ES2646165T3

ES2646165T3 - Bacteria que produce L-cisteína y procedimiento para la producción de L-cisteína

Info

Publication number: ES2646165T3
Application number: ES10833315.4T
Authority: ES
Inventors: Gen Nonaka
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2030-11-26
Also published as: CN102639691A; EP2508594A1; EP2508594A4; US8647847B2; CN102639691B; JP5817529B2; US20120288902A1; WO2011065469A1; JPWO2011065469A1; EP2508594B1; BR112012012915A2; BR112012012915B1

Abstract

Procedimiento para producir L-cisteína, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas, que comprende cultivar una bacteria Escherichia en un medio y recoger L-cisteína, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas a partir del medio, en el que la bacteria presenta una capacidad de producción de L-cisteína y es modificada de manera que es reducida la actividad de una proteína codificada por el gen yciW reduciendo la cantidad de expresión del gen yciW o mediante la disrupción del gen.

Description

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DESCRIPCION

Bacteria que produce L-cistefna y procedimiento para la produccion de L-cistefna Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir L-cistefna o una sustancia relacionada con la misma. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir L-cistefna o una sustancia relacionada con la misma, que utiliza una bacteria adecuada para la produccion de L-cistefna o una sustancia relacionada con la misma. La L-cistefna y las sustancias relacionadas con la misma se utilizan en los campos farmaceutico, cosmetico y alimentario.

Antecedentes de la tecnica

La L-cistefna se obtiene convencionalmente mediante extraccion a partir de sustancias que contienen queratina, tales como pelo, cuernos y plumas, o mediante la conversion del precursor acido DL-2-aminotiazolfn-4- carboxflico utilizando un enzima microbiano. Tambien se ha planificado producir L-cistefna a gran escala mediante un procedimiento con enzima inmovilizado que utiliza un nuevo enzima. Ademas, tambien se ha intentado producir L-cistefna mediante fermentacion utilizando un microorganismo.

Como microorganismos con capacidad para producir L-cistefna se conoce, por ejemplo, una bacteria corineforme en la que la actividad intracelular de serina acetiltransferasa se encuentra incrementada (documento de patente n° 1). Tambien se conoce una tecnica para incrementar la capacidad productora de L-cistefna mediante la incorporacion de una serina acetiltransferasa mutante de la que la inhibicion por retroalimentacion por la L- cistefna se encuentra atenuada (documentos de patente n° 2 a n° 4).

Ademas, como microorganismos en los que la capacidad productora de L-cistefna se encuentra incrementada mediante la supresion del sistema que actua descomponiendo la L-cistefna, se conocen bacterias corineformes o bacterias Escherichia en las que la actividad de la cistationfn-p-liasa (documento de patente n° 2), triptofanasa (documento de patente n° 5) u O-acetilserina sulfhidralasa B (documento de patente n° 6) se encuentra atenuada o anulada.

Ademas, es conocido que el gen ydeD codificante de la protefna YdeD participa en la secrecion de productos metabolicos de la ruta de la L-cistefna (documento no de patente n° 1). Ademas, tambien se conocen tecnicas de incremento de la capacidad de produccion de L-cistefna mediante el incremento de la expresion del locus mar, el locus emr, el locus acr, el locus cmr, el gen mex, el gen bmr o el gen qacA (documento de patente n° 7), o el gen emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr o cusA (documento de patente n° 8), en los que los loci/genes codifican para protefnas adecuadas para la secrecion de una sustancia citotoxica a partir de las celulas.

Ademas, como bacteria productora de L-cistefna se conoce Escherichia coli, en la que la actividad del factor de control transcripcional positivo del regulon de la cistefna codificado por el gen cysB se encuentra incrementada (documento de patente n° 9).

Ademas, es conocido que un gen serA mutante codificante de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa de la que la inhibicion por retroalimentacion por serina se encuentra atenuada, y se propone la utilizacion de la misma para la produccion de L-cistefna por Escherichia coli (documentos de patente n° 10 y n° 11).

Aunque yciW se encuentra registrado en la base de datos EcoCyc como gen codificante de una oxidorreductasa predicha (documento no de patente n° 2), las funciones reales de la misma no son conocidas y la relacion de las mismas con la produccion de L-cistefna no es conocida.

Ademas, aunque se ha informado de que el gen yciW se encuentra regulado positivamente por agotamiento de una fuente de azufre (documento no de patente n° 3), el furfural (documento no de patente n° 4) y el estres oxidativo (documento no de patente n° 5), se menciona en todos los documentos solo como uno de entre un gran numero de genes que muestran variacion en la expresion en los experimentos de micromatriz, y no se ha propuesto la relacion de los mismos con la produccion de la L-cistefna.

Referencias de la tecnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente n° 1 Documento de patente n° 2 Documento de patente n° 3 Documento de patente n° 4 Documento de patente n° 5

patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2002-233384. patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 11-155571. solicitud publicada de patente US n° 20050112731. patente US n° 6.218.168.

patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2003-169668.

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Documento de patente Documento de patente Documento de patente Documento de patente Documento de patente Documento de patente

n° 6: patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-245311. n° 7: patente US n° 5.972.663.

n° 8: patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-287333. n° 9: publicacion de patente internacional n° WO01/27307. n° 10: patente US n° 5.856.148.

n° 11: solicitud publicada de patente US n° 20050009162.

Documentos no de patente

Documento no de patente n° 1: Dabler et al., Mol. Microbiol. 36:1101-1112, 2000.

Documento no de patente n° 2: pagina principal de BioCyc, Escherichia coli K-12-substr. MG1655 Gen: yciW [busqueda de 14 de octubre de 2009], direccion URL de Internet: <
http://biocyc.org/ECOLI/NEW- IMAGE?type=GENE&object=G6640>

Documento no de patente n° 3: Gyaneshwar P. et al., J. Bacteriol. 187:1074-1090, 2005.

Documento no de patente n° 4: Elliot N., Miller E.N. et al., Appl. Envir. Microbiol. 10.1128-/AEM.01187-09, 2009. Documento no de patente n° 5: Wang S. et al., Appl. Envir. Microbiol. 10.1128/AEM.00914-09, 2009.

Divulgacion de la invencion

El documento US 20090226983 da a conocer una bacteria perteneciente a la familia de las enterobacteriaceas que presenta capacidad de produccion de L-cistefna y ha sido modificada para reducir la actividad de la protefna codificada por el gen yhaM.

Objetivo que debe alcanzar la invencion

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para producir L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas mediante el desarrollo de una nueva tecnica para mejorar la capacidad de produccion de L-cistefna de una bacteria.

En el contexto de la presente invencion se han realizado diversas investigaciones con el fin de conseguir el objetivo mencionado anteriormente. Como resultado se ha descubierto que la capacidad de produccion de L- cistefna de una bacteria podrfa mejorarse mediante la modificacion de la bacteria de manera que se reduzca la actividad de la protefna codificada por el gen yciW, y de esta manera ha llevado a cabo la presente invencion.

Es decir, la presente invencion puede realizarse de la manera siguiente.

[1] Un procedimiento para producir L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas, que comprende cultivar una bacteria Escherichia en un medio y recoger L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas a partir del medio, en el que la bacteria presenta capacidad de produccion de L-cistefna y ha sido modificada para que la actividad de la protefna codificada por el gen yciW se encuentre reducida mediante reduccion de la cantidad expresada del gen yciW, o mediante la disrupcion del gen.

[2] El procedimiento segun [1], en el que la protefna es una protefna definida en (A) o (B) a continuacion:

(A) una protefna que comprende la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID n° 2.

(B) Una protefna que comprende la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID n° 2, pero que incluye la sustitucion, eliminacion, insercion o adicion de uno o varios residuos aminoacidos, la reduccion de la actividad de la cual en la bacteria resulta en la mejora de la capacidad de produccion de L-cistefna.

[3] El procedimiento segun [1] o [2], en el que el gen yciW es un ADN definido en (a) o (b) a continuacion:

(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de las posiciones 301 a 1.428 en la secuencia de nucleotidos de la SEC ID n° 1,

(b) un ADN hibridable con una secuencia complementaria de la secuencia de nucleotidos de las posiciones 301 a 1.428 en la secuencia de nucleotidos de la SEC ID n° 1 o con una sonda que puede prepararse a partir de dicha secuencia complementaria, bajo condiciones restrictivas que comprenden el lavado a una concentracion salina y a una temperatura correspondientes a 1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, y la codificacion de una protefna la reduccion de actividad de la cual en una bacteria resulta en la mejora de la capacidad de produccion de L- cistefna.

[4] El procedimiento segun cualquiera de entre [1] y [3], en el que la bacteria comprende ademas por lo menos una de las caracterfsticas siguientes:

i) ha sido modificada de manera que la actividad de serina acetiltransferasa se encuentra incrementada,

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ii) ha sido modificada de manera que la expresion del gen ydeD se encuentra incrementada,

HI) ha sido modificada de manera que la actividad de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa se encuentra incrementada.

[5] El procedimiento segun cualquiera de entre [1] y [4], en el que la bacteria es Escherichia coli.

[6] El procedimiento segun cualquiera de entre [1] y [5], en el que el derivado de L-cistefna es un derivado tiazolidina.

Efecto de la invencion

Segun la presente invencion, pueden producirse eficientemente L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas.

Modos de poner en practica la invencion

<1> Bacteria utilizada en la presente invencion

La bacteria utilizada en la presente invencion es una bacteria Escherichia que presenta una capacidad de produccion de L-cistefna y ha sido modificada de manera que la actividad de la protefna codificada por el gen yciW se encuentra reducida. La capacidad de produccion de L-cistefna a la que se hace referenda en la presente memoria se refiere a una capacidad de la bacteria de producir L-cistefna en un medio o en las celulas de la bacteria y que se acumula en las mismas en una cantidad que permite la recoleccion de la L-cistefna del medio o de las celulas al cultivar la bacteria en el medio. Una bacteria con capacidad de produccion de L-cistefna se refiere a una bacteria que puede producir y en la que puede acumularse L-cistefna en el medio en una cantidad mayor que con una cepa de tipo salvaje o con una cepa parental, preferentemente una bacteria que puede producir y en la que se puede acumular L-cistefna en el medio en una cantidad de 0,05 g/l o superior, mas preferentemente de 0,1 g/l o superior, particularmente preferida de 0,2 g/l o superior.

Una parte de la L-cistefna producida por la bacteria puede convertirse en L-cistina en el medio mediante la formacion de un enlace disulfuro. Ademas, la S-sulfocistefna puede generarse mediante la reaccion de la L- cistefna y tiosulfato contenido en el medio (Szczepkowski T.W., Nature 182, 1958) tal como se menciona a continuacion. Ademas, la L-cistefna generada en las celulas bacterianas puede condensarse con una cetona o aldehfdo, por ejemplo acido piruvico, que se encuentra presente en las celulas, para producir un derivado tiazolidina mediante un hemitiocetal como producto intermedio (ver la patente japonesa n° 2992010). Este derivado tiazolidina y el hemitiocetal pueden encontrarse presentes en forma de mezcla en equilibrio. Por lo tanto, la capacidad de produccion de L-cistefna no se encuentra limitada a la capacidad de acumular unicamente L-cistefna en el medio o en las celulas, sino que tambien incluye la capacidad de acumular, ademas de L- cistefna, L-cistina, un derivado de la misma, tal como S-sulfocistefna, un derivado tiazolidina, o un hemitiocetal, o una mezcla de los mismos en el medio. Ademas, la L-cistefna se utiliza como materia prima en las biosfntesis de Y-glutamilcistefna, glutation, cistationina, homocistefna, metionina, S-adenosilmetionina, etc. Por lo tanto, mediante la utilizacion de una bacteria con capacidad para producir cualquiera de dichos compuestos ademas de la capacidad de producir L-cistefna, pueden producirse dichos compuestos. Por lo tanto, la capacidad de producir L-cistefna tambien incluye la capacidad de acumular otro compuesto que se produce mediante la L-cistefna.

La bacteria que presenta capacidad de producir L-cistefna puede presentar inherentemente la capacidad de produccion de L-cistefna, o puede obtenerse mediante la modificacion de una bacteria, tal como las indicadas a continuacion, mediante mutagenesis, o mediante una tecnica de ADN recombinante, de manera que adquiera la capacidad de produccion de L-cistefna. En la presente invencion, a menos que se indique especfficamente, el termino L-cistefna puede utilizarse para referirse a L-cistefna de tipo reducido, L-cistina, un derivado tal como los indicados anteriormente o una mezcla de los mismos.

La bacteria utilizada para la presente invencion es una bacteria del genero Escherichia.

Aunque las bacterias Escherichia no se encuentran particularmente limitadas, pueden utilizarse especfficamente las indicadas en el trabajo de Neidhardt et al. (Backmann B.J., Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, paginas 2460 a 2488, Tabla 1, en F.D. Neidhardt (editor), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/segunda edicion, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C., 1996). Entre ellas, puede utilizarse, por ejemplo, Escherichia coli. Entre los ejemplos especfficos de Escherichia coli se incluyen Escherichia coli W3110 (ATCC n° 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC n° 47076), y otras, las cuales se derivan de la cepa prototipo de tipo salvaje, la cepa K12.

Dichas cepas se encuentran disponibles a partir de, por ejemplo, la American Type Culture Collection (direccion: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Es decir, los numeros de registro se proporcionan para cada una de dichas cepas y las cepas pueden encargarse

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mediante la utilizacion de estos numeros de registro (ver
http://www.atcc.org/). Los numeros de registro de las cepas estan enumerados en el catalogo de la American Type Culture Collection.

En adelante en la presente memoria se describen procedimientos para proporcionar la capacidad de producir L- cistefna a las bacterias Escherichia, o los procedimientos para potenciar la capacidad de produccion de L- cistefna de dichas bacterias.

Para proporcionar capacidad de produccion de L-cistefna a una bacteria, pueden utilizarse procedimientos utilizados convencionalmente en la crfa de las bacterias corineformes, las bacterias Escherichia. Entre dichos procedimientos se incluyen la adquisicion de una cepa mutante auxotrofa, una cepa resistente a analogos, o una cepa mutante de la regulacion metabolica, o la construccion de una cepa recombinante en la que se sobreexprese un enzima de biosfntesis de la L-cistefna, y otros (ver "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a edicion, publicada el 30 de mayo de 1986, paginas 77 a 100). En el cultivo de las bacterias productoras de L-cistefna, puede proporcionarse la propiedad o propiedades anteriormente indicadas, tales como la auxotroffa, la resistencia a analogos y la mutacion de la regulacion metabolica, solas o en combinaciones de dos o mas. La expresion del enzima o enzimas de biosfntesis de la L-cistefna puede incrementarse sola o en combinaciones de dos o mas. Ademas, la provision de propiedades tales como la auxotroffa, la resistencia a analogos y la mutacion de la regulacion metabolica pueden combinarse con la potenciacion de un enzima biosintetico.

Puede obtenerse una cepa mutante auxotrofa, una cepa resistente a un analogo de la L-cistefna, o una cepa mutante de la regulacion metabolica con capacidad de produccion de L-cistefna, sometiendo una cepa parental o cepa de tipo salvaje a mutagenesis convencional, tal como la exposicion a rayos X o la irradiacion de UV o el tratamiento con un mutageno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o metanosulfonato de etilo (EMS), seguido de la seleccion de una cepa que muestre auxotroffa, resistencia a analogos o una mutacion de la regulacion metabolica y que presente una capacidad de produccion de un L-aminoacido a partir de las cepas mutantes obtenidas.

La capacidad de produccion de L-cistefna de una bacteria puede mejorarse potenciando la actividad de un enzima de la ruta de biosfntesis de la L-cistefna o de un enzima que participe en la generacion de un compuesto que actue como sustrato en la ruta, tal como la L-serina, por ejemplo la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa y la serina acetiltransferasa. Debido a que la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa resulta inhibida mediante inhibicion por retroalimentacion por la serina, la actividad enzimatica de dicho enzima puede incrementarse mediante la incorporacion en una bacteria de un gen serA de tipo mutante codificante para una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa mutante en la que la inhibicion por retroalimentacion se encuentre atenuada o anulada.

Ademas, la serina acetiltransferasa resulta inhibida mediante inhibicion por retroalimentacion por la L-cistefna. Por lo tanto, la actividad enzimatica de dicho enzima puede incrementarse mediante la incorporacion en una bacteria de un gen cysE de tipo mutante que codifique para una serina acetiltransferasa en la que la inhibicion por retroalimentacion se encuentre atenuada o anulada.

La capacidad de produccion de L-cistefna tambien puede incrementarse potenciando la expresion del gen ydeD, codificante para la protefna YdeD (Dabler et al., Mol. Microbiol. 36:1101-1112, 2000) o el gen yfiK codificante para la protefna YfiK (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2004-49237).

Una forma de realizacion de la bacteria utilizada en la presente invencion es una bacteria que presenta por lo menos una de las caracterfsticas siguientes:

ii) ha sido modificada de manera que la expresion del gen ydeD se encuentra incrementada y

iii) ha sido modificada de manera que la actividad de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa se encuentra incrementada.

Ademas, la capacidad de produccion de L-cistefna tambien puede mejorarse potenciando la actividad del sistema de transporte de sulfato/tiosulfato. Las protefnas del sistema de transporte de sulfato/tiosulfato se encuentran codificadas por el complejo genico cysPTWAM (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-137369, patente europea n° 1528108).

La capacidad de produccion de L-cistefna de una bacteria tambien puede mejorarse mediante el incremento de la expresion del gen yeaS (patente europea abierta al publico n° 1016710).

Entre los ejemplos especfficos de bacterias productoras de L-cistefna se incluyen de manera no limitativa cepas pertenecientes al genero Escherichia, tal como la cepa E. coli JM15 transformada con multiples tipos de alelos de cysE codificantes de serina acetiltransferasa (SAT) resistente a la inhibicion por retroalimentacion (patente US n° 6.218.168), la cepa E. coli W3110 con un gen sobreexpresado codificante de una protefna adecuada para la secrecion de una sustancia citotoxica (patente US n° 5.972.663), la cepa de E. coli en la que se encuentra reducida la actividad de la cistefna desulfhidrasa (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 11-155571) y la

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cepa E. coli W3310 en la que la actividad del factor de control transcripcional positivo del regulon cistefna codificado por el gen cysB se encuentra incrementada (documento n° WO01/27307), E. coli que presenta el plasmido pACYC-DES (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-137369 (solicitud publicada de patente uS n° 20050124049 (A1), patente europea abierta al publico n° 1528108 (A1)) que contiene el gen ydeD, un gen cysE mutante y un gen serA5 mutante, y otros. El pACYC-DES es un plasmido obtenido mediante la insercion de los tres tipos anteriormente indicados de genes en pACYC184 y la expresion de cada uno de los genes se encuentra controlada por el promotor PompA.

Como protefnas que presentan actividad de cistefna desulfhidrasa de E. coli, se conoce la cistationfn-p-liasa (producto de metC, patente japonesa abierta al publico n° 11-155571, Chandra et al., Biochemistry 21:30643069, 1982), triptofanasa (producto de tnA, patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2003-169668; Austin Newton et al., J. Biol. Chem. 240:1211-1218, 1965), O-acetilserina sulfhidrilasa B (producto del gen cysM, patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-245311) y el producto del gen malY (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-245311). Mediante la reduccion de las actividades de dichas protefnas, se mejora la capacidad de produccion de L-cistefna.

En la presente invencion, la bacteria productora de L-cistefna preferentemente presenta una SAT mutante que es resistente a la inhibicion por retroalimentacion. Como SAT mutante que deriva de Escherichia coli y es resistente a la inhibicion por retroalimentacion, se conoce especfficamente la SAT mutante en la que el residuo metionina en la posicion 256 ha sido sustituido por un residuo de glutamato (patente japonesa abierta al publico n° 11155571), la SAT mutante en la que el residuo metionina en la posicion 256 se ha sustituido por un residuo de glutamato (patente japonesa abierta al publico n° 11-155571), la SAT mutante en la que el residuo de metionina en la posicion 256 se ha sustituido por un residuo de isoleucina (Denk D. y Boeck A., J. General Microbiol. 133:515-525, 198), la SAT mutante que presenta una mutacion en la region entre el residuo aminoacido en la posicion 97 y el residuo aminoacido en la posicion 273 o la eliminacion de la region C-terminal entre el residuo aminoacido en la posicion 227 (publicacion de patente internacional n° WO97/15673, patente US n° 6.218.168), la SAT mutante en la que la secuencia de aminoacidos correspondiente a las posiciones 89 a 96 de la SAT de tipo salvaje contiene una o mas mutaciones y que se encuentra desensibilizada frente a la inhibicion por retroalimentacion por L-cistefna (solicitud publicada de patente US n° 20050112731 (A1)), la SAT mutante en la que el residuo de Val y el residuo de Asp en las posiciones 95 y 96 de SAT han sido sustituidas por un residuo de Arg y un residuo de Pro, respectivamente (nombre del gen mutante: cysE5, documento n° WO2005/007841), la mutacion en la que el residuo de treonina en la posicion 167 ha sido sustituido por un residuo de alanina (patente US n° 6.218.168, solicitud publicada de patente US n° 20050112731 (A1)) y otros.

El gen de SAT no se encuentra limitado al gen de Escherichia coli y puede utilizarse cualquier gen codificante para una protefna que presenta actividad de SAT. Es conocido un isozima de SAT de Arabidopsis thaliana desensibilizado respecto a la inhibicion por retroalimentacion por la L-cistefna y tambien puede utilizarse el gen codificante de dicho isoenzima (FEMS Microbiol. Lett. 179:453-459, 1999).

En el caso de que se introduzca un gen codificante de una SAT mutante en una bacteria, se proporciona capacidad de produccion de L-cistefna.

Para introducir un gen en una bacteria, pueden utilizarse diversos vectores para la expresion habitual de las protefnas. Entre los ejemplos de dichos vectores se incluyen pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 y otros.

Con el fin de introducir un vector recombinante en una bacteria pueden utilizarse procedimientos utilizados habitualmente para la transformacion de bacterias, tales como el procedimiento de D.A. Morrison (Methods in Enzymnology 68:326, 1979), un procedimiento de tratamiento de celulas receptoras con cloruro de calcio para incrementar la permeabilidad de las celulas para el ADN (Mandel M. y Higa A., J. Mol. Biol. 53:159, 1970) y un procedimiento basado en la electroporacion.

Ademas, tambien puede incrementarse la actividad de una protefna, tal como SAT, mediante el incremento del numero de copia del gen codificante para la protefna. El numero de copia de un gen puede incrementarse mediante la introduccion del gen en una bacteria mediante la utilizacion de un vector tal como los indicados anteriormente, o mediante la introduccion de multiples copias del gen en el ADN cromosomico de una bacteria. Se introducen multiples copias del gen mediante recombinacion homologa utilizando una secuencia presente en el ADN cromosomico en un numero de copia multiple como diana. Puede utilizarse un ADN repetitivo o una repeticion invertida en los extremos de un trasposon como secuencia presente en un ADN cromosomico en un numero de copia multiple. Alternativamente, tal como se da a conocer en la patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2-109985, pueden introducirse multiples copias de un gen en un ADN cromosomico mediante la incorporacion de las mismas en un trasposon y transfiriendolo.

La capacidad de producir compuestos biosintetizados a partir de la L-cistefna como materia prima, tal como y- glutamilcistefna, glutation, cistationina, homocistefna, metionina y S-adenosilmetionina, tambien puede proporcionarse o potenciarse mediante el incremento de la actividad de un enzima de la ruta de biosfntesis de un

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compuesto objetivo, o mediante la reduccion de la actividad de un enzima de una ruta que se desvfe de la ruta de biosfntesis de un compuesto objetivo o un enzima que descomponga el compuesto objetivo.

Por ejemplo, la capacidad de producir Y-glutamilcistefna puede potenciarse mediante el incremento de la actividad de la Y-glutamilcistefna sintetasa y/o mediante la reduccion de la actividad de la glutation sintetasa. Ademas, la capacidad de producir glutation puede proporcionarse o potenciarse mediante el incremento de la actividad de la Y-glutamilcistefna sintetasa y/o de la actividad de glutation sintetasa. Ademas, mediante la utilizacion de una Y-glutamilcistefna sintetasa mutante resistente a la inhibicion por retroalimentacion por el glutation, puede incrementarse la capacidad de produccion de Y-glutamilcistefna o glutation. La produccion del glutation se describe en detalle en la revision de Li et al. (Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:233-242, 2004).

La capacidad de producir L-metionina puede proporcionarse o potenciarse mediante el incremento de la auxotroffa de L-treonina o de la resistencia a norleucina (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2000139471). En E. coli, los genes de los enzimas que participan en la biosfntesis de la L-treonina existen como operon treonina (thrABC) y una cepa auxotrofa para L-treonina que ha perdido la capacidad de biosfntesis para la L-homoserina y pueden obtenerse los compuestos siguientes, por ejemplo mediante la eliminacion de la fraccion thrBC. En una cepa resistente a la norleucina, se atenua la actividad de la S-adenosilmetionina sintetasa y se proporciona o se potencia la capacidad de produccion de L-metionina. En E. coli, la S-adenosilmetionina sintetasa se encuentra codificada por el gen metK. La capacidad de producir L-metionina tambien puede proporcionarse o potenciarse mediante la eliminacion del represor de metionina o mediante el incremento de la actividad de un enzima que participa en la biosfntesis de la L-metionina, tal como la homoserina trans- succinilasa, la cistationina Y-sintasa y la aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa II (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2000-139471). En E. coli, el represor de metionina se encuentra codificado por el gen metJ, la homoserina trans-succinilasa se encuentra codificada por el gen metA, la cistationina Y-sintasa se encuentra codificada por el gen metB y la aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa II se encuentra codificada por el gen metL. Ademas, mediante la utilizacion de una homoserina trans-succinilasa mutante resistente a la inhibicion por retroalimentacion por la L-metionina, tambien puede proporcionarse o potenciarse la capacidad de produccion de L-metionina (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2000-139471, la solicitud publicada de patente US n° 200090029424). Debido a que la L-metionina se biosintetiza pasando por la L-cistefna como producto intermedio, tambien puede mejorarse la capacidad de produccion de la L-metionina mediante la mejora de la capacidad de producir la L-cistefna (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2000-139471, la solicitud publicada de patente US n° 20080311632). Por lo tanto, para proporcionar o potenciar la capacidad de producir la L-metionina, tambien resulta eficaz proporcionar o potenciar la capacidad de producir L-cistefna.

Entre los ejemplos especfficos de bacterias productoras de L-metionina y las cepas parentales utilizadas para la construccion de las mismas se incluyen cepas de E. coli tales como AJ11539 (NRRL n° B-12399), AJ11540 (NRRL n° B-12400), AJ11541 (NRRL n° B-12401), AJ11542 (NRRL n° B-12402) (patente britanica n° 2075055), cepa 218 resistente a norleucina, que es un analogo de la L-metionina (VKPM B-8125, patente rusa n° 2209248) y cepa 73 (VKPM B-8126, patente rusa n° 2215782).

Ademas, como bacteria productora de L-metionina o como cepa parental utilizada para la construccion de la misma, tambien puede utilizarse AJ13425 derivada de E. coli W3110 (FERM n° P-16808, patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2000-139471). AJ13425 es una cepa auxotrofa para L-treonina en la que el represor de metionina se encuentra eliminado, la actividad intracelular de la S-adenosilmetionina sintetasa se encuentra atenuada y la actividad intracelular de la homoserina trans-succinilasa, la actividad de la cistationina Y-sintasa y la actividad de la aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa II se encuentran incrementadas. AJ13425 fue depositada el 14 de mayo de 1998 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (actualmente el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, deposito internacional de organismos de patente, direccion: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon) y se le ha asignado el numero de acceso de FERM n° P-16808.

Debido a que la cistationina y la homocistefna son productos intermedios de la ruta de biosfntesis de la L- metionina, resulta eficaz utilizar parcialmente los procedimientos anteriormente mencionados con el fin de incrementar la capacidad de produccion de la L-metionina e incrementar de esta manera las capacidades de produccion de dichas sustancias. Como procedimientos especfficos para incrementar la capacidad de producir cistationina, se conoce un procedimiento que utiliza una cepa mutante auxotrofa para metionina (solicitud de patente japonesa n° 2003-010654) y un procedimiento de adicion de cistefna (o materia prima para la biosfntesis de la misma) y/o homoserina (o materia prima para la biosfntesis de la misma) a un medio de fermentacion (patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-168422). Debido a que la homocistefna es producida mediante la utilizacion de cistationina como precursor, los procedimientos mencionados anteriormente para incrementar la capacidad de producir cistationina tambien resultan eficaces para incrementar la capacidad de produccion de homocistefna.

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Debido a que la L-metionina es un precursor de la S-adenosilmetionina, para incrementar la capacidad de produccion de S-adenosilmetionina, resulta eficaz utilizar parcialmente los procedimientos anteriormente indicados para incrementar la capacidad de produccion de L-metionina. Por ejemplo, puede proporcionarse o potenciarse la capacidad de producir S-adenosilmetionina potenciando la metionina adenosiltransferasa (patente europea abierta al publico n° 0647712 y N° 1457569) o potenciando el factor de secrecion MdfA (patente US n° 7.410.789).

La bacteria utilizada en la presente invencion puede obtenerse mediante la modificacion de dicha bacteria de Escherichia y que presenta la capacidad de produccion de L-cistefna tal como se ha indicado anteriormente de manera que se reduce la actividad de la protefna codificada por el gen yciW (en adelante tambien denominada "YciW"). Alternativamente, tras modificar la bacteria de manera que se reduce la actividad de la protefna YciW, puede proporcionarse la capacidad de producir L-cistefna.

El termino gen yciW es sinonimo de ECK1282 y JW5200.

La expresion "actividad de la protefna codificada por el gen yciW se encuentra reducida" se refiere a que la actividad de la protefna YciW codificada por el gen yciW se encuentra reducida en comparacion con la de una cepa no modificada, tal como una cepa de tipo salvaje o una cepa parental, e incluye el caso en que la actividad ha desaparecido por completo.

Dicha modificacion para reducir la actividad de la protefna YciW se consigue mediante, por ejemplo, la reduccion de la expresion del gen yciW. Especfficamente, por ejemplo, puede reducirse la actividad intracelular de la protefna mediante la eliminacion de una parte o la totalidad de la region codificante del gen yciW en un cromosoma. La actividad de la protefna YciW tambien puede reducirse mediante la reduccion de la expresion del gen yciW modificando una secuencia de control de la expresion, tal como la secuencia del promotor y la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) del gen yciW, y similares. Ademas, el nivel de expresion del gen tambien puede reducirse mediante la modificacion de una region no traducida diferente de la secuencia de control de la expresion. Ademas, puede eliminarse el gen entero que incluye las secuencias presentes en ambos lados del gen en un cromosoma. Adicionalmente, tambien puede conseguirse mediante la introduccion de una sustitucion de aminoacido (mutacion de sentido incorrecto (“missense”)), un codon de parada (mutacion sin sentido (“nonsense”)) o una mutacion por desplazamiento de marco que anade o elimina uno o dos nucleotidos, en la region codificante del gen yciW en un cromosoma (Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617, 1997; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95:5511-5515, 1998; Journal of Biological Chemistry 266:20833-20839, 1991). Ademas, la expresion del gen tambien puede reducirse mediante la manipulacion de un factor que participa en el control de la expresion (moleculas pequenas que participan en el control transcripcional o traduccional (inductor, inhibidor, etc.), protefnas (factor transcripcional, etc.), acidos nucleicos (ARNs, etc.) y similares).

Ademas, la modificacion puede ser una modificacion provocada mediante mutagenesis convencional basada en rayos X o irradiacion ultravioleta o en la utilizacion de un mutageno, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, con la condicion de que sea una modificacion que reduzca la actividad de la protefna YciW.

Se lleva a cabo una modificacion de una secuencia de control de la expresion para preferentemente uno o mas nucleotidos, mas preferentemente dos o mas nucleotidos, particularmente preferentemente tres o mas nucleotidos. Al eliminar una region codificante, la region que debe eliminarse puede ser cualquiera de entre una region N-terminal, una region interna o una region C-terminal, o incluso puede ser la region codificante entera, con la condicion de que la funcion de la protefna YciW resulte reducida o anulada. La eliminacion de una region mas larga habitualmente puede inactivar con mas seguridad un gen. Ademas, resulta preferido que los marcos de lectura situados cadena arriba y cadena abajo de la region que debe eliminarse no sean iguales.

Ademas, tambien puede llevarse a cabo una modificacion para reducir la actividad de la protefna YciW mediante la insercion de otra secuencia en la region codificante del gen yciW. Al insertar otra secuencia en la region codificante del gen yciW, dicha secuencia puede insertarse en cualquier region del gen y la insercion de una secuencia mas larga puede inactivar con mas seguridad el gen. Resulta preferido que los marcos de lectura situados cadena arriba y cadena abajo del sitio de insercion no sean iguales. La otra secuencia no se encuentra particularmente limitada con la condicion de que se seleccione una secuencia la insercion de la cual reduzca o anule la funcion de la protefna YciW, y entre los ejemplos se incluyen un trasposon portador de un gen de resistencia a antibioticos o un gen util para la produccion de L-cistefna, y similares.

El gen yciW en el cromosoma puede modificarse tal como se ha mencionado anteriormente mediante, por ejemplo, la preparacion de un gen de tipo eliminacion en el que se elimina una secuencia parcial del gen de manera que el gen de tipo eliminacion no produzca la protefna YciW que funciona normalmente y transformar una bacteria con un ADN que contiene el gen de tipo eliminacion para causar la recombinacion homologa entre el gen de tipo eliminacion y el gen en el cromosoma, y sustituir de esta manera el gen de tipo eliminacion para el gen en el cromosoma. La protefna YciW codificada por el gen de tipo eliminacion presenta una conformacion diferente de la de la protefna de tipo salvaje, si se produce en absoluto, y de esta manera se reduce o se anula la

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funcion. Dicha disrupcion genica basada en la sustitucion genica mediante recombinacion homologa ya es un procedimiento establecido y existe un procedimiento denominado "integracion controlada por Red" (Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645, 2000), un procedimiento que utiliza un ADN lineal, tal como un procedimiento que utiliza la integracion controlada por Red en combinacion con un sistema de extraccion derivado del fago A (Cho E.H., Gumport R.I., Gardner J.F, J. Bacteriol. 184:5200-5203, 2002) (ver el documento n° WO2005/010175), un procedimiento que utiliza un plasmido que contiene un origen de replicacion sensible a la temperatura, un procedimiento que utiliza un plasmido susceptible de transferencia por conjugacion, un procedimiento que utiliza un vector suicida que no presenta origen de replicacion en un huesped (patente US n° 6.303.383, patente japonesa abierta al publico n° 05-007491) y similares.

La reduccion de la cantidad de transcripcion del gen yciW puede confirmarse mediante la comparacion de la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen con la observada en una cepa de tipo salvaje o una cepa no modificada. Entre los ejemplos del procedimiento para evaluar la cantidad de ARNm se incluyen la hibridacion northern, la RT-PCR (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001) y similares.

La reduccion de la cantidad de protefna YciW puede confirmarse mediante transferencia western utilizando anticuerpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001).

El gen yciW de la cepa Escherichia coli K12 corresponde a una secuencia complementaria de la secuencia en las posiciones 1347004 a 1348131 en la secuencia genomica registrada en la base de datos de NCBI como acceso de GenBank n° NC_000913 (version NC_000913.2 GI: 49175990). Ademas, la protefna YciW esta registrada como GenBank n° de acceso NP_415803 (version NP_415803.2 GI: 90111242, locus_tag="b1287"). La secuencia de nucleotidos que contiene el gen yciW y 300 pb de regiones cadena arriba y cadena abajo del mismo, y la secuencia de aminoacidos codificada por dicho gen se muestran en SEC ID n° 1 y n° 2, respectivamente.

Debido a que la secuencia de nucleotidos del gen yciW puede diferir segun el genero, especie o cepa a la que pertenezca la bacteria, el gen yciW que debe modificarse puede ser una variante de la secuencia de nucleotidos en las posiciones 301 a 1.428 de la secuencia de nucleotidos de SEC ID n° 1. Puede buscarse una variante del gen yciW mediante la utilizacion de BLAST (
http://blast.genome.jp/) o similar haciendo referencia a la secuencia de nucleotidos de SEC ID n° 1. Ademas, la variante del gen yciW incluye homologos del gen, tal como genes que pueden amplificarse mediante PCR utilizando, por ejemplo, un cromosoma de dicho microorganismo, tal como como una bacteria perteneciente a la familia de las enterobacteriaceas o bacterias corineformes, a modo de molde y oligonucleotidos sinteticos preparados basandose en la secuencia de nucleotidos de SEC ID n° 1.

Entre los ejemplos de los homologos del gen yciW de bacterias diferentes de Escherichia coli se incluyen los genes yciW de las bacterias siguientes. En la Tabla 1, la identidad (%) indica la identidad entre la protefna YciW de la cepa Escherichia coli K12 y el homologo de cada bacteria determinada por BLAST. Los numeros de acceso son los numeros de acceso de la base de datos NCBI.

[Tabla 1]

Cepa: Observacion Identidad (%) Numero de acceso

Shigella dysenteriae 1012: protefna hipotetica conservada 96 ZP 03066078

Shigella flexneri 2a str. 2457T: oxidorreductasa conservada 96 NP 836979

Shigella boydii CDC 3083-94: protefna hipotetica 94 YP 001880125

Shigella boydii Sb227: oxidorreductasa putativa 94 YP 408203

Escherichia albertii TW07627: oxidorreductasa putativa 77 ZP 02903357

Citrobacter koseri ATCC BAA-895: protefna hipotetica 60 YP 001452946

Citrobacter youngae ATCC 29220: protefna hipotetica 58 Z 03836971

Citrobacter sp. 30 2: protefna hipotetica conservada 57 ZP 04562177

Escherichia fergusonii ATCC 35469: amidasa o amidotransferasa putativa 54 YP_002382809

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Tennessee str. CDC07-0191: protefna hipotetica 53 ZP_04655747

Klebsiella pneumoniae: protefna hipotetica 54 YP 002238976

Cronobacter turicensis: protefna no caracterizada 48 YP 003210691

Enterobacter sakazakii ATCC BAA- 894: protefna hipotetica 47 YP 001437680

Enterobacter sp. 638: oxidorreductasa putativa 46 YP 001176905

Salmonella typhimurium LT2: protefna citoplasmatica putativa 50 NP 460660

Pantoea sp. At-9b: protefna hipotetica conservada 41 ZP 05729283

Erwinia pyrifoliae Ep1/96: protefna hipotetica 39 YP 002648706

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Erwinia tasmaniensis Et1/99: protefna hipotetica conservada 40 YP 001907570

Yersinia intermedia ATCC 29909: protefna hipotetica 38 ZP 04635903

Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081: protefna hipotetica 36 YP_001006371

Serratia proteamaculans 568: enzima relacionado con peroxidasa no caracterizado 37 YP_001478863

Yersinia pseudotuberculosis YPIII: protefna hipotetica 34 YP 001720631

Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1: peroxidasa no caracterizada- enzima no relacionado 28 YP_972817

El gen yciW tambien puede ser un gen codificante para una protefna que presenta la secuencia de aminoacidos de la protefna YciW tal como se ha mencionado anteriormente, pero que incluye la sustitucion, eliminacion, insercion, adicion o similar de uno o varios residuos aminoacidos en una o varias posiciones, con la condicion de que codifique una protefna, la reduccion de la actividad de la cual en la bacteria resulta en la mejora de la capacidad de produccion de L-cistefna. Aunque el numero al que hace referencia la expresion "uno o varios" puede diferir segun las posiciones de los residuos aminoacidos en la estructura tridimensional de la protefna o los tipos de los residuos aminoacidos, especfficamente preferentemente es de entre 1 y 20, mas preferentemente de entre 1 y 10, todavfa mas preferentemente de entre 1 y 5. La sustitucion, eliminacion, insercion o adicion anteriormente indicadas de uno o varios residuos aminoacidos es una mutacion conservadora que mantiene la funcion normal de la protefna. La mutacion conservadora tfpicamente es una sustitucion conservadora. La sustitucion conservadora es una mutacion en la que la sustitucion tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, en el caso de que el sitio de sustitucion sea de un aminoacido aromatico; de entre Leu, Ile y Val, en el caso de que sea un aminoacido hidrofobo; de entre Gln y Asn, en el caso de que sea un aminoacido polar; de entre Lys, Arg e His, en el caso de que sea un aminoacido basico; de entre Asp y Glu, en el caso de que sea un aminoacido acido, y de entre Ser y Thr, en el caso de que sea un aminoacido con grupo hidroxilo. Entre los ejemplos especfficos de sustituciones conservadoras se incluyen: la sustitucion de Ser o Thr por Ala; la sustitucion de Gln, His o Lys por Arg; la sustitucion de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn; la sustitucion de Asn, Glu o Gln por Asp; la sustitucion de Ser o Ala por Cys; la sustitucion de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln; la sustitucion de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu; la sustitucion de Pro por Gly; la sustitucion de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His; la sustitucion de Leu, Met, Val o Phe por Ile; la sustitucion de Ile, Met, Val o Phe por Leu; la sustitucion de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys; la sustitucion de Ile, Leu, Val o Phe por Met; la sustitucion de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe; la sustitucion de Thr o Ala por Ser; la sustitucion de Ser o Ala por Thr; la sustitucion de Phe o Tyr por Trp; la sustitucion de His, Phe o Trp por Tyr, y la sustitucion de Met, Ile o Leu por Val. La sustitucion, eliminacion, insercion, adicion, inversion, etc. de aminoacidos anteriormente indicados pueden ser el resultado de una mutacion natural (mutante o variante) debida a una diferencia individual, una diferencia de especie o similar de una bacteria a partir de la que se deriva el gen.

Ademas, el gen que presenta dicha mutacion conservadora tal como se ha indicado anteriormente puede ser un gen codificante para una protefna que muestra una homologfa de 80% o superior, preferentemente de 90% o superior, mas preferentemente de 95% o superior, todavfa mas preferentemente de 97% o superior, particularmente preferentemente de 99% o superior, respecto a la secuencia total de aminoacidos de la protefna codificada y que presenta una funcion equivalente a la de la protefna YciW de tipo salvaje. En la presente memoria, "homologfa" puede referirse a "identidad".

Ademas, el gen yciW puede ser un ADN que puede hibridarse con una sonda que puede prepararse a partir de una secuencia genica conocida, tal como la secuencia genica anteriormente indicada o una secuencia complementaria a la misma, bajo condiciones restrictivas, y que codifica una protefna que presenta una funcion equivalente a la de la protefna YciW. Las "condiciones restrictivas" se refieren a condiciones bajo las que se forma un denominado hfbrido especffico y no se forma un hfbrido no especffico. Entre los ejemplos de las condiciones restrictivas se incluyen aquellas bajo las que se hibridan ADN altamente homologos entre sf, por ejemplo ADN con homologfa no inferior a 80%, preferentemente con homologfa no inferior a 90%, mas preferentemente homologfa no inferior a 95%, todavfa mas preferentemente homologfa no inferior a 97%, particularmente preferentemente homologfa no inferior a 99%, se hibridan entre sf, y los ADN con menor homologfa que la indicada anteriormente no se hibridan entre sf, o condiciones de lavado de la hibridacion southern tfpica, es decir, condiciones de lavado una vez, preferentemente 2 o 3 veces, a una concentracion salina y a una temperatura correspondientes a 1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, preferentemente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, mas preferentemente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°C.

La sonda puede ser una parte de una secuencia complementaria al gen. Dicha sonda puede prepararse mediante PCR utilizando oligonucleotidos preparados basandose en una secuencia genica conocida como cebadores y un fragmento de ADN que contiene la secuencia de nucleotidos como molde. Por ejemplo, en el caso de que se utilice un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 300 pb como la sonda, las condiciones de lavado de la hibridacion pueden ser, por ejemplo, de 50°C, 2 x SSC y 0,1% de SDS.

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La explicacion anteriormente indicada de las variantes de los genes y protefnas tambien se aplican de manera similar a enzimas tales como la serina acetiltransferasa y la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa y la protefna YdeD, asf como a los genes codificantes de las mismas.

<2> procedimiento para producir L-cistefna, L-cistina, derivado de las mismas, o mezcla de las mismas segun la presente invencion

Mediante el cultivo de la bacteria utilizada en la presente invencion obtenida tal como se ha mencionado anteriormente en un medio y recolectando L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas a partir del medio, pueden producirse dichos compuestos. Entre los ejemplos del derivado de L-cistefna se incluyen S-sulfocistefna, derivados de tiazolidina, hemitiocetales correspondientes a los derivados tiazolidina y similares, tal como se ha mencionado anteriormente. La Y-glutamilcistefna, glutation, cistationina, homocistefna, metionina, S-adenosilmetionina, y similares, los cuales se biosintetizan a partir de L-cistefna como material de partida, tambien pueden producirse de una manera similar.

Como medio para la utilizacion, pueden indicarse medios ordinarios que contienen una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno, una fuente de azufre, iones inorganicos y otros componentes organicos segun se requieran.

Como fuente de carbono, pueden utilizarse sacaridos, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melaza e hidrolizado de almidon, y acidos organicos, tales como acido fumarico, acido cftrico y acido succfnico.

Como fuente de nitrogeno, pueden utilizarse sales amonicas inorganicas, tales como sulfato amonico, cloruro amonico y fosfato amonico, nitrogeno organico, tal como hidrolizado de soja, gas amonio, amonio acuoso y similares.

Como fuente de azufre, pueden indicarse compuestos de azufre inorganico, tales como sulfatos, sulfitos, sulfuros, hiposulfitos y tiosulfatos.

Como nutrientes traza organicos, resulta deseable anadir sustancias requeridas, tales como vitamina B1, extracto de levadura y otros en cantidades apropiadas. Ademas de ellos, se anaden fosfato de potasio, sulfato de magnesio, iones hierro, iones manganeso y similares en cantidades pequenas, segun se requiera.

El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo condiciones aerobicas durante 30 a 90 horas. La temperatura del cultivo preferentemente se controla para que sea de entre 25°C y 37°C, y el pH preferentemente se controla a un valor de entre 5 y 8 durante el cultivo. Para ajustar el pH, pueden utilizarse sustancias acidas inorganicas u organicas o alcalinas, gas amonio y similares. La recoleccion de L-cistefna a partir del caldo de cultivo puede llevarse a cabo mediante una combinacion de un procedimiento ordinario de resina de intercambio ionico, la precipitacion y otros procedimientos conocidos.

La L-cistefna obtenida tal como se ha mencionado anteriormente puede utilizarse para la produccion de derivados de L-cistefna. Entre los derivados de L-cistefna se incluyen metilcistefna, etilcistefna, carbocistefna, sulfocistefna, acetilcistefna y similares.

Ademas, al acumular en el medio un derivado tiazolidina de la L-cistefna, puede producirse L-cistefna mediante la recoleccion del derivado tiazolidina a partir del medio y rompiendo el equilibrio de reaccion entre el derivado tiazolidina y la L-cistefna de manera que se produce en exceso la L-cistefna.

Ademas, al acumular la S-sulfocistefna en el medio, puede convertirse en L-cistefna mediante reduccion utilizando un agente reductor, tal como ditiotreitol.

Ejemplo

En adelante en la presente memoria, la presente invencion se explica mas especfficamente haciendo referencia a un ejemplo.

(1) Construccion de una cepa deficiente en el gen yciW

La eliminacion del gen yciW se llevo a cabo mediante el procedimiento denominado "Integracion controlada por Red", desarrollado por primera vez por Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):6640-6645, 2000). Segun el procedimiento de "Integracion controlada por Red", mediante la utilizacion de un producto de PCR obtenido con oligonucleotidos sinteticos disenados para que una parte del gen diana se encuentre presente en el extremo 5', y una parte del gen de resistencia a antibiotico se encuentre presente en el extremo 3', respectivamente, como cebadores, puede construirse en una etapa una cepa con disrupcion genica. Un procedimiento para eliminar un gen de E. coli utilizando dicha "Integracion controlada por Red" y el sistema de extraccion derivado del fago A se describe en detalle en la patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-

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058227 (solicitud publicada de patente US n° 2006154344), documento n° WO2007/119880A1, y similares. Se obtuvo una cepa deficiente en el gen yciW mediante el mismo procedimiento que dichos procedimientos.

Se obtuvo mediante PCR un fragmento de ADN que comprendfa secuencias homologas de los dos extremos del gen yciW y un gen de resistencia a antibioticos (gen de resistencia a la canamicina (Kmr)) entre ellas. Los procedimientos y materiales experimentales especfficos son los mismos que los indicados en la patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005-058227 (solicitud publicada de patente US n° 2006154344) excepto en que se utilizaron como cebadores DyciWec-FW (SEC ID n° 3,

AT GGAACAACGCCACAT CACCGGCAAAAGCCACT GGT ATCAT GAAACGCAT GAAGCCTGCTTTTTT AT ACT AA GTTGGCA) y DyciWec-RV (SEC ID n° 4,

CCCATTGGTTAATTTCATTTTCGCCCTTGCGCATAAGGGTGCTGATTTTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCT GAACGA) y un como molde se utilizo un fragmento de ADN que contenfa la secuencia AattL-Km-AattR derivada de pMW118-(AattL-Kmr-AattR) (documento n° WO2006/093322A2).

Mediante dicho procedimiento, se obtuvo una cepa deficiente en gen yciW, MG1655AyciW::Kmr, a partir de E. coli MG1655 (ATCC n° 47076).

Ademas, el gen Kmr incorporado en la cepa con disrupcion del gen yciW puede eliminarse mediante la utilizacion del sistema de extraccion derivado del fago A.

(2) Construccion de bacteria productora de L-cistefna

pACYC-DES, un plasmido individual en el que se habfa integrado un cysE mutante codificante para una serina acetiltransferasa mutante en la que se encontraba reducida la inhibicion por retroalimentacion por L-cistefna (solicitud publicada de patente US n° 20050112731 (A1)), el gen ydeD codificante de un factor de secrecion de la L-cistefna (patente US n° 5.972.663) y un gen serA mutante codificante de una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa en la que se encontraba reducida la inhibicion por retroalimentacion por la L-serina (patente US n° 6.180.373), se introdujo en la cepa E. coli MG1655 y en las cepas MG1655DyciW::Kmr. En la serina acetiltransferasa mutante anteriormente indicada, se sustituyo el residuo de treonina en la posicion 167 por un residuo de alanina. Ademas, en la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa anteriormente indicada, el residuo de tirosina en la posicion 410 se habfa eliminado. La construccion de pACYC-DES se describe en la patente japonesa abierta al publico (Kokai) n° 2005137369 (solicitud publicada de patente US n° 20050124049(A1), patente europea abierta al publico n° 1528108(A1)).

(3) Cultivo de produccion de L-cistefna

Con el fin de investigar el efecto de la eliminacion del gen yciW sobre la produccion de L-cistefna y compuestos relacionados con la L-cistefna mediante fermentacion, se cultivaron las bacterias E. coli productoras de L-cistefna anteriormente indicadas, MG1655/pACYC-DES y MG1655DyciW::Kmr/pACYC-DES (deficiente en yciW) para la produccion mediante fermentacion y se compararon las cantidades producidas de L-cistefna y de compuestos relacionados con la L-cistefna. Para el cultivo, se utilizo un medio de produccion de cistefna que presentaba la composicion siguiente. Como fuente de azufre para la produccion de L-cistefna, se utilizo sulfato (sulfato amonico) y tiosulfato (tiosulfato sodico). El cultivo con solo el sulfato se llevo a cabo sin anadir el componente 6 (tiosulfato sodico) indicado en la composicion de medio siguiente. Ademas, el cultivo con tiosulfato se llevo a cabo mediante la utilizacion de la totalidad de los componentes de medio siguientes.

[Medio de produccion de L-cistefna] (las concentraciones de los componentes son concentraciones finales)

Componentes 1:

(NH4)2SO4: 15 g/l

KH2PO4: 1,5 g/l

MgSO4 ■ 7H2O: 1 g/l

Hidrocloruro de tiamina: 0,1 mg/l

Componentes 2:

FeSO4 ■ 7H2O: 1,7 mg/l

Na2MoO4 ■ 2H2O: 0,15 mg/l

CoCl2 ■ 6H2O: 0,7 mg/l

MnCl ■ 4H2O: 1,6 mg/l

ZnSO4■7H2O: 0,3 mg/l

CuSO4 ■ 5H2O: 0,25 mg/l

Componentes 3:

Triptona: 0,6 g/l

Extracto de levadura: 0,3 g/l

NaCl: 0,6 g/l

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Componente 4:

Carbonato de calcio 20 g/l

Componente 5:

Monohidrato de hidrocloruro de L-histidina 135 mg/l

Componente 6:

Tiosulfato sodico 4 g/l

Componente 7:

Hidrocloruro de piridoxina 2 mg/l

Componente 8:

Glucosa 40 g/l

Para dichos componentes se prepararon soluciones madre de concentracion de 10 veces (componentes 1), de concentracion de 1.000 veces (componentes 2), de concentracion de 100/6 veces (componentes 3), de concentracion de 100 veces (componente 5), de concentracion de 350/4 veces (componente 6), de concentracion de 1.000 veces (componente 7) y de concentracion de 10 veces (componente 8), se mezclaron en el momento de utilizarlos y se obtuvo el volumen definido con agua esterilizada para conseguir las concentraciones finales. Se llevo a cabo la esterilizacion mediante autoclave a 110°C durante 30 minutos (componentes 1, 2, 3, 5 y 8), esterilizacion con calor seco a 180°C durante 5 horas o mas (componente 4) o la esterilizacion mediante filtracion (componentes 6 y 7).

El cultivo de produccion de L-cistefna se llevo a cabo de la manera siguiente. Cada cepa de produccion se extendio sobre el medio de LB-agar para llevar a cabo el precultivo de durante la noche a 37°C y despues las celulas correspondientes a aproximadamente 7 cm sobre la placa se rasparon con un asa de inoculacion de 10 pl (NUNC Blue Loop) tres veces (tres asas) y se inocularon en 2 ml del medio de produccion de L-cistefna contenido en una probeta grande (diametro interior: 23 mm, longitud: 20 cm) para igualar sustancialmente la cantidad de celulas de ambas cepas en el momento de inicio del cultivo. El cultivo se llevo a cabo a 32°C bajo agitacion y se termino tras 25 horas. Se cuantifico la L-cistefna (incluyendo compuestos relacionados con la L- cistefna) producida en el medio mediante el procedimiento descrito por Gaitonde M.K. (Biochem. J. 104(2):627- 33, agosto de 1967). El experimento se llevo a cabo por cuadruplicado para cada cepa y las cantidades de L- cistefna producidas (medias) y las desviaciones estandares, y los rendimientos de L-cistefna para la glucosa consumida se muestran en la Tabla 2. En la Tabla 2, cepa de tipo salvaje se refiere a la cepa MG1655/pACYC- DES y la cepa de eliminacion de yciW se refiere a la cepa MG1655DyciW:Kmr/pACYC-DEs. Se revelo que la eliminacion del gen yciW presento el efecto de incrementar la acumulacion de L-cistefna para ambas fuentes de azufre.

[Tabla 2]

Fuente de azufre: Cepa L-cistefna (g/l) Rendimiento para el azucar consumido (%)

Sulfato: Cepa de tipo salvaje 0,5 ± 0,02 1,4 ± 0,07

: Cepa de eliminacion de yciW 1,7 ± 0,04 5,0 ± 0,21

Sulfato y tiosulfato: Cepa de tipo salvaje 1,4 ± 0,05 3,9 ± 0,12

: Cepa de eliminacion de yciW 1,8 ± 0,37 5,7 ± 1,29

Listado de secuencias

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> Bacteria que produce L-cistefna y procedimiento para la produccion de L-cistefna

<130> D195-10202

<150> JP2009-272358 <151 > 2009-11-30

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 1728 <212> ADN <213> Escherichia coli 5

<220>

<221> CDS <222> (301) .. (1428)

10 <400> 1

agccgttacc ccgattcgcc gtaccgttac tattgaagat: gtgggtaact ctgcggcatt 60

cctgtgctcc gatctctctg ccggtatctc cggtgaagtg: gtccacgttg acggcggttt 120

cagcattgct gcaatgaacg aactcgaact gaaataatcg: ttctgttggt aaagatgggc 180

ggcgttctgc cgcccgttat ctctgttata cctttctgat: atttgttatc gccgatccgt 240

ctttctcccc ttcccgcctt gcgtcaggat aacgatttcc: tttacgacca aggagcgccc 300

atg: gaa caa ege cac ate acc ggc aaa age cac tgg tat cat gaa acg 348

Met: Glu Gin Arg His lie Thr Gly Lys Ser His Trp Tyr His Glu Thr

1: 5 10 15

caa: tcc agt act acg gag tat gac gtt ctg cct ctg gtc ccg gaa gcc 396

Gin: Ser Ser Thr Thr Glu Tyr Asp Val Leu Pro Leu Val Pro Glu Ala



: 20 25 30

gca: aag gtc age gat ccc ttt eta etc gac gtg ate ett gaa aaa gaa 444

Ala: Lys Val Ser Asp Pro Phe Leu Leu Asp Val He Leu Glu Lys Glu


: 35 40 45

acg: ctg gcc ccc ttc ett tea tgg ctg gac cct geg cgt gtt ett gca 492

Thr: Leu Ala Pro Phe Leu Ser Trp Leu Asp Pro Ala Arg Val Leu Ala

: 50 55 60

gtg: gat ttg ttc cct gac cag ett acc gtg acc cgt tea cag acc ttc 540

Val: Asp Leu Phe Pro Asp Gin Leu Thr Val Thr Arg Ser Gin Thr Phe

65: 70 75 80

acc: get tat gaa ege ttg teg acg gcc ctg acg gtt get cag gtt tgc 588

Thr: Ala Tyr Glu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Thr Val Ala Gin Val Cys




: 85 90 95

ggc: gtc cag egg tta tgt aac tac tat teg geg cga ett acg ccg etc 636

Gly: Val Gin Arg Leu Cys Asn Tyr Tyr Ser Ala Arg Leu Thr Pro Leu



: 100 105 110

ccc: ggg cct gat tec acc agg gaa agt aat cat egg ttg gca caa ate 684

Pro: Gly Pro Asp Ser Thr Arg Glu Ser Asn His Arg Leu Ala Gin lie


: 115 120 125

acg: caa tat gcc ege caa ctg get age teg cct tet att ate gac aac 732

Thr: Gin Tyr Ala Arg Gin Leu Ala Ser Ser Pro Ser lie lie Asp Asn

: 130 135 140

cga: teg ege cag cat ctg aat gac gtc ggt ett act gcc tgg gac tgt 780

Arg: Ser Arg Gin His Leu Asn Asp Val Gly Leu Thr Ala Trp Asp Cys

145: 150 155 160

gtg: ate att age caa ate att ggt ttt att ggc ttt cag geg egg aca 828

Val: He lie Ser Gin lie lie Gly Phe lie Gly Phe Gin Ala Arg Thr




: 165 170 175

att: geg aca ttt cag get tat etc ggg cat ccg gta ege tgg tta ccc 876

lie: Ala Thr Phe Gin Ala Tyr Leu Gly His Pro Val Arg Trp Leu Pro



: 180 185 190

ggg: ctg gag at a caa aac tac gee gac geg tea ctg ttt get gat gaa 924

Gly: Leu Glu lie Gin Asn Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Phe Ala Asp Glu


: 195 200 205

tea: tta ege tgg ega age age tat gag gtg gaa aaa eta cct gaa gag 972

Ser: Leu Arg Trp Arg Ser Ser Tyr Glu Val Glu Lys Leu Pro Glu Glu

: 210 215 220

cac: aca aaa agt tea act gca gaa ett tgc caa ctg gee gaa at a etc 1020

His: Thr Lys Ser Ser Thr Ala Glu Leu Cys Gin Leu Ala Glu lie Leu

225: 230 235 240

tet: etc cac cct att tea ett tee ett etc gaa aag ttg tta aac age 1068

Ser: Leu His Pro lie Ser Leu Ser Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asn Ser




: 245 250 255

aca: egg ggc aat aca cag ccg gat aat cag ett geg geg ttg tta tgc 1116

Thr: Arg Gly Asn Thr Gin Pro Asp Asn Gin Leu Ala Ala Leu Leu Cys



: 260 265 270

geg: cgt at a aat ggc agt cct get tgt ttt gee ace tgt atg gat tea 1164

Ala: Arg lie Asn Gly Ser Pro Ala Cys Phe Ala Thr Cys Met Asp Ser


: 275 280 285

tea: aat gaa tat aaa aaa ate age ace ett atg ege aag ggc gaa aat 1212

Ser: Asn Glu Tyr Lys Lys lie Ser Thr Leu Met Arg Lys Gly Glu Asn

: 290 295 300

gaa: att aac caa tgg get gac cgt cat tet gtt gag ege get acc gtt 1260

Glu: lie Asn Gin Trp Ala Asp Arg His Ser Val Glu Arg Ala Thr Val

305: 310 315 320

cag: geg at a caa tgg ctg ace ega gca ccc gat ege ttt age gee gee 1308

Gin: Ala lie Gin Trp Leu Thr Arg Ala Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ala




: 325 330 335

cag: ttc age cct tta etc gaa cac gaa aaa tea tea aeg cag att att 1356

Gin: Phe Ser Pro Leu Leu Glu His Glu Lys Ser Ser Thr Gin lie lie



: 340 345 350

aat: ctg ctg gta tgg age ggg ctg tgt ggc tgg at a aat ege tta aaa 1404

Asn: Leu Leu Val Trp Ser Gly Leu Cys Gly Trp lie Asn Arg Leu Lys


: 355 360 365

ate: geg ttg ggt gag aca tat taa ccttgccgcg tcagacagat tcgcgtaaaa 1458

lie: Ala Leu Gly Glu Thr Tyr

: 370 375

ctgtcagccg ctctaatggc caccaaaata gacaattatg: tttcaggaca acccgctgct 1518

agcgcagctt aaacagcaac tgcattccca gacgccacgc: gctgaagggg tggtaaaagc 1578

cacagaaaaa ggctttggct tcctggaagt cgacgcgcaa: aaaagttatt tcattccgcc 1638

gccgcagatg aaaaaagtca tgcatggcga ccgaattatc: gcggtgatcc acagtgaaaa 1698

agaacgtgaa tccgcagagc cagaagaact: 1728

<210>2 <211> 375 5 <212> PRT

<213> Escherichia coli

<400>2

Met 1: Glu Gin Arg His 5 lie Thr Gly

Gin: Ser Ser Thr 20 Thr Glu Tyr Asp

Ala: Lys Val 35 Ser Asp Pro Phe Leu 40

Thr: Leu 50 Ala Pro Phe Leu Ser 55 Trp

Val 65: Asp Leu Phe Pro Asp 70 Gin Leu

Thr: Ala Tyr Glu Arg 85 Leu Ser
Thr

Gly: Val Gin Arg Leu Cys Asn Tyr

Lys: Ser 10 His Trp Tyr His Glu 15 Thr

Val 25: Leu Pro Leu Val Pro 30 Glu Ala

Leu: Asp Val lie Leu 45 Glu Lys Glu

Leu: Asp Pro Ala 60 Arg Val Leu Ala

Thr: Val Thr 75 Arg Ser Gin Thr Phe 80

Ala: Leu 90 Thr Val Ala Gin Val 95 Cys

Tyr: Ser Ala Arg Leu Thr Pro Leu

5

10

15

20

25



: 100

Pro: Gly Pro 115 Asp

Thr: Gin 130 Tyr Ala

Arg 145: Ser Arg Gin

Val: He He Ser

lie: Ala Thr Phe 180

Gly: Leu Glu 195 lie

Ser: Leu 210 Arg Trp

His 225: Thr Lys Ser

Ser: Leu His Pro

Thr: Arg Gly Asn 260

Ala: Arg He 275 Asn

Ser: Asn 290 Glu Tyr

Glu 305: He Asn Gin

Gin: Ala He
Gin

Gin: Phe Ser Pro 340

Asn: Leu Leu 355 Val

lie: Ala 370 Leu Gly

Ser: Thr Arg Glu 120

Arg: Gin Leu 135 Ala

His: Leu 150 Asn Asp

Gin 165: lie lie Gly

Gin: Ala Tyr Leu

Gin: Asn Tyr Ala 200

Arg: Ser Ser 215 Tyr

Ser: Thr 230 Ala Glu

lie 245: Ser Leu Ser

Thr: Gin Pro Asp

Gly: Ser Pro Ala 280

Lys
Lys: lie 295 Ser

Trp: Ala 310 Asp Arg

Trp 325: Leu Thr Arg

Leu
Leu: Glu His

Trp: Ser Gly Leu 360

Glu: Thr Tyr 375

105 Ser: Asn His Arg

Ser
Ser: Pro
Ser

Val: Gly Leu 140 Thr

Phe: lie 155 Gly
Phe

Gly: 170 His Pro Val

185 Asp: Ala Ser Leu

Glu: Val Glu Lys

Leu: Cys Gin 220 Leu

Leu
Leu: 235 Glu Lys

Asn: 250 Gin Leu Ala

265 Cys: Phe Ala Thr

Thr: Leu Met Arg

His: Ser Val 300 Glu

Ala: Pro 315 Asp Arg

Glu: 330 Lys Ser Ser

345 Cys: Gly Trp He

: 110

Leu 125: Ala Gin lie

lie
lie: Asp Asn

Ala: Trp Asp Cys 160

Gin: Ala Arg 175 Thr

Arg: Trp 190 Leu Pro

Phe 205: Ala Asp Glu

Leu: Pro Glu Glu

Ala: Glu lie Leu 240

Leu
Leu: Asn 255 Ser

Ala: Leu 270 Leu Cys

Cys 285: Met Asp Ser

Lys: Gly Glu Asn

Arg: Ala Thr Val 320

Phe: Ser Ala 335 Ala

Thr: Gin 350 lie lie

Asn 365: Arg Leu Lys

<210>3 <211> 80 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador DyciWec-FW <400>3

atggaacaac gccacatcac cggcaaaagc cactggtatc atgaaacgca tgaagcctgc 60

ttttttatac taagttggca 80

<210>4 <211> 80 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador DyciWec-RV <400> 4

cccattggtt aatttcattt tcgcccttgc gcataagggt gctgattttt cgctcaagtt 60

agtataaaaa agctgaacga 80

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para producir L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas, que comprende cultivar una bacteria Escherichia en un medio y recoger L-cistefna, L-cistina, un derivado de las mismas, o una mezcla de las mismas a partir del medio, en el que la bacteria presenta una capacidad de produccion de L-cistefna y es modificada de manera que es reducida la actividad de una protefna codificada por el gen yciW reduciendo la cantidad de expresion del gen yciW o mediante la disrupcion del gen.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la protefna es una protefna definida en los (A) o (B) siguientes:

(A) una protefna que comprende la secuencia de aminoacidos representada en SEC ID n°: 2,

(B) una protefna que comprende la secuencia de aminoacidos representada en SEC ID n°: 2, pero que incluye una sustitucion, eliminacion, insercion o adicion de uno o varios residuos aminoacidos, la reduccion de la actividad de la cual en la bacteria da como resultado la mejora en la capacidad de produccion de L- cistefna.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el gen yciW es un ADN definido en los (a) o (b) siguientes:

(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de las posiciones 301 a 1.428 en la secuencia de nucleotidos de SEC iD n°: 1,

(b) un ADN hibridable con una secuencia complementaria de la secuencia de nucleotidos de las posiciones 301 a 1.428 en la secuencia de nucleotidos de SEC ID n°: 1 o con una sonda que puede prepararse a partir de dicha secuencia complementaria, bajo condiciones restrictivas que comprenden lavar a una concentracion de sal y temperatura correspondientes a 1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C y codificar una protefna, cuya reduccion de actividad en una bacteria da como resultado la mejora de la capacidad de produccion de L- cistefna.
4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria comprende ademas por lo menos una de las caracterfsticas siguientes:

i) es modificada de manera que la actividad de la serina acetiltransferasa es aumentada,

ii) es modificada de manera que la expresion del gen ydeD es aumentada,

iii) es modificada de manera que la actividad de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa es aumentada.
5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la bacteria es la Escherichia coli.
6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el derivado de la L-cistefna es un derivado de tiazolidina.