ES2645775T3 - Sistemas de suministro de fármacos - Google Patents

Abstract

Un glóbulo rojo modificado, en el que la modificación comprende un complejo de asociación que comprende un fármaco y una proteína transportadora recombinante para el fármaco, en el que la forma no complejada del fármaco es capaz de atravesar la membrana del glóbulo rojo y en el que la proteína transportadora recombinante no complejada es una inmunofilina.

Description

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DESCRIPCION

Sistemas de suministro de farmacos

La presente invencion se refiere al uso de globulos rojos como vehlcuios de suministro de farmacos y a metodos para producir los mismos.

Introduccion

Los eritrocitos, tambien conocidos como globulos rojos (GR), se usan normalmente para transfusiones para reemplazar sangre perdida. Ademas de este uso bien conocido, los GR ahora se estan usando en numerosas nuevas aplicaciones, lo mismo como terapeuticas que como agentes de diagnostico. La mayorla de estas aplicaciones son posibles debido a la peculiar propiedad de estas celulas que les permite abrirse y liberarse sin afectar sus propiedades principales o en circulacion in vivo. La tecnologla para lograr esto se describe en los documentos US-A-6,139,836 y EP-A-882448 y permite que el procedimiento se realice en la cllnica, con cantidades mlnimas de sangre del paciente, para producir Gr procesados.

El uso biomedico de estos GR procesados son numerosos e incluyen la posibilidad de obtenerse por ingenierla los mismos mediante la adicion de farmacos, biologlas y/o nanomateriales. Estas construcciones proporcionan una adicion significante al arsenal disponible para los medicos para la liberacion de farmacos en circulacion, para el direccionamiento de farmacos a sitios seleccionados en el organismo, o para procedimientos diagnosticos in vivo basados en metodos magneticos y/u opticos.

Se han usado GR humanos autologos con analogos de corticoesteroides en el tratamiento de fibrosis qulstica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y pacientes de EPOC. Basandose en estos hallazgos, la E.M.E.A ha concedido la denominacion de "farmaco huerfano" al "fosfato sodico de dexametasona para la encapsulacion en eritrocitos humanos para el tratamiento de la fibrosis qulstica" (denominacion de farmaco huerfano EMEA/OD/039/04-EU/3/04/230).

La encapsulacion de nanopartlculas superparamagneticas dentro de GR ha llevado a la generation de nuevas construcciones biomimeticas que ahora permiten el uso de estos nanomateriales in vivo, evitando su rapido secuestro y su acumulacion en areas no deseadas (documento WO 2008/003524).

De manera similar, la encapsulacion de agentes fluorescentes infrarrojos en GR ha abierto el camino a la medicion de la vasomocion en la vasculatura retinal humana, lo que sugiere una posible correlation con el odema retinal [Reunion Macula 2009 en Nueva York].

Mutz y col. (documento US2009/053245) desvela un metodo para modular al menos una propiedad farmacocinetica de una enfermedad antiangiogenica o sangulnea o terapeutico de esteroides y efizacia cuando se administra a un huesped.

Liu y col. (1991, Cell, Vol.66, 807-815) desvela que los complejos ciclofilina-CsA y FKBP-FK506 (pero no ciclofilina, FKBP, rapamicina-FKBP o FKBP-506BD) se unen de manera competitiva a e inhiben el Ca2+- y la calcineurina fosfatasa dependiente de calmodulina.

Una limitacion en el uso de GR como partadores para farmacos es la permeabilidad de la membrana de los GR. Una vez el farmaco seleccionado se ha encapsulado usando el procedimiento tal como se describe anteriormente, existen tres posibilidades:

• El farmaco se retiene indefinidamente del GR ya que no esta siendo transportado por, o no se difunde fuera de, la membrana y permanece en circulacion siempre y cuando el GR cargado permanezca intacto;

• El farmaco se libera inmediatamente por el GR cargado porque puede difundirse facilmente a traves de la membrana del GR; o

• El farmaco no es difusible, permaneciendo dentro del GR hasta que se convierte a una forma difusible, tal como dexametasona-21-fosfato, que permanece hasta que el grupo fosfato se hidroliza para formar dexametasona.

Por tanto, el suministro de farmacos usando eritrocitos es una plataforma tecnologica que se presta a una amplia gama de aplicaciones, pero que esta sometida a una incapacidad inherente de controlar la liberacion de sustancias transportadas por los GR procesados.

Se ha encontrado ahora, sorprendentemente, que es posible usar GR como vehlculos de suministro de farmacos para farmacos difusibles, mediante la incorporation de protelnas dentro de los GR que tienen una afinidad por el farmaco y que no se difunden facilmente fuera del GR. En otras palabras, hemos encontrado que los Globulos Rojos pueden usarse como sistemas de suministro de farmacos cuando contienen protelnas que no se difunden facilmente fuere y que forman complejos de afinidad con el farmaco deseado. Tambien se preve que los Globulos Rojos cargados con protelnas capaces de formar complejos de afinidad con farmacos seleccionados tambien podrlan

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administrarse a un humano como antldoto en un caso de intoxicacion causado por el consumo accidental de una cantidad de farmaco superior del previsto.

Sumario de la invencion

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un globulo rojo modificado, en el que la modificacion comprende un complejo de asociacion que comprende un farmaco y una protelna transportadora recombinante para el farmaco, en el que la forma no complejada del farmaco es capaz de atravesar la membrana del globulo rojo y en el que la protelna transportadora recombinante no complejada en una inmunofilina.

Se desvela un globulo rojo que contiene una protelna que no pasa facilmente la membrana del globulo rojo y que puede formar un complejo de asociacion con un farmaco diana, siendo la forma no complejada del farmaco capaz de atravesar facilmente la membrana del globulo rojo.

Preferentemente, la protelna o un analogo de la misma, se produce en globulos rojos de tipo salvaje y se encuentra presente a niveles elevados. GR de tipo salvaje son los que se encuentran de modo natural en un paciente o una poblacion, antes de cualquier modificacion. Los GR adecuados pueden ser los propios del paciente, cuando se conoce el paciente o pueden ser de cualquier fuente adecuada. Una fuente preferida es un donante universal (grupo sangulneo O, Rhesus negativo).

Los GR son preferiblemente no modificados, distintos a los que introducen la protelna. Cuando son modificados, pueden modificarse de forma adecuada para evitar el escape de la protelna, por ejemplo, o para permitir el escape del farmaco. El primero puede ser mediante el bloqueo de las rutas de escape, tales como protelnas de transporte o mediante el bloqueo de enzimas capaces de catabolizar la protelna, mientras que el segundo puede ser mediante la permeabilizacion de la membrana o transformation de los GR para expresar o incorporar un transportador de membrana del farmaco.

El GR puede disenarse por ingenierla para expresar la protelna. En caso que la protelna ya esta expresada en el GR, tal diseno por ingenierla podrla ser mediante la amplification del numero de genes o mediante el aumento de las tasas de transcription de ARNm, tal como usando un promotor de numero de copia mayor.

Los GR maduros no continuan expresando protelnas y puede que no sea deseable expresar grandes cantidades de protelna transportadora antes del uso previsto. La transformacion tambien requiere un sistema reproductivo y generalmente un huesped, por lo que no sera normalmente adecuado para el tratamiento general. En consecuencia, se prefiere abrir el gR, tal como se describe en el documento US-A-6,139,836 por ejemplo, introducir la protelna transportadora y a continuation liberar el GR. El GR resultante y procesado puede exponerse a continuation al farmaco. Segun el farmaco puede atravesar la membrana del gR, puede, a continuacion, formar un complejo de asociacion con la protelna transportadora y los GR pueden a continuacion usarse para cualquier terapia prevista.

Se entendera que, en esta realization, el GR ya puede expresar la protelna transportadora, pero esa protelna transportadora adicional puede incorporarse, para aumentar la capacidad transportadora del GR para el farmaco. Se ha encontrado que tal aumento es generalmnte directamente proporcional a la cantidad de protelna extra anadida. A este sentido, los GR son sorprendentemente elasticos a los cambios en el contenido de la protelna, de modo que tales cantidades de protelna transportadora pueden elevarse hasta el 5 % p/p o hasta aproximadamente 10 veces los niveles que aparecen naturalmente si este no excede el 5 % p/p.

Preferentemente, el GR puede consistir unicamente de la protelna, es decir, con todas las protelnas de la membrana retiradas, aunque se prefiere la presencia de hemoglobina.

La protelna (es decir, inmunofilina) puede ser un analogo, un mutante o una vairante de una protelna que aparece naturalmente. Puede disenarse por ingenierla para la facilidad de expresion o recogida, para mejorar o reducir la afinidad de farmaco o para expresar solo aquellas unidades responsables de la union de farmaco o para expresar multiples unidades de union de farmaco como una protelna, por ejemplo. Tambien se prefieren las protelnas quimericas.

Por 'complejo de asociacion' quiere decirse que el farmaco y las protelnas se atraeran juntas in situ. Esta atraccion debe ser suficiente para permitir que los GR actuen como un deposito de farmaco, pero no tan fuerte que retire efectivamente el farmaco fuere de la solution por completo. El constante de disociacion debe ser tal que sea posible conseguir niveles terapeuticos de farmaco con transfusiones entre 50 ml y 500 ml de sangre procesada, preferiblemente dentro de 5 minutos y 2 horas de transfusion. Los valores Kd adecuados pueden encontrarse en el intervalo de 104 a 109 M-1.

La protelna no es capaz de atravesar facilmente la membrana del GR. A consecuencia del tamano, es posible generalmente evitar el pase de protelna a traves de la membrana practicamente de forma completa. Si no es posible, por lo tanto, no mas del 50 % de la protelna debe ser capaz de escapar dentro de las 24 horas, pero se prefiere reducir esto a no mas del 5 % y preferiblemente no mas del 1 %. La cantidad de protelna atrapada que se

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libera podrla medirse de distintas maneras conocidas en la tecnica, por ejemplo, mediante el uso de metodo inmunoquimico (es decir, ensayos ELISA), ensayos radioinmuniqulmicos o mediante la deteccion de protelna mediante la medicion de su actividad biologica (en caso de que la protelna atrapada sea una enzima, por ejemplo).

El farmaco debe ser capaz de atravesar la membrana y se prefiere que este pase libre, o facilitado, tal como mediante canales adecuados o transportadores, o mediante poracion del GR. No se prefiere el ultimo, ya que puede tener un efecto perjudicial sobre el GR.

No existe un llmite particular en la naturaleza del farmaco, siempre y cuando pueda atravesar la membrana del GR. Para facilitar la produccion, se prefiere que el farmaco sea capaz de atravesar la membrana de un GR no modificado. El farmaco puede ser un farmaco bien conocido o una forma modificada que sea capaz de atravesar una membrana de un GR. El ultimo se prefiere generalmente menos, ya que puede tener un efecto sobre la actividad del farmaco. Este concepto se ilustra en el presente documento mediante un numero de ejemplos no limitativos.

La protelna, una inmunofilina y el farmaco son capaces de asociarse. El farmaco asociado es un farmaco capaz de unir dicha protelna (una inmunofilina) hasta el punto que la encapsulation dentro de los GR es posible, como se describe en el presente documento. Ademas, muchos farmacos son conocidos por tener companeros de union que se asocian con ellos, tales como FKBP12 y FK506, o Ciclosporina y Ciclofilina. Se prefieren tales combinaciones. Sin embargo, tambien hemos mostrado que la rapamicina puede asociarse con FKBP12 y ser util en la presente invention. La presente invention, por lo tanto, abarca todos los farmacos y sus companeros de union de protelna asociados en los que la forma no complejada del farmaco es capaz de atravesar facilmente la membrana del globulo rolo y en el que la protelna no complejada no puede atravesar facilmente la membrana del globulo rojo, en el que el companero de union de la protelna es una inmunofilina.

Los farmacos tambien pueden ser agentes inmunosupresores y/o antivirales. Por ejemplo, la ciclosporina y sus derivados se usan para tratar el VHC. El farmaco tambien puede ser un agente anticancerlgeno. Por ejemplo, la rapamicina se usa para tratar celulas tumorales. El inmunosupresor es preferiblemente capaz de inhibir la activation de la calcineurina fosfatasa mediante la formation de un complejo con calcineurina y la inmunofilina. Por tanto, la inmunofilina se selecciona preferiblemente de FKBP12 (o sus analogos, o Ciclofilina (o sus analogos) o el inmunisupresor es un inhibidor de calcineurina. El inhibidor de calcineurina se selecciona preferiblemente de FK506 o Ciclosporina.

Por tanto, el farmaco es preferiblemente rapamicina o sus analogos y lo mas preferiblemente FK506 o sus analogos. En estos casos, se prefiere que la protelna asociada sea FKB12 o sus analogos. El farmaco tambien puede ser, preferentemente, Ciclosporina o sus analogos y en este caso se prefiere que la protelna asociada sea Ciclofilina o sus analogos.

Se desvela adicionalmente un GR tal como se ha descrito anteriormente, pero que contiene poco o nada de farmaco. El farmaco pude anadirse en, o cerca del, tiempo de administration. Esto puede ser de ayuda si una exposition prolongada al farmaco es perjudicial en cualquier modo para el GR, o cuando el farmaco tiene un perlodo de vida limitado una vez se ha expuesto a los GR, por ejemplo.

Tambien se desvelan metodos para el tratamiento o profilaxis de cancer o virus o metodos de inmunosupresion que comprende la administracion de los presente GR a pacientes que lo necesitan.

Tambien se desvelan un metodo de reduction de la concentration de un farmaco seleccionado en el fluido corporal de un paciente, preferiblemente el plasma, que comprende la administracion de Globulos Rojos cargados con protelnas asociadas capaces de formar complejos de afinidad con el farmaco seleccionado. El farmaco seleccionado puede absorberse formando un complejo con el farmaco, reduciendo, de este modo, la actividad del farmaco o biodisponibilidad y, por lo tanto, su toxicidad. La toxicidad puede estar causada por el consumo accidental de una cantidad de farmaco superior a la esperada, por lo tanto, se prefiere un metodo de tratamiento de sobredosis. Preferentemente, se administran pequenas cantidades del GR cargado con protelna y la dosis se aumenta gradualmente mientras que se controlan los niveles del farmaco, por ejemplo, evaluando el fluido corporal regularmente.

La invencion se describira ahora en mas detalle con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1 - construccion pET-45b(+)-FKBP12. Se inserto la codification de ADNc para la longitud completa de FKBP12 en el vector pET-45b(+) aguas abajo de la secuencia de codificacion de marcador de poli(histidina). La transcription del inserto de ADN clonado con el promotor T7 originara una forma recombinante de FKBP12 humano con marcador de histidina en el dominio N-terminal.

Figura 2 - homogenatos de SDS-page de BL21(DE3). Carril 1: BL21(DE3) no incluido, Carril 2: BL21(DE3) inducido con IPTG. Los extractos totales de protelna (30 pig) obtenidos a partir de celulas de BL21(DE3)

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homogeneizado se separaron en un 15 % de gel SDS-poliacrilamida.

Figura 3 - Caracterizacion de FKBP12 purificada a) SDS-PAGE b) inmunotransferencia. Carril 1: Estandares de bajo peso molecular, carril 2: FKBP12. 1,0, 2,5 y 5.0 pg de FKBP12 purificado se sometieron a desarrollo por electroforesis en un 15 % de SDS-page seguido de tincion con azul Coomassie y prueba densiometrica para verificar el peso molecular y nivel de pureza de las protelnas.

Figura 4 - Analisis por transferencia puntual de union de rFKBP12-FK506. Desde la parte superior hasta la parte inferior: FKBP12 10, 5 e 2,5 pg/pocillo. Se cargaron distintas cantidades de FKBP12 sobre un 15 % de gel de poliacrilamida, transferido sobre una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pm de tamano de poro y sometido a analisis por transferencia puntual tal como se describe en la seccion de Materiales y metodos.

Figura 5 - Recuperacion celular. El porcentaje de recuperacion celular obtenido al final del procedimiento de carga se calculo para el GR cargado con FKBP12 (20, 40 y 80 pM) y el GR no cargado respectivamente para las celulas no tratadas anadidas al inicio del procedimiento.

Figura 6 - Estabilidad de las celulas cargadas. Las celulas sometidas al procedimiento de carga (GR cargado y no cargado) se incubaron hasta 6 dlas antes del tratamiento y se estimaron las curvas de supervivencia para cada muestra.

Figura 7 - Capacidad de union de GR cargado con FKBP12 para Tacrolimus. El grafico muestra la capacidad de union para el Tacrolimus calculado para el GR cargado con FKBP12 a una concentracion de 20, 40 y 80 pM en comparacion con la calculada para eritrocitos nativos.

Figura 8 - Concentracion de FKBP12 recombinante en GR disenado por ingenierfa. Se evaluacion concentraciones de rFKBP12 que lograron en los eritrocitos humanos llevando a cabo procedimientos de carga con una especie de FKBP12 radiomarcada realizada en las mismas condiciones de cargas anteriormente informadas (20, 40 y 80 pM de protelna frente a ml de GR).

Figura 9 - Cromatograma CsA y CsD de UPLC. Desarrollo cromatografico de muestra estandar compuesta de CsA (10 pg/ml) y CsD (10 pg/ml).

Figura 10 - homogenatos de SDS-PAGE de BL21(DE3) y SDS-PAGE (a) e inmunotransferencia (b) de CypA purificada. Carriles de 1 a 6: Estandares de bajo peso molecular (BPM), BL21(DE3) no incluido, Bl21(dE3) inducido con IPTG durante 1,2, 3 y 4 horas. Los extractos totales de protelna (30 pg) obtenidos a partir de celulas de BL21(DE3) homogeneizado se separaron en un 15 % de gel SDS-poliacrilamida.

a) Carril 1: estandar de BPM, carril 2-4: CypA. 1,0, 2,5 y 5,0 pg de CypA purificada se sometieron a desarrollo por electroforesis sobre un 15 % de gel de poliacrilamida seguido de tincion con azul Coomassie y prueba densiometrica para verificar el peso moleculas y nivel de pureza de las protelnas. b) Las bandas de protelna se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pm y se inmunotransfirieron para verificar la identidad de la protelna.

Figura 11 - concentracion intra-eritrocftica de 125I-CypA y capacidad de union de CsA del GR cargado con CypA. Panel superior: Se cargo 125I-CypA en GR humano y la radioactividad recuperada usada para estimar la cantidad de protelna atrapada en distintas condiciones de carga distintas. Panel inferior: En el histograma se representan las capacidades de union para la CsA observada para GR cargado a una concentracion de 20, 40 y 80 pM en comparacion con la encontrada para eritrocitos no cargados.

Descripcion detallada de la invencion

La evaluacion de la estabilidad in vitro de GR cargado con FKBP12 mostro que no existlan diferencias entre las curvas de supervivencia de eritrocitos cargados en comparacion con las celulas no cargadas, sugiriendo que el excedente de protelna no disminuye la vitalidad celular. Tambien hemos demostrado que los eritrocitos cargados tienen una capacidad de union notablemente superior para el farmaco en comparacion con el GR nativo.

Ademas, nuestros datos demuestran que la cantidad de farmaco asociado con los globulos rojos depende estrechamente de la concentracion de protelna anadida a las suspensiones de GR en la etapa de dialisis. Preferentemente, la union farmaco-protelna es estequiometrica en una proporcion de aproximadamente 1: 1, y que cree que se refleja dentro de los globulos rojos. Por tanto, se ha demostrado que:

1) es posible encapsular una protelna tal como FKBP12 dentro de eritrocitos humanos;

2) la encapsulacion es dependiente de dosis; y

3) un atrapamiento de protelna superior se corresponde con una concentracion de farmaco intraeritrocltico superior. De hecho, los globulos rojos cargados con cantidades de protelna en aumento (20, 40 y 80 pM) fueron capaces de unir una cantidad de farmaco 4, 6 y 11 veces superior que las celulas nativas.

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Una ventaja adicional es que los GR procesados de la presente invention evitan el metabolismo hepatico prematuro y, mediante el uso de eritrocitos autologos como vehlculo, se evitan reacciones anafilacticas.

Despues del procesado para incorporar la protelna transportadora y el farmaco, los GR pueden suspenderse en un vehlculo adecuado. Este puede ser salino, pero es preferiblemente plasma y, puede ser adecuadamente plasma de un paciente, y puede ser plasma colocado a un lado cuando se alslan los GR del paciente. Si es vehlculo no es plasma, se entendera, por lo tanto, que debe tenerse cuidado en evitar un choque osmotico mediante el uso de una solution salina fisiologica.

La preparation de GR puede contener opcionalmente otros ingredientes, tal como una fuente de energla, y conservantes, y puede almacenarse de cualquier modo adecuado para almacenar sangre.

La cantidad de preparacion usada puede ser normalmente entre 50 ml y 500 ml y puede administrarse tan a menudo como lo recomiendo un medico. Esto puede ser una vez al dla, una vez a la semana, una vez al mes o cualquier otro intervalo, segun sea apropiado.

Una realization particularmente preferida de la presente invencion proporciona un GR con niveles mejorados de FKBP12 (la protelna de union 12-kDa FK506 vease a continuation). Se proporciona adicionalmente tal un GR en el que todo, o una parte sustancial del FKBP12 se encuentra en la forma de un complejo de asociacion con FK506. Esta realizacion se describe adicionalmente a continuacion.

El Tacrolimus (tambien conocido como FK506, Prograf) es un antibiotico macrolido producido y aislado del actinomiceto Streptomyces Tsukubaensis, y tiene una actividad inmunosupresora muy alta. Se aprobo por primera vez en 1994 para la prevention de rechazos en trasplantes de hlgado, el FK506 ahora esta indicado en varios palses como una terapia inmunosupresora primaria en el trasplante de hlgado, rinon, pancreas, corazon y pulmon o como terapia de rescate en rechazos de aloinjerto que son resistentes a otros agentes inmunosupresores o all! donde tales agentes produces efectos secundarios intolerables [Tsunoda SM 2000, Ciancio G 1999, Plosker GL 2000].

Tacrolimus 3S-[3R*[E( 1S*,3S*,4S*)],4S*,5R*,8S*,9E, 12R*,14R*,15S*,-16R*,18S*, 19S*,26aR*]]-

5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-hexadecahidro-5,19-dihidroxi-3-[2-(4-hidroxi-3-metoxiciclohexilo)-1- metiletenilo]-14,16-dimetoxi-4,10,12,18-tetrametil-8-(2-propenil)-15,19-epoxi-3H-pirido[2,1-c] [1,4]

oxaazaciclotricosina-1,7,20,21(4H,23H)-tetrona de monohidrato, CAS numero 104987-11-3), como Ciclosporina, pertence a la clase de "inhibidores de calcineurina", puesto que su actividad inmunosupresora depende de su capacidad de unir e inhibir la enzima calcineurina, una fosfatasa serina/treonina dependiente de calcio. En el nivel molecular, la union del farmaco con la fosfatasa esta mediada por una protelna citosolica que pertenece a la familia de las inmunofilinas, la protelna de union 12-kDa FK506 (FKBP12). In situ, la FK506 une fKb12, y el duplex FK506- FKBP12 resultante forma un complejo ternario con calcineurina, inhibiendo de este modo su actividad. La inhibition de enzima resulta en el bloqueo de la defosforilacion de NF-AT (Factor nuclear de celulas T activadas), impidiendo de este modo su translocation dentro del nucleo y la transcription del gen IL-2 [Griffith JP 1995].

Macroscopicamente, el bloqueo de IL-2 y otras rutas, por el Tacrolimus resulta en una falta de activation y proliferacion de celulas T, y en la inhibicion de la respuesta inmune mediada por celulas.

A pesar de su eficacia terapeutica, demostrado por una potencia in vitro 100 veces superior que la Ciclosporina y una reduction in vivo de la incidencia de rechazo de tejido [Armenti VT 1998], la FK506 posee una ventana terapeutica muy estrecha (5-20 ng/ml sangre completa 10-12 horas post dosis) y exhibe frecuentemente episodios de toxicidad, que incluye nefrotoxicidad, neurotoxicidad, intolerancia a la glucosa, etc. [Tsunoda SM 2000; Kershner RP, 1996]. Ademas, la FK506 presenta una alta variabilidad en el perfil farmacocinetico entre paciente y un amplio metabolismo presistemico y sistemico que muestra una biodisponibilidad oral que varla del 4 al 93 % y una semivida en circulation entre 3,5 y 40 horas [Undre NA 2003, Iwasaki K 2007]. La pobre correlation de dosis con respecto a la concentration en sangre y el bajo Indice terapeutico, hace del control de las concentraciones de sangre completa de Tacrolimus algo necesario en pacientes sometidos al tratamiento con el farmaco (Control de farmaco terapeutico) [Shaw LM 1999]. Adicionalmente, aunque la inyeccion endovenosa evita la adsorcion y tejidos de biodisponibilidad, esta forma de administration parenteral esta a menudo comprometida por reacciona anafilacticas inducidas por el vehlculo (aceite de ricino hidrogenado con PEG-60) utilizado como emulsionante para estabilizar el Tacrolimus en soluciones acuosas.

La FK506 en sangre esta principalmente asociada con eritrocitos (aproximadamente 85 %) seguido por plasma (14 %) y linfocitos (0,46 %) [Chow FS 1997]. Esta alta fraction de GR se debe a la presencia en eritrocitos de al menos dos tipos de inmunofilinas que unen el farmaco con una muy alta afinidad: FKBP12 (citada anteriormente), una protelna citosolica 12-kDa con actividad de peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa, y FKBP-13, una membrana 13-kDa asociada con protelna con al menos un 43 % de identidad de aminoacido con FKBP12 [Walensky LD 1998]. La capacidad de union de GR se calcula aproximadamente 440 ng/ml de sangre [Chow FS 1997].

La FKBP12 y sus analogos son protelnas utiles para la formation de complejos de asociacion y tambien pueden

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usarse para formar complejos de otros farmacos inmunosupresores, tal como rapamicina, por ejemplo.

Las ciclofilinas y sus analogos son ejemplos adicionales de protelnas que tambien pueden usarse para formar complejos de inmunosupresores, especialmente ciclosporina. La Ciclosporina A (CsA) es un polipeptido clclico lipofilo, producido por el hongo Tolypocladium inflatum, que pertenece a la clase de inmunosupresores de "inhibidores de calcineurina". La CsA, como el Tacrolimus, inhibe la activacion de la calcineurina fosfatasa activada por calcio/calmodulina a traves de la formacion de complejo con ciclofilina y, por lo tanto, evita la translocacion del factor de transcripcion de "factor nuclear de celulas T activadas) (NF-AT) [Dunn CJ 2001]. Puesto que se introdujo por primera vez en los 80, la Ciclosporina A ha mejorado el resultado de trasplante de organos solidos. Desafortunadamente, la CsA se caracteriza por una variabilidad farmacocinetica intra e inter paciente y una pobre biodisponibilidad. La biodisponibilidad de la CsA puede verse afectada por varios factores entre los que se incluye el tiempo despues de la cirugla, terapia concomitante, cambio en la funcion gastrointestinal y preparacion farmaceutica [Faulds D 1993, Pollard S 2003] as! como por polimorfismos geneticos en el gen MDR1 o genes CYP3A4/CYP3A5 [Cattaneo D 2004]. Ademas, el perfil de tolerabilidad de la ciclosporina se caracteriza por una cantidad de efectos adversos potencialmente graves que estan relacionados con la exposicion, que incluye la nefrotoxicidad aguda o cronica, hipertension y neurotixicidad. El efecto adverso limitante de dosis de la ciclosposina es la nefrotoxicidad, que normalmente se presenta como una disminucion reversible en la tasa de filtracion glomerular [Naesens M 2009].

Una concentracion de sangre completa de 50-1000 ng/ml, mas del 70 % de CsA esta asociado a eritrocitos; la CsA citosolica esta unida a la Ciclofilina A de eritrocito de peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa [Foxwell BM 1988]. La capacidad de union de GR total para la CsA que asciende a 43x10-5 nmol por 106 de GR [Foxwell BM 1988, Reichel C 1994]. El siguiente ejemplo se refiere a la posibilidad de aumentar la cantidad de CsA asociada con el GR mediante el aumento de la concentracion citosolica de la Ciclofilina A (CypA) inmunofilina.

Se prefiere particularmente que la FKBP12 (o sus analogos) vaya acompanada de FK506, o la Ciclofillina vaya acompanada de la CsA. Sin embargo, la FKBP12 (o sus analogos) pueden tambien ir acompanados de rapamicina. Por lo tanto, la FKBP12 puede unir (y transportar una vez atrapada dentro de los globulos rojos) tanto tacrolimus (FK506) como rapamicina.

Por analogos se refiere a cualquier variante funcional que tenga las mismas propiedades o similares que la permitan funcional del mismo modo que la molecula nombrada (este presente en el farmaco o presente en la protelna) en la presente invencion. Los mismo se aplica a los derivados. Por ejemplo, los analogos de FKBP12 (tambien conocidos como FKBP1A) incluyen FKBP25, FKBP51 y FKBP52; y los analogos de la Ciclofilina incluyen Ciclofilina A. Los analogos de la rapamicina se conocen en la tecnica como "rapalogos" e incluyen analogos de rapamicina fluorada (Chembiochem. 22 Mar 2010; 11(5):698-702). Entre los analogos de Ciclosporina se incluye Ciclosporina A, auerobasidina A, PKF-211-811-NX5 (NIM811) y sangliferina A (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010 Mar;30(3):419- 25) y otros analogos desvelados en Biochemical and Biophysical Research Communications, Volumen 363, publicacion 4, 30 de noviembre de 2007, Paginas 1013-1019.

Por ejemplo, la rapamicina ha demostrado asociarse con la inmunofilina FKBP12 y FKBP 25, ambas uniendo rapamicina con alta afinidad (Biochemistry. 3 Mar 1992;31(8):2427-34. Una inmunofilina de 25-kDa selectiva de rapamicina. Galat A, Lane WS, Standaert RF, Schreiber SL.)

La protelna, por ejemplo FKBP12, puede encapsularse dentro de eritrocitos (preferiblemente humanos) por medio de un procedimiento de dialisis hipotonica, liberacion isotonica y "reatemperacion". Se prefiere particularmente que este metodo, tal y como se ha descrito anteriormente en el documento EP 0 882 448 A1 o tal como se describe en mayor detalle en los presentes ejemplos. En resumen, se prefiere que los globulos rojos humanos se obtuvieran a partir de sangre recien recogida y lavada para retirar leucocitos y plaquetas. A continuacion, los GR recuperados se volvieron a suspender, por ejemplo al 70 % de hematocritos, en solucion fisiologica. La suspension puede a continuacion alicuotarse y la protelna anadirse a concentraciones que aumentan. Cada suspension de eritrocito puede, a continuacion, someterse a dialisis en tubos de dialisis y suspensiones de GR recogidas y dejadas que se estabilicen. La liberacion de eritrocitos puede obtenerse mediante incubacion de celulas con volumenes relativamente pequenos (por ejemplo solo 0,1 de volumenes) de solucion hipertonica en condiciones de liberacion conocidas (por ejemplo a 3000 mOsm que contiene inosina 100 mM, ATP 20 mM, glucosa 10 mM, piruvato de sodio 100 mM, MgC12 4 mM, NaCl 190 mM, KCl 1666 mM y NaH2PO4 33 mM (pH 7,4)).

Los GR liberados pueden, a continuacion, incubarse a temperatura corporal en presencia de la solucion hipertonica para permitir la re-atemperacion de los segmentos de la membrana y aumentar la recuperacion celular final. Finalmente, los eritrocitos cargados se lavaron al menos una vez en tampon fisiologico para retirar la fraccion de FKBP12 no cargada del medio externo. El MCV de Indices corpusculares de GR, Volumen corpuscular medio, MCH, Hemoglobina corpuscular media y MCHC, Concentracion de hemoglobina corpuscular media) puede, a continuacion evaluarse para tanto las celulas cargadas como no cargadas al final del procedimiento. Se proporcionan detalles adicionales en los ejemplos.

La presente invencion aumenta la cantidad de farmaco transportado por eritrocitos para usarlos como sistema de suministro lento para farmacos, especialmente inmunosupresores, particularmente Tacrolimus, rapamicina y/o

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ciclosporina, y analogos o derivados, y distribuir bajas dosis de los mismos en circulacion. La administracion a traves de eritrocitos autologos segura un vehiculo seguro y no inmunogenico para el farmaco, lo protege de un metabolismo hepatico prematuro y reduce los efectos secundarios proporcionando dosis bajas y constantes de farmaco, sin producir picos en los niveles de plasma.

Las proteinas recombinantes se incluyen dentro del alcance del termino "proteina" en el presente documento. En particular, se prefiere FKBP12 (rFKBPl2) recombinante como la proteina.

La presente invention se ilustrara adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Materiales y metodos

Obtencion de una forma recombinante de FKBP12 humana: se extrajo el ARNm total de celulas U937 y se amplifico mediante reaction de cadena de la polimerasa (PCR) usando un oligo-dT como cebador no especifico, a continuation de obtuvo ADNc mediante retro-transcripcion. A continuation, el segmento de ADNc que codifica el gen FKBP12 (numero de referencia del banco de genes NM_000801) se amplifico mediante PCR con 5'- TCCGCCCACGT GAT GGGAGTGCAGGT GGAAAC-3' (SEQ ID NO: 1) como cebador directo y 5'- GAGGCCAGGATCCTCATTCCAGTTTTAGAAGC-3' (SEQ ID NO: 2) como cebador inverso. El producto de PCR resultante se verifico mediante secuenciacion en ambas direcciones con un secuenciador capilar (PE 310 Perkin Elmer). ADNc-FKBP12 se purifico finalmente a traves del kit de purification PCR MiniElute (Qiagen), digerido con BamHI y PmlI y ligado en un vestor pET-45b(+) (Novagen) digerido de forma similar. El gen de FKBP12 se inserto en el vector de expresion aguas abajo de la secuencia de codification del marcador de poli(histidina) (Figura 1) de modo que la transcription y traduction del plasmido producira una FKBP12 marcada con 6His N-terminal FKBP12, SEQ ID NO: 3):

ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGATGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGC

ACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAATTT

GATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGG

GAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTAT

GGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAA

CTGGAATGA

celulas competentes (Stratagene) de E. coli BL21(DE3) se transformaron mediante la contruccion obtenida de pET45b-FKBP12. Las celulas a continuacion se cultivaron en un medio Luria-Bertani (LB)(10 g(l de Bacto-Triptona, 5 g/l de extracto de bacto-levadura, 10 g/l de NaCl) a un pH de 7,0) que contenia ampicilina (50 pg/ml) a 37 °C con agitation hasta que la densidad optica de cultivo a 600 nm alcanzo 0,6-0,7. La sobreexpresion de la FKBP12 recombinante se indujo, a continuacion, mediante adicion al cultivo ambos 1 mM de isopropil-beta-D- tiogalactopiranosido (IPTg) y se dejo crecer durante otras 2 horas a 37 °C con agitacion. Los BL21(DE3) inducidos se granularon y lisaron mediante homogeneizacion realizado en tampon de lisis (tampon de fosfato 20 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM, p-mercaptoetanol 3 mM y PmSf (fenilmetanesulfonilfluorido) 0,1 mM) con Emulsificante-C5 (Avestin Inc., Ottawa, ON, Canada). Se purifico 6His-FKBP12 hasta la homogeneidad a traves de una cromatografia de afinidad a Ni de unica etapa realizada sobre un Purificador AKTA (Amersham Pharmacia Biotech). Despues de centrifugar a 15000 rpm durante 30 minutos, el homogenato se cargo sobre una columna empaquetada de alto rendimiento de Sefarosa Ni pre-equilibrada con tampon de fosfato 20 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, Imidazol 10 mM y MSH 3 mM. La columna se lavo exhaustivamente para retirar las proteinas no unidas y se llevo a cabo la elucion de proteinas unidas mediante un gradiente de imidazol de 10 a 250 mM en el mismo tampon. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-page y aquellas mas puras que contenian 6His-FKBP12 se re- unieron y dializaron frente a 2 litros de tampon de almacenamiento (Hepes 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, azida de socio 1 mM). Se verifico la pureza final de la FKBP12 recombinante mediante electroforesis sobre 15 % de gel de acrilamida y tincion con azul Coomassie y la identidad de la proteina purificada se certifico mediante inmunotransferencia usando un raton policlonal anti-FKBP12 (Abnova, Taipei city, Taiwan).

Estudios de union preliminares de rFKBP12-FK506: se evaluo la capacidad de 6His-FKBP12 en unir el ligando FK506 mediante un analisis de transferencia puntual ligeramente modificado. En resumen, el 6His-FKBP12 en condiciones nativas se transfirio puntualmente sobre una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pm en concentraciones en aumento (2,5, 5, 10 pg/pocillo). A continuacion, la membrana se sometio a una unica etapa de incubation con una solution de conjugado de peroxidasa de rabano picante de Tacrolimus (PRO-Trac™ II Tacrolimus 5x Conjugado, DiaSorin, Stillwater, MN, USA) para permitir la union de FKBP12-Tacrolimus. Despues de lavar con suero salino tamponado con tris (TBS) con un 0,05 % de Tween20, se revelo la senal por el sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

Carga de FKBP12 recombinante en eritrocitos humanos: se encapsulo FKBP12 recombinante en eritrocitos humanos por medio de un procedimiento de dialisis hipotonica, liberation isotonica y "reatemperacion" tal como se ha descrito previamente [Magnani M 1989]. En particular, se obtuvieron globulos rojos humanos a partir de sangre

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recien recogida en heparina a partir de donantes sanos y se lavo con solucion fisiologica que contenla Hepes 10 mM (pH 7,4), NaCl 154 mM y Glucosa 5 mM para retirar leucocitos y plaquetas. Los GR recuperados se suspendieron al 70 % de hematocritos en solucion fisiologica, la solucion se alicuoto en 3 tubos y se anadio rFKBP12 en concentraciones en aumento (20, 40, 80 pM/tubo). Cada suspension de eritrocitos se sometio a dialisis en un tubo de dialisis con un corte de 3,5 kDa durante 90 minutos a 4 °C frente a 50 volumenes de solucion hipotonica de 60 mOsm que contenla NaH2PO4 10 mM, NaHCO3 10 mM pH 7,4, glucosa 20 mM, GSH 3 mM y ATP 2 mM. Al final De la etapa de dialisis, las suspensiones de GR se recogieron y dejaron estabilizar a 37 °C durante 5 minutos con una suave agitacion. La liberacion de eritrocitos se obtuvo mediante incubacion de celulas con 0,1 volumenes de solucion hipertonica a 3000 mOsm que contenla inosina 100 mM, ATP 20 mM, glucosa 10 mM, piruvato de sodio 100 mM, MgCl2 4 mM, NaCl 190 mM, KCl 1666 mM y NaH2PO4 33 mM (pH 7,4). Los GR liberados se incubaron durante 25 minutos a 37 °C en presencia de la solucion hipertonica para permitir la re-atemperacion de los segmentos de la membrana y aumentar la recuperacion celular final. Finalmente, los eritrocitos cargados se lavaron 2 veces en tampon fisiologico para retirar la fraccion de FKBP12 no cargada del medio externo. El MCV de Indices corpusculares de GR, Volumen corpuscular medio, MCH, Hemoglobins corpuscular media y MCHC, Concentracion de hemoglobina corpuscular media) se evaluaron para tanto las celulas cargadas como no cargadas al final del procedimiento.

Estabilidad in vitro de eritrocitos cargados con FKBP12: se evaluo la estabilidad in vitro de eritrocitos cargados con FKBP12 hasta 6 dlas despues del procedimiento de carga. Los GR cargados se resuspendieron a 0,5 % de hematrocitos enRPMI-1640 suplementado con un 10 % de FBS, 50 pg/ml de estreptomicina y 50 unidades/ml y se incubaron en una atmosfera humificada a 37 °C con un 5 % de CO2. Se calculo en los tiempos 0, 1, 2, 3 y 6 dlas el porcentaje de celulas supervivientes. En detalle, se recogieron las suspensiones, se centrifugaron y las celulas del sedimento se re-suspendieron en una cantidad fijada de solucion Hepes. Se evaluaron el volumen y los hematocritos de suspensiones de GR y la supervivencia celular se calculo para todas las muestras. En paralelo, se evaluaron el MCV, MCH y MCHC. Los eritrocitos no cargados, sometidos al mismo proceso de carga pero sin la adicion de FKBP12 durante la etapa de dialisis, se usaron como control para la supervivencia celular y valoracion de los parametros de los globulos rojos.

Evaluacion de la capacidad de union de Tacrolimus adquirida por eritrocitos cargados con FKBP12: Los GR

cargados con FKBP12 obtenidos al final del procedimiento de carga se resuspendieron en solucion de Hepes en hematocrito fisiologico (40 %) y Prograf 5 mg/ml. Se anadio a continuation inyeccion concentrada a 20 pg/ml de suspension de GR para evaluar la nueva capacidad de union de GR para el farmaco (se calculo la capacidad de union de FK506 para GR nativos 0,4 pg/ml de GR 40 % Ht). Las celulas se dejaron incubar durante 1 hora a 37 °C para permitir el equilibrio del farmaco entre los compartimentos intracelulares y extracelulares. A continuacion se lavaron los eritrocitos con solucion salina (pH 7,4) para retirar el Tacrolimus no unido del medio externo. Los GR nativos obtenidos a partir de sangre recien recogida en heparina a partir de donantes sanos se usaron como control durante el experimento.

La cantidad de Tacrolimus asociada con eritrocitos cargados con FKBP12 y nativos se evaluo a traves de un analizador de dimension RXL (RXL Dimension, Siemens, ex-Dade Behring). El analizador de dimension mide los niveles de FK506 en muestras de sangre completa mediante un Ensayo inmunologico magnetico conjugado de anticuerpo (ACMIA). El ensayo se realiza usando un cartucho de reactivo Flex. El cartucho Flex TACR contiene un reactivo de tratamiento previo, conjugado de anticuerpo de p-galactosidasa-FK506, FK506 inmovilizado sobre partlculas de dioxido de cromo, sustrato clorofenol rojo p-d- galactopiranosido (CPRG) y diluyente para hidratar los comprimidos. Sangre completa (200 pl) de un tubo de recogida eDtA, mezclada sobre un inversor, se anade en primer lugar a un recipiente para muestras por el operario. La Dimension usa una sonda de ultrasonidos para mezclar la muestra, somete a lisis las celulas sangulneas usando un tampon a base de saponina y sonicacion y a continuacion anade un conjugado de anticuerpo/p-galactosidasa de FK506. La FK506 presente en la muestra se une mediante el reactivo conjugado con el anticuerpo de FK506. Se anaden las partlculas magneticas recubiertas con FK506 para unir el conjugado anticuerpo-enzima libre. La mezcla de reaction se separa a continuacion magneticamente. Despues de la separation, el sobrenadante que contiene el complejo FK506-anticuerpo-enzima se transfiere a otra cubeta y se mezcla con el sustrato. La p-Galactosidasa cataliza la hidrolisis de CPRG para producir clorofenol rojo (CPR) que absorbe luz al maximo a 577 nm.

Carga de I125-FKBP12 en GR humanos: para demostrar que la cantidad superior de FK506 unida al FKBP12-GR disenado por ingenierla se debe a la presencia de cantidades en aumento de protelna, se realizo un procedimiento de cara con FKBP12 radiomarcada. En resumen, se obtuvo 125I-FKBP12 a traves de la yodacion de residuo Tyr por medio de activation qulmica de yodo de sodio (Perkin Elmer, Waltham, EE.UU.) con cloramina T (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.). El I-FKBP12 obtenido (actividad especlfica de 3045 cpm/pg) se encapsulo dentro de eritrocitos humanos a traves de dialisis hipotonica y liberacion isotonica realizadas en las mismas condiciones que se han informado anteriormente (20, 40 y 80 pM protelna/ml de GR). Las celulas cargadas se sometieron a solubilization y oxidation de hemoglobina con, respectivamente, perioxido de hidrogeno y Soluble (Perkin Elmer, Waltham, EE.UU.) tal como se detalla en el Protocolo Perkin Elmer para la preparation de muestra y recuento de las muestras de sangre completas. Los lisatos de GR se anadieron a continuacion con Coctel Plus de Centellador Emulsionante (Packard) y medicion de radioactividad mediante Contador de Centelleo Llquido (Packart).

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Resultados

Fabrication de una forma recombinante de FKBP12 humana: La FKBP12 marcado con His recombinante se expreso eficazmente en la cepa BL21(DE3) de E. Coli tal como se demostro mediante el SDS-page de homogenato bacteriano (Figura 2). La figura representa el SDS-PAGE de homogenato BL21(DE3) no inducido (carril 1) usado como control y homogenato BL21(DE3) inducido (carril 2). Despues de la tincion con azul Coomassie, puede observarse claramente una banda de protelna en el carril 2, que esta ausente en el control. Ademas, gracias a la alta afinidad del marcador de histidina para iones de nlquel, se aislo 6His-FKBP12 mediante una unica etapa de cromatografla de afinidad a partir de la agrupacion de protelnas en el homogenato bacteriano. La FKBP12 purificada se analizo finalmente mediante electroforesis de gel de poliacrilamida y evaluacion densiometrica para verificar el peso molecular y grado de pureza de la protelna obtenida. Mediante inmunoelectrotransferencia, las bandas de protelna se revelaron a continuation con anticuerpo policlonal frente a la aclaracion de FKBP12 que la protelna purificada es efectivamente la Protelna de union 12-kDa FK506. En la figura 3 se informa sobre el desarrollo por electroforesis de la FKBP12 final y la inmunotransferencia; ambos indican la presente de una banda unica de 13-14 kDa y un nivel de pureza superior al 99 %.

Estudios de union preliminares de rFKBP12-FK506: se verifico la capacidad de 6His-FKBP12 en unir el ligando FK506. En la figura 4, la exposition sobre pellcula de rayos X de membrana de nitrocelulosa despues de la reaction ECL muestra que la intensidad de senal de transferencia resulta directamente proporcional a la cantidad de protelna detectada, demostrando, de este modo, que la FKBP12 recombinante es capaz de unir Tacrolimus de un modo especlfico y dependiente de dosis.

Carga de FKBP12 recombinante en eritrocitos humanos y estabilidad de GR cargado con FKBP12: al final del procedimiento de carga se obtuvo una recuperation celular optima para todas las condiciones de incubation con FKBP12. El porcentaje de celulas recuperadas resulto en 70, 67 y 67 % para GR dializado incubado con 20, 40 y 80 pM de concentration de FKBP12 respectivamente, completamente comparable con el calculado para eritrocitos no cargados (Figura 5). Ademas, se han investigado los Indices de eritrocitos para celulas cargadas y no cargadas, revelando que FKBP12-GR posee valores MCV, MCH y MCHC completamente comparables con eritrocitos no cargados (Tabla 1); mediante comparacion de GR tratados con celulas nativas, solo puede notarse una pequena disminucion en el volumen celular medio pero las concentraciones de hemoglobinas se encuentran en el intervalo de variabilidad. La supervivencia celular calculada para GR cargado con FKBP12 a 1,2, 3 y 6 dlas es igual o superior en todas las condiciones de carga en comparacion con los eritrocitos no cargados, como se muestra en la figura 6. Las diferencias observadas en el porcentaje de supervivencia no puede atribuirse a la cantidad de protelna anadida a las suspensiones celulares en el tubo de dialisis. En la Tabla 2, se resumen los valores MCV, mCh y MCHC. Una vez mas las diferencias no pueden atribuirse entre los eritrocitos cargados con FKBP12 y controles en los tiempos presentados. Ademas, los valores obtenidos entre los GR cargados no presentan variaciones significantes para concentraciones de FKBP12 en aumento. Finalmente, se observaron pequenas reducciones en el contenido de hemoglobina y concentracion de hemoglobina en todos los grupos el sexto dla, probablemente debido al inicio de la hemolisis consecuente al procedimiento experimental.

Evaluation de la capacidad de union de Tacrolimus adquirida por eritrocitos cargados con FKBP12: Se

cuantificaron los niveles de Tacrolimus por medio de ensayo inmunoenzimatico sobre granulos de GR nativo y cargado con FKBP12. Los resultados, presentados en la figura 7, demuestran que los eritrocitos cargados con FKBP12 eran capaces de unir cantidades superior de farmaco en comparacion con las celulas nativas. Ademas, el grafico subraya como la cantidad de FK506 asociada con los globulos rojos cargados aumenta proporcionalmente a la concentracion de FKBP12 anadida durante la etapa de dialisis. De hecho, los eritrocitos sometidos a dialisis con FKBP12 concentrada a 20, 40 y 80 pM eran capaces de unir una cantidad de farmaco equivalente a 3,5±2,0, 6,0±2,6 e 11,4±3,8pg/ ml de GR a 100 % de hematocritos respectivamente, exactamente 4, 6 y 11 veces mayor que el GR nativo (1,0±0,4pg/ ml de GR 100 % de Ht).

Carga de I125-FKBP12 en GR humanos: Se cargo 125I-FKBP12 en eritrocitos humanos para demostrar que la protelna recombinante puede atraparse eficazmente gracias al procedimiento de carga. Mediante la dialisis de GR humano con protelna radiomarcada en la concentracion de 20, 40 e 80 pM tal como se describe en la section de Metodos, podrla obtenerse una concentracion de FKBP12 intraeritrocltica en aumento. En particular, en GR cargado con FKBP12 se lograron 3,5±2,5, 7,4±5,4 y 15,4±0,6 nmoles por millmetro de GR empaquetado, respectivamente para celulas dializadas frente a 20, 40 e 80 pM de protelna (Figura 8).

Discusion

La transcription y traduction de la construction produce una protelna con la secuencia Met-Ala-6His-Val antes de los 108 aminoacidos que componen la protelna nativa. Los 9 aminoacidos adicionales proporcionan un aumento en el peso molecular de protelna final de al menos 1,3 kDa (de 12 kDa a 13-14 kDa) tal y como se ha demostrado por el analisis SDS-page realizado en la seccion experimental. Sin embargo, la presencia del marcador de histidina hace el proceso de purification realmente sencillo y rapido ya que solo requiere una etapa de cromatografla de afinidad. Ademas, el protocolo de purificacion de etapa unica proporciona un alto rendimiento y pureza, con aproximadamente 50 mg obtenidos a partir de 1L de cultivo de E. Coli mas del 99 % de pureza. Finalmente, la presencia del marcador

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de poli(histidina) no compromete el plegamiento y la funcionalidad de la protelna, tal como se ha demostrado en el ensayo de union por transferencia puntual. Esta prueba tambien se demuestra en bibliografla, aunque los autores produjeron un FKBP12 recombinante con marcadores N-terminales "a base de His". [Wear MA 2006].

Respecto a la carga de FKBP12 en eritrocitos humanos por medios del metodo de dialisis hipotonica, la protelna se anadio directamente en el tubo de dialisis puesto que la entrada de sustancias de alto peso molecular parece ser favorecido mientras que alcanza el equilibrio osmotico. En las tres concentraciones evaluadas (20, 40 y 80 pM), La FKBP12 no parece hemolltica y la recuperacion celular fue optica en todas las condiciones, revelando que era completamente independiente de la presencia y concentracion de FKBP12.

La evaluacion de la estabilidad in vitro de GR cargado con FKBP12 mostro que no existlan diferencias entre las curvas de supervivencia de eritrocitos cargados en comparacion con las celulas no cargadas, sugiriendo que el excedente de protelna no disminuye la vitalidad celular. Finalmente, se investigaron los eritrocitos cargados por su capacidad de unir Tacrolimus. Se demostro una capacidad sorprendentemente superior de FK506 para GR cargado con FKBP12 en comparacion con el GR nativo (utilizado como control durante los experimentos). Ademas, se demostro que la cantidad de farmaco asociado con los globulos rojos depende estrechamente de la concentracion de protelna anadida a las suspensiones de GR en la etapa de dialisis. Puesto que la union farmaco-protelna es estequiometrica en la proportion 1: 1, Parece probable que la concentracion de FK506 se encuentra en relation directa con la concentracion de FKBP12 dentro de los globulos rojos. Ademas, comparando las concentraciones de farmaco esperadas en eritrocitos derivados de los experimentos empleando FKBP12 radiomarcada (Tabla 3) con aquellas medidas en las pruebas de capacidad de union de FK506, se encontraron concentraciones de Tacrolimus intraeritrocltico muy similares.

Por tanto, se ha demostrado que:

1) es posible encapsular FKBP12 dentro de eritrocitos humanos;

2) la encapsulation es dependiente de dosis; y

3) un atrapamiento de FKBP12 superior se corresponde con una concentracion de FK506 intraeritrocltico superior; de hecho, los globulos rojos cargados con cantidades de FKBP12 en aumento (20, 40 y 80 pM) fueron capaces de unir una cantidad de farmaco 4, 6 y 11 veces superior que las celulas nativas.

Los GR procesados de la presente invention evitan el metabolismo hepatico prematuro y, mediante el uso de eritrocitos autologos como vehlculo, se evitan reacciones anafilacticas.

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Tabla 1 - Volumen corpuscular medio (MCV), Hemoglobina corpuscular media (MCH) y Concentracion de 5 hemoglobina corpuscular media (MCHC) de GR cargado con FKBP12 frente a GR no cargado y nativo.

MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl)

Valores de referencia

83-97 27-32 32-36

GR nativo

89 ± 1,6 29,6 ± 0,6 33,2 ± 0,4

GR no cargado

78 ± 2,2 24,9 ± 0,9 31,9 ± 0,9

FKBP12-GR 20 pM

78 ± 1,3 24,5 ± 0,6 31,3 ± 0,6

FKBP12-GR 40 pM

78 ± 2,9 24,6 ± 0,7 31,4 ± 1,0

FKBP12-GR 80 pM

79 ± 1,1 24,8 ± 0,3 31,3 ± 0,7

10

Los resultados que se muestran en la tabla superior son los promedios aritmeticos y las desviaciones estandar de cinco experimentos de carga.

Tabla 2 - Valores MCV, MCH y MCHC en 6 dfas para FKBP12-cargada dentro a GR NC

GR no cargado FKBP12-GR 20 pM

Tiempo (dfas)

MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl)

0

73 28,2 38,3 74 28,7 38,6

1

74 28,3 38,2 75 29,1 38,9

2

74 28,4 38,4 74 28,4 38,3

3

73 28,2 38,8 74 28,5. 38,5

6

72 23,8 33,2 73 26,3 35,8

73,2 27,4 37,4 74,0 28,2 38,0

Desv.Estandar

0,8 2,0 2,3 0,7 1,1 1,3

FKBP12-GR 40 pM FKBP12-GR 80 pM

Tiempo (dfas)

MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl)

0

74 28,8 38,9 73 28,3 38,4

1

75 29,6 39,7 74 28,6 38,4

2

74 28,4 38,4 73 29,3 39,9

3

73 27,9 38,1 74 28,3 38,5

6

74 27,3 36,9 74 27,3 36,9

Promedio

74,0 28,4 38,4 73,6 28,4 38,4

Desv.Estandar

0,7 0,9 1,0 0,5 0,7 1,1

En la tabla se resumen los valores de MCV, MCH y MCHC obtenidos para GR cargado con FKBP12 (20, 40 y 80 15 pM) en los tiempos 0, 1,2, 3 y 6 dlas despues del tratamiento en comparacion con aquellos encontrados para gR no cargado. En la parte inferior se informa de los valores promedio y las desviaciones estandar calculadas para cada muestra durante el tiempo de incubacion.

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Tabla 3: Encapsulation de rFKBP12 y la capacidad total de eritrocitos cargados para unir FK506 (ultima columna a la derecha) y la contrubicion absoluta debido a la presente de FKBP12 recombinante (penultima columna a la

derecha)

Concentration de rFKBP12 (nmol/ml de GR 100%Ht) Concentration de FK506 (pg/ml de GR 100%Ht) Concentration total de FK506 (pg/ml de GR 100%Ht)

GR nativo

0 0 1,1 ± 0,4

GR FKBP12 20pM

3,5 ± 2,5 2,8 ± 2,0 3,9 ± 2,4

GR FKBP12 40pM

7,4 ± 5,4 5,9 ± 4,3 7,0 ± 4,7

GR FKBP12 80pM

15,5 ± 0,6 12,5 ± 0,5 13,6 ± 0,9

Los resultados que se muestran en la tabla superior son los promedios aritmeticos y las desviaciones estandar de tres experimentos de carga.

Ejemplo 2

CICLOFILINA-CICLOSPORINA

Materiales y metodos

Fabricacion de una forma recombinante de CiclofUina A humana: Se ha fabricado una forma recombinante de Ciclofilina A humana (CypA) como sigue. Se extrajo el ARN total de celulas HeLa y a continuation se obtuvo ADNc mediante retro-transcripcion con cebador oligo-dT. La codification de ADNc para el gen de CypA (numero de referencia del banco de genes NM_021130.3) se amplifico mediante PCR con un par de cebadores degenerados (Directo 5'-TATTAGCCCACGTGAACCCCACCGTGTTCTTCG-3' (SEQ ID NO: 4) e Inverso 5'- AACACAAGGGATCCTTATTCGAGTTGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 5)) y el amplicon secuenciado en ambas direcciones con un secuenciador cepilar para confirmar la correcta identidad del producto PCR. El ADNc de CypA obtenido se digirio finalmente con BamHI y PmlI y se ligo en el vector pET-45b(+) aguas abajo de la secuencia de codification de marcador de poli(histidina) para producir una CypA marcada con His N-terminal, tal como se informa para la fabricacion de FKBP12 en el anterior ejemplo.

ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGAACCCCACCGTGTTCTTCGACATTGCCGTCGACGGCGAGCCC

TTGGGCCGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCAGAAAATTTTCGTGCTCTG

AGCACTGGAGAGAAAGGATTTGGTTATAAGGGTTCCTGCTTTCACAGAATTATTCCAGGGTTTATGTGT

CAGGGTGGTGACTTCACACGCCATAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATCTATGGGGAGAAATTTGAAGAT

GAGAACTTCATCCTAAAGCATACGGGTCCTGGCATCTTGTCCATGGCAAATGCTGGACCCAACACAAAT

GGTTCCCAGTTTTTCATCTGCACTGCCAAGACTGAGTGGTTGGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGGCAAA

GTGAAAGAAGGCATGAATATTGTGGAGGCCATGGAGCGCTTTGGGTCCAGGAATGGCAAGACCAGCAAG

AAGATCACCATTGCTGACTGTGGACAACTCGAATAA (SEQ ID NO: 6)

Las celulas competentes de E. Coli BL21(DE3) se transformaron con la construction de pET45b-CypA y se cultivaron en un medio LB que contenia ampicilina (50 pg/ml) a 37 °C; cuando el cultivo O.D alcanzo 0,6-0,7, se indujo la expresion de la CypA recombinante mediante procedimiento estandar y el cultivo se continuo durante 2 horas mas. Los BL21(DE3) inducidos se homogeneizaron posteriormente en tampon de lisis y la proteina recombinante se purifico hasta la homogeneidad a traves de cromatografia de afinidad de Ni tal como se ha descrito anteriormente. Las fracciones eluidas se re-unieron despues del analisis SDS-page y se dializaron contra 2 litros de tampon de almacenamiento (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 20 mM, DTT 0,5 mM, glicerol 10 %). La pureza final de la CypA recombinante se verifico mediante electroforesis sobre un 15 % de gel de acrilamida y tincion con azul Coomassie y mediante inmunotransferencia con anticuerpo monoclonar con marcador anti-histidina de raton (AbD Serotec, Oxford, Reino Unido).

Carga de I125-CypA en GR humanos: La CypA recombinante se radiomarco con yodo-125 de sodio a traves del metodo de cloramina-T para cuantificar la cantidad de proteina atrapada dentro de los eritrocitos. Se encapsulo I125- CypA (actividad espetifica 695 cpm/pg) dentro de eritrocitos humanos por medio del procedimiento de dialisis hipotonica, liberation isotonica y "reatemperacion" descritos en el ejemplo anterior. En particular, se procesaron GR

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humanos al 70 % de hematocritos en solucion fisiologica con 125I-CypA a concentraciones en aumento (20, 40, 80 pM). Cada suspension de eritrocito se dializo en un tubo de dialisis separado con un corte de 3,5 kDa, frente 50 volumenes de solucion hipotonica durante 90 minutos a 4 °C. Se obtuvo la liberacion de eritrocitos obtenidos mediante incubacion de las celulas procesadas con 0,1 volumenes de solucion hipertonica e incubacion durante 25 minutos a 37 °C. Las celulas cargadas se trataron con perioxido de hidrogeno y Soluble (Perkin Elmer, Waltham, EE.UU.) y se sometieron a recuento de emision-p con Recuento de Centello Llquido (Packard) para cuantificar la cantidad de radioactividad atrapada.

Estudios de union de rCypA-CsA: La CypA marcada con His (18 kDa) se investigo a continuacion por su capacidad de unir Ciclosporina A (1202.6 amu) mediante fraccionamiento centrlfugo del complejo protelna-farmaco (que permanece en las unidades de filtro centrlfugo, corte 10 kDa) a partir del farmaco libre que se recupera en el ultrafiltrado. En resumen, se dejo producir la union CypA-CsA mediante la incubacion de la protelna y farmaco a una relacion molar de 1:1 durante 1h a 37 °C; a continuacion, la mezcla se centrifugo en unidades de filtro Amicon Ultra (10 kDa) (Millipore, Irlanda) de acuerdo con las instrucciones de producto. La concentracion de farmaco se detecto a continuacion mediante HPLC tanto sobre el ultrafiltrado como en el rCypA que contenla la solucion. Una muestra que contenla la molecula de CsA sola se filtro del mismo modo y se uso como control.

Carga de CypA recombinante dentro de eritrocitos humanos y evaluacion de la capacidad de union de CsA adquirida mediante eritrocitos cargados con CypA: se ha cargado CypA dentro de gR humanos por medio de la dialisis hipotonica y metodo de liberacion isotonica tal como se ha informado en la seccion "Carga de I125-CypA dentro de GR humanos". Se usaron GR no cargados, (es decir, sometidos al mismo proceso sin la adicion de protelna) como control para la estimacion de recuperacion celular y evaluacion de Indices corpusculares de GR. Los GR cargados con CypA obtenidos a partir del procedimiento de carga se re-suspendieron a continuacion en una solucion salina tamponada con Hepes al 40 % de hematrocitos y se anadio con CsA para probar la capacidad de union de los GR. Se disolvio CsA (Lc Laboratories, Woburn, EE.Uu.) en etanol (10 mg/ml) y se anadio a las celulas en la concentracion de 20 pg/ml de suspension de GR. Las celulas se incubaron durante 1 hora a 37 °C para permitir el equilibrio del farmaco y a continuacion se lavo con tampon salino para retirar la CsA no unida. Los GR no cargados se usaron como control durante el experimento de union de CsA.

Analisis HPLC: se ha evaluado la cantidad de CsA asociada con eritrocitos cargados con CypA y nativos a traves del metodo HPLC precedido por un procedimiento de extraccion de fase solida (SPE). En resumen, Las muestras de GR obtenidas al final de los estudios de capacidad de union se sometieron a lisis y desproteinizacion con una solucion de ZnSO4 acuosa y acetona tal como se informa en [Baldelli S 2005]. Las sobrenadantes aclarados se cargaron a continuacion sobre cartuchos C 18 de Isoluto (International Sorbent Technology, Tucson, EE.UU.) para aclarar adicionalmente los extractos. Se uso Ciclosporina D (CsD) como estandar interno durante el procedimiento de extraccion para evaluar el porcentaje de recuperacion de cada muestra (Figura 9). Los desarrollos cromatograficos se realizaron sobre columnas C8 en condiciones isocraticas tal como se describe en [Baldelli S 2006] con algunas modificaciones. La columna analltica, C8 150x4,6 mm empaquetada con perlas de Extrasil de 3 pm (Teknokroma, Barcelona, Espana), se calento a 75 °C, la fase movil consistla en un 70 % de CH3CN en agua de grado HPLC y se bombeo a un caudal de 0,7 ml/min durante la duracion de desarrollo total (10 minutos) y el detector UV (Varian 9050, Varian Inc., Palo Alto, EE.UU.) se establecio a 210 nm. Los datos se procesaron usando un software Jasco-Borwin (Jasco Inc., Easton, EE.UU.).

Resultados y discusion

Fabricacion de una forma recombinante de Ciclofilina A humana: La CypA marcada con His recombinante se expreso muy eficazmente en la cepa BL21(DE3) de E. Coli tal como se demostro por la figura 10 que representa los homogenatos bacterianos SDS-PAGE de BL21(DE3). La tincion con azul Coomassie revelo una banda de protelna de aproximadamente 18-19 kDa que parece aumentar despues de la induccion IPTG. De hecho, la CypA recombinante producida contiene los 8 aminoacidos adicionales Met- Ala-(His)6, aguas arriba a la secuencia de protelna de Ciclofina A nativa, en la que el iniciador Met se elimino [Gevaert K 2003,

http://www.uniprot.org/blast/?about=P62937[2-28]], y esto resulta en un aumento de peso molecular de aproximadamente 1kDa (de 18 a 19 kDa).

La CypA marcada con His inducida se ha aislado facilmente del homogenato bacteriano mediante cromatografla de afinidad Nichel resultando en un muy alto rendimiento (aproximadamente 79 mg por litro de cultivo de E. Coli). Ademas, la caracterizacion de la protelna purificada a traves de electroforesis de gel de poliacrilamida e inmunotransferencia, que se muestra en la figura 10, demuestra un nivel de pureza optimo. De hecho, el desarrollo electroforetico de la CypA final muestra la presencia de una unica banda con una movilidad electroforetica de aproximadamente 18-19 kDa y un nivel de pureza superior al 99 %, mientras que la inmunotransferencia certifica la identidad de la protelna purificada.

Carga de I125-CypA en GR humanos: al final del procedimiento se ha recuperado una radioactividad creciente en las muestras de GR cargados con concentraciones de 125I-CypA en aumento demostrando que la CypA recombinante puede cargarse en GR humanos de un modo dependiente de dosis. La figura 11 muestra las concentraciones intraeritroclticas en aumento de CypA alcanzados en las tres condiciones de carga (3,97, 5,00 y

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15,85 nmol/ml de GR 100 % de hematocritos, respectivamente, para GR sometidos a dialisis con 20, 40 y 80 pM de CypA).

Estudios de union de rCypA-CsA: los experimentos descritos en la seccion de metodos nos llevan a la conclusion que la CypA recombinante es capaz de unir ligando de CsA. De hecho, cuando la CsA se ha centrifugado en la presencia de CypA mas del 70 % del farmaco completo se ha recuperado en la fraccion no filtrada, mientras que cuando la CsA se ha centrifugado sola, se encontro solo el 15 % de ciclosporina en la parte superior, sugiriendo que el farmaco se retiene a consecuencia de la union con la protelna. De modo que la presencia del marcador de poli(histidina) para no comprometer la funcionalidad de la protelna.

Caracterizacion de GR cargado con rCypA: respecto a la produccion de GR disenado por ingenierla con cantidades superior de ciclofilina intracelular, se obtuvo una recuperacion celular optima para el GR cargado con CypA resultando respectivamente en el 67, 69 e 67 por ciento de GR sometido a dialisis incubado con 20, 40 e 80 pM de CypA, claramente similar al obtenido para eritrocitos sometidos a dialisis en ausencia de la protelna (68 %). Estos datos demuestran que la recuperacion celular no se ve afectada por la presencia y concentracion de CypA. Tambien la evaluation de los Indices corpusculares de GR (MCV, MCH, MCHC) revelaron valores para eritrocitos cargados con CypA de acuerdo con aquellos de las celulas no cargadas (NC) (Tabla 2).

Evaluacion de la capacidad de union de Ciclosporina A adquirida por eritrocitos cargados con CypA: Los GR

cargados con CypA y no cargados se investigaron finalmente por su capacidad de union frente a la Ciclosporina. Las celulas se han incubado con el farmaco y a continuation procesado para la cuantificacion de los niveles de CsA a traves de analisis HPLC. Los resultados ilustrados mediante el histograma en la figura 11 demuestra que los eritrocitos cargados con Cypa fueron capaces de unir cantidades superior de CsA en comparacion con las celulas no cargadas y que la cantidad de farmaco asociado con los GR cargados depende de la concentracion de protelna anadida durante la etapa de dialisis. Actualmente, Los GR sometidos a dialisis con 20, 40 y 80 pM de Cypa demostraron ser capaces de unir una cantidad de farmaco equivalente a 8,9, 12,2 y 17,0 pg/ ml de GR al 100 % de hematocritos, respectivamente, mientras que los GR no cargados fueron capaces de transportar unicamente 3,3 pg de CsA por mililitro de GR empaquetado. Mediante la comparacion de los resultados que se muestran anteriormente con aquellos presentados en la bibliografla sobre eritrocitos nativos (43x10-5 nmol de CsA por 106 de GR [Foxwell BM 1988, Reichel C 19941, que es equivalente a 5 pg de CsA por millmetro de GR empaquetado) es evidente que los GR cargados con CypA poseen una capacidad de union claramente superior para la CsA en todas las condiciones de carga.

En conclusion, los datos que ahora se exponen, demuestran que:

1) es posible encapsular CypA dentro de eritrocitos humanos;

2) la encapsulation es dependiente de dosis; y

3) un atrapamiento de CypA superior se corresponde con una concentracion de CsA intraeritrocltica superior; de hecho, los globulos rojos cargados con cantidades de CypA en aumento (20, 40 y 80 pM) fueron capaces de unir una cantidad de farmaco 3, 4 y 5 veces superior que las celulas no cargadas y 1,8, 2,4 y 3 veces mayor en comparacion con las celulas nativas.

Tabla 4 - Indices corpusculares de GR cargados con CypA frente a GR no cargados y GR nativo

MCV MCH MCHC

ND

90 ± 2,1 34,1 ± 1,0 38,1 ± 1,3

UL

80 ± 2,2 28,7 ± 0,9 36,0 ± 1,1

L1

78 ± 1,9 28,1 ± 0,8 36,1 ± 0,9

L2

79 ± 2,1 28,0 ± 1,1 35,7 ± 1,5

L3

77 ± 3,9 27,3 ± 1,6 35,6 ± 1,3

En la tabla se comparan los valores de MCV, MCH y MCHC mostrados por los GR cargados con CypA con aquellos de celulas no cargadas y nativas. Los valores presentados son desviaciones medias y estandar a partir de los cuatro experimentos de carga.

Referencias del Ejemplo 2:

1. Dunn CJ, Wagstaff AJ, Perry CM, Plosker GL, Goa KL. Cyclosporin: an updated review of the pharmacokinetic properties, clinical efficacy and tolerability of a microemulsion-based formulation (neoral)1 in organ transplantation. Drugs 2001; 61(13):1957-2016.

2. Faulds D, Goa KL, Benfield P. Cyclosporin. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in immunoregulatory disorders. Drugs 1993; 45(6):953-1040.

3. Pollard S, Nashan B, Johnston A, Hoyer P, Belitsky P, Keown P, Helderman H. A pharmacokinetic and clinical review of the potential clinical impact of using different formulations of cyclosporin A. Berlin, Alemania, 19 de

5 noviembre de 2001. Clin Ther. 2003; 25(6):1654-1669.

4. Cattaneo D, Perico N, Remuzzi G. From pharmacokinetics to pharmacogenomics: a new approach to tailor immunosuppressive therapy. Am.J Transplant. 2004; 4(3):299-310.

5. Naesens M, Kuypers DR, Sarwal M. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity. Clin J.Am.Soc.Nephrol. 2009; 4(2):481-508.

10 6. Foxwell BM, Frazer G, Winters M, Hiestand P, Wenger R, Ryffel B. Identification of cyclophilin as the

erythrocyte ciclosporin-binding protein. Biochim.Biophys.Acta 3-3-1988; 938(3):447-455.

7. Reichel C, von FM, Brockmeier D, Dengler HJ. Characterization of cyclosporine A uptake in human erythrocytes. Eur.J Clin Pharmacol. 1994; 46(5):417-419.

8. Baldelli S, Murgia S, Merlini S, Zenoni S, Perico N, Remuzzi G, Cattaneo D. High-performance liquid

15 chromatography with ultraviolet detection for therapeutic drug monitoring of everolimus. J Chromatogr.B

Analyt.Technol.Biomed.Life Sci. 25-2-2005; 816(1-2):99-105.

9. Baldelli S, Zenoni S, Merlini S, Perico N, Cattaneo D. Simultaneous determination of everolimus and cyclosporine concentrations by HPLC with ultraviolet detection. Clin Chim.Acta 2006; 364(1-2):354-358.

10. Gevaert K, Goethals M, Martens L, Van DJ, Staes A, Thomas GR, Vandekerckhove J. Exploring proteomes

20 and analyzing protein processing by mass spectrometric identification of sorted N-terminal peptides.

Nat.Biotechnol. 2003; 21(5):566-569.

Claims (12)

1. 5

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   35

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   REIVINDICACIONES

   1. Un globulo rojo modificado, en el que la modificacion comprende un complejo de asociacion que comprende un farmaco y una protelna transportadora recombinante para el farmaco, en el que la forma no complejada del farmaco es capaz de atravesar la membrana del globulo rojo y en el que la protelna transportadora recombinante no complejada es una inmunofilina.
2. 2. Un globulo rojo modificado segun la reivindicacion 1, en el que el farmaco es un agente inmunosupersor o antiviral asociado capaz de unir dicha inmunofilina.
3. 3. Un globulo rojo modificado segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que la protelna transportadora recombinante es FKBP12 y el farmaco es Tacrolimus (FK506) o Rapamicina, o en el que la protelna es Ciclofilina y el farmaco es Ciclosporina.
4. 4. Un globulo rojo modificado segun la reivindicacion 2, en el que el inmunosupresor es capaz de inhibir la activacion de la calcineurina fosfatasa mediante la formacion de un complejo con calcineurina y la inmunofilina.
5. 5. Un globulo rojo modificado segun las reivindicaciones 2 o 4, en el que la inmunofilina es FKBP12.
6. 6. Un globulo rojo modificado segun las reivindicacion 2 o 4, en el que la inmunofilina es ciclofilina.
7. 7. Un globulo rojo modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 o 5, en el que el inmunosupesor es un inhibidor de calcineurina.
8. 8. Un globulo rojo modificado segun la reivindicacion 7, en el que el inhibidor de FK506 (Tacrolimus) o Ciclosporina.
9. 9. Un globulo rojo modificado segun cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en donde el globulo rojo es del grupo sangulneo O y Rhesus negativo.
10. 10. Un globulo rojo modificado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento o la profilaxis de cancer o infecciones virales, comprendiendo dichos tratamiento o profilaxis la administration de los globulos rojos modificados a un paciente que lo necesita.
11. 11. Un globulo rojo modificado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en la inmunosupresion, comprendiendo dicha inmunosupresion la administracion de los globulos rojos modificados a un paciente que requiere inmunosupresion.
12. 12. Un globulo rojo modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un metodo de reduction de la concentration de un farmaco seleccionado en un fluido corporal del paciente, que comprende la administracion de los globulos rojos modificados cargados con las protelnas transportadoras asociadas capaces de formar complejos de afinidad con el farmaco seleccionado reduciendo de este modo la actividad o la biodisponibilidad del farmaco.