ES2644588T3 - Programación y reprogramación de células - Google Patents

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ES2644588T3 ES09763816.7T ES09763816T ES2644588T3 ES 2644588 T3 ES2644588 T3 ES 2644588T3 ES 09763816 T ES09763816 T ES 09763816T ES 2644588 T3 ES2644588 T3 ES 2644588T3
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Rudolf Jaenisch
Bryce Woodbury Carey
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Description

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poblaciones de células en diferentes momentos después de la infección. FIG. 26 ilustra la detección de pequeñas moléculas utilizando fibroblastos secundarios con factores que pueden ser inducidos de manera independiente. Fibroblastos primarios que llevan el M2rtTA viral y el marcador de OCT4-GFP se transdujeron con vectores inducibles por tamoxifeno de transducción de 3 factores y con un vector inducible DOX que transducen el cuarto factor (en este caso cMYC). Células iPS primarias serán derivadas por cultivo en el tamoxifeno y DOX y fibroblastos secundarios se derivan. Estas células, cuando se cultivan en tamoxifeno, se pueden examinar para las pequeñas moléculas que reemplazan cMYC para la reprogramación de células iPS secundarias. Las FIGS. 27A-27C muestran la caracterización de hiPSCs inducibles por DOX derivados de fibroblastos de pacientes con EP. FIG. 27A muestra la imagen de contraste de fase y tinción de inmunofluorescencia de líneas hiPSC M3F-1 (hiPSCs no-PD), PDA3F-1, PDB3F-5, PDC3F-1, PDD3F-1, y PDE3F-3 para marcadores de pluripotencia SSEA4, Tra-1-60, Oct4, Sox2 y Nanog. La FIG. 28A muestra RT-PCR cuantitativa para la reactivación de los genes relacionados con pluripotencia endógena NANOG, Oct4 y Sox2 en líneas hiPSC independientes, hESCs y fibroblastos primarios. Niveles relativos de expresión se normalizaron a la expresión de estos genes en fibroblastos. FIG. 28C muestra el análisis de metilación de región promotora OCT4. Cuadrados de color gris claro indican los cuadrados no metilados y negros indican los CpG metilados en el promotor OCT4 de hiPSCs y células de fibroblastos primarios parentales. Las FIGS. 28A-28C ilustran que hiPSCs derivados de pacientes con EP llevan números de copia bajos de integraciones víricas. FIG. 28A muestra hematoxilina y eosina de secciones de teratoma generados a partir de líneas hiPSC A6 (no-PD hiPSCs), PDA3F-1, PDB3F-1, PDC3F-1, PDD3F-1, y PDE3F-3 muestran: paneles de fila superior: el epitelio pigmentado de los nervios; paneles de 2ª fila: rosatas neuronales; paneles de 3ª fila: epitelio intestinal; oaneles de 4ª fila: hueso/cartílago; paneles de fila inferior: músculo liso. FIG. 28B muestra los resultados de análisis de transferencia Southern de línea BG01, células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y los hiPSCs derivados de pacientes con EP indicado (y línea M3F-1 hiPSC no PD) para integraciones provirales de ADN genómico digerido por XbaI utilizando sondas de ADN marcadas con 32P contra OCT4, KLF4, SOX2 y c-MYC. FIG. 28C es una tabla que resume el número aproximado de integraciones provirales para los cuatro factores de reprogramación en hiPSCs basados en el análisis de transferencia de Southern se muestra en la 28B. Las FIGS. 29A-29C muestran la generación de hiPSCs derivados del paciente PD utilizando factores de reprogramación escindible loxP. FIG. 29A es un dibujo esquemático de la construcción de lentiviral inducible por DOX FUW-teto-loxP, el locus genómico después de la integración proviral (2lox) y después de escisión mediada por Cre-recombinasa (1lox). El vector FUW-TetO-loxP contiene un elemento de respuesta de tetraciclina (TRE) situada 5' de un promotor de CMV mínimo y un sitio único MfeI utilizado para digestiones de transferencia Southern de diagnóstico. Los factores de reprogramación están flanqueados por sitios de restricción EcoRI. La LTR 3' de este vector lentiviral contiene un solo sitio loxP, que se duplica durante la replicación proviral en la LTR 5’. Esta duplicación resulta en un transgén flanqueado por 2 sitios loxP después de la integración genómica del provirus (2lox). Esto permite que la escisión del transgén en combinación con las secuencias promotoras completas utilizando Cre-recombinasa (1lox). (WRE = Woodchuck Response Element). FIG. 29B muestra la imagen de contraste de fase y tinción de inmunofluorescencia de líneas hiPSC PDB2lox-17 y PDB-21 para los marcadores de pluripotencia SSEA4, Tra-1-60, Oct4, Sox2 y NANOG. PDB2lox-17 y PDB2lox-21 se obtuvieron por expresión de los tres factores de reprogramación Oct4, Sox2 y KLF4 del virus FUW-teto-loxP se muestra en A. En estas células los tres factores de reprogramación están flanqueados por sitios loxP en su sitio de integración genómico. FIG. 29C muestra tinción de hematoxilina y eosina de una sección de teratoma generada a partir de células de PDB2lox-17 y PDB2lox-21 que llevan factores de reprogramación sujetos a impuestos especiales. FIGS. 30A-30D muestran generación y caracterización de hiPSCs libre de factor de reprogramación. FIG. 30A es una vista general esquemática de la escisión mediada por Cre de los transgenes para generar hiPSCs libres de factores de reprogramación. Células IPS PDB2lox se obtuvieron utilizando vectores lentivirales FUW-teto-loxP de transducción de 3 factores de reprogramación OCT4, KLF4 y SOX2. FIG. 30B muestra el análisis de transferencia Southern para las integraciones provirales de fibroblastos parentales (PDB), provirus portadores de clones PDB2lox (PDB2lox-17 y PDB2lox-21) y los clones PDB1lox indicados después de Cre-recombinasa mediada por la escisión de los transgenes. Clones puros indican PDB1lox, que se aislaron por selección de puromicina; GFP indica clones PDB1lox aislados por FACS de clasificación para EGFP (como se muestra en 30A). El ADN genómico fue digerido con XbaI y se sondó para integraciones provirales utilizando sondas de ADN marcadas con 32P contra OCT4, KLF4, y SOX2. Clones PDB1lox indicados en azul se tuvieron en cuenta debido a que quedan integraciones de transgenes sobre la base de la digestión MfeI mostrada en la Figura 34. La FIG. 30C muestra el análisis citogenético de líneas hiPSC PDB1lox-17Puro-5, y PDB1lox-21Puro-12 muestra cariotipo normal después de la escisión mediada por Cre de los transgenes. FIG. 30D es un resumen de la generación de hiPSCs libres de factor. FIG. 31A-31E muestra la caracterización de la reprogramación de hiPSCs libres de factores. FIG. 31A muestra la imagen de contraste de fase y tinción de inmunofluorescencia de líneas hiPSC libres de factor de reprogramación de PDB1lox-17Puro-5 y PDB1lox-21Puro-12 para los marcadores de pluripotencia SSEA4, Tra-1-60, Oct4, Sox2 y NANOG. FIG. 31B muestra RT-PCR cuantitativa para la reactivación de los genes relacionados con pluripotencia endógena NANOG, Oct4 y Sox2 en hESCs, fibroblastos (PDB), provirus portadores de clones PDB2lox (PDB2lox-17 y PDB2lox-21) y se indican clones PDB1lox después de escisión mediada por Cre-recombinasa de los transgenes. Niveles relativos de expresión se normalizaron a la expresión de estos genes en fibroblastos. FIG. 31C muestra hematoxilina y eosina de secciones de teratoma generadas a partir de PDB1lox-17puro-5 libre de factor y células
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Después de la transducción viral, se añadió doxiciclina al medio de cultivo para activar los transgenes e iniciar el proceso de reprogramación. Como era de esperar, aparecieron colonias iPS resistentes a Nanog-neo y positivos por Nanog-GFP y se establecieron líneas de células iPS clonales. Todas las líneas celulares iPS podrían ampliarse en ausencia de DOX, exhibir actividad de fosfatasa alcalina y homogéneamente expresar la marcadores de pluripotencia SSEA1, y Nanog (no mostrado). Esto indica que estas líneas de células iPS "primarias" habían activado su red transcripcional de núcleo de pluripotencia endógena y ya no se basó en la expresión exógena de 4 factores de reprogramación19. Para generar tejidos somáticos que estaban compuestos de células genéticamente homogéneas que llevan inserciones provirales idénticas conocidas para lograr la reprogramación en fibroblastos primarios, inyectamos varios de estas líneas clonales iPS primarias en blastocistos. Las quimeras de células iPS dox-inducibles resultantes se les permitió gestar hasta E13.5, en el que MEFs punto fueron aislados. A continuación se usó la selección de puromicina para seleccionar contra células derivadas del blastocisto huésped dejando sólo las células derivadas de iPS. Nos referiremos a las células tales como MEFs "secundarios", ya que se derivan de las células iPS primarias y por lo tanto llevan a un conjunto específico de inserciones provirales que es capaz de reprogramar células somáticas (FIG. 1A).
MEFs secundarios se aislaron de embriones quiméricos de células iPS generadas a partir de tres líneas celulares iPS distintas clonales primarias (una línea Nanog-neo y dos líneas de Nanog-GFP) y se cultivaron en presencia de DOX para determinar si los vectores lentivirales integrados retuvieron competencia para mediar en la reprogramación epigenética después de la diferenciación en el embrión en desarrollo. La adición de DOX a estos cultivos inició cambios morfológicos drásticos y líneas celulares "secundarias" iPS fueron eficientemente aisladas de estos cultivos por selección neo o la expresión de GFP y posteriormente se propagaron en ausencia de dox. Inmunofluorescencia demostró que las células iPS secundarias habían reactivado marcadores de pluripotencia de células de fosfatasa alcalina ES, SSEA1, y el gen endógeno Nanog (FIG. 1B y FIG. 6). la pluripotencia de estas líneas celulares se confirmó por su capacidad para formar células endodérmicas, ectodérmicas, y linajes mesodérmicos en ensayos de formación de teratomas y por su capacidad para contribuir a ratones quiméricos adultos tras la inyección de blastocisto (FIG. 1C, 1D).
Niveles de transgén de inducción, la cinética de reprogramación, y eficiencias varían entre MEFs secundarios derivados de líneas de células iPS distintas
Mientras que MEFs secundarios derivados de todas las tres líneas celulares iPS DOX inducibles se sometieron a la reprogramación para formar líneas de células iPS secundarias, nos dimos cuenta de diferencias con respecto a sus cambios morfológicos y las tasas de proliferación después del tratamiento dox. Inicialmente, MEFs de ambas líneas Nanog-GFP proliferaron para formar una monocapa de fibroblastos confluente después de la exposición a dox. Las células de NanogGFP línea 3 (NGFP3) se sometieron a proliferación robusta post confluente incluyendo el crecimiento de células en suspensión, mientras que las células de NanogGFP línea 2 (NGFP2) crecieron más lentamente, formando fosfatasa discreta alcalina positiva, ES como colonias sobre la monocapa de fibroblastos (FIG. 2A). Los fibroblastos derivados de la línea Nanog-neo nunca formaron una monocapa confluente después de la adición dox, pero generan colonias grandes, tridimensionales. Después de 12 días de administración de dox, las colonias de células iPS con morfología de células ES fueron fácilmente visibles en los tres cultivos (FIG. 2A, flechas).
Para evaluar la cinética de reprogramación en más detalle, MEFs de las tres líneas se cultivaron en medios que contienen DOX y análisis citométrico de flujo se utilizó para controlar la reactivación de SSEA1 y GFP (FIG. 2C). Todos los tres MEFs secundarios mostraron un aumento gradual de las células SSEA1-positivas en el transcurso del tiempo, pero se observaron algunas diferencias en el tiempo. Los MEFs NNeo mostraron el primer aumento de las células SSEA1-positivas de 1,3% a 17,8% entre los días 8 y 11. Los MEFs NGFP2 mostraron un aumento similar pero a un punto de tiempo mucho más tarde (del 4,4% al 29% entre los días 14 y 18). En contraste, los MEFs de la línea de células iPS NGFP3 mostraron una activación más lenta y gradual de SSEA1 alcanzando aproximadamente el 10% en el día 14. Se detectaron las primeros células GFP-positivas ya en el día 14 en NGFP2 y en el día 18 en MEFs de NGFP3.
Para controlar la temporización de la reactivación del locus Nanog endógeno en MEFs secundarias de NNeo, se platearon células y comenzamos la selección de medicamentos en diversos puntos temporales después del tratamiento dox. En contraste con la activación del gen reportero Nanog-GFP alrededor de 2 semanas después de la inducción, MEFs de NNeo fueron neomicina resistentes cuando se añadió neo a los cultivos ya en el día 4 (FIG. 2B). Esto podría reflejar una reactivación más rápida del locus Nanog similar a lo que hemos observado para la expresión SSEA1 en esta línea (FIG. 2C). Alternativamente, las colonias resistentes a neo puede aparecer antes de porque un bajo nivel de activación del gen Nanog es suficiente para dar resistencia a los medicamentos en contraste con la detección de GFP que requiere una mayor expresión14,20. Aunque la generación de células secundarias se selecciona para un conjunto específico de integraciones provirales la expresión de los cuales es capaz de inducir la formación de líneas de células iPS primarias, la cinética global de la activación de marcador de pluripotencia fueron similares a la observada en la infección directa de MEFs1,13,14. Esto apoya la idea de que el proceso de reprogramación requiere una serie de cambios epigenéticos secuenciales11,20.
A continuación se compara la eficiencia de reprogramación de los diferentes MEFs secundarios. Para
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sido infectadas directamente con vectores13,14. También se observó que cuando DOX fue retirado de los cultivos ya en el día 9, GFP+ secundarias iPS aparecieron las colonias continuamente durante las próximas semanas en ausencia de doxiciclina. Estos resultados apoyan la idea de que la reprogramación es accionada por una secuencia estocástica de modificaciones epigenéticas que requieren un período mínimo de expresión del transgén.
La eficiencia de reprogramación observada de MEFs secundarias fue tan alta como 4%, que es comparable a la eficiencia de reprogramación de células B22 maduras y mucho más alta que la eficiencia estimada 0,1% usando nueva infección y el fármaco de selección, y aproximadamente 8 veces superiores de lo que se ha reportado el uso de criterios de selección morfológica1, 11, 12. Ha sido bien documentado que las células iPS derivadas de MEFs infectadas llevan un promedio de 15 copias provirales diferentes que sugieren una fuerte selección para la pequeña fracción de las células infectadas que llevan el número "correcto" de provirus, o que expresan los 4 factores con la estequiometría apropiada para la reprogramación exitosa. Por lo tanto, se esperaría que la frecuencia de reprogramación de MEFs secundarias fuera mayor debido a que estas células se han derivado clonalmente de las células infectadas que llevan a la combinación "correcta" de provirus. Si es así, ¿por qué 4% pero la mayoría, o la totalidad de células secundarias tratadas por DOX dan lugar a células iPS secundarias? Consideramos que varias explicaciones no se excluyen mutuamente. (i) Se ha establecido que subclones genéticamente idénticos de MEFs directamente infectados se reprograman en momentos significativamente diferentes o en absoluto11,20. Como se discutió previamente, esto sugiere que la reprogramación implica una secuencia de acontecimientos estocásticos de tal manera que las células que llevan un número idéntico de copias provirales activará los genes de pluripotencia endógenos en diferentes momentos. (ii) Nuestros datos también muestran que el tratamiento DOX no activa los provirus de manera uniforme en todas las células, sino más bien que existen diferencias en los niveles de inducción entre las células individuales. Debido a estos niveles de expresión variegada sólo una fracción de MEFs secundarios puede lograr suficientemente altos niveles de expresión o los correctos niveles de expresión relativos entre los factores y por lo tanto ser capaz de generar células de iPS secundarias.
Mientras que la reprogramación es inducida por la transducción viral de los 4 factores, el mantenimiento del estado pluripotente depende de la re-establecimiento del bucle autorregulador que implica la activación de los cuatro pluripotencia endógeno factores de Oct4, Nanog, Sox2 y TCF3 20, 23 y el silenciamiento de factores exógenos. Del mismo modo, MEFs secundarios fueron capaces de ser totalmente reprogramado a un estado pluripotente que se mantuvo en la ausencia de la expresión del transgen.
También usamos el sistema secundario para examinar el potencial de reprogramación de varios tipos de células somáticas adultas adicionales. Células de iPS podrían derivarse de otros muchos tejidos incluyendo el cerebro, epidermis, epitelio intestinal, células madre mesenquimales, fibroblastos de punta de cola, riñón, músculo y glándula suprarrenal a través del tratamiento DOX que indica que los provirus se activaron apropiadamente en tipos celulares distintos de los MEFs. Esto demuestra que los 4 factores de reprogramación pueden mediar la reprogramación epigenética en células con diferentes orígenes evolutivos y los estados epigenéticos y pone de relieve la utilidad del sistema secundario para el estudio de reprogramación en una amplia gama de tipos de células. Aunque se tuvo especial cuidado para evitar otros tipos de células contaminantes, no podemos demostrar inequívocamente las células de origen de las células iPS de estos diversos tipos de tejidos. Experimentos de linaje genético de rastreo de hecho han demostrado que las células iPS se pueden derivar de las células del hígado y el páncreas después de la transducción con Oct4, Sox2, c-Myc y Klf424,25. Sin embargo, no todos los tipos de células son permisivos para la reprogramación de estos cuatro factores. Hemos demostrado que la reprogramación de células B maduras, pero no inmaduras requirió la transducción de un factor adicional (c/EBP-alfa) o la inhibición de factor de transcripción específico de células B de Pax522. Es posible que se requieren factores adicionales y aún desconocidos para reprogramar ciertos tipos de células. Una ventaja práctica del sistema aquí descrito es que los tipos de células incluyen los que podrían ser refractarios a cultivo ex vivo y la infección retroviral, tales como células epiteliales intestinales pueden estudiarse.
El sistema inducible por fármacos descrito aquí representa una plataforma de reprogramación novela con cinética y eficiencias predecibles y altamente reproducibles (véase la figura complementaria. 7B) que debe facilitar el estudio de eventos moleculares que conducen a principios de reprogramación epigenética. Además, la homogeneidad genética de tipos de células secundarias proporciona la viabilidad de los enfoques de detección químicos y genéticos para mejorar la eficiencia de reprogramación. Como un ejemplo, se demuestra que el agente de desmetilación de ADN 5-Aza-desoxicitidina mejora sustancialmente la eficiencia de reprogramación. Además, tales exámenes también se pueden aplicar para identificar compuestos que sustituyen a los factores de reprogramación originales. Debido a que el estado reprogramado no depende de los factores exógenos, los transgenes pueden ser genéticamente extirpados y células secundarias pueden ser generadas por la formación de quimera que carecen de un factor de reprogramación en particular15.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Preparación e infección viral
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23) Hanna, J. et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell 133, 250-264 (2008).
24) Cole, M.F., Johnstone, S.E., Newman, J.J., Kagey, M.H. & Young, R.A. Tcf3 is an integral component of the core regulatory circuitry of embryonic stem cells. Genes Dev 22, 746-755 (2008).
25) Aoi, T. et al. Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science (2008).
26) Stadtfeld, M., Brennand, K. & Hochedlinger, K. Reprogramming of Pancreatic beta Cells into Induced Pluripotent Stem Cells. Curr Biol (2008).
27) Rheinwald, J. in Cell Growth and Division: A Practical Approach. (ed. R. Baserga) 81-94 (Oxford Press, Oxford; 1989).
28) Vescovi, A.L., Galli, R. & Gritti, A. in Neural Stem Cells: Methods and Protocols. (eds. T. Zigova, P.R. Sanberg & J.R. Sanchez-Ramos) 115-123 (Humana Press, 2002).
29) Ferraris, R.P., Villenas, S.A. & Diamond, J. Regulation of brush-border enzyme activities and enterocyte migration rates in mouse small intestine. Am J Physiol 262, G1047-1059 (1992).
EJEMPLO 2
I. Descripción general
A. Generación de herramientas para la manipulación genética de ES humanas y células iPS
El trabajo descrito en este documento proporciona enfoques robustos para dirigir genes en células de matices y para generar herramientas para la reprogramación de células somáticas en células iPS. Más específicamente, la recombinación homóloga se utiliza para insertar GFP en genes de linajes neuronales claves de matices y de las células iPS. El marcador de GFP se utiliza para aislar células precursoras neuronales a partir de células iPS manipuladas para evaluar su potencial de desarrollo. Los protocolos de reprogramación actuales se basan en retroviral de transducción mediada por vector de factores de transcripción que resulta en múltiples inserciones provirales en las células iPS. Este trabajo describe métodos que o bien evitan el uso de múltiples infecciones virales o todos, pero eliminan la necesidad de reprogramación mediada por virus.
1. Vectores retrovirales inducibles por DOX y tamoxifeno
Vectores retrovirales DOX inducibles han sido importantes para definir la activación secuencial de marcadores de pluripotencia y el tiempo mínimo de expresión de vector durante la reprogramación de células de ratón somáticas. Hemos generado vectores lentivirales inducibles que permitan la expresión temporal restringida de los factores de reprogramación.
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Vectores de lentivirus inducibles de DOX: Siguiendo la misma estrategia que se usa para los genes murinos que hemos generado vectores lentivirales que transducen Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc c-ADN humano, ya sea constitutivamente o bajo el control de un promotor inducible por DOX [Brambrink, 2008 # 6877]. Para generar un sistema inducible por DOX se infectaron fibroblastos humanos con un vector lentiviral que lleva el transactivador rtTA. FIG. 11A muestra la expresión dependiente de DOX alto de Oct4, Sox2, y KLF4 en fibroblastos transducidos con los respectivos vectores inducibles DOX. Del mismo modo, se observó robusta expresión transgénica dependiente de DOX en las células iPS derivadas de los fibroblastos infectados (dos paneles derechos de la FIG. 11A).
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Vectores de lentivirus inducibles por tamoxifeno: Para habilitar el control inducible independiente de vectores que también generó construcciones de fusión Oct4, Sox2 y receptor de estrógeno C-MYC (ER) mediante la fusión de los factores al dominio de unión de ligando estrógeno para permitir la expresión dependiente de tamoxifeno [Grandori, 1996 # 6505]. Como se muestra en la FIG. 11B, la adición de tamoxifeno a las células transducidas con una construcción de fusión SOX2-ER conduce a la translocación de la proteína SOX2 desde el citoplasma al núcleo como se espera para la activación inducida por fármacos. Estos resultados muestran que los sistemas inducibles por DOX y de fusión ER pueden ser utilizados para controlar independientemente la expresión de factores transducidas.
Un concepto importante es el uso de dos sistemas regulables diferentes, cada una expresión de control de un subconjunto de los factores. Por ejemplo, se podría colocar 3 de los factores bajo control de un primero (por ejemplo, dox-inducible) promotor inducible y el 4º factor de bajo control de un segundo promotor inducible (por
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prolina y glicina, deteriorando formación normal de enlace peptídico entre el P y G sin afectar traducción aguas abajo. Una secuencia 2A ejemplar es VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 35) a partir de FMDV, donde los residuos subrayados se conservan en muchos péptidos 2A. El extremo C terminal de los péptidos 2A cardiovirus se conserva, muestra un alto grado de similitud con el péptido de FMDV 2A, y se ha demostrado que también media auto-escisión (Donnelly, ML, et al., J. Gen. Virol., 78, 13 -21 (1997). Péptido FDMV 2A se ha demostrado que media la escisión de una poliproteína artificial (Ryan, MD y Drew, J., EMBO J., 13, 928-933 (1994). La capacidad de expresar cuatro proteínas de manera eficiente y estequiométricamente de un policistron in vivo se demostró recientemente usando péptidos auto-procesamiento 2A para expresar las cuatro proteínas CD3 (Szymczak et al., Nature Biotech. 5, 589-594, 2004). genes policistrónicos trans-en el que se separan los ADNc individuales por péptidos 2A se han demostrado para promover la expresión del gen policistrónico en las células transfectadas, incluyendo células huES (Hasegawa, K., et al, Stem Células 2007 Jul; 25 (7): 1707-1712, 2007).
La presente invención proporciona constructos policistrónicos de ácido nucleico, casetes de expresión, y vectores útiles para la generación de células madre pluripotentes inducidas (IPS). En ciertas realizaciones, las construcciones de ácido nucleico policistrónico comprenden una porción que codifica un péptido autoescindible. la invención proporciona una construcción de ácido nucleico policistrónico que comprende al menos dos regiones de codificación, en que las regiones codificantes están unidas por un ácido nucleico que codifica un péptido autoescindible a fin de formar un único marco de lectura abierto, y en el que las regiones de codificación codifican factores primero y segundo de reprogramación capaces, ya sea solos o en combinación con uno o más de reprogramación adicional, de la reprogramación de una célula somática de mamífero a la pluripotencia, en el que la construcción de ácido nucleico no es un plásmido que comprende dos o más factores de reprogramación ligados a través de la secuencia 2A del virus de la fiebre aftosa. En algunas realizaciones de la invención, el constructo comprende dos regiones codificantes separadas por un péptido autoescindible. En algunas realizaciones de la invención, el constructo comprende tres regiones codificantes que codifica un factor de reprogramación, en el que las regiones codificantes adyacentes están separadas por un péptido autoescindible. En algunas realizaciones de la invención, la construcción comprende cuatro regiones de codificación de cada uno codifica un factor de reprogramación, en el que las regiones codificantes adyacentes están separados por un péptido autoescindible. Así, la invención proporciona construcciones que codifican una poliproteína que comprende 2, 3, o 4 factores de reprogramación, separados por péptidos de autoescisión. En algunas realizaciones, el constructo comprende un elemento de control de expresión, por ejemplo, un promotor, adecuado para dirigir la expresión en células de mamífero, en el que la parte de la construcción que codifica la poliproteína está unido operativamente al elemento de control de expresión. La invención proporciona así un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una poliproteína que comprende los factores de reprogramación, estando cada factor de reprogramación unido a al menos otro factor de reprogramación por un péptido autoescindible, unido operativamente a un promotor (u otro elemento de control de expresión adecuado). El promotor dirige la transcripción de un mensaje policistrónico que codifica los factores de reprogramación, cada factor de reprogramación se une a al menos otro factor de reprogramación por un péptido autoescindible. El promotor puede ser un promotor viral (por ejemplo, un promotor de CMV) o un promotor de mamífero (por ejemplo, un promotor PGK). El casete de expresión o constructo puede comprender otros elementos genéticos, por ejemplo, para mejorar la expresión o la estabilidad de una transcripción. En algunas realizaciones de la invención cualquiera de las construcciones anteriores o casetes de expresión pueden incluir, además, una región de codificación que no codifica un factor de reprogramación, en el que la región de codificación está separada de la región de codificación adyacente por un péptido autoescindible. En algunas realizaciones, la región de codificación adicional codifica un marcador seleccionable.
Factores de reprogramación específicos que pueden ser codificados por el constructo policistrónico incluyen factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, y Nanog, que se describen adicionalmente en este documento y conocidos en la técnica. La invención abarca todas las combinaciones de dos o más de los factores anteriores, en cada orden posible. Por motivos de brevedad, no todas estas combinaciones se enumeran de forma individual en el presente documento. En algunas realizaciones, el constructo codifica Oct4, Klf4, y Sox2, separadas por péptidos 2A. En algunas realizaciones, el constructo no codifica c-Myc. En algunas realizaciones, la construcción contiene una región de codificación que codifica Lin28. En algunas realizaciones, la construcción contiene una región de codificación que codifica C/EBP alfa.
En algunas realizaciones, la construcción comprende uno o más sitios que media o facilita la integración del constructo en el genoma de una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la construcción comprende uno o más sitios que media o facilita la orientación del constructo a un locus seleccionado en el genoma de una célula de mamífero. Por ejemplo, el constructo puede comprender una o más regiones homólogas a un locus seleccionado en el genoma.
En algunas realizaciones, el constructo comprende sitios para una recombinasa que es funcional en células de mamífero, en el que los sitios flanquean al menos la parte del constructo que comprende las regiones codificantes para los factores (es decir, un sitio está posicionado 5' y un segundo sitio se coloca 3' a la parte de la construcción que codifica la poliproteína), de modo que la secuencia que codifica los factores puede ser escindido del genoma después de la reprogramación. La recombinasa puede ser, por ejemplo, Cre o Flp, donde los sitios de recombinasa correspondientes son sitios LoxP y sitios FRT. En algunas realizaciones, la recombinasa es una transposasa. Se entenderá que los sitios de recombinasa no necesitan ser directamente adyacentes a la región que
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como fosfatasa alcalina, SSEA1, Oct4 y Nanog y que los factores de transcripción transducidos necesarios para ser expresados por al menos 12 días con el fin de dar lugar a células iPS [Brambrink, 2008 # 6877]. Un objetivo importante del objetivo A consiste en generar herramientas que ayudarán en la reprogramación de células somáticas y permitir la manipulación genética de células madre embrionarias humanas y iPS. Estas herramientas serán importantes para el objetivo B que se centra en el mecanismo de reprogramación de células somáticas humanas. El objetivo de objetivo C está estableciendo sistemas experimentales para evaluar el potencial de las células iPS humanas a diferenciarse en células neuronales funcionales in vitro así como in vivo en ratones quiméricos. Además, vamos a diseñar protocolos para generar células iPS a partir de sangre periférica humana. Finalmente, el enfoque de objetivo D es para la detección de compuestos químicos como alternativas a la activación de vías de reprogramación por medios genéticos.
A. Generación de herramientas para la manipulación genética de ES humanas y células iPS
La capacidad para alterar genéticamente genes endógenos por recombinación homóloga ha revolucionado la biología y, en combinación con las células madre embrionarias, da gran promesa para la medicina molecular. Aunque la orientación de genes es un procedimiento de rutina en células ES de ratón, ha sido previamente difícil de transferir esta tecnología a células madre embrionarias humanas [Giudice, 2008 # 6863]. De hecho, sólo 4 publicaciones han aparecido informando de focalización exitosa de un gen endógeno desde el primer aislamiento de células madre embrionarias humanas por Thomson hace 10 años [Davis, 2008 # 6860; Irion, 2007 # 6857; Zwaka, 2003 # 6223; Urbach, 2004 # 6163]. Las dificultades de la modificación genética de los genes endógenos han de superarse para desarrollar todo el potencial de las células madre embrionarias humanas.
El objetivo de este trabajo es el de establecer herramientas que permitan la manipulación genética eficiente de ES humanas y células iPS. Para producir las células que llevan marcador huES en genes específicos de linaje vamos a utilizar dos enfoques diferentes, genéticamente se crearon células ES humanas modificadas que llevan marcadores en reguladores de desarrollo clave usando recombinación homóloga convencional. Estos marcadores, insertados en genes específicos de linaje, serán utilizados en objetivos posteriores para la diferenciación de las células iPS en linajes neuronales específicos. Un sistema experimental que permite la reprogramación eficiente de células somáticas en la ausencia de retrovirus mediada por factor de transducción también se desarrolló.
El direccionamiento de genes específicos de linaje por recombinación homóloga
La derivación de células diferenciadas a partir de células ES no diferenciadas se facilita por los marcadores insertados en genes endógenos específicos de linaje que se pueden utilizar para el aislamiento de un tipo de célula diferenciada deseada. Nuestros experimentos preliminares demostraron la orientación de la OCT4, así como el locus COL1A1 con marcadores de GFP o de resistencia a fármacos. En consecuencia, un objetivo consistió en generar células ES y iPS que llevan marcadores de resistencia a fármacos y/o secuencias GFP (u otro marcador detectable) en genes que se expresan en células del linaje neural u otro y pueden utilizarse para el examen o selección de tipos de células diferenciadas que se ven afectados en enfermedades como el Alzheimer y el Parkinson.
(i) Orientación de genes de genes diana específicos de linaje neural por recombinación homóloga:
En contraste con las células ES de ratón, las células ES humanas están generalmente pasadas mecánicamente usando digestión enzimática sólo se limita como la clonación celular seleccionada de aberraciones cromosómicas que mejoran el crecimiento de células individuales. Esto, así como el lento crecimiento puede ser razones importantes que la orientación genética ha sido tan ineficiente en células huES. Recientemente, la aplicación del inhibidor de ROCA Y-27632 a células huES se ha demostrado que disminuye notablemente la apoptosis inducida por la disociación y para aumentar la eficiencia de clonación de [Watanabe, 2007 # 6549]. Todos los experimentos, por lo tanto, se harán en la presencia de este inhibidor.
Para la recombinación homóloga, vectores de abordaje que contienen GFP y marcadores de resistencia a neo separadas por secuencias 2A se construirá a partir de ADN genómico de las células isogénicas BGO2 o H9 ES utilizando procedimientos de rutina. El ADN se sometió a electroporación en las células tras procedimientos publicados [Costa, 2007 # 6868], y el ADN de colonias resistentes a fármaco se aislaron y analizaron para la orientación correcta. Vamos a apuntar a los genes que se activan en diferentes momentos durante la diferenciación neuronal y en diferentes subconjuntos de neuronas que se detallan a continuación.
SOX1: El factor de transcripción SOX1 es el gen más antiguo conocido que se expresa exclusivamente en precursores neuronales del ratón [Aubert, 2003 # 6841]. GFP insertado en este gen servirá como un marcador conveniente para la selección de huES o células precursoras neurales derivadas de células iPS.
FOXG1: La expresión de este gen se ha demostrado en la proliferación de células precursoras telencefálicas y en neuronas acetilcolinérgicas del cerebro anterior basal [Hebert, 2000 # 6844], las células que se ven afectadas en la enfermedad de Alzheimer.
PITX3: Este factor de transcripción del homeodominio se expresa selectivamente durante la diferenciación
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terminal de las neuronas positivas tirosina hidroxilasa y la clasificación de células ES diferenciadas derivadas de ratones transgénicos Pitx3-GFP se ha demostrado para enriquecer para las neuronas dopaminérgicas [Hedlund, 2008 # 6845; Zhao, 2004 # 6846].
LMX1: Este factor de transcripción del homeodominio parece ser un determinante crucial de la proliferación de células precursoras dopaminérgicas [Andersson, 2006 # 6840].
El marcado de genes específicos de linaje relevantes por GFP se ha demostrado que ayuda en el establecimiento de protocolos robustos diferenciación que permiten el aislamiento de poblaciones enriquecidas o incluso homogéneas de células diferenciadas. Células huES que llevan GFP en los 4 genes permitirán que el enriquecimiento para los precursores, así como células más diferenciadas que son relevantes para el estudio de las células iPS derivadas de pacientes con enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.
La dificultad de establecer métodos eficientes de recombinación homóloga ha impedido en gran medida la utilidad del sistema de pila de huES. Los datos preliminares son alentadores y demuestran que dos loci endógenos, Oct4 y COL1A1, se han dirigido con ADNc de GFP y puromicina de resistencia (FIG. 10). Sin embargo, hasta ahora sólo los genes que se expresan en células madre embrionarias (Oct4, dolor, ROSA26 [Irion, 2007 # 6857; Zwaka, 2003 # 6223; Urbach, 2004 # 6163]) o que están a punto de expresarse como MOXL1 [Davis, 2008 # 6860] han sido blanco en células madre embrionarias humanas. Además, el locus COL1A1 es altamente recombinogénico en células de ratón [Barba, 2006 # 6199] y la orientación de este locus puede no ser representativa de otros genes no expresados. Por lo tanto, porque nuestra intención es la de apuntar a los genes no expresados por recombinación homóloga, este objetivo plantea un desafío.
Células iPS "secundarias" llevan a diferentes combinaciones de factores de reprogramación
Hemos demostrado que las células iPS de ratón pueden llevar 15 o más inserciones provirales [Wernig, 2007 # 6641] lo que sugiere una fuerte selección para la pequeña fracción de células que albergan varias copias de cada vector para lograr altos niveles o una cierta estequiometría de la expresión del factor necesario para el inicio del proceso de reprogramación. Se describe aquí un sistema que evita la necesidad para la transducción viral y por lo tanto elimina la necesidad de seleccionar para la pequeña fracción de células que llevan la combinación "derecha" de provirus. De hecho, la generación de fibroblastos "secundarios" que se derivaron por clonación a partir de células iPS "primaria" y llevaban el número apropiado de DOX provirus inducibles que habían logrado reprogramación en el primer lugar nos permitió reprogramar las células B maduras a un estado pluripotente [Hanna, 2008 # 6842]. Este enfoque fue adaptado a las células humanas y generó fibroblastos secundarias que llevan los factores de reprogramación (i) ya sea como vectores provirales integrados en posiciones cromosómicas preseleccionadas o (ii) que se inserta por recombinación homóloga en un locus de expresión genómica. Este sistema se puede utilizar para determinar los mecanismos de reprogramación y para seleccionar moléculas pequeñas que mejoran la reprogramación o reemplazar cualquiera de los factores.
(i). Fibroblastos secundarios que llevan provirus pre-seleccionados: Para pre-seleccionar las células que llevan la combinación "derecha" y el número de copias retrovirales, un protocolo de dos pasos se pueden utilizar. Las FIGS. 23A-23B delinean el enfoque, que sigue la misma lógica utilizada para reprogramar las células B de ratón en células iPS [Hanna, 2008 # 6842]. En primer lugar, las células ES o iPS que llevan el marcador de GFP en el gen Oct4, así como un lentivirus transducido transactivador tet rtTA se diferencian en fibroblastos. Estos fibroblastos "primarios" se transdujeron con los cuatro factores utilizando vectores DOX inducibles y se cultivaron en presencia de DOX y se examinaron para la activación OCT4 para aislar células reprogramadas "primarias" iPS. Estas células iPS se diferenciarán en ausencia de DOX para generar fibroblastos "secundarios" (FIG. 23A). El fundamento para este enfoque es que los fibroblastos secundarios llevan la combinación "derecha" de copias del vector, ya que se seleccionaron como células iPS "primarias" en el primer paso. Estos fibroblastos secundarios son genéticamente homogéneos ya que surgen de una sola colonia iPS. Tras la adición de DOX a dichos cultivos los vectores integrados se reactivarán resultando en la generación consistente de células iPS "secundarias" sin que se requiera la nueva transducción de factores (FIG. 23B). Esto se puede utilizar para generar células humanas secundarias iPS (o ratón, mono, etc.), sin pasar por el proceso de generación de un animal de la célula iPS primaria. Alternativamente, vectores policistrónicos inducibles por DOX (FIG. 13A-13C) se pueden utilizar en lugar de los vectores de un solo factor para la generación de células iPS primarias. (ii). Fibroblastos secundarios que llevan factores de reprogramación en el locus COL1A1: En un esfuerzo para evitar todos los fibroblastos secundarios de infección retrovirus que llevan todos los factores de reprogramación en el locus COL1A1 o de otro locus no esencial, tal como ROSA26 o locus AAVS1 (un locus específico en el se integra virus que se asocia a adeno (AAV) se producen). En las células ES de ratón hemos demostrado que el locus COL1A1 se puede dirigir de manera eficiente lo que resulta en la expresión ubicua o inducible reproducible de los transgenes insertados [Barba, 2006 # 6199; Hochedlinger, 2005 # 5758]. Se construirán células reporteras que llevan, además del transactivador inducible rtTA DOX y el reportero OCT4 GFP un vector policistrónico insertado en el locus COL1A que codifica la totalidad o un subconjunto de los factores de reprogramación bajo el control del operador tet (FIG. 24). En esta ilustración, Oct4, Sox2 y cMYC se han insertado en el locus COL1A1. Fibroblastos primarios serán derivados in vitro y se infectarán con un virus KLF4 flanqueado por dos sitios lox.
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tales como la formación de teratoma y en la diferenciación in vitro.
Actualmente, la estrategia de aislamiento de células iPS específicas de pacientes prevé la reprogramación de células donantes derivadas de biopsias de piel profundas, un procedimiento que es más compleja y dolorosa que la recogida de sangre. Para la aplicación clínica de rutina que sería de interés evidente para diseñar protocolos reproducibles para el aislamiento de rutina de las células iPS específicas de pacientes a partir de muestras de sangre periférica. Anticipamos que los experimentos propuestos ayudarán en el establecimiento de tales protocolos.
Dada la facilidad y eficiencia de reprogramación de células B de ratón nos alienta que este protocolo también debe ser eficaz en la reprogramación de células derivadas de sangre periférica humana. Debido a que células B o iPS derivadas de células T llevarían a reordenamientos genéticos en el locus de Ig o TCR, respectivamente, puede ser ventajoso para aplicaciones terapéuticas potenciales para utilizar los macrófagos o monocitos como donantes como lo harían albergar cambios genéticos. Aunque no sabemos el mecanismo que causa que c/EBPalfa haga las células B maduras susceptibles a la reprogramación de Oct4, Sox2, cMYC y KLF4, puede implicar la conversión de la identidad de las células B a la de los macrófagos [Xie, 2004 # 5447]. Estas consideraciones sugieren que las células iPS derivadas de monocitos humanos pueden ser sencillas. Sin embargo, si los procedimientos desarrollados en el ratón fallan para producir células iPS humanas derivadas de la sangre, vamos a la detección de factores adicionales utilizando enfoques establecidos.
D. Cribado para moléculas pequeñas
La inducción de reprogramación por el vector de transferencia de genes mediados por retrovirus, en particular, la transducción de oncogenes, representa un serio impedimento para la aplicación terapéutica eventual de este enfoque. Por ejemplo, nosotros y otros [Okita, 2007 # 6542] hemos visto que los tumores se forman en quimeras producidas con células iPS debido a activación v-myc de c-Myc. Es, por tanto, de interés para identificar moléculas pequeñas que o bien mejoran la eficiencia de reprogramación o activarían una vía relevante y por lo tanto podría reemplazar la necesidad de expresar un factor dado, tal como C-MYC o KLF4. El objetivo de este objetivo consiste en establecer sistemas de ensayo basados en células de alto rendimiento para examinar bibliotecas químicas para tales compuestos.
D.1 Células de diseño y reporteras experimentales para cribados de biblioteca de moléculas pequeñas
Para detectar reprogramación en un cribado de alto rendimiento, necesitamos las células que llevan un marcador tal como GFP insertados en el OCT4 endógeno o locus NANOG. Dichas células no expresan el marcador pero puede ser utilizado para la detección de compuestos que activan cualquiera de los genes endógenos.
Para la creación de un cribado de alto rendimiento para la reprogramación tenemos en cuenta dos limitaciones principales que limitan el diseño experimental.
 Población celular heterogénea: Podría decirse que la limitación más crítica es que la transducción de fibroblastos con los cuatro factores producirá una población genéticamente heterogénea de células. Como se discutió anteriormente en VA3, es probable que sólo la pequeña fracción de las células infectadas que llevan un número específico de vectores virales que generan el nivel de expresión "derecho" o la combinación "derecha" de los niveles de expresión de los cuatro factores son los que se seleccionan al examinarse para reprogramación. Por lo tanto, las células infectadas en pocillos individuales serán diferentes con respecto a la integración viral y el número de copias virales que excluyen una comparación significativa de pocillos expuestos a diferentes compuestos en una pantalla.
 Frecuencia de activación de marcador, la sensibilidad y las limitaciones de tiempo de ensayo: Otra consideración importante para la realización del cribado se refiere a la sensibilidad del sistema de detección: ¿cuántas células necesitan expresar el gen reportero GFP OCT4 para ser detectable en un pocillo dado? Expresión del gen informador es una limitación importante como la fracción de células reprogramadas necesita ser lo suficientemente alta para producir al menos un solo evento de reprogramación detectable en un pocillo con un compuesto activo. Además, las células reprogramadas aparecen en una población de fibroblastos sólo de 3 a 5 semanas después de la infección con los cuatro factores. De este modo, las células infectadas necesitan sobrevivir y proliferar en 96 ó 384 formatos de pocillo para este período de tiempo, lo que limita el número de células que pueden sembrarse.
Para superar estas limitaciones que generarán poblaciones de fibroblastos que son genéticamente homogéneas, ya que (i) llevan el número idéntico de integraciones de vector o (ii) realizan diversas combinaciones de factores de reprogramación inserta en un locus de expresión endógena por recombinación homóloga.
(i). Fibroblastos clonales "secundarios" que llevan una combinación específica y predeterminada de Provirus: Recientemente hemos demostrado que las células iPS de ratón "secundarias" se pueden derivar de células iPS "primarias" que habían sido generadas por la infección de los fibroblastos con DOX lentivirus inducibles transducen los cuatro factores de transcripción Oct4, Sox2, c-myc y Klf4 [Hanna, 2008 # 6842]. Debido a que la combinación "derecha" y el número de copias provirales se realizó en los fibroblastos "secundarios", no era
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necesaria una infección viral para inducir reprogramación de las células B a las células iPS secundarias. Vamos a seguir un protocolo similar para pre-seleccionar las células que llevan la combinación "correcta" y el número de copias retrovirales. Como se muestra en la FIG. 23A-23B, los fibroblastos "secundarios" se derivan de las células iPS "primarias" por la diferenciación in vitro sin DOX. En lugar de utilizar vectores que transducen un solo factor vamos a utilizar alternativamente un constructo policistrónico como se describe en la FIG. 13A-13C y 14A-14E para la transducción de diferentes combinaciones de factores. Como se indica en VI.A.3, este enfoque de la utilización de fibroblastos "secundarios" o células B resultó en la activación dependiente eficiente y DOX de los factores de reprogramación conducen a la formación iPS sin necesidad de infecciones de virus adicionales [Hanna, 2008 # 6842]. Para evaluar la fracción de células iPS que surgen después de la adición DOX vamos a la placa 500 a 1000 células por pocillo de placas de 96 pocillos y aproximadamente 100 células por pocillo en placas de 384 pocillos y evaluar la fracción de células positivas para GFP. Los resultados en el sistema de ratón indicaron que surgen células iPS secundarias sólo dos a tres semanas después de la inducción DOX. Debido a que las células pueden ser cultivadas durante sólo alrededor de 7 días en 96 o 384 pocillos vamos a tratar previamente los fibroblastos secundarios con DOX para diferentes tiempos antes de sembrado. (ii). Fibroblastos transgénicos que llevan factores de reprogramación DOX-inducible en el locus COL1A1: Hemos demostrado que los transgenes insertados en el locus COL1A1 son altamente expresados en ratones transgénicos y, si es bajo el control del operador tet, se activan de forma reproducible en todos los tejidos después de la aplicación DOX [Barba, 2006 # 6199; Hochedlinger, 2005 # 5758]. Vamos a insertar constructos policistrónicos que expresan diferentes combinaciones de 3 o de los cuatro factores de reprogramación bajo el control del operador tet en el locus COL1A1 de células huES que llevan el marcador de GFP en el locus OCT4 (FIG. 10). Además, las células se infectaron con un vector de lentivirus que transduce el transactivador rtTA. Las células se pueden diferenciar en fibroblastos secundarios que pueden ser seleccionadas para los compuestos que mejoran la reprogramación o sustituyen un factor dado (véase más adelante, FIG. 24).
D.2 Cribado para los compuestos que mejoran la eficiencia de reprogramación
Para examinar compuestos que aumentan la eficiencia de reprogramación vamos a cultivar células iPS secundarias que llevan la combinación “derecha" de los cuatro factores o fibroblastos que llevan los cuatro factores en el locus COL1A1 en presencia de DOX (FIG. 24). En experimentos preliminares vamos a determinar la fracción de células positivas para GFP que se pueden detectar en los cribados. Dado que la fracción de células reprogramadas derivadas de los fibroblastos transducidos con los cuatro factores es baja, puede ser difícil o imposible de detectar una sola célula reprogramada en las células 1000 o 100 que pueden sembrarse por placa de 96 o 384 pocillos, respectivamente, a menos que un compuesto dado que aumentaría significativamente la fracción de células reprogramadas. El ensayo tiene, sin embargo, un fondo muy bajo que compensa la señal inherentemente baja.
En los cribados de piloto vamos a examinar la fracción de células positivas para GFP que surgen en las cuatro células informadoras de factor, que se cultivan en presencia de DOX y tienen o no han sido tratados con 5azadC o infectadas con el vector DNMT1 ARNsi, ambos de los cuales se reducirán los niveles globales de metilación del ADN, un tratamiento que se ha demostrado para mejorar reprogramación de fibroblastos de ratón [Mikkelsen, 2008 # 6891]. La fracción de células positivas GFP bajo cualquiera de estas condiciones determinará cuántas células necesitan ser sembradas por pocillo para detectar un compuesto que potencia la fracción de células positivas para GFP en un cribado menos estricto. Un cribado más estricto consistiría en utilizar células que no han sido tratadas con 5-azadC o infectadas con el vector DNMT1 ARNsi ya que esto supervisaría las células no sensibilizadas para compuestos que activan de manera más eficiente el reportero que anteriormente.
D.3 Cribado para compuestos que sustituyen a cualquiera de los cuatro factores
Para examinar compuestos que podrían sustituir a cualquiera de los factores de retrovirus transducidos vamos a transducir células con vectores que pueden regularse de forma independiente. El concepto de este enfoque es que 3 factores estarán bajo el control de un sistema inducible y el cuarto factor bajo control inducible independiente. Vamos a utilizar dos estrategias diferentes para producir las células utilizadas para el examen.
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Vectores inducibles por tamoxifeno: Hemos generado vectores de transducción Oct4, Sox2, Klf4 y construcciones C-MYC receptor de estrógeno (ER) de fusión [Grandori, 1996 # 6505] cuya expresión se activa por la adición de tamoxifeno para el medio (FIG. 11B). Como se indica en la FIG. 26, fibroblastos primarios reporteros Oct4-GFP se transdujeron con retrovirus que expresan tres factores inducibles por tamoxifeno con el cuarto factor expresado a partir de un vector dependiente de DOX. Las células infectadas se cultivan en medio que contiene el tamoxifeno y DOX y células iPS "primarias" serán seleccionadas por la detección de la expresión de GFP. Como se describió anteriormente, se pueden derivar los fibroblastos secundarios, expuestos a tamoxifeno para activar los tres factores tamoxifeno-dependientes y se proyectarán para los compuestos de pequeñas moléculas que activan el GFP reportero en ausencia de la expresión de DOX y cMYC.
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Los fibroblastos transgénicos portadores de diferentes combinaciones de factores en el locus COL1A1: Vamos a perseguir una estrategia alternativa que evita la infección retroviral como se indica en la FIG. 24. Fibroblastos primarios se derivan de células huES que llevan además del marcador de OCT4-GFP y un transactivador M2rtTA tet de virus transducido un constructo policistrónico que codifica cualquier combinación de
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tres factores de reprogramación en el locus COL1A1 [Barba, 2006 # 6199; Hochedlinger, 2005 # 5758]; compárese la FIG. 13A-13C, 14A-14E). Los fibroblastos se transdujeron con un vector Lox flanqueado que lleva el 4º factor (KLF4 en la FIG. 24) y se pueden derivar células de iPS primarias. Después de transducción Cre para eliminar el vector KLF4 serán derivados fibroblastos secundarios. La exposición a DOX activará los tres factores dependientes de DOX insertados en el locus COL1A1 y las células se proyectarán para las pequeñas moléculas que activan el reportero GFP en ausencia del 4º factor (en este caso KLF4). Para sensibilizar el cribado vamos a utilizar las células que han sido tratadas con 5-aza-DC.
D.4 Plataformas de detección
El examen de bibliotecas de moléculas pequeñas se llevará a cabo en colaboración con el laboratorio de S. Ding en Scripps (véase la carta por S. Ding). Por ejemplo, el laboratorio Ding ha desarrollado y optimizado cribados de alto rendimiento fenotípicos basados en células [Xu, 2008 # 6875] y se identificó la molécula pequeña pluripotin que sostiene la autorrenovación de las células ES en medio definido químicamente y en ausencia de LIF [Chen, 2006 # 6871]. El cribado se basó en la expresión de un marcador de GFP promotor Oct4 conducido. Vamos a examinar los fibroblastos transgénicos Oct4-GFP que llevan las diferentes combinaciones de factores como se describió anteriormente para la activación GFP.
La actividad de cualesquiera de los compuestos que puntúan positivos en las cribados se verificará en condiciones de cultivo definidas. Una cuestión importante consistirá en investigar las vías moleculares que están implicadas en el proceso de reprogramación.
Efectos presuntos e interpretación: Esperamos que el cribado para la activación del gen OCT4 identificará compuestos que facilitan la transición de un estado epigenético somático a uno que es característica de las células pluripotentes y de este modo hacer el proceso de reprogramación más eficiente. Otro objetivo importante de estos experimentos consiste en encontrar compuestos de pequeñas moléculas que podrían sustituir a la necesidad de manipulaciones genéticas que involucran la transducción de genes que codifican oncogenes tales como cMYC, Oct4
o KLF4.
Los dos problemas potenciales más significativos para un cribado de alto rendimiento son (i) el tiempo requerido para que la reprogramación tenga lugar y (ii) si un evento de reprogramación rara se puede detectar en el número limitado de células que pueden sembrarse por pocillo de una placa de 96 o 384. Como se discutió anteriormente, vamos a preacondicionar las células para llevar el número "correcto" y la combinación de factores y sensibilizar adicionalmente las células para aumentar la frecuencia de la activación de la reprogramación inducida de los diversos genes informadores. Una vez que se han identificado compuestos que aumentan la eficiencia de reprogramación que serán utilizados como sensibilizadores en cribados posteriores para compuestos adicionales que podrían mejorar aún más la formación de células iPS.
Importancia: Las estrategias actuales para inducir la reprogramación confían en la transducción de oncogenes de gran alcance, un obstáculo para cualquier aplicación terapéutica. Este objetivo pretende identificar pequeñas moléculas que podrían activar las vías pertinentes y por lo tanto mejoraría la eficiencia y, posiblemente, reducir al mínimo las alteraciones genéticas necesarias para la inducción de reprogramación.
Significado e implicaciones a largo plazo
El método de la generación in vitro de células iPS pluripotentes promete revolucionar el estudio de enfermedades humanas complejas y tiene implicaciones significativas para el tratamiento eventual de enfermedades degenerativas. Reprogramación in vitro de células somáticas de ratón a un estado pluripotente se ha demostrado ser razonablemente eficiente y los mecanismos moleculares subyacentes de este proceso se están estudiando activamente. Sin embargo, la reprogramación de células humanas ha demostrado ser más laboriosa y cuestiones técnicas difíciles necesitan resolverse antes de que esta tecnología podría ser adaptada para su uso clínico. El trabajo descrito en el presente documento pretende definir los mecanismos moleculares que provocan la conversión de las células somáticas humanas a un estado pluripotente, para idear estrategias para evaluar el potencial de desarrollo de las células iPS humanas y para lograr la reprogramación sin la necesidad de la manipulación genética. El trabajo descrito en este documento contribuirá a la solución de algunos de los obstáculos importantes que actualmente obstaculizan la aplicación de la tecnología para estudiar enfermedades humanas y para su eventual uso de la terapia de trasplante de enfermedades degenerativas.
Ejemplo 3: Reprogramación de células somáticas murinas y humanas utilizando un único vector policistrónico
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación e infección viral.
La construcción de vectores lentivirales que contienen 4F2A Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc bajo el control del operador de la tetraciclina y un promotor mínimo de CMV se genera después de clonación EcoRI a partir de una
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teratomas que contenían células diferenciadas de las tres capas germinales (FIG. 16A). Por último, la inyección de células MEF iPS (# 4) en blastocistos generó quimeras postnatales (FIG. 16B), demostrando que un virus policistrónico único 4F2A puede reprogramar MEFs a un estado pluripotente.
Para determinar el número de provirus realizados en las líneas celulares 4F2A iPS, el ADN se extrajo y se sometió a análisis de transferencia de Southern usando una enzima que no corta en las secuencias del vector. El uso de sondas de Oct4, Sox2, c-myc y Klf4 para la hibridación, se detectaron bandas de peso molecular idéntico que confirman que las secuencias de factor se realizaron en un provirus. El número total de provirus fue entre uno y tres con la línea de células iPS # 4 que lleva un único inserto viral (FIG. 16C). Una de las dos integraciones de línea celular iPS # 1 no logró producir una banda después de c-Myc de hibridación, lo que sugiere que puede haber ocurrido su eliminación a 3' de las secuencias de c-Myc. Un segundo digesto confirmó el número de copias provirales (FIG. 18A).
Para estimar MEFs de eficiencia de reprogramación se infectaron con los vectores de 4F2A y rtTA y se sembraron a 0,25x10^6 por 10 cm de placa de cultivo de placa. Aproximadamente 70% de los MEFs fueron infectados según las estimaciones de la inmunotinción de Oct4 a las 48 horas después de la infección (FIG. 19A). Las células fueron cultivadas en medios ES que contiene DOX durante 20 días y posteriormente se transfirió a medio de células ES hasta colonias GFP+ se contaron en el día 25. Un promedio de ~ 14,7+4 colonias se detectaron en tres platos independientes (10 + 10 + 17) que indica una eficiencia relativa de 0,0001%. Esto es de una a dos órdenes de magnitud menor que la de los fibroblastos infectados 'primarios' (3, 7).
Para ensayar la cinética de la reprogramación utilizando el virus 4F2A hemos realizado experimentos DOX de abstinencia en la que en días especificados (es decir, 2, 4, 8, 12 etc) medios que contienen DOX se sustituyen con medio ES y el número de colonias Nanog-GFP+ se cuentan en el día 25. Mediante el uso de virus separadas inducibles por drogas para administración de cuatro factores se han informado que ~ 9-12 días es el tiempo mínimo requerido para la generación de células iPS estables (20, 21). Las células no pasan durante este tiempo con el fin de minimizar la duplicación de eventos de reprogramación. Dos experimentos independientes se realizaron y en ambos casos colonias Nanog-GFP+ estuvieron presentes en placas cultivadas en medios DOX durante 8 días, similar al tiempo mínimo requerido mediante el uso de virus separadas (FIG. 14B).
Estos datos demuestran que un único virus policistrónico que contiene los cuatro factores unidos por tres péptidos 2A permite la expresión del factor suficiente para generar células iPS a partir de células somáticas embrionarias o adultas. Significativamente, nuestros resultados también muestran que una única copia proviral policistrónica es suficiente para reprogramar las células somáticas para la pluripotencia.
GENERACIÓN DE CÉLULAS IPS HUMANAS USANDO UN VIRUS POLICISTRÓNICO ÚNICO
Para investigar si las células humanas podían ser reprogramadas con el vector policistrónico, queratinocitos neonatales de prepucio humano (NHFK) fueron transducidos tanto con rtTA constitutivo y vectores 4F2A DOXinducibles. La fracción de las células infectadas fue de 10%, determinada por tinción para Oct4 a las 48 horas después de la transducción (FIG. 20A). Las células se incubaron en medio de queratinocitos + DOX y se dejaron crecer durante 6 días hasta que se pasaron y se cultivaron en medios de células madre + DOX en placas gelatinizadas. Las colonias se detectaron por primera vez en el día 12 y la mayoría mostraron morfología transformada con unas pocas colonias que presentan una apariencia distinta que se asemejaba a la morfología de tipo hESC. Dos de tales colonias generadas en las infecciones independientes se recogieron entre 22 y 35 días después de la infección y se encontró que ampliaba colonias como distintas con morfología similar a células madre (FIG. 17A). Estas células se expandieron en ausencia de DOX y dieron lugar a una población homogénea idéntica a hESC (Ker-iPS) después de 2-5 pasajes adicionales. Las células teñidas para marcadores de pluripotencia AP, Oct4, Nanog, Sox2, SSEA4, Tra1-60, Tra1-81 (FIG. 17B, FIG. 10B) y tenía un cariotipo normal (FIG. 17C). Huella de ADN excluyó que dichas líneas celulares Ker-iPS eran contaminación a partir de células iPS humanas previamente establecidas o líneas HES de nuestro laboratorio (datos no mostrados). Para determinar el número de copias provirales en líneas celulares Ker-iPS se extrajo ADN genómico y se sometió a análisis de transferencia de Southern usando una enzima que no corta en las secuencias del vector. Las sondas para los cuatro factores de reprogramación muestran hibridación con banda de peso molecular similar de nuevo que indica que se llevaron en un único virus. Dos digestos diferentes (XbaI y BamHI) muestran el número de copias provirales 4F2A es de tres (# 1.1) y dos (# 3), respectivamente (FIG. 21A-B).
Para ensayar la pluripotencia, una línea, Ker-iPS # 1.1, se inyectó por vía subcutánea en ratones SCID. Estas células indujeron teratomas y después de un examen histológico se diferenció en células de las tres capas germinales (FIG. 17D). Además, células Ker-iPS #1.1, cuando se someten a un protocolo de diferenciación neuronal in vitro produce poblaciones de células progenitoras neurales nestina +, así como Tuj1 + neuronas post-mitóticas como se detecta por inmunotinción. (FIG. 17E).
DISCUSIÓN:
Los experimentos descritos anteriormente muestran que hasta cuatro factores de reprogramación diferentes
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27. Hockemeyer D, Soldner F, Cook EG, et al. (2008) A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency Cell Stem Cell 3, 346-353.
Ejemplo 4: Células madre pluripotentes inducidas humano libres de factores de reprogramación virales
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Cultivo celular
Todas las líneas celulares de fibroblastos primarios descritos en este documento se adquirieron de Coriell Cell Repository. Fibroblastos se cultivaron en medio de fibroblastos [DMEM suplementado con 15% FBS (Hyclone), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de ácidos no esenciales aminoácidos (Invitrogen) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen)]. HiPSCs y las líneas de células madre BG01 y BG02 (Código de NIH: BG01 y BG02; BresaGen, Inc., Athens, GA) se mantuvieron en capas de alimentación de mitomicina C (MMC) de fibroblastos de embriones de ratón inactivados (MEF) en el medio de células madre [DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado con 15% FBS (Hyclone), 5% KnockOutTM Serum Replacement (Invitrogen), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 0,1 mM β-mercaptoetanol (Sigma) y 4 ng/ml FGF2 (R&D Systems)]. Los cultivos se pasaron cada 5 a 7 días ya sea manualmente o enzimáticamente con colagenasa tipo IV (Invitrogen; 1,5 mg/ml). Las células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09, Wisconsin Alumni Research Foundation, Madison, WI) se mantuvieron en MMC-MEF inactivadas o en fibroblastos humanos MMC inactivado (D551; American Type Culture Collection, Manassas, VA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la diferenciación inducida por EB, las colonias ESC/hiPSC se recogieron usando 1,5 mg/ml de colagenasa tipo IV (Invitrogen), separado de las células alimentadoras MEF por gravedad, suavemente se trituraron y se cultivaron durante 10 días en placas de cultivo de suspensión no adherentes (Corning) en DMEM suplementado con 15% de FBS.
Para escisión de vector mediada por Cre-recombinasa, líneas hiPSC se cultivaron en (ROCK)-inhibidor de Rho cinasa (Calbiochem; Y-27632) 24 horas antes de la electroporación. Las células se cosachan usando tripsina al 0,05%/solución de EDTA (invitrogen) y 1 x 107 células resuspendidas en PBS fueron transfectadas ya sea con pcre-PAC (50 µg; Taniguchi et al., 1998) o co-transfectadas con pTurbo-Cre (40 µg; GenBank número de acceso AF334827) y pEGFP-N1 (10 m. g; Clontech) por electroporación como se describe previamente (Costa et al, 2007; Gen Sistema Xcell Pulser de Bio-Rad: 250 V, 500 µF, cubetas de 0,4 cm). Las células se sembraron posteriormente en capas alimentadoras MEF (DR4 MEFs para la selección de puromicina) en medio suplementado con ROCKinhibidor de hESC para las primeras 24 horas. Se seleccionaron las células que expresan Cre-recombinasa usando uno de los métodos siguientes: 1) adición de puromicina (2 µg/ml) 2 días después de la electroporación por un período de 48 horas. 2) FACS (FACS-Aria; BD-Biosciences) de una suspensión de células individuales para células EGFP que expresan 60 horas después de la electroporación, seguido por resiembra a una densidad baja en ROCKinhibidor que contiene medio de células madre. Las colonias individuales se recogieron 10 a 14 días después de la electroporación.
Construcciones virales
El vector lentiviral FUW-M2rtTA y vectores lentivirales que contienen c-ADN humano para KLF4 (FUW-tetOhKLF4), OCT4 (FUW-teto-hOCT4), SOX2 (FUW-teto-hSOX2), y c-MYC (FUW-teto-hMYC) bajo el control del operador de la tetraciclina y un promotor mínimo CMV se han descrito previamente (Hockemeyer et al., 2008). Para generar los vectores lentivirales DOX-inducibles sujetos a impuestos especiales Cre-recombinasa, un fragmento Not I/Bsu36 I que contiene el promotor CMV operador tetraciclina/mínima y el humano c-ADN, ya sea para KLF4, Oct4 o SOX2 se subclonaron a partir de cada vector FUW-tetO en los sitios Not I/BSU36 I de la FUGW-loxP, que contiene un sitio loxP en el LTR en 3 '(Hanna et al., 2007).
Infección lentiviral y derivación hiPSC
Lentivirus recubierto de VSVG se generaron en células 293 como se ha descrito previamente (Brambrink et al., 2008). Brevemente, el medio de cultivo se cambió 12 horas después de la transfección y se recogió el sobrenadante que contiene el virus 60-72 horas después de la transfección. El sobrenadante viral se filtró a través de 0,45 µm de filtro. Sobrenadantes que contienen virus se agruparon para 3 y 4 infecciones de factores y se suplementó con virus FUW-M2rtTA y un volumen igual de medio de cultivo fresco. 1x106 fibroblastos humanos se sembraron 24 horas antes de la transducción en matraces T75. Cuatro infecciones consecutivas en la presencia de 2 µg/ml de polibreno se realizaron durante un período de 48 horas. El medio de cultivo se cambió 12 horas después de la última infección. Cinco días después de la transducción, los fibroblastos se sometieron a pases usando tripsina y se re-sembraron en placa a diferentes densidades entre 5 X 104 y 2 x 105 células por 10 cm2 en platos recubiertos con gelatina. Para inducir reprogramación, medio de cultivo se reemplazó 48 horas más tarde por medio hESC suplementado con DOX (Sigma-Aldrich; 2 µg/ml). Colonias de hiPSCs fueron recogidas manualmente basándose en la morfología entre 3 y 5 semanas después de inducción DOX y manualmente mantienen y se pasaron protocolos de células madre de acuerdo en ausencia de DOX. Para determinar la eficiencia de reprogramación, 1x105 fibroblastos humanos fueron sembrados en platos de 10 cm2 recubiertos de gelatina. Eficiencias de reprogramación se calcularon después de 20 días sobre la base de inmunocitoquímica para los marcadores de pluripotencia Tra-1-60 y
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Tabla 4.
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Resumen de hiPSCs derivados de fibroblastos primarios
Línea celular parental
Donantea Edad de inicio de EP Edad en biopsia Factores de reprogramación Número de clones IPSC caracteri zados Clon ID iPSC
AG20443 (PDA)
Paciente de enfermedad de Parkinson, varón idiopático NA 71 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2, KLF4) 2 PDA3F -1, -5
AG20442 (PDB)
Paciente de enfermedad de Parkinson, varón idiopático 51 53 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2, KLF4) 5b PDB3F -1, -5, -8, -9, PDB3F -d12
AG20442 (PDB)
Paciente de enfermedad de Parkinson, varón idiopático 51 53 Factores FUW-tetO 4 (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) 5c PDB4F -1, -2, -3, -4, -5
AG20446 (PDC)
Paciente de enfermedad de Parkinson, varón idiopático 50 57 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2. KLF4) 1 PDF3F -1
AG20445 (PDD)
Paciente de enfermedad de Parkinson, varón idiopático 44 60 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2, KLF4) 3 PDD3F -1, -4. -7
AG20445 (PDD)
Paciente de enfermedad de Parkinson, varón idiopático 44 60 Factores FUW-tetO 4 (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) 5 PDD4F -1, -4, -5, -8, -9
AG08395 (PDE)
Paciente de enfermedad de Parkinson, hembra idiopática 83 85 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2, KLF4) 2 PDE3F -3, -4
GM0178 6
Portador congénito de disqueratosis, hembra - 30 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2, KLF4) 2 M3F-1, -2
GM0166 0
Portador Lesh-Nythan, hembra - 11 Factores FUW-tetO 3 (OCT4, SOX2, KLF4) 2d A1, A6
MRC-5
Fibroblastos de embriones masculinos MYC Factores FUW-tetO 4 (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) 2d D1, D4
N/A No disponible a información adicional sobre estas líneas de células de fibroblastos se puede obtener del Instituto Coriell. b PDB3F-12D se aisló en experimentos para determinar los requisitos temporales de la expresión del transgen. PDB3F-12d se aisló de los cultivos expuestos durante 12 días a la doxiciclina. c Estas células se obtuvieron en experimentos para determinar los requisitos temporales de la expresión del transgen. PDB4F-1 a -3 fueron aisladas de cultivos expuestos durante 8 días a doxiciclina, mientras que PDB4F-4 y -5 fueron expuestas a doxiciclina durante 10 y 12 días, respectivamente. d Estas células hiPSCs se han caracterizado anteriormente en (Hockemeyer et al., 2008..
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