ES2645972T3 - Método de diagnóstico para predecir la respuesta a un inhibidor de TNF alfa - Google Patents

Método de diagnóstico para predecir la respuesta a un inhibidor de TNF alfa Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para predecir si un paciente que tiene artritis reumatoide respondería a un tratamiento con un inhibidor de TNFα, método que comprende determinar el nivel de expresión de genes CNTNAP3, CYP4F3, GZMB, MME, MX1, RAVER2, SERPINB10 y TNFAIP6, o el nivel de expresión de genes CNTNAP3, CYP4F3, EPSTI1, MME, RGS1, SERPINB10 y TNFAIP6, o el nivel de expresión de genes FCGR3A, GPAM, GZMB, IFI35, MME, PTGS2, RAVER2, RFC1 y RSAD2 en una muestra de sangre de dicho paciente.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de diagnostico para predecir la respuesta a un inhibidor de TNF alfa Campo de la invencion
La invencion se situa en el campo de metodos de diagnostico. Se desvelan nuevos metodos in vitro para predecir si un paciente respondena a un tratamiento con un inhibidor de TNFa.
Antecedentes de la invencion
El factor de necrosis tumoral (TNF) promueve la respuesta inflamatoria, lo que a su vez provoca muchos de los problemas clmicos asociados con trastornos autoinmunitarios, tales como artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, psoriasis, hidradenitis supurativa y asma refractaria. Estos trastornos se tratan algunas veces usando un inhibidor de TNF.
Se considera que la artritis reumatoide (AR) es un trastorno autoinmunitario inflamatorio sistemico cronico que puede afectar a muchos tejidos y organos, pero que ataca principalmente a las articulaciones flexibles. La AR es una afeccion dolorosa y habitualmente incapacitante que puede conducir a la perdida de movilidad. Mientras que la enfermedad de Crohn es un tipo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano, provocando una amplia diversidad de smtomas. Esa provoca principalmente dolor abdominal, diarrea, vomitos o perdida de peso, pero tambien puede provocar complicaciones fuera del tracto gastrointestinal.
Los tratamientos disponibles en la actualidad para las enfermedades anteriores se basan en poblaciones de pacientes en su conjunto. Como resultado, los tratamientos conocidos pueden hacer que algunos pacientes efectuen ciclos de tratamientos ineficaces antes de identificar una terapia eficaz. Por tanto, existe una necesidad de un medicamento personalizado para tratar mejor enfermedades relacionadas con TNF alfa (por ejemplo AR o EII) y identificar opciones de tratamiento eficaces para un paciente dado.
El documento EP 1857 559 desvela un metodo in vitro para predecir si un paciente respondena a un tratamiento con un agente de bloqueo de TNFa, metodo que comprende determinar el nivel de expresion de ocho genes en una muestra biologica del paciente, en el que dichos genes son EPS15, HLA-DPB1, AKAP9, RASGRP3. MTCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28.
El documento WO 2011/097301 desvela un metodo de prediccion de la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene artritis reumatoide (AR) al tratamiento con un inhibidor de TNFa, comprendiendo el metodo determinar la presencia de un alelo de epttopo compartido de HLA-DRB 1 (HLA-DRB 1 SE) en una muestra del sujeto, en el que la presencia de al menos una copia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto respondera al tratamiento con el inhibidor de TNFa.
A pesar del hecho de que los documentos WO 2011/097301 y EP 1857 559 desvelan metodos para predecir la capacidad de respuesta a tratamiento con un inhibidor de TNF-alfa, sigue existiendo la necesidad de metodos adicionales mas eficaces y precisos para determinar si un paciente que tiene una enfermedad relacionada con TNF alfa respondena a diversas opciones de tratamiento.
Breve descripcion de la invencion
Hasta el final de 2010, mas de 2.000.000 de pacientes en todo el mundo han recibido tratamiento con agentes biologicos anti TNF-a, tales como infliximab, adalimumab y etanercept, en afecciones tales como artritis reumatoide (AR) o enfermedad de Crohn (EC) entre otras, pero las eficacias de estos son diferentes (M.P. Karampetsou et al., QJM (2010) 103 (12): 917-928.).
El problema basico de la terapia con anticuerpo monoclonal (AMC) en enfermedades inflamatorias cronicas puede resumirse mediante las conclusiones de dos publicaciones recientes. 1) Un porcentaje significativo, aproximadamente un 30% de pacientes con AR no responden a la terapia biologica (Van Baarsen et al., Genes and Immunity 11,622-629). 2) Los resultados de diversos estudios a gran escala que se centran en el uso de terapias biologicas en enfermedades autoinmunes tambien indican que la eficacia puede disminuir tras un ciclo para un segundo inhibidor de TNF (Rubbert-Roth et al., Arthritis Research & Therapy 2009).
Por lo tanto, predecir si el paciente respondena a la terapia antes de la primera o segunda opcion terapeutica es una necesidad insatisfecha en el ambito clmico y tendna un gran efecto sobre el uso de estos medicamentos al hacer el tratamiento mas rentable y proporcionar a los pacientes la oportunidad de recibir una terapia personalizada.
El metodo de la invencion esta basado en el uso de un algoritmo basado en bioinformatica para identificar conjuntos de genes, los perfiles de expresion combinados de los cuales permiten distinguir entre pacientes que responden y pacientes que no responden a un tratamiento con un inhibidor de TNFa.
Mas espedficamente, para resolver el problema anterior, los presentes inventores han desarrollado un metodo in
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vitro para predecir si un paciente respondena a un tratamiento con un inhibidor de TNFa, como se define en las reivindicaciones 1 a 7 adjuntas. Adicionalmente, en el presente documento se desvela un metodo que comprende determinar el nivel de expresion de al menos 6 genes seleccionados entre los genes ABCC4, AIDA, ARHGEF12, BMP6, BTN3A2, CA2, CADM2, CD300E, CYP1B1, ENDOD1, FCGR1A, FMN1, GCLC, GPR34, HORMAD1, IGF2BP2, IL18R1, IL1RL1, KAT2B, MAP1LC3B, MMD, MS4A4A, MS4A7, ODC1, PBX1, PCYT1B, PIP4K2A, PIP5K1B, PRDM1, PSME4, RAD23A, RIOK3, RNASE2, RNF11, SLC7A5, THEM5, TMEM176A, TMEM176B, UBE2H, WARS o entre APOBEC3A, AQP9, CCL4, CNTNAP3, CYP4F3, DHRS9, EIF2AK2, ELOVL7, EPSTI1, FCGR3A, GPAM, GPR15, GZMB, IFI35, IFI44, IFI44L, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IFITM1, IL2RB, IRF2, IRF7, MGAM, MICA, MME, MX1, OR2A9P, PF4, PTGS2, RAVER2, RFC1, RGS1, RSAD2, S100P, SERPINB10, SERPING1, SIGLEC1, TNF, TNFAIP6 en una muestra biologica de dicho paciente. De acuerdo con una realizacion preferida, los niveles de expresion relativos de los genes seleccionados se determinan en comparacion a un gen constitutivo. Preferiblemente, dicho gen constitutivo es ciclofilina, mas preferiblemente Ciclofilina A (PPIA). En los metodos de la invencion, la muestra biologica es sangre periferica, mas preferiblemente el nivel de expresion se determina en celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP).
De acuerdo con un primer aspecto preferido de la divulgacion, se determinan en dicha muestra biologica el nivel de expresion de los genes ELOVL7, IFI44L, IFIT1, IFIT3, MICA, OR2A9P y RAVER2; o el nivel de expresion de los genes APOBEC3A, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFITM1, MICA y RGS1; o el nivel de expresion de los genes APOBEC3A, DHRS9, IFI35, IFI44, IFI44L, MICA y RFC1, preferiblemente en un paciente que padece de artritis reumatoide.
De acuerdo con un segundo aspecto preferido de la divulgacion, se determinan en dicha muestra biologica el nivel de expresion de los genes BMP6, CD300E, CYP1B1, ODC1, RNF11 y UBE2H; o el nivel de expresion de los genes ARHGEF12, CADM2, CD300E, GCLC, RIOK3 y UBE2H; o el nivel de expresion de los genes CADM2, CD300E, CYP1B1, MMD, ODC1, RNF11 y UBE2H, preferiblemente en un paciente que padece de una enfermedad inflamatoria intestinal p.ej. enfermedad de Crohn.
De acuerdo con un tercer aspecto preferido, el metodo se realiza para seguir la eficacia de dicho tratamiento con un inhibidor de TNFa.
De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, dicho inhibidor de TNFa es un anticuerpo anti-TNFa, una protema de fusion de TNF o una protema de union a TNF recombinante, mas preferiblemente dicho inhibidor de TNFa es Adalimumab, Certolizumab pegol, Etanercept, Golimumab, Infliximab, Pegsunercept o cualquier version biosimilar de los mismos, incluso mas preferiblemente, dicho inhibidor de TNFa es Infliximab o cualquier version biosimilar del mismo.
En otro aspecto, el metodo de la invencion comprende adicionalmente la etapa de comparar el nivel de expresion de los genes anteriores con valores de referencia obtenidos de grupos de pacientes que responden y que no responden.
Preferiblemente, en el metodo de la invencion, el nivel de expresion se determina cuantificando el nivel de ARNm de dichos genes en la muestra biologica. La tecnologfa del chip de ADN y la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-QPCR) son particularmente utiles para determinar el nivel de expresion de dichos genes.
De acuerdo con una realizacion preferida adicional de la invencion, el metodo comprende ademas la etapa de determinar el nivel de una protema biomarcadora. Preferiblemente, dicha protema biomarcadora es una citocina proinflamatoria, quimiocina o un anticuerpo antifarmaco.
Adicionalmente, la invencion se refiere a un inhibidor de TNFa para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa, en el que el paciente tratado se clasifica como respondedor a un tratamiento con un inhibidor de TNFa mediante el metodo de la invencion, preferiblemente dicho inhibidor de TNFa es Adalimumab, Certolizumab pegol, Etanercept, Golimumab, Infliximab o Pegsunercept.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Cronologfa y diseno del estudio de la invencion.
Figura 2: Ruta esquematica de la generacion automatica de paneles genicos.
Figura 3: Niveles normalizados de ARNm de genes significativamente cambiantes en grupos de pacientes con artritis reumatoide (AR) antes y despues de la terapia (valores p para AQP9: 0,02, TNFAIP6: 0,028, IGJ: 0,012). Los datos se calcularon basandose en mediciones de micromatrices.
Figura 4: Niveles de ARNm normalizados de los 4 genes que se encontro que cambiaban de una manera estadfsticamente significativa con respecto a NR (No respondedores) frente a R (Respondedores) en comparacion con la AR.
Figura 5: Niveles normalizados de ARNm de genes significativamente cambiantes en grupos de pacientes con
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enfermedad de Crohn (EC) antes y despues de la terapia (valores p para MMP8: 0,018, AQP9: 0,011, IGKC: 0,001, TNFAIP6: 0,005, MGAM: 0,011). Los datos se calcularon basandose en mediciones de micromatrices.
Figura 6: Niveles de ARNm normalizados de los 4 genes que se encontro que cambiaban de una manera estadfsticamente significativa con respecto a NR frente a R en comparacion con la EC.
Figura 7: Listas de tres genes puntuados mediante analisis discriminante lineal (ADL) en artritis reumatoide (AR). Las barras de la izquierda representan no respondedores, las barras de la derecha representan respondedores. Cuanto mas grande es la distancia entre los grupos y mas pequeno es el solapamiento entre las muestras, mayor es el poder de separacion de la lista genetica. El panel genico del experimento de micromatrices (cohorte de ensayo) esta a la izquierda, el panel genico de los experimentos de RT-QPCR (cohorte de validacion) esta a la derecha para cada panel genico, y una lista de genes con los valores p mas altos sirviendo como un control negativo basado en los datos de micromatrices esta a la derecha.
Figura 8: Listas de tres genes puntuados mediante analisis discriminante lineal (ADL) en enfermedad de Crohn (EC). Las barras de la izquierda representan no respondedores, las barras de la derecha representan respondedores. Cuanto mas grande es la distancia entre los grupos y mas pequeno es el solapamiento entre las muestras, mayor es el poder de separacion de la lista genetica. El panel genico del experimento de micromatrices (cohorte de ensayo) esta a la izquierda, el panel genico de los experimentos de RT-QPCR (cohorte de validacion) esta a la derecha para cada panel genico, y una lista de genes con los valores p mas altos sirviendo como un control negativo basado en los datos de micromatrices esta a la derecha.
Figura 9: Correlacion entre el numero de genes en cada panel genico y el valor de F mmimo calculado para dicho panel tanto en la cohorte de ensayo como en la de validacion en AR.
Figura 10: Correlacion entre el numero de genes en cada panel genico y el valor de F mmimo calculado para dicho panel tanto en la cohorte de ensayo como en la de validacion en EC.
Figura 11: Niveles de IFNy medidos mediante ELISA en EC (cohorte de ensayo)
Figura 12: Niveles de IL-6 medidos mediante ELISA en EC (cohorte de ensayo)
Figura 13: Diagramas de dispersion de citocinas sericas que muestran diferencias significativas en AR (cohorte de ensayo)
Figura 14: Niveles de TNFa medidos mediante ELISA en muestras de AR basales desde la cohorte de ensayo
Figura 15: Niveles de TNFa medidos mediante ELISA en muestras de AR a la semana 2 desde la cohorte de ensayo
Figura 16: Niveles de TNFa medidos mediante ELISA en muestras de AR basales y a la semana 2 desde la cohorte de ensayo
Figura 17: Niveles de Infliximab medidos mediante ELISA en pacientes con AR a la semana 2 y 14 (cohorte de ensayo).
Figura 18: Niveles de Infliximab a la semana 2 en pacientes con EC medidos mediante ELISA (cohorte de ensayo)
Figura 19: Niveles de Infliximab a la semana 2 en pacientes con AR medidos mediante ELISA (cohorte de ensayo).
Descripcion detallada de la invencion
El perfil de expresion genica global en sangre periferica es una tecnologfa probada en la descripcion del nivel de fondo patogenico de trastornos autoinmunitarios y la estratificacion de las enfermedades. La sangre periferica es una fuente accesible de material biologico, incluyendo celulas, y tiene ventajas evidentes para su uso en procesos di cribado. Adicionalmente, como las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) circulantes son celulas clave de la inflamacion; varios grupos de investigacion examinaron las CMSP en experimentos de micromatrices. Los patrones de expresion genica en monocitos circulantes, celulas T y celulas B, puede reflejar los mecanismos de la enfermedad, pero no necesariamente, lo que significa que es un reto extender los marcadores farmacogenomicos a ensayos de diagnostico multigenicos basados en paneles genicos que predicen la respuesta a terapias o la evolucion de la enfermedad. El perfil de expresion genica de CMSP proporciona una alternativa menos cara y menos invasiva a la biopsia u otros metodos invasivos. Sin embargo, aun no se ha realizado, hasta ahora, la comparacion de patrones de expresion genica de diferentes enfermedades autoinmunes centrandose en una terapia espedfica.
Los biomarcadores o conjuntos de biomarcadores combinados que predicen la respuesta a la terapia se usan ahora de una manera habitual para mejorar la especificidad del tratamiento. Utilizar el muestreo de sangre periferica menos invasivo tambien tiene ventajas evidentes. Aunque las limitaciones incluyen la dificultad del muestreo con respecto al
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procesamiento de las muestras en el laboratorio, y para minimizar la heterogeneidad de las muestras, deben seguirse directrices estrictas tanto por los facultativos que recolectan como para los investigadores que procesan las muestras.
Los presentes inventores determinaron paneles genicos con la mayor potencia discriminatoria a traves del perfil genico de sangre periferica global en una cohorte de pacientes de ensayo y validaron los resultados sobre una cohorte de pacientes independiente.
En resumen, el metodo de la invencion en un aspecto puede resumirse de la siguiente manera. Se recoge sangre periferica de pacientes con AR y opcionalmente se separan de las CMSP. Desde la sangre periferica o las CMSP aisladas el ARN se afsla y despues se transcribe inversamente a ADNc. Para la determinacion de niveles de expresion relativos de los genes seleccionados de acuerdo con la invencion se usa simultaneamente el metodo RT- QPCR.
El enfoque seguido por los presentes inventores fue realizar un analisis de expresion genica global en una cohorte de ensayo con tecnologfa de micromatrices Affymetrix para identificar una lista de genes que podnan validarse en una cohorte independiente con un metodo de qPCR mas sensible en tiempo real (RT). La tecnologfa RT-QPCR es la herramienta mas robusta para mediciones de expresion genica (en terminos de sensibilidad, intervalo dinamico, estandarizacion, rendimiento y precio) que tambien la hace ideal como herramienta de diagnostico.
Sin embargo, los inventores suponen que no solo datos basales, si no que los datos usados a la semana 2 podnan usarse para la validacion. Por tanto, los genes que determinan el estatus de respondedor de una manera estadfsticamente significativa a la semana 2 tambien se anadieron al conjunto genico de validacion; asf como unos pocos genes de la bibliograffa relevante.
Con respecto a las comparaciones de las muestras basales y a la semana 2 mediante micromatriz en ambas condiciones, los efectos de la terapia en sf misma se han representado mediante 5 genes en EC, fuera de los cuales se identificaron anteriormente AQP9 y TNFAIP6 como marcadores de EII en los niveles de expresion genetica; se encontro que MGAM es un factor predictivo de asociacion de genoma completo de respuesta a terapia de bloqueo de TNFa en EII pediatrica, mientras que se ha demostrado la expresion de MMP8 en el area activamente inflamada en la base ulcerosa de muestras colonicas en EII, y su presencia en el estroma sugiere una etiologfa de EII. En la AR, cada uno de los genes que se descubrieron que cambiaban significativamente en las primeras dos semanas de terapia es relevante para su patogenesis: AQP9 y TNFAIP6 discriminaban pacientes con AR de controles sanos a traves del perfil de expresion genica de CMSP; y la IGJ (inmunoglobulina J) mostraba una expresion de ARNm significativamente mayor en gemelos con AR comparados con sus co-gemelos sanos.
La validacion por RT-QPCR en una cohorte independiente tambien daba como resultado una lista de genes con diferencias significativas entre respondedores y no respondedores. En la EC, estos genes incluyen TMEM176B y TMEM176A que se consideran blancos de la funcion de las celulas dendnticas al formar multfmeros y restringir la maduracion de las celulas dendnticas; UBE2H con respecto al cual TNF-a es un regulador conocido de la actividad de conjugacion de ubiquitina dependiente de UBE2H; y WARS, una triptofanil-ARNt sintetasa. En la AR, se descubrio que eran significativos CYP4F3 que esta asociado con los patomecanismos de la osteoartritis; DHRS9, MGAM; y PF4 se detecto como un factor predictivo de no respuesta para infliximab en AR en un estudio proteomico.
Aunque genes individuales podnan mostrar diferencias significativas entre respondedores y no respondedores, las diferencias subyacentes que determinan una potencia de prediccion mayor pueden detectarse unicamente analizando los paneles genicos.
Para identificar paneles genicos con el mayor poder discriminatorio se uso el analisis de variables canonicas (AVC) o el analisis discriminante lineal (ADL), porque si se compara con el analisis univariable que puede ignorar las interacciones potenciales entre genes, puede revelar las diferencias subyacentes mediante el uso simultaneo de genes como un panel genico que proporciona una segregacion perfecta en el espacio multidimensional.
Se sabe que los conjuntos de paneles genicos relacionados con los resultados, identificados por estudios de expresion genica similares teman unicamente unos pocos genes en comun que podnan atribuirse a los diferentes metodos de preparacion de la muestra, extraccion de ARNm o analisis de los datos y, asf como las variaciones individuales y heterogenicidades asociadas con los marcadores, incluso en una cohorte clmicamente homogenea de pacientes. Que se incluyan en la lista de genes con diferencias estadfsticamente significativas entre respondedores y no respondedores no indica necesariamente la importancia del gen en la patogenetica de la enfermedad o terapia, por lo que debe analizarse la lista completa de genes relacionados con la respuesta para detectar los blancos potenciales para el tratamiento.
Cuando se automatiza la seleccion de los paneles genicos con un alto poder discriminatorio entre respondedores y no respondedores tanto en cohortes como en enfermedades mediante la construccion de un algoritmo basado en bioinformatica, se obtuvieron aproximadamente 4700 paneles genicos en cada afeccion con una segregacion del 100% con respecto al estatus de respondedor. Entre ellos, se identificaron 3-3 paneles genicos con el mas alto poder discriminatorio considerando los valores F de los paneles, los datos de validacion cruzada y los margenes entre los grupos segregados.
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Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que
1) en enfermedades inflamatorias cronicas, tales como en EC y AR, los perfiles de expresion genica de sangre periferica son adecuados para determinar paneles genicos predictivos, los niveles de expresion de los cuales, si se miden antes de la terapia con infliximab, identifican a los pacientes que son susceptibles a la terapia;
2) sorprendentemente, se necesitan paneles genicos totalmente diferentes para la prediccion del estatus respondedor en EC y AR, a pesar del hecho de que estas afecciones tienen antecedentes patogeneticos similares; y
3) se identificaron varios paneles genicos que muestran una segregacion perfecta en la cohorte de ensayo y validacion, asf como una fuerte segregacion en los analisis de validacion cruzada.
La toma de muestras es el punto crucial en el metodo de la invencion. Uno de los criterios principales del metodo aplicado es que debe estabilizar el ARN, haciendo de este modo posible el almacenamiento y la transferencia de muestras. Tales metodos estan disponibles en el mercado pero producen poblaciones celulares mas o menos diferentes que la que se uso en el estudio (CMSP/Trizol). La toma de muestras tambien tiene que ser capaz de proporcionar como mmimo 120-140 muestras, que es lo que se necesita para un analisis estadfstico adecuado. El procesado de muestras, QC y las mediciones de RT-qPCR son tecnologfas bien establecidas.
Ademas del metodo de toma de muestras CMSP/Trizol descrito, los inventores han probado otros metodos de toma de muestras. Entre estos, el metodo de muestreo PAXGene (Quiagen Corp., USA) y el LeukoLock (Life Technologies Corp., USA) mostraron una buena correlacion con el metodo CMSP/Trizol. Sin embargo, en la practica clmica, el metodo de muestreo preferido sena el metodo de muestreo PAXGene, puesto que este metodo requiere menos equipo de laboratorio y menos habilidades de la persona que realiza la toma de muestras.
El conjunto genico de acuerdo con la divulgacion que se identifico y valido por los presentes inventores satisface una necesidad insatisfecha de un metodo genomico que discrimine ineqmvocamente entre respondedores y no respondedores para una terapia con inhibidor de TNFa (por ejemplo infliximab) tanto en la enfermedad de Crohn (EC) como en artritis reumatoide (AR). El metodo de diagnostico de acuerdo con la invencion da una oportunidad para introducir por primera vez en este campo una atencion medica personalizada que beneficia a todos los pacientes. Adicionalmente, no solo es beneficioso para los pacientes que podnan verse privados de recibir una terapia ineficaz y despues pasar a un ciclo de la adecuada, sino tambien los medicos clmicos, las autoridades reguladoras y compensatorias y los proveedores tambien obtienen beneficio de la eficacia y seguridad aumentadas de la terapia.
Ejemplos
Diseno del estudio
Se incluyeron 20 pacientes con enfermedad de Crohn (EC) y 19 con artritis reumatoide (AR) en el estudio(muestreo antes y a las 2 semanas despues de la terapia) en la cohorte de ensayo para experimentos con micromatrices.
Para el proceso de validacion, se incluyeron en los experimentos de RT-QPCR muestras de 15 pacientes con AR a la semana 0 de la cohorte de validacion, 5 pacientes de la cohorte de ensayo (para validacion tecnica) y de 20 pacientes con EC a la semana 0 de la cohorte de validacion. El diagrama esquematico de la figura 1 muestra la cronologfa y el diseno del estudio.
Reclutamiento de pacientes
A) Artritis reumatoide
Criterios de inclusion:
• Artritis reumatoide diagnosticada clmicamente (criterios de la American Rheumatism Association de 1987)
• Edad entre 20 y 60
• Falta de respuesta a al menos dos farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad, incluyendo metotrexato
• Enfermedad activa (definida como tener una puntuacion de actividad de la enfermedad evaluada en 28 articulaciones (DAS28) >3,2).
• Pacientes no tratados previamente con terapia anti-TNF
• Se permitio el tratamiento con 10 mg por dfa de prednisona a condicion de que la dosis hubiera sido estable durante al menos 2 meses antes de la entrada.
• Se permitieron corticosteroides orales (dosis maxima de 10mg por dfa - prednisona) y farmacos antiinflamatorios no esteroideos si fueron estables durante al menos 1 mes antes del periodo basal.
• Los pacientes recibieron un tratamiento de metotrexato maximo tolerable (5-30 mg por semana), que tuvo que ser estable durante al menos 4 semanas antes del periodo basal.
• La proporcion mujeres:hombres es 3:1
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Criterios de exclusion:
fumador o ex fumador; embarazo o lactancia materna; malignidad actual o reciente; comorbilidades clmicamente significativas; enfermedad infecciosa activa; pacientes con antecedentes de una enfermedad articular inflamatoria aguda de diferente origen
Parametros recogidos:
Edad, Diagnostico de la AR (ano), DAS28, CRP, We, RF, Co-morbilidades, Farmacos(por ejemplo DMARDS). Despues de 14 semanas de tratamiento, la respuesta clmica al tratamiento se evalua utilizando tanto el criterio EULAR como la reduccion de la DAS28 de al menos 1,2.
B) Enfermedad de Crohn
Criterios de inclusion:
• Enfermedad de Crohn diagnosticada clmicamente
• Edad entre 20 y 60
• CDAI >250
• Nunca en terapia anti-TNF
• terapia de metotrexato (MTX), pero <20 mg/semana
• terapia de prednisolona, pero <10 mg/dfa
• La proporcion mujeres:hombres es 1:1
Criterios de exclusion:
fumador o ex fumador; embarazo o lactancia materna; malignidad actual o reciente; comorbilidades clmicamente significativas; enfermedad infecciosa activa; pacientes con antecedentes de una enfermedad intestinal inflamatoria aguda de diferente origen
Parametros recogidos:
Edad, Diagnostico de EC (ano), CDAI (si CDAI cayo por debajo de 150, los pacientes fueron considerados como respondedores, de lo contrario como no respondedores), CRP, We, comorbilidades, Farmacos, Sinopsis de biopsia de colon (si esta disponible), capacidad de respuesta a la semana 14
Toma de muestras del paciente, procesado y almacenaje (CMSP/Trizol)
La capacidad de respuesta a la terapia se determino 14 semanas despues de la terapia por los medicos clmicos basandose a los criterios descritos anteriormente. Se tomaron muestras de sangre periferica (10 ml) en tubos para extraccion de sangre venosa al vado que conteman EDTA (BD Vacutainer K2E) para separacion de CMSP y 10 ml de sangre periferica en tubos no tratados previamente para la extraccion de muestras de suero. Todas las muestras se procesaron una hora despues de la toma de muestras.
Las CMSP se separaron por centrifugacion en gradiente de Ficoll. Brevemente, la sangre periferica se diluyo con 10 ml de una solucion salina fisiologica y se estratifico en 10 ml de Ficoll. La centrifugacion se realizo a 2500 rpm durante 20 minutos, y despues se recogio la capa de las CMSP. Las celulas se lavaron dos veces con una solucion salina (1700 rpm, 7 minutos) y se sometieron a lisis en un reactivo de Trizol y se almacenaron a -70 °C hasta el aislamiento del ARN.
Estadisticas de parametros clmicos
Se compararon los parametros clmicos de las cohortes de pacientes usando GraphPad Prism, y se uso la prueba U de Mann-Whitney (un p<0,05 se considero estadfsticamente significativo).
Aislamiento de ARN
El ARN se aislo de las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) utilizando el reactivo de Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se comprobaron la cantidad y la calidad del ARN en un instrumento de fotometro UV NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y en un Agilent BioAnalyzer (Agilent Technologies).
Micromatriz
Se utilizo la matriz Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST para analizar el patron de expresion global de 28869 genes bien anotados. Se utilizaron el kit Ambion WT Expression (Applied Biosystems) y el kit GeneChip WT Terminal Labeling and Control (Affymetrix) para amplificar y marcar 250 ng de muestras de ARN. Las muestras se hibridaron a 45 grados Celsius durante 16 horas y despues se realizo un protocolo de lavado convencional usando GeneChip Fluidics Station 450 y las matrices se escanearon en un GeneChip Scanner 7G (Affymetrix).
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Analisis de datos de micromatrices
Los datos de las micromatrices se analizaron con un Genespring GX10 (Agilent Biotechnologies). Los archivos de datos de Affymetrix se importaron usando algoritmos de RMA y se realizo la normalizacion de mediana. Con respecto a la comparacion de las muestras del valor basal frente a la semana 2, el 20 % de los conjuntos de sondas con los niveles de expresion mas bajos se retiro por filtracion en la primera etapa, despues la lista de conjuntos de sondas restantes se filtro mediante relacion de cambio (corte de 1,2 veces) y se realizo un analisis estadfstico usando la prueba U de Mann-Whitney por pares con pruebas multiples de correccion de Benjamini-Hochberg.
Con respecto a la comparacion de respondedor frente a no respondedor, el 20 % de los conjuntos de sondas con los niveles de expresion mas bajos se retiro por filtracion en la primera etapa, despues la lista de conjuntos de sondas restantes se filtro mediante relacion de cambio (corte de 1,2 veces) y se realizo un analisis estadfstico usando una prueba T desapareada con correccion de Benjamini-Hochberg para ensayos multiples. La categorizacion funcional de genes se realizo con el sistema de clasificacion Panther (
http://www.pantherdb.org/).
RT-QPCR
Se obtuvieron datos de expresion genetica usando una matriz de baja densidad TaqMan (TLDA) (Applied Biosystems) que es una tarjeta microflmdica de 384 pocillos que permite realizar 384 ejecuciones simultaneas de PCR en tiempo real y que se ha usado para el perfil de expresion genica en varios estudios. Esta tarjeta microflmdica de rendimiento de bajo a medio permite que se hagan correr en paralelo 2 muestras frente a 96 blancos de ensayo de expresion genica TaqMan® que se precargan en cada uno de los pocillos en la tarjeta. Se genero ADNc con un kit de transcripcion inversa de ADNc de alta capacidad de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se uso 1 microgramo de ARN por muestra en las ejecuciones de RT-PCR. Se usaron 400 ng (4 pl) de ADNc en cada muestra. Se anadieron 196 pl de agua exenta de nucleasas y 200 pl 2* de mezcla TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) para las mediciones de la PCR cuantitativa en tiempo real. Despues, esta mezcla se dividio por igual sobre cuatro puertos de carga de muestras de la TLDA, cada uno conectado a un conjunto de 96 genes de interes. Las matrices se centrifugaron una vez (1', 1300 rpm a temperatura ambiente) para distribuir equitativamente la muestra sobre los pocillos. A continuacion, la tarjeta se cerro hermeticamente para prevenir un intercambio entre los pocillos. La amplificacion de la RT-QPCR se ha ejecutado usando un sistema de deteccion de secuencias Prism 7900HT de Applied Biosystems con las siguientes condiciones de termociclador: 2 min a 50 °C y 10 min a 94,5 °C, seguido de 40 ciclos de 30 s a 97 °C y 1 min a 59,7 °C. Se seleccionaron 91 genes basandose en nuestro experimento de micromatrices previo y los 5 genes restantes eran genes constitutivos para normalizacion.
Analisis de datos de RT-QPCR
Los archivos de datos de RT-QPCR se importaron con el software Data Assist (Applied BioSystems) y los datos en bruto se normalizaron mediante el metodo ACt. La ciclofilina A (PPIA) se selecciono como gen normalizador debido a que su expresion mostro la menor variacion entre las muestras. Para encontrar genes expresados diferencialmente entre los grupos respondedores y no respondedores se realizaron un ensayo estadfstico no parametrico (prueba U de Mann-Whitney) y una analisis de variables canonicas (AVC).
Analisis de variables canonicas (AVC) o analisis discriminate lineal (ADL)
La separacion entre grupos de objetos predefinidos se revela de la mejor manera mediante analisis de variables canonicas (AVC). El AVC es la generalizacion del analisis discriminante lineal (ADL), los dos terminos se usan equitativamente en el estudio. El AVC se uso para determinar si los grupos de respondedores y no respondedores son separables en el espacio multidimensional abarcado por las variables geneticas, y si asf fuera, que subconjuntos de genes tienen el mejor poder discriminatorio. Los resultados del AVC son las denominadas puntuaciones canonicas obtenidas a partir de las funciones canonicas derivadas a traves de un analisis propio, que sirven como coordenadas de observaciones en el espacio canonico.
Generacion automatica del panel genico
El analisis discriminante lineal (ADL) (Hamadeh HK et al. Prediction of compound signature using high density gene expression profiling. Toxicol Sci. 2002 Jun;67(2):232-40.) se uso para generar automaticamente paneles genicos que muestran una generacion del 100 % entre respondedores y no respondedores en ambas condiciones y en ambas cohortes (ensayo y validacion) de acuerdo con el siguiente algoritmo (se usaron 40 genes en EC y 41 genes en AR que se prefiltraron durante los experimentos con las cohortes de ensayo y se validaron en las cohortes de validacion.):
1) Se crea el conjunto de "genes en el modelo". Inicialmente, este conjunto contiene todos los genes. Tambien se crea un conjunto de genes con los denominados "genes protegidos". Inicialmente, este conjunto esta vacfo.
2) Se calcula para cada gen el valor F, que es la relacion de la variabilidad entre grupos y la variabilidad dentro de grupos.
3) El algoritmo clasificador (ADL) se ejecuta utilizando el conjunto de "genes en el modelo" tanto en cohortes de ensayo como de validacion. En ambos casos se registra un valor porcentual de precision como los "mejores
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valores de precision".
4) El conjunto de "genes seleccionables" se define como:
"genes seleccionables":= "genes en el modelo" menos "genes protegidos"
Si el grupo de "genes seleccionables" no esta vado, entonces el algoritmo se continua en la etapa 5, si no el algoritmo pasa a la etapa 7.
5) Se seleccionan genes desde el conjunto de "genes seleccionables" de acuerdo con los siguientes modelos:
a) aleatoriamente con probabilidades iguales (modelo uniform);
b) aleatoriamente con una probabilidad que es inversamente proporcional a sus valor F (modelo F_prop);
c) genes con los valores F mas bajos (modelo min F).
En cualquier caso, el gen seleccionado se retira temporalmente del conjunto de "genes en el modelo". La ventaja de usar modelos estocasticos en lugar del modelo min F es que estos pueden proporcionar una segregacion mejor de grupos de pacientes. Los modelos uniform y F_prop representan algoritmos estocasticos mientras que el modelo min F es determinista.
6) El clasificador se ejecuta usando el conjunto (reducido temporalmente) de "genes en el modelo".
a) Si cualquiera de los dos valores porcentuales de precision se hace inferior, el gen seleccionado se reinserta en el conjunto de "genes en el modelo" y se anade al conjunto de "genes protegidos".
b) Si ambos valores porcentuales de precision son al menos tan buenos como los "mejores valores de precision", el gen seleccionado se retira permanentemente de los "genes en el modelo" y el conjunto de "genes protegidos" se vada. Los "mejores valores de precision" se sobrescriben con los valores de precision calculados.
El algoritmo vuelve a la etapa 4.
7) El algoritmo finaliza. Los resultados son el conjunto de "genes en el modelo" y los "mejores valores de precision". El analisis discriminante lineal se realizo usando el software R (R Development Core Team (2008). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria. ISBN 3-900051-070, URL
http://www.R-project.org.) con el paquete MASS (Venables, W. N. & Ripley, B. D. (2002) Modem Applied Statistics with S. Cuarta edicion. Springer, New York) y el paquete wordcloud (Ian Fellows (2012). wordcloud: Word Clouds. R package version 2.0.
http://CRAN.R-proiect.org/package=wordcloud) para visualizacion.
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)
Para determinar los niveles sericos de IL-6, IL-8, IL-12, IFNg, TNFa, infliximab y anticuerpo anti-infliximab, se realizaron ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Se usaron los kits Quantikin ELISA (R&D Systems) para mediciones de IL-6, IL-8, IL-12 y IFNg de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de TNFa, infliximab y anticuerpos anti-infliximab se midieron mediante el kit LISA -TRACKER Premium Infliximab (BioMedical Diagnostics). Los resultados se dieron en pg/ml. Los datos se analizaron usando GraphPad Prism, y se uso la prueba U de Mann-Whitney (p<0,05 se considero estadfsticamente significativo).
Ejemplos
Ejemplo 1
Analisis global de expresion genica de muestras de cohorte de ensayo de artritis reumatoide Grupos de pacientes de cohorte de ensayo de artritis reumatoide
Se incluyeron muestras de 19 pacientes en el periodo basal y en la semana 2 en los experimentos de micromatrices. Los medicos clmicos identificaron 6 respondedores y 13 respondedores nulos o moderados. Cada paciente tuvo la misma terapia basica y era no fumador. Entre los grupos no respondedores (NR) y respondedores (R), no hubo diferencias significativas con respecto a la edad, DAS28, HAQ, CRP, factor reumatoide, anti-CCP o DMARD (Tabla 1).
Tabla 1: Parametros clmicos acumulados de grupos de pacientes en AR en la cohorte de ensayo. NS significa no significativo, DAS28, HAQ y DMARD son datos de puntuacion.
Respondedores (ACR70-50) Respondedores nulos o moderados (ACR20-0)
A la semana 0
6 13
Genero
Masculino/ Femenino 1/5 2/11
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(continuacion)
Respondedores (ACR70-50) Respondedores nulos o moderados (ACR20-0)
Edad
NS 44,33 47,08
DAS28
NS 5,63 5,26
HAQ
NS 1,27 2,06
CRP (mg/l)
NS 16,83 28,31
DMARD
NS 2,83 2,69
RF (lU/ml)
NS 105,83 148,62
CCP (lU/ml)
NS 675,78 756,31
Analisis de micromatrices
El perfil de expresion genica global revelo genes con diferencias estad^sticamente significativas entre respondedores y no respondedores en el penodo basal. El analisis de las muestras obtenidas a la semana 2 mostro genes con diferencias estadfsticamente significativas entre respondedores y no respondedores. La expresion de algunos genes fue significativamente diferente incluso en el penodo basal (ePsTI1, IFI44, IFIT1, IFIT2, IFIT3, RFC1 y RSAD2); mientras que otros se expresaron de manera diferente a la semana 2 (FCGR3A, GPAM, MICA, ELOVL7, pF4, RGS1 y SNORD41). Muchos de estos genes tienen una relacion con AR de acuerdo con la bibliograffa (FCGR3A, MICA, PF4, IFIT1, etc.)
La comparacion entre las muestras del penodo basal y a la semana 2 dio como resultado una lista de 3 genes (AQP9, IGJ y TNFAIP6) con diferencias estadisticamente significativas incluso con la correccion de Benjamini- Hochberg para ensayos multiples. Estos genes representan los efectos de la terapia a lo largo del tiempo (Figura 3).
Ejemplo 2
Validacion con RT-QPCR de paneles genicos de artritis reumatoide Grupos de pacientes de cohorte de validacion de artritis reumatoide
Los medicos clmicos identificaron 4 respondedores y 11 respondedores nulos o moderados. Cada paciente tuvo la misma terapia basica y era no fumador. Entre los grupos no respondedores (NR) y respondedores (R), no hubo diferencias significativas con respecto a la edad, DAS28, HAQ, CRp o DMARDs (Tabla 2).
Tabla 2: Parametros clmicos acumulados de grupos de pacientes en AR en la cohorte de validacion. Tambien se muestran entre parentesis los datos de la cohorte de ensayo. DAS28, HAQ y DMARD son datos de puntuacion.
Respondedores Respondedores nulos o moderados
A la semana 0
(cohorte de ensayo) 4 (6) 11 (13)
Genero
Masculino/Femenino 0/4 (1/5) 3/8 (2/11)
Edad
No significativo 54 (44,33) 56,2 (47,08)
DAS28
No significativo 5,23 (5,63) 5,44 (5,26)
HAQ
No significativo 1,59 (1,27) 1,93 (2,06)
CRP (mg/l)
No significativo 18,9 (16,83) 9,58 (28,31)
DMARD
No significativo 3 (2,83) 2,7 (2,69)
Analisis RT-QPCR
En los experimentos de RT-QPCR se incluyeron muestras de 15 pacientes a la semana 0 y de 5 pacientes desde la cohorte de ensayo para validacion tecnica - 2 respondedores, 3 no respondedores. La configuracion de los ensayos
q-PCR de validacion se realizo de la siguiente manera: en base a las micromatrices de la cohorte de ensayo, se probo que 29 conjuntos de sonda eran estad^sticamente significativas en el periodo basal con respecto a la comparacion entre no respondedor frente a respondedor, fuera de las cuales se incluyeron 27 genes (se excluyeron genes sin anotacion y ARN nucleolares pequenos) en las tarjetas de TLDA asf como 6 genes de la comparacion de 5 NR frente a R a la semana 2, y se seleccionaron 10 genes de la literatura. A parte de esto, se usaron 41 genes en el analisis final como se describe mas adelante (se excluyeron genes que no muestran diferencias). Los experimentos con RT-QPCR dieron como resultado 4 genes que muestran diferencias estadisticamente significativas (prueba U de Mann-Whitney unilateral) entre NR y R (Figura 4). Tambien se ejecuto la validacion tecnica y se probo que era satisfactoria.
10 Ejemplo 3
Analisis global de expresion genica de muestras de cohorte de ensayo de enfermedad de Crohn Grupos de pacientes de cohorte de ensayo de enfermedad de Crohn
Se incluyeron muestras de 20 pacientes en el periodo basal y en la semana 2 en los experimentos de micromatrices (cohorte de ensayo). Los medicos clmicos identificaron 14 respondedores y 6 no respondedores. Cada paciente tuvo 15 la misma terapia basica y era no fumador. Entre los grupos no respondedores (NR) y respondedores (R), no hubo diferencias significativas con respecto a la edad, CDAI, CRP, hemoglobina, leucocitos o neutrofilos (Tabla 3).
Tabla 3: Parametros clmicos acumulados de grupos de pacientes en EC en la cohorte de ensayo. El CDAI, mdice de actividad de enfermedad de Crohn es una puntuacion
Respondedores No respondedores
A la semana 0
14 6
Genero
Masculino/Femenino 8/6 3/3
Edad
No significativo 36,2 36
CDAI
No significativo 319,6 351,5
CRP (mg/l)
No significativo 22,78 13,59
Hemoglobina (g/l)
No significativo 125,1 120,6
Leucocitos (G/l)
No significativo 9,02 8,01
Neutrofilos (%)
No significativo 70,0 74,5
20 Analisis de micromatrices
El perfil de expresion genica global revelo genes con diferencias estadfsticamente significativas entre respondedores y no respondedores en el periodo basal. El analisis de las muestras obtenidas a la semana 2 mostro genes con diferencias estadfsticamente significativas entre respondedores y no respondedores. Algunos de estos genes estaban del mismo modo cambiando significativamente en el periodo basal (DDX11L2, BMP6, THEM5 y ABCC4); 25 mientras que otros fueron nuevos descubrimientos a la semana 2 (GPR34, PRDM1, IL1RL1, CA2, MMD, SCL7A5, CADM2 y RAD23A). Muchos de estos genes tienen una relacion con EC de acuerdo con la literatura (BMP6, ABCC4, CA2, IL1RL1 y PRDM1). La comparacion de las muestras en el periodo basal y en la semana 2 dio como resultado una lista de 5 genes (AQP9, IGKC, MGAM, MMP8 y TNFAIP6) con diferencias estadfsticamente significativas. Estos genes representan los efectos de la terapia a lo largo del tiempo (Figura 5).
30 Ejemplo 4
Validacion con RT-QPCR de paneles genicos de enfermedad de Crohn Grupos de pacientes de cohorte de validacion de enfermedad de Crohn
Se incluyeron muestras de 20 pacientes en el periodo basal en los experimentos de RT-QPCR (cohorte de validacion). Los medicos clmicos identificaron 13 respondedores y 7 no respondedores. Cada paciente tuvo la 35 misma terapia basica y era no fumador. Entre los grupos no respondedores (NR) y respondedores (R), no hubo diferencias significativas con respecto a la edad, CDAI, CRP, hemoglobina, leucocitos o neutrofilos (Tabla 4).
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30
35
40
Tabla 4: Parametros ctfnicos acumulados de grupos de pacientes en EC en la cohorte de validacion. Tambien se muestran entre parentesis los datos de la cohorte de ensayo. El CDAI, ^ndice de actividad de enfermedad de Crohn
es una puntuacion. Analisis RT-QPCR
Respondedores No respondedores
En el periodo basal
(cohorte de ensayo) 13 (14) 7 (6)
Genero
Masculino/Femenino 8/5 (8/6) 4/4 (4/3)
Edad
No significativo 26,8 (36,2) 30,2 (36)
CDAI
No significativo 338,3 (319,6) 370,7 (351,5)
CRP (mg/l)
No significativo 27,2 (22,78) 16,5 (13,59)
Hemoglobina (g/l)
No significativo 130 (125,1) 127 (120,6)
Leucocitos (G/l)
No significativo 7,58 (9,02) 9,24 (8,01)
Neutrofilos (%)
No significativo 74,0 (70,0) 72,83 (74,5)
La configuracion de los ensayos q-PCR de validacion se realizo de la siguiente manera: en base a las 40 micromatrices en la cohorte de ensayo, se probo que 49 conjuntos de sondas eran estadfsticamente significativos en el periodo basal con respecto a la comparacion entre no respondedor frente a respondedor, fuera de las cuales se incluyeron 36 genes (se excluyeron genes sin anotacion y ARN nucleolares pequenos) en las tarjetas de TLDA asf como 8 genes de la comparacion de NR frente a R a la semana 2, y 7 genes de la literatura. A parte de esto, se usaron 40 genes en el analisis final como se describe mas adelante (se excluyeron genes que no muestran
diferencias). Los experimentos de RT-QPCR dieron como resultado 4 genes que muestran diferencias
estadfsticamente significativas (prueba U de Mann-Whitney unilateral) entre NR y R (Figura 6).
Ejemplo 5
Analisis bioestadistico de datos de expresion
Se realizo un analisis estadfstico utilizando datos de expresion genica de los 40/41 genes (AR/EC) prefiltrados en ambas cohortes utilizando la generacion automatica de panel genico descrita con detalle anteriormente, se diseno un algoritmo para encontrar los mejores paneles genicos que discriminan entre respondedores y no respondedores.
El algoritmo se ejecuto con el min_F determinista y 5000 veces con ambos modelos estocasticos. En la AR F_prop produjo 4747 combinaciones de paneles genicos que muestran un 100 % de segregacion entre respondedores y no respondedores tanto en las cohortes de ensayo como de validacion (usando micromatrices y datos de RT-QPCR, respectivamente), mientras que uniform produjo incluso mas, 4909 paneles genicos. En la EC, estos numeros
fueron 4657 para F_prop y 4878 para uniform. El modelo min_F tambien produjo una segregacion del 100 %, pero
debe indicarse que los modelos estocasticos produjeron una segregacion mucho mas profunda en terminos de indicadores de precision en ambas enfermedades. El alto numero de paneles genicos que proporcionan una segregacion del 100 % generados mediante 5000 ejecuciones sugiere que hay otros paneles con una segregacion del 100 %, se estima que el numero total de estos paneles excede los 50.000.
La validacion cruzada es una manera de predecir el ajuste de un modelo a un conjunto de validacion hipotetico cuando no esta disponible un conjunto de validacion explfcito. Usamos una validacion cruzada dejando uno fuera (LOOCV) que implica usar una sola observacion de la muestra original como los datos de validacion, y las observaciones restantes como datos de entrenamiento. Esto se repite de tal manera que cada observacion en la muestra se usa una vez como los datos de validacion. Para la visualizacion, se seleccionaron 3-3 paneles genicos con el mejor poder discriminatorio considerando valores F, datos de validacion cruzada y margenes entre los grupos segregados. Una lista de genes con los valores p mas altos en el experimento de micromatrices sirvio como controles negativos que no muestran segregacion (Tabla 5).
El panel genico para AR con el mejor poder discriminatorio inclrna genes, tales como CNTNAP3, CYP4F3, GZMB, mMe, MX1, RaVeR2, SERPINB10 y TNFAIP6 (RA1); mientras que el segundo panel genico contema CNTNAP3, CYP4F3, EPSTI1, MME, RGS1, SERPINB10 y TNFAIP6 (RA2); y el tercero consist en FCGR3A, GPAM, GZMB, IFI35, MME, PTGS2, RAVER2, RFC1 y RSAD2 (RA3). (Figura 7).
El panel genico para EC con el mejor poder discriminatorio inclrna genes, tales como ARHGEF12, ENDOD1, FCGR1A, GCLC, GPR34, KAT2B, MAP1LC3B y ODC1 (CD1); mientras que el segundo panel genico contema ABCC4, AIDA, ARHGEF12, CADM2, FMN1, KAT2B, ODC1, PCYT1B y RNASE2 (CD2); el tercero consist en AIDA, CADM2, GCLC, KAT2B, MMD, PCYT1B, PIP5K1B, RIOK3 y RNF11 (CD3). (Figura 8)
Tabla 5: Indicadores de precision de los paneles genicos seleccionados para visualizacion. Se presentan datos de segregacion y validacion cruzada de cada panel genico seleccionado as^ como tambien del control negativo.
Panel genico
RA1 RA2 RA3 Control negativo
Cohorte de artritis reuma- toide
Cohorte de ensayo Cohorte de validacion Cohorte de ensayo Cohorte de validacion Cohorte de ensayo Cohorte de validacion Cohorte de ensayo
Segrega- cion de los grupos
100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 53%
Resultado de validacion cruzada
100 % 87% 95% 93% 95% 87% -
Fuente de datos
Micromatri z RT-QPCR Microma- triz RT-QPCR Micromatriz RT-QPCR Micromatriz
Panel genico N.°
CD1 CD2 CD3 Control negativo
Cohorte de enferme- dad de Crohn
Cohorte de ensayo Cohorte de validacion Cohorte de ensayo Cohorte de validacion Cohorte de ensayo Cohorte de validacion Cohorte de ensayo
Segrega- cion de los grupos
100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 55%
Resultado de validacion cruzada
95% 80% 90% 85% 90% 80% -
Fuente de datos
Microma- triz RT-QPCR Microma- triz RT-QPCR Micromatriz RT-QPCR Micromatriz
En las figuras 9 y 10, el numero de genes dentro de cada panel que muestran una segregacion del 100% entre 5 respondedores y no respondedores y el valor F mas bajo calculado para cada grupo de pacientes (cuanto mayor es el valor F, mejor es la segregacion, lo que significa que la seleccion del valor F mmimo representa el punto mas debil del modelo) se muestran ordenados por valor F para revelar el numero estimado de paneles genicos con el poder discriminatorio mas alto. El punto de inflexion de la curva de valor F mmimo muestra que en AR aproximadamente 350 mientras que en EC 2O0 paneles genicos dieron como resultado una discriminacion fuerte, observando que 10 todos los paneles genicos en la grafica han conducido a una diferenciacion del 100% entre respondedores y no respondedores.
Ejemplo 6
Analisis ELISA
Se realizaron mediciones de ELISA para determinar los niveles de protema en suero de cinco citocinas 15 proinflamatorias (TNFa, IL6, IL8, IFNg y IL12), el anticuerpo monoclonal terapeutico infliximab y el anticuerpo anti- farmaco (anti-infliximab). La Tabla 6 muestra que basandose en un analisis estadfstico, se encuentra una diferencia significativa en AR entre respondedores y no respondedores en el periodo basal en el nivel de IL-12, mientras que en EC, el nivel de IFNy volvio a ser estadfsticamente diferente. Se midio TNFa con un kit TRACKER Premium Infliximab en la cohorte de AR. En las figuras 11 - 13 se muestran diagramas de dispersion detallados de las 20 comparaciones significativas.
Tabla 6: Se obtuvieron valores estad^sticos de valores p de ELISA de medicion de citocina mediante el analisis estad^stico de datos de nivel de citocina de grupos de NR frente a R y de periodo basal frente a la semana 2 usando una prueba U de Mann-Whitney. Los numeros en negrita representan valores estad^sticamente significativos.
Artritis reumatoide Enfermedad de Crohn
NR frente a R en periodo basal Periodo basal frente a semana 2 NR frente a R en periodo basal Periodo basal frente a semana 2
IL6
0,2 0,03 0,2 0,005
IL8
0,3 0,01 0,9 0,06
IL12
0,05 0,05 0,6 0,8
IFNg
0,5 0,5 0,02 0,06
TNF
0,2 0,67
5 Tambien se realizaron experimented de prueba ELISA de TNFa, infliximab y anti-infliximab para probar el kit LISA - TRACKER Premium Infliximab. Por la cantidad limitada del kit solo pudieron incluirse muestras de las cohortes de ensayo. Se incluyeron las siguientes muestras:

TNFa 17 AR en periodo basal, 17 AR a la semana 2 7 AR a la semana 14

Infliximab 16 EC a la semana 2 19 AR a la semana 2 7 AR a la semana 14

Anti-infliximab 17 EC a la semana 2 19 AR a la semana 2 7 AR a la semana 14
Por lo tanto, solo se midio TNFa en muestras de pacientes con AR de la cohorte de ensayo pero no pudo detectarse diferencia entre respondedores y no respondedores en periodo basal o a la semana 2 o en comparaciones del 10 periodo basal frente a la semana 2 (Figuras 14 -16).
Se midieron infliximab y anti-infliximab en muestras a la semana 2 y a la semana 14 de AR y EC (cohorte de ensayo) (Figuras 17 - 19). Solo pudieron detectarse niveles de anti-infliximab en 3 muestras que representan pacientes que mostraron niveles cero de infliximab a la semana 14.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo in vitro para predecir si un paciente que tiene artritis reumatoide respondena a un tratamiento con un inhibidor de TNFa, metodo que comprende determinar el nivel de expresion de genes CNTNAP3, CYP4F3, GZMB, MME, MX1, RAVER2, SERPINB10 y TNFAIP6, o el nivel de expresion de genes CNTNAP3, CYP4F3, EPSTI1,
    5 MME, RGS1, SERPINB10 y TNFAIP6, o el nivel de expresion de genes FCGR3A, GPAM, GZMB, IFI35, MME, PTGS2, RAVER2, RFC1 y RSAD2 en una muestra de sangre de dicho paciente.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los niveles de expresion relativos de los genes seleccionados se determinan en comparacion a un gen constitutivo.
  3. 3. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de TNFa es un 10 anticuerpo anti-TNFa, una protema de fusion de TNF o una protema de union a TNF recombinante.
  4. 4. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de TNFa es Adalimumab, Certolizumab pegol, Etanercept, Golimumab, Infliximab o Pegsunercept.
  5. 5. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende ademas la etapa de comparar el nivel de expresion de dichos genes con valores de referencia obtenidos a partir de grupos de pacientes
    15 respondedores y no respondedores.
  6. 6. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el nivel de expresion se determina cuantificando el nivel de ARNm de dichos genes en la muestra de sangre.
  7. 7. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de determinar el nivel de una protema biomarcadora.
    20
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016179469A1 (en) * 2015-05-07 2016-11-10 Abbvie Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating inflammatory bowel disease
WO2017004151A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Anti-apobec3 antibodies and methods of making and using
GB2547406A (en) * 2015-11-20 2017-08-23 Folkersen Lasse Apparatus and methods of using of biomarkers for predicting TNF-inhibitor response
GB201521357D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Univ Liverpool Methods for predicting response to anti-TNF therapy
EP3433271A4 (en) * 2016-03-23 2019-11-27 Regents of the University of Minnesota PROCEDURE FOR DETECTING APOBEC3 EXPRESSION AND PREDICTING CLINICAL RESULTS
WO2019159186A1 (en) * 2018-02-19 2019-08-22 Genefron Ltd. Methods of determining response to tnf alpha blockers
WO2019178546A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Scipher Medicine Corporation Methods and systems for predicting response to anti-tnf therapies
US20220099686A1 (en) * 2018-11-30 2022-03-31 Cha University Industry-Academic Cooperation Foundation Brain-derived vesicle-specific marker and brain disease diagnostic method using same
EP3901264B1 (en) * 2018-12-07 2026-07-15 DNA Chip Research Inc. Method for predicting efficacy of rheumatoid arthritis therapeutic agent and biomarker used therein
JP2022541125A (ja) 2019-06-27 2022-09-22 サイファー メディシン コーポレーション 患者を層別化するための分類子の開発
KR102429261B1 (ko) * 2020-08-25 2022-08-03 충북대학교 산학협력단 한국인의 tnf 저해제 약물 반응성 예측을 위한 바이오마커
KR102941328B1 (ko) * 2023-02-20 2026-03-20 재단법인 아산사회복지재단 크론병에 대한 항-tnf 치료 반응성을 예측하기 위한 동반진단용 바이오마커 조성물
EP4621071A1 (en) * 2024-03-22 2025-09-24 Fundación Pública Galega Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago de Compostela In vitro method for predicting the response of patients suffering from rheumatoid arthritis to a treatment with tumor necrosis factor (tnf) inhibitors

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000058362A1 (en) * 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
ME00426B (me) * 2003-04-09 2011-10-10 Genentech Inc Liječenje autoimunih bolesti kod pacijenata sa neadekvatnim odgovorom na tnf-alfa inhibitor
EP1857559A1 (en) * 2006-05-16 2007-11-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A method for predicting responsiveness to TNF alpha blocking agents
CA2682406A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Genentech, Inc. Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to b-cell antagonists
WO2008132176A2 (en) * 2007-04-27 2008-11-06 Universite Catholique De Louvain Method for evaluating the response of an individual to tnf blocking therapy
EP2165194A4 (en) * 2007-05-31 2010-09-08 Abbott Lab BIOMARKERS FOR PREDICTING RESPONSABILITY TO TNF ALPHA INHIBITORS IN AUTOIMMUNE DISEASES
JP2012500993A (ja) * 2008-08-25 2012-01-12 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 潰瘍性大腸炎及び関連した疾患における抗ｔｎｆ処置のためのバイオマーカー
JP2011004743A (ja) * 2009-06-26 2011-01-13 Dna Chip Research Inc 関節リウマチ患者におけるインフリキシマブ薬効の有効性を判別する方法
WO2012061620A1 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis

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