ES2646622T3 - Sistema y método de clasificación de materiales usando dirección de láser holográfica - Google Patents

Abstract

Un método de examen de células, que comprende: introducir una pluralidad de células (104) a través de un canal de entrada (301) dispuesto entre dos canales tamponadores (302, 303); hacer fluir solución tamponadora a través de dichos dos canales tamponadores (302, 303); mantener flujo laminar en dicho canal de entrada (301) y en dichos dos canales tamponadores (302, 303) en líneas paralelas de flujo; y examinar cada una de dicha pluralidad de células (104) en una región de interrogación de dicho canal de entrada (301), para determinar al menos una identidad química de cada una de dicha pluralidad de células (104) de acuerdo con un análisis de datos espectrales de cada una de dicha pluralidad de células (104); iluminar dicha pluralidad de células usando una fuente de iluminación de formación de imágenes; caracterizado porque dicha pluralidad de células son células de esperma portadoras de cromosoma X y de cromosoma Y y se usa un tinte para enlazar a ADN de cada una de dicha pluralidad de células de tal manera que una fluorescencia total presente es una medida de un ADN total presente; porque las células de esperma de cromosoma X se distinguen de las células de esperma de cromosoma Y en base a su fluorescencia; y porque dicha pluralidad de células de esperma se destruyen selectivamente en base a algún criterio predeterminado.

Description

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DESCRIPCION

Sistema y metodo de clasificacion de materiales usando direccion de laser holografica

La presente invencion reivindica la prioridad de las solicitudes de patente provisionales de EE.UU. n° 60/399.386, presentada el 31 de julio de 2002, y n° 60/435.541, presentada el 20 de diciembre de 2002.

Antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere a un aparato y un metodo de examen de celulas. En cuanto a tecnica anterior, vease pro ejemplo el documento WO 98/10267. En la industria estadounidense, existen gran cantidad de necesidades de clasificacion y separacion sin satisfacer relacionadas con materiales fabricados de particulas o unidades menores de 50 micrometros. Estas necesidades varian en las industrias desde el dimensionado de las particulas y la preparacion de muestras en los campos de la quimica especializada y los materiales, incluida la fabricacion de productos de nanotecnologia, hasta la seleccion y purificacion de proteinas en las industrias farmaceutica y biotecnologica. Otros ejemplos incluyen la clasificacion y seleccion de celulas, en los sectores de la medicina, el diagnostico y la agricultura.

Se puede observar la importancia de estas necesidades al examinar los gastos anuales en areas donde se han desarrollado soluciones especializadas o parciales, asi como al calcular el valor en el mercado de la produccion clasificada/separada/purificada en areas donde actualmente no existe ni siquiera una solucion parcial. Como ejemplo de lo anterior, las industrias biotecnologica y farmaceutica gastan anualmente una enorme cantidad en equipos y suministros para la purificacion de proteinas. Como ejemplo de esto ultimo, actualmente en el sector de la agricultura no existe ninguna manera de seleccionar eficazmente el genero de la descendencia de los animales de granja; no obstante, se calcula que solo en el area del ganado vacuno, se anadiria valor al permitir dicha seleccion de esperma como parte del proceso de inseminacion actual de uso extendido en la industria.

Fuera del mercado de la ganaderia, actualmente el proceso de purificacion de celulas de islote a partir de pancreas humanos es una gran preocupacion de los cientificos medicos que desarrollan nuevos metodos de tratamiento para la diabetes de tipo I. Se han hechos avances significativos en los metodos de trasplante de islotes, pero el problema de la purificacion es uno de los escollos que quedan. Los metodos tradicionales para purificar celulas de islote son ineficaces y dan lugar a danos en las celulas.

El trasplante de celulas de islote es importante debido a que, en la forma de diabetes de tipo I, las celulas de islote existentes en el pancreas del paciente estan danadas y ya no producen la insulina necesaria para la supervivencia humana. El tratamiento actual para la diabetes de tipo I implica la inyeccion de insulina de 1 a 5 veces al dia. A pesar del tratamiento, con frecuencia la enfermedad da lugar a complicaciones que incluyen ceguera, problemas de flujo sanguineo que requieren amputaciones, insuficiencia renal y muerte. Se espera que una pureza mayor y la reduccion de los contaminantes para las celulas de islote usadas en el trasplante reduzcan la aparicion de estas complicaciones.

Del millon aproximado de pacientes actuales de diabetes de tipo I en Estado Unidos, al menos 50.000 pacientes al ano se someterian a un trasplante de celulas de islote si estuviera disponible. Tras la aceptacion a gran escala del trasplante de celulas de islote como tratamiento eficaz, cabria esperar que los costes dieran un salto sustancial. El salto responderia a la dificultad de uso del metodo de tratamiento actual (inyecciones frecuentes) y las graves consecuencias incluso cuando el tratamiento se administra de forma adecuada.

Por tanto, la purificacion de islotes no es mas que un problema importante que requiere la clasificacion altamente selectiva de celulas humanas de manera no perjudicial y no invasiva.

Otro problema que es necesario abordar es la purificacion de celulas sanas a partir de celulas cancerosas de la medula osea de personas sometidas a un tratamiento de radiacion del cuerpo entero para el cancer.

Otro mas es la seleccion de celulas madre para la investigacion sobre las causas de y los tratamientos para, enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson.

Otra preocupacion adicional es el desarrollo de nuevas maneras de estudiar grandes cantidades de celulas humanas y seleccionar las que tienen caracteristicas que no se pueden someter a marcaje fluorescente, lo que ampliaria enormemente el alcance y la potencia de los diagnosticos medicos.

Una tecnica convencional en la manipulacion de objetos microscopicos es el atrapamiento optico.

Una descripcion aceptada del efecto del atrapamiento optico es que la luz con enfoque estrecho, tal como la luz enfocada por una lente de microscopio de abertura numerica alta, tiene un gradiente de intensidad pronunciado. Las trampas opticas usan las fuerzas del gradiente de un haz de luz para atrapar una particula en funcion de su constante dielectrica. "Particula" se refiere a material biologico u otro material quimico, incluidos, pero sin limitacion,

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oligonucleotidos, polinucleotidos, compuestos quimicos, proteinas, lipidos, polisacaridos, ligandos, celulas, anticuerpos, antigenos, organulos celulares, lipidos, blastomeros, agregaciones celulares, microorganismos, peptidos, ADNc, ARN y similares.

Para reducir al minimo su energia, una particula con una constante dielectrica mayor que la del medio circundante se movera hacia la region de una trampa optica donde el campo electrico sea mas alto. Las particulas con al menos un pequeno diferencial de la constante dielectrica con su entorno son sensibles a este gradiente y se ven atraidas o repelidas desde el punto de mayor intensidad de luz, es decir, hacia o desde el punto focal del haz de luz. Al construir una trampa optica, se emplean las fuerzas del gradiente optico de un solo haz de luz para manipular la posicion de una particula dielectrica inmersa en un medio fluido con un indice de refraccion menor que el de la particula, pero tambien se pueden manipular particulas reflejantes, absorbentes y de constante dielectrica baja.

La fuerza del gradiente optico de una trampa optica compite con la presion de la radiacion, que tiende a desplazar la particula atrapada a lo largo del eje del haz. Una trampa optica se puede colocar en cualquier sitio dentro del volumen focal de una lente de objetivo mediante la seleccion aproximada de la direccion de propagacion del haz de entrada y el grado de colimacion. Un haz colimado que entra por la lente de la abertura trasera de un objetivo llega a un foco en el centro del plano focal de la lente, mientras que otro haz que entra con un angulo llega a un foco descentrado. Un haz ligeramente divergente enfoca mas alla del plano focal, mientras que un haz convergente enfoca mas aca.

Cada uno de los multiples haces que entran por la pupila de entrada de la lente simultaneamente, forma una trampa optica en el volumen focal en una posicion determinada por su angulo de incidencia. La tecnica de atrapamiento optico holografico usa un elemento difractivo optico de modificacion de fase para imponer el patron de fase para multiples hacer sobre el frente de onda de un solo haz de entrada, transformando de este modo el haz individual en multiples trampas.

En la creacion de trampas opticas se prefiere la modulacion de la fase de un haz de entrada debido a que el atrapamiento se basa en los intersticios de los haces y no en sus fases relativas. Las modulaciones de la amplitud pueden desviar la luz de las trampas y disminuir su eficacia.

Cuando una particula esta opticamente atrapada, las fuerzas del gradiente optico ejercidas por la trampa superan otras presiones de la radiacion que surgen de la dispersion y la absorcion. En general, para un haz de laser de entrada gaussiano TEM00, esto significa que el diametro del haz deberia coincidir sustancialmente con el diametro de la pupila de entrada. Una abertura numerica preferente para formar una trampa es de aproximadamente 0, 9 a aproximadamente 1, 0.

Una dificultad para aplicar la tecnologia de atrapamiento optico es que, en general, cada trampa que se va a generar requiere su propio haz de luz enfocado. Muchos sistemas de interes requieren multiples trampas opticas y se han desarrollado varios metodos para lograr configuraciones de trampas multiples. Un metodo existente usa un solo haz de luz que se redirige entre ubicaciones de multiples trampas para "compartir en el tiempo" el haz entre diversas trampas. No obstante, a medida que aumenta el numero de trampas, se pueden alargar los intervalos durante los que cada trampa esta en su estado "apagado" para que las particulas se alejen por difusion de la ubicacion de la trampa antes de que la trampa se energice de nuevo. Todas estas preocupaciones han limitado las aplicaciones de este metodo a menos de aproximadamente 10 trampas por sistema.

Otro metodo tradicional de crear sistemas multitrampa se basa en el paso simultaneo de multiples haces de luz a traves de una sola lente de abertura numerica alta. Esto se hace usando multiples laseres o usando uno o mas divisores de haz en el haz de un solo laser. Un problema con esta tecnica es que, a medida que aumenta el numero de trampas, el sistema optico se hace cada vez mas complejo de forma progresiva. Debido a estos problemas, las aplicaciones conocidas de este metodo se limitan a menos de aproximadamente 5 trampas por sistema.

En un tercer enfoque para lograr un sistema multitrampa, se usa un elemento difractivo optico (DOE) (p. ej., un holograma de desplazamiento de fase que utilice una geometria de transmision o reflexion) para modificar el frente de onda de un solo haz de laser. Esta invencion se divulga en la patente de EE.UU. n° 6.055.106 de Grier et al. El frente de onda se modifica de tal forma que el haz de laser posterior se convierte esencialmente en un numero mayor de haces de laser individuales con posiciones relativas y direcciones de desplazamiento fijadas por la naturaleza exacta del elemento difractivo optico. En efecto, la transformada de Fourier del DOE produce un conjunto de maximos de intensidad, cada uno de los cuales actua como una trampa individual o "pinza".

Algunas aplicaciones del tercer enfoque han usado un holograma de transmision fijo para crear entre 16 y 400 centros de atrapamiento individuales.

Se ha usado un holograma fijo para demostrar el principio del atrapamiento optico holografico, pero el uso de una rejilla de cristal liquido como holograma permitio la 'fabricacion' de un holograma independiente para cada nueva distribucion de trampas. La modulacion de la fase espacialmente variable impuesta sobre el laser de atrapamiento por la rejilla de cristal liquido se puede controlar facilmente en tiempo real por un ordenador, permitiendo asi una

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variedad de manipulaciones dinamicas.

Otros tipos de trampas que se pueden usar para atrapar opticamente particulas incluyen, pero sin limitacion, vortices opticos, embudos opticos, rotores opticos y jaulas de luz. Un vortice optico produce un gradiente que rodea una zona de campo electrico cero que es util para manipular particulas con constantes dielectricas mas bajas que la del medio circundante o que son particulas reflectoras o de otro tipo que son repelidas por una trampa optica. Para reducir al minimo esta energia, una particula de este tipo se movera a la region donde el campo electrico es mas bajo, a saber la zona de campo electrico cero del punto focal de un haz de laser de forma apropiada. El vortice optico proporciona una zona de campo electrico cero muy parecida al agujero de un donut (toroide). El gradiente optico es radial con el campo electrico mas alto de la circunferencia del donut. El vortice optico detiene una particula pequena dentro del agujero del donut. La detencion se lleva a cabo deslizando el vortice por encima de la particula pequena a lo largo de la linea de campo electrico cero.

El embudo optico difiere de un vortice optico en que tiene un campo electrico cero solo en el foco y un campo electrico distinto de cero en todas las demas direcciones que rodean al foco, en un extremo del vortice. Un embudo optico puede ser util para atrapar atomos y nanoagrupaciones que pueden ser demasiado pequenos o demasiado absorbentes para atraparlos con un vortice optico o pinzas opticas. (Vease J. Arlt y M.J. Padgett. "Generation of a beam with a dark focus surrounded by regions of higher intensity: The optical bottle beam", Opt. Lett. 25, 191-193, 2000). La jaula de luz (patente de EE.UU. n° 5.939.716) es, vagamente, un pariente macroscopico del vortice optico. Una jaula de luz forma un anillo promediado en el tiempo de trampas opticas para rodear una particula demasiado grande o reflectora para atraparla con constantes dielectricas mas bajas que la del medio circundante.

Cuando el haz de laser se dirige a traves de o se refleja desde el elemento optico de patron de fase, el elemento optico de patron de fase produce una pluralidad de haces elementales que tienen un perfil de fase modificado. En funcion del numero y el tipo de trampas opticas deseadas, la modificacion puede incluir difraccion, conformacion del frente de onda, desplazamiento de la fase, direccion, divergencia y convergencia. Basandose en el perfil de fase escogido, se puede usar el elemento optico de patron de fase para generar trampas opticas en forma de trampas opticas, vortices opticos, embudos opticos, rotores opticos, jaulas de luz y combinaciones de dos o mas de estas formas.

Con respecto a la manipulacion de materiales, se ha demostrado el pinzamiento de virus y bacterias ademas del pinzamiento de esferas dielectricas. Ademas de los procariotas y los virus, se han pinzado satisfactoriamente una gran variedad de protistas tales como Tetrahymena thermophila. Ademas, se han atrapado y manipulado tanto celulas somaticas tales como leucocitos y celulas epiteliales de los carrillos, como celulas de linea germinal tales como espermatozoides.

Los investigadores han buscado metodos indirectos para manipular celulas, tales como marcar las celulas con microparticulas de diamante y pinzar despues las particulas de diamante. Las manipulaciones de celulas han incluido la orientacion de celulas para su analisis al microscopio, asi como extender las celulas. Tambien se han dispuesto las celulas de tejidos con pinzas in vitro en la misma distribucion que in vivo.

Ademas de las propias celulas, las pinzas opticas se han usado para manipular organulos celulares, tales como vesiculas transportadas a lo largo de microtubulos, cromosomas o ADN globular. Tambien se han insertado objetos en celulas usando pinzas opticas.

Tambien son posibles con pinzas opticas una variedad de procesos de clasificacion con fines biologicos.

Ya se han demostrado la clasificacion celular usando atrapamiento optico tradicional para ensayos y recogida de cromosomas y la clasificacion para crear colecciones. Tambien se han desarrollado ensayo celulares para cribado farmacologico.

En consecuencia, como ejemplo de nuevos tipo de clasificacion usando trampas opticas dirigidas por laser, se necesita un metodo de clasificacion celular usando una tecnica nueva que aisle celulas valiosas de otras celulas, tejidos y contaminantes. Ademas, es necesaria una manera de lograr una contribucion unica del atrapamiento optico a las principales necesidades industriales de clasificacion y purificacion (de celulas). Aun mas, existe la necesidad de separar celulas de esperma en el mercado de la ganaderia.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un aparato y un metodo de examen de celulas como se definen mediante la materia de las reivindicaciones independientes. Antes de explicar al menos una realizacion consistente con la presente invencion en detalle, se ha de entender que la invencion no esta limitada en su aplicacion a los detalles de construccion y a las disposiciones de los componentes expuestos en la siguiente descripcion o ilustrados en los dibujos. Los metodos y aparatos consistentes con la presente invencion son susceptibles de otras realizaciones y de ser puestos en practica y llevados a cabo de diversas maneras. Tambien, se ha de entender que la fraseologia y la terminologia empleadas aqui, asi como en el resumen incluido mas adelante, tienen fines descriptivos y no se deben

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considerar como limitantes.

Como tales, los expertos en la tecnica apreciaran que la concepcion en la que se basa esta divulgacion puede utilizarse como una base para el diseno de otras estructuras, metodos y sistemas para llevar a cabo los diversos propositos de la presente invencion.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 ilustra esquematicamente un sistema de atrapamiento optico holografico.

Las figuras 2A y 2B son un diagrama esquematico en vista lateral y un diagrama esquematico en vista superior, respectivamente, que muestran una muestra que se esta introduciendo en el soporte de muestras.

La figura 3 representa una micrografia de barrido electronico de una camara de muestras.

La figura 4 muestra una vista ampliada de la zona de trabajo de una muestra.

La figura 5 es un diagrama esquematico de un sistema de atrapamiento optico holografico para clasificar objetos.

La figura 6 ilustra un ejemplo de deflexion lateral para clasificacion.

Las figuras 7A y 7B ilustran vistas esquematicas frontal y lateral, respectivamente, de trampas de canalizacion de acuerdo con una realizacion consistente con la presente invencion.

La figura 8 ilustra un clasificador de celulas con una base de disco giratorio.

La figura 9 ilustra el peristaltismo optico.

Descripcion detallada de la invencion

En un aparato o sistema de atrapamiento optico holografico 100 como se ilustra en la figura 1, la luz incide desde un sistema de laser y entra como se muestra por la flecha descendente, para alimentar el sistema 100.

Preferentemente un elemento optico de patron de fase 101 es un elemento dinamico optico (DOE), con una superficie dinamica, que tambien es un modulador de luz espacial solo de fase (SLM) <BR> tal como el "PAL-SLM serie X7665", fabricado por Hamamatsu de Japon, el "SLM 512SA7" o el "SLM 512SA15", fabricados ambos por Boulder Nonlinear Systems de Lafayette, Colorado. Estos elementos opticos de patron de fase 101 se controlan por ordenador para generar los haces elementales por un holograma codificado en el medio que se puede variar para generar los haces elementales y seleccionar la forma de los haces elementales. Un patron de fase 1-2 generado en la parte inferior izquierda de la figura 1 produce las trampas 103 mostradas en la parte inferior derecha rellenas de esferas 104 de silice de 1 pm de diametro suspendidas en agua 105. Por tanto, el sistema 100 se controla por el holograma dinamico mostrado mas abajo a la izquierda.

El haz de laser se desplaza a traves de las lentes 106, 107, hasta un espejo dicroico 108. El divisor de haces 108 se construye de un espejo dicroico, un espejo de hueco de banda fotonica, un espejo omnidireccional u otro dispositivo parecido. El divisor de haces 108 refleja selectivamente la longitud de onda de la luz usada para formar las trampas opticas 103 y transmite otras longitudes de onda. La porcion de luz reflejada desde la zona del divisor de haces 108 se hace pasar despues a traves de una zona de un elemento optico de patron de fase de fase codificado dispuesto sustancialmente en un plano conjugado con una abertura trasera plana de una lente (objetivo) de enfoque 109.

En el atrapamiento optico de haz individual (tambien llamado pinzas de laser u opticas), se habia pensado, antes de la presente invencion, que para trampas opticas aceptables era necesaria una lente de abertura numerica alta. Una base para esta creencia era que, para el atrapamiento optico, se usa el gradiente del campo electrico de la luz que incide para atrapar la particula. Con el fin de obtener una fuerza de atrapamiento grande, se ha creido necesaria la existencia de un gradiente del campo electrico (o densidad numerica de rayos) grande. La manera en que habitualmente se lleva a cabo esto es haciendo pasar el campo de luz a traves de una lente de abertura numerica alta.

Una preocupacion con la observacion y el atrapamiento de muestras dentro de un campo de vision grande es que tales observacion y atrapamiento implicarian una lente de objetivo con una abertura numerica baja. Al contrario que la ensenanza anterior, la presente divulgacion proporciona una lente de abertura numerica baja como, por ejemplo, la lente de objetivo 109 de la figura 1. La capacidad de observar y atrapar en estar situacion podria ser util en cualquier aplicacion donde fuese beneficioso un campo de vision grande dado por una lente de aumento pequeno, tal como colocar piezas fabricadas microscopicas o trabajar con grandes cantidades de objetos, tales como celulas, por ejemplo.

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Como ejemplo, se atraparon esferas 104 de silice de 3 micrometros, suspendidas en agua 105 con lentes 109 con una abertura numerica baja sin precedentes. Las lentes 109 usadas eran fabricadas por Nikon:

(a) plan 4x con una AN de 0, 10; y

(b) plan 10x con una AN de 0, 25.

Los elementos opticos de patron de fase adecuados se caracterizan como transmisores o reflectores en funcion de como dirigen el haz de luz enfocado u otra fuente de energia. Los elementos difractivos opticos transmisores transmiten el haz de luz u otra fuente de energia, mientras que los elementos difractivos opticos reflectores reflejan el haz.

El elemento optico de patron de fase 101 tambien se puede categorizar como de superficie estatica o dinamica. Los ejemplos de elementos opticos de patron de fase adecuados incluyen aquellos con una o mas regiones de superficie fijas, tales como rejillas, incluidas rejilla difractoras, rejillas reflectoras y rejillas transmisoras, hologramas, incluidos hologramas policromaticos, plantillas, filtros holograficos de conformacion de la luz, hologramas policromaticos, lentes, espejos, prismas, placas de onda y similares. El elemento optico de patron de fase estatico transmisor se caracteriza por una superficie fijada.

No obstante, en algunas disposiciones, el elemento optico de patron de fase 101 por si mismo es movil, permitiendo de este modo la seleccion de una o mas de las regiones de superficie fija moviendo el elemento optico de patron de fase 101 con relacion al haz de laser para seleccionar la region apropiada.

El elemento optico de patron de fase estatico puede estar unido a un pivote y hacerse girar con un motor electrico controlado (no mostrado). El elemento optico de patron de fase estatico tiene una superficie fija y regiones discretas. En otras disposiciones de elementos opticos de patron de fase estaticos, ya sean transmisores o reflectores, la superficie fija tiene una superficie no homogenea que contiene regiones que varian de forma sustancialmente continua, o una combinacion de regiones discretas y regiones que varian de forma sustancialmente continua.

Los ejemplos de elementos opticos de patron de fase dinamicos adecuados que tienen un aspecto de su funcion dependiente del tiempo incluyen patrones de difraccion generados por ordenador, materiales de desplazamiento de fase, matrices de cristal liquido de desplazamiento de fase, micromatrices de espejo, incluidas micromatrices de espejo de modo piston, moduladores de luz espaciales, deflectores electro-opticos, moduladores acusto-opticos, espejos deformables, matrices reflectoras MEMS y similares. Con un elemento optico de patron de fase 101 dinamico, el medio 105 que comprende el elemento optico de patron de fase 101 codifica un holograma que se puede modificar para conferir un desplazamiento de fase de patron al haz de luz enfocado que da lugar al cambio correspondiente en el perfil de la fase del haz de luz enfocado, tal como difraccion o convergencia. Adicionalmente, se puede modificar el medio 105 para producir un cambio en la ubicacion de las trampas opticas 103. Una ventaja de los elementos opticos de patron de fase 101 dinamicos es que se puede modificar el medio 105 para mover independientemente cada trampa optica 103.

En aquellas disposiciones en las que el perfil de fase de los haces elementales es menos intenso en la periferia y mas intenso en regiones interiores a la periferia, resulta util sobrecargar la abertura trasera en menos de aproximadamente el 15 por ciento para formar trampas opticas con mayor intensidad en la periferia que las trampas opticas formadas sin sobrecargar la abertura trasera.

En algunas disposiciones, la forma de una trampa optica puede cambiar desde su forma original a la de una trampa optica de punto, un vortice optico, un haz de Bessel, un embudo optico, un rotor optico o una jaula de luz. La trampa optica se puede mover en dos o tres dimensiones. El elemento optico de patron de fase tambien es util para impartir un modo topologico en particular a la luz de laser, por ejemplo, al convertir un modo gaussiano en un modo de Gauss-Laguerre. En consecuencia, se puede formar un haz elemental en un modo de Gauss-Laguerre al mismo tiempo que se puede formar otro haz elemental en un modo gaussiano. La utilizacion de modos de Gauss-Laguerre potencia enormemente el atrapamiento al reducir la presion de la radiacion.

1. Sistema de formacion de imagenes

El presente diseno de instrumento usa una camara CCD de alta resolucion para el sistema de formacion de imagenes 110 principal. La mayor ventaja de la camara CCD (vease el numero de referencia 511 de la figura 5) es la favorable relacion de coste/rendimiento, dado que esta es una tecnologia madura.

Otra ventaja de las camaras CCD es su amplio intervalo dinamico y la facilidad para generar resultados digitales.

Las imagenes se visualizan en un monitor de ordenador (vease el numero de referencia 510 de la figura 5) para proporcionar un marco de referencia tanto para seleccionar la ubicacion de las trampas como para reducir al minimo la posibilidad de la exposicion accidental del operario al laser.

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2. Interfaz del usuario

a. Presentacion de los objetos La interfaz del usuario consiste en un monitor de ordenador que presenta el campo de vision tomado por la camara CCD. El usuario indica los sitios de las trampas con un raton. Tambien existe una opcion para suprimir una ubicacion.

Como de describe con mas detalle a continuacion, el usuario tambien puede especificar la potencia por trampa con el fin de evitar que se dane la muestra. Ademas, es deseable poder variar la potencia de la trampa debido a que el atrapamiento depende de la diferencia entre el indice refraccion de la muestra y el medio de suspension, que cabe esperar que varien de una muestra a otra.

b. El holograma

El proposito de indicar los sitios de las trampas es proporcionar datos de entrada para el calculo del holograma. En esencia, el holograma es una funcion cuya transformada de Fourier produce la matriz de trampas deseada. No obstante, en el caso de la pantalla de cristal liquido, esta funcion es un objeto de fase (es decir, un objeto que cambia la fase del frente de onda sin absorber energia alguna).

c. Metodos de eleccion

El conjunto de trampas cuando se necesitan un gran numero de trampas, el tiempo para indicar su ubicacion con un raton de ordenador puede ser desmesuradamente alto. Por lo tanto, existen varias opciones para reducir el tiempo necesario.

Con frecuencia, se desea usar las trampas para mover un objeto en una direccion en particular. Esto se puede llevar a cabo usando el raton para crear una linea (arrastrando). El programa de ordenador interpreta una linea como una peticion para desplegar una serie de trampas de forma secuencial y lo suficientemente proximas entre si como para mover el objetivo en pequenas etapas sin perder el bloqueo del objetivo.

La presente divulgacion tambien incluye la capacidad de cambiar la altura de las trampas. Si un haz de laser esta paralelo al eje optico de la lente de objetivo 109, entonces se forma una trampa a la misma altura que el plano focal de la lente 109. El cambio de la altura de una trampa se lleva a cabo mediante el ajuste del holograma de modo que el haz de luz que forma la trampa converge (o diverge) ligeramente cuando entra en la lente de objetivo 109 del microscopio. Se puede ajustar la altura de una trampa usando lentes, pero solo un atrapamiento optico holografico (HOT) permite ajustar la altura de cada trampa individual independientemente de cualquier otra trampa. Esto se lleva a cabo por el ajuste del programa de ordenador de la modulacion de la fase provocada por el holograma de cristal liquido.

3. Soporte de muestras

a. General La camara de muestras 200 (veanse las figuras 2A y 2B) es barata y desechable. Aunque se describe la camara de muestras 200 a continuacion, otro objeto de la presente invencion es un diseno flexible que se puede cambiar para aplicaciones diferentes.

La camara de muestras 200 descansa sobre la superficie de un portaobjetos 201 de microscopio. La camara de muestras 200 contiene una serie de canales 203 para introducir muestras u objetos. Los canales 203 estan conectados a depositos de suministro y recogida por un tubo fino 204 (disponible comercialmente). Las muestras u objetos estaran suspendidos en un medio liquido y se introduciran en la zona de trabajo a traves de los canales 203. La camara de muestras 200 esta cubierta por un cubreobjetos 205.

b. Fabricacion de la camara de muestras

En una disposicion, para fabricar la camara 200 se usa una resina de poli (dimetilsiloxano) (PDMS). El proceso implica crear el patron de canales 203 deseado en un ordenador usando metodos ordinarios de CAD/CAM y transferir el patron a una fotomascara usando tecnicas convencionales de fotorresistencia/grabado. Despues se usa la fotomascara como mascara negativa para crear un patron inverso de los canales que se graban sobre una oblea de silicio. La profundidad de los canales 203 se controla mediante el tiempo de grabado. La oblea de silicio es una replica negativa de la camara de muestras 200 real. La etapa final consiste en crear la camara de muestras 200 positiva vertiendo PDMS sobre la oblea y polimerizandolo. Esto da lugar a un molde de PDMS que se une a un portaobjetos 201 de vidrio y se cubre con un cubreobjetos 205. La union del vidrio al PDMA se efectua con un grabado con oxigeno que activa las superficies expuestas.

Para garantizar una calidad consistente son necesarias una serie de etapas adicionales. Por ejemplo, se mantiene la solucion de PDMS/endurecedor a vacio con el fin de evitar la formacion de burbujas. Se silaniza la oblea de silicio para evitar que el PDMS se pegue a la oblea. Existen una variedad de etapas que implican limpiar las replicas y mantener los controles ambientales apropiados. Representan la tecnologia ordinaria.

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Los canales 203 se conectan al tubo 204 de calibre microscopico usando agujas 206 de jeringuilla pequenas sujetas usando pegamento 214, que se insertan a traves del molde de PDMS dentro de pocillos 207 circulares pequenos que conectan con cada canal 203. Las soluciones de muestra se introducen en el canal 203 usando microbombas 208.

La figura 2B muestra un diagrama de una disposicion tipica para la introduccion de una muestra a traves de la bomba 208 de la jeringuilla en 210. El medio se introduce en 211 y los desechos se recogen en 21 y las colectas deseadas en 213.

La figura 3 presenta una representacion de una micrografia de barrido electronico del diagrama de la figura 2B como se creo realmente a partir del proceso descrito anteriormente. Los canales tienen aproximadamente 50 micrometros de anchura y 50 micrometros de profundidad. La figura 4 presenta una representacion de una micrografia de barrido electronico del volumen 'de trabajo' donde se producirian las manipulaciones de la muestra en estudio. Los diagramas muestran claramente que los canales 203 son lisos y estan limpios.

Aunque los canales 203 son de seccion transversal rectangular, tambien pueden preverse otras formas. Los canales 203 estan disenados para permitir que se hagan fluir las muestras hacia la "zona de trabajo", cuya forma se puede disenar a medida de los requisitos experimentales.

c. Trampas opticas holograficas

A diferencia de las trampas opticas escaneadas, que dirigen multiples puntos de atrapamiento en secuencia y por tanto, son de tiempo compartido, las trampas opticas holograficas iluminan cada una de sus trampas de forma continua. Para que una trampa optica escaneada logre la misma fuerza de atrapamiento que una trampa iluminada de forma continua, debe proporcionar al menos la misma intensidad promediada en el tiempo. Esto significa que la trampa escaneada debe tener un maximo de intensidad mayor en un factor proporcional a al menos el numero de regiones de atrapamiento. Este maximo de intensidad mayor aumenta las oportunidades de dano inducido opticamente en el material atrapado. Este dano puede surgir por al menos tres mecanismos: (1) absorcion monofotonica que da lugar a calentamiento local, (2) absorcion monofotonica que da lugar a transformaciones fotoquimicas y (3) absorcion multifotonica que da lugar a transformaciones fotoquimicas. Los acontecimientos (1) y (2) se pueden mitigar escogiendo una longitud de onda de la luz que el material de atrapamiento y el medio fluido circundante absorban debilmente. El acontecimiento (3) es un problema mas general y se mitiga en parte trabajando con luz de mayor longitud de onda. Asi, las trampas opticas holograficas pueden manipular materiales delicados mas suavemente con mayor eficacia mediante la distribucion de cantidades mas pequenas de fuerza continuamente entre una serie de puntos sobre un objeto en lugar de danar potencialmente el objeto al ejercer la fuerza total sobre un solo punto o a una intensidad mayor durante un periodo de tiempo.

En una disposicion, el diseno es flexible en cuanto que se puede disenar cualquier patron de canales 203 deseado con un programa de ordenador de CAD/CAM ordinario. La complejidad del patron no es un factor siempre que los canales 203 esten lo suficientemente separados como para no se invadan entre si. Como se puede ver en las figuras 2B y 3, se pueden acomodar facilmente multiples conjuntos de canales 203 de modo que se puede usar un solo chip para mas de un experimento. Ademas, una vez que se fabrica un molde, se puede usar para fabricar miles de camaras de muestras, de modo que la metodologia se adapta facilmente a las tecnicas de produccion en masa. Se calcula que el coste marginal de una sola camara seria del orden de unos pocos centimos cuando se produce en masa.

4. Sistema optico

a. Sintesis del holograma

Las primeras versiones de las trampas opticas holograficas usaban hologramas fijados fabricados a partir de una variedad de materiales. Eran adecuados para demostrar el principio del uso de hologramas para crear varios cientos de trampas. No obstante, el principal defecto de estos hologramas era que eran estaticos y que se tardaba horas en fabricar un solo holograma. Con la llegada de los equipos para crear pantallas de cristal liquido controladas por ordenador capaces de formar hologramas muchas veces por segundo, el uso de trampas opticas como un dispositivo dinamico se ha convertido en una realidad en la practica. El principio para calcular el holograma se describe a continuacion.

b. El microscopio

El sistema optico 110 consiste en un microscopio optico de alta calidad ordinario. El objetivo es una lente 109 de abertura numerica alta acoplada con una lente condensadora de distancia de trabajo larga. La lente de objetivo 109 de abertura numerica alta se usa para el atrapamiento. Aunque la lente condensadora de distancia de trabajo larga puede reducir en cierta medida la resolucion de las imagenes, no pone en riesgo el atrapamiento y proporciona espacio extra cerca del portaobjetos de la muestra para acomodar tuberias y receptaculos. Se pueden mover los

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objetos sujetandolos con trampas y moviendo la platina del microscopio vertical o lateralmente.

En una disposicion, se emplean aproximadamente 2 mW de potencia de laser para producir 200 microvatios en la trampa. El nivel de potencia que proporciona un laser de 2 W es adecuado para crear aproximadamente 1000 trampas. Se usa un laser verde (532 nm), pero tambien se pueden usar otras longitudes de onda, incluidas, por ejemplo, un laser del rojo lejano para trabajar con materiales que absorben cerca del valor de 532 nm.

El atrapamiento depende del gradiente del indice de refraccion, de modo que los materiales con indices de refraccion proximos al del medio circundante necesitan trampas con niveles de potencia mayores. Ademas, la tolerancia de los materiales al dano variara con la potencia de las trampas, de modo que es deseable que el operario pueda controlar este parametro. El usuario puede aumentar el nivel de potencia de cualquier trampa en particular usando un 'regulador de potencia que se muestra en la interfaz grafica.

c. El holograma de cristal liquido (llamado tambien modulador de luz espacial o SLM)

El modulador de luz espacial 108 es esencialmente una matriz de cristal liquido controlada por un campo electrostatico que, a su vez, se puede controlar por un programa de ordenador. La matriz de cristal liquido tiene la propiedad de que retarda la fase de la luz en cantidades diferentes en funcion de la fuerza del campo electrico aplicado.

Se usan dispositivos de cristal liquido nematico para pantallas o aplicaciones donde es necesaria una profundidad grande de modulacion solo de fase (211 o mayor). Las moleculas de cristal liquido nematico se encuentran habitualmente paralelas a la superficie del dispositivo, dando el retardo maximo debido a la birrefringencia del cristal liquido. Cuando se aplica un campo electrico, las moleculas se inclinan paralelas al campo electrico. A medida que aumenta el voltaje, disminuyen eficazmente el indice de refraccion a lo largo del eje extraordinario y por tanto, la birrefringencia, provocando una reduccion del retardo del dispositivo.

d. El laser

Los laseres utiles incluyen laseres de estado solido, laseres bombeados por diodos, laseres gaseosos, laseres de tinte, laseres de alejandrita, laseres de electrones libres, laseres VCSEL, laseres de diodos, laseres de Ti-zafiro, laseres YAG dopados, laseres YLF dopados, laseres YAG bombeados por diodos y laseres YAG bombeados por lamparas de destellos. Se prefieren los laseres de Nd:YAG bombeados por diodos que funcionan a entre 10 mW y 5 W. Las longitudes de onda preferidas del haz de laser usadas para formar matrices para investigar material biologico incluyen las longitudes de onda del infrarrojo, infrarrojo cercano, rojo visible, verde y azul visible, siendo las mas preferidas longitudes de onda desde aproximadamente 400 nm hasta aproximadamente 1060 nm.

5. Metodo de funcionamiento

En una disposicion, un sistema de atrapamiento optico 500 (vease la figura 5) (tal como el sistema BioRyx comercializado por Arryx, Inc., Chicago, Illinois) incluye un microscopio 501 de la serie TE 2000 de Nixon en el que se ha dispuesto una montura para formar las trampas opticas usando una unidad de atrapamiento optico holografico 505. El portaobjetivos 502 al que se une un alojamiento, encaja directamente en el microscopio 501 por medio de la montura. Para la formacion de imagenes, se dispone una fuente de iluminacion 503 por encima de la lente de objetivo 504 para iluminar la muestra 506.

En una disposicion, el sistema 100 de trampas opticas (veanse las figuras 1 y 5) incluye un extremo del primer canal de luz, que esta muy proximo al elemento optico y el otro extremo del primer canal de luz, que corta con y comunica con un segundo canal de luz formado perpendicular al mismo. El segundo canal de luz esta formado dentro de una base de una torre de montaje de lentes de microscopio o "portaobjetivos". El portaobjetivos esta adaptado para encajar en un microscopio de la serie TE 200 de Nixon. El segundo canal de luz comunica con un tercer canal de luz que tambien es perpendicular al segundo canal de luz. El tercer canal de luz atraviesa desde la superficie superior del portaobjetivos a traves de la base del portaobjetivos y es paralelo a una lente de enfoque de la lente de objetivo 109. La lente de enfoque 109 tiene unas partes superior e inferior que forman una abertura trasera. Interpuesto en el tercer canal de luz entre el segundo canal de luz y la abertura trasera de la lente de enfoque se encuentra un divisor de haz 108 de espejo dicroico.

Otros componentes del interior del sistema de trampas opticas para formar las trampas opticas incluyen un primer espejo, que refleja los haces elementales que emanan del elemento optico de patron de fase 101 a traves del primer canal de luz, un primer conjunto de opticos de transferencia 106 dispuestos dentro del primer canal de luz, alineados para recibir los haces elementales reflejados por el primer espejo, un segundo conjunto de opticos de transferencia 107 dispuestos dentro del primer canal de luz, alineados para recibir los haces elementales que pasan a traves del primer conjunto de lentes de transferencia y un segundo espejo 108 situado en la interseccion del primer canal de luz y el segundo canal de luz, alineado para reflejar los haces elementales que pasan a traves del segundo conjunto de opticos de transferencia y a traves del tercer canal de luz.

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Para generar las trampas opticas, se dirige un haz de laser desde un laser 507 (vease la figura 5) a traves de un colimador y a traves de un extremo de fibra optica 508 y se refleja desde la superficie dinamica del elemento difractivo optico 509. El haz de luz que sale del extremo de colimador de la fibra optica se difracta por la superficie dinamica del elemento difractivo optico en una pluralidad de haces elementales. Se puede controlar y variar el numero, tipo y direccion de cada haz elemental modificando el holograma codificado en el medio de superficie dinamica. Los haces elementales se reflejan despues desde el primer espejo a traves del primer conjunto de opticos de transferencia hacia abajo del primer canal de luz a traves del segundo conjunto de opticos de referencia hacia el segundo espejo; y se dirigen al espejo dicroico 509 hasta la abertura trasera de la lente de objetivo 504, convergen a traves de la lente de objetivo 504, produciendo de este modo las condiciones de gradiente optico necesarias para formar las trampas opticas. Esa porcion de la luz que se divide a traves del espejo dicroico 509, para la formacion de imagenes, pasa a traves de la parte inferior del tercer canal de luz formando una corriente de datos opticos (vease la figura 1).

La espectroscopia de una muestra de material biologico se puede llevar a cabo con una fuente de iluminacion 503 para formacion de imagenes adecuada para espectroscopia inelastica o retrodispersion de luz polarizada, siendo la anterior util para evaluar la identidad quimica y siendo la ultima adecuada para medir dimensiones de estructuras internas tales como el tamano del nucleo. Con el uso de estos metodos espectroscopicos, en algunas realizaciones, se estudian las celulas. Se puede usar un ordenador 510 para analizar los datos espectrales y para identificar celulas portadoras de un cromosoma X o Y, o tipos celulares que se sospecha que son cancerosos, precancerosos y/o no cancerosos. El programa de ordenador puede aplicar despues la informacion a dirigir trampas opticas para que contengan tipos celulares seleccionados. Despues, se pueden identificar las celulas contenidas basandose en la reaccion o la union de las celulas contenidas con compuestos quimicos.

Los presentes metodo y sistema se prestan a un proceso semiautomatico o automatico para rastrear el movimiento y el contenido de cada trampa optica. Se puede realizar un seguimiento del movimiento por medio de una camara de video 511, espectros o una corriente de datos opticos y que proporciona un programa de ordenador que controla la seleccion de las celulas y la generacion de trampas opticas. En otras disposiciones, el movimiento de las celulas se rastrea basandose en el movimiento predeterminado de cada trampa optica originado por la codificacion del elemento optico de patron de fase. Adicionalmente, en algunas disposiciones, se usa un programa de ordenador para llevar un registro de cada celula contenida en cada trampa optica.

Despues, la corriente de datos opticos se puede visualizar, convertir en una senal de video, monitorizar o analizar por inspeccion visual de un operario, espectroscopicamente y/o por seguimiento en video. La corriente de datos opticos tambien se puede procesar por un fotodetector para realizar un seguimiento de la intensidad, o cualquier dispositivo adecuado para convertir la corriente de datos opticos en una corriente de datos digitales adaptados para su uso por un ordenador.

En un enfoque que no emplea un SLM, se lleva a cabo el movimiento mediante la transferencia de los objetos desde un primer conjunto de trampas opticas hasta un segundo, un tercero y despues un cuarto, etc. Para mover los objetos desde la primera posicion hasta una segunda posicion, se gira un elemento optico de patron de fase estatico alrededor de un pivote para alinear el haz de laser con una segunda region que genera el segundo conjunto de trampas opticas a un correspondiente segundo conjunto de posiciones predeterminadas. Al construir el segundo conjunto de trampas opticas a la proximidad apropiada de la primera posicion, se pueden hacer pasar las sondas desde el primer conjunto de trampas opticas hasta el segundo conjunto de trampas opticas. La secuencia puede continuar pasando las sondas desde el segundo conjunto de posiciones predeterminadas hasta un tercer conjunto de posiciones predeterminadas, desde el tercer conjunto de posiciones hasta un cuarto conjunto de posiciones predeterminadas y desde el cuarto conjunto de posiciones predeterminadas y asi sucesivamente, mediante la rotacion del elemento optico de patron de fase para alinear la region apropiada correspondiente a la posicion deseada. El intervalo de tiempo entre la finalizacion de un conjunto de trampas opticas y la generacion del siguiente es de una duracion que garantice que se transfieren las sondas al siguiente conjunto de trampas opticas antes de que se desvien.

En un movimiento escalonado de los objetos desde una proximidad amplia hasta una estrecha, el movimiento escalonado de las celulas se produce de una forma parecida. No obstante, a medida que los objetos pasan desde un primer conjunto de trampas opticas hasta un segundo conjunto y se mueven a una segunda posicion y subsiguientes, la disposicion escalonada de las trampas permite un empaquetado denso de los objetos sin colocar un conjunto de trampas demasiado proximo a dos objetos al mismo tiempo, lo que podria hacer que los objetos estuvieran contenidos en la trampa optica equivocada: Una vez que un objeto o celula ha interaccionado con una trampa, se pueden usar metodos espectrales para estudiar la celula. El espectro de las celulas que tuvieron resultados positivos (es decir, las celulas que reaccionaron con o se unieron a una marca) se puede obtener mediante el uso de iluminacion para formacion de imagenes tal como la adecuada para espectroscopia inelastica o retrodispersion de luz polarizada. Un ordenador puede analizar los datos espectrales para identificar los objetivos deseados y dirigir el elemento optico de patron de fase para separar esos objetivos deseados. Despues de finalizar el ensayo, se puede realizar la seleccion, por ordenador o por un operario, de que celulas descartar y cuales recoger.

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El peristaltismo optico (vease la figura 9) es un proceso existente que emplea lineas paralelas de trampas 400 en un microcanal fluidico 401 dispuestas de modo que el espaciado entre las lineas permite que las particulas 402 atrapadas en una linea se absorban en trampas de la otra linea cuando se apaga la primera linea de trampas. El peristaltismo optico se puede usar como alternativa a y junto con marcas fluorescentes (como se describe despues con referencia a las aplicaciones). El proceso funciona sincronizando la extincion de las lineas de trampas sincronizadas de modo que las particulas se mueven en las direcciones deseadas especificadas por la disposicion de las lineas de trampas. Al escoger si una linea de trampas de un lado o el otro de una particula estan encendidas o apagadas, se puede mover la particula hacia delante o atras en una direccion. Por tanto, al emplear grandes cantidades de trampas, se pueden mover grandes cantidades de particulas conjuntamente en una direccion dada. Asi, se pueden mover las particulas atraidas a las trampas hacia una zona dada y si se desea, recogerlas alli.

Analogamente, al reducir de forma gradual el espaciado entre las trampas de las lineas hacia una direccion dada y/o al variar la curvatura de las lineas de trampas, se pueden barrera las particulas en un patron de enfoque para concentrarlas. La inversion de este patron dispersaria las particulas.

El espaciado entre lineas puede ser relativamente mayor para acelerar el movimiento de las particulas, o relativamente mas estrecho para ralentizarlas. Analogamente, tambien se puede emplear la variacion de la intensidad de trampas o lineas seleccionadas y por tanto, su efecto sobre las particulas. Al hacer converger o divergir los flujos, se pueden combinar o separar particulas. Ademas, se puede combinar el peristaltismo optico con efectos diferenciales de arrastre viscoso o campos electricos para producir conjuntos complejos y especificos de valores de parametros para separar materiales con precision, por ejemplo. Al oponer las fuerzas de atrapamiento y otras, el punto de equilibro de las dos fuerzas determina si una particula se mueve con la trampa o con la otra fuerza.

En una disposicion, se puede aplicar el peristaltismo optico con un sistema holografico que realiza un ciclo a traves de una secuencia de patrones de fase para aplicar una secuencia correspondiente de patrones de atrapamiento optico holografico. Estos patrones se pueden codificar en el relieve de la superficie de elementos difractivos opticos reflectores montados sobre la cara de un prisma, en la que un motor gira cada patron a su sitio. Analogamente, se pueden colocar elementos difractivos opticos transmisores sobre el perimetro de un disco y hacerlos girar para que realicen un ciclo a traves de los patrones. Tambien se pueden usar rejillas de fase conmutable y hologramas de fase codificados sobre peliculas.

Para particulas conducidas mas alla de una matriz rectilinea por una fuerza externa oblicua, tal como el flujo de fluido, cuando la fuerza de atrapamiento es considerablemente mayor que la fuerza externa directriz, quedan atrapadas las particulas. Cuando la fuerza oblicua es mayor, las particulas fluyen mas alla de la matriz.

Entre estos extremos, la fuerza oblicua supera la fuerza de atrapamiento en diferente medida para diferentes fracciones de las particulas, haciendo que las particulas salten de trampa a trampa a lo largo de la direccion del eje principal de la matriz. Cuando se gira la matriz a 45° se puede observar una deflexion de red cero porque: (1) se producen desplazamientos positivos y negativos con igual probabilidad; o (2) las particulas se bloquean en la direccion [11], saltando en diagonal a traves de la matriz.

Las particulas afectadas en mayor medida por una matriz se pueden desviar con angulos mayores que las particulas afectadas en mayor medida por la fuerza oblicua. La fuerza de gradiente optico ejercida sobre las particulas varia aproximadamente como a3, donde a = radio. El arrastre de Stokes sobre las particulas varia como "a". Por tanto, las particulas mayores se ven afectadas de forma desproporcionada por las matrices de trampas, mientras que las particulas mas pequenas experimentan una deflexion menor. Al orientar la matriz cerca del angulo de deflexion optima y ajustar la intensidad se colocan las particulas mayores en condiciones de salto y por tanto, con una deflexion mayor que las particulas mas pequenas. Las particulas con diferentes deflexiones se pueden recoger o fraccionar mas mediante matrices adicionales posteriores a la primera.

Algunas tecnicas convencionales para el fraccionamiento logran la separacion en la direccion de una fuerza aplicada. No obstante, estas tecnicas funcionan sobre lotes de muestras en lugar de continuamente.

Otras tecnicas convencionales para el microfraccionamiento emplean tamices microfabricados que consisten en un entramado bidimensional de obstaculos o barreras. Por ejemplo, una disposicion asimetrica de barreras rectifica el movimiento browniano de las particulas que pasan a traves del tamiz, haciendo que las particulas sigan trayectorias que dependen de los coeficientes de difusion de las particulas. No obstante, los entramados microfabricados usados se obstruyen y no se pueden adaptar al tamano y tipo de particula.

En la figura 6, se ejemplifica un ejemplo de clasificacion de particulas. Aunque el ejemplo ilustrado ejemplifica la deflexion lateral, en el mismo sistema se puede obtener el peristaltismo optico. Una representacion de una imagen de video muestra la separacion de material basada en la luz, en este caso adaptada para separar objetos en funcion del tamano de particula. El flujo del canal superior izquierdo contiene particulas de 1, 2,25 y 4,5 pm y desde el inferior izquierdo entra otro flujo. Las lineas superpuestas indican respectivamente el flujo de cada canal cuando la alimentacion del sistema de laser esta apagada. Cuando la alimentacion del laser esta encendida, la luz de la region

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de interaccion (indicada por la caja verde superpuesta), extrae las particulas de 4,5 Lni del flujo superior y las lleva al canal inferior derecho como indica la trayectoria blanca superpuesta.

6. Aplicacion en la clasificacion de esperma

a. Antecedentes

En una aplicacion, se pone en practica una clasificacion de celulas de alto rendimiento de alta resolucion mediante el uso de tecnologia de atrapamiento optico. La necesidad de poner en practica esta tecnologia como nueva base para la clasificacion de celulas se evidencia por el fracaso de los citometros de flujo tradicionales al realizar las determinaciones de alta resolucion de las caracteristicas celulares necesarias en muchos problemas de clasificacion. En este ejemplo de separacion de espermas portadores de cromosomas X e Y entre si en la industria ganadera, se escalan los caudales sustancialmente a partir de las velocidades actuales de los sistemas del estado de la tecnica. El motivo es que la citometria de flujo tradicional es mejor para realizar una determinacion de fluorescencia/no fluorescencia y en este modo, puede funcionar a velocidades que proporcionan resultados de 30.000 celulas/segundo. Dado que el problema esta en discriminar entre diferentes niveles de fluorescencia (como lo es en el problema de separacion del esperma), estos metodos se vuelven muy ineficaces. En el problema de separacion del esperma, cuando los espermas portadores de cromosomas X e Y difieren en la fluorescencia en aproximadamente el 4 %, la velocidad se ralentiza a aproximadamente 4.000 celulas de resultado por segundo (vease J.L. Schenk, et al., Proceedings, The Range Beef Cow Symposium XVI, 1999).

b. Clasificacion usando trampas opticas holograficas

El metodo de aplicacion de la clasificacion de celulas de alto rendimiento de alta resolucion, tiene los siguientes componentes: desarrollo microfluidico, desarrollo de un sistema de trampas opticas (componente de atrapamiento para el sistema de canalizacion y el componente de trampa para el sistema de separacion), medida de fluorescencia de alta resolucion, control del sistema (incluido el calculo del holograma) y diseno mecanico.

El primer componente es una celda de flujo que tiene un canal de entrada de fluido, que lleva la muestra de entrada y dos canales de salida que llevan celulas separadas fuera del canal de entrada. El segundo componente es un conjunto de trampas que realizan la funcion de "canalizacion" (esta "funcion de canalizacion" es el equivalente de la boquilla que forma el flujo de gotitas en un citometro de flujo tradicional). El tercer componente es el sistema de deteccion y finalmente, el cuarto componente es el sistema de clasificacion. Las figuras 7A-7B ilustran la relacion entre estos cuatro componentes.

En este ejemplo, se usa esperma como objetivo de muestra para la separacion. El metodo tradicional de diferenciacion entre espermas portadores de cromosomas X e Y emplea Hoechst 33342, un tinte que se une especificamente al ADN de tal forma que la fluorescencia total presente es una medida del ADN total presente. La medida de esta fluorescencia proporciona una estimacion de la naturaleza de la carga cromosomica subyacente. (Schenk, 1999; tambien, Erik B. van Munster, Cytometr y, volumen 47, pagina 192, 2002).

El rasgo esencial que permite esta realizacion propuesta de la presente invencion alcanzar rendimientos altos es su capacidad inherente para desplazar material en lineas paralelas simultaneamente y proximas entre si. Para esta aplicacion inicial, se crea un sistema de flujo con 10 lineas de entrada 300, separadas unas de otras por 10 micrometros. Esto determina una anchura total para el flujo desde el deposito de entrada de 110 micrometros. Los canales de salida 302, 303 tienen cada uno los mismos 110 micrometros de ancho que el canal de entrada 301 y discurren paralelos al canal de entrada 301 como se muestra en las figuras 7A y 7B. Dentro de los “canales de salida” 302, 303 se encuentra una solucion tamponadora que se introduce en estos canales al mismo caudal que se mantiene en el canal de entrada 301. Estos tres canales 301, 302, 303 estan disenados para mantener el flujo laminar en los intervalos de flujo de interes. En la region de clasificacion, donde se transfieren celulas especificas desde el canal de entrada 301 a uno de los canales de salida 302, 303, los tres flujos son adyacentes, sin separacion mecanica entre ellos. Los flujos laminares mantienen cualquier material en su flujo correspondiente a menos que se introduzca una fuerza externa especifica para transferir ese material desde un canal de flujo a otro.

Las trampas de canalizacion 305 actuan sobre las celulas de entrada 306 de modo que ambas se desplazan en lineas de flujo bien definidas y por tanto, las celulas de entrada 306 estan separadas entre si por una distancia minima 306 que debe fijar el operario. Los caudales de los canales 301, 302, 303 se fijan por esta distancia minima 306, por la velocidad de "actualizacion" del dispositivo que realiza la funcion de separacion y por la velocidad global de procesamiento de las celulas deseada. Suponiendo que la distancia minima en el caso de la presente muestra es de 20 micrometros (suficiente para separar completamente las cabezas del esperma, pero una distancia que permitira un solapamiento sin consecuencias de las colas) y una velocidad de procesamiento de 1.500 celulas/segundo, este sistema usa un caudal de 3 mm/segundo [(15.000 celulas/segundo) x (20 micrometros/linea de celulas) (10 lineas)].

El sistema de canalizacion se compone de un patron de trampas 305 de baja intensidad establecido por un conjunto de hologramas estaticos que estan montados en una rueda giratoria de modo que el patron cambia como funcion del

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patron de rotacion. Las trampas de canalizacion mas posteriores son de intensidad y posicion fijas, por lo que solo sirven para mantener la separacion entre las lfneas de flujo de celulas. Las trampas mas anteriores 305 pueden cambiar tanto de intensidad como de posicion con el tiempo para actuar de modo que alteren el flujo en celulas agrupadas y pasen a traves de celulas individuales, no agrupadas.

La medida tras la cual se realiza la determinacion de la clasificacion se puede producir en la region posterior a las trampas de canalizacion 305 o se puede producir en una region mas alla del sistema de canalizacion. Para este sistema inicial, la medida consistira en la deteccion de fluorescencia de alta resolucion. No obstante, en el futuro se pueden aplicar otros criterios de clasificacion activa, tales como medidas de dispersion, o se pueden emplear tecnicas pasivas tales como las que usan la deflexion optica como se explica anteriormente.

El componente final del dispositivo es el sistema de separacion en el que los criterios de clasificacion se utilizan para desviar las celulas hacia uno de los canales de salida 302, 303 o para dejar que permanezcan en el flujo del canal de entrada 301. El parametro crucial para este componente es el campo de vision de la lente de objetivo 304 de abertura numerica alta usada para aplicar la matriz de trampas dinamicas 305 que controlan la separacion. La anchura de este campo de vision son los mismos 110 micrometros de las anchuras de los canales individuales. La longitud, no obstante, depende de los caudales, las profundidades de los canales y las velocidades de actualizacion del dispositivo optico usado para controlar estas trampas.

En la actualidad, una disposicion incluye moduladores de luz espaciales para crear mascaras de fase que son muy eficaces para dirigir sistemas de atrapamiento optico. Estos dispositivos tienen velocidades de actualizacion de 30 Hz o mas. Con una profundidad de los canales estimada de 10 micrometros y suponiendo que las celulas de esperma se deberfan mover en etapas de 1 micrometro, se emplean 10 actualizaciones del modulador de luz espacial para mover una celula desde el centro del canal de entrada 301 hasta el centro de cualquiera de los canales de salida 302, 303. Con un valor de actualizacion de 30 Hz, la aplicacion de estas 10 etapas se producira en 1/3 de segundo. A un caudal de 3 mm/segundo, estas 10 etapas se aplican en una longitud de 1 mm en la direccion del flujo. Por lo tanto la lente de objetivo 304 para el componente de separacion tendrfa un area de trabajo de 110 micrometros x 1000 micrometros. Un area de desarrollo importante de este proyecto es el diseno de este montaje de lente. En general, la compensacion del diseno de la lente esta entre el campo de vision y la abertura numerica. Es decir, para un montaje de lente de una complejidad en particular, un aumento significativo del rendimiento de una de estas areas llevara consigo una disminucion del rendimiento en la otra area. Este es el motivo de que las lentes de alto rendimiento usadas en areas tales como la produccion litografica de alta resolucion de productos electronicos con circuitos integrados sean bastante complejas. No obstante, la presente divulgacion, esta en niveles de rendimiento significativamente inferiores a los de estos montajes de lentes.

7. Divulgacion sobre pinzamiento de vortice de campo amplio

El pinzamiento con un campo de vision amplio implica lentes de objetivo de microscopio que tienen una abertura numerica relativamente baja. La capacidad de atrapar opticamente objetos en la direccion axial se basa en enfocar un haz de luz hacia abajo de manera que tenga los mayores gradientes en la direccion axial. Esto implica que se forme un cono de luz con el radio mas amplio posible. El radio del cono viene determinado directamente por la abertura numerica del objetivo, es decir, una abertura numerica alta significa un radio de cono amplio. Esto esta en conflicto directo con los requisitos de campos de vision amplios. Tradicionalmente, esto ha dificultado el pinzamiento con un campo de vision amplio en la direccion axial. Una de las principales contribuciones a la dificultad del pinzamiento axial es la presion de la radiacion del haz de luz enfocado. Especialmente para partfculas que tienen una buena combinacion de densidad con el medio circundante, por ejemplo, microesferas de poliestireno, la presion de la radiacion puede expulsar las partfculas de la trampa. Con un objetivo de abertura numerica baja, es diffcil superar la presion de la radiacion con una fuerza de pinzamiento suficiente en la direccion axial. No obstante, las trampas opticas holograficas tienen la capacidad de formar modos inusuales de luz que reducen enormemente la presion de la radiacion del haz de luz. Las trampas de vortice, por ejemplo, tienen un centro oscuro debido a que las fases variables de la luz se anulan en el centro de la trampa. Este centro oscuro significa que dejan de existir la mayorfa de los rayos de luz que se desplazan hacia abajo por el centro del haz. Son exactamente estos haces los que albergan la mayor parte de la presion de la radiacion de la luz, de modo que su eliminacion mitiga enormemente la dificultad en el atrapamiento axial. Otros modos, p. ej., modos de donut, tienen la misma ventaja.

La manipulacion (empuje, direccion, clasificacion) de objetos o celulas en general se hace mas segura al tener disponibles multiples haces. Como un lecho de pinchos, las multiples pinzas garantizan que se introduce menos potencia en cualquier punto de la celula en particular. Esto elimina los puntos calientes y reduce el riesgo de dano. Cualquier proceso bifotonico destructor se beneficia enormemente, dado que la absorcion es proporcional al cuadrado de la potencia del laser. La simple adicion de una segunda pinza reduce la absorcion bifotonica en un punto en particular en un factor de cuatro. Las celulas grandes, como las de Tetrahymena, que se mantienen en su sitio mediante una matriz de pinzas, implican una gran cantidad de potencia de laser para un atrapamiento eficaz. La disposicion de la potencia en una sola trampa provocarfa un dano inmediato a la celula.

Por ultimo, la manipulacion incluso de una sola celula se potencia enormemente por la utilizacion de atrapamiento optico holografico. Se puede manipular una sola celula epitelial de carrillo mediante una lfnea de pinzas, que

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levantan la celula a lo largo del perimetro de un lado. La rotacion resultante permite una vision de la celula de 360 grados. Ademas de la ventaja para ver las muestras biologicas, tambien existe la capacidad de orientar las muestras de forma estable, lo que tiene un beneficio claro para estudios tales como experimentos de dispersion que tienen una gran dependencia de la orientacion de la muestra.

8. Clasificador de celulas basado en disco giratorio

Debido a la gran cantidad de esperma de una eyaculacion bovina tipica y la pequena cantidad de tiempo disponible antes de que el esperma deje de ser funcional, para un clasificador de esperma comercialmente viable se clasifica una gran cantidad de esperma por segundo (del orden de un millon). La clasificacion con trampas opticas holograficas confiere una enorme a traves de su capacidad para procesar en paralelo una gran cantidad de celulas.

La tecnologia para usar laseres para acceder a una gran cantidad de sitios rapidamente ya existe en forma de disco laser giratorio, reproductor de CD o reproductor de DVD. Estos dispositivos combinan el movimiento rotacional del disco con el movimiento radial del laser para acceder a sitios a velocidades increiblemente altas. Por ejemplo, el reproductor de DVD tipico puede acceder a aproximadamente 4.000 millones de "bits" independientes en el disco en aproximadamente dos horas. La combinacion de este enfoque de disco giratorio con el atrapamiento optico (vease la figura 8) permite acceder a las celulas a velocidades parecidas y el atrapamiento optico holografico aumenta estas velocidades en factores de 100 o incluso mayores.

Como se muestra en la figura 8, se introducen los objetos o celulas en la entrada de muestras 700 y mediante el uso de un sistema de administracion de muestras 701 apropiado, se disponen las celulas en el disco de distribucion de muestras 702 que se hace rotar por el control de un motor. El sistema de atrapamiento y formacion de imagenes 703, que esta conectado a un sistema de control y analisis 704, clasifica las celulas y se recogen en las camaras de muestras 705 y 706.

Existen muchos mecanismos para distribuir las celulas por toda la superficie del disco. Las camaras de fluidos que alojan celulas individuales, geles que inmovilizan las celulas, superficies pegajosas o cerosas que unen las celulas, o incluso la congelacion de las celulas en una masa solida, son metodos que se pueden emplear. Una vez que las celulas estan situadas de forma que mantienen sus posiciones relativas, se pueden medir correctamente. Se puede usar entonces el atrapamiento optico para liberar las celulas deseadas o las no deseadas de la superficie o volumen. En situaciones donde se desea clasificar en mas de dos grupos, se puede liberar cada grupo en un solo paso y se pueden ejecutar multiples pasos.

9. Clasificacion de celulas y material no biologico mediante el uso de sustratos fundibles

Las tecnologias tales como la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), aunque bien establecidas, padecen el hecho de que son metodos de procesamiento en serie. Debido a la ubicuidad de los tintes marcadores en biologia, es posible la clasificacion basada en estos tintes. Frecuentemente, estos tintes crean una diferencia de absorcion de alguna longitud de onda o intervalo de longitudes de onda entre muestras tenidas y sin tenir, suponiendo que los grupos que se han de clasificar no presentan ya de forma inherente esta diferencia de absorcion. Se pueden usar entonces trampas opticas holograficas tanto para calentar como para manipular la muestra en un sustrato que se funde por la temperatura elevada de la muestra. La muestra que se incrusta se puede liberar despues con un aumento de la temperatura de la masa. Ademas, es posible un metodo de procesamiento aun mas paralelo mas rapido en el que se iluminan las celulas con una fuente de luz amplia de potencia alta que procesa toda la matriz de muestras simultaneamente. El mismo conjunto de metodos se pueden aplicar a muestras no biologicas que difieren en los espectros de absorcion, o se pueden preparar selectivamente para tal fin.

10. Clasificacion basada en gel

Las trampas de laser opticas holograficas suponen una gran ventaja para la manipulacion de objetos en cuanto que pueden acceder a y mover objetos en tres dimensiones. A medida que avanzan las aplicaciones de clasificacion biologica, es necesario clasificar cantidades mayores de muestras, frecuentemente en cantidades de tiempo pequenas. El acceso tridimensional de las trampas opticas holograficas significa que se pueden realizar estas aplicaciones de clasificacion. Se pueden clasificar eficazmente cantidades de celulas y otras muestras de interes biologico que serian engorroso o imposible clasificar en serie o en un sustrato bidimensional.

Una aplicacion de esta clasificacion tridimensional se basa en un proceso de gelificacion reversible. Se gelifican las celulas en una red y despues se extraen del gel las celulas deseadas o las no deseadas usando trampas opticas holograficas. Se puede usar el calor de las trampas para fundir el gel y proporcionar trayectorias de salida.

De forma alternativa, se destruyen celulas de forma selectiva, basandose en algun criterio, las trampas de laser opticas holograficas. Despues, se funde el gel entero y se separan las celulas vivas de las muertas. En lugar de destruirlas simplemente, se puede generar una explosion termica mas destructiva, que desintegra la celula en componentes mucho mas pequenos y despues se puede efectuar la clasificacion basandose en el tamano, agrupando o conectando determinadas celulas juntas de nuevo.

11. Destruccion de muestras biologicas

Una gran variedad de aplicaciones se benefician de la capacidad de destruir muestras biologicas de forma selectiva. 5 Una de estas aplicaciones es la eliminacion de patogenos de la sangre. Otra aplicacion es la clasificacion de celulas. Se identifican las celulas, se destruyen uno o mas grupos de celulas y despues se eliminan las celulas muertas. La destruccion se lleva a cabo por la energia luminica de los propios laseres y no requiere necesariamente trampas opticas para realizar esta funcion.

10 Esencialmente, se calientan las celulas o el medio que rodea las celulas con el haz de laser, danando y destruyendo la celula. Las trampas opticas holograficas, debido a su versatilidad y control tridimensional, permiten la destruccion de celulas paralela masiva selectiva.

12. Fijacion de componentes electronicos 15

Observese que muchas de las tecnicas anteriores se pueden usar para mover componentes electronicos pequenos o para fijar componentes electronicos en su sitio.

Aunque la invencion se ha mostrado en particular con referencia a las realizaciones anteriores, se entendera por los 20 expertos en la tecnica que se pueden hacer en ellas diversos otros cambios en la forma y en los detalles sin salir del alcance de esta invencion.

Claims (15)

1. 5

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   20

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de examen de celulas, que comprende:

   introducir una pluralidad de celulas (104) a traves de un canal de entrada (301) dispuesto entre dos canales tamponadores (302, 303);

   hacer fluir solucion tamponadora a traves de dichos dos canales tamponadores (302, 303);

   mantener flujo laminar en dicho canal de entrada (301) y en dichos dos canales tamponadores (302, 303) en lineas paralelas de flujo; y

   examinar cada una de dicha pluralidad de celulas (104) en una region de interrogacion de dicho canal de entrada (301), para determinar al menos una identidad quimica de cada una de dicha pluralidad de celulas (104) de acuerdo con un analisis de datos espectrales de cada una de dicha pluralidad de celulas (104);

   iluminar dicha pluralidad de celulas usando una fuente de iluminacion de formacion de imagenes;

   caracterizado porque dicha pluralidad de celulas son celulas de esperma portadoras de cromosoma X y de cromosoma Y y se usa un tinte para enlazar a ADN de cada una de dicha pluralidad de celulas de tal manera que una fluorescencia total presente es una medida de un ADN total presente; porque las celulas de esperma de cromosoma X se distinguen de las celulas de esperma de cromosoma Y en base a su fluorescencia; y porque dicha pluralidad de celulas de esperma se destruyen selectivamente en base a algun criterio predeterminado.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho canal de entrada y dichos canales tamponadores estan dispuestos en un clasificador de celulas.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que no hay ninguna separacion mecanica en dicho flujo laminar en dicho canal de entrada (301) y en dichos dos canales tamponadores (302, 303).
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en el que destruir dicha pluralidad de celulas comprende generar una explosion termica que desintegra dicha pluralidad de celulas.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que danar y destruir dicha pluralidad de celulas (104) se consigue usando un laser.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que danar y destruir dicha pluralidad de celulas se basa en analisis de datos espectrales.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que se usa un ordenador para realizar dicho analisis de datos espectrales.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 5, o de la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7 cuando dependen de la reivindicacion 5, que comprende ademas retirar celulas muertas destruidas mediante dicho laser.
9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas generar trampas opticas que atrapan cada una de dicha pluralidad de celulas, para examen.
10. 10. Un aparato dispuesto para examinar celulas, que comprende:

    un canal de entrada (301) dispuesto de tal manera que se pueden introducir una pluralidad de celulas a traves del canal de entrada (301) y dos canales tamponadores (302, 303) dispuestos de tal manera que se puede introducir solucion tamponadora a traves de los canales tamponadores (302, 303), estando dicho canal de entrada (301) dispuesto entre dichos dos canales tamponadores (302, 303) y siendo dicha pluralidad de celulas celulas de esperma portadoras de cromosoma X y de cromosoma Y distinguibles en base a su fluorescencia, y estando enlazado un tinte a ADN de cada una de dicha pluralidad de celulas de tal manera que una fluorescencia total presente es una medida de un ADN total presente, y dispuesto de tal manera que se puede mantener flujo laminar en dicho canal de entrada (301) y en dichos dos canales tamponadores (302, 303) en lineas paralelas de flujo;

    un analizador de datos espectrales que esta configurado para realizar un analisis de datos espectrales de cada una de dicha pluralidad de celulas (104) en una zona de interrogacion de dicho canal de entrada (301), para determinar al menos una identidad quimica de cada una de dicha pluralidad de celulas (104);

    una fuente de iluminacion de formacion de imagenes dispuesta para iluminar dicha pluralidad de celulas; y

    un laser dispuesto para danar y destruir celulas seleccionadas de dicha pluralidad de celulas (104) en base a algun

    criterio predeterminado.
11. 11. El aparato de la reivindicacion 10, en el que dicho canal de entrada y dichos canales tamponadores estan dispuestos en un clasificador de celulas.

    5
12. 12. El aparato de la reivindicacion 10 o la reivindicacion 11, en el que no hay ninguna separacion mecanica en dicho flujo laminar en dicho canal de entrada (301) y en dichos dos canales tamponadores (302, 303).
13. 13. El aparato de la reivindicacion 10, reivindicacion 11 o la reivindicacion 12, que comprende ademas unos medios 10 dispuestos para generar una explosion termica que desintegra dicha pluralidad de celulas en base a algun criterio

    predeterminado.
14. 14. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, dispuesto de tal manera que celulas muertas destruidas por dicho laser son retirables de dicho canal de entrada.

    15
15. 15. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende ademas un aparato de atrapamiento optico accionable para generar trampas opticas que, en uso, atrapan cada una de dicha pluralidad de celulas, para examen.