ES2644553T3 - Matrices densas de colágeno para la reparación tisular y su procedimiento de preparación - Google Patents

Description

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La figura 7 representa el aspecto macroscópico después de 15 y 30 días de implantación de una matriz densa a 300 mg/ml (MD 300).

La figura 8 representa el aspecto microscópico de matrices densas a 20 mg/ml (MD 20 figura 8A) y 40 mg/ml (MD 40 figura 8B) 15 días después de la implantación de forma subcutánea.

La figura 9 representa el aspecto microscópico después de 15 días de implantación de una matriz densa a 300 mg/ml (MD300) de forma subcutánea a un aumento x 4. Las flechas representan las células que migran/colonizan al interior del gel

La figura 10 representa el aspecto microscópico después de 15 días de implantación de una matriz densa a 300 mg/ml (MD300) de forma subcutánea a un aumento x 10. Las flechas representan las células que migran al interior del gel

La figura 11 representa el aspecto microscópico después de 15 días de implantación de una matriz densa a 300 mg/ml (MD300) de forma intramuscular a un aumento x 4. Las flechas representan las células que migran al interior del gel

La figura 12 representa el aspecto microscópico después de 15 días de implantación de una matriz densa a 300 mg/ml (MD300) de forma intramuscular a un aumento x 10. Las flechas representan las células que migran al interior del gel.

La figura 13 representa esquemáticamente el principio de la obtención de matrices densas por evaporación.

La figura 14 representa esquemáticamente el principio de la obtención de matrices densas por diálisis.

La figura 15 representa esquemáticamente el principio de la obtención de matrices densas en microceldas.

La figura 16 representa esquemáticamente el principio de la obtención de matrices densas por compresión.

EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE ACUERDO CON LA INVENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN

1.1. Preparación de las soluciones de colágeno iniciales

Un colágeno de tipo I se prepara a partir de colas de ratas Wistar jóvenes, de acuerdo con el siguiente modo operatorio. Los tendones de cola de rata se escinden en una campana de flujo laminar estéril, y a continuación se lavan en una solución tampón fosfato salina que contiene 137 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 8,07 mM de Na2HPO4 y 1,47 mM de NaH2PO4, para eliminar las células y los restos de sangre. Los tendones se sumergen a continuación en una solución de NaCl 4 M para eliminar las células intactas restantes y precipitar una parte de las proteínas con peso molecular elevado. Después de un nuevo lavado con la solución tampón salina, los tendones se disuelven en una solución acuosa a 500 mM de ácido acético. La solución obtenida de este modo se clarifica por centrifugado a 41000 g durante 2 h. Las proteínas diferentes del colágeno de tipo I precipitan de manera selectiva en una solución acuosa de NaCl 300 mM, y a continuación se eliminan mediante centrifugado a 41000 g durante 3 h. El colágeno se recupera a partir del sobrenadante por precipitación en una solución acuosa de NaCl 600 mM seguida de un centrifugado a 3000 g durante 45 min. Los sedimentos obtenidos de este modo se disuelven en una solución acuosa de ácido acético 500 mM, y a continuación se dializan cuidadosamente en el mismo disolvente para eliminar totalmente el NaCl. Las soluciones se mantienen a 4 °C y se centrifugan a 41000 g durante 4 h antes de utilizarlas.

1.2. Preparación del material homogéneo

Se introducen 18 ml de una solución de colágeno a una concentración de 3,2 mg/ml en un elemento de diálisis dotado de un empujador eléctrico tal como se describe en la figura 1. La velocidad de inyección se fija a 2 l/min. La diálisis se realiza a 19 °C en presencia de 150 ml de una solución a 500 mg/ml de polietilenglicol de peso molecular 35 kDa disuelto en una solución acuosa de ácido acético 500 mM. El tiempo de inyección es de 8 días seguidos de una parada de 4 días para alcanzar el equilibrio. La concentración de colágeno de la solución ácida tal como se determinó antes la fibrilogénesis mediante determinación de la cantidad de hidroxiprolina es de ∼250 mg/ml.

La fibrilogénesis se realiza por inmersión del material de colágeno en vapor de amoníaco durante 24 horas.

1.3. Medida de la homogeneidad del material obtenido

Se observan al microscopio electrónico de barrido muestras de material obtenido a partir de una solución que tiene una concentración inicial de colágeno soluble en ácidos ∼1 mg/ml (figura 3), bien de acuerdo con la técnica de diálisis inversa convencional, o bien de acuerdo con el procedimiento de la invención que tiene una concentración inicial de colágeno soluble en ácidos ∼3 mg/ml. (figura 2).

El colágeno (soluble en ácido) obtenido por diálisis es macroscópicamente inhomogéneo (figura 2A) y el tamaño de las fibras es inhomogéneo (figuras 2B a 2D). Por el contrario, el colágeno fibrilado obtenido mediante el procedimiento de acuerdo con la invención es macroscópicamente homogéneo (figura 4A) y el tamaño de las fibras

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