ES2644668T3 - Agente de formación de inmunoimágenes para el uso con la terapia de conjugado de anticuerpo-fármaco - Google Patents

Description

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correlaciona con un encogimiento del tumor o la infrarregulación del objetivo, acoplado a una eficacia insuficiente). Este diagnóstico acompañante puede reducir el desgaste y ayudar a administrar una medicina eficaz a los pacientes con mayor rapidez. La proteína de unión similar a un anticuerpo para el diagnóstico acompañante, según se describe en la presente, también puede utilizarse para la detección de CA6 in vivo mediante la formación de bioimágenes PET. Para conseguir unos tiempos de exposición cortos y una formación de imágenes rápida, por ejemplo, en 48 a 24 horas o menos, con una alta señal de tumor a sangre, es necesario un ligante muy específico con la cinética de eliminación apropiada.

Se han desarrollado diferentes proteínas de unión similares a anticuerpos nuevas a partir de la secuencia del anticuerpo DS6, junto con un quelante adecuado y un radiomarcador, para cumplir con los requisitos de la formación de imágenes PET (por ejemplo, mejor penetración en el tumor, una cinética de eliminación más rápida, y una excelente proporción de tumor a sangre). Basándose en un factor de calidad de formación de imágenes (IFOM) predeterminado, se eligió un fragmento de anticuerpo de 70 kDa (una inmunoglobulina en tándem monoespecífica bivalente, denominada B-Fab) para la evaluación de la especificidad y, en último término, la traducción clínica. El formato de B-Fab proporciona las ventajas de: (1) una alta estabilidad frente al estrés térmico (incubación a 42ºC durante una semana); (2) alta estabilidad en suero humano (incubación a 37ºC durante 24 h); y (3) productividad razonable en cultivo de células provisional (2 mg/l). Comparados con los anticuerpos de longitud completa (150 kDa), los fragmentos de anticuerpos (50-75 kDa) muestran unas velocidades de eliminación renal y de eliminación sanguínea más rápidas, lo cual produce unas proporciones de señal a ruido más altas durante la formación de bioimágenes PET.

La proteína de unión similar a un anticuerpo B-Fab DS6 contiene dos sitios de reconocimiento del antígeno CA6 basados en los sitios de reconocimiento del antígeno CA6 del anticuerpo monoclonal humanizado DS6, y muestra una alta afinidad de unión con el antígeno CA6. Después de la conjugación con un quelante (por ejemplo, DOTA, NOTA, DTPA, TETA, o Df), el DS6 B-Fab se radiomarcó y se usó para experimentos de formación de bioimágenes PET in vivo.

Se emplearon metodologías de ADN recombinante convencionales para construir los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que forman el anticuerpo para el diagnóstico acompañante (basado en el anticuerpo DS6) de la invención, para incorporar estos polinucleótidos en vectores de expresión recombinantes, y para introducir dichos vectores en células hospedantes. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed.). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante, tal como se llevan a cabo habitualmente en la técnica, o según se describe en la presente. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada con relación a la química analítica, la química orgánica sintética y la química médica y farmacéutica, y los procedimientos y técnicas de laboratorio que implican, es muy conocida y se emplea habitualmente en la técnica. De modo similar, pueden emplearse técnicas convencionales para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación, formulación y administración de productos farmacéuticos, y el tratamiento de pacientes.

1. Definiciones generales

Tal como se emplean según la presente descripción, los siguientes términos y expresiones, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados. A menos que el contexto indique lo contrario, los términos y expresiones en singular incluyen el plural y viceversa.

El término “polinucleótido”, tal como se emplea en la presente, se refiere a polímeros de ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios con una longitud de al menos 10 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, o una forma modificada de cualquiera de estos tipos de nucleótidos. Estas modificaciones incluyen modificaciones de la base, tales como bromuridina, modificaciones de la ribosa, tales como arabinósido y 2’,3’-didesoxirribosa, y modificaciones del enlace internucleotídico, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El término “polinucleótido” incluye específicamente formas monocatenarias y bicatenarias del ADN.

Un “polinucleótido aislado” es un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético, o alguna de sus combinaciones, que, en virtud de su origen, el polinucleótido aislado: (1) no está asociado con todo o con una porción de un polinucleótido en el que puede encontrarse el polinucleótido aislado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que: (1) está exento de al menos otros polipéptidos con los que se encuentra normalmente, (2) está fundamentalmente exento de otros polipéptidos del mismo origen, por ejemplo, de la misma especie, (3) es expresado por una célula procedente de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente 50% de los polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales con los que está asociado en la naturaleza, (5) no está asociado (mediante una interacción covalente o no covalente) con porciones de un polipéptido con el que el “polipéptido aislado” está asociado en la naturaleza, (6) está asociado operablemente (mediante una interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado

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en la naturaleza, o (7) no aparece en la naturaleza. Este polipéptido aislado puede ser codificado por ADN genómico, ADNc, ARNm, u otro ARN, de origen sintético, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente exento de polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que podrían interferir con su uso (terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, para investigación, u otros).

Tal como se emplea en la presente, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos y murinos.

La expresión “anticuerpo humano”, tal como se emplea en la presente, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que sustancialmente se corresponden con secuencias de inmunoglobulinas de líneas germinales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos se producen en mamíferos no humanos que incluyen, pero no se limitan a roedores, tales como ratones y ratas, y lagomorfos, tales como conejos. En otras realizaciones, los anticuerpos humanos son producidos en células de hibridoma. En todavía otras realizaciones, los anticuerpos humanos se producen de modo recombinante.

Los anticuerpos naturales generalmente comprenden un tetrámero. Cada uno de estos tetrámeros generalmente está compuesto por dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, y cada pareja presenta una cadena “ligera” de longitud completa (que generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” de longitud completa (que generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Los términos “cadena pesada” y “cadena ligera”, tal como se emplean en la presente, se refieren a cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tenga secuencia de dominio variable suficiente para conferir especificidad por un antígeno objetivo. La porción amino-terminal de cada cadena ligera y pesada generalmente incluye un dominio variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que es generalmente responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena generalmente define un dominio constante responsable de la función efectora. Así, en un anticuerpo natural, un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada de longitud completa incluye un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3), en el que el dominio VH se encuentra en el extremo amino-terminal del polipéptido, y el dominio CH3 se encuentra en el extremo carboxilo-terminal, y un polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera de longitud completa incluye un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL), en el que el dominio VL se encuentra en el extremo amino-terminal del polipéptido, y el dominio CL se encuentra en el extremo carboxilo-terminal.

Las cadenas ligeras de mamíferos, en particular las cadenas ligeras humanas, se clasifican generalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y las cadenas pesadas humanas se clasifican generalmente como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG presenta varias subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. El IgM presenta subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgM1 e IgM2. IgA se subdivide de modo similar en subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgA1 e IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, los dominios variables y constantes generalmente están unidos a través de una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, por ejemplo, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2a ed., 1989). Las regiones variables de cada pareja de cadena ligera/pesada generalmente forman un sitio de unión al antígeno. Los dominios variables de los anticuerpos naturales generalmente muestran la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada pareja generalmente están alineadas mediante las regiones de marco, lo cual puede permitir la unión a un epítopo específico. Desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal, ambos dominios variables de cadena ligera y pesada comprenden generalmente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4.

La expresión “Fc nativo”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une al antígeno que resulta de la digestión de un anticuerpo o que es producido por otros medios, en forma monomérica o multimérica, y que puede contener la región de bisagra. La fuente de la inmunoglobulina original del Fc nativo es preferiblemente de origen humano, y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Las moléculas de Fc nativo están formadas por polipéptidos monoméricos que pueden estar unidos para producir formas diméricas o multiméricas mediante una asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas de Fc nativo varía de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, e IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, e IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido por disulfuro que surge de la digestión con papaína de una IgG. La expresión “Fc nativo”, tal como se emplea en la presente, es genérica para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.

La expresión “variante de Fc”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una molécula o una secuencia que se ha modificado a partir de un Fc nativo, pero que aún comprende un sitio de unión para el receptor de rescate FcRn (receptor de Fc neonatal). En la técnica se conocen ejemplos de variantes de Fc y su interacción con el receptor de rescate. Así, la expresión “variante de Fc” puede comprender una molécula o una secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende regiones que pueden eliminarse porque proporcionan unas características estructurales o una actividad biológica que no es necesaria para las proteínas de

unión similares a anticuerpos de la invención. Así, la expresión “variante de Fc” comprende una molécula o una secuencia que carece de uno o más sitios o restos del Fc nativo, o en la que uno o más sitios o restos del Fc se han modificado, que afectan o están implicados en: (1) la formación de enlaces disulfuro, (2) la incompatibilidad con una célula hospedante seleccionada, (3) una heterogeneidad N-terminal tras la expresión en una célula hospedante seleccionada, (4) la glicosilación, (5) la interacción con el complemento, (6) la unión a un receptor de Fc distinto del receptor de rescate, o (7) una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

La expresión “dominio de Fc”, tal como se emplea en la presente, incluye Fc nativo y variantes de Fc y secuencias, según se definió anteriormente. Al igual que los variantes de Fc y las moléculas de Fc nativo, la expresión “dominio de Fc” incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, digeridas a partir de un anticuerpo completo o producidas por otros medios.

La expresión “proteína de unión similar a un anticuerpo”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una molécula modificada no natural (o recombinante) que se une específicamente a al menos un antígeno objetivo. Incluye, por ejemplo, un fragmento F(ab), fragmentos F(ab’) y diacuerpos.

En ciertos aspectos, la “proteína de unión similar a un anticuerpo” comprende las respectivas secuencias de ADN de VL y VH procedentes de un anticuerpo dispuestas en tándem y separadas por una secuencia corta de enlazador de aminoácidos, según las siguientes fórmulas [I] y [II]:

VL1-L1-VL2-CL

[I]

VH1-L2-VH2-CH1

[II]

en las que:

VL1 es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina; VL2 es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina; VH1 es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina; VH2 es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina; CL es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina; CH1 es un domino constante de cadena pesada CH1 de inmunoglobulina; L1 y L2 son enlazadores de aminoácidos; y en la que los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula II forman un fragmento Fab (un fragmento

de inmunoglobulina en tándem monoespecífica bivalente).

En ciertos aspectos, VL1 y VL2 son polipéptidos idénticos, y en ciertos aspectos, VH1 y VH2 son polipéptidos idénticos.

En ciertos aspectos, cada uno de L1 y L2 tiene una longitud de al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos.

En ciertos aspectos, o generalmente, los dominios CL y CH1 están unidos mediante un enlace disulfuro.

En ciertos aspectos, cada uno de L1 y L2 es GGGGS o GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3).

En ciertos aspectos, el polipéptido de fórmula [I] comprende una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:1.

En ciertos aspectos, el polipéptido de fórmula [II] comprende una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:7. En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo comprende además al menos un radiomarcador,

un agente de formación de imágenes, un agente terapéutico, o un agente de diagnóstico.

En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo tiene una actividad específica de al menos 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 o 1,5 Ci/moles. En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo puede tener una Kd aparente como máximo de

8, 7, 6, 5 o 4 nM cuando la unión se mide mediante FACS, por ejemplo, con una proteína de unión similar a un

anticuerpo libre. En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo presenta una alta estabilidad al estrés térmico. De modo más específico, puede perderse menos del 25, 20, 15, 10 o 5% de proteína de unión similar a un anticuerpo soluble después de una incubación a 42ºC durante una semana.

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En ciertos aspectos, dicha proteína de unión similar a un anticuerpo presenta una alta estabilidad en suero humano. De modo específico, al menos 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de la proteína de unión similar a un anticuerpo puede ser monomérica después de una incubación a 37ºC durante 24 horas en suero humano.

Una proteína de unión similar a un anticuerpo “aislada” es una proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para la proteína de unión similar a un anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, la proteína de unión similar a un anticuerpo estará purificada: (1) hasta más del 95% en peso del anticuerpo, según se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferiblemente en más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente como para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o una secuencia de aminoácidos interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras empleando tinción de azul de Coomassie o, preferiblemente, de plata. Las proteínas de unión similares a anticuerpos aisladas incluyen la proteína de unión similar a un anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de la proteína de unión similar a un anticuerpo no estará presente.

Las expresiones “sustancialmente puro” o “sustancialmente purificado”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar, la que es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie comprende al menos aproximadamente 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En todavía otras realizaciones, la especie se purifica hasta una homogeneidad fundamental (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales), en la que la composición consiste fundamentalmente en especies macromoleculares individuales.

El término “antígeno” o la expresión “antígeno objetivo”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una molécula, o a una porción de una molécula, que es capaz de ser unida por un anticuerpo o por una proteína de unión similar a un anticuerpo, y que además es capaz de ser empleada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de este antígeno. Un antígeno objetivo puede tener uno o más epítopos. Con respecto a cada antígeno objetivo reconocido por una proteína de unión similar a un anticuerpo, la proteína de unión similar a un anticuerpo es capaz de competir con un anticuerpo intacto que reconozca al antígeno objetivo. Se entiende que una proteína de unión similar a un anticuerpo “bivalente”, distinta de una proteína de unión similar a un anticuerpo “multiespecífica” o “multifuncional”, comprende sitios de unión al antígeno que tienen especificidad antigénica idéntica.

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional generalmente es un anticuerpo híbrido artificial que presenta dos parejas de cadena pesada/cadena ligera diferentes y dos sitios de unión o epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos mediante una diversidad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, fusión de hibridomas

o enlace de fragmentos F(ab’).

Un fragmento F(ab), también denominado Fab, generalmente incluye una cadena ligera y los dominios VH y CH1 de una cadena pesada, en el que la porción de cadena pesada VH-CH1 del fragmento F(ab) no puede formar un enlace disulfuro con otro polipéptido de cadena pesada. Tal como se emplea en la presente, un fragmento F(ab) también puede incluir una cadena ligera que contiene dos dominios variables separados por un enlazador de aminoácidos y una cadena pesada que contiene dos dominios variables separados por un enlazador de aminoácidos y un dominio CH1. Un fragmento F(ab) también puede incluir un enlace disulfuro entre CL y CH1.

Un fragmento F(ab’) generalmente incluye una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene más de la región constante (entre los dominios CH1 y CH2), de modo que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula de F(ab’)2.

Un “diacuerpo” generalmente es un dímero de dos fragmentos variables monocatenarios (scFv) que consisten cada uno en las regiones variables de cadena pesada (VH) y variables de cadena ligera (VL) conectadas por un pequeño enlazador peptídico que es demasiado corto como para que las dos regiones variables se plieguen juntas, lo cual obliga a los scFv a dimerizarse.

Las expresiones “propiedad biológica”, “característica biológica”, y el término “actividad”, con referencia a una proteína de unión similar a un anticuerpo de la invención, se emplean de modo intercambiable en la presente e incluyen, pero no se limitan a, la afinidad y la especificidad por un epítopo, la capacidad de antagonizar la actividad del antígeno objetivo (o del polipéptido objetivo), la estabilidad in vivo de la proteína de unión similar a un anticuerpo, y las propiedades inmunogénicas de la proteína de unión similar a un anticuerpo. Otras características o propiedades biológicas identificables de una proteína de unión similar a un anticuerpo incluyen, por ejemplo, reactividad cruzada (es decir, con homólogos no humanos del antígeno objetivo, o con otros antígenos objetivo o tejidos, en general), y la capacidad para conservar unos altos niveles de expresión de la proteína en células de

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radionúclidos, radioisótopos, metales y radiometales. Los quelantes de tipo DOTA, cuando el ligando incluye funciones quelantes de bases fuertes, tales como grupos carboxilato o amina, son los más eficaces para quelar cationes de ácidos duros, en especial cationes de metales del Grupo IIa y del Grupo IIIa. Estos complejos de metalquelato pueden hacerse muy estables adaptando el tamaño del anillo al metal de interés. Además, puede conjugarse más de un tipo de quelante con la construcción objetivo para unir múltiples iones metálicos, por ejemplo, radionúclidos de diagnóstico y/o radionúclidos terapéuticos.

Los radiomarcadores, radionúclidos o radioisótopos de diagnóstico particularmente útiles que pueden unirse a los agentes quelantes del anticuerpo o de la proteína de unión similar a un anticuerpo modificada incluyen, pero no se limitan a, 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94Tc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I,131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, u otros emisores de rayos gamma, beta, o de positrones. Los radimarcadores de diagnóstico incluyen una energía de descomposición en el intervalo de 25 a 10.000 keV, más preferiblemente en el intervalo de 25 a 4.000 keV, y aún más preferiblemente en el intervalo de 20 a 1.000 keV, y aún más preferiblemente en el intervalo de 70 a 700 keV. Las energías de descomposición totales de los radionúclidos emisores de positrones útiles son preferiblemente < 2.000 keV, más preferiblemente menores que 1.000 keV, y lo más preferiblemente < 700 keV. Los radiomarcadores útiles como agentes de diagnóstico que emplean la detección por rayos gamma incluyen, pero no se limitan a: Cr-51, Co-57, Co58, Fe-59, Cu-67, Ga-67, Se-75, Ru-97, Tc-99m, In-111, In-114m, I-123, I-125,1-131, Yb-169, Hg-197, y T1-201. Las energías de descomposición de los radiomarcadores emisores de rayos gamma útiles son preferiblemente de 20 a 2000 keV, más preferiblemente de 60 a 600 keV, y lo más preferiblemente de 100 a 300 keV.

El término “paciente”, tal como se emplea en la presente, incluye, pero no se limita a, sujetos humanos y animales.

Un “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría de un tratamiento que emplee el anticuerpo o la proteína de unión similar a un anticuerpo modificada de la invención. “Trastorno” y “afección” se emplean de modo intercambiable en la presente e incluyen trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen a un paciente al trastorno en cuestión. En ciertos aspectos, el trastorno es un cáncer, tal como un cáncer de tumor sólido. En ciertos aspectos específicos, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, carcinoma ovárico, cáncer endometrial, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, cáncer de riñón, un cáncer del sistema linfático, un sarcoma o un carcinoma en el que se expresa CA6, u otro cáncer que aún deba determinarse, en el que el glicotopo CA6 se exprese predominantemente. El cáncer puede ser, por ejemplo, un carcinoma ovárico seroso, carcinoma ovárico endometriode, neoplasia del cuello uterino, neoplasia del endometrio, neoplasia de la vulva, carcinoma de mama, tumor pancreático, y tumor del urotelio.

Cualquier trastorno que pueda tratarse mediante la destrucción de poblaciones de células seleccionadas es adecuado para su uso con las proteínas de unión similares a anticuerpos descritas en la presente, tal como un cáncer, una enfermedad autoinmunológica, tal como lupus sistémico, artritis reumatoide, y esclerosis múltiple; el rechazo de injertos, tal como el rechazo a un transplante renal, el rechazo a un transplante de hígado, el rechazo a un transplante de pulmón, el rechazo a un transplante cardíaco, y el rechazo a un transplante de médula ósea; la enfermedad del injerto contra el hospedante; una infección viral, tal como una infección por mV, una infección por VIH, SIDA, etc.; y una infección parasitaria, tal como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis, y otras, según pueden determinar los expertos en la técnica.

Un nivel de expresión de referencia puede ser, por ejemplo, el nivel de expresión de CA6 en tejido no enfermo del paciente (por ejemplo, procedente del mismo tipo de tejido que el que contiene el tumor), o el estándar de referencia puede determinarse, por ejemplo, a partir de un estándar aceptado en la técnica, tal como derivado de los niveles de expresión en tejidos no enfermos procedentes de una población de individuos.

Los términos “tratamiento” o “tratar”, tal como se emplean en la presente, se refieren al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que presentan el trastorno, así como los propensos a presentar el trastorno, o aquellos en los que el trastorno debe prevenirse.

Las expresiones “composición farmacéutica” o “composición terapéutica”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un compuesto o una composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administran de modo adecuado a un paciente.

La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “vehículo fisiológicamente aceptable”, tal como se emplean en la presente, se refieren a uno o más materiales de formulación adecuados para realizar o potenciar el suministro de un anticuerpo o una proteína de unión similar a un anticuerpo modificada.

Los términos “cantidad eficaz” y “cantidad terapéuticamente eficaz”, cuando se emplean haciendo referencia a una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos o proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas, se refieren a una cantidad o dosis suficiente para producir un resultado terapéutico deseado. De modo más específico, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de un anticuerpo o una proteína de unión similar a un anticuerpo modificada que es suficiente para inhibir, durante algún período de tiempo, uno o más de los procesos patológicos clínicamente definidos asociados con el trastorno que se está tratando. Tal como se emplea en

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El desarrollo de una proteína de unión similar a un anticuerpo o sonda para el diagnóstico acompañante de formación de imágenes fundamentalmente requiere un proceso similar al descubrimiento de fármacos (por ejemplo, comenzando a partir de una sonda objetivo, dosimetría de radiación, estudios de toxicidad realizados con prácticas de laboratorio correctas, producción con prácticas de fabricación correctas, evaluación preclínica, validación preclínica de la sonda objetivo y evaluación clínica). Otros parámetros que pueden evaluarse son: el momento óptimo para realizar la formación de las imágenes con relación a la administración del trazador, la correlación con análisis ex vivo, la biodistribución del trazador y la especificidad de objetivo (ensayados con un fragmento radiomarcado no pertinente). Tras haber sido totalmente desarrollada, la sonda de formación de imágenes moleculares puede emplearse como prueba de diagnóstico acompañante de formación de imágenes moleculares para un agente o fármaco concreto.

Las proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas de la invención también son útiles para la formación de imágenes in vivo. Una proteína de unión similar a un anticuerpo marcada con un resto detectable puede administrarse a un animal, preferiblemente a la corriente sanguínea, y ensayarse la presencia y la localización del anticuerpo marcado. La proteína de unión similar a un anticuerpo puede marcarse con cualquier resto que sea detectable en un animal, mediante resonancia magnética nuclear, tomografía de emisión de positrones, u otros medios de detección conocidos en la técnica.

La técnica de formación de imágenes in vivo puede utilizarse para formar la imagen de un tejido, tal como un tejido tumoral, para evaluar el nivel de expresión del glicotopo CA6 en el tejido. La determinación del nivel de expresión de CA6 en el tejido es útil, por ejemplo, para determinar si un paciente, tal como un paciente de cáncer, sería un buen candidato para el tratamiento con un fármaco dirigido a un glicotopo CA6. Por ejemplo, la proteína de unión similar a un anticuerpo es útil como prueba de diagnóstico acompañante para un agente citotóxico huDM6-DM4.

En una realización, un paciente se evalúa para un tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4. El paciente se evalúa, por ejemplo, mediante la adquisición de información con respecto al nivel de expresión de CA6 en un tejido enfermo, tal como un tejido tumoral (por ejemplo, una biopsia de un tejido), y si se determina que el nivel de expresión de CA6 es mayor que 10% del nivel de expresión de referencia (por ejemplo, mayor o igual a 10%, 20%, 30%, 40% o más que un nivel de referencia), entonces se determina que el paciente es un buen candidato para un tratamiento con la molécula dirigida a CA6. Se predice que un paciente que es un buen candidato para un tratamiento con la molécula dirigida a CA6 responderá positivamente al tratamiento con la molécula. Se determina que un paciente que no presenta un nivel adecuado de expresión de CA6, por ejemplo, menor que 10% de expresión de CA6, comparado con un estándar de referencia, no es un buen candidato para un tratamiento con una molécula dirigida a CA6.

Un nivel de expresión de referencia puede ser, por ejemplo, el nivel de expresión de CA6 en un tejido no enfermo del paciente (por ejemplo, del mismo tipo de tejido que el que contiene el tumor), o el estándar de referencia puede ser determinado, por ejemplo, a partir de un estándar aceptado en la técnica, tal como el derivado de los niveles de expresión en tejidos no enfermos procedentes de una población de individuos.

En una realización, el nivel de expresión de CA6 en un tejido de un sujeto se adquiere indirectamente, tal como a partir de un proveedor de servicios, una institución médica, un hospital o una clínica o la consulta de un médico, o a partir de un profesional sanitario, tal como un médico o un enfermero, o a partir de un agente de seguros, o a partir de una base de datos. En otra realización, el nivel de expresión de CA6 se determina directamente, tal como mediante la administración al sujeto de la proteína de unión similar a un anticuerpo incluida en la invención, y determinar el nivel de expresión de CA6 mediante una técnica de formación de bioimágenes.

A un paciente que se ha determinado que es un buen candidato para un tratamiento con una molécula dirigida a CA6 opcionalmente se le puede administrar después la molécula dirigida a CA6. En algunas realizaciones, un paciente tratado con una molécula dirigida a CA6 se controlará a intervalos (por ejemplo, cada semana, cada dos semanas, cada mes, cada dos meses) después de la administración de la molécula dirigida a CA6 para determinar si el nivel de expresión de CA6 está cambiando (por ejemplo, está disminuyendo) después del tratamiento con la molécula dirigida a CA6. Si después de una cierta cantidad de tiempo, o después de que el paciente presente acontecimientos adversos, si el nivel de expresión de CA6 en el tejido enfermo sigue sin cambiar, puede tomarse la decisión de detener o de continuar el tratamiento con la molécula dirigida a CA6.

En una realización, un paciente se controla durante el tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4. El paciente se controla, por ejemplo, adquiriendo información con respecto al nivel de expresión de CA6 en un tejido enfermo, tal como un tejido tumoral, después de la administración de una molécula dirigida a CA6 o un tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4, y si se determina que el nivel de expresión de CA6 es mayor que 10% del nivel de expresión de referencia (por ejemplo, mayor o igual a 10%, 20%, 30%, 40%

o mayor que un nivel de referencia), entonces se determina que el paciente es un buen candidato para un

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tratamiento continuado con la molécula dirigida a CA6. Si se determina que el nivel de expresión de CA6 ha disminuido durante el tratamiento con una molécula dirigida a CA6, tal como huDM6-DM4, entonces se determina que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento con la molécula, y que el tratamiento con huDS6-DM4 debe continuar. Se determina que un paciente que no presenta un nivel adecuado de expresión de CA6, por ejemplo, menor que 10% de expresión de CA6, comparado con un estándar de referencia, o que presenta un mayor nivel de expresión de CA6, no es un buen candidato para un tratamiento continuado con una molécula dirigida a CA6.

La invención, según se describe en la presente, también se refiere a un kit que comprende una proteína de unión similar a un anticuerpo de la invención y otros reactivos útiles para detectar niveles de antígenos objetivo en muestras biológicas. Estos reactivos pueden incluir un marcador detectable, suero de bloqueo, muestra de control positivo y negativo, y reactivos de detección.

4. Composiciones de proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas y su administración

Las composiciones que comprenden proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas de la invención están dentro del alcance de la invención. Estas composiciones de diagnóstico, terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender una cantidad diagnóstica o terapéuticamente eficaz de una proteína de unión similar a un anticuerpo, o un conjugado de fármaco-proteína de unión similar a un anticuerpo, mezclado con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable seleccionado por su idoneidad con respecto al modo de administración.

Los materiales de formulación aceptables preferiblemente no son tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas.

La composición de diagnóstico o farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción, o la penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o bisulfito de sodio), amortiguadores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos), agentes de relleno (tal como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA)), agentes formadores de complejo (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina, o hidroxipropilbeta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa, o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas), agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes, agentes emulgentes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sales (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol, o polietilenglicol), alcoholes de azúcares (tales como manitol o sorbitol), agentes suspensores, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronic; PEG; ésteres de sorbitano; polisorbatos, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; Tritón; trometamina; lecitina; colesterol o Tyloxapol), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, o manitol sorbitol), vehículos de transporte, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18ª Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), y ediciones posteriores del mismo).

La composición de diagnóstico o farmacéutica óptima será determinada por los expertos en la técnica dependiendo, por ejemplo, de la vía prevista de administración, el formato de administración y la dosificación deseada. Estas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de eliminación in vivo de la proteína de unión similar a un anticuerpo.

El principal vehículo o portador en una composición de diagnóstico o farmacéutica puede tener una naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para la inyección puede ser el agua, una disolución salina fisiológica, o fluido cerebroespinal artificial, quizás suplementado con otros materiales habituales en composiciones para la administración parenteral. Otros ejemplos de vehículos son la disolución salina amortiguada neutra o la disolución salina mezclada con albúmina de suero. Otros ejemplos de composiciones farmacéuticas comprenden amortiguador de Tris con pH de aproximadamente 7,0-8,5, o amortiguador de acetato con pH de aproximadamente 4,0-5,5, que también pueden incluir sorbitol o un sustituto adecuado. En una realización de la invención, las composiciones de proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas pueden prepararse para la conservación mezclando la composición seleccionada con el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, las proteínas de unión similares a anticuerpos pueden formularse como un liofilizado empleando excipientes apropiados, tales como sacarosa.

Las composiciones de diagnóstico o farmacéuticas de la invención pueden seleccionarse para la administración parenteral. Como alternativa, las composiciones pueden seleccionarse para la inhalación o para la administración a través del tracto digestivo, tal como la administración oral. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro del conocimiento de la técnica.

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Los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de la administración. Por ejemplo, se emplean amortiguadores para mantener la composición al pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, generalmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones de diagnóstico o terapéuticas para su uso en esta invención pueden estar en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable y apirógena, que comprende la proteína de unión similar a un anticuerpo deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es el agua destilada estéril, en la que se formula una proteína de unión similar a un anticuerpo en forma de una disolución isotónica estéril conservada de modo apropiado. Otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que proporcione la liberación controlada o sostenida del producto, que después puede administrarse mediante una inyección de liberación lenta. También puede emplearse el ácido hialurónico, y éste puede tener el efecto de estimular la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen los dispositivos de administración de fármacos implantables.

En una realización, la composición de diagnóstico o farmacéutica puede formularse para la inhalación. Por ejemplo, una proteína de unión similar a un anticuerpo modificada puede formularse como un polvo seco para la inhalación. Las disoluciones de inhalación de proteínas de unión similares a un anticuerpo también pueden formularse con un propelente para la administración en aerosol. En otra realización, las disoluciones pueden nebulizarse.

También se contempla que ciertas formulaciones puedan administrarse por vía oral. En una realización de la invención, las proteínas de unión similares a un anticuerpo que se administran de este modo pueden formularse con

o sin los vehículos que habitualmente se emplean para preparar formas de dosificación sólidas, tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, puede diseñarse una cápsula para que libere la porción activa de la formulación en un punto del tracto gastrointestinal en el que la biodisponibilidad se maximice y la degradación presistémica se minimice. Pueden incluirse otros agentes para facilitar la absorción de la proteína de unión similar a un anticuerpo. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes suspensores, agentes disgregantes de comprimidos, y aglutinantes.

Otra composición de diagnóstico o farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de proteína de unión similar a un anticuerpo mezclada con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitarias. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina, o goma arábiga; o agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico,

o talco.

Otras composiciones de diagnóstico o farmacéuticas de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica, e incluyen formulaciones que incluyen una proteína de unión similar a un anticuerpo en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una diversidad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como vehículos de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de liberación lenta. Otros ejemplos de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas, copolímeros del ácido Lglutámico y gamma-etil-L-glutamato, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), etileno-acetato de vinilo, o poli(ácido D(-)-3hidroxiburítico). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica.

Las composiciones de diagnóstico o farmacéuticas de la invención que se van a emplear para la administración in vivo generalmente deben ser estériles. Esto puede lograrse mediante una filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización, empleando este método, puede realizarse antes o después de la liofilización y la reconstitución. La composición para la administración parenteral puede conservarse en forma liofilizada o en una disolución. Además, las composiciones parenterales generalmente se introducen en un recipiente que tiene un acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tenga un tapón que pueda ser atravesado por una aguja de inyección hipodérmica.

Tras haber formulado la composición de diagnóstico o farmacéutica, ésta puede conservarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones pueden conservarse en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiera una reconstitución antes de la administración.

La invención también incluye kits para producir una unidad de administración de dosis unitaria. Los kits pueden contener cada uno un primer recipiente que contiene una proteína seca y un segundo recipiente que contiene una formulación acuosa. Dentro del alcance de la invención también se incluyen kits que contienen jeringas prerrellenas de una única cámara y de múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas para líquidos y liojeringas).

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La composición también puede administrarse de modo local mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Cuando se emplea un dispositivo de implantación, éste puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación programada, o administración continua.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de realizaciones específicas de la invención y sus diversos usos. Solo se ofrecen con objetivos explicativos y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención de ninguna forma.

Ejemplo 1: Radiomarcaje y caracterización in vitro del anticuerpo monoclonal DS6 humanizado y DS6-DM4

Un agente de formación de imágenes moleculares clínicamente útil produce imágenes de alto contraste dentro de una cantidad razonable de tiempo después de la administración, demuestra penetración en el tumor, tiene una cinética de eliminación más rápida y muestra una excelente proporción de tumor a sangre. Una salvedad en la utilización de anticuerpos nativos intactos para la formación de bioimágenes es la cinética inherentemente lenta de la captación tumoral y la eliminación de la sangre; también tienden a presentar un efecto de fondo alto y se requiere un tiempo muy largo (de horas a días) para obtener imágenes claras del tumor.

Previamente se ha demostrado que un trazador radiomarcado, combinado con la formación de bioimágenes, puede trasladarse desde un modelo tumoral preclínico hasta un entorno clínico (Williams et al., 2008, Cancer Biother and Radiopharm 23(6):797; Liu et al., (2009) Mol Imaging Biol 12:530). Los inventores también han demostrado que un anticuerpo DS6 radiomarcado y DS6-DM4 se han dirigido con eficacia a tumores de xenoinjerto WISH en ratones. Basándose en estos resultados, se desarrollaron tres proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas para una farmacocinética optimizada como pruebas de diagnóstico acompañante basado en la formación de imágenes.

Ejemplo 2: Expresión de B-Fab de DS6 modificado

Se propagaron plásmidos de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera de las correspondientes construcciones en células de E. coli DH5. Los plásmidos empleados para la transfección se prepararon a partir de

E. coli utilizando el kit Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit (las secuencias de ADN y de los polipéptidos para la proteína de unión similar a un anticuerpo B-Fab aparecen en la Tabla 2).

La proteína de unión similar al anticuerpo DS6 B-Fab se produjo mediante la transfección transitoria de células HEK293 en medio FreeStyle F17 (Invitrogen). Siete días después de la transfección se recolectó el sobrenadante y se sometió a centrifugación y una filtración de 0,2 m para eliminar las partículas. La purificación se realizó mediante una captura sobre KappaSelect (GE Healthcare). Después de la unión en la columna KappaSelect, la columna se lavó con PBS o amortiguador HEPES (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, FP12016), seguido de una elución con glicina 0,1 M (pH 2,5) y una neutralización con Tris 1 M/HCl, pH 9. La etapa de refinamiento de la purificación consistió en una cromatografía de exclusión molecular empleando Superdex 200 (GE Healthcare) con PBS o amortiguador HEPES (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, FP12016). Después de la etapa de refinamiento, el producto de la purificación se concentró mediante ultrafiltración, y por último el DS6 B-Fab se esterilizó mediante filtración empleando una membrana de 0,22 m.

La concentración de proteínas se determinó mediante la medida de la absorbancia a 280 nm. Cada lote se analizó mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras para determinar la pureza y el peso molecular de cada subunidad y del monómero. La calidad del DS6 B-Fab purificado se comprobó mediante los métodos analíticos descritos a continuación.

Tabla 2. Secuencias de ADN y de los polipéptidos para B-Fab basado en DS6

Secuencia de aminoácidos para: VL1-L1-VL2-CL (SEQ ID NO: 1)

Secuencia de aminoácidos para: VL1 anti-CA6 (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoácidos para: Enlazador L1 (SEQ ID NO: 3)

GGGGSGGGGS

Secuencia de aminoácidos para: VL2 anti-CA6 (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoácidos para: CL de IGKC humana (SEQ ID NO: 4)

Secuencia codificante de ADN para: VL1-L1-VL2-CL (SEQ ID NO: 5)

Secuencia codificante de ADN para: VL1-L1-VL2-CL (SEQ ID NO: 6) Con secuencia señal

Secuencia de aminoácidos para:

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VH1-L2-VH2-CH1 (SEQ ID NO: 7)

Secuencia de aminoácidos para: VH1 anti-CA6 (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoácidos para: Enlazador L2 (SEQ ID NO: 3)

GGGGSGGGGS

Secuencia de aminoácidos para: VH2 anti-CA6 (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoácidos para: Domino constante de cadena pesada humano CH1 (SEQ ID NO: 9)

Secuencia codificante de ADN para VH1-L2-VH2-CH1 (SEQ ID NO: 10)

Secuencia codificante de ADN para VH1-L2-VH2-CH1 (SEQ ID NO: 11) Con secuencia señal

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Ejemplo 3: Desarrollo de proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas basadas en el anticuerpo DS6

Para desarrollar una proteína de unión similar a un anticuerpo para el diagnóstico acompañante basado en la

5 formación de imágenes para huDS6-DM4, se crearon tres proteínas de unión similares a anticuerpos modificadas (B-Fab, véase la Figura 1) basadas en las secuencias de unión de CA6 procedentes del anticuerpo monoclonal DS6 humanizado. Cada una de las tres proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas se purificó y se ensayó como se describe a continuación; los resultados aparecen en la Tabla 3. Las características deseables incluyen >95% de pureza mediante HPLC o SDS-PAGE, una concentración de 10 mg/ml, un péptido estable, una unión

10 similar al anticuerpo DS6, y la determinación de que la presencia de una etiqueta de polihistidina (6x-His) pueda afectar a los trazadores de PET. Otros criterios de selección incluyen: una señal tumoral de >5% ID/g; una proporción de tumor a músculo de 3:1; una eliminación renal eficaz; y una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre la captación no bloqueada y bloqueada (véase la Tabla 4 para un resumen de los criterios de calidad para B-Fab quelado radiomarcado).

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correspondiente intervalo de tiempo y se deconvolucionaron empleando la herramienta de reconstrucción de proteínas incluida en BioAnalyst de Applied Biosystems/MDS Sciex.

c) Identificación de proteínas mediante análisis de la huella de masa peptídica empleando LC-MS

La línea de interés se extrajo, se carbamidometiló y se digirió con la endoproteinasa tripsina. Después la muestra se

5 analizó mediante LC-MS/MS empleando un espectrómetro de masas OrbiTrap XL. Los espectros obtenidos se compararon con la base de datos definida por los usuarios Swiss-Prot PP a la cual se añadió el constructo concreto, así como con todas las especies de la base de datos Swiss-Prot.

Cada una de las tres proteínas de unión similares a un anticuerpo basadas en DS6 modificadas se conjugó químicamente con el quelante de cationes de ácidos duros DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10

10 tetraacético), se radiomarcó con 64Cu, y se empleó para experimentos de formación de bioimágenes PET in vivo en modelos tumorales preclínicos y en ensayos de unión celulares in vitro para caracterizar cada una de las tres proteínas de unión similares a un anticuerpo basadas en DS6 modificadas. En la Tabla 5 y en las Figuras 2-4 puede observarse un resumen de los datos de estas actividades y experimentos para cada anticuerpo modificado.

Tabla 5. Resumen de las actividades de las proteínas de unión similares a un anticuerpo modificadas de DS6

B-Fabs

Pureza (SEC)

>95%

Estabilidad in vitro: Estrés de congelación/descongelación (3x -80ºC/RT) Estrés térmico (1 semana a 42ºC)

Bien tolerado Bien tolerado

Estabilidad sérica (24 horas a 37ºC)

>90% monomérica

Afinidades de uniónFACS (estirpe celular WISH, CA6+)

2 nM

Rendimiento radioquímico

60-80%

Parámetros de formación de imágenes Tumor (WISH, CA6+) Tumor (A2780, CA6-)

7,5-10,4% ID/g 4-5,6% ID/g

Biodistribución Hígado Riñón Sangre Músculo

7-10% ID/g 57-73% ID/g 2-3% ID/g 1% ID/g

Proporción de tejido tumoral WISH a tejido normal: Tumor/sangre Tumor/músculo

4-6 9-11

Proporción de tumor WISH (CA6+) a tumor A2780 (CA6-)

1,7-1,9

WISH es una estirpe celular positiva para el antígeno CA6. A2780 es una estirpe celular negativa para el antígeno CA6.

Todas las anteriores proteínas de unión similares a anticuerpos y sus correspondientes conjugados con DOTA (1,52,5 DOTA/fragmento) presentan una alta afinidad (Kd = 4-20 nM) por las células CA6-positivas (estirpe celular

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