ES2644823T3 - Método para la calificación de preparaciones de pentosano polisulfato, materias primas y procesos de producción de estas - Google Patents

Método para la calificación de preparaciones de pentosano polisulfato, materias primas y procesos de producción de estas Download PDF

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ES2644823T3
ES2644823T3 ES14703299.9T ES14703299T ES2644823T3 ES 2644823 T3 ES2644823 T3 ES 2644823T3 ES 14703299 T ES14703299 T ES 14703299T ES 2644823 T3 ES2644823 T3 ES 2644823T3
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Lorenzo De Ferra
Annamaria Naggi
Maurizio Zenoni
Barbara Pinto
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Description

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DESCRIPCION
Metodo para la calificacion de preparaciones de pentosano polisulfato, materias primas y procesos de produccion de estas
La presente invencion se refiere a metodos y productos basados en la identificacion de las unidades estructurales caractensticas de pentosano polisulfato y el xilano correspondiente sin grupos sulfato, en particular a productos obtenidos mediante un metodo de calificacion y seleccion de procesos de produccion, materias primas, intermediarios, lotes de produccion de pentosano polisulfato basado en la identificacion de dichas unidades estructurales caractensticas.
Estado de la tecnica
Diversos productos farmaceuticos (por ejemplo, Elmiron®, CCRIS 8869, Fibrase®, Fibrezym®, HSDB 7294, Hoe/bay 946, NSC 626201, SP-54, Thrombocid®, PZ68, Hemoclar®, Fibrocid® y Tavan®) contienen, como ingrediente activo, pentosano polisulfato, un polisacarido cuyo esqueleto principal se constituye de secuencias de unidades de xilosa sulfatada unidas entre sf a traves de un enlace p-(1 —^4) glicos^dico.
Al obtenerse a partir de xilanos extrafdos de arboles altos como el haya, las ramificaciones del acido 4-O-metil- glucuronico se presentan y distribuyen de una manera no necesariamente regular.
La estructura qmmica del pentosano polisulfato informada en la literatura tecnica y cientifica corresponde a la siguiente formula 1:
imagen1
en donde R es H o SOaNa.
El producto comercial Elmiron® tiene un alto grado de sulfatacion y su peso molecular es de 4000 - 6000 Dalton. Por lo tanto, el pentosano polisulfato se compone de una mezcla de polisacaridos sulfatados diferentes entre sf en cuanto a longitud de la cadena y ramificacion. El pentosano polisulfato se usa en el campo farmaceutico como anticoagulante y en el tratamiento de la cistitis intersticial. Ademas muestra otras numerosas actividades biologicas que incluyen actividad antitumoral y antimetastasica, actividad antiviral y antiinflamatoria. Se ha propuesto como un agente terapeutico en la prevencion y el tratamiento de la enfermedad prionica. Tiene efecto en la inhibicion del crecimiento de los cristales de oxalato de calcio los cuales conducen a la formacion de calculos renales. Ademas mostro eficacia como agente antiartntico en animales que padecen de osteoartritis.
El grado de polimerizacion y la variedad estructural pueden influir fuertemente en la actividad biologica, inmunologica y toxicologica de los polisacaridos y de los polisacaridos sulfatados [T.Astrup Scand J Clin Lab Invest 137 (1952)].
Por lo tanto, es extremadamente importante un conocimiento profundo de las caractensticas estructurales del pentosano polisulfato para asegurar la eficacia terapeutica y la seguridad de los tratamientos farmacologicos que lo usan.
Debido al origen natural de la materia prima y debido a los procesos de aislamiento y produccion, pueden presentarse en la cadena polimerica de xilano polisulfato agrupamientos estructurales que contribuyen a incrementar su complejidad estructural. Por ejemplo, ademas de xilosa sulfatada y acido 4-O-metil-glucuronico sulfatado, pueden presentarse diferentes unidades de monosacaridos.
Ademas, pueden presentarse diferentes especies polimericas sulfatadas y no sulfatadas, tales como, por ejemplo, las derivadas a partir de otros polisacaridos presentes en la fuente natural de la materia prima.
En particular, la complejidad estructural del pentosano polisulfato puede aumentar adicionalmente en dependencia del metodo para la extraccion del xilano a partir de la fuente natural de la materia prima. De hecho dicho metodo de extraccion, en dependencia de su selectividad, proporcionara xilano con diferentes caractensticas y diferentes grados de pureza. Ademas, durante la transformacion del xilano en el producto final, es posible que se introduzcan nuevas impurezas y que se produzca la transformacion de los grupos qmmicos presentes o la introduccion de nuevos grupos qmmicos en la estructura polimerica. Estos factores pueden contribuir ademas a la complejidad del producto en su conjunto.
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En la actualidad, la caracterizacion estructural del pentosano polisulfato no se ha llevado al nivel de los detalles requeridos en vista de la complejidad del producto y por lo tanto no se adecua a la necesidad de garantizar el estandar de calidad y la equivalencia de la produccion de los farmacos en el mercado y a la prueba de la equivalencia de los productos farmaceuticos genericos.
Por lo tanto, se necesita urgentemente un progreso en la caracterizacion analttica del pentosano polisulfato y en la identificacion de sus unidades estructurales caractensticas.
En el presente contexto, unidad estructural caractenstica significa una parte de la estructura qmmica del pentosano polisulfato o del xilano usado para su preparacion. Sobre la base de dicha unidad estructural caractenstica pueden calificarse diversas composiciones o metodos de preparacion de estos polisacaridos.
La calificacion significa el reconocimiento de la idoneidad de una composicion de polisacarido o de un metodo para su preparacion para la fabricacion de un producto farmaceutico para el uso humano.
Resumen de la invencion
La invencion se basa en el descubrimiento de que la estructura del pentosano polisulfato en los productos farmaceuticos se caracteriza por la presencia de algunas unidades estructurales caractensticas que no se han identificado hasta ahora en la estructura qmmica de la formula 1 informada en la literatura.
Dichas unidades estructurales caractensticas se han identificado por el solicitante y son unidades de monosacaridos acetilados, y en particular unidades de xilosa acetilada sustituida con acido 4-O-metil-glucuronico.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a metodos para identificar la presencia de dichas unidades estructurales caractensticas en el pentosano polisulfato y en el xilano y a su aplicacion para la calificacion de preparaciones de pentosano polisulfato, sus materias primas tales como el xilano y sus procesos de produccion.
Un objeto adicional de la presente invencion es un metodo para la preparacion de pentosano polisulfato y xilano que comprende al menos una etapa de calificacion basada en dichas unidades estructurales caractensticas.
Breve descripcion de los dibujos
Fig. 1 - Espectro de RMN-1H de pentosano polisulfato
Fig. 2 - (A) Espectro de RMN HSQC de pentosano polisulfato (XS) y (B) de xilano sin grupos sulfato obtenido mediante desulfatacion del pentosano polisulfato (XSDS)
Fig. 3 - Espectro Maldi-TOF de xilano XSDS
Descripcion detallada de la invencion
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a polisacaridos de la formula 2
imagen2
en donde
R es H o SOaNa;
G es H, SOaNa o acetilo;
obtenido mediante un metodo que comprende al menos una etapa de identificacion o cuantificacion de unidades de monosacaridos acetilados, y en particular unidades de xilosa acetilada sustituida con acido 4-O-metil-glucuronico.
El pentosano polisulfato de la formula 2 se caracteriza por la presencia de unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O- metil-glucuronico y acetiladas (G = acetilo) las cuales representan unidades estructurales caractensticas identificadas por el solicitante.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a metodos para identificar la presencia de dichas unidades estructurales caractensticas en el pentosano polisulfato asf como tambien en el xilano y a su aplicacion para la calificacion de preparaciones de pentosano polisulfato, sus materias primas (xilanos) y sus procesos de produccion.
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En una modalidad adicional, la presente invencion se refiere al xilano de la formula 2 en donde R es hidrogeno y G es hidrogeno o acetilo caracterizado por la presencia de unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico y acetiladas (G = acetilo) las cuales representan unidades estructurales caractensticas identificadas por el solicitante.
La invencion se basa en el descubrimiento de que la estructura del pentosano polisulfato presente en productos farmaceuticos se caracteriza por la presencia de algunas unidades estructurales caractensticas las cuales pueden correlacionarse con la eficacia terapeutica y la seguridad del pentosano polisulfato.
En el presente contexto, los terminos "pentosano polisulfato para uso farmaceutico", "productos farmaceuticos que contienen pentosano polisulfato" y "pentosano polisulfato comercial" significan productos en el mercado y/o productos conocidos los cuales contienen pentosano polisulfato como ingrediente activo para uso farmaceutico, con referencia preferida al producto medicinal comercializado bajo el nombre de Elmiron®.
Mediante el analisis de muestras de pentosano polisulfato comercial mediante espectroscopfa RMN-1H, en particular Elmiron®, se han detectado las senales que corresponden a la estructura de polisulfato con alto grado de sulfatacion de la formula 1, en donde los grupos R son principalmente grupos sulfato, y ademas se ha encontrado inesperadamente que el espectro muestra la presencia de senales a aproximadamente 2,3 ppm que corresponde a la presencia de grupos acetilo y la division de algunos picos. En particular, se destaca la division de la senal a aproximadamente 3,48 ppm que corresponde al grupo metoxi de las unidades de acido 4-O-metil-glucuronico (Figura 1). Ademas, se han detectado senales en la region de 8,8 - 9,3 ppm debido a grupos piridinio derivados del procedimiento de sulfatacion usado para la produccion de pentosano polisulfato para uso farmaceutico.
La presencia de grupos piridinio unidos al pentosano polisulfato se informa en la literatura, por ejemplo en WO03073106 y Carbohydrate Polymers 16 (1991) 211 - 214.
Por el contrario, no se espera la division de la senal de RMN-1H con relacion al grupo metoxi de la unidad del acido 4-O- metil-glucuronico y la presencia de senales que corresponden a grupos acetilo sobre la base de la estructura qmmica del pentosano polisulfato informada en la literatura tecnica y cientffica y representada por la formula 1.
El solicitante ha tomado en consideracion la posibilidad de que la senal de RMN a aproximadamente 2,3 ppm se causo por trazas de solventes o sales usadas en el proceso de produccion de pentosano polisulfato y no eliminadas completamente durante la purificacion. Los analisis qmmicos tales como la determinacion de los aniones libres mediante HPLC, el analisis de solventes residuales por cromatograffa gaseosa y la comparacion de los desplazamientos qmmicos RMN-1H en la region de 2,3 ppm, permitieron excluir la presencia de especies tales como ion acetato y solventes tales como acido acetico y acetato de etilo en cantidades tales como para justificar la presencia de la senal de RMN-1H a aproximadamente 2,3 ppm en el espectro de pentosano polisulfato mostrado en la Figura 1.
Dicha senal de RMN-1H se atribuyo entonces a la presencia de un grupo acetilo unido qmmicamente al pentosano polisulfato.
El xilano de haya se usa como una materia prima en la fabricacion de productos farmaceuticos de pentosano polisulfato para uso humano.
El xilano nativo de haya se constituye de cadenas de xilosa 1-4 beta acetilada parcialmente en las posiciones 2 y 3; ademas existen unidades de acido alfa 4-O-metil-glucuronico unidas a la posicion 2 de la unidad de xilosa de la cadena de polisacarido [ver por ejemplo Carbohydrate Research 337 (2002) 373 - 377]. Los procesos usados comunmente para el aislamiento de xilano de haya implican el uso de soluciones fuertemente alcalinas en las cuales el xilano muestra una solubilidad bastante buena; bajo estas condiciones se produce la desacetilacion completa del xilano.
Por lo tanto, es sorprendente haber identificado la presencia de la funcion acetilo unida al pentosano polisulfato; en vista de las implicaciones potenciales sobre las actividades biologicas y toxicologicas del pentosano polisulfato para uso farmaceutico, el grupo acetilo es una unidad estructural caractenstica del producto.
Para la identificacion estructural de la unidad que caracteriza al pentosano polisulfato, se llevaron a cabo experimentos basados en espectroscopfa de RMN, lo que explota el potencial de esta tecnica en el analisis estructural de polisacaridos y polisacaridos sulfatados.
El espectro de RMN de Coherencia Heteronuclear Cuantica Simple (HSQC) de muestras de pentosano polisulfato muestra una serie de senales que corresponden a las diferentes posiciones de las unidades de xilosa y acido 4-O-metil- glucuronico del polisacarido (Figura 2-A).
La atribucion de cada senal detectada a posiciones qmmicamente definidas espedficas se dificulta por el gran numero de combinaciones estructurales similares entre sf presentes en el polisacarido, y por lo tanto por la presencia de una multitud de senales en el espectro de RMN de HSQC; esas senales estan cercanas entre sf en el espectro y parcialmente solapadas. La multiplicidad de posiciones similares qmmicamente, pero distinguibles espectroscopicamente, se deriva a partir de la combinacion de los diversos patrones posibles de sustitucion con grupos funcionales (sulfato, hidrogeno o acetilo) o ramificaciones de la unidad xilosa de la cadena, extremo reductor o extremo
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no reductor. Las senales que corresponden a las unidades de acido 4-O-metil-glucuronico, las cuales estan presentes en las diversas variedades estructurales posibles, solapan las senales que corresponden a las especies informadas anteriormente.
Esta situacion obstaculiza el trabajo de atribucion de todas las senales de RMN de HSQC a contextos estructurales espedficos.
Al repetir el experimento de RMN en muestras de pentosano polisulfato para uso farmaceutico que se habfan sometido a un procedimiento de desulfatacion exhaustiva para obtener el correspondiente xilano sin grupos sulfato, se encontro una mayor resolucion de las senales y la simplificacion del espectro HSQC. Los ambientes qmmicos que corresponden a las diferentes posiciones del polisacarido estan aparentemente mas diferenciados entre sf en el producto desulfatado que en el producto sulfatado. Ademas, la eliminacion de los grupos sulfato reduce la variabilidad estructural de las diferentes unidades constituyentes del polisacarido al tener en consideracion que ademas en el pentosano polisulfato, a pesar de su alto grado de sulfatacion, estan presentes unidades de sacarido no completamente sulfatadas y que cada una de ellas puede asociarse con una serie de senales de RMN. Por lo tanto, una reduccion de la variedad estructural corresponde a una simplificacion del espectro de RMN (Figura 2-B).
Por lo tanto fue posible, mediante la combinacion de varias tecnicas de RMN tales como el analisis HSQC, HMBC, TOCSY y COSY, encontrar que el grupo acetilo no se distribuye equitativamente entre las posiciones 2 y 3 de las unidades repetitivas las cuales constituyen el pentosano polisulfato, pero esta presente principalmente en la posicion 3 de las unidades repetitivas de xilosa.
Ademas, el solicitante encontro que dichos grupos acetilo se unen principalmente a la posicion 3 de las unidades de xilosa, las cuales tienen ademas una unidad de acido 4-O-metil-glucuronico en la posicion 2.
Por lo tanto, el solicitante ha determinado experimentalmente que el pentosano polisulfato para uso farmaceutico se caracteriza por la presencia de unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico y acetiladas, las cuales representan unidades estructurales caractensticas.
Esta determinacion de las unidades estructurales del polisacarido se ha confirmado mediante el analisis de espectroscopfa de masas del xilano obtenido mediante desulfatacion exhaustiva de pentosano polisulfato sobre el cual se llevo a cabo un analisis Maldi-TOF. La Fig. 3 muestra el espectro resultante que muestra la presencia de tres conjuntos diferentes de secuencias que difieren por el valor que corresponde a la masa de la unidad repetitiva de xilosa (132 daltons), que tiene las siguientes masas:
- la primera serie que tiene picos con masa de 701, 833, 965, 1165 Da, etcetera, que corresponden a oligomeros de polixilano (Xil)n
- la segunda serie que tiene picos con masa de 759, 891, 1023, 1155 Da, etcetera, que corresponden a oligomeros de polixilano con una ramificacion de acido 4-O-metil-glucuronico (Xil)n-(Xil-GlcAOMe)-(Xil)m
- latercera serie que tiene picos con una masa de 801, 933, 1065 Da, etcetera, que corresponden a oligomeros de polixilano con una ramificacion de acido 4-O-metil-glucuronico en la cual ademas esta presente un grupo acetilo (Xil)n-(Xil-OAc-GlcAOMe)-(Xil)m
Los resultados obtenidos a partir de la caracterizacion mediante espectroscopfa de masas MALDI-TOF muestran que el grupo acetilo se une a la estructura del polisacarido. Dichos resultados muestran ademas que el grupo acetilo esta presente principalmente en especies en las cuales ademas existe un grupo acido 4-O-metil-glucuronico. Al combinar adecuadamente los resultados del analisis de RMN fue posible llenar la Tabla 1 siguiente con la asignacion de las senales de RMN con relacion a la muestra obtenida mediante el procedimiento de desulfatacion.
Tabla 1
Posicion
Sacarido Tipo 1H ppm 13C ppm
1
Xil interno 4.47 104.61
Xil
nr 4.44 104.87
Xil
reda 5.17 94.98
Xil
redp 4.57 99.47
Xil
que tiene 4-MGA unido en 2 4.74 103.61
Xil
acetilado en 3 + 4-MGA unido en 2 4.63 104.17
4-MGA
unido a Xil 5.27 100.88
4-MGA
unido a Xil acetilado en 3 5.30 101.16
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2
Xil interno 3.29 75.69
Xil
nr 3.29 75.69
Xil
reda 3.53 74.39
Xil
redp 3.24 77.00
Xil
que tiene 4-MGA unido en 2
Xil
acetilado en 3 + 4-MGA unido en 2 3.68 78.41
4-MGA
unido a Xil 3.58 73.93
4-MGA
unido a Xil acetilado en 3 3.58 73.93
3
Xil interno 3.55 76.68
Xil
nr 3.42 78.66
Xil
reda 3.75 74.00
Xil
redp 3.55 76.68
Xil
que tiene 4-MGA unido en 2
Xil
acetilado en 3 + 4-MGA unido en 2 5.09 76.99
4-MGA
unido a Xil 3.65 75.21
4-MGA
unido a Xil acetilado en 3 3.80 75.22
4
Xil interno 3.78 79.36
Xil
nr 3.62 72.22
Xil
reda 3.78 79.36
Xil
redp 3.78 79.36
Xil
que tiene 4-MGA unido en 2 3.78 79.36
Xil
acetilado en 3 + 4-MGA unido en 2 3.94 78.87
4-MGA
unido a Xil 3.80 84.31
4-MGA
unido a Xil acetilado en 3 3.82 84.46
5
Xil interno 4.10 65.96
Xil
nr 3.96 68.21
Xil
reda 3.81 61.86
Xil
redp 4.10 65.96
Xil
que tiene 4-MGA unido en 2 4.10 65.96
Xil
acetilado en 3 + 4-MGA unido en 2 4.10 65.96
4-MGA
unido a Xil 4.03 73.22
4-MGA
unido a Xil acetilado en 3 4.64 72.67
5'
Xil interno 3.37 65.95
Xil
nr 3.30 68.21
Xil
reda 3.74 61.86
Xil
redp 3.37 65.95
Xil
que tiene 4-MGA unido en 2 3.37 65.95
Xil
acetilado en 3 + 4-MGA unido en 2 3.37 65.95
5
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40
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Otros
4-MGA O-CH3 unido a Xil 3.49 63.00
4-MGA
O-CH3 unido a Xil acetilado en 3 3.49 63.00
4-MGA
-COOH MGA unido a Xil 176.50
4-MGA
-COOH MGA unido a Xil acetilado en 3 177.00
Xil
O-Ac (metilo) 2.17 23.89
Xil
O-Ac (carbonilo) 176.60
TSP 0
Xil - xilosa
4-MGA -4-O-metN-glucur6nico TSP - trimetilsilMpropionato Ac - acetilo
nr- unidad de sacarido en el extremo no reductor reda - unidad de sacarido en el extremo reductor a redp - unidad de sacarido en el extremo reductor p
Mediante el uso de la informacion recogida a partir del analisis de muestras de xilano obtenidas mediante desulfatacion de pentosano polisulfato, fue posible completar la asignacion de las senales de RMN para el producto no desulfatado. Al combinar esta informacion con los resultados de los experimented de RMN, tales como HSQC, HMBC, TOCSY y COSY, llevados a cabo directamente sobre muestras no desulfatadas, se confirmaron los resultados del analisis estructural y se preparo la tabla 2 siguiente sobre la base de senales de RMN 1H y 13C de pentosano polisulfato.
Tabla 2
Posicion
Sacarido Tipo 1H ppm 13C ppm
1
Xil(S) interno 5.17 102.40
Xil(S)
nr 5.17 102.40
Xil(S)
reda 5.39 93.68
Xil(S)
redp 5.10 101.38
Xil(S)
que tiene 4-MGA(S) unido a 2
Xil(S)
acetilado en 3 + 4-MGA(S) unido a 2 5.00 106.73
4-MGA(S)
unido a Xil(S) 5.79 96.86
4-MGA(S)
unido a Xil(S) acetilado en 3 5.76 96.99
2
Xil(S) interno 4.47 75.85
Xil(S)
nr 4.49 75.39
Xil(S)
reda 4.35 78.16
Xil(S)
redp 4.42 75.88
Xil(S)
que tiene 4-MGA(S) unido a 2
Xil(S)
acetilado en 3 + 4-MGA(S) unido a 2 3.93 76.85
4-MGA(S)
unido a Xil(S) 4.32 78.22
4-MGA(S)
unido a Xil(S) acetilado en 3 4.31 77.76
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
3
Xil(S) interno 4.80 75.36
Xil(S)
nr 4.83 74.20
Xil(S)
reda 4.76 78.55
Xil(S)
redp 4.74 75.99
Xil(S)
que tiene 4-MGA(S) unido a 2
Xil(S)
acetilado en 3 + 4-MGA(S) unido a 2 5.25 75.96
4-MGA(S)
unido a Xil(S) 4.95 80.04
4-MGA(S)
unido a Xil(S) acetilado en 3 4.42 80.83
4
Xil(S) interno 3.97 77.38
Xil(S)
nr 4.57 74.40
Xil(S)
reda 3.89 77.78
Xil(S)
redp 3.97 76.70
Xil(S)
que tiene 4-MGA(S) unido a 2
Xil(S)
acetilado en 3 + 4-MGA(S) unido a 2 4.14 76.79
4-MGA(S)
unido a Xil(S) 3.45 84.04
4-MGA(S)
unido a Xil(S) acetilado en 3 3.45 84.04
5
Xil(S) interno 4.44 61.92
Xil(S)
nr 4.51 61.40
Xil(S)
reda 3.94 63.69
Xil(S)
redp 4.44 61.92
Xil(S)
que tiene 4-MGA(S) unido a 2
Xil(S)
acetilado en 3 + 4-MGA(S) unido a 2 4.29 65.60
4-MGA(S)
unido a Xil(S) 4.36 75.05
4-MGA(S)
unido a Xil(S) acetilado en 3 3.92 75.71
5'
Xil(S) interno 3.86 61.92
Xil(S)
nr 3.89 61.40
Xil(S)
reda 3.94 63.64
Xil(S)
redp 3.86 61.92
Xil(S)
que tiene 4-MGA(S) unido a 2
Xil(S)
acetilado en 3 + 4-MGA(S) unido a 2 3.69 65.60
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Otros
4-MGA(S) O-CH3 unido a Xil(S) 3.50 63.37
4-MGA(S)
O-CH3 unido a Xil(S) acetilado en 3 3.48 63.61
4-MGA(S)
-COOH 4-MGA(S) unido a Xil(S) 178.90
4-MGA(S)
-COOH 4-MGA(S) unido a Xil(S) acetilado en 3 178.44
Xil(S)
O-Ac (metilo) 2.30 23.37
Xil(S)
O-Ac (carbonilo) 176.14
Xil(S) - xilosa sulfato
4-MGa(S) - 4-O-metil-glucuronico sulfato
Ac - acetilo
nr- unidad de sacarido en el extremo no reductor reda - unidad de sacarido en el extremo reductor a red3 - unidad de sacarido en el extremo reductor 3
Basado en los resultados obtenidos, el solicitante ha atribuido al pentosano polisulfato para uso farmaceutico la estructura de la formula 2:
imagen3
en donde
R es H o SOaNa G es H, SOaNa o acetilo;
en donde el grupo estructural G, el cual puede ser un grupo acetilo, esta presente.
El solicitante ha definido experimentalmente que el pentosano polisulfato para uso farmaceutico se caracteriza por la presencia de unidades de xilosa sustituidas por acido 4-O-metil-glucuronico y acetilado (G = acetilo) como unidades estructurales caractensticas.
Esta alta especificidad estructural es un elemento que caracteriza al pentosano polisulfato usado como ingrediente farmaceutico activo para uso humano.
La identificacion de esta unidad estructural espedfica de pentosano polisulfato tiene diversas aplicaciones utiles, tales como la seleccion del metodo de aislamiento de la materia prima (xilano de haya), la evaluacion del proceso para la transformacion de xilano en el producto final que comprende las etapas de despolimerizacion y sulfatacion, los procedimientos para el aislamiento y purificacion del pentosano polisulfato resultante, la evaluacion de lotes de la produccion de intermediarios y de producto final.
Las caractensticas anteriores tienen una aplicacion practica adicional de la invencion, que consiste en el xilano obtenido mediante la desulfatacion de pentosano polisulfato o mediante otros metodos y representado por la formula 2 en donde R es hidrogeno y G es hidrogeno o acetilo, asf como tambien en el uso de dicho xilano como materia prima para la preparacion de pentosano polisulfato para uso farmaceutico mediante la preservacion de sus unidades estructurales.
Otra modalidad practica adicional de la presente invencion es la posibilidad de hacer mas significativos los controles del proceso en diferentes etapas de la produccion al enlazarlos con parametros estructurales espedficos.
Estos factores se tendran en cuenta en la produccion y comercializacion de pentosano polisulfato para uso farmaceutico y ademas deben considerarse como parte del proceso de registro del producto ante las autoridades reguladoras, tales como la FDA, para la autorizacion de versiones genericas del pentosano polisulfato.
Estas evaluaciones no se limitan a la comprobacion de la presencia de la unidad estructural caractenstica, sino ademas a su cuantificacion. Para este proposito, todavfa puede usarse la espectroscopfa de RMN. A traves de esta tecnica hemos encontrado que la presencia de los grupos acetilo esta principalmente en la posicion 3 de las unidades de xilosa repetitivas. Ademas, hemos encontrado que dichos grupos acetilo se unen principalmente a la posicion 3 de las
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unidades de xilosa que tienen ademas una unidad de acido 4-O-metil-glucuronico unida en la posicion 2. Mediante la integracion en el espectro HSQC de diferentes muestras de xilano y pentosano polisulfato, se determino la cantidad de unidades de xilosa que tienen tanto un grupo acetilo como una unidad de acido 4-O-metil-glucuronico (determinada mediante la integracion de la senal con relacion a la posicion 3 de la unidad de xilosa especificada), con respecto a las unidades de xilosa totales que portan una unidad de acido 4-O-metil-glucuronico en la posicion 2 (que integra las senales correspondientes de las posiciones 1). Basado en los datos obtenidos, el solicitante ha podido determinar que el contenido de unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico, las cuales tambien tienen un grupo acetilo en el pentosano polisulfato para uso farmaceutico y en el xilano correspondiente sin grupos sulfato, es al menos 20 %, preferentemente entre 35 % y 70 %, con respecto a la cantidad total de los residuos presentes del acido 4-O-metil- glucuronico.
Por lo tanto, las caractensticas preferidas de la presente invencion son xilano y pentosano polisulfato de la formula 2 que contienen al menos 20 % de unidades de xilosa sustituidas con un acido 4-O-metil-glucuronico acetiladas, como unidades estructurales caractensticas obtenidas con un metodo que comprende al menos una etapa de calificacion basada en dichas unidades estructurales caractensticas.
En otros aspectos particularmente preferidos, la presente invencion se refiere a xilano y a pentosano polisulfato de la formula 2 que contienen entre 35 % y 70 % de unidades de xilosa sustituidas con un acido 4-O-metil-glucuronico acetiladas, como unidades estructurales caractensticas obtenidas con un metodo que comprende al menos una etapa de calificacion basada en dichas unidades estructurales caractensticas.
Esta evaluacion cuantitativa implica multiples ventajas tales como la seleccion del metodo de aislamiento de la materia prima (xilano de haya), la evaluacion del proceso de transformacion del xilano en el producto final que comprende las etapas de despolimerizacion y sulfatacion, los procedimientos de aislamiento y purificacion del pentosano polisulfato resultante, la evaluacion de lotes de produccion de materia prima, intermediarios y producto final.
Despues, se tendran en cuenta ademas estas caractensticas estructurales relacionadas con la cuantificacion de la unidad estructural para la produccion y comercializacion de pentosano polisulfato para uso farmaceutico; ademas, estas caractensticas estructurales deben considerarse ademas como parte del proceso de registro del producto ante las autoridades reguladoras, tales como por ejemplo la FDA, para la autorizacion de versiones genericas de pentosano polisulfato.
La identificacion de las unidades estructurales caractensticas del xilano y polisulfato pentosano se llevo a cabo como se describio previamente mediante el uso de tecnicas espectroscopicas avanzadas, sin embargo, los metodos de la presente invencion no se limitan a estas tecnicas, sino que incluyen ademas el uso de la informacion relativa a la presencia y cuantificacion de dicha unidad estructural caractenstica determinada mediante cualquiertecnica analttica tal como espectroscopfa IR, analisis HPLC, analisis de los productos de despolimerizacion, ELISA, electroforesis capilar.
La ausencia o la presencia y la cuantificacion de las senales de la unidad estructural caractenstica se determinan mediante cualquier metodo que permita la identificacion en la preparacion de xilano o xilano sulfato como tales, sus fracciones o sus productos de hidrolisis. Por ejemplo, pueden usarse uno o mas de los siguientes metodos: resonancia magnetica nuclear (RMN), espectrometna de masas, por ejemplo espectrometna de masas por desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDl-MS), espectrometna de masas por ionizacion por electrospray (ESI MS), acoplada o no a tecnicas de separacion cromatografica (por ejemplo, exclusion portamano, ionica, etcetera).
Los metodos de la presente invencion usan preferentemente espectroscopfa de RMN, aun con mayor preferencia la espectroscopfa de RMN de HSQC.
Es de particular importancia el uso de la informacion relativa a la presencia y la cuantificacion de las unidades estructurales caractensticas para la calificacion y la seleccion de lotes de ingrediente activo de pentosano polisulfato farmaceutico. En ese caso, sobre la base de esta informacion puede tomarse la decision de aprobar, rechazar o posiblemente reelaborar lotes de pentosano polisulfato para uso farmaceutico.
Con el fin de ilustrar mejor la presente invencion sin limitarla, se dan a continuacion los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Procedimiento para la desulfatacion de pentosano polisulfato
500 mg de pentosano polisulfato (Elmiron ®) se convirtieron en la forma acida mediante tratamiento con una resina de intercambio ionico (Amberlite IR 120 H+) y la solucion resultante (50 ml) se neutralizo con piridina y despues se liofilizo. La sal de piridina se disolvio en una solucion de DMSO (2 ml) que contema 10 % de H2O y la solucion se calento a 80 °C durante 4 horas. Despues de este tiempo, la solucion se anadio a un volumen de agua al menos 3 veces mayor y se enfrio. La muestra de xilano sin grupos sulfato se aislo despues de operaciones de purificacion adecuadas (precipitacion, dialisis, cromatograffa de exclusion por tamano). Este procedimiento se repitio para preparar al menos 3 muestras (P5146, P5211 y P5212).
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Ejemplo 2
Procedimiento para el registro de espectros de RMN
Los espectros se registraron con un espectrometro Bruker AVANCE de 500 o 600 MHz equipado con una criosonda.
Preparacion de la muestra: se disolvieron aproximadamente 20 mg en 0,6 ml de D2O (agua deuterada D 99,9 %) o en una mezcla D2O/DMSO (dimetilsulfoxido deuterado) en relacion 1:9 y se transfirio a un tubo para analisis de RMN de 5 mm. Los espectros de RMN-1H se adquirieron a una temperatura de 303 Kelvin con saturacion previa de la senal de agua con un intervalo de reciclado de 12 s, para una serie de barridos de 16 a 24 para calibrar el espectro con respecto a TSP.
Ejemplo 3
Identificacion de los parametros caractensticos de la estructura del pentosano polisulfato o xilano sin grupos sulfato mediante RMN bidimensional (2D)
Los experimentos de RMN 2D pueden ser homonucleares (por ejemplo, COSY, TOCSY, etcetera) o heteronucleares (HSQC, HSQC-DEP, HMQC, HMBC, etcetera). Todos los espectros 2D (HSQC, HMBC, COSY, TOCSY y HSQC- TOCSY) se llevaron a cabo en muestras preparadas en las mismas condiciones descritas para el espectro RMN-1H y se adquirieron a una temperatura de 303 Kelvin, se calibro el espectro con respecto a TSP si se realizo en solvente D2O y con respecto al pico del solvente DMSO, si los espectros se llevaron a cabo en el solvente DMSO/D2O.
Los espectros bidimensionales DQF (filtro de doble cuanto)-COSY y 2D-TOCSY se adquirieron mediante el uso de 16 a 24 barridos por conjunto de 2048 * 512 puntos con llenado de ceros en F1 (4096 * 2048), se aplico una funcion "coseno cuadrado desplazada (n/3)" antes de la transformada de Fourier. El espectro HSQC (coherencia heteronuclear cuantica simple) se obtuvo en "modo de absorcion pura potenciada, fase sensible" con desacoplamiento durante la adquisicion. Las dimensiones de la matriz fueron de 1024 x 320 puntos de datos que se "llenaron de ceros" a 4096 x 2048 mediante la aplicacion de una funcion coseno cuadrado antes de la transformada de Fourier.
Un experimento HMBC en una muestra de xilano sin grupos sulfato mostro una correlacion a larga distancia entre la senal del residuo de xilosa y un grupo carboxilo del grupo acetilo.
Esta senal se identifico mediante un experimento COZY y HSQC-TOCSY como la posicion 3 de un residuo de xilosa que porta el grupo acetilo. Se encontro que la posicion 2 de dicho residuo correlaciona en el espectro de HMBC con un residuo de acido glucuronico lo que destaca la presencia de acido glucuronico en la posicion 2 y del grupo acetilo en la posicion 3 del mismo residuo de xilosa. Esto explico la division de las senales relacionadas con el residuo de acido glucuronico en las posiciones 1, 3, 4 y 5 ademas de la division de la senal del grupo O-Me.
Los experimentos bidimensionales descritos anteriormente permitieron ademas identificar los desplazamientos qmmicos de los residuos reductores/no reductores y los parametros caractensticos de la estructura como se muestra en la Tabla 1. El experimento HMBC en la muestra de Elmiron® (pentosano polisulfato) mostro correlaciones a larga distancia similares entre la senal correspondiente a la posicion 3 del residuo de xilosa acetilado y el grupo carboxilo del grupo acetilo. El espectro bidimensional permitio ademas la asignacion de las senales informadas en la Tabla 2.
Ejemplo 4
Cuantificacion de parametros caractensticos de la estructura de xilano sin grupos sulfato y pentosano polisulfato
La ausencia o la presencia y la cuantificacion de las senales de las unidades estructurales caractensticas se determino con espectros de RMN-2D de xilanos sin grupos sulfato obtenidos mediante desulfatacion como se describio en el ejemplo 1 y con los espectros de pentosano polisulfato y se asociaron con la presencia de una senal en la region correspondiente a residuos de xilosa que portan el grupo acetilo. Resulto que el grupo acetilo no se distribuyo de manera equivalente entre las posiciones 2 y 3 de las unidades repetitivas que forman la estructura de polisacarido, pero se concentro principalmente en la posicion 3 de las unidades de xilosa repetitivas.
Resulto ademas que estos grupos acetilo se unieron principalmente a la posicion 3 de unidades de xilosa que portaban ademas una unidad de acido 4-O-metil-glucuronico en la posicion 2. La presencia de la senal significo que la unidad estructural caractenstica puede detectarse y cuantificarse mediante integracion como % en comparacion con el numero total de residuos presentes de acido 4-O-metil-glucuronico.
La tabla 3 siguiente informa los valores de la cuantificacion llevada a cabo en diferentes muestras.
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Tabla 3
Muestras de pentosano polisulfato Elmiron® Muestras de Xilano sin grupos sulfato obtenidas mediante desulfatacion del pentosano polisulfato Elmiron®
P5093
P5196 P5197 P5146 P5211 P5212
Unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico que portan ademas el grupo acetilo (% Ac)
60,5 % 54,5 % 44,0 % 58,8 % 46,0 % 37,5 %
La cuantificacion del porcentaje de las unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico que portan ademas el grupo acetilo (% Ac) se calculo al procesar las integrales de las senales de RMN de conformidad con la
%Ac= JC3- XilAc /f£C1 -Glc
en donde:
IC3-XilAc = integral de la senal de la posicion 3 de la xilosa que porta el grupo acetilo en 3 y el acido 4-O-metil- glucuronico en 2
IlC1-Glc = integral de la suma de las senales de la posicion C1 del acido 4-O-metil-glucuronico, unido a xilosa con grupo acetilo y unido a xilosa sin grupo acetilo.
El analisis ademas se llevo a cabo en una muestra de pentosano polisulfato para uso farmaceutico de un fabricante diferente y comprado en el mercado indio. Las senales del grupo OAc a 2,3 ppm, del grupo C3-XilAc a 5,25/75,96 ppm y del grupo C1-XilAc a 5,00/106,73 ppm no se detectaron en sus espectros de RMN.
El analisis por RMN de esta muestra mostro la presencia de estructuras las cuales no estan presentes en pentosano sulfatos extrafdos a partir del producto comercial Elmiron®, asociado con senales en diferentes regiones del espectro, y en particular entre 5,8/6,2 ppm y 95/115 ppm, lo que destaca la capacidad diagnostica de esta tecnica para la investigacion estructural.
Ejemplo 5
Analisis de masa de xilano
La espectrometna de masas se aplico como una tecnica ortogonal de analisis estructural. La muestra de xilano sin grupos sulfato obtenida como se describio en el ejemplo 1 se analizo mediante espectrometna de masas MALDI al seguir el procedimiento siguiente. La muestra se disolvio en H2O a una concentracion de aproximadamente 0,5 mg/ml. Se anadio 1 microlitro de la solucion de analito a 5 microlitros de una solucion de matriz DHB a una concentracion de 10 mg/ml en EtOH al 80 %. Se coloco 1 microlitro de la mezcla en el objetivo y se analizo con un espectrometro Bruker Daltonics Autoflex MALDI-TOF en polaridad positiva y en modo reflectron.

Claims (11)

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    Reivindicaciones
    1. Un metodo para la preparacion de polisacaridos de la formula
    imagen1
    en donde
    R es H o SOsNa
    G es H, SOsNa o acetilo
    que comprende al menos una etapa de identification o cuantificacion de las unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico y acetilado (G = acetilo).
  2. 2. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el polisacarido contiene al menos 20 % de unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico acetiladas (G = acetilo).
  3. 3. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 2, en donde el polisacarido contiene del 35 % al 70 % de unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico acetiladas (G = acetilo).
  4. 4. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha etapa de identificacion o cuantificacion se lleva a cabo mediante espectroscopia de RMN.
  5. 5. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 4, en donde la identificacion comprende la detection de una o
    mas senales a 2,17(1H), 23,89(13C); 176,60(13C); 4,63(1H), 104,17(13C); 3,68(1H), 78,41(13C); 5,09(1H), 76,99(13C); 3,78(1H), 79,36(13C); 4,10(1H), 65,96(13C); 3,37(1H), 65,95(13C); 5,30(1H), 101,16(13C); 3,58(1H), 73,93(13C); 3,80(1H), 75,22(13C); 3,82(1H), 84,46(13C); 4,64(1H), 72,67(13C); 3,49(1H), 63,00(13C);
    177,00(13C); 2,30(1H), 23,37(13C); 176,14(13C); 5,00(1H), 106,73(13C); 3,93(1H), 76,85(13C); 5,25(1H),
    75,96(13C); 4,14(1H), 76,79(13C); 4,29(1H), 65,60(13C); 3,69(1H), 65,60(13C); 5,76(1H), 96,99(13C); 4,31(1H), 77,76(13C); 4,42(1H), 80,83(13C); 3,45(1H), 84,04(13C); 3,92(1H), 75,71(13C); 3,48(1H), 63,61(13C);
    178,44(13C).
  6. 6. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 4, en donde la cuantificacion se calcula de conformidad con la formula %Ac = jC3-XilAc/!C1-Glc, en donde jC3-XilAc = integral de la senal de la position 3 de la xilosa que porta el grupo acetilo en 3 y el acido 4-O-metil-glucuronico en 2 y jlC1-Glc = integral de la suma de las senales de la posicion C1 del acido 4-O-metil-glucuronico, unido a xilosa con grupo acetilo y unido a xilosa sin grupo acetilo.
  7. 7. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparacion de pentosano polisulfato.
  8. 8. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparacion de xilano.
  9. 9. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la calificacion del pentosano polisulfato para uso farmaceutico, las materias primas de este y los productos de fabrication de este.
  10. 10. Un polisacarido de formula
    imagen2
    en donde
    R es H y G es H o acetilo; y
    al menos el 20 % de las unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico tienen ademas G = acetilo.
  11. 11. Un polisacarido de conformidad con la reivindicacion 10, en donde del 35 % al 70 % de las unidades de xilosa sustituidas con acido 4-O-metil-glucuronico tienen ademas G = acetilo.
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