ES2644945T3 - Proteínas de toxinas activas contra hemípteros y coleópteros de Bacillus thuringiensis - Google Patents

Proteínas de toxinas activas contra hemípteros y coleópteros de Bacillus thuringiensis Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido que codifica una proteína inhibidora de insectos TIC807, en el que dicha proteína inhibidora de insectos TIC807 comprende una secuencia polipeptídica que tiene por lo menos 70 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5.

Description

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invención, las plantas transgénicas albergan los minicromosomas como elementos extracromosómicos que no están integrados en los cromosomas de la planta huésped.
Las plantas transgénicas se obtienen típicamente ligando el gen de interés (es decir, en este caso un casete de expresión de TIC807) a un gen marcador seleccionable, introduciendo los transgenes ligados en una célula de planta, un tejido de planta o una planta mediante una cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, y regenerando o de algún otro modo recuperando la planta transgénica en condiciones que requieren la expresión de dicho gen marcador seleccionable para el crecimiento de la planta. El gen marcador seleccionable puede ser un gen que codifica una proteína de fosfotransferasa de neomicina, una proteína fosfinotricina acetiltransferasa, una proteína 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato, una proteína higromicina fosfotransferasa, una proteína dihidropteroato sintasa, una proteína acetolactato sintasa insensible a sulfonilurea, una proteína Q insensible a atrazina, una proteína nitrilasa capaz de degradar bromoxinil, una proteína deshalogenasa capaz de degradar dalapon, una proteína 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenasa, una proteína dihidrofolato reductasa insensible a metotrexato, y una proteína octopina sintasa insensible a aminoetilcisteína. Los genes selectivos correspondientes utilizados en conjunto con cada gen puede ser: neomicina (para la selección de la proteína neomicina fosfotransferasa), fosfinotricina (para la selección de la proteína fosfinotricina acetiltransferasa), glifosato (para la selección de la proteína 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato), higromicina (para la selección de la proteína higromicina fosfotransferasa), sulfadiazina (para una selección de la proteína dihidropteroato sintasa), clorsulfuron (para una selección de la proteína acetolactato sintasa insensible a sulfonilurea), atrazina (para una selección de la proteína Q insensible a atrazina), bromoxinil (para una selección de la proteína nitrilasa), dalapon (para una selección de proteína deshalogenasa), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (para una selección de la proteína 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenasa), metotrexato (para una selección de la proteína dihidrofolato reductasa insensible al metotrexato) o aminoetilcisteína (para una selección de la proteína octopina sintasa insensible a aminoetilcisteína).
Las plantas transgénicas también pueden obtenerse por ligamiento de un gen de interés (es decir, en este caso un casete de expresión de TIC807) a un gen marcador que se puede puntuar introduciendo los transgenes ligados en una célula vegetal por uno cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, y regenerando las plantas transgénicas de las células vegetales transformadas que dan resultado positivo en el ensayo para determinar la expresión del gen marcador que se puede punuar. El gen marcador que se puede puntuar puede ser un gen que codifica una proteína beta-glucuronidasa, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente amarilla, una proteína fluorescente roja, una proteína beta-galactosidasa, una proteína luciferasa derivada de un gen luc, una proteína luciferasa derivada de un gen lux, una proteína sialidasa, una proteína estreptomicina fosfotransferasa, una proteína nopalina sintasa, una proteína octopina sintasa o una proteína acetil transferasa de cloranfenicol.
Cuando el vector de expresión se introduce en una célula de planta o tejido de planta, las células o tejidos transformados se regeneran típicamente en plantas enteras cultivando estas células o tejidos en condiciones que promueven la formación de una planta entera (es decir, el proceso de regenerar hojas, tallos, raíces y, en ciertas plantas, tejidos reproductivos). El desarrollo o regeneración de plantas transgénicas de protoplastos de plantas únicos o diversos explantes es bien conocido en la técnica (Horsch, R.B. y col. 1985). Este proceso de regeneración y crecimiento típicamente incluye las etapas de selección de células transformadas y cultivo de células seleccionadas en condiciones que brindarán plántulas con raíces. Los brotes con raíces transgénicos resultantes son a continuación plantados en un medio de crecimiento de planta apropiado tal como suelo. Como alternativa, también pueden introducirse transgenes en meristemas de brotes de plantas aislados y pueden regenerarse plantas sin pasar por el cultivo de tejidos en etapa de callo (Patente de los Estados Unidos N.º 7.002.058). Cuando el transgén es introducido directamente en una planta, o más específicamente en el tejido meristemático de una planta, la semilla puede ser recolectada de la planta y seleccionada o puntuada para determinar la presencia del transgén. En el caso de especies de plantas transgénicas que se reproducen sexualmente, las semillas pueden recolectarse de plantas que han sido auto-polinizadas o se han cruzado externamente (es decir, utilizadas como un donante o receptor de polen) para establecer y mantener la línea de planta transgénica. Las plantas transgénicas que no se reproducen sexualmente puede propagarse vegetativamente para establecer y mantener la línea de planta transgénica. Como se utiliza en el presente documento, línea de planta transgénica se refiere a plantas transgénicas derivadas de un evento de transformación donde el transgén se ha insertado en uno o más lugares en el genoma de la planta. Una semilla producida mediante la planta transformada, una descendencia de dicha semilla, y una semilla producida por la descendencia de la planta transgénica original, producida de acuerdo con el proceso antes mencionado tendrán un transgén que codifica la proteína TIC807 incorporado establemente en su genoma y dichas plantas descendientes heredarán los rasgos proporcionados por la introducción de un transgén estable de manera Mendeliana. Todas las plantas transgénicas de ese tipo que han incorporado en su genoma segmentos de ADN transgénicos que codifican una o más proteínas o polipéptidos TIC807 son aspectos de esta invención. Se reconoce además que las plantas transgénicas que contiene las construcciones de ADN descritas en esta invención, y materiales derivados de las mismas, pueden identificarse a través del uso de PCR o de otros procedimientos que pueden detectar específicamente las secuencias en las construcciones de ADN.
Una vez que una planta transgénica se regenera o recupera, pueden utilizarse una diversidad de procedimientos para identificar u obtener una planta transgénica que expresa una cantidad inhibidora de insectos de TIC807. Un conjunto general de procedimientos consiste en realizar ensayos que miden la cantidad de TIC807 que se produce. Por ejemplo, pueden utilizarse diversos procedimientos de detección basados en anticuerpos que emplean
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uso en agricultura” abarca todos los adyuvantes, por ejemplo, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes de la pegajosidad y aglutinantes que son comúnmente utilizados en la tecnología de las formulaciones insecticidas; estos son bien conocidos por los expertos en la formulación de insecticidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y pueden prepararse por diversos medios, por ejemplo, por mezclado homogéneo, combinado y/o trituración de la composición insecticida con adyuvantes adecuados utilizando técnicas convencionales de formulación.
Las composiciones inhibidoras de insectos de esta invención son aplicadas al medioambiente del insecto hemíptero, homóptero o heteróptero objetivo, típicamente sobre el follaje de la planta o cultivo que se va a proteger por procedimientos convencionales, preferentemente por pulverización. La concentración y la duración de la aplicación insecticida se ajustará de acuerdo con las condiciones específicas para la o las plagas, cultivos en particular que se van a tratar y condiciones ambientales particulares. La relación proporcional de principio activo a vehículo dependerá naturalmente de la naturaleza química, solubilidad y estabilidad de la composición insecticida, así como también de la formulación en particular contemplada.
Otras técnicas de aplicación, por ejemplo espolvoreo, rociado, remojo, inyección en suelo, revestimiento de la semilla, revestimiento de la plántula, pulverizado, aireación, nebulizado y atomizado, son también factibles y pueden ser requeridos en ciertas circunstancias tales como, por ejemplo, insectos que causan infestación de las raíces o del tallo, o para la aplicación a vegetación delicada o plantas decorativas. Estos procedimientos de aplicación son también bien conocidos por los expertos en la técnica.
La composición inhibidora de insectos de la invención puede emplearse en el procedimiento de la invención de forma única o en combinación con otros compuestos, incluyendo otros pesticidas. El procedimiento de la invención también puede utilizarse en conjunto con otros tratamientos tales como tensioactivos, detergentes, polímeros o formulaciones de liberación en el tiempo. Las composiciones insecticidas de la presente invención pueden ser formuladas para uso tópico o sistémico.
La concentración de agente inhibidor de insectos en la composición inhibidora de insectos la cual se utiliza para la aplicación ambiental, sistémica o foliar varía ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación en particular, de los medios de aplicación, de las condiciones ambientales y del grado de actividad inhibidora de insectos. Típicamente, el agente inhibidor de insectos en la composición estará presente en la formulación aplicada en una concentración de por lo menos 1 % en peso y puede ser hasta e incluyendo 99 % en peso. Las formulaciones secas de las composiciones pueden ser de 1 % a 99 % o más en peso de la composición, mientras que las formulaciones líquidas pueden comprender en general entre 1 % y 99 % o más del principio activo en peso. Las formulaciones las cuales comprenden células bacterianas intactas generalmente contendrán entre 104 y 1012 células/mg de la composición.
La formulación inhibidora de insectos puede ser administrada a una planta en particular o área objetivo en una o más aplicaciones según lo necesario, con una proporción de aplicación de campo típica por cada 0,01 km2 (1 hectárea) que oscila en el orden de entre 1 g y 1 kg, 2 kg, 5 kg o más de principio activo.
XI. Productos de base
También se contempla que pueden obtenerse diversos productos de base con las composiciones y procedimientos de esta invención. Asimismo, se contempla específicamente que una o más ventajas pueden asociarse con los productos de base derivados de esta invención. Se anticipa que el uso de la proteína inhibidora de insectos TIC807 y procedimientos asociados puede proporcionar productos de base con niveles reducidos de residuo de pesticidas. En ciertos casos, los cultivadores deberán utilizar menos cantidad de pesticidas tales como organofosfatos, carbamatos, neonicotinoide, e insecticidas piretroides. La exposición de individuos que cultivan, recolectan, procesan o de algún otro modo tienen contacto con los productos de base de esta invención a estos pesticidas por lo tanto se anticipa que debe reducirse. El uso reducido de pesticidas también se prevé que proporciona costes reducidos de producción de los productos de base, niveles reducidos de contaminación ambiental y efectos secundarios no deseados reducidos sobre insectos beneficiosos (no objetivo) y sobre la fauna. Además se contempla que el uso de esta invención proporcionará productos de base con costes de producción más bajos debido a factores, que incluyen mayor rendimiento y/o menor uso de insecticidas.
XII. Procedimientos para Utilizar Proteínas Inhibidoras de Insectos TIC807 en Combinación con Otros Agentes Inhibidores de Insectos
Se contemplan diversos procedimientos mediante los cuales se logra una mayor resistencia a una plaga de insectos específica o resistencia más amplia a diversas clases de plagas de insectos. Ambos procedimientos implican poner en contacto la o las plagas de insectos con una proteína TIC807 en combinación con un agente inhibidor de insectos diferente. Este agente inhibidor de insectos diferente puede inhibir las mismas plagas de insectos hemípteros inhibidas por la TIC807 para proporcionar una incidencia reducida de resistencia de insectos hemípteros a la proteína TIC807 u otro agente inhibidor de insectos hemípteros. Como alternativa, el agente inhibidor de insectos diferente puede inhibir un insecto que no es inhibido por TIC807 para expandir el espectro de inhibición de insectos obtenido.
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TABLA 1
Aminoácidos
Códigos de Aminoácidos Codones
Alanina
Ala (A) GCA GCC GCG GCU
Cisteína
Cys (C) UGC UGU
Ácido Aspártico
Asp (D) GAC GAU
Ácido glutámico
Glu (E) GAA GAG
Fenilalanina
Phe (F) UUC UUU
Glicina
Gly (G) GGA GGC GGG GGU
Histidina
His (H) CAC CAU
Isoleucina
Ile (l) AUA AUC AUU
Lisina
Lys (K) AAA AAG
Leucina
Leu (L) UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina
Met (M) AUG
Asparagina
Asn (N) AAC AAU
Prolina
Pro (P) CCA CCC CCG CCU
Glutamina
Gln (Q) CAA CAG
Arginina
Arg (R) AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina
Ser (S) AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina
Thr (T) ACA ACC ACG ACU
Valina
Val (V) GUA GUC GUG GUU
Triptófano
Trp (W) UGG
Tirosina
Tyr (Y) UAC UAU
Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de actividad bioquímica o biológica. Puesto que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una 5 proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, pueden realizarse ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia proteica y, naturalmente, su secuencia codificadora de ADN subyacente, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, los inventores contemplan que pueden efectuarse diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones desveladas, o en las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad
10 biológica.
En la realización de tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva sobre una proteína es generalmente entendida en la técnica (Kyte y Doolittle, J Mol Biol. 157(1):105-32, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo cual a su vez
15 define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos y antígenos.
Cada aminoácido ha sido asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, Ibid). Estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9);
20 tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropático similar y aun dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, aun
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