con la invencion presenta menos afinidad por el microorganismo a detectar que el ligando, es decir que, de acuerdo con la invencion, presenta preferentemente una afinidad por el microorganismo inferior al menos 10 veces, particularmente inferior al menos 100 veces, 1000 veces, 10.000 veces, 100.000 o 1.000.000 veces a la del ligando por el microorganismo. En particular, las afinidades del ligando y del sensor por el microorganismo pueden determinarse mediante el metodo de Scatchard en las mismas condiciones experimentales. De manera mas preferida, el sensor de acuerdo con la invencion no presenta afinidad por el microorganismo.
Preferentemente, se considera, de acuerdo con la invencion, que los valores de la primera senal y de la segunda senal para un mismo periodo de cultivo son diferentes cuando la diferencia de la primera senal y de la segunda senal es superior o igual a dos veces la senal medida del ruido de fondo. La senal medida del ruido de fondo corresponde particularmente a la primera senal medida en ausencia de microorganismo.
Como se entiende en el presente documento, la senal medible de acuerdo con la invencion es generada directamente por la fijacion o la union de un compuesto, particularmente un microorganismo, al ligando o el sensor.
En particular, la senal medible de acuerdo con la invencion no proviene preferentemente de un mediador, tal como una sonda de oxidorreduccion, o de un marcador presente en el medio, o anadido al medio, diferente del ligando y el sensor de acuerdo con la invencion. De este modo, preferentemente, la senal medible de acuerdo con la invencion no proviene de la fijacion adicional de un marcador espedfico del microorganismo a un microorganismo al que ya se ha fijado el ligando o el sensor.
La senal puede medirse mediante cualquier tecnica adecuado para la medida de al menos dos senales simultaneamente, en particular directa, y particularmente por microscopfa, por resonancia de plasmon superficial, por espejos resonantes, por medida de la impedancia, por un microsistema electromecanico (MEMS), tal como microbalanzas de cuarzo o “vigas” flexibles, por medida de absorcion de la luz, en particular ultravioleta o visible, o tambien por medida de la fluorescencia, particularmente si el microorganismo es, a su vez, fluorescente, que son bien conocidas por el experto en la materia. A este respecto, como sera claramente evidente para el experto en la materia, el marcador definido anteriormente no designa un microorganismo de acuerdo con la invencion; de modo que la senal de acuerdo con la invencion puede provenir del microorganismo cuando se la ha fijado el ligando o el sensor. La resonancia de plasmon superficial es particularmente preferida de acuerdo con la invencion.
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Preferentemente, el ligando y el sensor estan fijados a un soporte. Mas preferentemente, el soporte permite la transduccion de la senal producida por la union de un compuesto al ligando y/o al sensor, particularmente de modo que la senal pueda ser medida por las tecnicas mencionadas anteriormente. Dichos soportes son bien conocidos por el experto en la materia y comprenden, particularmente, sustratos transparentes recubiertos de superficies metalicas, continuas o discontinuas, adecuados para la medida por resonancia de plasmon superficial. De este modo, en una realizacion preferida de la invencion, el ligando y el sensor estan fijados a un soporte, identico o diferente, que es, a su vez, constitutivo de un biochip. Por otro lado, el ligando y el sensor, el o los soportes, o el dispositivo, de acuerdo con la invencion, pueden estar comprendidos en un recipiente concebido para recoger lfquidos susceptibles de contener microorganismos, o concebido para cultivar microorganismos, tales como un matraz de hemocultivo o una bolsa Stomacher, por ejemplo.
Tambien preferentemente, la senal se mide en tiempo real, particularmente sin que sea necesario efectuar tomas del cultivo para medir la senal. La senal medida es preferentemente registrada, por ejemplo en forma de curva que porta la intensidad de la senal medida en funcion del tiempo. Tambien es posible registrar imagenes del soporte en el que estan fijados el ligando y el sensor de acuerdo con la invencion para determinar el grado, o el nivel, de ocupacion del ligando y del sensor por el microorganismo.
En realizaciones particulares de la invencion, el procedimiento de acuerdo con la invencion permite detectar la presencia de varios microorganismos diferentes, determinar la cantidad de diferentes microorganismos presentes en la muestra, o determinar la sensibilidad de diferentes microorganismos a uno o mas antimicrobianos, basta entonces que se utilicen varios ligandos espedficos respectivamente de los diferentes microorganismos. Dicho procedimiento se denomina entonces multiple.
Como se entiende en el presente documento, el termino «antimicrobiano» se refiere a cualquier compuesto microbicida, que inhibe el crecimiento del microorganismo, o que reduce su proliferacion, particularmente a cualquier compuesto antibiotico, bactericida o bacteriostatico, tal como eritromicina. Por otro lado, el termino «antimicrobiano» se refiere tambien, particularmente cuando el microorganismo de acuerdo con la invencion es una celula tumoral, a cualquier compuesto anticanceroso, particularmente quimioterapeutico, concebido para destruir el microorganismo o para reducir su proliferacion.
Preferentemente, cuando se determina la sensibilidad del microorganismo a al menos un antimicrobiano de acuerdo con la invencion, la evolucion del valor de la primera senal en funcion del periodo de cultivo proviene, en parte o en total, de una variacion del tiempo necesario para la division de un microorganismo, es decir del tiempo de generacion, y de este modo de la evolucion con el paso del tiempo del numero de microorganismos que se uniran al primer ligando. Como comprende bien el experto en la materia, si el tiempo de generacion del microorganismo aumenta significativamente, la variacion del numero de microorganismos sera menor que la obtenida en ausencia del antimicrobiano. De este modo, de manera preferida, la evolucion del valor de la primera senal no se debe a la destruccion por el antimicrobiano de los microorganismos fijados al primer ligando de acuerdo con la invencion.
Descripcion de las figuras
Figuras 1, 2 y 3
Las figuras 1 a 3 se obtienen de tres experimentos independientes y representen la variacion de reflectividad (dR, eje de ordenadas, en %) medida por formacion de imagenes de resonancia de plasmon superficial, en funcion del periodo de cultivo (eje de abscisas, tiempo en minutos), de un biochip funcionalizado con ayuda (i) de anticuerpos anti-CbpE (estrellas grandes, triplicado) dirigidos contra Streptococcus pneumoniae, (ii) de plasminogeno (Plg) (drculos grandes, triplicado), (iii) de IgG no espedficas de S. pneumoniae (triangulos grandes, triplicado) y (iv) de pirrol unicamente (cuadrados grandes), y colocado en presencia de un cultivo de S. pneumoniae cepa R6 a la concentracion inicial de 102 bacterias/ml (figura 1), 103 bacterias/ml (figura 2) y 104 bacterias/ml (figura 3), en un volumen de muestra de 500 |il (es decir, respectivamente 50, 500 y 5000 bacterias). Por otro lado, a modo de controles, y con la notacion (c), tambien se presentan las curvas obtenidas con ayuda del mismo biochip colocado en presencia de un medio de cultivo no sembrado.
Figura 4
La figura 4 representa la variacion de reflectividad ARspr, eje de ordenadas, en %), medida por formacion de imagenes de resonancia de plasmon superficial, de un biochip funcionalizado con ayuda de anticuerpos anti- CbpE dirigidos contra Streptococcus pneumoniae (cono positivo) y de pirrol unicamente (cono negativo), en presencia de un cultivo de S. pneumoniae, en funcion del periodo de cultivo (eje de abscisas, t en minutos), asf como una curva que modeliza la reflectividad del cono funcionalizado con ayuda de anticuerpos anti-CbpE (curva calculada).
Figura 5
La figura 5 representa la variacion de reflectividad (dR, eje de ordenadas, en %) de un biochip funcionalizado con ayuda de anticuerpos anti-CbpE dirigidos contra Streptococcus pneumoniae, de plasminogeno (Plg), de IgG no espedficas de S. pneumoniae, y de pirrol unicamente, colocado en presencia de un cultivo de S. pneumoniae cepa R6 a la concentracion inicial de 104 bacterias/ml en dos cubetas en paralelo, en las que se anade
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respectivamente a tiempo t = 250 min, (i) eritromicina a una concentracion final de 40 mg/ml diluida en etanol a la concentracion final del 0,08%, (+ ATB), (ii) etanol (EtOH) a la concentracion final del 0,08%.
Ejemplos
Ejemplo 1: deteccion de microrganismos en una muestra Construccion de un biochip
Se preparo un biochip de protemas utilizando el metodo de electro-polimerizacion de las protemas en un prisma con superficie dorada (utilizado como electrodo de trabajo), como lo ha descrito Grosjean y col. (2005) Analytical Biochemistry 347: 193-200, a partir de un conjugado de protema-pirrol en presencia de pirrol libre. En resumen, la electro-polimerizacion del pirrol libre y de las protemas acopladas al pirrol-NHS se realiza mediante una punta de pipeta que contiene una varilla de platino que sirve de contraelectrodo; la polimerizacion se efectua mediante pulsos electricos rapidos de 100 ms (2,4 V) entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo, como es descrito particularmente por Guedon y col. (2000) Anal. Chem. 72: 6003-6009. Cada especie proteica ha sido depositada en forma de triplicados sobre la superficie dorada del prisma para estimar la reproducibilidad del proceso.
Los ligandos utilizados son los siguientes:
- Ligandos que reconocen Streptoccocus pneumoniae
(i) anticuerpos anti-CbpE preparados de acuerdo con Attali y col. (2008) Infect. Immun. 76: 466-76
(ii) plasminogeno humano (Sigma Aldrich).
- Sensores para los controles negativos:
(iii) IgG de conejo purificados (Sigma Aldrich) o IgG monoclonales anti-toxina botulmica;
(iv) Pirrol (Tokyo kasei, TCI)
Todos estos productos se acoplaron al pirrol y a continuacion se depositaron en forma de conos sobre el prisma dorado de acuerdo con un plan de deposito adaptado a la forma de las cubetas que permiten el cultivo de los microorganismos. Cada cubeta esta provista de 2 compartimentos independientes que pueden contener dos muestras diferentes entre las cuales un control.
Preparacion de los cultivos de bacterias
Los neumococos cepa R6 se cultivaron en medio de cultivo Todd Hewitt (TH de Mast Diagnostic). El cultivo se detuvo durante la fase de crecimiento optimo de las bacterias, es decir a una densidad optica medida a 600 nm (DO600) de 0,4, lo que corresponde a una concentracion bacteriana de aproximadamente 108 bacterias/ml. Se realizaron diluciones sucesivas en medio TH para obtener concentraciones de 102 a 104 bacterias/ml.
Medicion de formacion de imagenes de resonancia de plasmon superficial (SPRi):
Se realizaron mediciones de formacion de imagenes de tipo SPR utilizando el sistema SPRi-Lab de Genoptics (Orsay, Francia).
El biochip se bloqueo previamente con ayuda de tampon PBS que comprendfa un 1% de albumina de suero bovino (BSA) durante 15 minutos. 0,5 mililitros de muestra que contema eventualmente bacterias se introducen en el compartimento de «muestra», mientras que medio de cultivo desprovisto de neumococos se introduce en el compartimento de «controles». El sistema se coloca en el recinto del aparato SPRi calentado a 37 °C. La cubeta se tapa para evitar la evaporacion del medio de cultivo durante el crecimiento realizado en ausencia de agitacion.
En paralelo, se realizaron controles de crecimiento. Se prepararon varios tubos que conteman 1 ml del cultivo a 103 bacterias/ml y se incubaron en una estufa a 37 °C. La DO600 se midio cada hora, para seguir la evolucion del crecimiento bacteriano en funcion del tiempo y compararla con las curvas de crecimiento en SPRi. Las bacterias se cultivaron durante 16 horas.
densidad optica a 600 nm
Periodo de cultivo
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Periodo de cultivo
DO
4 horas
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0,25
7 horas
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Estudio de la selectividad
Despues de la inyeccion de 500 bacterias, en la figura_2 se observa que las primeras senales, asociadas a la captura de las bacterias por los anticuerpos anti-CbpE asf como por el plasminogeno, son detectables despues de aproximadamente 300 minutos. Mas alla de 400 minutos, una senal se vuelve visible para los conos que portan los controles negativos (fijaciones no espedficas). Las senales (c) obtenidas en la cubeta de control, sin siembra bacteriana, siguen siendo negativas
Se observa tambien un crecimiento bacteriano significativo entre 300 y 400 minutos a partir de la Tabla 1.
La inyeccion de una cantidad menor de bacterias (50 bacterias, figura 1), y de una cantidad superior (5000 bacterias, figura 3), genera tambien un aumento de senal visible. Los desfases temporales observados corresponden bien a un tiempo de generacion del orden de 30 minutos.
Ejemplo 2: cuantificacion de las bacterias presentes en la muestra de partida
La figura_4 presenta la evolucion temporal de las variaciones de la reflectividad medida en formacion de imagenes de tipo SPR (ARspr) observadas en el cono funcionalizado con el anticuerpo anti-CbpE y en un cono de control negativo que comprendfa unicamente pirrol.
Se ve que, despues de un periodo de latencia de aproximadamente 400 minutos, durante el cual la evolucion de la senal esta enmascarada por el ruido experimental, el aumento de reflectividad es claramente exponencial.
A este respecto, la figura_4 muestra tambien la curva representativa de la funcion ARspr = Ro 2(t/I) - Ro que modeliza la evolucion de ARspr observada en el cono funcionalizado por el anticuerpo anti-CbpE utilizando para el valor de 30 minutos para t que es tfpico del tiempo de duplicacion de poblacion asociado a Streptococcus pneumoniae. El factor de multiplicacion Ro es proporcional al numero de microorganismos presentes inicialmente en la muestra. La determinacion de este factor permite, por lo tanto, una evaluacion cuantitativa de las bacterias presentes inicialmente en la muestra.
A partir de 550 minutos, se produce un alejamiento de este regimen exponencial. Esta reduccion del ritmo de crecimiento puede atribuirse a las limitaciones inducidas por modificaciones del medio de cultivo, particularmente su empobrecimiento susceptible de afectar significativamente al crecimiento bacteriano, como sabe el experto en la materia.
La curva del control negativo sigue estando cerca de cero hasta 600 minutos. En lo sucesivo, se puede observar un comienzo de aumento de ARspr atribuible a las interacciones no espedficas entre Streptococcus pneumoniae y la superficie del cono de control.
Ejemplo 3: Inhibicion de un crecimiento por adicion de antibiotico
La figura 5 presenta el impacto de la adicion de un antibiotico (ABT) (eritromicina, Aldrich) dirigido contra los neumococos, a la concentracion final de 40 mg/ml, y etanol (EtOH) a la concentracion final del 0,08%, sobre la reflectividad de un cultivo de Streptococcus pneumoniae, sembrado con 103 bacterias/ml, despues de 250 min de cultivo.
Se observa que la adicion del antibiotico provoca una clara disminucion de la pendiente de las curvas que reflejan la reflectividad particularmente marcada para los conos que portan los anticuerpos anti-CbpE y el plasminogeno. La disminucion esta, por lo tanto, asociada a una inhibicion del crecimiento bacteriano. Por otro lado, no se observo ninguna disminucion durante la adicion de solucion de control a la misma concentracion de etanol, lo que demuestra que la inhibicion del crecimiento bacteriano observado anteriormente es directamente imputable a la accion del antibiotico y no a un efecto de disolvente.
Por consiguiente, el procedimiento de cuantificacion del crecimiento bacteriano de la invencion es util para establecer un antibiograma.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de deteccion de al menos un microorganismo presente en una muestra, que comprende:
    - el cultivo en medio lfquido de la muestra en presencia de al menos un ligando espedfico del microorganismo y de al menos un sensor no espedfico del microorganismo, produciendo la union del microorganismo al ligando una primera senal medible y produciendo la union del microorganismo al sensor una segunda senal medible;
    - la determinacion de valores de la primera y de la segunda senal para al menos un periodo de cultivo;
    en el que se deduce que la muestra comprende el microorganismo cuando los valores de la primera senal y de la segunda senal para un mismo periodo de cultivo son diferentes.
  2. 2. Procedimiento de deteccion de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el periodo de cultivo es de al menos dos veces el tiempo de generacion del microorganismo.
  3. 3. Procedimiento de deteccion de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el microorganismo se selecciona entre el grupo constituido por una bacteria, un hongo, un alga, un protozoo y una celula aislada de metazoo.
  4. 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ligando se selecciona entre el grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un scFv, un aptamero (ADN, ARN), una protema o una glucoprotema, bacteriofagos o virus completos, fragmentos de bacteriofagos o de virus y protemas de bacteriofagos o de virus.
  5. 5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra se selecciona entre el grupo constituido por una muestra biologica, una muestra alimentaria, una muestra de agua, una muestra de suelo y una muestra de aire.
  6. 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando y/o el sensor estan fijados a un soporte de transduccion de la senal producida por la union de un compuesto al ligando y/o al sensor.
  7. 7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la primera y la segunda senal se miden en tiempo real.
  8. 8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la senal se mide por microscopfa, por resonancia de plasmon superficial, por espejo resonante, por medida de la impedancia, por microbalanza de cuarzo, por “viga” flexible, por medida de absorcion de la luz, o por medida de la fluorescencia de microorganismos fluorescentes.
  9. 9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la senal se mide en tiempo real por resonancia de plasmon superficial.
  10. 10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la senal medible de acuerdo con la invencion no proviene de un mediador o de un marcador presente en el medio, o anadido al medio, diferente del ligando y el sensor de acuerdo con la invencion.
  11. 11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que, cuando la muestra comprende un microorganismo, se determina ademas la cantidad de microorganismos presentes en la muestra al comienzo del cultivo a partir de la evolucion del valor de la primera senal en funcion del periodo de cultivo.
  12. 12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que, cuando la muestra comprende un microorganismo, la sensibilidad del microorganismo se determina a al menos un antimicrobiano a partir de la evolucion del valor de la primera senal en funcion de la duracion del cultivo despues de la introduccion del antimicrobiano en el cultivo.
  13. 13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se determina la presencia o la cantidad de varios microorganismos diferentes en la muestra.
  14. 14. Dispositivo adecuado para la implementacion de un procedimiento tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende al menos una camara adecuada para el cultivo en medio lfquido de un microorganismo, comprendiendo la camara al menos un ligando espedfico del microorganismo y al menos un sensor no espedfico del microorganismo, produciendo la union del microorganismo al ligando una primera senal medible y produciendo la union del microorganismo al sensor una segunda senal medible, estando el ligando y el sensor fijados a un soporte para estar en contacto con el medio de cultivo lfquido.
  15. 15. Dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 14, comprendido en un recipiente concebido para recoger lfquidos susceptibles de contener microorganismos y/o para cultivar microorganismos.
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