ES2645083T3 - Uso de microorganismos y nutrientes sinérgicos para producir señales que facilitan la germinación y la colonización de raíces vegetales por hongos micorrizales en ambientes ricos en fósforo - Google Patents

Abstract

Composición que comprende lo siguiente: de 6,75E8 ± 6.75E6 a 4,20E9 ± 4,20E7 unidades formadoras de colonias de una Trichoderma virens, de 1,35E10 ± 1,35E8 a 8,40E10 ± 8,40E8 unidades formadoras de colonias de un Bacillus amyloliquefaciens, 30 000 propágulos de una micorriza en 18,93 ± 0,1893 litros de agua ; y una solución acuosa del 15 al 40 por ciento de un fitato o ácido fítico en 3,78 ± 0,0378 litros de agua.

Description

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DESCRIPCION

Uso de microorganismos y nutrientes sinergicos para producir senales que facilitan la germinacion y la colonization de raices vegetales por hongos micorrizales en ambientes ricos en fosforo

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] Esta invention se refiere a la combination de microorganismos sinergicos para producir las senales que son necesarias para facilitar la germinacion y la colonizacion de raices vegetales de hongos micorrizales. La colonizacion de la raiz vegetal por hongos micorrizales da como resultado el aumento de la disponibilidad de nutrientes para las plantas, el control de patogenos y la mejora de la estructura y/o la calidad del suelo. En particular, una realization ilustrativa de la invencion se refiere a la combinacion de fitato como fuente de nutrientes con una combinacion de Trichoderma virens, Bacillus amyloliquefaciens, y hongos micorrizales, que incluyen las siguientes especies conocidas: Glomus intraradices, Glomus etunicatum, Glomus aggregatum, Glomus mosseae, con el fin de reemplazar, duplicar o mejorar el efecto de los compuestos fertilizantes estandar que contienen fosforo, como un fertilizante 10-34-0, 9-18-9, 3-18-18, u otras combinaciones de fertilizantes NPK.

[0002] El acido fitico [conocido como hexakisfosfato de inositol (IP6) o fitato cuando esta en forma de sal] es la principal forma de almacenamiento de fosforo en muchos tejidos vegetales, especialmente en el salvado y las semillas. El fitato es tambien una forma principal de fosforo organico dentro del perfil del suelo, constituyendo tipicamente un 20% -50% del fosforo organico del suelo.

[0003] Trichoderma es un genero de hongos que contiene alrededor de 20 especies. Los sinonimos para el nombre del genero incluyen Aleurisma y Esporoderma Trichoderma virens, que tambien se llama Gliocladium virens, es un miembro del genero. Los habitats naturales de estos hongos incluyen la tierra y el material vegetal. Un miembro del genero, Trichoderma harzianum KRL-AG2 (ATCC 20847) tambien conocido como cepa T-22, se utiliza como agente de control biologico que se aplica como tratamiento de semillas o de tierra, o en esquejes y trasplantes. Las cepas de la especie, Trichoderma virens, tambien se han utilizado para controlar las enfermedades de putrefaction de semillas en las plantas. Por ejemplo, Trichoderma (Gliocladium) virens Gl-21 es conocida y esta disponible comercialmente a un precio razonable, y se vende bajo la marca registrada SoilGuard® 12G (Numero de registro EPA: 70051-3 y Numero de establecimiento EPA: 067250-IL-001). Esta fabricada por Thermo Trilogy Corporation de Columbia, MD. Otras cepas conocidas y disponibles comercialmente de Trichoderma virens incluyen las que tienen los siguientes numeros de acceso ATCC: 10043, 10044, 10045, 13213, 13362, 204067, 204443, 204444, 204445, 20903, 20904, 20906, 24290, 42955, 44327, 44734, 48179, 52045, 52199, 58676, 58677, 58678, 62399, 64271, 74180, 9645, MYA-297, MYA-298, MYA-649 y MYA-650.

[0004] Bacillus es un genero de bacterias en forma de baston, gram positivas, aerobicas o (bajo ciertas condiciones) anaerobicas. Las especies de Bacillus se encuentran en gran cantidad en la tierra y el agua y algunas se han utilizado para controlar las enfermedades de las plantas, incluida la putrefaccion de la raiz. Bacillus amyloliquefaciens es un miembro formador de esporas del genero. La cepa F (ATCC 23350) de Bacillus amyloliquefaciens de L.L. Campbell es la cepa tipo para la especie. Otras cepas conocidas y disponibles comercialmente de Bacillus amyloliquefaciens incluyen las que tienen los siguientes numeros de acceso ATCC: 23842, 23843, 23844, 23845, 31592, 49763, 53495 y BAA-390 (Int. J. Sys. Bacteriol. 37: 69-71, 1987; J. Bacteriol. 94: 1124-1130, 1967).

[0005] En el pasado, antes de que el nombre se cambiara oficialmente para reconocer que el microorganismo era una especie nueva, Bacillus amyloliquefaciens tambien fue llamado Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens por algunos investigadores. Una proteasa producida a partir de Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens se usa comunmente como ablandador para productos carnicos crudos. De acuerdo con la Agencia de Protection Ambiental de EE. UU. (EPA), la cepa FZB24 de Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens es un microorganismo de origen natural y esta muy extendido en el medio ambiente. Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens FZB24 (Numero de registro EPA: 72098-5 y el Numero de establecimiento EPA: 73386-DEU-001) se conoce y esta disponible comercialmente a un precio razonable, vendida bajo la marca comercial Taegro® por Novozymes, Inc. de Brookfield, WI.

[0006] Un hongo micorrizal arbuscular es un tipo de micorriza en el cual el hongo penetra en las celulas corticales de las raices de una planta vascular. Los hongos micorrizales arbusculares ayudan a las plantas a capturar nutrientes como el fosforo, el azufre, el nitrogeno y micronutrientes del suelo. Se cree que el desarrollo de la simbiosis micorncica arbuscular jugo un papel crucial en la colonizacion inicial del terreno por las plantas y en la evolucion de las plantas vasculares.

[0007] El desarrollo de hongos micorrizales arbusculares antes de la colonizacion de la raiz, conocido como presimbiosis, comprende tres etapas: germinacion del propagulo, crecimiento hifal, y reconocimiento de huesped y formation de apresorio. Los propagulos son estructuras de reposo con multiples nucleos y paredes gruesas. Los propagulos de hongos micorrizales arbusculares pueden germinar dadas las condiciones adecuadas de la

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matriz del suelo, la temperatura, la concentracion de dioxido de carbono, el pH y la concentracion de fosforo. No se cree que la germinacion del propagulo este bajo el control directo de la planta ya que los propagulos han germinado en condiciones experimentales en ausencia de plantas tanto in vitro como en tierra. Sin embargo, la tasa de germinacion del propagulo puede aumentarse con los exudados de la raiz hospedadora de la planta.

[0008] El crecimiento de las hifas micorrizales arbusculares a traves del suelo esta controlado por los exudados de la raiz del huesped y la concentracion de fosforo en el suelo. La colonizacion de hongos micorrizales arbusculares es mayor en suelos pobres en nutrientes, y disminuyo con la adicion de fertilizantes fosfatados. Las bajas concentraciones de fosforo en el suelo aumentan el crecimiento y ramificacion de la hifa, e inducen la exudacion en plantas de compuestos que controlan la intensidad de la ramificacion de la hifa. Los hongos micorrizales arbusculares tambien tienen capacidades quimiotaxicas que permiten el crecimiento hifal hacia las raices de una planta huesped potencial.

[0009] Un desafio importante para el micorrizologo es comprender los mecanismos de senalizacion extremadamente armoniosos del huesped de hongos micorrizales arbusculares y el proceso de colonizacion. Esta armoniosa relacion simbiotica se refleja en la obligada naturaleza biotrofica de los hongos, que no se pueden cultivar en ausencia de un huesped. Si bien se ha alcanzado el exito en el logro de asociaciones micorrizales eficaces con las plantas de cultivo que crecen en suelo esterilizado, el exito final para el uso agricola de los hongos micorrizales vesiculoarbusculares (VAM) ocurrira cuando puedan usarse de manera fiable para mejorar el rendimiento de los cultivos que crecen en suelo no fumigado .

[0010] Esta invencion proporciona una senal que produce la germinacion del propagulo y posterior colonizacion de la raiz de las micorrizas de una manera muy sorprendente. Desde hace tiempo se sabe que las semillas almacenan fosforo como fitato (IP6) y que una semilla germinante produce la enzima fitasa para descomponer el fitato en formas utilizables por las plantas para proporcionar nutrientes a la planta. Tambien se sabe que la descomposicion del fitato (una molecula de seis fosforos) por la enzima fitasa libera tres moles de fosforo inorganico (ortofosfato) y mio-inositol trifosfato (IP3). Las plantas necesitan fosforo en forma inorganica, principalmente ortofosfato, para llevar el nutriente a la raiz. Las plantas usan muy poco fosforo organico ya que no poseen un metodo eficaz para descomponer el fitato. El mio-inostitol trifosfato (IP3) se conoce como un segundo mensajero que puede facilitar las comunicaciones y/o las respuestas entre los organismos. La liberacion de mio-inositol que se produce a traves de la hidrolisis del fitato con fitasa de B. amyloliquefaciens tiene un impacto en las interacciones planta-microbio y especificamente interacciones entre plantas y bacterias fijadoras de N. Se desconoce la senal que es responsable de la germinacion de las micorrizas y la posterior colonizacion de la raiz de la planta por hongos micorrizales. Ademas, no se ha sugerido en la literatura que la senal IP3 tenga ningun vinculo con la respuesta de los hongos micorrizales, la germinacion del propagulo o la colonizacion de la raiz. De hecho, es bien sabido que la colonizacion de raices por micorrizas puede lograrse en condiciones de tierra de bajo fosforo, pero es extremadamente dificil producir germinacion micorricica y colonizacion de raices en condiciones de tierra con alto contenido de fosforo o un ambiente de rizosfera de fosforo alto. Es, por lo tanto, tambien un hecho que la literatura desaconseja la nocion de que el uso de una enzima fitasa para reducir el fitato y liberar facilmente fosforo disponible en la planta en la rizosfera daria como resultado una senal que facilita la germinacion y posterior colonizacion de las raices de las plantas por hongos micorricicos

[0011] Es probable que un estudio adicional de esta invencion produzca mecanismos de senal dual y tal vez multiple, ya que se sabe que la germinacion de propagulos de micorrizas puede ocurrir en ausencia de la raiz de la planta; sin embargo, la germinacion del propagulo es mas probable cuando la raiz esta presente. Esto sugiere una respuesta de senal desconocida.

[0012] Los antecedentes de la tecnica se caracterizan por las patentes EE.UU. N.os 4.476.881; 4.489.161;

4.642.131; 4.668.512; 4.678.669; 4.713.342; 4.724.147; 4.748.021; 4.818.530; 4.828.600; 4.877.738; 4.915.944;

4.952.229; 5.047.239; 5.049.379; 5.071.462; 5.068.105; 5.084.272; 5.194.258; 5.238.690; 5.260.213; 5.266.316;

5.273.749; 5.300.127; 5.344.647; 5.401.655; 5.422.107; 5.455.028; 5.409.509; 5.552.138; 5.589.381; 5.614.188;

5.628.144; 5.632.987; 5.645.831; 5.665.354; 5.667.779; 5.695.982; 5.702.701; 5.753.222; 5.852.054; 5.869.042;

5.882.641; 5.882.915; 5.906.818; 5.916.029; 5.919.447; 5.922.603; 5.972.689; 5.974.734; 5.994.117; 5.998.196;

6.015.553; 6.017.525; 6.030.610; 6.033.659; 6.060.051; 6.103.228; y 7.339.091.

[0013] Tanto CN 102 229 644 como CN 101 531 999 describen una composicion que comprende acido fitico, calcio y enzima fitasa.

[0014] Usman Irshad et al., Plant and Soil, vol. 358, paginas 155-168 describe una composicion que comprende plantula, fitato, un basidiomiceto micorricico y una fitasa que produce Bacillus subtilis.

[0015] CN 101 665 374 describe una mezcla de fertilizante que comprende un componente nutritivo, un hongo tal como Trichoderma y/o hongo micorricico, p. ej., Glomos y una bacteria como Bacillus, asi como el uso de la mezcla para aumentar el rendimiento de la planta.

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BREVE RESUMEN DE LA INVENCION

[0016] Un aspecto de la invencion es que crea una asociacion efectiva de hongos micorrizales con la raiz de una planta huesped en un entorno rico en fosforo. Otros aspectos de la invencion son la germinacion de propagulos de micorrizas y posterior colonizacion de raices desencadenada por una molecula de senal. Otro aspecto adicional de la invencion es la presencia de la molecula de senal IP3. Otro aspecto adicional de la invencion es el uso de una bacteria que produce una enzima fitasa en un entorno alto en fosforo debido a la presencia del gen PhyC. Otro aspecto mas de la invencion es el uso de un componente microbiano, un hongo de Trichoderma, que produce enzimas de fosfatasa que pueden romper los enlaces en compuestos estables tales como fosfato tricalcico y liberar iones de Ca ++.

[0017] Tal como se usa en el presente documento, los siguientes terminos y variaciones de los mismos tienen los significados que se dan a continuacion, a menos que un significado diferente este pensado claramente por el contexto en el que se usa dicho termino:

Debe interpretarse que "uno/a" y "el/la" y referentes similares utilizados en este documento cubren tanto el singular como el plural a menos que su uso en contexto indique lo contrario.

[0018] "Aproximadamente" significa dentro del uno por ciento de un parametro o medida enumerados, y preferiblemente dentro del 0,1 por ciento de dicho parametro o medida.

[0019] "Comprender" y las variaciones del termino, como "que comprende" y "comprende", no pretenden excluir otros aditivos, componentes, enteros o pasos.

[0020] "E" significa "por 10 elevado a."

[0021] "Ejemplar", "ilustrativo" y "preferido" significan "otro".

[0022] Una realizacion ilustrativa de la invencion comprende una combinacion de nutrientes principales, micronutrientes, hongos y bacterias que aumentan el rendimiento de las plantas de una manera que es comparable o superior a la aplicacion de una quimica de fertilizantes estandar.

[0023] En uso, una realizacion ilustrativa de la invencion crea una sinergia que tiene lugar cuando se junta un tipo apropiado y proporciones apropiadas de nutrientes, hongos y bacterias de tal manera que proporcionan a las plantas los nutrientes disponibles que aumentan el rendimiento de la planta o el rendimiento de la semilla.

[0024] Una realizacion ilustrativa de la invencion comprende: una multitud de nutrientes, que pueden o no estar disponibles para plantas, combinados con una multitud de hongos y una multitud de bacterias en presencia de una semilla, una planta o una raiz.

[0025] Una realizacion ilustrativa de la invencion es un metodo que comprende los siguientes pasos: producir una mezcla que esta compuesta de nutrientes, hongos y bacterias de tal manera que produzca una sinergia entre los componentes; aplicar la mezcla a una semilla o aplicar la mezcla en una banda en contacto con la semilla o cerca de la semilla o en una mezcla de tierra en la que dichos hongos y dichas bacterias reducen dichos nutrientes a una forma disponible para la planta, permitiendo asi que los hongos micorrizales colonicen la raiz en presencia de los nutrientes disponibles para la planta y aumentar el rendimiento de la planta o el rendimiento de la semilla.

[0026] En una realizacion ilustrativa, la invencion es una composicion de materia que comprende:

una combinacion de fitato y una multitud de microorganismos que comprenden un hongo de Trichoderma virens u otro hongo solubilizante de calcio o un componente de calcio soluble, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otra bacteria que produce enzima fitasa o una enzima fitasa, y un hongo micorrizal o una multitud de hongos micorrizales que se colocan en la vecindad de una raiz vegetal de manera que permite que dicha multitud de microorganismos en la composicion de materia colonice dicha raiz de la planta.

[0027] En otra realizacion ilustrativa, la invencion es un metodo para aumentar el rendimiento de la planta que comprende: colocar una combinacion de fitato y una multitud de microorganismos que comprenden un hongo de Trichoderma virens u otro hongo solubilizante de calcio o un componente de calcio soluble, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otra bacteria que produce enzima fitasa o una enzima fitasa y un hongo micorrizal o una multitud de hongos micorrizales en la vecindad de una raiz vegetal de manera que permita que dichos microorganismos colonicen dicha raiz vegetal. Preferiblemente, dicha composicion se coloca en la proximidad de dicha raiz vegetal mediante la aplicacion a una semilla preplantada, mediante aplicaciones en los surcos a medida que se siembra una semilla, o a voleo sobre una fila de semillas.

[0028] En otra realizacion preferida, la invencion es un metodo para mejorar la agregacion y la calidad de la tierra colocando un hongo de Trichoderma virens, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otra bacteria que produzca una enzima fitasa, y un hongo micorrizal o una multitud de hongos micorrizales en la proximidad de una raiz vegetal de manera que permita que dichos microorganismos colonicen dicha raiz vegetal.

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[0029] En otra realization ilustrativa, la invention es una composition de materia que comprende: aproximadamente 30 000 propagulos de micorrizas en aproximadamente cinco galones de agua; aproximadamente un galon de una solution acuosa de aproximadamente un 15 a aproximadamente un 40 por ciento de un fitato; de aproximadamente 6,75E8 a aproximadamente 4,20E9 unidades formadoras de colonias de Trichoderma virens; y de aproximadamente 1,35E10 a aproximadamente 8,40E10 unidades formadoras de colonias de Bacillus amyloliquefaciens.

[0030] En otra realization ilustrativa, la invention es una composition de materia que comprende: una combination de un fitato y una multitud de microorganismos que comprenden un hongo de Trichoderma virens u otro hongo solubilizante de calcio, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otra bacteria que produce una enzima fitasa, y un hongo micorrizal o una multitud de hongos micorrizales; donde dicha combination esta operativa para permitir que dicha multitud de microorganismos colonice una raiz vegetal cuando dicha combination se coloca en la proximidad de dicha raiz vegetal.

[0031] En otra realization ilustrativa mas, la invention es una composition de materia que comprende: un fitato o acido fitico; medios para producir calcio soluble, o calcio soluble; y medios para producir enzima fitasa, o una enzima fitasa.

[0032] En otra realization ilustrativa, la invention es una composition de materia que comprende: una multitud de nutrientes que comprenden un fosforo organico (por ejemplo, un fitato o acido fitico), combinado con una multitud de hongos y una multitud de bacterias en presencia de una semilla, una planta o una raiz.

[0033] En otra realization ilustrativa, la invention es una composition de materia que comprende: un componente de Trichoderma virens; un componente de Bacillus amyloliquefaciens ; un hongo micorrizal o un componente de hongos micorrizales; y un componente de fitato o acido fitico.

[0034] En otra realization ilustrativa mas, la invention es un metodo que comprende: producir una mezcla que esta compuesta por un componente nutriente, un componente fungico y un componente bacteriano que este operativo para producir una sinergia entre los componentes; aplicar dicha mezcla a una semilla, o aplicar dicha mezcla en un medio de crecimiento en contacto con dicha semilla o cerca de dicha semilla, o en una mezcla de tierra en donde dicho componente fungico y dicho componente bacteriano reducen dicho componente nutriente a una forma disponible para la planta; permitiendo que un hongo micorrizal colonice una raiz producida por dicha semilla en presencia de dicha forma disponible para plantas y aumentando el rendimiento de la planta o el rendimiento de la semilla.

[0035] En otra realization ilustrativa, la invention es un metodo para aumentar el rendimiento de la planta que comprende: colocar una combination de fitato y una multitud de microorganismos que comprenden un hongo de Trichoderma virens u otro componente fungico solubilizante del calcio, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otro componente bacteriano productor de enzima fitasa bacteriana y un hongo micorrizal o una multitud de hongos micorrizales en la vecindad de una raiz vegetal de manera que permita que dichos microorganismos colonicen dicha raiz vegetal. En otra realization, el metodo comprende ademas: aplicar dicho hongo de Trichoderma virens u otro componente fungico solubilizante de calcio en una concentration que varia de aproximadamente 1,0E7 a aproximadamente 1,0E11 unidades formadoras de colonias por gramo (ufc/g) o unidades formadora de colonias por mililitro (ufc ml) de Trichoderma virens G1-3 viable o esporas de la cepa G1-21 de Trichoderma virens por gramo de dicho hongo de Trichoderma virens u otro componente fungico solubilizante del calcio y a una tasa de aplicacion de aproximadamente 1,35 g por acre o 1,35 ml por acre. En otra realization, el metodo comprende ademas: aplicar dicha bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otro componente bacteriano productor de enzima fitasa en una concentration que varia de aproximadamente 1E7 a aproximadamente 5E11 ufc/g o ufc/ml de la cepa viable BAA-3 de Bacillus amyloliquefaciens o esporas de la cepa FZB24 de Bacillus amyloliquefaciens por gramo de bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otro componente bacteriano productor de enzima fitasa y a una tasa de aplicacion de aproximadamente 1,35 g o 1,35 ml por acre. En otra realization, dicha combination se coloca en la proximidad de dicha raiz vegetal mediante la aplicacion a una semilla preplantada, mediante aplicacion en los surcos a medida que se siembra una semilla, o a voleo sobre una fila de semillas.

[0036] En otra realization ilustrativa, la invention es un metodo para mejorar la agregacion y la calidad de la tierra que comprende: colocar un hongo de Trichoderma virens u otro hongo solubilizante de calcio, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens u otra bacteria que produce una enzima fitasa, y un hongo micorrizal o una multitud de hongos micorrizales en la vecindad de una raiz vegetal de una manera que permita que dichos hongos y bacterias colonicen dicha raiz vegetal.

[0037] En otra realization ilustrativa, la invention es un metodo para aumentar el rendimiento de una planta, que comprende: usar una enzima fitasa para reducir el fitato y liberar facilmente fosforo disponible en la planta en una rizosfera en la que dicha planta esta creciendo; y producir una molecula de senal que facilita la germination de un hongo micorrizal y la posterior colonization de las raices de la planta por dicho hongo micorrizal. En otra

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realizacion, dicha molecula de senal es mio-inositol trifosfato. En otra realizacion, el metodo comprende, ademas: usar una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens para producir dicha enzima fitasa en dicha rizosfera. En otra realizacion, el metodo comprende, ademas: usar un microorganismo para producir dicha enzima fitasa. En otra realizacion, dicha germinacion y colonization de la raiz se producen en un entorno alto en fosforo creado al aplicar un fertilizante que comprende fosforo a dicha rizosfera. En otra realizacion, el metodo comprende, ademas: usar un hongo de Trichoderma para producir una enzima fosfatasa que esta operativa para romper los enlaces en el fosfato tricalcico y liberar iones de calcio. En otra realizacion, el hongo de Trichoderma es Trichoderma virens Gl-3.

[0038] En otra realizacion ilustrativa, la invention es un metodo para aumentar el rendimiento de un cultivo, que comprende: aplicar una composition de materia que comprende los siguientes componentes a cada acre de tierra de cultivo: aproximadamente un cuarto de una solution de fitato del 40 por ciento (en peso); de aproximadamente un galon a 5 galones de agua o agua mas un fertilizante NPK estandar; aproximadamente 1,35 g de una composicion de esporas de B. amyloliquefaciens TJ1000 (a una concentration de aproximadamente 1E10 ufc/g); aproximadamente de 1,35 g de una composicion de esporas de T. virens G1-3 (a una concentracion de aproximadamente 5,0E8 ufc/g); y aproximadamente 0,136 g de una composicion de propagulos de micorrizas (a una concentracion de aproximadamente 220 000 propagulos/g). En otra realizacion, el metodo comprende, ademas: mezclar la composicion de la materia en un tanque aplicador de fertilizantes; y aplicarla a la tierra de cultivo en un surco o una banda muy cerca de un surco de semillas o una raiz vegetal.

[0039] En otra realizacion ilustrativa, la invencion es un metodo para aumentar el rendimiento de un cultivo, que comprende: aplicar una composicion de materia a cada acre de tierra de cultivo; donde dicha composicion de materia comprende: aproximadamente 30 000 propagulos de micorrizas en aproximadamente cinco galones de agua, aproximadamente un galon de una solucion acuosa de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 40 por ciento de un fitato, de aproximadamente 6,75E8 a aproximadamente 4,20E9 unidades formadoras de colonias de Trichoderma virens y aproximadamente 1,35E10 a aproximadamente 8,40E10 unidades formadoras de colonias de Bacillus amyloliquefaciens.

[0040] Aspectos adicionales de la invencion se haran evidentes a partir de la consideration de los dibujos y la description subsiguiente de realizaciones ejemplares de la invencion. Un experto en la tecnica se dara cuenta de que son posibles otras realizaciones de la invencion y que los detalles de la invencion pueden modificarse en varios aspectos, todos sin apartarse del concepto. Por lo tanto, los siguientes dibujos y descripciones deben considerarse de naturaleza ilustrativa y no restrictiva.

BREVE DESCRIPCION DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS

[0041] Las caracteristicas de la invencion se comprenderan mejor haciendo referencia a los dibujos adjuntos que ilustran realizaciones ejemplares de la invencion. En los dibujos:

La Fig. 1 es una tabla que presenta datos de rendimiento de una prueba de campo de una realizacion ilustrativa de la invencion que se realizo cerca de Watertown, SD en 2011. El cultivo del ensayo fue un maiz hibrido de madurez relativa 95. En la Fig. 1, CHK significa control y representa el control no tratado dentro de la prueba, Mico significa hongos micorrizales, ES significa aplicacion en surcos, T.V significa Trichoderma virens, B.A. significa Bacillus amyloliquefaciens, LSD significa diferencia menos significativa y CV significa coeficiente de variation. En las notas a pie de pagina, "a" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga la letra "a"; "ab" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "ab"; "bcd" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "bcd"; "cd" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "cd"; "ef" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "ef"; "f" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga la letra "f"; "cde" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "cde"; "g" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga la letra "g".

La Fig. 2 es una tabla que muestra los datos de exploration de raiz de un ensayo de maiz realizado en un cuarto de cultivo. En las notas a pie de pagina, "a" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga la letra "a"; "ab" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "ab"; "b" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga la letra "b"; "c" indica que el valor correspondiente es significativamente diferente de cualquier otro valor que no contenga las letras "c".

La Fig. 3 es un diagrama esquematico que ilustra la production de Bacillus amyloliquefaciens de la enzima fitasa y reaction de fitasa en fitato (IP6) y la posterior degradation en 3 moles de fosforo inorganico y el componente de senal mio-Inositol trifosfato (IP3).

La Fig. 4 es una fotografia producida tinendo con azul de tripan una raiz de maiz que incorpora una

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realization de la invention.

La Fig. 5 es una fotografia de raices de una planta de maiz de control (a la izquierda) y una planta de maiz tratada con una realization ilustrativa de la invention (a la derecha), respectivamente.

La Fig. 6 es una fotografia que muestra la estructura de hifas micorrizales colonizando dentro de una raiz de una planta tratada con una realization ilustrativa de la invention.

La Fig. 7 es un grafico que presenta los datos que se recogieron en Carmi, IL con tratamientos sobre maiz hibrido durante la temporada de cultivo de 2012.

La Fig. 8 es un grafico que muestra la interaction de los componentes de una realization ilustrativa de la invencion.

La Fig. 9 es un grafico que presenta los datos que se recogieron en Ashkum, IL con tratamientos sobre maiz hibrido durante la temporada de cultivo de 2012.

La Fig. 10 es otro grafico que muestra la interaction de los componentes de una realization ilustrativa de la invencion.

La Fig. 11 es un grafico que presenta los datos que se recogieron en Olivia, MN con tratamientos sobre maiz hibrido durante la temporada de cultivo de 2012.

La Fig. 12 es otro grafico que muestra la interaction de los componentes de una realization ilustrativa de la invencion.

La Fig. 13 es un grafico que presenta los datos de rendimiento de las semillas de soja que se cultivaron en un ensayo de campo en la Irrigation Research Foundation, Yuma, CO en la temporada de cultivo de 2012.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0042] En una realization ilustrativa, la invention comprende cuatro componentes: un componente de Trichoderma virens, un componente de Bacillus amyloliquefaciens, un componente de hongos micorrizales y un componente de fitato o acido fitico.

[0043] Una realization actualmente preferida de la invention se refiere a una composition que comprende lo siguiente:

de 6,75E8 ± 6.75E6 a 4,20E9 ± 4,20E7 unidades formadoras de colonias de una Trichoderma virens, de 1,35E10 ± 1,35E8 a 8,40E10 ± 8,40E8 unidades formadoras de colonias de un Bacillus amyloliquefaciens, 30 000 propagulos de una micorriza en 18,93 ± 0,1893 litros de agua ; y

una solution acuosa del 15 al 40 por ciento de un fitato o acido fitico en 3,78 ± 0,0378 litros de agua.

[0044] En una realization ilustrativa de la invention, el componente de Trichoderma virens (por ejemplo, una composition que comprende Trichoderma virens Gl-3) se cultiva usando tecnicas de sustrato solido. El cultivo de hongos se realiza primero usando fermentation liquida de cultivo sumergido. El cultivo se evalua respecto a los contaminantes mediante el hemocitometro y la dilution en serie en agar papa dextrosa (APD) y luego se incuba a 20 grados centigrados (C) durante 48 horas y en agar de soja triptico (AST) y luego se incuba a 37 grados C durante 24 y 48 horas para verificar contaminantes en el cultivo. El cultivo liquido puro se rotia uniformemente sobre lechos de fermentation que contienen un sustrato solido (por ejemplo, cebada, cascaras de arroz, salvado de trigo o un sustrato nutriente organico, tal como pulpa de papel suplementada con fuentes de nutrientes inorganicos). Se agrega penicilina en esta etapa para asegurar que no haya contaminantes bacterianos presentes. Despues de la incubation en los lechos de fermentation, el cultivo se evalua para determinar los contaminantes usando los metodos descritos anteriormente, y una vez que se determina que el cultivo no tiene contaminantes, se seca hasta el 15 por ciento de humedad en peso. Luego, las esporas se separan del sustrato usando separadores vibratorios y se evaluan para determinar la concentration y la contamination del titulo usando dilution en serie cultivada en APD y AST, asi como recuentos hemacitometricos. El cultivo se estandariza usando dextrosa hasta 1x10e9 unidades formadoras de colonias por gramo (ufc/g) y la concentration del titulo final y se realiza la evaluation de contaminantes usando dilution en serie en APD para confirmar la integridad del producto.

[0045] El componente de Trichoderma virens (por ejemplo, Trichoderma virens G1-3) de la invention tiene una concentration de aplicacion preferida de 5E8 ufc/g (si se trata de una suspension liquida, ufc/ml) y se aplica preferiblemente a 1,35 g (1,35 ml) por acre. Un rango de concentration aceptable es de 1,0E7 a 1,0E11 ufc/g de esporas viables Trichoderma virens Gl-3 por gramo de componente de Trichoderma virens. En una realization ilustrativa, el porcentaje en peso de este componente puede variar entre un 1 por ciento y un 99 por ciento del peso total de las esporas Trichoderma virens y las esporas de Bacillus amyloliquefaciens

[0046] Una realization ilustrativa de la invention comprende el aislado G1-3 (ATCC 58678) del hongo de Trichoderma virens u otros aislados. Estos microorganismos se pueden obtener de la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 y otras colecciones de cultivos o aisladas de la naturaleza.

[0047] Otra realization ilustrativa de la invention comprende el aislado Gl-21 de Trichoderma (Gliocladium) virens que es comercializado bajo la marca registrada SoilGuard® 12G por Certis USA L.L.C., 9145 Guilford Road, Suite 175, Columbia, MD 21046.

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[0048] Ademas de la cepa Gl-3 de Trichoderma virens y la cepa Gl-21 Trichoderma virens, otras cepas que pueden usarse para hacer esta invention incluyen las siguiente: Trichoderma virens T-1 (ATCC 9645), Trichoderma virens NCTC 7057 (ATCC 11043), Trichoderma virens NCTC 7056 (ATCC 10044), Trichoderma virens NCTC 7055 (ATCC 10045), Trichoderma virens 167 (ATCC 13213), Trichoderma virens UCLA 230 (ATCC 13362), Trichoderma virens 031 (ATCC 20903), Trichoderma virens 035 (ATCC 20904), Trichoderma virens 035 (ATCC 20904), Trichoderma virens 41 (ATCC 20906), Trichoderma virens ANA 215 (aTcC 24290), Trichoderma virens IFO 8349 (ATCC 44734), Trichoderma virens NRRL 1828 (ATCC 44734), Trichoderma virens ATCC 48179, Trichoderma virens GV-P (ATCC 52045) Trichoderma virens 290-4 (ATCC 52199), Trichoderma virens s Gl-17 (ATCC 58676), Trichoderma virens Gl-9 (ATCC 58677), Trichoderma virens TUB F-109 (ATCC 62399), Trichoderma virens pREM 47610 (ATCC 64271) Trichoderma virens MF5783 (ATCC 74180), Trichoderma virens ATCC 204067, Trichoderma virens s IBT 7706 (ATCC 20443), Trichoderma virens IBT 9354 (ATCC 20444), Trichoderma virens s IBT 9355 (ATCC 204445), Trichoderma virens G-4 (MYA-297), Trichoderma virens G-6 (MYA-298) y Trichoderma virens GJS 95-194 (MYA-1298).

[0049] Debido a que Trichoderma virens esta extendido en el ambiente de tierra, las nuevas cepas pueden aislarse en el futuro y usarse en otras realizaciones de la invencion. Trichoderma virens puede aislarse muestreando la tierra o el tejido vegetal y utilizando diluciones en serie para poner las muestras en placas de ADP con penicilina (para reducir la contamination bacteriana). Las colonias se aislan luego adicionalmente. La confirmation de identidad se realiza a traves de la secuenciacion del ADN. Otras especies de Trichoderma que tienen caracteristicas similares a T. virens y que se puede usar en la invencion incluyen T. viride, T. harzanium, T. asperellum y T. gamsii y otros. Ademas, dado que el ion de calcio es vital para la estabilizacion de la fitasa de B. amyloliquefaciens, una realization alternativa implica agregar un componente de calcio soluble u otro hongo solubilizante de calcio a la tierra. Alternativamente, se puede usar cualquier hongo que libere calcio libre a traves de un nuevo proceso enzimatico que no requiera la acidification de la molecula de calcio. Los hongos solubilizantes de calcio se pueden obtener a traves de colecciones de cultivo (es decir, ATCC; NRRL). Las especies conocidas como solubilizantes de fosfato tricalcico incluyen T. vixens, T. viride y T. harzanium. Se puede obtener una forma soluble de calcio a partir de una cantidad de distribuidores de fertilizantes agricolas en formas tales como sulfato de calcio o EDTA de calcio. Ademas, el calcio granular (99,0 %) se puede obtener de proveedores de productos quimicos, incluyendo Sigma-Aldrich.

[0050] En una realizacion ilustrativa de la invencion, el componente de Bacillus amyloliquefaciens (por ejemplo, Bacillus amyloliquefaciens TJ-1000) se cultiva usando fermentation liquida de cultivo sumergido. Los cultivos se someten a control de calidad respecto a la contaminacion mediante dilution en serie hasta 10E12 y se cultivan en placas ADP y AST. Las placas se incuban a 37 grados C y se evalua la contaminacion a las 24 y 48 horas. Si la inspection de la placa no revela ninguna contaminacion, el cultivo se concentra entonces para eliminar la mayor parte de los medios de fermentacion usados. Los granulos restantes se liofilizan. Despues de la liofilizacion, la concentration del titulo se determina suspendiendo 10 gramos de polvo de esporas liofilizado en 90 ml de agua esteril que contiene un surfactante. La dilucion en serie se usa para determinar la concentracion del titulo de las esporas viables y para verificar la contaminacion. El cultivo se mezcla luego con dextrosa para estandarizar el polvo de esporas a 1,0E11 ufc/g.

[0051] Una tasa de aplicacion preferida para el componente de Bacillus amyloliquefaciens es una tasa de aplicacion solida de 1,35 g por acre a una concentracion de 1E10 ufc/g de Bacillus amyloliquefaciens o una tasa de aplicacion Kquida de 1,35 ml por acre a una concentracion de 1E10 ufc/ml. El rango de concentracion puede variar de 1E7 ufc/g a 5E11 ufc/g. En una realizacion ilustrativa, el porcentaje en peso de este componente varia de un 1 por ciento a un 99 por ciento del peso total de las esporas de Trichoderma virens y las esporas de Bacillus amyloliquefaciens

[0052] Una realizacion ilustrativa adicional de la invencion comprende la bacteria de Bacillus amyloliquefaciens TJ1000 o 1BE. Este microorganismo fue depositado en el ATTC el 31 de octubre de 2001 y se le asigno el numero de acceso ATCC BAA-390. Las realizaciones alternativas de la invencion comprenden otras cepas de Bacillus amyloliquefaciens que pueden aislarse de la naturaleza u obtenerse de la ATCC u otras colecciones de cultivo.

[0053] Otra realizacion ilustrativa de la invencion comprende la cepa FZB24 de Bacillus amyloliquefaciens que es comercializada bajo la marca registrada Taegro® por Earth Bioscience, Inc., 26 Sherman Court, PO Box 764, Fairfield, CT 06430.

[0054] Otras cepas de Bacillus amyloliquefaciens que se pueden usar para hacer la invencion incluyen B. amyloliquefaciens B-543 (NRRL), B. amyloliquefaciens B-644 (NRRL), B. amyloliquefaciens B-645 (NrRl), B. amyloliquefaciens B-942 (NRRL), B. amyloliquefaciens NRS-763 (NRRL), B. amyloliquefaciens IFO 15535 (ATTC 23350), B. amyloliquefaciens T (ATCC 23842), B. amyloliquefaciens SB-1 (ATCC 23844), B. amyloliquefaciens P (ATCC 23844), B. amyloliquefaciens N (ATCC 23845), B. amyloliquefaciens K49 (ATCC 27505), B. amyloliquefaciens RUB 500H (ATCC 31592), B. amyloliquefaciens RUB 500 (ATCC 49763), B. amyloliquefaciens H (ATCC 53495) y B. amyloliquefaciens 3002 (ATCC 700385).

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[0055] B. amyloliquefaciens es una bacteria de origen natural de tierra/plantas y las futuras cepas pueden aislarse o volverse a designar como B. amyloliquefaciens y usarse para hacer la invencion. Las B. amyloliquefaciens pueden obtenerse de la tierra, el tejido vegetal y el ensilado y aislarse utilizando diluciones en serie, y pueden clasificarse mediante secuenciacion de ADN (16S RNA).

[0056] Ademas, en una realization alternativa, el gen phyC que produce la enzima fitasa estable dependiente de calcio puede ser producido por otra bacteria que esta geneticamente disenada para producir la enzima, por ejemplo, ver patente EE. UU. N° 7.339.091 Por esta razon, el solicitante cree que cualquier bacteria que exprese el gen phyC puede usarse en la invencion para estimular la colonization micorrizal. La transferencia de un gen a otro organismo se puede lograr purificando el ADN de un Bacillus amyloliquefaciens, disenando cebadores correspondientes a la secuencia del gen phyC y amplificando la secuencia a traves de la reaction en cadena de la polimerasa (PCR). Los fragmentos amplificados pueden luego purificarse y transferirse a otro organismo mediante el uso de un vector de donation. La confirmation de que el gen se ha insertado mediante amplification por PCR se puede lograr mediante hibridacion utilizando los cebadores usados para la amplificacion inicial por PCR. Se puede obtener una bacteria que produce una enzima fitasa a traves de colecciones de cultivo (es decir, ATTC, NRRL). Las especies conocidas como productores de fitasa incluyen B. amyloliquefaciens y B. subtilis Tambien se puede obtener una enzima fitasa a traves de proveedores quimicos comerciales como Sigma- Aldrich. Ademas, muchas enzimas fitasa se utilizan como aditivos en piensos para cerdos y pollos. Una de estas enzimas fitasa es Ronozyme®, un producto de DSM.

[0057] En otra realizacion alternativa, la B. amyloliquefaciens se cultiva en un caldo y la fitasa producida se combina con micorrizas, T. virens y fitato, produciendo de ese modo una combination que tiene el mismo efecto que la incorporation de una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens en la invencion. Para la production de la enzima fitasa, se suplementa un medio de crecimiento simple (por ejemplo, un medio de glucosa) con fitato y calcio. Una B. amyloliquefaciens o un organismo geneticamente modificado que contiene el gen phyC se inocula en los medios de cultivo. La enzima fitasa se produce en cantidades adecuadas debido a la disponibilidad de fitato y calcio. Las celulas vegetativas se eliminan de los medios a traves de un proceso de centrifugation y los medios de crecimiento de fitasa se usan para producir una realizacion ilustrativa de la invencion.

[0058] El componente de hongos micorrizales de la invencion se puede cultivar a traves de los siguientes pasos. Las semillas de maiz se esterilizan superficialmente (se pueden usar la mayoria de las semillas de cultivo, pero los cultivos de raices fibrosas tienden a producir mas ramificaciones hifales) y se pregerminan en papel de germination. Se esteriliza un medio bajo en fosforo para plantas de maiz en crecimiento y se obtienen inoculos de propagulos de G. intraradices, G. etunicatum, G. aggregatum y G. mossae de una coleccion de cultivos. En esta realizacion, se preparan cuatro lotes de medio separados que contienen una parte por volumen de inoculos micorrizales hasta 20 partes por volumen de medio de cultivo (un lote por cada especie de Glomus). Los medios inoculados se agregan a tarros de 6-10 pulgadas. Se plantan cuatro a seis plantulas de maiz por tarro y se dejan crecer durante 14-16 semanas. Las plantas se riegan diariamente y se fertilizan cada semana con un fertilizante de bajo contenido de fosforo.

[0059] Las plantas se recolectan eliminando las raices de las macetas y cortandolas en pequenos fragmentos de 1 cm a 2 cm de longitud. Los fragmentos de raiz de las cuatro especies de Glomus se mezclan preferiblemente entre si y se usan como el componente de hongos micorrizales de la invencion. La tasa de aplicacion preferida de las cuatro especies de Glomus es de 30 000 propagulos totales por acre (o 0,136 g a 220 000 propagulos/gramo). El intervalo de propagulos por gramo puede variar de 50 propagulos a 220 000 propagulos por gramo. Este componente comprende preferiblemente de un uno por ciento a un 99 por ciento del peso de los otros componentes biologicos de la invencion

[0060] Otra realizacion ilustrativa de la invencion comprende un componente de hongos micorrizales que es comercializado bajo la marca comercial MycoApply® por Mycorrhizal Applications Inc., 810 NW E St., Grants Pass, OR 97526.

[0061] Ademas de Glomus intraradices, Glomus etunicatum, Glomus aggregatum, y Glomus mossae, se pueden usar otras especies de Glomus para preparar el componente de hongos micorrizales de la invencion, que incluyen las siguientes: G. albidum, G. caledonium, C. claroideum, G. clarum, G. clavispora, G. constrictum, G. coronatum, G. deserticola, G. diaphanum, G. eburneum, G. fragilistratum, G. gerosporum, G. Globiferum, G. hadleyi, G. hyalinum, G. insculum, G. lamellosum, G. luteum, G. macrocarpum, G. manihot, G. microaggregatum, G. mirificum, G. monosporum, G. pustulatum, G. sinuosum, G. spurucum, G. tortuosum, G. verruculosum, G.versiforme y G. viscosum (disponibles en INVAM-West Virginia University). Las siguientes especies endomicorrizales tambien se pueden usar para preparar el componente de hongos micorrizales de la invencion: Ambisporaceae spp.; Archaeosporaceae spp. [Ar. leptoticha, Ar. gerdemanniiy A. trappei (disponibles en INVAM- West Virginia University)] Geosiphonaceae spp., Acaulosporaceae spp. [A. colossica, A. delicatta, A. denticulate, A. foveata, A. koskei, A. lacunosa, A. laevis, A. longula, A. mellea, A. morrowiae, A. rehmii, A. scrobiculata, A. spinosay A. tuberculata (disponibles en INVAM-West Virginia University)]; Enterophosporaceae spp. (E. colombiana, E. contigua, E. infrequens, E. kentinesis), Dicersisporaeceae spp, Gigasporaceae spp. [incluyendo

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Gi. Albida, Gi. decipiens, Gi. gigantea, Gi margarita y Gi. rosea) (disponibles en INVAM, Universidad de Virginia Occidental)]; Paraglomus spp. (P. brasilianum y P. occultum (disponibles en INVAM-West Virginia University)]; y Scutellospora spp (S. calospora, S. cerradensis, S. coralloidea, S. dipurpurascens, S. eritropa, S. fulgida, S. gregaria, S. heterogama, S. pellucida, S. persica, S. reticulada, S. rubra, S. scutata y S. verruscosa (disponibles en INVAM-West Virginia University)]. Los hongos micorrizales arbusculares son hongos de tierra que se producen de forma natural, y pueden descubrirse nuevas cepas y especies en el futuro y usarse para fabricar la invention.

[0062] Otra realization ilustrativa de la invencion comprende un componente de fitato o acido fitico que se puede obtener de Northwest Scientific, Inc., PO Box 1811 Billings, MT 59103. La tasa de aplicacion preferida de fitato es de un cuarto por acre de una solution de fitato al 40 por ciento. Debido a que las altas cantidades de fitato no inhiben el crecimiento de las micorrizas o de las plantas, se pueden usar mayores tasas de aplicacion. La concentration de fitato en la solucion puede variar de un uno por ciento a un 99 por ciento en peso de fitato como un porcentaje del peso de la solucion o quimica de fertilizante estandar, por ejemplo, una solucion que contiene 9-18-9 o 10-34-0 Nitrogeno (N ) -Fosforo (P) - Potasio (K). Por lo tanto, se puede usar agua o una solucion que tenga una quimica de fertilizante estandar, es decir, 10N-34P-0K como el Kquido de suministro para la composition de fitato/biologica. El fitato es generalmente un subproducto del procesamiento de cultivos agricolas o un subproducto de las instalaciones de tratamiento de estiercol/biorreactor. Por lo tanto, el fitato/acido fitico se puede obtener a partir de maiz, soja, trigo, arroz, estiercol, etc.

[0063] En una realizacion ilustrativa, la invencion es una composicion de materia que comprende: una combination de fitato y una multitud de microorganismos que comprenden un hongo de Trichoderma virens, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens y un hongo micorrizal o una pluralidad de hongos micorrizales micorrizas que se colocan en la proximidad de una raiz vegetal de manera que permite que dicha multitud de microorganismos en la composicion de la materia colonice dicha raiz vegetal.

[0064] En otra realizacion, la invencion es un metodo para aumentar el rendimiento de la planta que comprende: colocar una combinacion de fitato y una multitud de microorganismos que comprenden un hongo de Trichoderma virens, una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens y una multitud de hongos micorrizales en la vecindad de una raiz vegetal de manera que permita a dichos microorganismos colonizar dicha raiz vegetal. En otra realizacion, dicha composicion se coloca en la proximidad de dicha raiz vegetal mediante la aplicacion a una semilla preplantada, mediante aplicacion en los surcos a medida que se siembra una semilla, o a voleo sobre una fila de semillas.

[0065] En una realizacion ilustrativa, la invencion es un metodo que comprende aplicar la siguiente composicion de materia a cada acre de tierra de cultivo: aproximadamente un cuarto de una solucion de fitato de aproximadamente un 40 por ciento (en peso); de aproximadamente un galon a cinco galones de agua o agua mas un fertilizante NPK estandar; 1,35 g de una composicion de esporas TJ1000 de B. amyloliquefaciens (a una concentracion de aproximadamente 1E10 ufc/g); 1,35 g de una composicion de esporas Gl-3 de T. virens (a una concentracion de aproximadamente 5,0E8 ufc/g); y 0,136 g de una composicion de propagulos de micorrizas (a una concentracion de aproximadamente 220 000 propagulos/g). Los componentes biologicos se mezclan preferiblemente en un tanque aplicador de fertilizante y se aplican en el surco o se colocan en bandas en las proximidades del surco o raiz vegetal.

[0066] Con respecto al componente de Bacillus amyloliquefaciens de la invencion, una formulation liofilizada seca preferida tiene un recuento de esporas de aproximadamente 1E10 ufc/g de esporas TJ1000 de Bacillus amyloliquefaciens y se aplica a una tasa preferida de 1,35 gramos de componente de Bacillus amyloliquefaciens por acre. Una tase de aplicacion de fiquido preferida es de aproximadamente 1,35 ml de componente de Bacillus amyloliquefaciens por acre a una concentracion de aproximadamente 1E10 ufc/ml de esporas TJ1000 de Bacillus amyloliquefaciens. Un rango de concentraciones aceptable para la formulacion solida es de aproximadamente 1E7 ufc/g a aproximadamente 5E11 ufc/g. En una realizacion preferida de la invencion, el componente de Bacillus amyloliquefaciens comprende entre aproximadamente el uno por ciento y aproximadamente el 99 por ciento del peso combinado del componente de Trichoderma virens y el componente de Bacillus amyloliquefaciens. Estos valores tambien se usan con otras cepas de Bacillus amyloliquefaciens.

[0067] Con respecto al componente de Trichoderma virens de la invencion, la tasa de aplicacion preferida para este componente de la invencion es de aproximadamente 1,35 gramos por acre a una concentracion de aproximadamente 5E8 ufc/gramo, con un rango de concentracion preferido de aproximadamente 1E7 ufc a aproximadamente 1E11 ufc de esporas Gl-3 viables de Trichoderma virens por gramo de componente de Trichoderma virens. Este componente como porcentaje en peso puede variar entre aproximadamente un uno por ciento y aproximadamente un 99 del peso combinado del componente de Trichoderma virens y el componente de Bacillus amyloliquefaciens. Estos valores tambien pueden usarse con otras cepas de Trichoderma virens.

[0068] Con respecto al componente de hongos micorrizales de la invencion, la tasa de aplicacion preferida de las cuatro especies de Glomus es de aproximadamente 30 000 propagulos por acre (aproximadamente 0,136 gramos del componente de hongos micorrizales a una concentracion de aproximadamente 220 000

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propagulos/gramo). El rango de propagulos por gramo puede variar de aproximadamente 50 propagulos por gramo a aproximadamente 220 000 propagulos por gramo. Este componente comprende preferiblemente desde aproximadamente el uno por ciento hasta aproximadamente el 99 por ciento del peso combinado del componente de Trichoderma virens y el componente de Bacillus amyloliquefaciens.

[0069] Con respecto al componente de fitato de la invencion, una tasa de aplicacion preferida de fitato es de aproximadamente un cuarto por acre de una solucion de fitato de aproximadamente el 40 por ciento. Debido a que las altas cantidades de fitato no inhiben el crecimiento de las micorrizas o las plantas, se puede usar una cantidad mayor. La concentracion de la solucion puede variar entre un uno por ciento y un 99 por ciento p/p de fitato/agua o una solucion de fertilizante NPK. Las practicas agricolas convencionales han estado haciendo uso de iniciadores NPK o fertilizantes emergentes que se aplican con bandas o en surcos en el momento de la siembra. Los componentes de esta invencion pueden aplicarse por si mismos, o mezclados con agua o con fertilizantes NPK.

Ejemplos de trabajo

[0070] En los ejemplos de trabajo, las cuatro micorrizas son Glomus aggregatum, Glomus etunicatum, Glomus intraradices y Glomus mossae. La cepa de Bacillus amyloliquefaciens es Bacillus amyloliquefaciens TJ-1000 y la cepa de Trichoderma virens es Trichoderma virens Gl-3. Como ha senalado anteriormente, otras especies o cepas de micorrizas y otras cepas de Trichoderma virens y otras cepas de Bacillus amyloliquefaciens se pueden usar en la practica de la invencion.

[0071] En referencia a la Fig. 1, se presentan los resultados del ensayo de los campos de maiz de Dakota del Sur (SD). En esta prueba de campo, el maiz se planto en dos bloques: un bloque sin fertilizante aplicado en la siembra y el otro bloque con 4 galones de un fertilizante Kquido de fosforo estandar en la industria con un analisis de un 10 por ciento de nitrogeno y un 34 por ciento de fosforo. Los tratamientos dentro de los bloques fueron identicos y son los siguientes:

Tratamiento 1 - CHK: Este fue el control no tratado que consistio en semillas de maiz que fueron tratadas con el tratamiento estandar de semillas con fungicidas/insecticidas de la industria. Este tratamiento de semillas fue consistente a lo largo de los otros tratamientos y bloques.

Tratamiento 2: Mico ES: este tratamiento fue una aplicacion en el surco de propagulos de micorrizas aplicados a una velocidad de 30 000 propagulos por acre con 5 galones de agua por acre como portador. Tratamiento 3 - Mico + T.V. + B.A.ES: este tratamiento fue una aplicacion en el surco de propagulos de micorrizas aplicados a razon de 30 000 propagulos por acre mas esporas de Trichoderma virens aplicadas a una tasa de 4,05E08 por acre y esporas de Bacillus amyloliquefaciens aplicadas a una tasa de 1,35E10 por acre.

Tratamiento 4 - Fitato ES: este tratamiento fue una aplicacion en el surco de una solucion de fitato al 15 por ciento aplicada a 1 galon por acre mas 4 galones de agua para el portador en el bloque no iniciador o 4 galones de fertilizante liquido para el bloque 10-34- 0.

Tratamiento 5 - Fitato + Mico ES: este tratamiento fue una aplicacion en el surco de propagulos de micorrizas a una tasa de 30 000 propagulos por acre en una solucion del 15 por ciento de fitato aplicado a razon de 1 galon por acre mas 4 galones de agua para el portador en el bloque no iniciador o 4 galones de fertilizante liquido para el bloque 10-34-0.

Tratamiento 6 - Fitato + T.V. + B.A. ES: Este tratamiento fue una aplicacion en el surco de una combination de esporas de Trichoderma virens aplicado a una tasa de 4.05E08 por acre y Bacillus amyloliquefaciens aplicado a una tasa de 1,35E10 por acre en una solucion de fitato al 15 por ciento a una tasa de 1 galon por acre mas 4 galones de agua para el portador en el bloque no iniciador o 4 galones de fertilizante kquido para el bloque 10-34-0.

Tratamiento 7 - Fitato + Mico + T.V. + B.A. ES: Este tratamiento fue una aplicacion en el surco de una combinacion de propagulos de micorrizas a una tasa de 30 000 por acre mas Trichoderma virens a una tasa de 4.05E08 por acre mas Bacillus amyloliquefaciens aplicado a una tasa de 1,35E10 por acre en una solucion de fitato al 15 por ciento a una tasa de 1 galon por acre mas 4 galones de agua para un portador en el bloque no iniciador o 4 galones de fertilizante kquido para el bloque 10-34-0.

[0072] Conclusion del ensayo: la aplicacion de propagulos de micorrizas por si sola (Tratamiento 2) produjo un aumento significativo en el rendimiento en el bloque no iniciador, pero no produjo un rendimiento significativo en el entorno de fosforo alto en el bloque 10-34-0 por encima del CHK (Tratamiento 1). Esta fue una respuesta esperada, ya que se esperaba que las micorrizas experimentasen dificultades para producir una respuesta de rendimiento en un entorno con alto contenido en fosforo.

[0073] Cuando las micorrizas, Trichoderma virens y Bacillus amyloliquefaciens se aplicaron juntas (Tratamiento 3) o cuando se anadio fitato por si mismo (Tratamiento 4) no hubo un aumento significativo en el rendimiento del Tratamiento 2 ni en el bloque no iniciador, ni en el 10-34-0.

[0074] El fitato mas las micorrizas (Tratamiento 5) aumento significativamente el rendimiento cuando se

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compare con las micorrizas solas (Tratamiento 2) en el bloque no iniciador, pero no tuvo un impacto significativo en el rendimiento del bloque 10-34-0 en ese ambiente alto en fosforo.

[0075] Trichoderma virens y Bacillus amyloliquefaciens mas fitato (Tratamiento 6) aumentaron significativamente el rendimiento por encima del fitato solo (Tratamiento 4) en el bloque no iniciador, pero no aumento el rendimiento en el bloque 10-34-0.

[0076] Las micorrizas, Trichoderma virens, Bacillus amyloliquefaciens, mas fitato (Tratamiento 7) aumentaron significativamente el rendimiento por encima de todas las otras entradas de tratamiento (Tratamientos 1 a 6) tanto en el bloque no Iniciador como en el bloque 10-34-0 con el ambiente de alto contenido en fosforo. Este resultado fue, de hecho, un avance asombroso y una confirmation de que el Tratamiento 7 es a la vez novedoso y sorprendente.

[0077] En resumen, los datos de la Fig. 1 muestran que una composition de hongos micorrizales (Tratamiento 2) aplicada en el surco de la semilla aumento el rendimiento en condiciones de bajo fosforo. Sin embargo, cuando se aplico una composicion de hongos micorrizales de la misma manera en condiciones de alto contenido de fosforo (es decir, con cuatro galones de un fertilizante 10-34-0) no hubo respuesta de rendimiento. Esta es una respuesta esperada.

[0078] Cuando se aplico fitato con una combination de hongos micorrizales mas un hongo de Trichoderma virens mas una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens con fertilizante no iniciador (Tratamiento 7), el rendimiento del maiz se incremento a niveles mayores que la aplicacion de un fertilizante 10-34-0 por si solo. Ademas, la misma combinacion aumento el rendimiento del maiz a niveles mas altos incluso bajo condiciones de fosforo elevado y fue el unico tratamiento que produjo una respuesta de rendimiento significativa con la aplicacion de un fertilizante 10-34-0. Los dos resultados producidos por este tratamiento son sorprendentes. Es bien sabido que los hongos micorrizales son inhibidos de la germination y colonization de las raices de las plantas en ambientes de alto fosforo o en presencia de un fertilizante de fosforo aplicado, como un fertilizante 10-34-0.

[0079] El tratamiento 7 combino un hongo de Trichoderma virens y una bacteria de Bacillus amyloliquefaciens con fitato (IP6) y una composicion de hongos micorrizales para producir una composicion que es sorprendentemente efectiva para aumentar el rendimiento del maiz. El hecho de que esta composicion aumentara el rendimiento de manera mas efectiva que un fertilizante 10-34-0 establece que el solicitante descubrio una solution largamente buscada para aumentar el rendimiento de la planta. La invention permite el reemplazo de un fertilizante quimico estandar con uno que es microbiano en su modo de action. El tratamiento 7 tambien proporciono un mecanismo para establecer hongos micorrizales en las raices de las plantas en presencia de fosforo.

[0080] Haciendo referencia a la Fig. 2, se presentan los resultados de un experimento de cuarto de cultivo de maiz. El maiz se sembro en conos de siembra Deepots ™ en una mezcla de arena:tierra de 2: 1 y se repitio aleatoriamente dentro de las bandejas. Los tratamientos se colocaron 1 pulgada hacia el lado y 1 pulgada hacia abajo respecto de donde se plantaron las semillas. Las plantas se cultivaron bajo luces duales de sodio y halogenuros metalicos de alta presion de 1000 vatios con un ciclo de crecimiento de 12 horas de encendido/12 horas de apagado. Las plantas se regaron diariamente con el equivalente a 1 pulgada de agua. Las plantas de maiz se cosecharon 28 dias despues de la siembra.

Tratamiento 1: control: el tratamiento CHK fue el tratamiento con semilla de fungicida (FST) y el tratamiento con semilla de insecticida (1ST) y este tratamiento de semilla fue consistente a lo largo del ensayo. El equivalente de 5 galones de agua se coloco 1 pulgada hacia un lado y 1 pulgada debajo de la semilla. Tratamiento 2 - Fitato: el equivalente de fitato del 15 por ciento a razon de 1 galon por acre, y agua a razon de 4 galones por acre se colocaron 1 pulgada hacia un lado y 1 pulgada debajo de la semilla.

Tratamiento 3 - Fitato + T.V. + B.A .: El equivalente de esporas de Trichoderma virens a 4,05E08 por acre mas esporas de Bacillus amyloliquefaciens a 1,35E10 por acre mas fitato del 15 por ciento a razon de 1 galon por acre y agua a 4 galones por acre.

Tratamiento 3 - Fitato + T.V. + B.A. : El equivalente de esporas de Trichoderma virens a 4,05E08 por acre mas esporas de Bacillus amyloliquefaciens a 1,35E10 por acre mas fitato del 15 por ciento a razon de 1 galon por acre y agua a 4 galones por acre.

Tratamiento 4 - Fitato + Mico: el equivalente de propagulos de micorrizas a 30 000 por acre mas fitato del 15 por ciento a razon de 1 galon por acre y agua a 4 galones por acre.

Tratamiento 5 - Fitato + Mico + T.V. + B.A .: El equivalente de propagulos de micorrizas a 30 000 por acre mas esporas de Trichoderma virens a 4,05E8 por acre mas esporas de Bacillus amyloliquefaciens a 1,35E10 por acre mas de fitato del 15 por ciento a 1 galon por acre y agua a razon de 4 galones por acre.

[0081] La adicion de fitato en solitario (Tratamiento 2) causo una propiedad antinutriente, disminuyendo el crecimiento de las plantas. La adicion de fitato + T.V. + B.A. (Tratamiento 3) y fitato + mico (Tratamiento 4) aumentaron el crecimiento de las plantas. Fitato + Mico + T.V. + B.A. (Tratamiento 5) produjo el mayor rendimiento para el crecimiento de las plantas, y esto proporciona evidencia de que la adicion de fitato,

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Trichoderma virens y Bacillus amyloliquefaciens puede acelerar la germinacion y la colonizacion de propagulos de micorrizas por encima de un control y por encima de lo que las micorrizas pueden hacer por si solas. Este ensayo es una confirmacion adicional de los resultados de campo presentados en la Fig. 1.

[0082] En resumen, en el ensayo del cuarto de cultivo (Fig. 2), la altura de la planta, la masa de brote y la masa de la raiz del Tratamiento 5 fueron significativamente diferentes de las del tratamiento de control 1. El tratamiento 5 contiene todos los componentes (fitato, T.virens, B.amyloliquefaciens y hongos micorrizales) que producen sorprendentes resultados. Este ensayo repite la respuesta del ensayo de campo para corroborar aun mas los sorprendentes resultados.

[0083] La Fig. 3 representa la reaccion de la produccion de Bacillus amyloliquefaciens de enzima fitasa y el impacto de la enzima fitasa en el fitato (IP6). Esta reaccion da como resultado la liberation de 3 moles de fosforo inorganico mas mio-inositol trifosfato (IP3). Es probable que el mio-inositol trifosfato actue como senal para promover la germinacion y/o la colonizacion de las raices por las micorrizas.

[0084] El uso de realizaciones ilustrativas de esta invention es ventajoso para el crecimiento de la mayoria de los cultivos de importancia agricola. La agricultura convencional (aplicaciones de fertilizantes con alto contenido en fosforo, rotation de cultivos, sin cultivos en el suelo durante largos periodos de tiempo, fungicidas quimicos / biologicos) reduce las poblaciones de micorrizas nativas. El aumento de la germinacion y la colonizacion de los hongos micorrizales les permite a los agricultores reducir los costos de los insumos y obtener mayores rendimientos mediante la utilization de nutrientes ya presentes en el suelo mientras se mantiene la fertilization de nutrientes inorganicos adecuada. Los hongos micorrizales arbusculares colonizan el 80 por ciento de las plantas, en su mayoria plantas verdes frondosas y plantas producidas comercialmente. Esta invencion encuentra utilidad en el crecimiento de cultivos de importancia agricola que incluyen alfalfa, cebada, judias (todos), maiz, algodon, mijo, arroz, sorgo, soja, girasol y trigo. Esta invencion tambien es aplicable a una serie de otros cultivos de importancia comercial que incluyen, pero no se limitan a: acacia, agapanto, aliso, almendra, manzana, albaricoque, alcachofa, fresno, esparrago, alamo temblon, aguacate, bambu, platano, albahaca, arandano, haya , begonia, cereza negra, mora, algarrobo, grama azul, sauco, boj, castano de Indias, cacao, cactus, camelia, carisa, zanahoria, mandioca, ceanoto, cedro, apio, cereza, crisantemo, citricos (todos), coco, cafe, arbol de coral, alamo, caupi, arbol del cangrejo, creosota, cryptomeria, pepino, grosella, cipres, cornejo, berenjena, olmo, eucalipto, evonimo, helecho, festuca, higo, lino, flores (casi todos), forsitia, fucsia, gardenia, ajo, geranio, uva (todos), hierbas (perennes), fresno verde, guayule, goma, almizcle, espino, canamo, hierbas (todos), hibisco, acebo, hostas, impatiens, jatrofa, jojoba, enebro, kiwi , puerro, lechuga, ligustro, lirio, robinia, lichi, caoba, magnolia, mahonia, mango, arces (todos), calendulas, mezquite, mimosa, dondiego de dia, mora, mirto, capuchina, quingombo, olivo, cebolla, tejo del Pacifico, palmas (todos), hierba de pampa, maracuya, papaya, chirimoya, guisantes, melocotones, cacahuetes, pera, pimientos (todos), pistacho , caqui, azahar de la China, ciruela, podocarpus, flor de Pascua, alamo, patata, calabaza, frambuesa, secuoya, arroz, rosa, caucho, ballico, artemisa, planta de sal, amelanchier, chalote, boca de dragon, acedera, calabacin, fruta de estrella, fresa, suculentas, pasto del Sudan, cana de azucar, zumaque, goma dulce, batata, sicomoro, taxus, te, tabaco, tomate, violetas, name, yuca y sauce.

[0085] La mayoria de las sembradoras modernas tienen un tanque de aplicacion de fertilizante/insecticida. En realizaciones ilustrativas de esta invencion, la solution de fitato/microorganismos se mezcla con agua y/o fertilizante NPK y se aplica en una banda o en un surco. La solucion tambien se puede repartir mediante la aplicacion con un pulverizador antes o despues de la siembra de semillas. El fitato tambien se puede aplicar como un polvo seco, comprimido o recubierto en una prensa con las micorrizas, B. amyloliquefaciens y T. virens. Se puede aplicar como una banda, en surcos, o repartir en un campo. La combination tambien puede aplicarse o mezclarse en la tierra y usarse en invernaderos. La combinacion puede aplicarse como un tratamiento de semillas donde los componentes se aplican como tratamiento a la semilla en seco o en una solucion kquida.

[0086] En otra realization ilustrativa, la invencion implica combinar fitato o acido fitico (Componente D) con tres microorganismos en un rango de posibles valores de ufc/g. Tres microorganismos constituyen tres componentes de la invencion: Componente A, Componente B y Componente C.

[0087] En esta realizacion, el Componente A es una composition que comprende un hongo de Trichoderma virens. Este componente preferiblemente tiene un rango de concentration de Trichoderma virens viable de entre aproximadamente 1,0E6 a aproximadamente 1,0E11 ufc por gramo del Componente A. En una realizacion preferida de la invencion, el Componente A comprende preferiblemente entre aproximadamente el uno por ciento y aproximadamente el 99 por ciento del peso combinado del Componente A mas el Componente B (denominado Combinacion AB). Una tasa de aplicacion preferida del Componente A es de aproximadamente 1,35 gramos (a una concentracion de aproximadamente 5,0E8 ufc/gramo) por acre de tierra de cultivo, en donde el Componente A comprende aproximadamente el 50 por ciento del peso de la Combinacion AB.

[0088] En esta realizacion, el Componente B es una composicion que comprende una bacteria Bacillus amyloliquefaciens . Este componente preferiblemente tiene un rango de concentracion de Bacillus amyloliquefaciens viable de entre aproximadamente 1,0E7 a aproximadamente 5,0E11 ufc por gramo del

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Componente B. En una realizacion preferida de la invencion, el Componente B comprende preferiblemente entre aproximadamente el uno por ciento y aproximadamente el 99 por ciento del peso combinado de la Combination AB. Una tasa de aplicacion preferida del Componente A es de aproximadamente 1,35 gramos (a una concentration de aproximadamente 1,0E10 ufc/gramo) por acre de tierras de cultivo, en donde el Componente B comprende aproximadamente el 50 por ciento del peso de la Combinacion AB.

[0089] En esta realizacion, el Componente C es una composition que comprende Glomus spp. Este componente preferiblemente tiene un Glomus spp. viable. La concentracion varia entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 220 000 propagulos/gramo. El componente C comprende preferiblemente entre aproximadamente el uno por ciento y aproximadamente el 99 por ciento del peso combinado de la combinacion AB. Por ejemplo, la parte biologica de una realizacion ilustrativa de la invencion comprende aproximadamente el 98 por ciento en peso de la Combinacion AB y aproximadamente el 2 por ciento en peso del Componente C. Una tasa de aplicacion preferida del Componente C es de aproximadamente 0,136 gramos (a una concentracion de aproximadamente 220 000 propagulos/gramo) o aproximadamente 30 000 propagulos por acre de tierras de cultivo.

[0090] Si bien existe un hmite inferior preferido para la tasa de aplicacion de propagulos de Glomus (p. ej., 5000 propagulos por acre de tierras de cultivo), no hay ningun Kmite superior (aparte de los economicos) para la aplicacion de propagulos de Glomus por acre de tierras de cultivo. El siguiente cuadro describe una proportion minima y maxima preferida de ufc de Bacillus amyloliquefaciens y ufc de Trichoderma virens para propagulos de Glomus

Bacillus amyloliquefaciens minima Bacillus amyloliquefaciens maxima Trichoderma virens minima Trichoderma virens maxima

Por cada propagulo de Glomus

3,3E2 ufc 1,7E7 ufc 3,3E1 ufc 3,3E6 ufc

[0091] El cuadro anterior muestra los limites inferior y superior de lo que el solicitante cree que es un rango de los numeros efectivos de esporas de Bacillus y esporas de Trichoderma por cada propagulo Glomus. Se cree que el extremo superior del rango es apropiado para entornos de campo (cultivo), pero las tasas mas bajas pueden ser efectivas en entornos mas controlados, por ejemplo, en configuraciones de invernadero.

[0092] En esta realizacion, el Componente D es una composicion que comprende fitato. Una tasa de aplicacion preferida para el Componente D es de aproximadamente un cuarto de una solution de fitato de aproximadamente el 40 por ciento por acre. La solucion puede ser con agua o con agua mas un fertilizante estandar (Nitrogeno (N), Fosforo (P), Potasio (K), por ejemplo, un fertilizante 10-34-0). La concentracion de fitato puede variar de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 90 por ciento del peso de la solucion total. Alternativamente, el componente de fitato tambien se puede aplicar en forma de sal, es decir, como una molecula de fitato de calcio al 99 por ciento.

[0093] Haciendo referencia a la Fig. 3, se presenta un diagrama esquematico que ilustra la reaction de Bacillus amyloliquefaciens. Esta figura ilustra que el uso de una enzima fitasa para reducir el fitato y liberar facilmente el fosforo disponible en la planta en la rizosfera da como resultado una senal que facilita la germination y posterior colonization de las raices de las plantas por hongos micorrizales.

[0094] Haciendo referencia a la Fig. 4, se presenta una fotografia que fue producida tinendo una raiz de maiz con azul tripan. La raiz del maiz se tomo de un campo donde el tratamiento aplicado fue Fitato + Micorrizas + T. virens+B. amyloliquefaciens y 3 galones de 10-34-0 en el surco durante la siembra. Cuando la muestra de la raiz se tomo 18 dias despues de la aparicion, la raiz ya mostraba una colonizacion micorrizal saludable tanto fuera como dentro de la raiz. El aumento de la raiz es 50 veces (50x).

[0095] Haciendo referencia a la Fig. 5, se presenta una fotografia de las raices de plantas de maiz que tienen 28 dias de antiguedad. Esta fotografia proporciona evidencia empirica de que la realizacion ilustrativa de la invencion utilizada es eficaz para producir senales que hacen que los propagulos de micorrizas germinen y colonicen la raiz del maiz en un entorno de alto fosforo. El aumento de la proliferation de raices es causado por micorrizas que aumentan el crecimiento de las raices.

[0096] Haciendo referencia a la Fig. 6, se presenta una fotografia de una raiz con micorrizas tenidas de azul con azul tripan y fotografiadas bajo un microscopio con un aumento de 50x. Esta fotografia muestra la estructura de las hifas micorrizales que colonizan dentro de la raiz.

[0097] Haciendo referencia a la Fig. 7, se presenta un cuadro que muestra los datos que se recolectaron en Carmi, IL con tratamientos en maiz hibrido durante la temporada de cultivo de 2012. La ubicacion se encontraba bajo una fuerte presion de sequia, como indica el bajo rendimiento. Se espera que el rendimiento del maiz en

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condiciones de humedad promedio sea de mas de 200 bushels por acre en esta zona. Estos datos muestran que la realization ilustrativa de la invention utilizada fue efectiva bajo condiciones de humedad muy baja. La ubicacion tiene una aplicacion estandar de fertilizante para un rendimiento de mas de 200 bushels, que proporcionana un entorno alto en fosforo. El uso de la realizacion ilustrativa de la invencion produjo claramente una respuesta de rendimiento mejorada de 16+ bushels por acre que fue proporcionada por la colonization de la raiz de micorriza a pesar de las condiciones altas en fosforo. Estos datos muestran que la aplicacion en el surco de Micorrizas + Fitato +Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens incremento el rendimiento en este ambiente alto en fosforo y baja humedad. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria Base + Mico + Fitato + T.V. + B.A. = tratamiento de semillas base + una aplicacion en el surco de 5 galones de una solution que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

[0098] En referencia a la Fig. 8, se presentan mas datos de Carmi, IL. Este grafico muestra que la interaction de los componentes de la realizacion ilustrativa de la invencion en una aplicacion en el surco no se ve obstaculizada por los ingredientes activos de T. virens + B. amyloliquefaciens aplicados a la semilla. De hecho, la semilla aplicada combinada de T. virens +B. amyloliquefaciens y la aplicacion en el surco de la invencion da como resultado una ventaja de rendimiento de mas de 23 bushels por acre. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria

Base + T.V. + B.A.-SA = Base + Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens que es la semilla aplicada

(SA).

Base + Mico + Fitato + T.V. + B.A. = tratamiento de semillas base + una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

Base + T.V + B.A-SA + Mico + Fitato + T.V + B.A. = Base + T.V. + B.A. (SA) mas una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

[0099] Haciendo referencia a la Fig. 9, se presenta un cuadro que muestra los datos recolectados en Ashkum, IL con tratamientos sobre maiz hibrido durante la temporada de crecimiento de 2012. La ubicacion se encontraba bajo una fuerte presion de sequia, como lo indica el bajo rendimiento, sin embargo, la presion de sequia no fue tan grande como en la ubicacion de Carmi IL. Se espera que el rendimiento del maiz en condiciones de humedad promedio sea de mas de 200 bushels por acre en esta zona. Estos datos muestran que la realizacion ilustrativa de la invencion utilizada es efectiva bajo condiciones de humedad muy baja. La ubicacion tiene una aplicacion estandar de fertilizante para un rendimiento de mas de 200 bushels, que proporcionaria un entorno alto en fosforo. Los datos muestran claramente la respuesta de rendimiento mejorada de mas de 32 bushels por acre proporcionados por la colonizacion de raices de micorrizas como resultado del uso de una realizacion ilustrativa de la invencion a pesar de las condiciones de alto fosforo. Los datos confirman que la aplicacion en el surco de micorrizas + fitato +Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens aumentan el rendimiento en este ambiente alto en fosforo y de humedad baja a media. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria Base + Mico + Fitato + T.V. + B.A. = tratamiento de semillas base + una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

[0100] Haciendo referencia a la Fig. 10, se presentan los datos obtenidos en Ashkum, IL. El cuadro muestra que la interaccion de los componentes de una realizacion ilustrativa de la invencion en una aplicacion en el surco no se ve obstaculizada por los ingredientes activos de T. virens + B. amyloliquefaciens aplicados a la semilla. De hecho, la semilla aplicada combinada de T. virens +B. amyloliquefaciens y la aplicacion en el surco de la invencion da como resultado una ventaja de rendimiento de mas de 38 bushels por acre. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria

Base + T.V. + B.A.-SA = Base + Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens que es la semilla aplicada

(SA).

Base + Mico + Fitato + T.V. + B.A. = tratamiento de semillas base + una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

Base + T.V + B.A-SA + Mico + Fitato + T.V + B.A. = Base + T.V. + B.A. (SA) mas una aplicacion en el surco

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de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

[0101] Haciendo referencia a la Fig. 11, se presenta un cuadro que muestra los datos recolectados en Olivia, MN con tratamientos sobre maiz hibrido durante la temporada de crecimiento de 2012. Esta ubicacion tenia precipitaciones normales a diferencia de las ubicaciones en Carmi y Ashkum, IL. Se espera que el rendimiento del maiz bajo condiciones de humedad promedio sea de mas de 200 bushels por acre en esta zona. Estos datos muestran que la realizacion ilustrativa de la invencion utilizada es efectiva bajo condiciones de humedad adecuadas o normales. La ubicacion tiene una aplicacion estandar de fertilizante para un rendimiento de mas de 200 bushels, que proporcionaria un entorno alto en fosforo. El uso de la realizacion ilustrativa de la invencion produjo claramente una respuesta de rendimiento mejorada de 33+ bushels por acre proporcionados por la colonization de la raiz de micorriza a pesar de las condiciones altas en fosforo. Los datos muestran que la aplicacion en el surco de Micorrizas + Fitato +Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens incremento el rendimiento en este ambiente alto en fosforo y humedad adecuada. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria Base + Mico + Fitato + T.V. + B.A. = tratamiento de semillas base + una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

[0102] Haciendo referencia a la Fig. 12, se presenta un grafico que muestra los datos de Olivia, MN. El cuadro muestra que la interaction de los componentes de la realizacion ilustrativa de la invencion utilizada en una aplicacion en el surco no se ve obstaculizada por los ingredientes activos de T. virens + B. amyloliquefaciens aplicados a la semilla. De hecho, la semilla aplicada combinada de T. virens +B. amyloliquefaciens y la aplicacion en el surco de la invencion da como resultado una ventaja de rendimiento de mas de 44 bushels por acre. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria

Base + T.V. + B.A.-SA = Base + Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens que es la semilla aplicada

(SA).

Base + Mico + Fitato + T.V. + B.A. = tratamiento de semillas base + una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

Base + T.V + B.A-SA + Mico + Fitato + T.V + B.A. = Base + T.V. + B.A. (SA) mas una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

[0103] Haciendo referencia a la Fig. 13 se presenta un grafico que muestra los datos de rendimiento de las semillas de soja que se cultivaron en un ensayo de campo en la Irrigation Research Foundation, Yuma, CO en la temporada de cultivo de 2012. En este lugar de ensayo, se irrigaron las semillas de soja y se aplico un fertilizante con el analisis de 15-20-0-2s-.027ZN en surcos a razon de 4,5 galones por acre. Los datos confirman nuevamente que una realizacion ilustrativa de la invencion rinde de manera similar en una legumbre dicotiledonea, en este caso soja, a como lo hace en una monocotiledoneo, maiz en presencia elevada de fosforo. Los datos tambien confirman que el uso de una semilla aplicada (SA) T. virens + B. amyloliquefaciens continuo para permitir la realizacion de la invencion usada para producir un rendimiento incrementado. El aumento general de los tratamientos combinados fue de 6,7 bushels de soja por acre. Los tratamientos fueron los siguientes:

Base = tratamiento estandar de las semillas con fungicidas e insecticidas de la industria

Base + T.V. + B.A.-SA = Base + Trichoderma virens + Bacillus amyloliquefaciens que es la semilla aplicada

(SA).

Base + T.V + B.A-SA + Mico + Fitato + T.V + B.A. = Base + T.V. + B.A. (SA) mas una aplicacion en el surco de 5 galones de una solucion que contiene 4 cepas de propagulos de micorrizas a 30 000 propagulos por acre + 40 % de fitato a 1 cuarto por acre + Trichoderma virens a 4,20E9 unidades formadoras de colonias por acre, Bacillus amyloliquefaciens a 8,40E10 unidades formadoras de colonias por acre.

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Composition que comprende lo siguiente:

   de 6,75E8 ± 6.75E6 a 4,20E9 ± 4,20E7 unidades formadoras de colonias de una Trichoderma virens, de 1,35E10 ± 1,35E8 a 8,40E10 ± 8,40E8 unidades formadoras de colonias de un Bacillus amyloliquefaciens, 30 000 propagulos de una micorriza en 18,93 ± 0,1893 litros de agua ; y

   una solution acuosa del 15 al 40 por ciento de un fitato o acido fitico en 3,78 ± 0,0378 litros de agua.
2. 2. Composition segun la revindication 1, en la que la Trichoderma virens se selecciona del grupo que consiste en Trichoderma virens G1-3 y el aislado de Trichoderma virens G1-21.
3. 3. Composition segun la revindication 1-2, en la que el Bacillus amyloliquefaciens se selecciona del grupo que consiste en Bacillus amyloliquefaciens TJ-1000, Bacillus amyloliquefaciens 1BE y Bacillus amyloliquefaciens FZB24.
4. 4. Composition segun la revindication 1-3, en la que las micorrizas se seleccionan del grupo que consiste en Glomus aggregatum, Glomus etunicatum, Glomus intraradices y Glomus mossae.
5. 5. Metodo para aumentar el rendimiento de un cultivo, que comprende:

   aplicar una composition que comprende

   un Trichoderma virens aplicado a una tasa de 6,75E8 ± 6,75E6 a 4,20E9 ± 4,20E7 unidades formadoras de colonias,

   un Bacillus amyloliquefaciens aplicado a una tasa de 1,35E10 ± 1,35E8 a 8,40E10 ± 8,40E8 unidades formadoras de colonias,

   una micorriza aplicada a una tasa de 30 000 propagulos en 18,93 ± 0,1893 litros de agua; y

   una solution acuosa del 15 al 40 por ciento de un fitato o acido fitico aplicado a una tasa de 3,78 ± 0,0378

   litros de agua.

   por 4046,856 metros cuadrados de tierras de cultivo.
6. 6. Metodo segun la revindication 5, en el que la composition se coloca en la proximidad de una raiz de planta mediante la aplicacion a una semilla preplantada, mediante aplicacion en el surco a medida que se siembra una semilla o a voleo sobre una fila de semillas.
7. 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en el que la colocation de la composition permite que los hongos y la bacteria colonicen la raiz de la planta.
8. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que el Trichoderma virens se selecciona del grupo que consiste en Trichoderma virens G1-3 y el aislado de Trichoderma virens G1-21.
9. 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el Bacillus amyloliquefaciens se selecciona del grupo que consiste en Bacillus amyloliquefaciens TJ-1000, Bacillus amyloliquefaciens 1BE y Bacillus amyloliquefaciens FZB24.
10. 10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que las micorrizas se seleccionan del grupo que consiste en Glomus aggregatum, Glomus etunicatum, Glomus intraradices y Glomus mossae.
11. 11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5-10, que comprende ademas: mezclar la composition en un tanque aplicador de fertilizantes; y aplicarlo a la tierra de cultivo en un surco o una banda muy cerca de un surco de semillas o una raiz de planta.
12. 12. Composition segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5-11 que comprende ademas un fertilizante NPK.