ES2646815T3

ES2646815T3 - Genes que producen hidrocarburos y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2646815T3
Application number: ES08769538.3T
Authority: ES
Inventors: Lisa Friedman; Bernardo Da Costa
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2007-05-22
Filing date: 2008-05-20
Publication date: 2017-12-18
Anticipated expiration: 2028-05-20
Also published as: US9200299B2; WO2008147781A2; JP2015091244A; JP2010527612A; KR101646966B1; EP2160460A2; AU2008256921B2; BRPI0813359A2; CA2679085A1; WO2008147781A3; AU2008256921A1; KR101862691B1; KR20100022984A; US20160076058A1; EP2160460B1; CA2679085C; JP5912251B2; CN101809146A; KR20160099717A; US20190376094A1

Abstract

Célula modificada genéticamente para expresar una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido de OleA que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 2, en la que la célula es una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de animal no humano, una célula de insecto, una célula bacteriana o una célula de algas, y en la que el polipéptido de OleA está implicado en la biosíntesis de cetonas alifáticas u olefinas.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes que producen hidrocarburos y métodos para su uso

Antecedentes de la invención

Los desarrollos en la tecnología han ido acompañados por un aumento de la dependencia de las fuentes de combustible, y tales fuentes de combustible están haciéndose cada vez más limitadas y difíciles de adquirir. 5 Teniendo lugar el quemado de combustibles fósiles a una tasa sin precedentes, es probable que la demanda de combustible mundial pronto sea mayor que los suministros de combustible actuales.

La mayoría de las fuentes de combustible producidas actualmente proceden de fuentes de petróleo o del procesamiento químico de aceites vegetales. Las fuentes de petróleo se enfrentan a varios problemas: son recursos no renovables, requieren un periodo de tiempo prolongado (años) para formarse, y la formación se restringe a 10 ubicaciones distintas. A medida que el petróleo se consume como fuente de energía, los recursos de petróleo geológicos finalmente se agotarán.

Como resultado, se han dirigido esfuerzos hacia la utilización de fuentes de energía renovable, tales como luz solar, agua, viento y biomasa. El uso de biomasa para producir nuevas fuentes de combustible que no se derivan de fuentes de petróleo (es decir, biocombustible) ha surgido como opción alternativa. El biocombustible (por ejemplo, 15 biodiesel) es un combustible biodegradable compuesto por ésteres y alcanos de cadena larga. El biodiesel puede usarse en la mayor parte de los motores diesel de combustión interna o bien en forma pura, que se denomina biodiesel “puro”, o bien como mezcla en cualquier concentración con diesel de petróleo normal.

En teoría, el biocombustible puede producirse a partir de cualquier fuente de carbono biológica. La fuente de carbono biológica más común, de lejos, son plantas fotosintéticas que capturan energía solar. Se usan muchas 20 plantas diferentes y materiales derivados de plantas para fabricar biocombustibles. Uno de los mayores desafíos técnicos es desarrollar modos para convertir la energía de biomasa específicamente en combustibles líquidos para su transporte. Una estrategia frecuentemente usada para producir biocombustible es cultivar cultivos azucareros (por ejemplo, caña de azúcar o remolacha azucarera) o cultivos de almidón (por ejemplo, maíz) y luego usar la fermentación con levaduras para producir etanol (es decir, alcohol etílico). Otra estrategia frecuentemente usada 25 para producir biocombustible es cultivar plantas que producen de manera natural aceites, tales como palma de aceite, soja o jatrofa. Una fuente alternativa de aceite producido de manera natural es a partir de organismos, tales como algas. Cuando se calientan estos aceites, su viscosidad se reduce, y pueden quemarse directamente en un motor diesel. Alternativamente, los aceites pueden procesarse químicamente para producir combustibles, tales como biodiesel. Los métodos actuales de producción de biodiesel implican la transesterificación de triacilglicéridos (por 30 ejemplo, aceite vegetal o grasa animal) que conduce a una mezcla de ésteres grasos y el producto secundario no deseado glicerina. Esto da como resultado un producto que es heterogéneo y un producto de desecho, lo que conduce a ineficacias económicas.

Los aceites vegetales siguen siendo una alternativa atractiva a los combustibles fósiles porque son recursos renovables. Sin embargo, los aceites vegetales son una parte importante de la cadena alimentaria. Es improbable 35 que puedan cultivarse suficientes cultivos como para satisfacer las necesidades de tanto alimentos como productos químicos industriales, tales como combustibles y polímeros. Además, las plantas productoras de aceites pueden estar restringidas por las condiciones medioambientales en las que florecen. Además, los aceites vegetales no son hidrocarburos (por ejemplo, alcanos o alquenos). Más bien, los aceites vegetales son principalmente triglicéridos, que contienen moléculas de oxígeno, que cuando se queman en un motor de combustión coquificarán el motor. 40

En vista de lo anterior, sería deseable permitir la producción de combustibles a partir de fuentes alternativas con el fin de proporcionar un método mejorado de producción de biocombustibles. La invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para polipéptidos que están implicados en la biosíntesis de hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos. Además, la invención se refiere a métodos de uso de los mismos para la producción de biocombustibles. La invención descrita en el presente documento supera los problemas asociados con recursos 45 de hidrocarburos no renovables, limitados y proporciona métodos mejorados que pueden usarse para producir biocombustibles. Estas y otras ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

El documento US 2003/0233675 A1 se refiere a la expresión de proteínas microbianas en plantas para la producción de plantas con propiedades mejoradas y describe un polipéptido (SEQ ID NO: 15607) que muestra en algún grado 50 identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 de la presente divulgación. Crossman et al. (Genome Biology, Biomed Central Ltd., Londres, 17 de abril de 2008, vol. 9, n.º 4, página R74) describen el análisis de genoma completo, comparativo y funcional de Stenotrophomonas maltophilia. Palleroni y Bradbury (Int. J. of Systematic Bacteriology, 31 de julio de 1993, págs. 606-609) describen Stenotrophomonas como un nuevo nombre de género de bacterias para Xanthomonas maltophilia, para restaurar de ese modo el género Xanthomonas a su definición anterior. Da Silva 55 et al. (Nature, Nature Publishing Group, Londres, 23 de mayo de 2002, vol. 417, n.º 6887, págs. 459-463) describen una comparación de los genomas de dos patógenos de Xanthomonas con especificidades de huésped diferentes. Allen y Bartlett (Microbiology, 2002, vol. 148, págs. 1903-1913) describen la estructura y regulación de los genes de

ácido graso poliinsaturado omega-3 sintasa de la cepa de bacteria de aguas profundas Photobacterium profundum SS9. Kalscheuer et al. (Microbiology, 2006, vol. 152, págs. 2529-2536) se refieren a la producción de microdiesel mediante Escherichia coli modificada genéticamente. El número de registro de la base de datos EBI A0H249 da a conocer una secuencia de polipéptido de Chloroflexus aggregans DSM 9485 relacionada con SEQ ID NO: 18 de la presente divulgación. El número de registro de la base de datos EBI Q6FTD0 da a conocer una secuencia de 5 polipéptido de Candida glabrata relacionada con SEQ ID NO: 64 de la presente divulgación. El número de registro de la base de datos EBI Q8PQT8 da a conocer una secuencia de polipéptido de Xanthomonas axonopodis relacionada con SEQ ID NO: 12 de la presente divulgación.

Breve sumario de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. 10

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia motivo de aminoácido de OleA, OleB, OleC u OleD.

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (b) un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (c) una 15 variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservados; y (d) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% con una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC.

La invención se refiere a un método para producir una cetona alifática que comprende incubar un sustrato con OleA, en condiciones suficientes para producir una cetona alifática. La invención también se refiere a un método para 20 producir un hidrocarburo que comprende incubar un sustrato con OleA, OleB, OleC, OleBC, OleD, o una combinación de los mismos en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo.

La invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica para OleA, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. 25

La invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica para OleC, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos.

La invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica para OleD, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una o más sustituciones, adiciones, inserciones o 30 deleciones de aminoácidos.

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que codifica para OleA, OleC u OleD.

La invención se refiere además a un organismo modificado genéticamente que comprende una secuencia exógena de ácido nucleico incorporada de manera estable en el genoma de un organismo en el sentido de 5’ de una 35 secuencia genómica de ácido nucleico que (a) tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% con una secuencia de ácido nucleico que codifica para OleA, OleB, OleC u OleD y (b) codifica para un polipéptido.

La invención se refiere a un organismo modificado genéticamente preparado (a) proporcionando un organismo que tiene una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% con OleC u OleD y (b) delecionando o mutando la secuencia de ácido nucleico. 40

La invención también se refiere a un método para identificar una enzima útil para la producción de hidrocarburos que comprende transformar una célula que comprende polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en (a) OleA y OleD, (b) OleA y OleC, y (c) OleC y OleD con un ácido nucleico que codifica para una enzima que se sospecha que tiene la capacidad para producir hidrocarburos; y determinar si la célula produce hidrocarburos, en el que la existencia de producción de hidrocarburos por la célula indica que el ácido nucleico codifica para un polipéptido útil 45 para la producción de hidrocarburos.

La invención se refiere a un hidrocarburo que tiene un 13C de -28 o más. La invención también se refiere a un hidrocarburo que tiene un pMC de al menos 50.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

La figura 1 es un cromatograma de iones totales de hidrocarburos extraídos de E. coli C41(DE3) fadE que produce 50 las proteínas OleA (SEQ ID NO: 2), OleC (SEQ ID NO: 6) y OleD (SEQ ID NO: 8).

Las figuras 2A-2J son una serie de diez espectros de EM para los hidrocarburos mostrados en la figura 1. La figura 2A muestra los datos de espectros de EM para trieno C27. La figura 2B muestra los datos de espectros de EM para

dieno C27. La figura 2C muestra los datos de espectros de EM para monoeno C27. La figura 2D muestra los datos de espectros de EM para dieno C28. La figura 2E muestra los datos de espectros de EM para trieno C29. La figura 2F muestra los datos de espectros de EM para dieno C29. La figura 2G muestra los datos de espectros de EM para monoeno C29. La figura 2H muestra los datos de espectros de EM para dieno C30. La figura 2I muestra los datos de espectros de EM para trieno C31. La figura 2J muestra los datos de espectros de EM para dieno C31. 5

La figura 3 es un cromatograma de iones totales de hidrocarburos extraídos de S. maltophilia.

Las figuras 4A-4E son una serie de cromatogramas de iones totales de extracciones con metanol:hexano de diversos cultivos de Stenotrophomonas maltophilia. La figura 4A muestra olefinas detectadas en el extracto de S. maltophilia ATCC 17679 silvestre. La figura 4B muestra que no se detectaron picos principales en el extracto de la cepa de S. maltophilia oleA (deleción de oleA). La figura 4C muestra olefinas detectadas en el extracto de S. 10 maltophilia ATCC 17679. La figura 4D muestra cetonas alifáticas detectadas en los extractos de S. maltophilia oleC (deleción de oleC). La figura 4E muestra las cetonas alifáticas detectadas en los extractos de S. maltophilia oleD (deleción de oleD).

Las figuras 5A-5C son una serie de cromatogramas de iones totales de cetonas alifáticas extraídas de E. coli C41(DE3) que produce la proteína OleA (SEQ ID NO: 2). La figura 5A muestra cetonas alifáticas extraídas de E. coli 15 C41(DE3) que produce la proteína OleA (SEQ ID NO: 2). La figura 5B muestra el extracto de la figura 5A superpuesto con 16-hentriacontano (cetona C31 saturada). La figura 5C muestra el extracto de la figura 5A superpuesto con 14-heptacosanona (cetona C27 saturada).

Las figuras 6A-6H son una serie de espectros de EM para cada cetona alifática mostrada en la figura 5A. La figura 6A muestra una cetona C27:2 (con dos enlaces insaturados). La figura 6B muestra una cetona C27:1 (con un doble 20 enlace). La figura 6C muestra una cetona C27 (saturada). La figura 6D muestra una cetona C29:2 (con dos enlaces insaturados). La figura 6E muestra una cetona C29:1 (con un doble enlace). La figura 6F muestra una cetona C29 (saturada). La figura 6G muestra una cetona C31:2 (con dos enlaces insaturados). La figura 6H muestra una cetona C31:1 (con un doble enlace).

Las figuras 7A-7C demuestran que se detectan cetonas alifáticas en un ensayo in vitro que combina lisado de 25 células de E. coli que expresan oleA (SEQ ID NO: 1) con sustratos de acil-CoA. La figura 7A es un cromatograma de iones totales de un extracto de una muestra que contiene lisado de OleA con un sustrato de miristoil-CoA. La figura 7B es un cromatograma de iones totales del extracto de control que contiene lisado de OleA sin sustrato de miristoil-CoA añadido. La figura 7C es un gráfico que compara la cantidad de cetona encontrada en cada una de las muestras. El eje y representa el área bajo la curva y el eje x representa las cetonas alifáticas indicadas. Las barras 30 sombreadas representan la muestra con extracto celular de OleA solo y las barras negras representan extracto celular de OleA combinado con sustrato de miristoil-CoA.

Las figuras 8A y 8B representan datos de CG/EM data de los extractos de un ensayo in vitro que contiene proteína OleA purificada, sustrato de miristoil-CoA y lisado celular de E. coli C41(DE3). La figura 8A es un cromatograma de iones totales que muestra un pico que eluye al tiempo de retención de 13,95 minutos en el cromatograma de iones 35 totales, indicando la presencia de cetona alifática C27 saturada. La figura 8B representa los espectros de EM para la cetona alifática C27.

La figura 9 es un gráfico del área bajo la curva de CG para cetonas alifáticas que se detectaron en extractos de fermentaciones de E. coli C41(DE3) fadE que contenía diversos vectores para la expresión de secuencias de proteína oleA. Las barras negras representan la cantidad de cetona alifática observada en extractos de una cepa 40 que expresa un plásmido que contiene oleA basándose en el genoma de Chloroflexus aggregans, las barras con rayado diagonal representan la cantidad de cetona alifática observada en extractos de una cepa que expresa un plásmido que contiene oleA basándose en el genoma de Xanthomonas axonopodis, las barras blancas representan la cantidad de cetona alifática observada en extractos de una cepa que expresa un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos nativa que codifica para el polipéptido de OleA de Stenotrophomonas maltophilia 45 ATCC17679, y las barras sombreadas representan la cantidad de cetona alifática observada en extractos de una cepa que expresa un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos sintética, con codones optimizados que codifica para el polipéptido de OleA de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 (S. maltophilia CO). S. maltophilia CO se refiere a la expresión de un ADN sintético con codones optimizados que codifica para la secuencia de aminoácidos de OleA de S. maltophilia R551-3 (SEQ ID NO: 4). 50

La figura 10 es un gráfico que muestra el aumento en la producción de cetonas alifáticas que resultó debido a la expresión de oleA en las cepas de E. coli C41(DE3) con alteraciones en fadE, fadD, y/o tesA. Las barras blancas representan cetona C27, las barras sombreadas representan cetona C29, y las barras negras representan cetona C31. Un signo (-) indica una desactivación de la actividad de un gen y un signo (+) indica sobreexpresión del gen de interés. 55

La figura 11 es un gráfico que muestra el aumento en la producción de olefinas que resultó debido a la expresión de oleA, oleC y oleD en las cepas de E. coli C41(DE3) con alteraciones en fadE, fadD y/o tesA. Las barras blancas representan olefina C27, las barras sombreadas representan olefina C29 y las barras negras representan olefina

C31. Un signo (-) indica una desactivación de la actividad del gen y un signo (+) indica sobreexpresión del gen de interés.

Las figuras 12A-12E son gráficos que muestran la observación de tetradecanal, 14-heptacosanona e isómeros de heptacosano mediante cromatografía CG/EM del extracto orgánico de las reacciones in vitro con las enzimas OleA y OleD combinadas con miristoil coenzima A. La figura 12A es un cromatograma de iones totales de tetradecanal. La 5 figura 12B es un cromatograma de iones totales con 2 picos que indican isómeros de heptacosano. La figura 12C es un espectro de EM del pico 1 de la figura 12B. La figura 12D es un espectro de EM del pico 2 de la figura 12B. La figura 12E es un cromatograma de iones totales de 14-heptacosanona.

Las figuras 13A-13C son una serie de cromatogramas de iones totales que representan la observación de tetradecanal, 14-heptacosanona e isómeros de heptacosano mediante cromatografía CG/EM del extracto orgánico 10 de dos reacciones in vitro de enzimas Ole combinadas con miristoil coenzima A. Una reacción comprendía las enzimas OleA y OleD, y la otra comprendía las enzimas OleA, OleD y OleB. La figura 13A es un cromatograma de iones totales de tetradecanal. La figura 13B es un cromatograma de iones totales de 2 picos que indican isómeros de heptacosano. La figura 13C es un cromatograma de iones totales de 14-heptacosanona. Las flechas indican la reacción OleA + OleD + OleB y la reacción de OleA + OleD. La presencia de OleB potencia la formación de 15 tetradecanal y heptacosano y disminuye los niveles de 14-heptacosanona.

La figura 14 es un cromatograma de iones totales que demuestra que la levadura S. cerevisiae puede producir OleA funcional. La figura 14 muestra un cromatograma de iones totales del extracto de una reacción de lisado celular de S. cerevisiae pESC-HIS-OleA con la adición de miristoil coenzima A. Se observan ácido mirístico, 14-heptacosanona y la adición conocida de control de hexacosano. 20

Las figuras 15A-15H son una serie de cromatogramas de iones totales y espectros de EM que demuestran que se observan olefinas y aldehídos deuterados en el extracto orgánico de un ensayo in vitro que contiene OleA purificada, lisado celular que contiene OleD y NADPH deuterada. La figura 15A es un cromatograma de iones totales de tetradecanal observado tras la extracción de una reacción in vitro que comprende OleA, lisado celular que contiene OleD, miristoil coenzima A y R-(4-2H)NADPH. La figura 15B es un espectro de EM del tetradecanal de la figura 15A. 25 La figura 15C es un cromatograma de iones totales de tetradecanal observado tras la extracción de una reacción in vitro que comprende OleA, lisado celular que contiene OleD, miristoil coenzima A y S-(4-2H)NADPH. La figura 15D es un espectro de EM del tetradecanal de la figura 15C. La figura 15E es un cromatograma de iones totales de isómeros de heptacosano formados mediante la reacción de OleA y lisado celular que contiene OleD con R-(4-2H)NADPH. La figura 15F es un espectro de EM del isómero de heptacosano de la figura 15E. La figura 15G es un 30 cromatograma de iones totales de isómeros de heptacosano observado tras la extracción de una reacción in vitro que comprende OleA, lisado celular que contiene OleD, miristoil coenzima A y S-(4-2H)NADPH. La figura 15H es un espectro de EM del heptacosano de la figura 15G.

Las figuras 16A-16C son una serie de cromatogramas de iones totales que demuestran la capacidad para sintetizar olefinas alifáticas in vitro. La figura 16A es un cromatograma de iones totales del extracto de una reacción realizada 35 con un lisado celular preparado a partir de la cepa de E. coli C41(DE3)fadE con plásmidos para la expresión de oleA, oleB, oleC y oleD con miristoil coenzima A. Las flechas indican heptacosanos C27:1, C27:2 y C27:3. La figura 16B es un cromatograma de iones totales del extracto de una reacción realizada con un lisado celular preparado a partir de la cepa de E. coli C41(DE3)fadE con plásmidos para la expresión de oleA, oleB, oleC y oleD con la adición de miristoil coenzima A. Las flechas indican heptacosanos C27:1, C27:2 y C27:3. La figura 16C es un cromatograma 40 de iones totales del extracto de una reacción realizada con un lisado celular preparado a partir de la cepa de E. coli C41(DE3)fadE con plásmidos para la expresión de oleA, oleB, oleC y oleD con la adición de miristoil-ACP. Las flechas indican heptacosanos C27:1, C27:2 y C27:3.

Las figuras 17A-17J son una serie de cromatogramas de iones totales y espectros de EM de iones seleccionados para hidrocarburos extraídos de fermentaciones de B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB. La figura 17A es 45 un cromatograma de iones totales de la olefina de 25 carbonos que tiene un ion parental de 350. La figura 17B es un espectro de masas de los compuestos que eluyen a un tiempo de retención 3,092 minutos y es característico de una olefina monoinsaturada C25 ramificada. La figura 17C es un cromatograma de iones totales de la olefina de 26 carbonos que tiene un ion parental de 364. La figura 17D es el espectro de masas de los compuestos que eluyen a un tiempo de retención 3,390 minutos y es característico de una olefina monoinsaturada C26 ramificada. La figura 50 17E es un cromatograma de iones totales de la olefina de 27 carbonos que tiene un ion parental de 378. La figura 17F es un espectro de masas de los compuestos que eluyen a un tiempo de retención 3,567 minutos y es característico de una olefina monoinsaturada C27 ramificada. La figura 17G es un cromatograma de iones totales de la olefina de 28 carbonos que tiene un ion parental de 392. La figura 17H es un espectro de masas de compuestos que eluyen a un tiempo de retención 3,893 minutos y es característico de una olefina monoinsaturada C28 55 ramificada. La figura 17I es un cromatograma de iones totales de la olefina de 29 carbonos que tiene un ion parental de 406. La figura 17J es un espectro de masas de compuestos que eluyen a un tiempo de retención 4,013 minutos y es característico de una olefina monoinsaturada C29 ramificada.

Figuras 18A-18E son una serie de cromatogramas de iones totales y espectros de EM de extractos de B. subtilis. La figura 18A es un cromatograma de iones totales de cetonas alifáticas extraídas de B. subtilis IHA01; pHT01_OleA. 60

La figura 18B es un cromatograma de iones totales del extracto de B. subtilis IHA01; pHT01 que no produce ningún hidrocarburo alifático. La figura 18C es un espectro de masas de compuestos que eluyen a un tiempo de retención de 3,584 y es característico de cetonas C25 alifáticas ramificadas. La figura 18D es un espectro de masas de compuestos que eluyen a un tiempo de retención de 4,036 y es característico de cetonas C27 alifáticas ramificadas. La figura 18E es un espectro de masas de compuestos que eluyen a un tiempo de retención de 4,485 y es 5 característico de cetonas C29 alifáticas ramificadas.

Las figuras 19A-19B son un cromatograma de iones totales y espectros de masas de extractos de Arthrobacter aurescens TC1. La figura 19A es un cromatograma de iones totales de hidrocarburos extraídos de Arthrobacter aurescens TC1. Los tres picos indican diversas versiones ramificadas de olefina C29 monoinsaturada. La figura 19B es un espectro de masas de compuestos que eluyen a un tiempo de retención 13,6 minutos y es característico de 10 olefina C29 monoinsaturada.

La figura 20 es un diagrama de las rutas propuestas para la biosíntesis de ácido micólico y la síntesis de olefinas usando OleA, OleB, OleC y OleD. X puede ser o bien CoA o bien ACP.

La figura 21 es un diagrama de una ruta propuesta para la producción de olefinas de cadena larga en organismos productores de ácido micólico que expresan oleC y oleD. 15

La figura 22 es una ruta propuesta para la producción de olefinas de cadena larga en organismos productores de ácido micólico que expresan oleC.

Descripción detallada de la invención

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de varios genes que codifican para proteínas que están implicadas en la biosíntesis de hidrocarburos. Pueden usarse organismos transformados con una o más 20 secuencias de ácido nucleico que codifican para una o más de las proteínas identificadas en el presente documento para generar hidrocarburos, tales como olefinas, y productos intermedios de hidrocarburos, tales como cetonas alifáticas. Los términos “olefina” y “alqueno” se usan de manera intercambiable en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, estas secuencias de ácido nucleico se han identificado como genes que están implicados en la biosíntesis de hidrocarburos. Por tanto, pueden usarse células que se han transformado con 25 uno o más de estos genes como fuente para la producción de hidrocarburos, incluyendo olefinas, y sus precursores (por ejemplo, cetonas alifáticas). Este descubrimiento proporciona una fuente para hidrocarburos que pueden usarse como combustible en lugar de recursos de hidrocarburos no renovables, limitados (por ejemplo, combustibles a base de petróleo). Además, permite la producción de una amplia gama de productos de olefinas y cetonas alifáticas específicos diseñados para aplicaciones particulares. Controlando el organismo huésped y/o los sustratos de 30 reacción (por ejemplo, controlando la longitud de cadena, ramificación, saturación y/o la ubicación de dobles enlaces), pueden crearse organismos que producen una amplia gama de productos de hidrocarburos, incluyendo los que tienen ramificaciones o puntos de insaturación particulares.

Se identificaron cuatro genes en Stenotrophomonas maltophilia que codifican cada uno para una proteína implicada en la biosíntesis de hidrocarburos, tales como olefinas, y productos intermedios de hidrocarburos, tales como 35 cetonas alifáticas. Estos cuatro genes se denominan oleA, oleB, oleC y oleD, y las proteínas codificadas por estos genes se denominan OleA, OleB, OleC y OleD, respectivamente. Además, estos genes también se han encontrado en parejas dentro de otros organismos. Este apareamiento incluye una fusión entre oleB y oleC, en el presente documento denominada oleBC, y la proteína codificada por este gen se denomina OleBC. Conjuntamente, estas cinco proteínas representan una familia de proteínas Ole que están implicadas en la biosíntesis de hidrocarburos y 40 productos intermedios de hidrocarburos. Individualmente, OleA se refiere a una familia de proteínas con actividad de OleA, OleB se refiere a una familia de proteínas con actividad de OleB, OleC se refiere a una familia de proteínas con actividad de OleC, OleBC se refiere a una familia de proteínas con actividad de OleBC y OleD se refiere a una familia de proteínas con actividad de OleD. Un experto habitual en la técnica apreciará que usando la información proporcionada en el presente documento referente a la estructura y función de secuencias génicas de ole de S. 45 maltophilia, pueden obtenerse otras secuencias génicas que codifican para proteínas que tienen actividad similar.

Dadas estas enseñanzas, un experto habitual en la técnica apreciará que pueden clonarse fácilmente secuencias de oleA, oleB, oleC, oleBC y oleD adicionales y usarse para producir hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos. Por tanto, a lo largo de toda esta descripción, la referencia a proteínas Ole debe entenderse que significa todas las proteínas que presentan actividad similar a la de cualquiera de las proteínas de la familia Ole, 50 incluyendo OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD. De manera similar, la referencia a OleA, OleB, OleC, OleBC u OleD debe entenderse que significa todas las proteínas que presentan la actividad respectiva de cada proteína Ole, incluyendo, por ejemplo, todas las proteínas OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD enumeradas en las tablas 1 y 2, así como otras proteínas Ole que pueden identificarse o modificarse por ingeniería genética a través de diversos métodos bioinformáticos o técnicas moleculares, tales como unión de anticuerpos, hibridación de ácidos nucleicos, 55 PCR, y otros métodos adecuados.

Además, a lo largo de toda esta descripción, la referencia a genes ole debe entenderse que significa todos los genes que codifican para proteínas que presentan una actividad similar a la de cualquiera de las proteínas de la familia Ole,

incluyendo OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD. De manera similar, la referencia a oleA, oleB, oleC, oleBC u oleD debe entenderse que significa todos los genes que codifican para proteínas que presentan la actividad respectiva de cada proteína Ole, incluyendo, por ejemplo, todas las proteínas OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD enumeradas en las tablas 1 y 2, así como otras proteínas Ole que pueden identificarse o modificarse por ingeniería genética a través de diversos métodos bioinformáticos o técnicas moleculares, tales como unión de anticuerpos, hibridación de ácidos 5 nucleicos, PCR, y otros métodos adecuados.

La invención se refiere ácidos nucleicos aislados que codifican para proteínas Ole. El término “aislado” con respecto a ácidos nucleicos se refiere a la retirada de un ácido nucleico de su entorno natural. Además, un “ácido nucleico aislado” pretende incluir fragmentos de ácido nucleico, que no se producen de manera natural como fragmentos y no se encontrarían en la naturaleza.El término “aislado” también se usa en el presente documento para referirse a 10 polipéptidos, que están aislados isolated de otras proteínas celulares y pretende abarcar tanto polipéptidos purificados como recombinantes. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de precursores químicos 15 u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Los términos “ácido nucleico” y “secuencia de ácido nucleico” pretenden abarcar un polímero de ADN o ARN (es decir, un polinucleótido), que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o alterados. Debe entenderse que los términos incluyen, como equivalentes, análogos de o bien ARN o bien ADN preparado a partir de análogos nucleotídicos y, según sea aplicable a la realización que está describiéndose, 20 polinucleótidos mono (sentido o antisentido) y bicatenarios, EST, cromosomas, ADNc, ARNm y ARNr.

Las tablas 1 y 2 proporcionan una lista a modo de ejemplo de proteínas Ole. En la tabla 1, #/#* indica que el organismo contiene dos homólodos con las identidades respectivas. Los organismos en negrita tenían o bien una actividad génica demostrada o bien una producción de olefinas demostradas. El porcentaje de identidad se determinó en comparación con la secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC u OleD (tal como se indica en las 25 tablas 1 y 2) de S. maltophilia ATCC17679 tal como se calcula mediante el software BLAST™ fijado a parámetros por defecto. Por ejemplo, puede usarse el software blastn (versión 2.0) para determinar la identidad de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico usando parámetros por defecto (expectativa = 10, matriz = BLOSUM62, filtro = DUST (Tatusov y Lipmann, datos sin publicar; y Hancock y Armstrong, Comput. Appl. Biosci., 10: 67-70 (1994)), coste de existencia de huecos = 11, coste de hueco por residuo = 1 y razón lambda = 0,85). Para la comparación de 30 dos polipéptidos, puede usarse el software blastp (versión 2.0) con parámetros por defecto (expectativa 10, filtro = SEG (Wootton et al., Computers in Chemistry, 17: 149-163 (1993)), matriz = BLOSUM62, coste de existencia de huecos = 11, coste de hueco por residuo = 1, lambda= 0,85).

TABLA 1

Organismo: Proteína SEQ ID NO: Porcentaje de identidad

Stenotrophomonas maltophilia ATCC17679: OleA SEQ ID NO: 152 100

Stenotrophomonas maltophilia R551-3: OleA SEQ ID NO: 150 99

Stenotrophomonas maltophilia K279a: OleA SEQ ID NO: 151 99

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004: OleA SEQ ID NO: 155 88

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa ATCC 33913: OleA SEQ ID NO: 157 88

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa B100: OleA SEQ ID NO: 154 88

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria cepa 85-10: OleA SEQ ID NO: 153 88

Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306: OleA SEQ ID NO: 158 87

Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331: OleA SEQ ID NO: 160 87

Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF 311018: OleA SEQ ID NO: 156 87

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256: OleA SEQ ID NO: 159 87

Xylella fastidiosa Dixon: OleA SEQ ID NO: 162 78

Xylella fastidiosa 9a5c: OleA SEQ ID NO: 163 78

Xylella fastidiosa Ann-1: OleA SEQ ID NO: 478 78

Xylella fastidiosa M12: OleA SEQ ID NO: 161 78

Xylella fastidiosa M23: OleA SEQ ID NO: 229 78

Xylella fastidiosa Temecula1: OleA SEQ ID NO: 479 78

Plesiocystis pacifica SIR-1: OleA SEQ ID NO: 164 48

Chloroflexus aggregans DSM 9485: OleA SEQ ID NO: 165 45

Arthrobacter clorophenolicus A6: OleA SEQ ID NO: 224 45

Chloroflexus aurantiacus J-10-fl: OleA SEQ ID NO: 166 44

Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus: OleA SEQ ID NO: 199 44

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382: OleA SEQ ID NO: 189 44

Arthrobacter aurescens TC1: OleA SEQ ID NO: 168 44

Brevibacterium linens BL2: OleA SEQ ID NO: 204 43

Desulfatibacillum alkenivorans AK-01: OleA SEQ ID NO: 217 42

Congregibacter litoralis KT71: OleA SEQ ID NO: 206 40

Kineococcus radiotolerans SRS30216: OleA SEQ ID NO: 192 39

Micrococcus luteus NCTC 2665: OleA SEQ ID NO: 225 38

Geobacter uraniumreducens Rf4: OleA SEQ ID NO: 190 36

Pelobacter propionicus DSM 2379: OleA SEQ ID NO: 182 36

Opitutus terrae PB90-1: OleA SEQ ID NO: 203 36

Desulfotalea psychrophila LSv54: OleA SEQ ID NO: 174 36

Geobacter bemidjiensis Bem: OleA SEQ ID NO: 212 35

Geobacter lovleyi SZ: OleA SEQ ID NO: 211 35

Shewanella benthica KT99: OleA SEQ ID NO: 218 35

Shewanella loihica PV-4: OleA SEQ ID NO: 188 35

Photobacterium profundum SS9: OleA SEQ ID NO: 169 35

Shewanella baltica OS155: OleA SEQ ID NO: 186 35

Shewanella baltica OS185: OleA SEQ ID NO: 480 35

Shewanella baltica OS195: OleA SEQ ID NO: 197 35

Shewanella baltica OS223: OleA SEQ ID NO: 481 35

Shewanella sp. ANA-3: OleA SEQ ID NO: 181 34

Desulfococcus oleovorans Hxd3: OleA SEQ ID NO: 196 34

Shewanella amazonensis SB2B: OleA SEQ ID NO: 183 34

Shewanellafrigidimarina NCIMB 400: OleA SEQ ID NO: 179 34

Shewanella woodyi ATCC 51908: OleA SEQ ID NO: 200 34

Photobacterium profundum 3TCK: OleA SEQ ID NO: 208 34

Moritella sp. PE36: OleA SEQ ID NO: 215 34

Shewanella denitrificans OS217: OleA SEQ ID NO: 176 34

Psychromonas ingrahamii 37: OleA SEQ ID NO: 184 34

Shewanella pealeana ATCC 700345: OleA SEQ ID NO: 195 34

Shewanella putrefaciens 200: OleA SEQ ID NO: 482 34

Shewanella putrefaciens CN-32: OleA SEQ ID NO: 483 34

Shewanella sediminis HAW-EB3: OleA SEQ ID NO: 194 34

Shewanella sp. W3-18-1: OleA SEQ ID NO: 185 34

Shewanella halifaxensis HAW-EB4: OleA SEQ ID NO: 198 34

Shewanella oneidensis MR-1: OleA SEQ ID NO: 172 34

Shewanella sp. MR-7: OleA SEQ ID NO: 178 34

Colwellia psychrerythraea 34H: OleA SEQ ID NO: 175 34

Shewanella sp. MR-4: OleA SEQ ID NO: 177 34

Geobacter sp. FRC-32: OleA SEQ ID NO: 210 33

Blastopirellula marina DSM 3645: OleA SEQ ID NO: 205 33

Planctomyces maris DSM 8797: OleA SEQ ID NO: 213 33

Rhodopirellula baltica SH 1: OleA SEQ ID NO: 173 33

Lentisphaera araneosa HTCC2155: OleA SEQ ID NO: 214 33

Desulfuromonas acetoxidans DSM 684: OleA SEQ ID NO: 209 32

Gemmata obscuriglobus UQM 2246: OleA SEQ ID NO: 223 30

Psychromonas sp. CNPT3: OleA SEQ ID NO: 207 30

Streptomyces ambofaciens ATCC 23877: OleA SEQ ID NO: 170 29

Opitutaceae bacterium TAV2: OleA SEQ ID NO: 216 37

Arthrobacter sp. FB24: OleA SEQ ID NO: 167 27

Burkholderia oklahomensis C6786: OleA SEQ ID NO: 220 27

Burkholderia oklahomensis EO147: OleA SEQ ID NO: 219 27

Clostridium botulinum A cepa ATCC 3502: OleA SEQ ID NO: 191 27

Clostridium botulinum A3 cepa Loch Maree: OleA SEQ ID NO: 202 27

Clostridium botulinum B1 cepa Okra: OleA SEQ ID NO: 201 27

Clostridium botulinum F cepa Langeland: OleA SEQ ID NO: 193 27

Maricaulis maris MCS10: OleA SEQ ID NO: 180 27

Streptomyces ambofaciens DSM40697: OleA SEQ ID NO: 171 27

Candidatus Kuenenia stuttgartiensis: OleA SEQ ID NO: 226 26

Clostridium botulinum Bf: OleA SEQ ID NO: 222 26

Clostridium botulinum NCTC 2916: OleA SEQ ID NO: 221 26

Burkholderia pseudomallei 1106a: OleA SEQ ID NO: 187 25

Neisseria gonorrhoeae FA 1090: OleA SEQ ID NO: 227 25

Stenotrophomonas maltophilia ATCC17679: OleB SEQ ID NO: 302 100

Stenotrophomonas maltophilia R551-3: OleB SEQ ID NO: 300 98

Stenotrophomonas maltophilia K279a: OleB SEQ ID NO: 301 99

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004: OleB SEQ ID NO: 303 78

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa ATCC 33913: OleB SEQ ID NO: 240 78

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa B100: OleB SEQ ID NO: 236 78

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria cepa 85-10: OleB SEQ ID NO: 253 80

Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306: OleB SEQ ID NO: 241 79

Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331: OleB SEQ ID NO: 251 78

Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF 311018: OleB SEQ ID NO: 325 78

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256: OleB SEQ ID NO: 318 78

Xylella fastidiosa Dixon: OleB SEQ ID NO: 287 72

Xylella fastidiosa 9a5c: OleB SEQ ID NO: 239 72

Xylella fastidiosa Ann-1: OleB SEQ ID NO: 288 72

Xylella fastidiosa M12: OleB SEQ ID NO: 285 72

Xylella fastidiosa M23: OleB SEQ ID NO: 326 72

Xylella fastidiosa Temecula 1: OleB SEQ ID NO: 243 72

Plesiocystis pacifica SIR-1: OleB SEQ ID NO: 314 52

Chloroflexus aggregans DSM 9485: OleB SEQ ID NO: 297 45

Arthrobacter clorophenolicus A6: OleB SEQ ID NO: 323 y 324 46/36*

Chloroflexus aurantiacus J-10-fl: OleB SEQ ID NO: 282 45

Desulfatibacillum alkenivorans AK-01: OleB SEQ ID NO: 316 31

Geobacter uraniumreducens Rf4: OleB SEQ ID NO: 274 53

Pelobacter propionicus DSM 2379: OleB SEQ ID NO: 265 51

Opitutus terrae PB90-1: OleB SEQ ID NO: 286 47

Desulfotalea psychrophila LSv54: OleB SEQ ID NO: 249 39

Geobacter bemidjiensis Bem: OleB SEQ ID NO: 307 52

Geobacter lovleyi SZ: OleB SEQ ID NO: 298 51

Shewanella benthica KT99: OleB SEQ ID NO: 317 56

Shewanella loihica PV-4: OleB SEQ ID NO: 272 53

Photobacterium profundum SS9: OleB SEQ ID NO: 250 54

Shewanella baltica OS155: OleB SEQ ID NO: 271 53

Shewanella baltica OS185: OleB SEQ ID NO: 275 53

Shewanella baltica OS195: OleB SEQ ID NO: 281 53

Shewanella baltica OS223: OleB SEQ ID NO: 308 53

Shewanella sp. ANA-3: OleB SEQ ID NO: 263 53

Desulfococcus oleovorans Hxd3: OleB SEQ ID NO: 280 42

Shewanella amazonensis SB2B: OleB SEQ ID NO: 266 53

Shewanella frigidimarina NCIMB 400: OleB SEQ ID NO: 262 53

Shewanella woodyi ATCC 51908: OleB SEQ ID NO: 284 54

Photobacterium profundum 3TCK: OleB SEQ ID NO: 294 54

Moritella sp. PE36: OleB SEQ ID NO: 313 56

Shewanella denitrificans OS217: OleB SEQ ID NO: 257 54

Psychromonas ingrahamii 37: OleB SEQ ID NO: 267 54

Shewanella pealeana ATCC 700345: OleB SEQ ID NO: 279 54

Shewanella putrefaciens 200: OleB SEQ ID NO: 306 52

Shewanella putrefaciens CN-32: OleB SEQ ID NO: 273 52

Shewanella sediminis HAW-EB3: OleB SEQ ID NO: 277 y 278 54/28*

Shewanella sp. W3-18-1: OleB SEQ ID NO: 270 52

Shewanella halifaxensis HAW-EB4: OleB SEQ ID NO: 283 54

Shewanella oneidensis MR-1: OleB SEQ ID NO: 242 53

Shewanella sp. MR-7: OleB SEQ ID NO: 261 53

Colwellia psychrerythraea 34H: OleB SEQ ID NO: 252 55

Shewanella sp. MR-4: OleB SEQ ID NO: 260 53

Geobacter sp. FRC-32: OleB SEQ ID NO: 296 51

Blastopirellula marina DSM 3645: OleB SEQ ID NO: 291 42

Planctomyces maris DSM 8797: OleB SEQ ID NO: 309 40

Rhodopirellula baltica SH 1: OleB SEQ ID NO: 244 36

Lentisphaera araneosa HTCC2155: OleB SEQ ID NO: 310 35

Desulfuromonas acetoxidans DSM 684: OleB SEQ ID NO: 295 52

Gemmata obscuriglobus UQM 2246: OleB SEQ ID NO: 320 47

Psychromonas sp. CNPT3: OleB SEQ ID NO: 293 51

Streptomyces ambofaciens ATCC 23877: OleB SEQ ID NO: 234 39

Opitutaceae bacterium TAV2: OleB SEQ ID NO: 315 43

Mycobacterium vanbaalenii PYR-1: OleB SEQ ID NO: 268 31

Marinobacter algicola DG893: OleB SEQ ID NO: 311 y 312 30/31*

Hahella chejuensis KCTC 2396: OleB SEQ ID NO: 255 37

Jannaschia sp. CCS1: OleB SEQ ID NO: 256 34

Mycobacterium avium 104: OleB SEQ ID NO: 264 33

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10: OleB SEQ ID NO: 245 33

Anaeromyxobacter sp. Fw109-5: OleB SEQ ID NO: 276 32

Proteobacteria gamma marina HTCC2080: OleB SEQ ID NO: 299 32

Mycobacterium marinum M: OleB SEQ ID NO: 232 y 233 32

Mycobacterium tuberculosis C: OleB SEQ ID NO: 289 32

Mycobacterium tuberculosis H37Rv: OleB SEQ ID NO: 238 32

Mycobacterium tuberculosis cepa Haarlem: OleB SEQ ID NO: 237 y 319 32

Paenibacillus sp. JDR-2: OleB SEQ ID NO: 321 32

Burkholderia cenocepacia AU 1054: OleB SEQ ID NO: 258 31

Burkholderia cenocepacia PC184: OleB SEQ ID NO: 290 31

Burkholderia sp. 383: OleB SEQ ID NO: 254 31

Ralstonia pickettii 12J: OleB SEQ ID NO: 304 31

Burkholderia ambifaria IOP40-10: OleB SEQ ID NO: 322 30

Marinobacter aquaeolei VT8: OleB SEQ ID NO: 269 30

Pseudoalteromonas atlantica T6c: OleB SEQ ID NO: 259 30

Rhodococcus rhodochrous: OleB SEQ ID NO: 246 30

Rhodococcus sp.: OleB SEQ ID NO: 230 30

Rhodococcus sp. TDTM0003: OleB SEQ ID NO: 247 30

Mycobacterium sp. GP1: OleB SEQ ID NO: 248 29

Microscilla marina ATCC 23134: OleB SEQ ID NO: 305 28

Organismo marino sin cultivar: OleB SEQ ID NO: 235 27

Flavobacteriales bacterium HTCC2170: OleB SEQ ID NO: 292 26

Stenotrophomonas maltophilia ATCC17679: OleC SEQ ID NO: 385 100

Stenotrophomonas maltophilia R551-3: OleC SEQ ID NO: 383 98

Stenotrophomonas maltophilia K279a: OleC SEQ ID NO: 384 96

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004: OleC SEQ ID NO: 399 77

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa ATCC 33913: OleC SEQ ID NO: 330 77

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa B100: OleC SEQ ID NO: 335 77

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria cepa 85-10: OleC SEQ ID NO: 348 77

Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306: OleC SEQ ID NO: 329 77

Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331: OleC SEQ ID NO: 332 75

Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF 311018: OleC SEQ ID NO: 349 75

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256: OleC SEQ ID NO: 395 74

Xylella fastidiosa Dixon: OleC SEQ ID NO: 373 73

Xylella fastidiosa 9a5c: OleC SEQ ID NO: 327 y 336 71

Xylella fastidiosa Ann-1: OleC SEQ ID NO: 374 71

Xylella fastidiosa M12: OleC SEQ ID NO: 400 71

Xilella fastidiosa M23: OleC SEQ ID NO: 401 71

Xilella fastidiosa Temecula1: OleC SEQ ID NO: 331 y 340 71

Plesiocystis pacifica SIR-1: OleC SEQ ID NO: 392 48

Chloroflexus aggregans DSM 9485: OleC SEQ ID NO: 381 46

Arthrobacter clorophenolicus A6: OleC SEQ ID NO: 398 33

Chloroflexus aurantiacus J-10-fl: OleC SEQ ID NO: 369 46

Desulfatibacillum alkenivorans AK-01: OleC SEQ ID NO: 402 20

Geobacter uraniumreducens Rf4: OleC SEQ ID NO: 363 51

Pelobacter propionicus DSM 2379: OleC SEQ ID NO: 355 50

Opitutus terrae PB90-1: OleC SEQ ID NO: 372 43

Desulfotalea psychrophila LSv54: OleC SEQ ID NO: 344 41

Geobacter bemidjiensis Bem: OleC SEQ ID NO: 387 51

Geobacter lovleyi SZ: OleC SEQ ID NO: 382 50

Shewanella benthica KT99: OleC SEQ ID NO: 394 45

Shewanella loihica PV-4: OleC SEQ ID NO: 361 44

Photobacterium profundum SS9: OleC SEQ ID NO: 328 y 346 43

Shewanella baltica OS155: OleC SEQ ID NO: 360 41

Shewanella baltica OS185: OleC SEQ ID NO: 364 41

Shewanella baltica OS195: OleC SEQ ID NO: 368 41

Shewanella baltica OS223: OleC SEQ ID NO: 388 41

Shewanella sp. ANA-3: OleC SEQ ID NO: 354 50

Desulfococcus oleovorans Hxd3: OleC SEQ ID NO: 367 46

Shewanella amazonensis SB2B: OleC SEQ ID NO: 356 45

Shewanella frigidimarina NCIMB 400: OleC SEQ ID NO: 353 44

Shewanella woodyi ATCC 51908: OleC SEQ ID NO: 371 44

Photobacterium profundum 3TCK: OleC SEQ ID NO: 378 43

Moritella sp. PE36: OleC SEQ ID NO: 391 42

Shewanella denitrificans OS217: OleC SEQ ID NO: 350 42

Psychromonas ingrahamii 37: OleC SEQ ID NO: 357 41

Shewanella pealeana ATCC 700345: OleC SEQ ID NO: 366 41

Shewanella putrefaciens 200: OleC SEQ ID NO: 386 41

Shewanella putrefaciens CN-32: OleC SEQ ID NO: 362 41

Shewanella sediminis HAW-EB3: OleC SEQ ID NO: 365 41

Shewanella sp. W3-18-1: OleC SEQ ID NO: 359 41

Shewanella halifaxensis HAW-EB4: OleC SEQ ID NO: 370 40

Shewanella oneidensis MR-1: OleC SEQ ID NO: 339 40

Shewanella sp. MR-7: OleC SEQ ID NO: 352 40

Colwellia psychrerythraea 34H: OleC SEQ ID NO: 347 39

Shewanella sp. MR-4: OleC SEQ ID NO: 351 39

Geobacter sp. FRC-32: OleC SEQ ID NO: 380 50

Blastopirellula marina DSM 3645: OleC SEQ ID NO: 376 44

Planctomyces maris DSM 8797: OleC SEQ ID NO: 389 44

Rhodopirellula baltica SH 1: OleC SEQ ID NO: 341 41

Lentisphaera araneosa HTCC2155: OleC SEQ ID NO: 390 39

Desulfuromonas acetoxidans DSM 684: OleC SEQ ID NO: 379 48

Gemmata obscuriglobus UQM 2246: OleC SEQ ID NO: 396 y 397 50/50*

Psychromonas sp. CNPT3: OleC SEQ ID NO: 377 39

Streptomyces ambofaciens ATCC 23877: OleC SEQ ID NO: 333 36

Opitutaceae bacterium TAV2: OleC SEQ ID NO: 393 41

Mycobacterium vanbaalenii PYR-1: OleC SEQ ID NO: 358 34

Nocardia farcinica IFM 10152: OleC SEQ ID NO: 345 43

Organismo marino sin cultivar: OleC SEQ ID NO: 334 31

Bdellovibrio bacteriovorus HD100: OleC SEQ ID NO: 343 28

Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1: OleC SEQ ID NO: 342 28

Roseovarius nubinhibens ISM: OleC SEQ ID NO: 375 26

Stenotrophomonas maltophilia ATCC17679: OleD SEQ ID NO: 456 100

Stenotrophomonas maltophilia R551-3: OleD SEQ ID NO: 454 98

Stenotrophomonas maltophilia K279a: OleD SEQ ID NO: 455 96

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004: OleD SEQ ID NO: 404 82

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa ATCC 33913: OleD SEQ ID NO: 408 82

Xanthomonas campestris pv. campestris cepa B100: OleD SEQ ID NO: 406 80

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria cepa 85-10: OleD SEQ ID NO: 417 80

Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306: OleD SEQ ID NO: 409 80

Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331: OleD SEQ ID NO: 415 79

Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF 311018: OleD SEQ ID NO: 418 79

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256: OleD SEQ ID NO: 142 80

Xylella fastidiosa Dixon: OleD SEQ ID NO: 444 71

Xylella fastidiosa 9a5c: OleD SEQ ID NO: 407 72

Xylella fastidiosa Ann-1: OleD SEQ ID NO: 445 72

Xylella fastidiosa M12: OleD SEQ ID NO: 145 72

Xylella fastidiosa M23: OleD SEQ ID NO: 146 71

Xylella fastidiosa Temecula 1: OleD SEQ ID NO: 411 72

Plesiocystis pacifica SIR-1: OleD SEQ ID NO: 462 y 463 49/38*

Chloroflexus aggregans DSM 9485: OleD SEQ ID NO: 451 y 452 55/46*

Arthrobacter clorophenolicus A6: OleD SEQ ID NO: 144 38

Chloroflexus aurantiacus J-10-fl: OleD SEQ ID NO: 438 45

Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus: OleD SEQ ID NO: 440 41

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382: OleD SEQ ID NO: 431 41

Arthrobacter aurescens TC1: OleD SEQ ID NO: 427 37

Brevibacterium linens BL2: OleD SEQ ID NO: 443 37

Desulfatibacillum alkenivorans AK-01: OleD SEQ ID NO: 149

Congregibacter litoralis KT71: OleD SEQ ID NO: 447 47

Kineococcus radiotolerans SRS30216: OleD SEQ ID NO: 433 39

Micrococcus luteus NCTC 2665: OleD SEQ ID NO: 403 39

Geobacter uraniumreducens Rf4: OleD SEQ ID NO: 432 59

Pelobacter propionicus DSM 2379: OleD SEQ ID NO: 424 55

Opitutus terrae PB90-1: OleD SEQ ID NO: 442 47

Desulfotalea psychrophila LSv54: OleD SEQ ID NO: 413 46

Geobacter bemidjiensis Bem: OleD SEQ ID NO: 458 56

Geobacter lovleyi SZ: OleD SEQ ID NO: 453 56

Shewanella benthica KT99: OleD SEQ ID NO: 464 49

Shewanella loihica PV-4: OleD SEQ ID NO: 429 47

Photobacterium profundum SS9: OleD SEQ ID NO: 414 50

Shewanella baltica OS155: OleD SEQ ID NO: 148 42

Shewanella baltica OS185: OleD SEQ ID NO: 484 44

Shewanella baltica OS195: OleD SEQ ID NO: 485 43

Shewanella baltica OS223: OleD SEQ ID NO: 486 43

Shewanella sp. ANA-3: OleD SEQ ID NO: 423 50

Desulfococcus oleovorans Hxd3: OleD SEQ ID NO: 436 y 437 47/40*

Shewanella amazonensis SB2B: OleD SEQ ID NO: 425 46

Shewanellafrigidimarina NCIMB 400: OleD SEQ ID NO: 422 50

Shewanella woodyi ATCC 51908: OleD SEQ ID NO: 441 46

Photobacterium profundum 3TCK: OleD SEQ ID NO: 449 48

Moritella sp. PE36: OleD SEQ ID NO: 461 45

Shewanella denitrificans OS217: OleD SEQ ID NO: 419 49

Psychromonas ingrahamii 37: OleD SEQ ID NO: 426 48

Shewanella pealeana ATCC 700345: OleD SEQ ID NO: 435 46

Shewanella putrefaciens 200: OleD SEQ ID NO: 457 47

Shewanella putrefaciens CN-32: OleD SEQ ID NO: 430 46

Shewanella sediminis HAW-EB3: OleD SEQ ID NO: 434 46

Shewanella sp. W3-18-1: OleD SEQ ID NO: 428 46

Shewanella halifaxensis HAW-EB4: OleD SEQ ID NO: 439 48

Shewanella oneidensis MR-1: OleD SEQ ID NO: 410 48

Shewanella sp. MR-7: OleD SEQ ID NO: 421 49

Colwellia psychrerythraea 34H: OleD SEQ ID NO: 416 44

Shewanella sp. MR-4: OleD SEQ ID NO: 420 49

Geobacter sp. FRC-32: OleD SEQ ID NO: 450 55

Blastopirellula marina DSM 3645: OleD SEQ ID NO: 446 51

Planctomyces maris DSM 8797: OleD SEQ ID NO: 459 47

Rhodopirellula baltica SH 1: OleD SEQ ID NO: 412 40

Lentisphaera araneosa HTCC2155: OleD SEQ ID NO: 460 40

Desulfuromonas acetoxidans DSM 684: OleD SEQ ID NO: 487 51

Gemmata obscuriglobus UQM 2246: OleD SEQ ID NO: 143 52

Psychromonas sp. CNPT3: OleD SEQ ID NO: 448 48

Streptomyces ambofaciens ATCC 23877: OleD SEQ ID NO: 405 44

Opitutaceae bacterium TAV2: OleD SEQ ID NO: 147 28

TABLA 2

Organismo: Proteína Seq ID No Porcentaje de identidad de OleB Porcentaje de identidad de OleC

Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus: OleBC SEQ ID NO: 138 33 36

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382: OleBC SEQ ID NO: 136 33 35

Arthrobacter aurescens TC1: OleBC SEQ ID NO: 135 37 33

Brevibacterium linens BL2: OleBC SEQ ID NO: 139 27 34

Kineococcus radiotolerans SRS30216: OleBC SEQ ID NO: 137 31 34

Micrococcus luteus NCTC 2665: OleBC SEQ ID NO: 141 32 32

Congregibacter litoralis KT71: OleBC SEQ ID NO: 140 32 33

La invención se refiere a cinco familias de proteínas implicadas en la biosíntesis de hidrocarburos, las familias de proteínas OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD, que se denominan colectivamente la familia de proteínas Ole. Se usaron programas bioinformáticos, tales como los programas BLAST (proporcionados por los NHI, Bethesda, MD), para identificar secuencias de proteína y nucleótidos que pertenecen a las familias de proteínas OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD. 5

Con el fin de identificar proteínas que lo más probablemente estén implicadas en la biosíntesis de hidrocarburos, se aplicaron restricciones adicionales al análisis bioinformático. La biosíntesis de hidrocarburos no se realiza mediante una única proteína Ole. Por tanto, puede ser más probable que los organismos que contienen las cuatro proteínas Ole produzcan hidrocarburos. Por consiguiente, se realizó el análisis bioinformático en más de 940 genomas bacterianos, así como más de 100 genomas de arqueas y eucariotas. Esta investigación reveló 67 genomas 10 bacterianos que contienen los cuatro genes de síntesis de hidrocarburos ole: Stenotrophomonas maltophilia R551-3, Stenotrophomonas maltophilia K279a, Arthrobacter aurescens TC1, Arthrobacter clorophenolicus A6, Blastopirellula marina DSM 3645, Brevibacterium linens BL2, Desulfococcus oleovorans Hxd3, Chloroflexus aggregans DSM 9485, Chloroflexus aurantiacus J-10-fl, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382, Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus, Colwellia psychrerythraea 34H, Congregibacter litoralis KT71, Desulfotalea 15 psychrophila LSv54, Desulfuromonas acetoxidans DSM 684, Gemmata obscuriglobus UQM 2246, Geobacter bemidjiensis Bem, Geobacter lovleyi SZ, Geobacter sp. FRC-32, Geobacter uraniumreducens Rf4, Kineococcus radiotolerans SRS30216, Lentisphaera araneosa HTCC2155, Micrococcus luteus NCTC 2665, Moritella sp. PE36, Opitutus terrae PB90-1, Pelobacter propionicus DSM 2379, Photobacterium profundum 3TCK, Photobacterium profundum SS9, Planctomyces maris DSM 8797, Plesiocystis pacifica SIR-1, Psychromonas ingrahamii 37, 20 Psychromonas sp. CNPT3, Rhodopirellula baltica SH 1, Shewanella amazonensis SB2B, Shewanella baltica OS155, Shewanella baltica OS185, Shewanella baltica OS195, Shewanella baltica OS223, Shewanella benthica KT99, Shewanella denitrificans OS217, Shewanella frigidimarina NCIMB 400, Shewanella halifaxensis HAW-EB4, Shewanella loihica PV-4, Shewanella oneidensis MR-1, Shewanella pealeana ATCC 700345, Shewanella putrefaciens 200, Shewanella putrefaciens CN-32, Shewanella sediminis HAW-EB3, Shewanella sp. ANA-3, 25 Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. MR-7, Shewanella sp. W3-18-1, Shewanella woodyi ATCC 51908, Streptomyces ambofaciens ATCC 23877, Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306, Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004, Xanthomonas campestris pv. campestris cepa B100, Xanthomonas campestris pv. campestris cepa ATCC 33913, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria cepa 85-10, Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331, Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF 311018, Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256, 30 Xylella fastidiosa 9a5c, Xylella fastidiosa Ann-1, Xylella fastidiosa Dixon, Xylella fastidiosa M12, Xylella fastidiosa M23 y Xylella fastidiosa Temecula 1.

Informes previos han intentado caracterizar la capacidad de diversos organismos para producir hidrocarburos, pero estos informes no pudieron confirmarse (véanse, por ejemplo, Jones et al., J. Gen. Microbiol., 59: 145-152 (1969), Ladygina et al., Process Biochemistry, 41:1001-1014 (2006)). Aunque se publica muy poco sobre la capacidad de los 35 organismos para producir hidrocarburos no isoprenoides, hay cuatro organismos que se ha mostrado en la bibliografía que producen los tipos de olefinas descritos en el presente documento: Stenotrophomonas maltophilia, Kineococcus radiotolerans, especies de Chloroflexus y diversas especies de Micrococcus, incluyendo la secuenciada recientemente Micrococcus luteus (Tomabene et al., Can. J. Microbiol., 24: 525-532 (1978); Suen et al., Journal of Industrial Microbiology, 2: 337-348 (1988); Morrison et al., J. Bacteriol., 108: 353-358 (1971); van der Meer 40 et al., Org. Geochem., 30: 1585-1587 (1999); Albro et al., Biochemistry, 8: 394-404 (1969); Philips et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52:933-938 (2002)).

Búsquedas bioinformáticas identificaron independientemente los cuatro genes ole en Stenotrophomonas maltophilia (R551-3 y K279a), Kineococcus radiotolerans, Chloroflexus aggregans, Chloroflexus aurantiacus y Micrococcus luteus. Además, se ha confirmado la producción de hidrocarburos (por ejemplo, olefinas) a partir de estos 45 organismos. Específicamente, se sometieron a prueba las proteínas Ole de varios de estos organismos para determinar su capacidad para producir hidrocarburos. Se seleccionaron dos organismos que se sabe que producen hidrocarburos y dos organismos que no se ha notificado que produzcan hidrocarburos, pero se identificaron en el análisis bioinformático, y sometieron a prueba para determinar su capacidad para producir hidrocarburos cuando se expresan en E. coli. 50

El ejemplo 6 muestra que las secuencias de proteína OleA, OleC y OleD de Stenotrophomonas maltophilia, Xanothomonas axonopodis y Chloroflexus aggregans funcionan produciendo hidrocarburos cuando se expresan en un huésped, tal como E. coli o Bacillus megaterium. Además, la secuencia de proteína OleC de Plesiocystis pacifica también produce hidrocarburos cuando se expresa con oleA y oleD en E. coli.

Para confirmar que estos genes confieren capacidad de producción de hidrocarburos en Stenotrophomonas 5 maltophilia, se prepararon mutaciones por deleción de oleA, oleC y oleD en una cepa productora de hidrocarburos de Stenotrophomonas maltophilia. Los mutantes por deleción de Stenotrophomonas maltophilia que carecen de oleA no producen ningún hidrocarburo, los mutantes por deleción de Stenotrophomonas maltophilia que carecen de o bien oleC o bien oleD no producen hidrocarburos, pero producen cetonas alifáticas en su lugar.

Usando bioinformática, pueden diseñarse motivos de aminoácidos de Ole identificando regiones conservadas de 10 cada proteína Ole. Estos motivos de aminoácidos pueden diseñarse mediante alineaciones de proteínas seguido por inspección visual de las secuencias de proteína. Estos motivos de aminoácidos pueden usarse entonces para identificar proteínas que tienen funciones biológicas similares a las proteínas Ole. Varios programas bien conocidos en la técnica pueden usar los motivos de aminoácidos para identificar proteínas que pertenecen a la familia de proteínas funcionales. Por ejemplo, uno de tales programas disponibles públicamente es 15 http://motif.genome.jp/motif2.html (véase el ejemplo 7).

Basándose en los datos experimentales, se predijo que los organismos que contienen los cuatro genes ole lo más probablemente tienen la capacidad para producir hidrocarburos. Por tanto, los motivos de aminoácidos se crearon compilando todas las secuencias de proteínas OleA, OleB, OleC y OleD de los sesenta y siete organismos (véase, por ejemplo, la tabla 1) que contienen las cuatro proteínas Ole. Por fusiones de proteínas, tales como las proteínas 20 OleBC, se alinearon las secciones de OleB con las secuencias de proteína OleB y se alinearon las secciones de OleC con la secuencia de proteína OleC. Los organismos con secuencias genómicas parciales o posibles recombinaciones genómicas no se incluyeron en la tabla 1 y, por tanto, no se usaron para diseñar estos motivos de aminoácidos. Basándose en las regiones conservadas de estos sesenta y siete organismos que contienen los cuatro genes ole, se predice que otras secuencias de polipéptido que contienen estos motivos de aminoácidos pueden ser 25 proteínas Ole funcionales. Los motivos de aminoácidos diseñados a partir de los sesenta y siete organismos que contienen los cuatro genes ole se muestran en las tablas 3-6. En todos los motivos representados, la numeración de subíndices indica la posición del aminoácido dentro del motivo. X representa cualquier aminoácido (por ejemplo, cualquier aminoácido que se produzca de manera natural), y los elementos entre corchetes reflejan la elección de residuos de aminoácido para la posición indicada. Por ejemplo, [LF]1 significa o bien L o bien F en la posición de 30 residuo 1.

TABLA 3

TABLA 4

35

TABLA 5

TABLA 6

Se desarrollaron motivos de aminoácidos adicionales considerando adicionalmente la bibliografía publicada que identificó organismos como productores de hidrocarburos en combinación con datos bioinformáticos que muestran 5 que estos organismos también contenían los cuatro genes ole. Además, se desarrollaron estos motivos usando datos experimentales que demostraron que los organismos particulares sometidos a prueba con los cuatro genes ole producían hidrocarburos. Estos motivos de aminoácidos se muestran en las tablas 7-9.

TABLA 7

10

TABLA 8

TABLA 9

Finalmente, se desarrollaron motivos de aminoácidos adicionales alineando secuencias de proteínas Ole de 5 organismos cuyos genes ole se expresaron de manera heteróloga en E. coli y se confirmó que tenían un papel en la producción de hidrocarburos (véase, por ejemplo, el ejemplo 6). Estos motivos de aminoácidos se muestran en las tablas 10-12.

TABLA 10

10

TABLA 11

TABLA 12

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia 5 de motivo de aminoácido de OleA, OleB, OleC u OleD. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64-74 y 91-133.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de OleA. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una 10 secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64-69, 98-102 y 116-120. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de OleB. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 91-97. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de OleC. Por ejemplo, el ácido nucleico 15 aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 72-74, 103-108 y 121-126. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de OleD. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, 71, 109-115 y 127-133. 20

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende más de una secuencia de motivo de aminoácido de OleA, OleB, OleC u OleD. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una, dos, tres o cuatro secuencias de motivo de aminoácido de Ole. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de OleB y una secuencia de motivo de aminoácido de OleC. 25

Alternativamente, el ácido nucleico aislado puede codificar para más de un polipéptido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de Ole. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende una secuencia de motivo de aminoácido de Ole o en el que cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64-74 y 91-133. El ácido 5 nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido y un tercer polipéptido, en el que cada uno del primer, segundo y tercer polipéptido comprende una secuencia de motivo de aminoácido de Ole. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido y un tercer polipéptido, en el que cada uno del primer, segundo y tercer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64-74 y 91-133. El ácido nucleico aislado puede codificar para 10 un primer polipéptido, un segundo polipéptido, un tercer polipéptido y un cuarto polipéptido, en el que cada uno del primer, segundo, tercer y cuarto polipéptido comprende una secuencia de motivo de aminoácido de Ole. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido, un tercer polipéptido y un cuarto polipéptido, en el que cada uno del primer, segundo, tercer y cuarto polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64-74 y 91-133. 15

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido de no más de 1500 residuos de aminoácido que comprende una secuencia de motivo de aminoácido de Ole. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido de no más de 1500 residuos de aminoácido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64-74 y 91-133. Cada uno de los polipéptidos primero y segundo puede ser de no más de 1500 residuos de aminoácido, cada uno de los polipéptidos primero, segundo y 20 tercero puede ser de no más de 1500 residuos de aminoácido, o cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercer y cuarto es de no más de 1500 residuos de aminoácido.

El análisis bioinformático de los genes ole reveló que los genes se encuentran a menudo dentro de una región de pares de bases de 5000 a 10000 transcrita en la misma dirección que si estuviese en un operón. Los genes se han encontrado también en pares dentro de los organismos. Esta formación de pares incluye una fusión de proteínas 25 entre OleB y OleC (en el presente documento denominada OleBC). Por ejemplo, se ha observado la fusión del gen oleBC en siete de los 67 organismos descritos anteriormente: Arthrobacter aurescens, ambas especies de Clavibacter michiganensis, Kineococcus radiotolerans, Brevibacterium linens, Congregibacter litoralis y Micrococcus luteus.

Identificar un organismo que contiene uno o más del/de los gen(es) ole indicaría que el organismo también produce 30 hidrocarburos de manera natural. Se usaron técnicas bioinformáticas para identificar otros organismos secuenciados que contienen genes que pertenecen a estas familias génicas (véanse, por ejemplo, las tablas 1 y 2). Pueden usarse estos genes para conferir producción de hidrocarburos en su organismo huésped, así como en otros huéspedes cuando se expresan en otros organismos huésped. Un experto habitual en la técnica apreciará que pueden clonarse fácilmente secuencias de oleA, oleB, oleC, oleD y oleBC adicionales y usarse para elaborar hidrocarburos y 35 productos intermedios de hidrocarburos. Puede encontrarse una lista a modo de ejemplo de proteínas OleA, OleB, OleC, OleD y OleBC adicionales identificadas usando los métodos dados a conocer en el presente documento en las tablas 1 y 2. Un experto en la técnica podría identificar o deducir las secuencias génicas a partir de las secuencias de proteínas OleA, OleB, OleC, OleD y OleBC expuestas en las tablas 1 y 2.

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende, consiste 40 esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (b) un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (c) una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 45 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 99,5%) con una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC.

Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID 50 NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (b) un homólogo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (c) una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID 55 NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con 60 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO

478-487.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 5 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado codifica para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 10 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos de OleA. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 150-229. El 15 ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos de OleB. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un 20 polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 230-326. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, SEQ ID NO: 10.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste 25 en, una secuencia de aminoácidos de OleC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 327-402. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID 30 NO: 20 y SEQ ID NO: 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos de OleD. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 142-149 y SEQ ID NO: 403-35 464. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos de OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un 40 polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 135-141.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste 45 esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un 50 homólogo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es un homólogo de OleA. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de 55 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 150-229. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es un homólogo de OleB. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 230-326. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, 5 un homólogo de SEQ ID NO: 10.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es un homólogo de OleC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 10 20, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 327-402. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es un homólogo de OleD. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede 15 codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 142-149 y SEQ ID NO: 403-464. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22 20

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es un homólogo de OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un homólogo de SEQ ID NO: 135-141.

Un homólogo de una proteína OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC es uno que se comporta de manera funcional 25 sustancialmente igual que una proteína OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC, por ejemplo, en cuanto a tener actividad hidrocarburo sintasa. Por ejemplo, una proteína OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC y un homólogo de proteína OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC no tienen necesariamente secuencias de aminoácidos similares. Sin embargo, tienen actividades hidrocarburo sintasa similares.

Los cálculos de “homología” entre dos secuencias pueden realizarse tal como sigue. Se alinean las secuencias con 30 fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácidos para lograr una alineación óptima y pueden ignorarse secuencias no homólogas con fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia que se alinea con fines de comparación es de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al 35 menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento, “identidad” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente 40 a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que tienen que introducirse para lograr una alineación óptima de las dos secuencias.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, 45 OleB, OleC, OleD u OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que 50 comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste 55 en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 150-229. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de 60

aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleB. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o 5 consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 230-326. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de SEQ ID NO: 10.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste 10 en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 327-402. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de 15 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleD. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o 20 consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 142-149 y SEQ ID NO: 403-464. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22. 25

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 135-141. 30

Tal como se usa en el presente documento, una “variante” del polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido X en el que se alteran uno o más residuos de aminoácido. La variante puede tener cambios conservativos o cambios no conservativos. Puede encontrarse una guía para determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR). 35

El término “variante,” cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótido, puede abarcar una secuencia de polinucleótido relacionada con la de un gen o la secuencia codificante del mismo. Esta definición puede incluir también, por ejemplo, variantes “alélicas”, “de corte y empalme”, “de especie” o “polimórficas”. Una variante de corte y empalme puede tener identidad significativa con un polinucleótido de referencia, pero tendrá generalmente un número mayor o menor de polinucleótidos debido al corte y empalme alternativo de exones durante 40 el procesamiento del ARNm. El polipéptido correspondiente puede presentar dominios funcionales adicionales o no tener dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótido que varían de una especie a otra. Los polipéptidos resultantes tendrán generalmente una identidad de aminoácidos significativa entre sí. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótido de un gen particular entre individuos de una especie dada. 45

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden ser cualquier sustitución de aminoácidos mostrada en la tabla 13. Específicamente, las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden seleccionarse del grupo que consiste en alanina a D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys; arginina a D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, lle, D-Met, D-lle, Orn, D-Orn; asparagina a D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln; ácido aspártico a D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln; cisteína a D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr; ácido glutámico a D-Glu, D-50 Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln; glicina a Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, b-Ala, Acp; isoleucina a D-lle, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met; leucina a D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met; lisina a D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, lle, D-lle, Orn, D-Orn; metionina a D-Met, S-Me-Cys, lle, D-lle, Leu, D-Leu, Val, D-Val; fenilalanina a D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, trans-3, 4 ó 5-fenilprolina, cis-3, 4 ó 5-fenilprolina; prolina a D-Pro, ácido L-1-tioazolidin-4-carboxílico, ácido D- o L-1-oxazolidin-4-carboxílico; serina a D-Ser, Thr, D-55 Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys; treonina a D-Thr, Ser, D-Ser, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val; tirosina a D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His; y valina a D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met.

TABLA 13

Para aminoácido: Código Sustituir con cualquiera de

Alanina: A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys

Arginina: R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, lle, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn

Asparagina: N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln

Ácido aspártico: D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln

Cisteína: C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr

Ácido glutámico: E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln

Glicina: G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, b-Ala, Acp

Isoleucina: 1 D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met

Leucina: L D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met

Lisina: K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn

Metionina: M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val

Fenilalanina: F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3, 4 ó 5-fenilprolina, cis-3, 4 ó 5-fenilprolina

Prolina: P D-Pro, ácido L-1-tioazolidin-4-carboxílico, ácido D- o L-1-oxazolidin-4-carboxílico

Serina: S D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys

Treonina: T D-Thr, Ser, D-Ser, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val

Tirosina: Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His

Valina: V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

Una variante conservativa de una proteína Ole puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, una variante conservativa puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ó 50 sustituciones de aminoácidos conservativas. En una realización preferida, una variante conservativa tiene no más de 50 sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, una variante conservativa puede tener no más de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ó 50 sustituciones de aminoácidos conservativas. Una variante conservativa de SEQ ID 5 NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487 es una que se comporta de manera funcional sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos respectiva sin las sustituciones de aminoácidos. Uno cualquiera de los ensayos proporcionados en el presente documento puede usarse para evaluar la actividad. En algunos ejemplos, una variante conservativa de una proteína OleA puede 10 someterse a ensayo para determinar la actividad hidrocarburo sintasa, tal como actividad de condensación de acilo, actividad cetona alifática sintasa y/o actividad olefina sintasa. Tal como se usa en el presente documento, el término “sintasa” se refiere a una enzima que cataliza un proceso de síntesis. Tal como se usa en el presente documento, el término sintasa incluye sintasas, sintetasas y ligasas.

En otros ejemplos, pueden someterse a ensayo variantes conservativas de OleC y OleD para determinar la actividad 15 tal como se describe en el presente documento. La variante conservativa puede tener, por ejemplo, una sustitución de aminoácido conservativa, dos sustituciones de aminoácido, tres sustituciones de aminoácido, cuatro sustituciones de aminoácido o cinco o más sustituciones de aminoácido en una secuencia de aminoácidos, siempre que se mantenga la actividad de la proteína.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste 20 en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 88 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas seleccionada del grupo que consiste en Ala a Cys, Gly o Ser; Arg a lle, Lys, Met u Orn; Asn a Asp, Gln, Glu o His; Asp a Asn, Gln o Glu; Cys a Met, Ser o Thr; Gln a Asn, Asp o Glu; Glu a Asn, Asp o Gln; 25 Gly a Acp, Ala o Pro; His a Asn o Gln; lle a Leu, Met o Val; Leu a lle, Met o Val; Lys a Arg, Gln, Glu, lle, Met u Orn; Met a Cys, lle, Leu o Val; Phe a His, L-Dopa, Leu, Met, Thr, Trp, Tyr, 3-fenilprolina, 4-fenilprolina o 5-fenilprolina; Pro a ácido L-1-tioazolidin-4-carboxílico o ácido D- o L-1-oxazolidin-4-carboxílico; Ser a Cys, Met o Thr; Thr a Met, Ser o Val; Trp a Tyr; Tyr a L-Dopa, His o Phe; y Val a lle, Leu o Met.

En algunas realizaciones, una variante conservativa incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservativas 30 en comparación con la secuencia de la que se deriva, y aún conserva su actividad respectiva. Por ejemplo, una variante conservativa puede conservar al menos el 10% de la actividad biológica de la proteína original de la que se deriva, o alternativamente, al menos el 20%, al menos el 30%, o al menos el 40% de la actividad biológica de la proteína original. Una variante conservativa puede conservar al menos el 50% de la actividad biológica de la proteína original de la que se deriva. Las sustituciones de aminoácidos conservativas de una variante conservativa 35 pueden producirse en cualquier dominio de la proteína. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden dar como resultado actividad biológica potenciada en comparación con la proteína original. Por ejemplo, la variante conservativa puede tener una actividad biológica de al menos el 100% de la actividad biológica de la proteína original de la que se deriva, o alternativamente, al menos el 110%, al menos el 120%, al menos el 150%, al menos el 200% o al menos el 1000% de la actividad biológica de la proteína original de la que se deriva. 40

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 99,5%) con OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, 5 consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID 10 NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos 15 el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 88.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste 20 en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con OleA. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una 25 identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 150-229.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste 30 en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con OleB. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una 35 identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 230-326.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos 40 el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con OleC. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al 45 menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 327-402.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al 50 menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con OleD. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, 55 al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 142-149 y SEQ ID NO: 403-464.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos 60 el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con OleBC. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o

consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 135-141.

Un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, 5 una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de entre el 35% y el 100% con una secuencia de aminoácidos que codifica para una proteína Ole también se proporciona en el presente documento. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 10 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5% con una secuencia de aminoácidos que codifica para una proteína Ole.

Aunque se dan a conocer realizaciones particulares de hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos que forman secuencias de ácido nucleico y aminoácidos, se entenderá que pueden aislarse secuencias que tienen características estructurales similares de otros organismos. Estas secuencias recién aisladas pueden someterse a 15 ensayo para determinar la actividad hidrocarburo sintasa (véanse las tablas 1 y 2 para una lista de ejemplos no limitativos, específicos de secuencias relacionadas). Además, se entenderá que otras formas funcionalmente equivalentes de secuencias de ácido nucleico y aminoácidos dadas a conocer en el presente documento pueden identificarse fácilmente y/o generarse usando técnicas de biología molecular convencionales, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de cebador M13, PCR propensa a error, PCR sexual, síntesis de 20 ADN o intercambio de ADN. Se proporcionan detalles de muchas de estas técnicas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor, Nueva York (2000).

Por tanto, además de secuencias estructuralmente relacionadas y secuencias homólogas, la divulgación también abarca secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID 25 NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88 y/o SEQ ID NO: 135-464. También se abarcan secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 99,5% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88 y/o SEQ ID NO: 135-464. 30

Las secuencias que conservan similitud estructural y funcional con respecto a OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD pueden identificarse mediante varios métodos conocidos. Uno de tales métodos implica el examen de secuencias genómicas para la alineación de secuencias con la(s) secuencia(s) conocida(s). Los métodos para alinear secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith et al., Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981); Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443 (1970); Pearson 35 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988); Higgins et al., Gene, 73: 237-244 (1988); Higgins & Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16: 10881-10890 (1988); Huang et al., CABIOS, 8: 155-165 (1992); y Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24: 307-331 (1994). Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990), presentan una descripción detallada de los métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología. 40

El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman, citado anteriormente, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz BLOSUM62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse también usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz 45 NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que debería usarse si el profesional no tiene claro qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) es una matriz de puntuación BLOSUM62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento del marco de lectura de 5. 50

En el presente documento se da a conocer un ácido nucleico aislado que codifica para más de un polipéptido, en el que cada polipéptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (b) un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD, u OleBC; (c) una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC que comprende una o más sustituciones de 55 aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. El ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que cada uno del primer 60 y segundo polipéptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos

seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (b) un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (c) una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al 5 menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que cada uno del primer y segundo polipéptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID 10 NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (c) una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 15 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 20 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido y un tercer polipéptido, en el que cada uno de los polipéptidos primero, segundo y tercero comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos de 25 OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (b) un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (c) una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos 30 el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido, y un tercer polipéptido, en el que cada uno de los polipéptidos primero, segundo y tercero comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ 35 ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (c) una variante conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, 40 SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos el 85%, al menos 90%, al menos el 95%, al menos 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID 45 NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido, un tercer polipéptido y un cuarto polipéptido, en el que cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) 50 una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (b) un homólogo de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC; (c) una variante conservativa de una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al 55 menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con una secuencia de aminoácidos de OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un primer polipéptido, un segundo polipéptido, un tercer polipéptido y un cuarto polipéptido, en el que cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID 60 NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487; (c) una variante

conservativa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas; y (d) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 5 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que tiene 1500 residuos de aminoácido, 1400 residuos de aminoácido, 1300 residuos de aminoácido, 1200 residuos de aminoácido, 1100 residuos de aminoácido, 1000 10 residuos de aminoácido, 900 residuos de aminoácido, 800 residuos de aminoácido, 700 residuos de aminoácido, 600 residuos de aminoácido, 500 residuos de aminoácido, 400 residuos de aminoácido o 300 residuos de aminoácido. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que tiene no más de 1500 (por ejemplo, no más de 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ó 200) residuos de aminoácido.

El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que tiene al menos 100 residuos de aminoácido. Por 15 ejemplo, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que tiene al menos 200 residuos de aminoácido, al menos 250 residuos de aminoácido o al menos 300 residuos de aminoácido. Alternativamente, el ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que tiene no menos de 100 (por ejemplo, no menos de 100, 150, 200 ó 250) residuos de aminoácido. El ácido nucleico aislado puede codificar para un polipéptido que tiene entre 200 residuos de aminoácido y 1500 residuos de aminoácido, entre 300 residuos de aminoácido y 1000 20 residuos de aminoácido, entre 500 residuos de aminoácido y 800 residuos de aminoácido, o entre 600 residuos de aminoácido y 1000 residuos de aminoácido.

El ácido nucleico aislado puede aislarse de una bacteria, una planta, un insecto, una levadura, un hongo o un animal (por ejemplo, un mamífero). Cuando el ácido nucleico se aísla de una bacteria, la bacteria puede ser cualquier género de bacteria. Por ejemplo, la bacteria puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste en 25 Anaeromyxobacter, Arthrobacter, Bdellovibrio, Blastopirellula, Brevibacterium, Burkholderia, Candidatus, Chloroflexus, Clavibacter, Clostridium, Colwellia, Congregibacter, Desulfatibacillum, Desulfococcus, Desulfotalea, Desulfuromonas, Flavobacteriales, Gemmata, Geobacter, Hahella, Jannaschia, Kineococcus, Lentisphaera, Maricaulis, Marinobacter, Micrococcus, Microscilla, Moritella, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Opitutaceae, Opitutus, Paenibacillus, Pelobacter, Photobacterium, Photorhabdus, Planctomyces, Plesiocystis, 30 Pseudoalteromonas, Psychromonas, Ralstonia, Rhodococcus, Rhodopirellula, Roseovarius, Shewanella, Stenotrophomonas, Streptomyces, Xanthomonas y Xilella.

Más específicamente, el ácido nucleico puede aislarse de cualquier bacteria seleccionada del grupo que consiste en Anaeromyxobacter, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter clorophenolicus, Arthrobacter sp. FB24, Bdellovibrio bacteriovorus, Blastopirellula marina, Brevibacterium linens, Burkholderia ambifaria, Burkholderia cenocepacia, 35 Burkholderia oklahomensis, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia sp. 383, Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, Chloroflexus aggregans, Chloroflexus aurantiacus, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus, Clostridium botulinum, Colwellia psychrerythraea, Congregibacter litoralis, Desulfatibacillum alkenivorans, Desulfococcus oleovorans, Desulfotalea psychrophila, Desulfuromonas acetoxidans, Flavobacteriales bacterium, Gemmata obscuriglobus, Geobacter bemidjiensis, Geobacter lovleyi, Geobacter sp. 40 FRC-32, Geobacter uraniumreducens, Hahella chejuensis, Jannaschia sp. CCS1, Kineococcus radiotolerans, Lentisphaera araneosa, Maricaulis maris, Marinobacter algicola, Marinobacter aquaeolei, Micrococcus luteus, Microscilla marina, Moritella sp. PE36, Mycobacterium avium, Mycobacterium marinum, Mycobacterium sp. GP1, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium vanbaalenii, Neisseria gonorrhoeae, Nocardiafarcinica, Opitutaceae bacterium, Opitutus terrae, Paenibacillus sp. JDR-2, Pelobacter propionicus, Photobacterium profundum, 45 Photobacterium profundum, Photorhabdus luminescens, Planctomyces maris, Plesiocystis pacifica, Pseudoalteromonas atlantica, Psychromonas ingrahamii, Psychromonas sp. CNPT3, Ralstonia pickettii, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp., Rhodopirellula baltica, Roseovarius nubinhibens ISM, Shewanella amazonensis SB2B, Shewanella baltica OS155, Shewanella baltica, Shewanella benthica, Shewanella denitrificans, Shewanella frigidimarina, Shewanella halifaxensis, Shewanella loihica, Shewanella oneidensis, Shewanella 50 pealeana, Shewanella putrefaciens, Shewanella sediminis, Shewanella sp. ANA-3, Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. MR-7, Shewanella sp. W3-18-1, Shewanella woodyi, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces ambofaciens, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae y Xilella fastidiosa. En una realización preferida, el ácido nucleico se aísla de una cepa de Stenotrophomonas maltophilia (por ejemplo, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17679, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17674, Stenotrophomonas 55 maltophilia ATCC 17445, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17666, Stenotrophomonas maltophilia K279a o Stenotrophomonas maltophilia R551-3).

Cuando una secuencia genómica no está disponible para una especie de interés particular, pueden amplificarse secuencias relacionadas a partir de ADN genómico usando métodos de PCR convencionales. Brevemente, se extrae ADN genómico de las células de interés mediante uno cualquiera de una variedad de métodos bien 60 conocidos. Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences (1989), proporcionan descripciones de métodos para el aislamiento de ADN.

Generalmente, puede usarse cualquier organismo como fuente de tal ADN. El ADN extraído se usa entonces como molde para realizar una reacción en cadena de la polimerasa. Puede requerirse el uso de cebadores degenerados para PCR. Se describen métodos y condiciones para PCR, por ejemplo, en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, California, 1990.

La selección de cebadores de amplificación se realizará según el gen particular que va a amplificarse. En la tabla 14, 5 a continuación, se muestran ejemplos de cebadores específicos de uso. Sin embargo, estos cebadores son ilustrativos solo. Un experto habitual en la técnica apreciará que pueden derivarse muchos cebadores diferentes de las secuencias de ácido nucleico de oleA, oleB, oleC, oleBC y oleD. Pueden requerirse variaciones en las condiciones de amplificación para acomodar cebadores y amplicones de composición y longitudes diferentes. Tales consideraciones se conocen bien en la técnica y se comentan, por ejemplo, en PCR Protocols, A Guide to Methods 10 and Applications, lnnis et al. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, California, 1990.

La secuenciación de los productos de PCR obtenidos mediante estos procedimientos de amplificación puede usarse para facilitar la confirmación de la secuencia amplificada y proporcionar información sobre la variación natural de esta secuencia en diferentes especies. Los oligonucleótidos derivados de las secuencias de OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD proporcionadas pueden usarse en tales métodos de secuenciación. Las secuencias ortólogas 15 estrechamente relacionadas de OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD pueden compartir una identidad de secuencia de al menos el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 99,5% con las secuencias de OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD dadas a conocer (véanse, por ejemplo, las tablas 1 y 2).

El ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ 20 ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 87.

También se dan a conocer en el presente documento constructos de ácido nucleico recombinante que incluyen uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican para proteínas Ole, homólogos de proteínas Ole, variantes conservativas de proteínas Ole y/o secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos el 35% (por 25 ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con proteínas Ole. Los constructos de ácido nucleico recombinante a modo de ejemplo incluyen vectores de clonación, vectores de expresión u operones sintéticos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que 30 puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico que puede replicarse de manera extra cromosómica). Vectores útiles son los que pueden replicarse de manera autónoma y/o expresar ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos de manera operativa se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo 35 en forma de “plásmidos” que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenarios circulares que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. Tal como se usa en el presente documento, “plásmido” y “vector” se usan de manera intercambiable, puesto que el plásmido es la forma más frecuentemente usada de vector. Sin embargo, también se incluyes otras formas de vectores de expresión tales que sirven para funciones equivalentes y que se conocieron en la técnica posteriormente a esto. 40

Tanto los vectores de clonación como de expresión contienen secuencias de nucleótidos que permiten que los vectores se repliquen en uno o más organismos recombinantes adecuados. En los vectores de clonación, esta secuencia es generalmente una que permite que el vector se replique independientemente de los cromosomas del organismo recombinante y también incluye o bien orígenes de replicación o bien secuencias de replicación autónoma. Diversos orígenes de replicación bacterianos y víricos se conocen bien e incluyen, pero no se limitan a, 45 replicón ColE1 derivado de pBR322, el replicón P15A, el replicón pCloDF13, el replicón pKN402, el replicón pMB1 (pUC), el replicón pSC101, y los orígenes virales de SV40, polioma, adenovirus, VSV y VPB.

Los ácidos nucleicos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para producir proteínas mediante el uso de vectores de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico aislado. Puede usarse una amplia variedad de vectores de expresión. Por ejemplo, vectores derivados de plásmidos, de cromosomas, de episomas y 50 de virus, incluyendo vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levaduras, virus, tales como baculovirus, papovirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la seudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmido y bacteriófago, tales como cósmidos y fagémidos.

Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para expresar un 55 polipéptido en un organismo recombinante puede usarse para la expresión en este sentido. Por tanto, puede usarse cualquier otro vector que sea replicable y viable en el organismo recombinante. Los ejemplos no limitativos de vectores de expresión bacterianos incluyen pKK223-3 y pTrc 99A, que portan el promotor trp-lac; pUC, pTZ, pSK y pGEM, que portan el promotor lac; el vector pET y derivados del mismo, que contienen el promotor T7; y la serie de

vectores pHUB, la serie de vectores pPLc, pKC30, pASl, pRM1/pRM9 y pTrxFus, que contienen todos el promotor  pL de bacteriófago. Los vectores a modo de ejemplo adicionales incluyen la serie de vectores pATH, la serie de vectores pBAD, la serie de vectores pBEc, la serie de vectores pCAL, la serie de vectores pCRT7, pGAL, pGEX, y derivados, la serie de vectores pLEX, la serie de vectores pMAL, la serie de vectores pOSEX, la serie de vectores pQE, la serie de vectores pRSET y la serie de vectores pTriEx. Los vectores adecuados para la expresión del ácido 5 nucleico en S. cerevisiae incluyen, por ejemplo, pAD-GAL4 y derivados del mismo, pBridge, pCM y derivados del mismo, la serie de vectores pEMBLY, pESC y derivados del mismo, la serie de vectores pFL, pSZ62, la serie de vectores pYC2 y pYC6, y la serie de plásmidos YIP.

La secuencia de ácido nucleico apropiada se inserta en el vector mediante cualquiera de una variedad de técnicas de rutina y bien conocidas. En general, una secuencia de ácido nucleico para la expresión se une a un vector de 10 expresión escindiendo la secuencia de ácido nucleico y el vector de expresión con una o más endonucleasas de restricción y luego uniendo los fragmentos de restricción entre sí usando una ligasa T4-ADN. Los procedimientos para la restricción y ligación se conocen bien en la técnica. Los procedimientos adecuados en este sentido y para la construcción de vectores de expresión usando técnicas alternativas, que también se conocen bien en la técnica, se exponen en más detalle en Sambrook et al., citado anteriormente. Los ejemplos no limitativos de estas técnicas 15 alternativas incluyen, por ejemplo, la incorporación de la secuencia de ácido nucleico mediante recombinasa o topoisomerasa.

Las secuencias de ácido nucleico pueden modificarse o unirse entre sí mediante técnicas convencionales tales como PCR SOE, síntesis de ADN, ligamiento de extremos romos o ligamiento en sitios de enzimas de restricción. Si no están disponibles sitios de restricción adecuados, entonces pueden usarse adaptadores o ligadores de 20 oligonucleótidos sintéticos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Ausubel et al., citado anteriormente).

Un experto habitual en la técnica reconocerá que numerosos promotores son funcionales en células y se han descrito en la bibliografía, incluyendo promotores constitutivos, inducibles, regulados por el desarrollo y regulados medioambientalmente. De particular interés es el uso de promotores (también denominados regiones de iniciación 25 transcripcional) que son funcionales en el organismo recombinante apropiado. Por ejemplo, si se usa E. coli como organismo recombinante, entonces los promotores a modo de ejemplo que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, el promotor PL de fago lambda, los promotores lac, trp, trc y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40, promotores de LTR retrovirales y el promotor 35S de CaMV. Si Saccharomyces cerevisiae es el huésped, entonces las secuencias de interés están normalmente bajo el control de promotores de levadura. Un 30 ejemplo no limitativo de un promotor de levadura útil incluye el promotor GAL/CYC.

Cualquier promotor adecuado conocido para un experto habitual en la técnica que no se menciona en el presente documento puede emplearse fácilmente en la invención descrita en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión pueden contener también un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción y un sitio 35 de terminación de la transcripción. El vector puede contener también secuencias útiles para la amplificación de la expresión génica.

En el presente documento se da a conocer un ácido nucleico aislado que comprende un promotor operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para el polipéptido. El promotor puede ser un promotor inducible, un promotor constitutivo o un promotor específico para células. El promotor puede ser un promotor T7. El promotor puede ser 40 también un promotor pTrc, un promotor PxylA, un promotor Pgrac, un promotor GAL1 o un promotor GAL10.

Tal como se usa en el presente documento, el término “operativamente unido” significa que la secuencia de nucleótidos seleccionada (por ejemplo, que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento) está en proximidad con un promotor para permitir que el promotor regule la expresión del ADN seleccionado. Además, el promotor se ubica en el sentido de 5’ de la secuencia de nucleótidos seleccionada en cuanto a la dirección de 45 transcripción y traducción. Por “operativamente unido” quiere decirse que una secuencia de nucleótidos y una(s) secuencia(s) regulatoria(s) se conecta de tal manera que permite la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas de activador transcripcional) se unen a la(s) secuencia(s) regulatoria(s).

También pueden proporcionarse regiones reguladoras de terminación de la transcripción en constructos de expresión. Las regiones de terminación de la transcripción pueden proporcionarse mediante la secuencia de vector 50 que codifica para las secuencias de proteína Ole o puede usarse una región de terminación de la transcripción que está asociada de manera natural con la región de iniciación de la transcripción. Puede emplearse cualquier región de terminación de la transcripción conveniente que pueda terminar la transcripción en un organismo recombinante en los constructos dados a conocer en el presente documento. Los vectores de expresión y clonación pueden contener, y habitualmente contienen, un gen estructural o marcador de selección que tiene las regiones regulatorias 55 necesarias para la expresión en un organismo recombinante para proporcionar la selección de células transformantes. El gen puede proporcionar resistencia a un agente citotóxico (por ejemplo, un antibiótico, metal pesado, o toxina), complementación que proporciona prototrofía a un huésped auxotrófico, inmunidad vírica, o similar. Dependiendo del número de especies huésped diferentes en las que se introduce el constructo de expresión o componentes del mismo, pueden emplearse uno o más marcadores en los que se usan diferentes condiciones 60

para la selección para los diferentes huéspedes.

Los ejemplos no limitativos, específicos de marcadores de selección adecuados incluyen genes que confieren resistencia a bleomicina, eritromicina, gentamicina, glifosato, higromicina, kanamicina, metotrexato, ácido nalidíxico, fleomicina, fosfinotricina, espectinomicina, estreptomicina, sulfonamida, sulfonilureas, ampicilina/carbenicilina, cloramfenicol, estreptomicina/espectinomicina o tetraciclina. Otro ejemplo de un marcador de selección adecuado 5 son los genes marcadores seleccionables auxotróficos, tales como genes marcadores seleccionables de histidina. Los ejemplos no limitativos, específicos de marcadores incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina (AP), myc, hemaglutinina (HA), 13 glucuronidasa (GUS), luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). Preferiblemente, el ácido nucleico aislado comprende además un marcador de selección acoplado al ácido nucleico que codifica para el polipéptido. El marcador de selección puede ser resistencia a ampicilina/carbenicilina, resistencia a kanamicina, 10 resistencia a cloramfenicol, resistencia a eritromicina, resistencia a estreptomicina/espectinomicina o un gen marcador seleccionable auxotrófico de histidina.

Además, los vectores de expresión pueden contener también secuencias de marcadores operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos para una proteína que codifica para una proteína adicional usada como marcador. El resultado es un híbrido o proteína de fusión que comprende dos proteínas diferentes y unidas. La proteína 15 marcadora puede proporcionar, por ejemplo, un marcador enzimático o inmunológico para la proteína recombinante producida mediante el vector de expresión. Adicionalmente, puede modificarse el extremo del polinucleótido mediante la adición de una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos útil para la purificación de la proteína producida. Por ejemplo, puede incluirse una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos que confiere afinidad para un método de cromatografía particular. Se han ideado diversos métodos 20 para la adición de tales restos de purificación por afinidad a proteínas. Pueden encontrarse ejemplos representativos en las patentes estadounidenses n.os 4.703.004, 4.782.137, 4.845.341, 5.935.824 y 5.594.115. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para la adición de secuencias de nucleótidos que codifican para restos de purificación (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente).

En particular, se dan a conocer en el presente documento constructos recombinantes que incluyen uno o más ácidos 25 nucleicos aislados que codifican para proteínas Ole o variantes y homólogos de las mismas. Los constructos pueden incluir un vector, tal como un vector viral o plasmídico, en el que se ha insertado la secuencia, o bien en la orientación directa o inversa. El constructo recombinante puede incluir además una secuencia regulatoria, incluyendo, por ejemplo, un promotor operativamente unido a la secuencia. Se conoce un gran número de vectores y promotores adecuados y están disponibles comercialmente. En una realización, se usan los vectores pET-21b(+), 30 pCOLADuet-1, pCDFDuet-1, pcDNA3.1(+), pCMV SPORT6.1 (Invitrogen), o cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. Sin embargo, puede usarse cualquier plásmido o vector adecuado siempre que sean replicables y viables en el huésped.

En el presente documento se da a conocer un vector que comprende un ácido nucleico aislado. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido. Preferiblemente, el vector es un plásmido seleccionado de pET21b(+), pCOLADuet-1, 35 pCDFDuet-1, pACYCDuet-1, pACYCpTrc, pCL1920pTrc, pESC-HIS, pSUP104, pMM1522, pWH1520 y pHT01. En una realización preferida, el vector es un plásmido seleccionado de pET21b(+), pCOLADuet-1, pCDFDuet-1, pWH1520, pHT01, pESC-HIS, pET-21d(+), pETDuet-1, pACYCDuet-1, pTrcHis2A, pMAL-c2X o pCL1920pTrc.

La tecnología de ADN recombinante que da como resultado la integración de los ácidos nucleicos respectivos que codifican para OleA (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ 40 ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487), OleB (por ejemplo, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 230-326), OleC (por ejemplo, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 327-402), OleD (por ejemplo, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 142-149, y SEQ ID NO: 403-464), OleBC (por ejemplo, SEQ ID NO: 135-141), y/o variantes y homólogos de estas secuencias en el cromosoma de cualquier 45 organismo vivo puede dar como resultado la expresión y producción de las proteínas respectivas.

El ácido nucleico aislado también puede ser parte de un casete de expresión que, como mínimo, incluye un promotor, uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican para OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC, y una secuencia de señal de terminación transcripcional funcional en un organismo recombinante. El promotor puede ser cualquiera de los tipos tratados en el presente documento, por ejemplo, un promotor inducible o promotor 50 constitutivo. El casete de expresión puede incluir además una secuencia de direccionamiento operativamente unida o péptido de tránsito o secreción que codifica para una región que puede dirigir el transporte de la proteína producida. El casete de expresión puede incluir además una secuencia de ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable y/o un resto de purificación.

Pueden introducirse o alterarse secuencias regulatorias, secuencias codificantes y combinaciones de las mismas en 55 el genoma de la cepa del huésped. En algunos ejemplos, la integración de la secuencia recombinante deseada en la secuencia genómica del organismo recombinante no requiere el uso de un marcador seleccionable, tal como un antibiótico. En algunos ejemplos, las alteraciones genómicas incluyen cambiar la secuencia de control de los genes diana, tales como oleA, oleB, oleC, oleBC u oleD sustituyendo el/los promotor(es) nativo(s) con un promotor insensible a la regulación. Existen numerosos enfoques para realizar esto. Por ejemplo, Valle y Flores, Methods Mol. 60

Biol. 267: 113-122 (2006) describen un método basado en PCR para sobreexpresar genes cromosómicos en E. coli. Otro enfoque se basa en el uso de oligonucleótidos monocatenarios para crear mutaciones específicas directamente en el cromosoma usando la tecnología desarrollada por Costantino et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 100: 15748-15753 (2003). Esta tecnología se basa en el uso de la sobreexpresión de la proteína beta del bacteriófago lambda para potenciar la recombinación genética. Las ventajas de este enfoque son que pueden usarse oligonucleótidos 5 sintéticos de 70 o más bases de largo para crear mutaciones puntuales, inserciones y deleciones. Este método elimina las etapas de clonación. Además, el sistema es tan eficaz que no son necesarios marcadores para aislar las mutaciones. Este enfoque es útil para sobreexpresar, entre otras cosas, las secuencias codificantes endógenas, tales como las que codifican para OleA, OleB, OleC, OleD, OleBC, o enzimas de rutas de biosíntesis de ácidos grasos. 10

En el presente documento se da a conocer un ácido nucleico aislado que comprende además al menos una secuencia de ácido nucleico adicional seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia regulatoria operativamente acoplada al ácido nucleico que codifica para el polipéptido; (b) un marcador de selección operativamente acoplado al ácido nucleico que codifica para el polipéptido; (c) un resto de purificación operativamente acoplado al ácido nucleico que codifica para el polipéptido; (d) una secuencia de secreción 15 operativamente acoplada al ácido nucleico que codifica para el polipéptido; y (e) una secuencia de direccionamiento operativamente acoplada al ácido nucleico que codifica para el polipéptido.

En el presente documento se da a conocer una célula que comprende un ácido nucleico aislado. En particular, la célula puede comprender un ácido nucleico aislado o un vector que comprende un ácido nucleico aislado. La célula puede transformarse con un ácido nucleico aislado usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. 20 Alternativamente, la célula puede transfectarse con un vector usando cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “transfectar” significa la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, por medio de un vector de expresión) en una célula receptora mediante transferencia génica mediada por ácido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, “transformar” se refiere a un proceso en el que el 25 genotipo de una célula se cambia como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno. Esto puede dar como resultado que la célula transformada exprese una forma recombinante de un ARN o polipéptido. En el caso de expresión antisentido a partir del gen transferido, se altera la expresión de una forma que se produce de manera natural del polipéptido.

La célula puede ser una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de alga, una célula animal, una célula de 30 insecto, una célula bacteriana o una célula vegetal. La célula puede ser una célula de Archaea. En una realización, la célula es una célula bacteriana.

La célula puede seleccionarse de cualquier célula del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, 35 Schizosaccharomyces, Stenotrophamonas, Kineococcus, Yarrowia o Streptomyces. Específicamente, la célula puede ser una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amiloliquefaciens. 40 Adicionalmente, la célula puede ser una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei. 45

En una realización preferida, la célula es una célula de Streptomyces lividans, una célula de Streptomyces murinus, una célula de Actinomycetes o una célula de Escherichia coli. La célula de Escherichia coli puede ser una célula de una cepa B, una cepa C, una cepa K o una cepa W de Escherichia coli. La célula puede ser también una célula de Stenotrophomonas maltophilia, una célula de Kineococcus radiotolerans, una célula de Bacillus megaterium o una célula de Saccharomyces cerevisiae. 50

Más específicamente, la célula puede ser cualquier cepa de Anaeromyxobacter sp. Fw109-5, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter clorophenolicus, Arthrobacter sp. FB24, Bdellovibrio bacteriovorus, Blastopirellula marina, Brevibacterium linens, Burkholderia ambifaria, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia oklahomensis, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia sp. 383, Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, Chloroflexus aggregans, Chloroflexus aurantiacus, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus, 55 Clostridium botulinum, Colwellia psychrerythraea, Congregibacter litoralis, Desulfatibacillum alkenivorans, Desulfococcus oleovorans, Desulfotalea psychrophila, Desulfuromonas acetoxidans, Flavobacteriales bacterium, Gemmata obscuriglobus, Geobacter bemidjiensis, Geobacter lovleyi, Geobacter sp. FRC-32, Geobacter uraniumreducens, Hahella chejuensis, Jannaschia sp. CCS1, Kineococcus radiotolerans, Lentisphaera araneosa, Maricaulis maris, Marinobacter algicola, Marinobacter aquaeolei, Micrococcus luteus, Microscilla marina, Moritella sp. 60

PE36, Mycobacterium avium, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium sp. GPl, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium vanbaalenii, Neisseria gonorrhoeae, Nocardia farcinica, Opitutaceae bacterium, Opitutus terrae, Paenibacillus sp. JDR-2, Pelobacter propionicus, Photobacterium profundum, Photobacterium profundum, Photorhabdus luminescens subsp. laumondii, Planctomyces maris, Plesiocystis pacifica, Pseudoalteromonas atlantica, Psychromonas ingrahamii, Psychromonas sp. CNPT3, Ralstonia 5 pickettii, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp., Rhodopirellula baltica, Roseovarius nubinhibens, Shewanella amazonensis, Shewanella baltica, Shewanella benthica, Shewanella denitrificans, Shewanella frigidimarina, Shewanella halifaxensis, Shewanella loihica, Shewanella oneidensis, Shewanella pealeana, Shewanella putrefaciens, Shewanella sediminis, Shewanella sp. ANA-3, Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. MR-7, Shewanella sp. W3-18-1, Shewanella woodyi, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces ambofaciens, 10 Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae y Xylella fastidiosa.

Opcionalmente, la célula puede ser una célula animal. Por ejemplo, la célula animal puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula HeLa, una célula Cv1, una célula MDCK, una célula 293, una célula 3T3 y una célula PC12.

En el presente documento se da a conocer una célula que comprende una alteración en un gen implicado en la ruta 15 de biosíntesis de ácidos grasos. Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta de biosíntesis de ácidos grasos” significa una ruta de biosíntesis que produce ácidos grasos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos incluye enzimas de ácidos grasos que pueden modificarse por ingeniería genética, tal como se describe en el presente documento, para producir ácidos grasos, y en algunas realizaciones pueden expresarse con enzimas adicionales para producir ácidos grasos que tienen características de cadena de carbono deseadas. 20

Tal como se usa en el presente documento, “enzima de ácidos grasos” significa cualquier enzima implicada en la biosíntesis de ácidos grasos. Las enzimas de ácidos grasos pueden expresarse o sobreexpresarse en células huésped para producir ácidos grasos. Los ejemplos no limitativos de enzimas de ácidos grasos incluyen ácido graso sintasas y tioesterasas.

Por ejemplo, la célula puede sobreexpresar acil-Coa sintasa (EC 6.2.1.3, 2.3.1.86), tioesterasa (EC 3.1.2.-, 3.1.1.15, 25 3.1.2.14), acetil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2, 6.3.4.14), una proteína portadora de acilo, piruvato deshidrogenasa (EC 1.2.4.1), aldehído descarbonilasa (EC4.1.99.5), beta-hidroxidecanoil tioéster deshidrasa (EC 4.2.1.60), 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa I (EC 2.3.1.41), [proteína portadora de acilo] S-maloniltransferasa (EC 2.3.1.39), 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] reductasa (EC 1.1.1.100), 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa III (EC 2.3.1.180), enoil-[proteína portadora de acilo] reductasa (EC 1.3.1.9), (3R)-hidroximiristol-proteína 30 portadora de acilo deshidratasa (EC 4.2.1.-), lipasa (EC 3.1.1.3), malonil-CoA descarboxilasa (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), aspartato 1-descarboxilasa (EC 4.1.1.11), pantotenato cinasa (EC 2.7.1.33), piruvato deshidrogenasa (EC 1.2.4.1), nucleótido de piridina transhidrogenasa (EC 1.6.1.1), y combinaciones de las mismas.

Además para sobreexpresar uno o más péptidos para producir sustratos que contienen cadenas de acilo graso, la célula puede tener adicionalmente uno o más péptidos delecionados, mutados o atenuados de manera funcional. Tal 35 como se usa en el presente documento, el término “atenuar” significa debilitar, reducir o disminuir. Por ejemplo, un polipéptido puede atenuarse modificando el polipéptido para reducir su actividad (por ejemplo, modificando una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido).

Por ejemplo, uno o más de los siguientes pueden delecionarse, mutarse o atenuarse: acetato cinasa (EC 2.7.2.1), alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa II (EC 2.3.1.179), 40 represor transcripcional FabR (registro NP_418398), acil-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), sn-glicerol 3-fosfato deshidrogenasa biosintética (EC 1.1.1.94), lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.28), formiato acetiltransferasa (EC 2.3.1.54), aciltransferasa (EC 2.3.1.15), piruvato oxidasa (EC 1.2.2.2) y fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8).

En algunos ejemplos, la célula puede producir productos ramificados, incluyendo sustratos que contienen cadenas de acilo graso; hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos. Por consiguiente, las células pueden 45 modificarse por ingeniería para aumentar la ramificación sobreexpresando un péptido seleccionado de uno o más componentes del complejo ceto ácido de cadena ramificada deshidrogenasa (EC 1.2.4.4), aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa (EC 2.6.1.42), dihidrolipoamida deshidrogenasa (E3) (EC 1.8.1.4), crotonil-CoA reductasa (EC 1.6.5.5, 1.1.1.1), isobutiril-CoA mutasa, subunidad A (EC 5.4.99.2), isobutiril-CoA mutasa, subunidad B (5.4.99.2), beta-cetoacil-ACP sintasa III (EC 2.3.1.180), beta-cetoacil-ACP sintasa II (EC 2.3.1.179), proteína 50 portadora de acilo (NP_823468), enoil-CoA reductasa (EC 1.3.1.34), enoil-CoA isomerasa (EC 4.2.1.-), y combinaciones de los mismos.

El nivel de saturación del sustrato que contiene una cadena de acilo graso, hidrocarburo y producto intermedio de hidrocarburo puede alterarse modificando por ingeniería genética la célula para sobreexpresar un péptido seleccionado de 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa I (EC 2.3.1.41), trans-2-enoil-ACP reductasa II (EC 55 1.3.1.9), enoil-(proteína portadora de acilo) reductasa (EC 1.3.1.9), trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa (4.2.1.17), acil-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-) y combinaciones de las mismas.

Además para modificar por ingeniería la célula para producir hidrocarburos o productos intermedios de

hidrocarburos, pueden regularse también las condiciones medioambientales, tales como temperatura, para cambiar los tipos de hidrocarburos producidos. Por ejemplo pueden usarse temperaturas más bajas para producir mayores números de dobles enlaces en un hidrocarburo y temperaturas más altas pueden conducir a mayores niveles de saturación. En 1962, Marr y Ingraham publicaron un artículo que demostraba que la temperatura influye en el grado de saturación en lípidos producidos por E. coli (Marr et al., J Bacteriol., 84: 1260-7 (1962)). Temperaturas bajas dan 5 como resultado la producción de lípidos con un mayor grado de insaturación mientras que temperaturas más altas dan como resultado mayores cantidades de lípidos saturados (véase, por ejemplo, el ejemplo 14). Por tanto, reducir las temperaturas durante la producción puede alterar el producto para conducir a mayores grados de insaturación en hidrocarburos o productos intermedios de hidrocarburos.

La célula puede comprender una alteración en un gen que codifica para una acil-CoA deshidrogenasa. Esta 10 alteración puede ser una deleción, una mutación o una atenuación de un gen que codifica para acil-CoA deshidrogenasa. En otra realización preferida, la célula comprende una alteración en un gen que codifica para una tioesterasa. Esta alteración puede ser una sobreexpresión de un gen que codifica para una tioesterasa.

En algunos ejemplos se sobreexpresa un péptido que tiene actividad acil-CoA sintasa. Por ejemplo, acil-CoA sintasas tales como fadD (NP_416319), fadK (NP_416216), fadD (YP_045024), fadD (NP_438551), BH3103 15 (NP_243969), yhfL (NP_388908), Pfl_4354 (YP_350082), fadD1 (NP_251989), fadD2 (NP_251990), fadD (YP_533919), RPC_4074 (YP_533919), fadD1 (NP_520978), fadD35 (NP_217021), fadD22 (NP_217464), y combinaciones de las mismas pueden expresarse, delecionarse, mutarse o atenuarse. Otro ejemplo de una acil-CoA sintasa es un homólogo fadD de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 (ZP_01644857.1).

Además, puede controlarse la expresión de tioesterasa para alterar la cantidad de productos y/o la longitud de 20 cadena de carbono de los productos que incluyen cadenas de acilo graso. Por ejemplo, tioesterasas tales como tesA sin secuencia líder (AAC73596), tesB (AAC73555), Uc fatB (Q41635, AAA34215), Ch fatB2 (Q39513, AAC49269), Ch fatB3 (AAC49269, AAC72881), Ce fatB (Q39473, AAC49151), At fatB [M141T] (CAA85388), At fatA (NP 189147, NP 193041), Ch fatA (AAC72883), Ha fatAl (AAL79361), o combinaciones de las mismas pueden expresarse, delecionarse, mutarse o atenuarse. 25

Opcionalmente, la célula puede comprender una acil-CoA sintasa o una tioesterasa. Por ejemplo, la célula puede transformarse con un ácido nucleico aislado que codifica para una acil-CoA sintasa o una tioesterasa. Alternativamente, la célula puede transfectarse con un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica para una acil-CoA sintasa o una tioesterasa.

Pueden modificarse organismos recombinantes por ingeniería genética usando los ácidos nucleicos aislados y las 30 proteínas dados a conocer en el presente documento para producir hidrocarburos y cetonas alifáticas que tienen características estructurales definidas (por ejemplo, grados de ramificación, saturación o longitud de cadena de carbono). Un método de elaboración de hidrocarburos implica aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, una o más enzimas de condensación de acilo (enzimas que condensan más de una acil-CoA, acil-ACP, acil-AMP, acil-éster, ácido graso, o mezclas de los mismos). Un experto habitual en la técnica apreciará que los 35 productos producidos a partir de tales reacciones de condensación varían con la cadena acilo que se condensa. Los productos que pueden producirse incluyen, por ejemplo, hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos, tales como cetonas alifáticas.

Un experto habitual en la técnica apreciará que los sustratos que contienen una cadena de acilo graso y productos intermedios de la misma pueden producirse usando reacciones in vitro, incluyendo conversiones químicas o 40 enzimáticas, así como mediante reacciones in vivo. Adicionalmente, puede utilizarse una combinación de conversiones in vivo e in vitro. Además, pueden producirse cetonas alifáticas específicas proporcionando de manera selectiva sustratos seleccionados, tales como ácidos grasos, acil-ACP o acil-CoA para la conversión. Alternativamente, pueden producirse hidrocarburos proporcionando de manera selectiva sustratos seleccionados, tales como ácidos grasos, acil-ACP, acil-CoA, cetonas alifáticas, -alquil--cetoácidos o -alquil--cetoésteres para 45 la conversión.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido graso” significa un ácido carboxílico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R puede comprender entre 4 y 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una realización preferida, el ácido graso se elabora a partir de una ruta de biosíntesis de ácidos grasos. 50

Los términos “convertir” o “conversión” se refieren al uso de o bien medios químicos o bien medios biológicos (por ejemplo, polipéptidos en una reacción) que cambian un primer producto intermedio o sustrato a un segundo producto intermedio o producto. El término “conversión química” se refiere a reacciones que no están facilitadas activamente por polipéptidos. El término “conversión biológica” se refiere a reacciones que están facilitadas activamente por polipéptidos. Las conversiones pueden tener lugar in vivo, in vitro, o ambas. Cuando se usan conversiones 55 biológicas, los péptidos y/o las células pueden inmovilizarse sobre soportes, tal como mediante unión química sobre soportes poliméricos. Las conversiones pueden realizarse usando cualquier reactor conocido por un experto habitual en la técnica, por ejemplo en un reactor discontinuo o continuo.

El organismo recombinante puede convertir varios productos intermedios en productos intermedios posteriores o el organismo recombinante puede alimentarse, o ponerse en contacto con, un producto intermedio que se convierte en un producto. En determinados ejemplos, el organismo recombinante se pone en contacto con un producto intermedio, tal como una molécula de acil-CoA y esa molécula de acil-CoA se convierte luego en un producto.

Dada la divulgación proporcionada en el presente documento, ahora es posible la producción enzimática a gran 5 escala de las proteínas Ole (por ejemplo, OleA, OleB, OleC, OleD y OleBC) y homólogos de las mismas. Brevemente, las secuencias codificantes de uno cualquiera de estos péptidos u homólogos de estos péptidos (véanse, por ejemplo, las tablas 1 y 2) puede clonarse en un plásmido de alta expresión, tal como pET-21b(+), pCOLADuet-1 (EMD Chemicals, Inc., Alemania), pWH1520 (Mo Bi Tec, Alemania) o pHT01 (Mo Bi Tec, Alemania). El plásmido puede introducirse en una célula huésped para la producción de las enzimas. Los péptidos resultantes 10 pueden purificarse entonces y usarse en producción discontinua.

Cuando se usan métodos in vitro, los péptidos suministrados a la reacción dependerán del material de partida. Por ejemplo, cuando se desea un hidrocarburo, se añadirían los sustratos acil-ACP y/o acil-CoA a una mezcla de reacción in vitro que contiene OleA, OleC y OleD. De manera similar, cuando el material de partida es una cetona alifática, -alquil--cetoácidos, o -alquil--ceto ésteres, pueden usarse los péptidos OleC y OleD en la reacción in 15 vitro.

Cuando se usa un primer péptido para convertir un primer producto intermedio en un segundo producto intermedio y luego se usa un segundo péptido para convertir el segundo producto intermedio en un tercer producto intermedio, pueden añadirse los péptidos a la reacción simultáneamente o en serie. En algunos ejemplos, en los que se añaden péptidos en serie, puede retirarse el primer péptido antes de la adición del segundo péptido. 20

Adicionalmente, puede usarse una combinación de conversiones químicas y conversiones biológicas para producir un producto deseado. Por ejemplo, un experto habitual en la técnica apreciará que dos ácidos grasos pueden condensarse para elaborar una cetona alifática por medio de conversión química, y la cetona alifática resultante puede convertirse entonces en un hidrocarburo usando conversiones biológicas.

Dada la divulgación proporcionada en el presente documento, pueden producirse cetonas alifáticas, hidrocarburos, y 25 productos intermedios de los mismos en una célula recombinante. La célula recombinante puede producir uno o más péptidos codificados por OleA, OleB, OleC, OleD, OleBC y secuencias relacionadas de los mismos. Un experto habitual en la técnica apreciará que la elección de péptidos para expresar en la célula recombinante dependerá del producto deseado y el material de partida proporcionado a las células. Por ejemplo, si a la célula se le suministran cetonas alifáticas y el producto deseado es un hidrocarburo, entonces la célula recombinante puede modificarse por 30 ingeniería genética con un ácido nucleico que codifica para OleC y OleD.

Los métodos in vivo descritos en el presente documento pueden usarse también en combinación con conversiones químicas y conversiones biológicas in vitro. Por ejemplo, un primer producto intermedio puede convertirse en un segundo producto intermedio usando un péptido in vitro; el segundo producto intermedio puede alimentarse entonces a una célula que expresa péptidos necesarios para la conversión del segundo producto intermedio en un 35 tercer producto intermedio. En otro ejemplo, un primer producto intermedio puede convertirse en un segundo producto intermedio por medio de conversión química, y entonces el segundo producto intermedio puede alimentarse a una célula recombinante que codifica para los péptidos necesarios para conversiones posteriores.

Adicionalmente, pueden producirse productos usando dos o más etapas de reacción in vivo. Por ejemplo, una primera célula recombinante puede usarse para convertir un primer producto intermedio en un segundo producto 40 intermedio. El segundo producto intermedio puede liberarse de la célula, por ejemplo mediante transporte pasivo, transporte activo o lisis celular, y el segundo producto intermedio puede alimentarse entonces a una segunda célula recombinante donde se convierte en un tercer producto intermedio. En algunos ejemplos, el tercer producto intermedio será el producto deseado.

La invención permite la producción a gran escala de cetonas alifáticas, hidrocarburos y productos intermedios de 45 hidrocarburos que tienen longitudes de la cadena de carbono, niveles de saturación y puntos de ramificación definidos. La producción de tales moléculas modificadas por ingeniería genética proporciona una diversidad de productos que pueden usarse como combustibles y productos químicos de especialidad.

En el presente documento se da a conocer una célula transformada con cualquiera de los ácidos nucleicos dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican para cualquiera de las 50 secuencias de polipéptido dadas a conocer en el presente documento) o transfectada con cualquiera de los vectores dados a conocer en el presente documento. La célula puede producir un hidrocarburo o una cetona alifática. El hidrocarburo puede ser una olefina. El hidrocarburo o cetona alifática puede secretarse por la célula. La célula puede comprender un ácido nucleico aislado que codifica para OleA. Específicamente, la célula que comprende un ácido nucleico aislado que codifica para OleA puede ser una célula de Saccharomyces cerevisiae. 55

En el presente documento se da a conocer un método para producir un hidrocarburo que comprende cultivar cualquier célula que comprenda cualquiera de los ácidos nucleicos aislados dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican para cualquiera de las secuencias de

polipéptido dadas a conocer en el presente documento) con un sustrato en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo. Por ejemplo, el sustrato puede ser una fuente de carbono, ácido graso, acil-CoA, acil-AMP, acil-ACP, -alquil--cetoácido, -alquil--cetoéster o una cetona alifática. Preferiblemente, la productividad de la célula es de al menos 3 mg/l/DO600. Por ejemplo, la productividad de la célula puede ser de al menos 5 mg/l/DO600, al menos 8 mg/l/DO600, al menos 15 mg/l/DO600, al menos 20 mg/l/DO600 o al menos 30 mg/l/DO600. 5

En el presente documento se da a conocer un método para producir un hidrocarburo que comprende cultivar cualquier célula que comprenda un ácido nucleico aislado dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquiera de las secuencias de polipéptido dadas a conocer en el presente documento) con un sustrato en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo que comprende aislar un hidrocarburo. El hidrocarburo puede aislarse de la célula o del medio en el que se cultiva la célula. El 10 sustrato puede ser, por ejemplo, una fuente de carbono, ácido graso, acil-CoA, acil-AMP, acil-ACP, -alquil--cetoácido, -alquil--cetoéster o una cetona alifática.

En el presente documento se da a conocer un método para producir un hidrocarburo que comprende cultivar cualquier célula que comprenda los ácidos nucleicos aislados dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquiera de las secuencias de polipéptido dadas a 15 conocer en el presente documento) con un sustrato (por ejemplo, una fuente de carbono, ácido graso, acil-CoA, acil-AMP, acil-ACP, -alquil--cetoácido, -alquil--cetoéster o una cetona alifática) en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo que comprende además someter a craqueo o refinado el hidrocarburo.

El método puede producir un hidrocarburo que es monoinsaturado o poliinsaturado (por ejemplo, diinsaturado, triinsaturado, etc.). El hidrocarburo puede tener una longitud de cadena de carbono de entre 10 y 40 carbonos. Por 20 ejemplo, el hidrocarburo puede tener una longitud de cadena de carbono de entre 15 y 35, 17 y 34, 18 y 33, 19 y 33 carbonos, entre 27 y 33 carbonos, entre 29 y 31 carbonos, o 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ó 33 carbonos.

En el presente documento se da a conocer un método para producir una cetona alifática que comprende cultivar cualquier célula que comprenda los ácidos nucleicos aislados dados a conocer en el presente documento (por 25 ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquiera de las secuencias de polipéptido dadas a conocer en el presente documento) con un sustrato en condiciones suficientes para producir una cetona alifática. Por ejemplo, el sustrato puede ser una fuente de carbono, ácido graso, acil-CoA, acil-AMP, acil-ACP, -alquil--cetoácido o -alquil--cetoéster. Preferiblemente, la productividad de la célula es de al menos 0,1 mg/l/DO600. Por ejemplo, la productividad de la célula puede ser de al menos 0,1 mg/l/DO600, al menos 1 mg/l/DO600, al menos 30 3 mg/l/DO600, al menos 6 mg/l/DO600, al menos 9 mg/l/DO600 o al menos 12 mg/l/DO600.

En el presente documento se da a conocer un método para producir una cetona alifática que comprende cultivar cualquier célula que comprenda los ácidos nucleicos aislados dados a conocer en el presente documento con un sustrato en condiciones suficientes para producir una cetona alifática que comprende aislar una cetona alifática. La cetona alifática puede aislarse de la célula o del medio en el que se cultiva la célula 35

El método puede producir una cetona alifática que es saturada, monoinsaturada, o poliinsaturada (por ejemplo, diinsaturada, triinsaturada, etc.). La cetona alifática puede tener una longitud de cadena de carbono de 10 a 40 carbonos. Por ejemplo, la cetona alifática puede tener una longitud de cadena de carbono de entre 15 y 35, 17 y 34, 18 y 33, 19 y 33 carbonos, entre 23 y 29 carbonos, entre 25 y 27 carbonos, o 19, 20, 21, 22, 23, 24. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ó 33 carbonos. 40

En el presente documento se da a conocer un método para producir un polipéptido purificado que comprende cultivar cualquier célula que comprenda un ácido nucleico aislado dado a conocer en el presente documento en condiciones suficientes para producir el polipéptido codificado por el ácido nucleico aislado. Específicamente, el polipéptido es OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC.

Tal como se usa en el presente documento, el término “purificar”, “purificado” o “purificación” significa la retirada o 45 aislamiento de una molécula de su entorno mediante, por ejemplo, aislamiento o separación. Las moléculas “sustancialmente purificadas” están al menos el 60% libres, preferiblemente al menos el 75% libres, y más preferiblemente al menos el 90% libres de otros componentes con los que están asociadas. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la retirada de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de olefinas en una 50 muestra. Por ejemplo, cuando se producen olefinas en una célula huésped, pueden purificarse las olefinas mediante la retirada de proteínas de la célula huésped. Tras la purificación, aumenta el porcentaje de olefinas en la muestra.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” no requieren pureza absoluta. Son términos relativos. Por tanto, por ejemplo, cuando se producen polipéptidos en células, un polipéptido purificado es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos 55 nucleicos, lípidos, hidratos de carbono o hidrocarburos). En otro ejemplo, la preparación de olefina purificada es una en la que la olefina está sustancialmente libre de contaminantes, tales como los que pueden estar presentes tras la fermentación. En algunas realizaciones, una olefina está purificada cuando al menos el 50% en peso de una

muestra está compuesta por la olefina. En otras realizaciones, una olefina está purificada cuando al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 92%, el 95%, el 98% o el 99% o más en peso de una muestra está compuesta por la olefina.

En el presente documento se da a conocer un método para producir una cetona alifática que comprende incubar un sustrato con OleA, en condiciones suficientes para producir una cetona alifática. Específicamente, el sustrato puede 5 comprender acil-CoA, acil-AMP o acil-ACP.

En el presente documento se da a conocer un método para producir un hidrocarburo que comprende incubar un sustrato con OleA, OleB, OleC, OleD, OleBC, o una combinación de las mismas en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo. El sustrato puede comprender acil-CoA, acil-AMP o acil-ACP. Las proteínas OleA, OleB, OleC, OleD u OleBC usadas para producir un hidrocarburo pueden ser proteínas purificadas o sin purificar. Por 10 ejemplo, puede añadirse un sustrato de acil-CoA a un lisado celular de un organismo que expresa los genes ole para producir hidrocarburos.

El método para producir un hidrocarburo puede comprender incubar un sustrato con OleA y OleD en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo. Opcionalmente, el método puede comprender OleB. El método puede comprender incubar un sustrato con OleA, OleC y OleD en condiciones suficientes para producir un hidrocarburo. 15 Opcionalmente, el método puede comprender OleB.

Los péptidos de condensación de acilo incluyen péptidos que pueden catalizar la condensación de acil-ACP, acil-CoA, acil-AMP, ácidos grasos, y mezclas de los mismos usando los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, estos péptidos de condensación de acilo tienen alta, media o baja especificidad de sustrato. En algunos ejemplos, los péptidos de condensación de acilo son más específicos de sustrato y solo 20 aceptarán sustratos de una longitud de cadena específica. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de condensación de acilo catalizarán también otras reacciones. Por ejemplo, algunos péptidos de condensación de acilo aceptarán otros sustratos además de acil-CoA, acil-ACP, acil-AMP, acil-éster, ácido graso, o mezclas de los mismos. Por tanto, tales péptidos no específicos de condensación de acilo se incluyen también. Los ejemplos de enzimas de condensación de acilo, además de las secuencias de OleA 25 proporcionadas en la tabla 1, están disponibles públicamente.

OleC y OleD pueden usarse para producir olefinas sin OleA. Además, OleC puede usarse para producir olefinas sin OleA y OleD.

Los ácidos micólicos son ácidos 2-alquil-3-hidroxigrasos producidos por bacterias (por ejemplo, Mycobacterium y Corynebacterium). Los ácidos micólicos se incorporan a menudo en paredes celulares bacterianas. Estos ácidos 2-30 alquil-3-hidroxigrasos se derivan de una condensación Claisen seguida por una reducción del grupo ceto. Esta reacción es similar a las reacciones enzimáticas realizadas por OleA y OleD en el procedimiento de síntesis de hidrocarburos descrito en el presente documento. Por tanto, las primeras etapas en la ruta del ácido micólico pueden usarse para producir los sustratos necesarios para OleC o la combinación de OleC y OleD para producir hidrocarburos. Además, modificaciones genéticas adicionales en la ruta del ácido micólico podrían aumentar los 35 niveles de producción de alquenos.

La figura 20 esboza una ruta sintética propuesta para la biosíntesis de ácido micólico (véanse, por ejemplo, Lea-Smith et al., Journal of Biological Chemistry, 282: 11000-11008 (2007) y Portevin et al., Proceedings of the National Academy of Science, 101: 314-319 (2004)) y para la síntesis de olefinas mediante los genes ole. El examen de estas dos rutas revela productos intermedios similares. El producto de la condensación de ácidos grasos en ambas rutas 40 es una 2-alquil-3-cetoacil graso-CoA o 2-alquil-3-cetoacil graso-ACP. Como resultado, la sobreexpresión de oleC y oleD en un organismo que produce ácido micólico, tal como C. glutamicum, puede “secuestrar” la ruta de biosíntesis de ácido micólico conduciendo a la producción de olefinas.

En el primer esquema, oleC y oleD están sobreexpresados en un organismo que produce ácido micólico. Un organismo huésped apropiado podría ser C. glutamicum, un huésped industrial bien establecido con herramientas 45 genéticas bien elaboradas que es tolerante a la pérdida de producción de ácido micólico. La especificidad de ácido graso de los genes de ácido micólico de C. glutamicum es similar a los perfiles de especificidad observados para oleA, oleB, oleC y oleD. La sobreexpresión de oleC y oleD dirigiría al producto de pks13 hacia la síntesis de olefinas tal como se esboza en la figura 21.

En el segundo esquema, solo se sobreexpresa oleC en un organismo que produce ácido micólico. Este esquema 50 propuesto asume que OleC puede funcionar independientemente sobre un producto intermedio de 2-alquil-3-hidroxiacilo graso para formar olefinas. Esta ruta se destaca en la figura 22.

La potenciación de la producción de olefinas en una cepa que produce ácido micólico que expresa oleC y oleD puede obtenerse completando las siguientes modificaciones genéticas. Para evitar la eliminación de sustratos para OleC y OleD, cmrA, o su homólogo funcional, puede desactivarse para evitar la formación de ácido micólico mientras 55 se permite la acumulación de 2-alquil-3-cetoacil graso-ACP, un sustrato para OleD. Adicionalmente, la sobreexpresión de fadD32, accA3, accD4, accD5 o pks13 debe aumentar la producción de productos intermedios de ácido micólico requeridos, dando como resultado una mayor producción de olefinas con la sobreexpresión de oleC y

oleD.

Generalmente, existen varios métodos de identificación de péptidos que tienen actividad de condensación de acilo. La formación de producto usando uno o más de estos métodos indica que el péptido tiene actividad de condensación de acilo. Además de los ensayos in vitro proporcionados en el ejemplo 3, el péptido puede expresarse a partir de un ácido nucleico exógeno en una célula y luego puede prepararse un lisado celular. Diversos sustratos 5 tales como acil-CoA, acil-ACP, acil-AMP, acil-éster, ácido graso, o mezclas de los mismos pueden añadirse al lisado y los productos pueden detectarse usando los métodos de CG/EM o CG/FID descritos en el presente documento. En otro ejemplo, el péptido puede purificarse e incubarse con lisado celular a partir de una célula que no expresa el péptido (a continuación en el presente documento, lisado silvestre). El péptido purificado, lisado silvestre y diversos sustratos pueden incubarse. Los productos resultantes pueden caracterizarse usando los métodos de CG/EM o 10 CG/FID descritos en el presente documento. En aún otro ejemplo, la actividad de condensación de acilo puede caracterizarse incubando enzima purificada y sustrato en presencia de lisado celular que se ha calentado hasta desnaturalizar las proteínas. En otro ejemplo, el péptido purificado y diversos sustratos pueden incubarse, y el producto resultante puede caracterizarse usando los métodos de CG/EM descritos en el presente documento. Los péptidos que tienen actividad de condensación de acilo se identifican como aquellos que producen cetonas 15 alifáticas. Un experto habitual en la técnica apreciará que cuando se usa un lisado celular que ya contiene cetonas alifáticas, los péptidos que tienen actividad de condensación de acilo se reconocerán por un aumento en cetonas alifáticas en comparación con el lisado sin la adición de sustrato (tal como un aumento de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 50% o al menos el 90%).

En algunos casos, la condensación puede dar como resultado la producción de moléculas derivadas de uno o más 20 de los sustratos. Por ejemplo, la condensación de dos moléculas de acil-CoA puede producir al menos una molécula de CoA. Puesto que CoA tiene un resto tiol libre (RSH), que es altamente reactivo, esta molécula puede detectarse mediante una variedad de métodos. Un método de este tipo es la reacción con ácido ditionitrobenzoico (reactivo de Ellman) que puede seguirse espectrofotométricamente a 411 nm. Alternativamente, puede hacerse reaccionar CoA con monobromobimano y detectarse mediante HPLC (Fahey, et al., Methods Enzymol. 143: 85-96, (1987)). 25

Pueden usarse métodos bioinformáticos para encontrar péptidos de condensación de acilo. Las condensaciones de acilo se producen mediante una reacción química bien conocida, conocida como “condensación de Claisen”. La condensación de Claisen es una reacción que forma enlaces carbono-carbono que se produce entre dos ésteres o un éster y otro compuesto de carbonilo en presencia de una base fuerte que dando como resultado un -cetoéster o una -dicetona. 30

Los péptidos de condensación de acilo contienen normalmente una tríada catalítica compuesta por Cys-His-Asn. Las enzimas de condensación comparten un pliegue tridimensional común, aunque comparten poca similitud al nivel de aminoácidos. Sus sitios activos, sin embargo, presentan similitudes significativas. (Heath et al, Nat. Prod. Rep., 19: 581-596, (2002)).

Los péptidos de condensación de acilo a modo de ejemplo incluyen las secuencias de OleA dadas a conocer en el 35 presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 135-464 y SEQ ID NO 478-487, homólogos de estas secuencias, enzimas que tienen uno o más de los motivos estructurales de OleA proporcionados en el presente documento, y fragmentos activos/variantes de las mismas que presentan actividad de condensación de acilo. 40

Pueden modificarse organismos recombinantes por ingeniería genética usando los péptidos dados a conocer en el presente documento para producir hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos que tienen características estructurales definidas (grados de ramificación, saturación y longitud de cadena de carbono). Un método de elaboración de productos intermedios de hidrocarburos implica expresar, aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, una o más enzimas, por ejemplo, actividad hidrocarburo sintasa, péptidos de 45 adenilación, deshidrogenasas, deshidratasas o enzimas de condensación de acilo. Las enzimas a modo de ejemplo que pueden manipularse para aumentar la producción de hidrocarburos incluyen OleA, OleB, OleC, OleBC y OleD, así como otras enzimas que aumentan o modifican la producción de ácidos grasos. Un experto habitual en la técnica apreciará que los productos producidos a partir de tales enzimas varían con la cadena de acilo del sustrato.

Los péptidos de adenilación incluyen péptidos que pueden catalizar la adición de adenosina monofosfato a 50 productos intermedios de hidrocarburos, tales como un -cetoácido, incluyendo -cetoácidos -sustituidos, particularmente los que incluyen un hidrocarburo alifático en la posición . Tal como se describió anteriormente, el grupo -alifático en tales productos intermedios es normalmente una cadena de hidrocarburo opcionalmente ramificada que incluye opcionalmente uno o más sitios de insaturación, por ejemplo, uno, dos, o tres sitios de insaturación en la cadena de hidrocarburo. Tales péptidos de adenilación pueden catalizar también la adición de 55 adenosina monofosfato a -hidroxiocetoácidos para formar un -cetoéster. Métodos de identificación de tal actividad se proporcionan en el presente documento.

En algunos ejemplos, los péptidos de adenilación son más específicos para sustrato y solo aceptarán, por ejemplo, -cetoésteres activados por CoA o ACP. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos

péptidos de adenilación también reaccionan. Por ejemplo, algunos péptidos de adenilación aceptarán otros sustratos además de -cetoácidos -sustituidos. Por tanto, tales péptidos de adenilación relativamente no específicos también se incluyen. Los ejemplos de péptidos de adenilación están disponibles públicamente (véanse, por ejemplo, las tablas 1 y 2). A menudo el péptido de adenilación cataliza reacciones adicionales, tales como la transesterificación del compuesto adenilado con otros grupos activadores, tales como CoA. Esta actividad se considera actividad 5 sintasa. Un ejemplo sería el siguiente conjunto de reacciones:

1) R + ATP  R-OPO3-Adenosina + pirofosfato

2) R-OPO3-Adenosina + CoASH  R-SCoA + AMP

Existen varios métodos de identificación de péptidos que tienen actividad de adenilación. La formación de producto usando uno o más de estos métodos indica que el péptido tiene actividad de adenilación. Además de los ensayos in 10 vivo proporcionados en el presente documento, el péptido puede expresarse a partir de un ácido nucleico exógeno en una célula y luego puede prepararse un lisado celular. Pueden añadirse diversos sustratos tales como ATP al lisado, y pueden detectarse los productos usando los métodos descritos en el presente documento. En otro ejemplo, el péptido puede purificarse e incubarse con lisado celular de una célula que no expresa el péptido. El péptido purificado, lisado silvestre y diversos sustratos pueden incubarse. Los productos resultantes pueden caracterizarse 15 usando los métodos descritos en el presente documento. Un experto habitual en la técnica apreciará que cuando se usa un lisado celular que ya contiene productos adenilados, los péptidos que tienen actividad de adenilación se reconocerán por un aumento en o bien PPi libre, -cetoésteres -sustituidos de AMP o -hidroxiésteres -sustituidos de AMP en comparación con el lisado sin la adición de sustrato. Los péptidos de adenilación a modo de ejemplo incluyen OleC (por ejemplo, SEQ ID NO: 6), las proteínas OleC enumeradas en la tabla 1 y fragmentos 20 activos/variantes de las mismas que presentan actividad de adenilación.

Los péptidos de deshidrogenasa incluyen péptidos que pueden catalizar la reducción de un grupo ceto en una cetona alifática, un -cetoácido alifático o una molécula de -cetoéster alifática al grupo hidroxilo correspondiente (la adición de H2 a través del doble enlace carbono-oxígeno). En el presente documento se proporcionan métodos de identificación de tal actividad. En algunos ejemplos, los péptidos de deshidrogenasa son más específicos de sustrato 25 y solo aceptarán, por ejemplo, ésteres de -cetoésteres -alifáticos de CoA o ACP. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de deshidrogenasa catalizarán otras reacciones también. Por ejemplo, algunos péptidos de deshidrogenasa aceptarán otros sustratos además de -cetoésteres. Por tanto, también se incluyen tales péptidos de deshidrogenasa no específicos. Ejemplos de péptidos de deshidrogenasa son OleD (por ejemplo, SEQ ID NO: 8) y los péptidos deshidrogenasas disponibles públicamente proporcionados en la 30 tabla 1.

Existen varios métodos de identificación de péptidos que tienen actividad deshidrogenasa. La formación de producto usando uno o más de estos métodos indica que el péptido tiene actividad deshidrogenasa. Además de los ensayos in vivo proporcionados en el presente documento, el péptido puede expresarse a partir de una secuencia exógena de ácido nucleico en una célula y luego puede prepararse un ensayo in vitro que contiene lisado celular o péptido 35 purificado. Pueden añadirse diversos sustratos, tales como NADPH y/o NADH, al ensayo y pueden detectarse los productos usando los métodos de CG/EM descritos en el presente documento.

En otro ejemplo, el péptido puede purificarse e incubarse con lisado celular de una célula que no expresa el péptido. El péptido purificado, lisado silvestre y diversos sustratos (por ejemplo, ácido graso, acil-CoA, acil-AMP, acil-ACP, -alquil--cetoácido, -alquil--cetoéster, o una cetona alifática) pueden incubarse. Los productos resultantes pueden 40 caracterizarse usando los métodos descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, el ejemplo 1).

En aún otro ejemplo, puede detectarse la actividad deshidrogenasa monitorizando espectrofotométricamente la oxidación dependiente de deshidrogenasa del NADPH o NADH en presencia del sustrato cetona. La actividad deshidrogenasa se detecta como una disminución en la absorbancia de la disolución de reacción a 340 nm.

En aún otro ejemplo, la actividad deshidrogenasa puede caracterizarse incubando enzima purificada y sustrato (por 45 ejemplo, NAD(P)H, -cetoésteres -alifáticos y/o -cetoácidos -alifáticos) en presencia de lisado celular que se ha calentado para desnaturalizar las proteínas. Los péptidos que tienen actividad deshidrogenasa se identifican como los que producen moléculas de -hidroxiácido o éster (particularmente, éster activado) a partir de una o más de las reacciones descritas anteriormente. Un experto habitual en la técnica apreciará que cuando se usa un lisado celular que ya contiene productos de -hidroxiácido y/o éster, los péptidos que tienen actividad deshidrogenasa se 50 reconocerán por un aumento en o bien NADP, -hidroxiácido y/o bien moléculas de éster en comparación con el lisado sin la adición de sustrato.

Los péptidos de deshidrogenasa a modo de ejemplo incluyen OleD (por ejemplo, SEQ ID NO: 8) y las enzimas relacionadas mostradas en la tabla 1. Pueden identificarse enzimas OleD adicionales buscando en diversas bases de datos usando los motivos de OleD proporcionados en el presente documento y la metodología descrita en el 55 presente documento.

Además, en el presente documento se dan a conocer ácidos nucleicos que codifican para un péptido que tiene

actividad hidrolasa. En particular, el péptido tendría actividad hidrolítica de -ceto o -hidroxiéster. Un péptido de este tipo catalizaría probablemente la hidrólisis de ésteres de todos los sustratos descritos anteriormente para producir el ácido carboxílico correspondiente. Pueden detectarse éster hidrolasas monitorizando la producción de producto, tal como el -cetoácido o -hidroxiácido mediante HPLC (u otras técnicas bien conocidas). En otra realización, la disminución resultante en el pH debida a la formación de los ácidos libres puede monitorizarse. 5 Alternativamente, puede monitorizarse la hidrólisis de éster midiendo la acumulación del resto liberado del éster graso, tal como CoASH, AMP o fosfato. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para monitorizar estos compuestos y algunos de estos métodos se describieron anteriormente. Puede monitorizarse fosfato, por ejemplo, mediante la reacción con molibdato y verde malaquita. Pueden obtenerse ensayos adicionales comercialmente (por ejemplo, de BioVision, Inc., Mountain View, CA). 10

En el presente documento se da a conocer un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que codifica para OleA que comprende una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50) sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18, en el que la secuencia de aminoácidos 15 comprende una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50) sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido.

En el presente documento se dan a conocer polipéptidos que comprenden actividad biológica. La actividad biológica del polipéptido puede ser actividad de condensación de Claisen. Específicamente, la actividad biológica del polipéptido puede ser la condensación de dos aciltioésteres. 20

En el presente documento se da a conocer un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que codifica para OleD que comprende una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50) sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una o más (por 25 ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50) sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido.

En el presente documento se da a conocer un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica que una proteína OleA. Por ejemplo, en el presente documento se da a conocer un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido que 30 comprende, consiste esencialmente en o consiste en, la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22. El ácido nucleico aislado puede comprender (i) una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma, o (ii) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con un complemento de 35 una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 21 o a un fragmento de la misma.

Puede encontrarse una guía para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 – 6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y puede usarse cualquier método. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente 40 documento son tal como sigue: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a 45ºC, seguido por dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55ºC para las condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a 45ºC, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 60ºC; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en SSC 6X a 45ºC, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS 45 al 0,1% a 65ºC; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido por uno o más lavados a SSC 0,2X, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones de muy alta rigurosidad (4) son las condiciones preferidas a no ser que se especifique otra cosa. Tal como se usa en el presente documento, el término “se hibrida” se refiere generalmente a condiciones de baja rigurosidad, de rigurosidad media, de alta rigurosidad o de muy alta rigurosidad. 50

En el presente documento se dan a conocer polipéptidos que comprenden actividad biológica. La actividad biológica puede ser actividad oxidorreductasa. Específicamente, la actividad biológica puede ser reducción de un grupo ceto (por ejemplo, una cetona, cetona alifática, -alquil--cetoácido, -alquil--cetoéster).

La actividad hidrocarburo sintasa es la actividad de uno o más péptidos que producen la conversión de un sustrato que contiene una cadena de acilo graso, tal como acil-CoA, acil-ACP, o ácido graso, en un hidrocarburo o producto 55 intermedio de hidrocarburo. Los ejemplos de péptidos que tienen actividad hidrocarburo sintasa incluyen Ole A, Ole B, OleC, OleD y OleBC.

La actividad hidrocarburo sintasa puede someterse a prueba, por ejemplo, usando un ensayo de complementación (véase el ejemplo 6, más adelante). Los organismos que se sabe que elaboran hidrocarburos tras la expresión de

OleA, OleB, OleC y OleD pueden usarse como huésped de prueba. Por ejemplo, si está sometiéndose a prueba una OleC candidata para determinar la actividad hidrocarburo sintasa, entonces se modifica por ingeniería genética el huésped de prueba para expresar solo oleA y oleD, pero no oleC. El oleC candidato se expresa entonces en el huésped de prueba que carece de oleC. Se considera que la OleC candidata tiene actividad hidrocarburo sintasa si el huésped de prueba produce hidrocarburos. 5

Usando las secuencias de OleA, OleBC u OleC y OleD proporcionadas en el presente documento y el ensayo de complementación descrito en el ejemplo 6, pueden identificarse genes que forman hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos adicionales. Pueden formarse hidrocarburos y productos intermedios de los mismos expresando OleA, OleBC u OleC y OleD en E. coli. Por tanto, puede usarse E. coli modificada por ingeniería genética para elaborar hidrocarburos u otros organismos que producen hidrocarburos de manera natural (por 10 ejemplo, S. maltophilia, C. aggregans, X. axonopodis o A. aurescens) para determinar la actividad hidrocarburo sintasa de una proteína o secuencia de ADN específica cuando esa secuencia de ADN específica que va a someterse a prueba no se expresa en la célula huésped.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula huésped” es una célula usada para producir un producto descrito en el presente documento (por ejemplo, una olefina descrita en el presente documento). Una célula 15 huésped puede modificarse para expresar o sobreexpresar genes seleccionados o para tener una expresión atenuada de genes seleccionados.

Como ejemplo, cuando la secuencia de ADN que va a someterse a prueba codifica para un homólogo de una secuencia de proteína OleA, se expresa en un huésped que ya expresa las secuencias de oleC y oleD, pero no las secuencias de oleA. Se considera que el homólogo de OleA es activo (es decir, tiene actividad hidrocarburo sintasa) 20 si el huésped produce hidrocarburos o productos intermedios de hidrocarburos cuando expresa el homólogo de oleA.

En el presente documento se da a conocer un método para identificar una enzima útil para la producción de hidrocarburos que comprende (i) transformar una célula que comprende polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en (a) OleA y OleD, (b) OleA y OleC, y (c) OleC y OleD con un ácido nucleico que codifica para una enzima 25 que se sospecha que tiene la capacidad para producir hidrocarburos; y (ii) determinar si la célula produce hidrocarburos, en el que la existencia de producción de hidrocarburos por la célula indica que el ácido nucleico codifica para un polipéptido útil para la producción de hidrocarburos.

Por ejemplo, el método puede comprender (i) transformar una célula que comprende polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en (a) OleA y OleD, (b) OleA y OleC, (c) OleC y OleD, (d) OleA y OleBC, y (e) OleBC y OleD con 30 un ácido nucleico que codifica para una enzima que se sospecha que tiene la capacidad para producir hidrocarburos, en el que la OleA comparte una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 18; en el que la OleC comparte una identidad de 35 secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 88; y en el que la OleD comparte una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 40 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 22, con un ácido nucleico que codifica para una enzima que se sospecha que tiene la capacidad para producir hidrocarburos; y (ii) determinar si la célula produce hidrocarburos, en el que la existencia de producción de hidrocarburos por la célula indica que el ácido nucleico codifica para un polipéptido útil para la producción de hidrocarburos. 45

Los organismos que producen hidrocarburos de manera natural (sin modificación por ingeniería genética) pueden modificarse por ingeniería genética para sobreproducir hidrocarburos o producir hidrocarburos con características de cadena de carbono específicas alterando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos tal como se describe en el presente documento. Los organismos a modo de ejemplo que se sabe que producen hidrocarburos y que pueden modificarse por ingeniería genética para alterar la producción de hidrocarburos usando las enseñanzas proporcionadas en el 50 presente documento incluyen, pero no se limitan a, Acinetobacter spp., Chloroflexus spp., Kineococcus radiotolerans, Stenotrophomonas maltophilia, Micrococcus spp., Arthrobacter spp., Vibrio furnissii y cianobacterias. Estos organismos recombinantes modificados por ingeniería genética son útiles para la producción de hidrocarburos.

Los organismos recombinantes modificados por ingeniería genética también pueden usarse para producir cetonas alifáticas. Por ejemplo, los organismos que tienen oleA, oleC y oleD pueden modificarse por ingeniería genética para 55 producir cetonas alifáticas delecionando o atenuando genes que codifican para oleC y oleD. El organismo modificado genéticamente resultante produce cetonas como resultado de la expresión de oleA endógena cuando oleC y oleD están delecionados o atenuados. Los organismos que tienen oleA y oleC pueden modificarse por ingeniería genética para producir cetonas alifáticas delecionando o atenuando el gen que codifica para oleC. De manera similar, los organismos que tienen oleA y oleD pueden modificarse por ingeniería para producir cetonas 60

alifáticas delecionando o atenuando el gen que codifica para oleD. El organismo modificado genéticamente resultante produce cetonas como resultado de la expresión de oleA endógeno cuando oleC o oleD están delecionados o atenuados.

En otros ejemplos, los organismos recombinantes que producen hidrocarburos se modifican por ingeniería genética para sobreexpresar uno o más péptidos seleccionados de OleA, OleB, OleC, OleD, OleBC, y combinaciones de los 5 mismos. Estos genes pueden sobreexpresarse en organismos que producen hidrocarburos de manera natural, tales como los descritos anteriormente, o pueden sobreexpresarse en organismos que no producen hidrocarburos de manera natural.

Tal como se usa en el presente documento, “sobreexpresar” significa expresar o hacer que se exprese un ácido nucleico, polipéptido o hidrocarburo en una célula a una concentración mayor que la expresada normalmente en una 10 célula silvestre correspondiente. Por ejemplo, un polipéptido puede “sobreexpresarse” en una célula recombinante cuando el polipéptido está presente en una concentración mayor en la célula recombinante en comparación con su concentración en una célula no recombinante de la misma especie.

Los ejemplos de organismos recombinantes que sobreexpresan un péptido incluyen organismos que expresan ácidos nucleicos que codifican para OleA, OleB, OleC, OleD, OleBC, o combinaciones de las mismas. Otros 15 ejemplos incluyen organismos en los que se han introducido secuencias de promotor exógenas en el sentido de 5’ de la secuencia codificante endógena de OleA, OleB, OleC, OleD, OleBC, o combinaciones de las mismas. En algunos ejemplos, la sobreexpresión de uno o más genes que alteran rutas de biosíntesis de ácidos grasos puede sobreexpresarse en combinación con OleA, OleB, OleC, OleBC u OleD.

Se proporcionan organismos recombinantes (por ejemplo, células bacterianas, fúngicas o eucariotas) que están 20 modificados por ingeniería genética (por ejemplo, transformados, transducidos o transfectados) con una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más de OleA (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18), OleB (por ejemplo, SEQ ID NO: 10), OleC (por ejemplo, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 88), OleD (por ejemplo, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22), o una variante u homólogo de una o más de estas secuencias. Estas secuencias pueden expresarse a partir de 25 constructos de vector, directamente a partir del cromosoma tras la integración génica o a partir de matrices extracromosómicos. Por ejemplo, una proteína OleA (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), OleC (por ejemplo, SEQ ID NO: 6) u OleD (por ejemplo, SEQ ID NO: 8) está codificada por un ácido nucleico que está operativamente unido a elementos de control de la expresión génica que son funcionales en el organismo recombinante deseado, por ejemplo un promotor T7 en E. coli. 30

Tal como se usa en el presente documento, “elemento de control” significa un elemento de control transcripcional. Los elementos de control incluyen promotores y potenciadores. El término “elemento promotor”, “promotor” o “secuencia de promotor” se refiere a una secuencia de ADN que funciona como un interruptor que activa la expresión de un gen. Si el gen está activado, se dice que se transcribe o participa en la transcripción. La transcripción implica la síntesis de ARNm a partir del gen. Un promotor, por tanto, sirve como un elemento 35 regulatorio transcripcional y también proporciona un sitio para la iniciación de la transcripción del gen para dar ARNm. Los elementos de control interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis et al., Science 236: 1237 (1987)).

Los métodos de expresión de proteínas en sistemas de expresión heterólogos se conocen bien en la técnica. Normalmente, un organismo recombinante de levadura o bacteriano se transforma mediante transformación natural, 40 electroporación, conjugación o transducción. El constructo de expresión resultante puede ser o bien extracromosómico, como con un plásmido, o bien estar integrado en el cromosoma tras la recombinación. En células eucariotas, normalmente, se transfecta un organismo recombinante con (o se infecta con un virus que contiene) un vector de expresión usando cualquier método adecuado para el organismo recombinante particular. Tales métodos de transfección se conocen bien también en la técnica y se describen métodos a modo de ejemplo no limitativos en 45 el presente documento. El organismo recombinante transformado puede expresar la proteína codificada por el ácido nucleico en el casete de expresión. En otra realización, puede realizarse también transfección transitoria o estable del organismo recombinante con uno o más vectores de expresión.

Pueden usarse muchos tipos diferentes de organismos recombinantes para producir las proteínas proporcionadas en el presente documento, tales como bacterias, levaduras, algas, hongos, insectos, células de vertebrados (tales 50 como células de mamífero) y células vegetales, incluyendo (tal como sea apropiado) células primarias y líneas celulares inmortales. Se usan frecuentemente numerosos representantes de cada tipo de célula y están disponibles de una amplia variedad de fuentes comerciales, incluyendo, por ejemplo, ATCC, Pharmacia e Invitrogen.

Frecuentemente se usan diversas cepas de levadura y vectores derivados de levaduras para la producción de proteínas heterólogas. Por ejemplo, los ejemplos no limitativos, específicos de células de levadura adecuadas 55 incluyen células de Saccharomyces cerevisiae, células de Aspergillus, células de Trichoderma, células de Neurospora, células de Fusarium o células de Chrysosporium. En un ejemplo específico no limitativo, pueden usarse sistemas de expresión de Pichia pastoris, obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, California), para producir un péptido de OleA, OleB, OleC, OleBC u OleD. Tales sistemas incluyen cepas de Pichia pastoris, vectores, reactivos,

transformantes, cebadores de secuenciación y medios adecuados. Por ejemplo, las cepas disponibles incluyen, pero no se limitan a, KM71H (una cepa prototrófica), SMD1168H (una cepa prototrófica) y SMD1168 (una cepa mutante de pep4) (Invitrogen).

Saccharomyces cerevisiae es otra especie de levadura usada frecuentemente como huésped. El plásmido YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141, (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157, 5 (1980)) se usa frecuentemente como vector de expresión en un mutante de Saccharomyces que no puede producir triptófano. Este plásmido contiene el gen trp1 que cuando se transforma en la cepa mutante de levadura permite que la cepa mutante de la levadura produzca triptófano y crezca en ausencia de triptófano. Los ejemplos de cepas huésped en las que puede usarse el gen trp1 como marcador de selección incluyen, pero no se limitan a, ATCC n.º 44.076 y PEP4-1 (Jones, Genetics, 23: 12, (1977)). La presencia de lesión de trp1 en el genoma del organismo 10 recombinante de levadura proporciona una característica eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

Los organismos recombinantes de levadura pueden transformarse usando el método de polietilenglicol, tal como se describe por Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, (1978). Se exponen protocolos de transformación de levadura en Gietz et al., Nucl. Acids Res., 20(17): 1425, (1992) y Reeves et al., FEMS, 99(2-3): 193-197, (1992). 15

Muchos organismos celulares, tales como levadura, animales y bacterias, producen lípidos como componentes esenciales de sus membranas celulares. Los métodos mediante los que estos organismos producen los grupos acilo grasos usados como lípidos están altamente conservados. No obstante, existen variaciones en las rutas que pueden influir en la disponibilidad de algunos de los productos intermedios de lípidos, tales como acil-coA y acil-ACP. Estos productos intermedios de lípidos son también sustratos clave en la producción de cetonas alifáticas e hidrocarburos 20 por las proteínas Ole. En Saccharomyces cerevisiae, acil-coA se une a proteína de unión a acil-coenzima A (ACBP), que protege las acil-coA de la hidrólisis por tioesterasas (véanse, por ejemplo, Rose et al., PNAS, 89: 11287-11291 (1992), Feddersen et al., Biochem. J., 407: 219-230 (2007)). Las proteínas Ole competirían con la ACBP para usar acil-coA como sustrato para la síntesis de hidrocarburos o cetonas alifáticas. Por tanto, pueden ser necesarias modificaciones en ACBP para reducir su competición por acil-CoA. Las mutaciones condicionales en la ACBP han 25 mostrado en la bibliografía que liberan acumulaciones de acil-CoA en S. cerevisiae (véase, por ejemplo, Gaigg et al., Mol. Blol. Cell, 12: 1147-1160 (2001)). Por tanto, la expresión de los genes ole en una cepa huésped en la que existe control sobre la cantidad de acil-CoA libre disponible, tal como la cepa de S. cerevisiae Y700pGAL1-ACB1 (véase, por ejemplo, Gaigg et al., citado anteriormente), debe conducir a mayores niveles de cetonas alifáticas o hidrocarburos producidos. 30

En la construcción de vectores de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes están ligadas también en la región en 3’ de la secuencia que se desea expresar. Cualquier vector de plásmido que contiene un promotor compatible con levadura que puede transcribir una secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARNt procariota, un origen de replicación y una secuencia de terminación, es adecuado.

Otros organismos recombinantes adecuados son células bacterianas. Los ejemplos no limitativos, específicos de 35 filos bacterianos adecuados que podrían ser organismos recombinantes incluyen Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes, Chlamydiae, Clorobi, Cloroflexi Chrysiogenetes, Cianobacteria, Deferribacteres, Deinococcus, Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae y Verrucomicrobia. 40

Los ejemplos no limitativos, específicos, de especies bacterianas que podrían usarse como organismos recombinantes incluyen Escherichia coli, Thermus thermophilus, Stenotrophomonas maltophilia, Kineococcus radiotolerans, Bacillus stearothermophilus, Methanococcusjannaschii, Methanosarcina mazei, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Halobacterium tal como Haloferax volcanii y especies de Halobacterium NRC-i, Archaeoglobusfulgidus, Pyrococcus fitriosus, Pyrococcus horikoshii, 45 Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Aeuropyrum pernix, Thermoplasma acidophilum y Thermoplasma volcanium.

En una realización, el organismo recombinante es una célula de E. coli, una célula de S. maltophilia, una célula de Pseudomonas sp., una célula de Bacillus sp., una célula de Actinomycetes o células que pertenecen al género Rhodococcus. La introducción del constructo en el organismo recombinante puede lograrse mediante una variedad 50 de métodos incluyendo, pero sin limitarse a, transfección por fosfato de calcio, transfección mediada por dextrano-DEAE, transfección mediada por polibreno, fusión de protoblastos, transfección mediada por liposomas, conjugación, transformación natural, electroporación, y otros métodos conocidos en la técnica.

Todavía otros organismos recombinantes adecuados son células vegetales (por ejemplo, licopodios, helechos, angiospermas o gimnospermas). Los organismos recombinantes adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan 55 a, algas, musgos y líquenes. Puede emplearse cualquier método conocido para la transformación, el cultivo y la regeneración de células vegetales. Los métodos para la introducción de ADN foráneo en células vegetales incluyen, pero no se limitan a, transferencia que implica el uso de Agrobacterium tumefaciens y vectores Ti apropiados, incluyendo vectores binarios; transferencia inducida químicamente (por ejemplo, con polietilenglicol); biolística; y

microinyección. Véase, por ejemplo, An et al., Plant Molecular Biology Manual, A3: 1-19 (1988). Se conocen en la técnica diversos promotores adecuados para la expresión de genes heterólogos en células vegetales, incluyendo promotores constitutivos, por ejemplo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que se expresa en muchos tejidos vegetales, promotores específicos de órganos o tejidos y promotores que son inducibles mediante productos químicos, tales como jazmonato de metilo, ácido salicílico o protectores. 5

Los organismos recombinantes se hacen crecer en condiciones apropiadas hasta una densidad celular adecuada. Si la secuencia de interés está operativamente unida a un promotor inducible, se realiza la alteración medioambiental apropiada para inducir la expresión. Si el producto (por ejemplo, hidrocarburo) se acumula en el organismo recombinante, se recogen las células, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración. Pueden realizarse extracciones de células completas para purificar los productos de las células completas. En una realización 10 alternativa, podría realizar una extracción de cultivo completo, en la que el organismo, el medio y el producto se recogen juntos, para recuperar el producto deseado. Entonces puede purificarse el extracto de cultivo completo para obtener el producto deseado. Si los organismos recombinantes secretan el producto al medio, las células y el medio se separan. El medio se conserva entonces para la purificación del producto deseado.

En el presente documento se da a conocer un organismo modificado genéticamente que comprende una secuencia 15 exógena de ácido nucleico incorporada de manera estable en el genoma de un organismo en el sentido de 5’ de una secuencia genómica de ácido nucleico que (a) tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con respecto a la secuencia de ácido nucleico de un gen ole y (b) codifica para un polipéptido. Por ejemplo, el 20 organismo modificado genéticamente puede comprender una secuencia exógena de ácido nucleico incorporada de manera estable en el genoma de un organismo en el sentido de 5’ de una secuencia genómica de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con respecto a una secuencia de 25 ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 87, y una secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquiera de SEQ ID NO: 135-464. El organismo modificado genéticamente puede comprender una secuencia exógena de ácido nucleico incorporada de manera estable en el genoma de un organismo en el sentido de 5’ de una secuencia genómica de ácido nucleico 30 que tiene una identidad de secuencia del al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) con respecto a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y 35 SEQ ID NO: 87.

El organismo modificado genéticamente puede comprender una secuencia exógena de ácido nucleico incorporada de manera estable en el genoma de un organismo en el sentido de 5’ de una secuencia genómica de ácido nucleico que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ 40 ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 87.

En el presente documento se da a conocer un organismo modificado genéticamente preparado (a) proporcionando un organismo que tiene una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al 45 menos el 99,5%) con respecto a la secuencia de ácido nucleico de un gen ole y (b) delecionando o mutando la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el organismo modificado genéticamente se prepara delecionando o mutando una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 99,5%) 50 con respecto a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 87, y una secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquiera de SEQ ID NO: 135-464. El organismo modificado genéticamente puede prepararse delecionando o mutando una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 35% (por ejemplo, al menos el 55 45%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 99,5%) con respecto a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 87.

El organismo modificado genéticamente puede prepararse delecionando o mutando una secuencia de ácido nucleico 60 que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y

SEQ ID NO: 87.

El organismo modificado genéticamente puede ser cualquier organismo susceptible de modificación por ingeniería genética. Preferiblemente, el organismo modificado genéticamente se selecciona del grupo que consiste en Anaeromyxobacter sp. Fw109-5, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter clorophenolicus, Arthrobacter sp. FB24, Bdellovibrio bacteriovorus, Blastopirellula marina, Brevibacterium linens, Burkholderia ambifaria, Burkholderia 5 cenocepacia, Burkholderia oklahomensis, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia sp. 383, Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, Chloroflexus aggregans, Chloroflexus aurantiacus, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus, Clostridium botulinum A, Clostridium botulinum A3, Clostridium botulinum B1, Clostridium botulinum Bf, Clostridium botulinum F, Clostridium botulinum, Colwellia psychrerythraea, Congregibacter litoralis, Desulfatibacillum alkenivorans, Desulfococcus oleovorans, Desulfotalea psychrophila, 10 Desulfuromonas acetoxidans, Flavobacteriales bacterium, Gemmata obscuriglobus, Geobacter bemidjiensis, Geobacter lovleyi, Geobacter sp. FRC-32, Geobacter uraniumreducens, Hahella chejuensis, Jannaschia sp. CCS1, Kineococcus radiotolerans, Lentisphaera araneosa, Maricaulis maris, Marinobacter algicola, Marinobacter aquaeolei, Micrococcus luteus, Microscilla marina, Moritella sp. PE36, Mycobacterium avium, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium sp. GP1, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium 15 vanbaalenii, Neisseria gonorrhoeae, Nocardia farcinica, Opitutaceae bacterium, Opitutus terrae, Paenibacillus sp. JDR-2, Pelobacter propionicus, Photobacterium profundum, Photobacterium profundum, Photorhabdus luminescens subsp. laumondii, Planctomyces maris, Plesiocystis pacifica, Pseudoalteromonas atlantica, Psychromonas ingrahamii, Psychromonas sp. CNPT3, Ralstonia pickettii, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp., Rhodopirellula baltica, Roseovarius nubinhibens, Shewanella amazonensis, Shewanella baltica, Shewanella 20 benthica, Shewanella denitrificans, Shewanella frigidimarina, Shewanella halifaxensis, Shewanella loihica, Shewanella oneidensis, Shewanella pealeana, Shewanella putrefaciens, Shewanella sediminis, Shewanella sp. ANA-3, Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. MR-7, Shewanella sp. W3-18-1, Shewanella woodyi, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces ambofaciens, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae y Xylella fastidiosa. 25

La secuencia exógena de ácido nucleico incorporada de manera estable en el genoma de un organismo modificado genéticamente puede aumentar la expresión del polipéptido codificado por la secuencia genómica de ácido nucleico en relación con la expresión del mismo polipéptido en el organismo antes de la incorporación de la secuencia exógena de ácido nucleico en las mismas condiciones. El organismo modificado genéticamente puede producir una cantidad aumentada de un hidrocarburo en relación con la producción de un hidrocarburo en un organismo silvestre 30 en las mismas condiciones.

La deleción o mutación de la secuencia de ácido nucleico en el organismo modificado genéticamente puede dar como resultado una producción disminuida de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico en relación con la producción del mismo polipéptido en el organismo antes de la deleción o mutación de la secuencia de ácido nucleico en las mismas condiciones. El organismo modificado genéticamente puede producir cetonas. Por 35 ejemplo, el organismo modificado genéticamente puede producir una cantidad aumentada de cetonas en relación con la producción de cetonas en el organismo antes de la deleción o mutación de la secuencia de ácido nucleico en las mismas condiciones.

En el presente documento se dan a conocer métodos de elaboración de cetonas alifáticas, hidrocarburos y productos intermedios de los mismos. Se proporcionan diversos organismos recombinantes que pueden usarse para 40 producir productos que tienen longitudes de la cadena de carbono, sitio de insaturación y puntos de ramificación modificados por ingeniería genética. También se proporcionan métodos de elaboración de tales productos así como métodos de modificación adicional de los productos, tales como mediante craqueo, para crear biocombustibles y productos químicos de especialidad de alta calidad.

Las cetonas alifáticas, los hidrocarburos y los productos intermedios de hidrocarburos pueden modificarse por 45 ingeniería genética para tener características de cadena de carbono específicas expresando diversas enzimas o atenuando la expresión de diversas enzimas en el organismo recombinante. Por ejemplo, la longitud de la cadena de carbono puede controlarse expresando diversas tioesterasas en el organismo recombinante al tiempo que se atenúa la expresión de tioesterasas endógenas. De manera similar, pueden introducirse diversos puntos de ramificación en la cadena de carbono expresando diversos genes -cetoácido descarboxilasa/deshidrogenasa de cadena ramificada 50 (por ejemplo, genes bkd), y el grado de saturación también puede controlarse expresando diversos genes, por ejemplo, sobreexpresando genes de -ceto-ACP-sintasa (por ejemplo, fabB). Se proporciona una descripción detallada de las diversas modificaciones que pueden incluirse en un organismo recombinante para proporcionar características de cadena de carbono específicas y para aumentar la producción de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2007/136762, que se incorpora en el presente 55 documento en su totalidad por referencia.

Se da a conocer en el presente documento un método para producir biocombustibles que comprende cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Tal como se usa en el mismo, el término “biocombustible” se refiere a cualquier combustible derivado de biomasa. Los biocombustibles pueden sustituir a combustibles a base de petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles incluyen combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diesel, 60 combustible de motores de reacción, etc.), combustibles de calefacción y combustibles de generación de

electricidad. Los biocombustibles son una fuente de energía renovable. Específicamente, el biocombustible producido puede ser una gasolina, biodiesel o combustible de motores de reacción.

Los biocombustibles que comprenden hidrocarburos producidos de manera biológica, particularmente hidrocarburos producidos de manera biológica usando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, no se han producido a partir de fuentes renovables y, como tales, son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos combustibles pueden 5 distinguirse de los combustibles derivados del carbono petroquímico basándose en la huella de carbono isotópico doble o la datación de 14C. Adicionalmente, la fuente específica de carbono de biofuentes (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante la huella de carbono isotópico doble (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.169.588).

La capacidad de distinguir biocombustibles de combustibles a base de petróleo es beneficiosa en el seguimiento de 10 estos materiales en el comercio. Por ejemplo, pueden distinguirse productos químicos o combustibles que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto de base biológica como a base de petróleo de productos químicos y combustibles preparados únicamente a partir de materiales a base de petróleo. Por tanto, puede realizarse un seguimiento de los presentes materiales en el comercio basándose en su perfil de isótopos de carbono único.

Los biocombustibles pueden distinguirse de los combustibles a base de petróleo comparando la razón de isótopos 15 de carbono estables (13C/12C) en cada combustible. La razón 13C/12C en un material de base biológica dado es una consecuencia de la razón 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento de fijar el dióxido de carbono. También refleja la ruta metabólica precisa. También se producen variaciones regionales. El petróleo, las plantas C3 (de hoja ancha), las plantas C4 (las hierbas) y los carbonatos marinos muestran diferencias significativas en 13C/12C y los valores de 13C correspondientes. Además, los análisis de materia lipídica de plantas C3 y C4 son diferentes de 20 los materiales derivados de componentes de hidratos de carbono de las mismas plantas como consecuencia de la ruta metabólica.

Dentro de la precisión de la medición, 13C muestra grandes variaciones debido a efectos de fraccionamiento isotópico, el más significativo de los cuales para biocombustibles es el mecanismo fotosintético. La principal causa de diferencias en la razón de isótopos de carbono en plantas está estrechamente asociada con diferencias en la ruta 25 del metabolismo de carbono fotosintético en las plantas, particularmente la reacción que se produce durante la carboxilación primaria (es decir, la fijación inicial de CO2 atmosférico). Dos grandes clases de vegetación son las que incorporan el ciclo fotosintético “C3”(o de Calvin-Benson) y las que incorporan el ciclo fotosintético “C4” (o de Hatch-Slack).

En las plantas C3, la reacción de carboxilación o fijación de CO2 principal implica la enzima ribulosa-1,5-difosfato 30 carboxilasa, y el primer producto estable es un compuesto de 3 carbonos. Las plantas C3, tales como de madera dura y coníferas, son dominantes en las zonas de clima templado.

En las plantas C4, una reacción de carboxilación adicional que implica otra enzima, fosfoenol-piruvato carboxilasa, es la reacción de carboxilación principal. El primer compuesto de carbono estable es un ácido de 4 carbonos que posteriormente se descarboxila. El CO2 así liberado vuelve a fijarse en el ciclo C3. Ejemplos de plantas C4 son 35 hierbas tropicales, maíz y caña de azúcar.

Tanto las plantas C4 como C3 muestran un intervalo de razones isotópicas 13C/12C, pero los valores normales son de -7 a -13 por mil para plantas C4 y de -19 a -27 por mil para plantas C3 (véase, por ejemplo, Stuiver et al., Radiocarbon 19:355, 1977). El carbón y el petróleo se encuentran generalmente en este último intervalo. La escala de medición de 13C se definió originalmente por un ajuste a cero por la caliza Pee Dee Belemnite (PDB), en la que 40 los valores se facilitan en partes por mil desviaciones a partir de este material. Los valores de “13C” son en partes por mil (por mil), abreviado, %o, y se calculan de la siguiente manera:

13C (%o) = [(13C/12C)muestra - (13C/12C)patrón]/ (13C/12C)patrón x 1000

Dado que el material de referencia (RM) PDB se ha agotado, se ha desarrollado una serie de RM alternativos en colaboración con IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios de isótopos internacionales seleccionados. Las 45 anotaciones para las desviaciones por mil a partir de PDB son de 13C. Las mediciones se realizan con CO2 mediante espectrometría de masas de razón estable de alta precisión (IRMS) con iones moleculares con masas de 44, 45 y 46.

Se da a conocer en el presente documento un hidrocarburo o biocombustible producido mediante cualquiera de los métodos dados a conocer en el presente documento. Específicamente, el hidrocarburo o biocombustible puede tener 50 una 13C de -28 o superior, -27 o superior, -20 o superior, -18 o superior, -15 o superior, -13 o superior, -10 o superior y -8 o superior. Por ejemplo, el hidrocarburo puede tener una 13C de -30 a -15, de -27 a -19, de -25 a -21, de -15 a -5, de -13 a -7 o de -13 a -10. También se da a conocer en el presente documento un hidrocarburo o biocombustible con una 13C de -10, -11, -12 o -12,3.

Los biocombustibles también pueden distinguirse de combustibles a base de petróleo comparando la cantidad de 55 14C en cada combustible. Dado que 14C tiene una semivida nuclear de 5730 años, los combustibles a base de

petróleo que contienen carbono “más antiguo” pueden distinguirse de los biocombustibles que contienen carbono “más reciente” (véase, por ejemplo, Currie, “Source Apportionment of Atmospheric Particles”, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, Eds., 1 de vol. I de IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 3-74).

La suposición básica en la datación de radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera 5 conduce a la constancia de 14C en los organismos vivos. Sin embargo, debido a pruebas nucleares atmosféricas desde 1950 y al quemado de combustible fósil desde 1850, 14C ha adquirido una segunda característica temporal geoquímica. Su concentración en el CO2 atmosférico, y por tanto en la biosfera viva, aproximadamente se duplicó en el máximo de las pruebas nucleares, a mediados de la década de 1960. Desde entonces ha vuelto gradualmente a la tasa de isótopos (14C/12C) inicial cosmogénica (atmosférica) en estado estacionario de aproximadamente 1,2 x 10 10-12, con una “semivida” de relajación aproximada de 7-10 años. (Esta última semivida no debe interpretarse de manera literal; en vez de eso, debe usarse la función de introducción/degradación nuclear atmosférica detallada para rastrear la variación de 14C atmosférico y biosférico desde el inicio de la era nuclear).

Esta última característica temporal de 14C biosférico es la que mantiene la promesa de una datación anual de carbono biosférico reciente. 14C puede medirse mediante espectrometría de masas con acelerador (AMS), con 15 resultados facilitados en unidades de “fracción de carbono moderno” (fM). fM se define por el National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRM) 4990B y 4990C. Tal como se usa en el presente documento, la “fracción de carbono moderno” o “fM” tiene el mismo significado que el definido por el National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRM) 4990B y 4990C, conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 20 0,95 veces la razón de isótopos 14C/12C de HOxI (con referencia a 1950 DC). Esto es aproximadamente equivalente a la madera previa a la revolución industrial corregida para la degradación. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1.

Se da a conocer en el presente documento un hidrocarburo o biocombustible que puede tener una fM de 14C de al menos 1. Por ejemplo, el hidrocarburo o biocombustible puede tener una fM de 14C de al menos 1,01, una fM de 14C 25 de 1 a 1,5, una fM de 14C de 1,04 a 1,18 o una fM de 14C de 1,111 a 1,124.

Otra medición de 14C se conoce como el porcentaje de carbono moderno, pMC. Para un arqueólogo o geólogo que usa dataciones de 14C, 1950 DC es igual a “cero años de edad”. Esto también representa 100 pMC. El “carbono de bombas” en la atmósfera alcanzó casi el doble del nivel normal en 1963 en el máximo de las armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores que son superiores 30 a 100 pMC para plantas y animales vivos desde 1950 DC. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor actual próximo a 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como maíz, tendrá una firma de 14C próxima a 107,5 pMC. Los compuestos a base de petróleo tendrán un valor de pMC de cero. Combinar carbono fósil con carbono actual dará como resultado una dilución del contenido de pMC actual. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido de 14C de los materiales de biomasa actuales y 0 pMC representa el contenido 35 de 14C de los productos a base de petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componentes. Por ejemplo, un material derivado al 100% de semillas de soja actuales dará una firma de radiocarbono próxima a 107,5 pMC. Si ese material se diluyó al 50% con productos a base de petróleo, dará una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC.

Un contenido de carbono de base biológica se deriva asignando el 100% igual a 107,5 pMC y el 0% igual a 0 pMC. 40 Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC dará un contenido de carbono de base biológica equivalente del 93%. Este valor se denomina el resultado de carbono de base biológica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originaron o bien de material biológico actual o bien de material a base de petróleo.

Se da a conocer en el presente documento un hidrocarburo o biocombustible que puede tener un pMC de al menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100. Se da a conocer además en el presente documento un 45 hidrocarburo o combustible que tiene un pMC de entre 50 y 100, 60 y 100, 70 y 100, 80 y 100, 85 y 100 y 87 y 98, 90 y 95. Se da a conocer además en el presente documento un hidrocarburo o biocombustible con un pMC de 90, 91, 92, 93, 94 ó 94,2.

El hidrocarburo puede ser una olefina. La olefina puede ser monoinsaturada o poliinsaturada (por ejemplo, diinsaturada, triinsaturada, etc.). La olefina puede tener una longitud de cadena de carbono de entre 10 y 40 50 carbonos. Por ejemplo, la olefina puede tener una longitud de cadena de carbono de entre 15 y 35, 17 y 34, 18 y 33, 19 y 33 carbonos, entre 27 y 33 hidrocarburos, entre 29 y 31 hidrocarburos, o 27, 28, 29, 30, 31, 32 ó 33 hidrocarburos.El hidrocarburo puede ser un hidrocarburo de cadena lineal o un hidrocarburo de cadena ramificada. El hidrocarburo puede comprender un resto cíclico.

Se da a conocer en el presente documento un biocombustible que comprende los hidrocarburos dados a conocer en 55 el presente documento. El biocombustible puede ser gasolina, biodiesel o combustible de motores de reacción. El biocombustible puede derivarse de una fuente de carbono. Tal como se usa en el presente documento, la frase “fuente de carbono” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para el crecimiento de células eucariotas sencillas o procariotas. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas,

incluyendo, pero sin limitarse a polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Estos incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa y galactosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos tales como xilosa y arabinosa; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico, tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, 5 tales como succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa.

Una fuente de carbono preferida es biomasa. Tal como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a una fuente de carbono derivada de material biológico. La biomasa puede convertirse en un biocombustible. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es materia vegetal. Por ejemplo, puede usarse maíz, caña de azúcar o 10 pasto varilla como biomasa. Otro ejemplo no limitativo de biomasa es materia animal, por ejemplo estiércol de vaca. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, agricultura, silvicultura y del hogar. Ejemplos de tales productos de desecho que pueden usarse como biomasa son desechos de fermentación, paja, leña, aguas residuales, basura y sobras de alimentos. La biomasa también incluye fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos). Otra fuente de carbono preferida es glucosa. 15 Preferiblemente, la fuente de carbono es una fuente de energía renovable. La fuente de energía renovable puede ser una biomasa.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero no deben interpretarse como limitativos en ningún modo de su alcance.

EJEMPLO 1 20

Este ejemplo describe materiales y métodos usados para llevar a cabo los ejemplos dentro de esta patente. Aunque se describen métodos particulares, un experto habitual en la técnica comprenderá que también pueden usarse otros métodos similares. En general, se usaron prácticas de laboratorio convencionales, a menos que se estipule otra cosa. Por ejemplo, se usaron prácticas de laboratorio convencionales para: clonación; manipulación y secuenciación de ácidos nucleicos; purificación y análisis de proteínas; y otras técnicas de bioquímica y biología molecular. Tales 25 técnicas se explican en detalle en manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al., citado anteriormente; y Ausubel et al., citado anteriormente.

Secuencias genómicas: La secuencia genómica completa de Stenotrophomonas maltophilia está disponible para el público para dos cepas diferentes. La secuencia genómica completa de S. maltophilia R551-3 puede encontrarse en http://genome.ornl.gov/microbial/smal/ (último acceso el 16 de mayo de 2007). La secuencia genómica completa de 30 la cepa de S. maltophilia K279a puede encontrarse en http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_maltophilia/ (último acceso del 16 de mayo de 2007). Las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas descritas en el presente documento se encuentran en ambos genomas secuenciados y se confirmaron experimentalmente en la cepa de S. maltophilia de ATCC 17679. Además, algunas de las actividades proteicas se confirmaron en E. coli, B. subtilis, B. megaterium y S. cerevisiae usando secuencias de ácido nucleico y secuencias de ácido nucleico con 35 codones optimizados tal como se describe en el presente documento.

Cepas microbianas: Las cepas microbianas usadas en el presente documento fueron las siguientes:

S. maltophilia (números de cepas de la ATCC: 17674, 17679, 17445, 17666);

S. maltophilia ATCC 17679oleA

S. maltophilia ATCC 17679 oleC 40

S. maltophilia ATCC 17679 oleD

E. coli T7 Express lysY/lq (New England Biolabs, Ipswich, MA 01938-2723)

E. coli C41(DE3) (Lucigen Corporation, Middleton, WI 53562)

E. coli C41(DE3) fadE (la cepa de E. coli C41(DE3) de Lucigen Corporation, Middleton, WI 53562 con una deleción del gen fadE EC 1.3.99.3, una acil-CoA deshidrogenasa, Klein. K. et al., Eur. J. Biochem. II I 19: 442-450 (1971)). 45

E. coli C41(DE3) fadE; pET-21b(+)_OleA, pCOLADuet-1_OleC, pCDFDuet-1_OleD

E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleA

E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleB

E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleD

E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD 50

E. coli MG1655 fadE (la E. coli MG1655 con una deleción del gen fadE)

E. coli MG1655 fadE, fadD (+) (la cepa de E. coli MG1655 con una deleción del gen fadE y una secuencia de promotor T5 en el sentido de 5’ de fadD)

Saccharomyces cerevisiae Hansen, teleomorfo BY4741 (ATCC 201388)

S. cerevisiae BY4741; pESC-HIS_OleA 5

Bacillus megaterium WH320 (cepa de Mo Bi Tec, Alemania)

B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB

B. megaterium WH320; pWH1520

Bacillus subtilis IHA01 lacA::spec leuB8 metB5 r(-)m(+) Sp (cepa de Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH número de cepa BGSC lA785) 10

B. subtilis IHA01, pHT01_OleA

Arthrobacter aurescens TC1 (cepa de ATCC BAA-1386)

Marcadores de resistencia: En los ejemplos descritos en el presente documento, se usaron los marcadores de resistencia AmpR, ampicilina/carbenicilina (100 g/ml); KanR, kanamicina (30 g/ml); CamR, cloramfenicol (34 g/ml); SmR, estreptomicina/espectinomicina (50 g/ml); y tetraciclina (E. coli, B. megaterium 15 g/ml, S. 15 maltophilia 50 g/ml).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Se usó PCR para amplificar las secuencias de ácido nucleico especificadas a partir de ADN para crear muchos de los constructos de expresión descritos en el presente documento. Los cebadores usados para las reacciones de PCR descritas en el presente documento se enumeran en la tabla 14. Los plásmidos se enumeran en la tabla 15. 20

imagen1

TABLA 15

Vectores: Fuente

pET-21b(+): Expresión de T7 Novagen Brand

pET-21d(+) pCOLADuet-1 pCDFDuet-1 pETDuet-1 pACYCDuet-1: Vectores EMD Chemicals, Inc. Gibbstown, NJ 08027

pJ201: Estructura principal de vector usada por DNA2.0 DNA2.0 Menlo Park, CA

pEX18-Tc: Vector suicida para S. maltophilia Hoang et al. 1998

pESC-HIS: Vector de expresión usado en S. cerevisiae Stratagene, La Jolla, CA

pTrcHis2A: Vector de expresión Invitrogen, Carlsbad, CA

pCL1920 (NCCB#3176): Plásmido de bajo número de copias The Netherlands Culture Collection of Bacteria, Utrecht, Países bajos

pCL1920pTrc: Plásmido de bajo número de copias para expresión Descrito en el presente documento

pLoxCat2 pJW168: Palmeros et al. 2000

pKD46: Datsenko y Wanner 2000

pMAL-c2X: NEB, Ipswich, MA

pWH1520: Vector de expresión usado en B. megaterium Mo Bi Tec, Alemania

pHT01: Vector de expresión usado en B. subtilis Mo Bi Tec, Alemania

Constructos de expresión: Vector Inserto

OleA de S. maltophilia: pET-21b(+)_OleA pET-21d(+)_OleA pCOLADuet-1_OleA pCDFDuet-1_OleA pETDuet-1_OleA pACYCDuet-1_OleA: ATCC17679: pET-21b(+), o pCOLADuet-1 cortado con Ndel y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB118 y LB119 cortado con Ndel y XhoI Descrito en el presente documento

OleC de S. maltophilia: pET-21b(+)_OleC pET-21d(+)_OleC pCOLADuet-1_OleC pCDFDuet-1_OleC pETDuet-1_OleC pACYDuet-1_OleC: vectores anteriores cortados con Ndel y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB155 y LB159 cortado con Ndel y XhoI Descrito en el presente documento

OleD de S. maltophilia: pET-21b(+)_OleD pET-21d(+)_OleD pCOLADuet-1_OleD pCDFDuet-1_OleD pETDuet-1_OleD pACYDuet-1_OleD: vectores anteriores cortados con Ndel y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB157 y LB158 cortado con Ndel y XhoI Descrito en el presente documento

OleB de S. maltophilia: pET-21b(+)_OleB pET-21d(+)_OleB pCOLADuet-1_OleB pCDFDuet-1_OleB pETDuet-1_OleB pACYDuet-1_OleB: vectores anteriores cortados con Ndel y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB151 y LB152 cortado con Ndel y XhoI Descrito en el presente documento

OleA y OleB de S. maltophilia: pET-21b(+)_OleAB pET-21d(+)_OleAB pCOLADuet-1_OleAB pCDFDuet-1_OleAB pETDuet-1_OleAB pACYDuet-1_OleAB: vectores anteriores cortados con Ndel y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB118 y LB152 cortado con Ndel y XhoI Descrito en el presente documento

OleC y OleD de S. maltophilia: pET-21b(+)_OleCD pET-21d(+)_OleCD pCOLADuet-1_OleCD: vectores anteriores cortados con Ndel y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB155 y LB158 cortado con Ndel y XhoI Descrito en el presente documento

pCDFDuet-1_OleCD pETDuet-1_OleCD pACYDuet-1_OleCD

OleA con codones optimizados (CO) para la expresión en E. coli, secuencia de aminoácidos basada en S. maltophilia: pET-21d_OleA(CO) pCOLADuet-1_OleA(CO): pET-21d, o pCOLADuet-1 cortado con Ncol y Hindlll Producto de PCR derivado de los cebadores LF305 y LF306 cortado con Pcil y Hindlll Descrito en el presente documento

OleA Xanthomonas axonopodis pET-21d_OleA(Xan) pCOLADuet-1 OleA(Xan): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll Producto de PCR derivado de los cebadores LF307 y LF308 cortado con Pcil y Hindlll Descrito en el presente documento

OleA Chloroflexus aggregans pET-21d_OleA(Chl) pCOLADuet-1 OleA(Chl): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll Producto de PCR derivado de los cebadores LF314 y LF315 cortado con Pcil y Hindlll Descrito en el presente documento

OleC Chloroflexus aggregans pET-21d_OleC(chl) pCOLADuet-1_OleC(chl): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll fragmento de restricción de ADN sintético cortado con Ncol y Hindlll que codifica para la proteína OleC de Chloroflexus aggregans Descrito en el presente documento

OleC Plesiocystis pacifica pET-21d_OleC(Ple) pCOLADuet-1_OleC(Ple): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll fragmento de restricción de ADN sintético cortado con Ncol y Hindlll que codifica para la proteína OleC de Plesiocystis pacifica Descrito en el presente documento

OleC Xanthomonas axonopodis pET-21d_OleC(Xan) pCOLADuet-1_OleC(Xan): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll fragmento de restricción de ADN sintético cortado con Ncol y Hindlll que codifica para la proteína OleC de Xanthomonas axonopodis Descrito en el presente documento

OleD Chloroflexus aggregans pET-21d_OleD(Chl) pCOLADuet-1_OleD(chl): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll fragmento de restricción de ADN sintético cortado con Ncol y Hindlll que codifica para la proteína OleD de Chloroflexus aggregans

OleD Xanthomonas axonopodis pET-21d_OleD(Xan) pCOLADuet-1_OleD(Xan): vectores anteriores cortados con Ncol y Hindlll fragmento de restricción de ADN sintético cortado con Ncol y Hindlll que codifica para la proteína OleD de Xanthomonas axonopodis Descrito en el presente documento

pCDFDuet-1_FadD y pETDuet-1_FadD: FadD una acil-CoA sintasa de la cepa de E. coli K12 sucepa W3110, n.º de registro de Genbank BAA15609: pCDFDuet-1 o pETDuet-1 cortado con Ncol y Hindlll Producto de PCR de E. coli derivado de los cebadores fadD_F y fadD_R cortado con Ncol y Hindlll Descrito en el presente documento

pETDuet-1_’TesA:: vector pETDuet-1 cortado Producto de PCR de E. Descrito en el presente

gen de ‘TesA (gen de tioesterasa A, n.º de registro de Genbank AAA24664 sin secuencia líder (Cho y Cronan, J. Biol. Chem., 270:4216-9 (1995)) a partir de E. coli: con Ndel y Avrll coli derivado de los cebadores TesA_F y TesA_R cortado con Ndel y Avrll documento

pESC-HIS_OleA: OleA de S. maltophilia: pESC-HIS cortado con Apal y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB217 y LF304 y cortado con Apal y Xhol Descrito en el presente documento

pCL1920pTrc_OleA: OleA de S. maltophilia: pCL1920-pTrc cortado con Ncol y Xhol Producto de PCR derivado de los cebadores LB189 y LF304 cortado con Pcil y Xhol Descrito en el presente documento

pHT01_OleA: OleA de S. maltophilia con codones optimizados para la expresión en E. coli: pHT01 cortado con BamHI y Xbal Producto de PCR derivado de los cebadores LB388 y LB386 cortado con BamHI y Xbal Descrito en el presente documento

Uc FatB1: vector pMAL-c2X Producto de PCR derivado de los cebadores UcFatB1_F y UcFatB1_R Descrito en el presente documento

Cc FatB: vector pETDuet-1 cortado con Ndel y Avrll Producto de PCR derivado de los cebadores CcFatB_F y CcFatB_R cortado con Ndel y Avrll Descrito en el presente documento

ChFatB2: vector pMAL-c2X Producto de PCR derivado de los cebadores ChFatB2_F y ChFatB2_R Descrito en el presente documento

Métodos de clonación: Se usaron procedimientos de clonación de biología molecular convencionales para clonar ADN en los vectores descritos en la tabla 15 (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente). Las enzimas de restricción Aatll, Aflll, Avrll, BamHI, Bglll, HindIII, NcoI, NdeI, NheI, NruI, PciI, ScaI, SfoI, SpeI, Xbal, XhoI, y ZraI se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA 01938).

Protocolo de expresión: Se realizaron diversas escalas de fermentaciones para someter a prueba la expresión o 5 producción de producto. Estos protocolos se describen a continuación y se les hace referencia en cada ejemplo como o bien la fermentación de 5 ml, la fermentación de 25 ml o bien se describe una técnica de fermentación alternativa.

Fermentación de 5 ml: Estas fermentaciones se llevaron a cabo en tubos de ensayo de 15 ml con 5 ml de caldo de Luria Miller (LB) (EMD, Chemicals, Inc., San Diego, CA). Se hicieron crecer los cultivos hasta una DO600 de entre 0,1 10 y 1 y se indujeron con IPTG a una concentración final de 1 mM. Se extrajeron los cultivos en cualquier momento desde las 6 hasta 48 horas tras la inducción dependiendo del experimento. Se incubaron las fermentaciones a 25ºC, 30ºC o 37ºC con agitación.

Fermentación de 25 ml: Se llevaron a cabo estas fermentaciones en frascos de 125 ml con un volumen final de 25 ml de medio. Se prepararon cultivos simiente inoculando 5 ml de medio LB en un tubo de ensayo de 15 ml con 15 células de un raspado de una reserva de congelador. Se prepararon las reservas de congelador añadiendo glicerol hasta una concentración final del 20% en medio LB y almacenando los cultivos a -80ºC. Se incubo la simiente con agitación a 37ºC hasta que la DO600 del cultivo alcanzó entre 0,15 y 0,6. Entonces se usaron los cultivos para inocular la fermentación. Se inocularon 22 ml de medio M9 (Na2HPO4 6 g/l, KH2PO4 3 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 1 g/l, tiamina 1 mg/l, MgSO4 1 mM, CaCl2 0,1 mM) con el 2% de glucosa con 2 ml de medio LB con una densidad celular 20 de 0,15 unidades de DO600. Entonces se incubaron los cultivos con agitación hasta que la DO600 era de entre 0,3 y 0,6 unidades, momento en el que se indujeron los cultivos con IPTG hasta una concentración final de 1 mM. En experimentos en los que se alimentaron ácidos grasos, se añadieron en el mismo punto en el tiempo cuando se indujeron los cultivos. Se extrajeron los cultivos en cualquier momento desde las 2 hasta 48 horas tras la inducción, dependiendo del experimento. Se incubaron las fermentaciones a 25ºC, 30ºC o 37ºC con agitación. 25

Protocolo de lisado celular: Se usaron protocolos de lisis celular convencionales. En resumen, se rompieron las

células mediante sonicación y/o mediante el uso del kit de reactivo de nucleasa Benzonase® más BugBuster® (n.º de catálogo 70750 Novagen de EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA). Por ejemplo, se centrifugó un cultivo de 10 ml a 3500 rpm durante 15 minutos (centrífuga Allegra X-15R con rotor SX-4750A, Beckman Coulter, Fullerton, CA), y se resuspendió el sedimento resultante en 2 ml de BugBuster® y 2 l de nucleasa Benzonase®.

Protocolo de purificación de proteínas: Se purificaron proteínas etiquetadas con His usando procedimientos 5 convencionales. Se purificaron las proteínas según las instrucciones encontradas en el protocolo de usuario TB054 Rev. F0106 (Novagen de EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA).

Métodos de extracción de hidrocarburos:

Método de extracción 1: Extracciones de sedimentos de 5 ml

Se extrajeron compuestos orgánicos (olefinas, cetonas alifáticas e hidrocarburos) de sedimentos de células 10 bacterianas usando un protocolo de extracción con metanol:hexano. En resumen, se centrifugaron 5 ml de caldo de cultivo/fermentación en un tubo de ensayo de vidrio a 3500 rpm durante 15 minutos (centrífuga Allegra X-15R con rotor SX-4750A, Beckman Coulter, Fullerton, CA), se decantó el sobrenadante, se resuspendió el sedimento resultante en 100 l de agua destilada estéril, y se mezcló en una mezcladora de vórtex hasta que era homogénea. A continuación, se añadió 1 ml de metanol y se mezcló la muestra usando una mezcladora de vórtex. Entonces se 15 sonicó la muestra entre 15 minutos y 1,5 horas en un baño de agua de sonicación (Bransonic®, Tabletop Ultrasonic Cleaners, modelo 5510, Danbury, CT). Tras la sonicación, se añadieron 4 ml de hexano, y se mezcló la muestra en una mezcladora de vórtex. Entonces se centrifugaron las muestras a 3500 rpm durante 15 minutos (centrífuga Allegra X-15R con rotor SX-4750A, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Se retiró la fase superior (fase de hexano) y se añadió a un tubo de vidrio limpio. Entonces se secó la muestra a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, 20 Eppendorf, Westbury, NY) durante aproximadamente 30 minutos hasta que no estaba presente esencialmente disolvente. Entonces se resuspendió la muestra en 100 l de acetato de etilo o cloroformo. A continuación, se analizó 1 l de la muestra en la CG/EM según los métodos de detección descritos más adelante.

Método de extracción 2: Método para ensayos in vitro

Para ensayos in vitro, se extrajeron compuestos orgánicos (olefinas, cetonas alifáticas e hidrocarburos) de muestras 25 in vitro usando un protocolo de extracción de acetato de etilo/ácido acético al 1%. Se extrajeron muestras de ensayo in vitro mediante la adición de 500 l de acetato de etilo que contenía ácido acético al 1%. Se mezcló la muestra en una mezcladora de vórtex, seguido por centrifugación a 3500 rpm durante 5 minutos para separar las fases acuosa y orgánica (centrífuga 5424 con rotor FA-45-24-11, Eppendorf, Westbury, NY). Se transfirió la fase superior (fase de acetato de etilo) a un tubo limpio. Entonces se secó la muestra a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, 30 Eppendorf, Westbury, NY) durante aproximadamente 30 minutos hasta que no estaba presente esencialmente disolvente. Se resuspendió la muestra en 50 l de acetato de etilo y se analizó mediante CG/EM y/o CG/FID. Se analizaron entre 1 y 10 l en la CG/EM o CG/FID para determinar el contenido de hidrocarburos según los métodos de detección descritos más adelante.

Método de extracción 3: Extracciones de cultivo de células completas a pequeña escala 35

Se añadieron entre 0,5 y 1 ml del cultivo de fermentación a un tubo Eppendorf de 1,7 ml. Entonces se extrajo este cultivo con entre 0,25 y 0,5 ml de acetato de etilo que contenía la adición conocida de hidrocarburos apropiada (por ejemplo, cis-9-tricoseno 10 mg/l o hexacosano 10 mg/l para olefinas, 14-heptacosanona 10 mg/l para cetonas alifáticas, etc.). Se mezcló la mezcla de cultivo-acetato de etilo en una mezcladora de vórtex a alta velocidad durante 10 minutos. Entonces se centrifugó la muestra a 13.000 rpm en una centrífuga Eppendorf durante 5 minutos 40 (centrífuga 5424 con rotor FA-45-24-11, Eppendorf, Westbury, NY). Se retiró la fase orgánica (fase superior) para su análisis usando los métodos de detección de CG/EM o CG/FID descritos más adelante.

Métodos de detección de hidrocarburos:

Método de detección 1: CG/EM de 20 minutos

Para la detección por CG/EM, se observaron hidrocarburos y cetonas alifáticas y se verificaron usando el siguiente 45 protocolo:

Tiempo de ejecución: 20 minutos

Columna: HP-5-MS (5% de difenilsiloxano, 95% de dimetilsiloxano) n.º de parte 19091S-433E, longitud: (metros) 30, diámetro interno: orificio estrecho de (mm) 0,25, película: (M) 0,25

Intervalo de barrido de MSD: 50 - 800 M/Z 50

Inyector: entrada Agilent 6850 de 1 l

Entrada: 300ºC sin desdoblamiento

Gas portador: Helio

Temp. del horno: 5 minutos mantenida a 100ºC; 25ºC/minuto hasta 320ºC; 5 minutos mantenida a 320ºC

Det.: Agilent 5975B VL MSD

Temp. de det.: 300ºC

Método de detección 2: CG/EM de 5 minutos 5

Para la detección por CG/EM, se detectaron hidrocarburos y cetonas alifáticas y se verificaron usando el siguiente protocolo:

Tiempo de ejecución: 4,9 minutos

Columna: HP-5-MS (5% de difenilsiloxano, 95% de dimetilsiloxano) n.º de parte 19091S-433E, longitud: (metros) 30, diámetro interno: orificio estrecho de (mm) 0,25, película: (M) 0,25 10

Intervalo de barrido de MSD: 50 - 140 M/Z

Inyector: entrada Agilent 6850 de 1 l

Entrada: 300ºC sin desdoblamiento

Gas portador: Helio

Temp. del horno: no mantenida a 225ºC; 25ºC/minuto hasta 320ºC; 1,1 minutos mantenida a 320ºC 15

Det: Agilent 5975B VL MSD

Temp. de det.: 300ºC

Método de detección 3: CG/FID

Para la detección por CG/FID, se detectaron hidrocarburos y cetonas alifáticas y se verificaron usando el siguiente protocolo: 20

Tiempo de ejecución: de 2,75 a 4 minutos dependiendo de la longitud de los hidrocarburos que interesa observar. Se usaron tiempos más largos para hidrocarburos más largos.

Columna: Thermo Electron Corporation: (n.º de parte UFMC 002 000 000 00): Ph5, grosor de película 0,4 mm, longitud: (metros) 5, diámetro interno: 0,1 mm, volumen de muestra inyectado: de 1 a 10 l dependiendo del experimento 25

Entrada: sin desdoblamiento

Gas portador: Helio

Temp. del horno: 1 min mantenida a 100ºC; 200ºC/min a 350ºC; 0,50 min mantenida a 350ºC

Det.: detector Thermo FID

Método de detección 4: CG/EM de 5,8 minutos 30

Para la detección por CG/EM, se observaron hidrocarburos y cetonas alifáticas y se verificaron usando el siguiente protocolo:

Tiempo de ejecución: 5,83 minutos

Columna: DB-1HT (100% de dimetilpolisiloxano) n.º de parte 122-1111 (Agilent Technologies, Inc), longitud: (metros) 15, diámetro interno: orificio estrecho de (mm) 0,25, película: (M) 0,1 35

Intervalo de barrido de MSD: 50 - 550 m/z

Inyector: entrada Agilent 6890 N de 1 l

Entrada: 300ºC sin desdoblamiento

Gas portador: Helio (velocidad de flujo: 1,3 ml/min)

Temp. del horno: 0,3 minuto mantenida a 160ºC; 30ºC/minuto a 320ºC; 0,2 minuto mantenida a 320ºC 40

Det: Agilent 5975B XL EI/CI MSD

Temp. de det.: 250ºC

Construcción de plásmidos: Se construyeron varios plásmidos para la expresión de oleA, oleB, oleC y oleD en cualquier célula de interés, incluyendo E. coli, B. subtilis, B. megaterium y S. cerevisiae. Estos constructos pueden dividirse en plásmidos que contienen genes individuales y plásmidos que contienen combinaciones de genes en 5 operones.

Plásmidos que contienen genes individuales oleA, oleB, oleC y oleD: Se derivaron las secuencias génicas de oleA, oleB, oleC y oleD o bien mediante amplificación por PCR a partir de ADN genómico de una cepa huésped que contiene estas secuencias génicas o bien mediante el diseño y la producción de genes sintéticos con un contrato (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA 94025). En resumen, se amplificaron oleA, oleB, oleC y oleD a partir de ADN 10 genómico aislado de S. maltophilia ATCC 17679 tal como sigue: se amplificó oleA (SEQ ID NO: 1) usando los cebadores LB118 (SEQ ID NO: 29) y LB119 (SEQ ID NO: 30); se amplificó oleB (SEQ ID NO: 9) usando los cebadores LB151 (SEQ ID NO: 35) y LB152 (SEQ ID NO: 36); se amplificó oleC (SEQ ID NO: 5) usando los cebadores LB155 (SEQ ID NO: 31) y LB159 (SEQ ID NO: 32); se amplificó oleD (SEQ ID NO: 7) usando los cebadores LB157 (SEQ ID NO: 33) y LB158 (SEQ ID NO: 34). Se insertaron los productos de amplificación de oleA 15 (SEQ ID NO: 1), oleB (SEQ ID NO: 9), oleC (SEQ ID NO: 5) y oleD (SEQ ID NO: 7) en pET-21b(+), pCDFDuet-1, pCOLADuet-1, pETDuet-1 o pACYCDuet-1 usando las enzimas de restricción Ndel y Xhol. Se seleccionaron los clones de plásmido correcto a partir de los transformantes resultantes y se confirmaron mediante digestión y secuenciación de ADN. Pueden usarse métodos de clonación similares para insertar oleA (SEQ ID NO: 1), oleB (SEQ ID NO: 9), oleC (SEQ ID NO: 5) y oleD (SEQ ID NO: 7) en cualquier vector de interés. 20

Se construyó el plásmido pCL1920pTrcOleA clonando la secuencia de nucleótidos de oleA a partir del plásmido pET21b(+)_OleA que contiene la secuencia de ADN de oleA nativa de S. maltophilia ATCC17679 en el vector de expresión bacteriano pCL1920pTrc usando técnicas de clonación convencionales tal como se describió anteriormente. Se construyó la estructura principal de vector pCL1920pTrc (SEQ ID NO: 24) en LS9, Inc. En resumen, se amplificó un producto de PCR que contenía la secuencia de laclq, el promotor pTrc, y un sitio de 25 clonación múltiple usando LF302 (SEQ ID NO: 76) y LF303 (SEQ ID NO: 77) a partir del plásmido pTrcHis2A (Invitrogen, Carlsbad, CA) ADN. Se digirió el producto de PCR resultante con Aflll y Zral y se clonó mediante ligamiento de ADN convencional en el plásmido pCL1920 (NCCBNr3176 Nuecl. Acids Res., 18: 4631, (1990)) cortado con Aflll y Sfol. Los clones resultantes contenían el inserto en la orientación incorrecta y el sitio de restricción Aflll no se conservó. Se designó el plásmido resultante pCL1920pTrc (SEQ ID NO: 24). 30

Para construir el plásmido pCL1920pTrcOleA, se amplificó por PCR oleA (SEQ ID NO: 1) usando los cebadores LB189 (SEQ ID NO: 45) y LF304 (SEQ ID NO: 44). Se clonó el producto de amplificación de OleA en pCL1920pTrc usando las enzimas de restricción Pcil y Xhol para crear el plásmido pCL1920pTrcOleA.

Para construir el plásmido pHT01_OleA para la expresión de oleA en B. subtilis, se amplificó por PCR oleA (SEQ ID NO: 3) usando los cebadores LB388 (SEQ ID NO: 491) y LB386 (SEQ ID NO: 490) a partir del molde de ADN 35 pCL1920pTrcOleCDAB, que contiene la secuencia de nucleótidos basada en la secuencia de aminoácidos de S. maltophilia, cuyos codones se han optimizado para la expresión en E. coli. Se clonó el producto de amplificación de OleA en pHT01 usando las enzimas de restricción BamHI y Xbal para crear el plásmido pHT01_OleA.

Plásmidos que contienen el operón de olefina sintasa:

Se construyeron múltiples plásmidos que contenían los cuatro genes: oleA, oleB, oleC y oleD en diversos órdenes. 40 Todas las fermentaciones sometidas a prueba con cepas que expresan los genes a partir de estos operones produjeron olefinas. El orden de los genes en un operón sintético no influye en la capacidad del organismo para producir hidrocarburos. Muchos de estos plásmidos pueden usarse de manera intercambiable en los ejemplos descritos a continuación. Los plásmidos reales usados en cada ejemplo se describen en el ejemplo pertinente.

En plásmidos que contienen genes ole basados en las secuencias de aminoácidos de S. maltophilia, los plásmidos 45 se nombraron dependiendo del orden de los genes en la secuencia de ADN, por ejemplo, con OleA, OleB, OleC, OleD, OleAB, OleBC, OleCD, OleABCD, etc.

Cuando el gen ole es de un genoma de otro organismo, el nombre del gen va seguido por paréntesis con las primeras tres letras del organismo del que se derivó el gen. Por ejemplo, OleA(Xan) indica la secuencia génica que codifica para la secuencia de aminoácidos de OleA encontrada en la secuencia del genoma de Xanthomonas 50 axonopodis.

Se creó un operón sintético que contenía los genes oleA, oleB, oleC y oleD que codifican para las secuencias de proteínas basadas en S. maltophilia. Se optimizaron los codones de los genes ole para la expresión en E. coli mediante modificación del programa en DNA2.0, Inc. (Menlo Park, CA 94025).

Se usó la secuencia génica sintetizada (SEQ ID NO: 23) para construir el plásmido pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD. 55 Se subclonó el operón de olefina sintético (SEQ ID NO: 23) proporcionado por DNA2.0 en el plásmido pCL1920pTrc.

Se aisló el fragmento de operón digiriendo con Pcil y Hindlll, y se ligó en el plásmido pCL1920pTrc cortado con Ncol y Hindlll. Se designó el clon resultante pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD (SEQ ID NO: 78).

Se construyó otro plásmido, pCL1920pTrcOleCDAB, que contenía los cuatro genes de olefina sintasa (oleA, oleB, oleC y oleD) en un orden diferente y se usó en algunos de los siguientes ejemplos. Se construyó este plásmido tal como sigue: en primer lugar, se construyó el plásmido pCL1920pTrcOleCD clonando un producto de PCR que 5 contenía la secuencia de lacIq en la estructura principal de vector digerida con Nhel y Spel de pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD. El plásmido resultante contiene la secuencia de laclq en el sentido de 5’ de los genes oleC y oleD. Se amplificó el producto de PCR que contiene el represor lac usando LB270 (SEQ ID NO: 79) y LB271 (SEQ ID NO: 80) de pCL1920pTrc, se prepararon el producto de PCR y el vector para clonación mediante digestión con Nhel y Spel. 10

En segundo lugar, se construyó entonces el plásmido de operón, pCL1920pTrcOleCDAB, clonando un fragmento de PCR que contenía oleA y oleB en el sentido de 3’ de oleC y oleD en el plásmido pCL1920pTrcOleCD. Se amplificó el producto de PCR de oleAB usando LB272 (SEQ ID NO: 81) y LB275 (SEQ ID NO: 82) a partir de pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD. Se digirió el producto de PCR resultante con BamHI y Bglll y se clonó mediante ligamiento de ADN convencional en el pCL1920pTrcOleCD digerido con BamHI y Bglll y tratado con fosfatasa 15 Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, MA 01938). El plásmido resultante se designó pCL1920pTrcOleCDAB. Pueden usarse métodos similares para insertar un operón de olefina sintético en cualquier vector de interés.

Para construir el plásmido pWH1520_OleCDAB para la expresión en B. megaterium, se amplificaron por PCR oleC, oleD, oleA y oleB usando los cebadores LB402 (SEQ ID NO: 488) y LB387 (SEQ ID NO: 489) a partir del molde de ADN pCL1920pTrcOleCDAB que contiene la secuencia de nucleótidos basada en la secuencia de aminoácidos de 20 S. maltophilia cuyos codones se han optimizado para la expresión en E. coli. El producto de PCR que contiene oleC, oleD, oleA y oleB se digirió con Spel y Bglll y se clonó en pWH1520 usando las enzimas de restricción Spel y BamHI para crear el plásmido pWH1520_OleCDAB.

Plásmidos que contienen genes de tioesterasa: Se construyeron múltiples plásmidos que contenían la región codificante para diferentes tioesterasas, incluyendo (Uc FatB1, Ce FatB1, Ch FatB2 y 'tesA. Se derivó la secuencia 25 génica para 'tesA de E. coli mediante amplificación por PCR a partir de ADN genómico de E. coli MG1655. Las secuencias génicas para FatB1 de Umbellularia californica (Uc FatB1), FatB1 de Cinnamomum camphora (Cc FatB1) y FatB2 de Cuphea hookeriana (Ch FatB2) se derivaron mediante diseño y producción de genes sintéticos con un contrato (Codon Devices, Cambridge, MA 02139). En resumen, se amplificó 'tesA (SEQ ID NO: 25) usando los cebadores TesA_F (SEQ ID NO: 50) y TesA_R (SEQ ID NO: 51). Volvieron a clonarse los genes sintéticos en 30 plásmidos de expresión mediante amplificación por PCR y protocolos de digestión y ligamiento convencionales. Se amplificó Cc FatB1 (SEQ ID NO: 26) usando los cebadores CcFatB_F (SEQ ID NO: 52) y CcFatB_R (SEQ ID NO: 53). Se amplificó Ch FatB2 (SEQ ID NO: 27) usando los cebadores ChFatB2_F (SEQ ID NO: 54) y ChFatB2_R (SEQ ID NO: 55). Se amplificó Uc FatB1 (SEQ ID NO: 28) usando los cebadores UcFatB1_F (SEQ ID NO: 56) y UcFatB1_R (SEQ ID NO: 57). Se clonaron los productos de amplificación de 'tesA (SEQ ID NO: 25) y Cc FatB1 35 (SEQ ID NO: 26) en pETDuet-1 usando las enzimas de restricción Ndel y Avrll. Se clonaron los productos de amplificación de Ch FatB2 (SEQ ID NO: 27) y Uc FatB1 (SEQ ID NO: 28) en pMAL-c2X (NEB, Ipswich, MA) en marco con el gen malE usando las enzimas de restricción Xbal y Hindlll.

Plásmidos que contienen la acil-CoA sintasa: Se expresó el gen fadD a partir de varios constructos diferentes, incluyendo dos vectores distintos, pETDuet-1 y pACYCpTrc, así como a partir de un promotor constitutivo integrado 40 directamente en la cepa huésped de E. coli. Estos constructos se describen a continuación.

pETDuet-1_fadD: Se clonó el gen fadD que codifica para acil-CoA sintasa a partir de E. coli en un vector pETDuet-1 digerido con NcoI/Hindlll. La secuencia de ácido nucleico de fadD (SEQ ID NO: 492) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de E. coli C41(DE3) usando los cebadores fadD_F (SEQ ID NO: 46) y fadD_R (SEQ ID NO: 47). Se clonó el producto de amplificación de fadD en pETDuet-1 usando las enzimas de restricción Ncol y Hindlll para crear 45 pETDuet-1_fadD.

pACYCpTrcfadD: Para construir pACYCpTrcfadD, se construyó en primer lugar el plásmido de vector pACYCpTrc. Las regiones de promotor y terminador lacIq y pTrc se amplificaron por PCR usando los cebadores pTrc_F (SEQ ID NO: 493) y pTrc_R (SEQ ID NO: 494) a partir de pTrcHis2A (lnvitrogen, Calrsbad, CA). Se digirió entonces el producto de PCR con Aatll y Nrul. Entonces se clonó el producto de PCR en pACYC177 digerido con Aatll y Scal. La 50 secuencia de ácido nucleico de fadD se amplificó por PCR usando los cebadores fadD_F (SEQ ID NO: 46) y fadD_R (SEQ ID NO: 47) a partir del ADN genómico de E. coli C41(DE3) y se clonó en pACYCpTrc medinate digestión con Ncol y EcoRI para crear el plásmido pACYCpTrcFadD.

Expresión constitutiva de acil-CoA sintasa

Se expresó de manera constitutiva FadD mediante sustitución de la región flanqueante en 5’ en el sentido de 5’ del 55 gen fadD (SEQ ID NO: 495) con una secuencia de ADN sintético que contiene la secuencia de promotor T5 (SEQ ID NO: 496) usando recombinación homóloga (intercambio alélico) seguido por eliminación del marcador de resistencia antimicrobiana Cre lox (véanse, por ejemplo, Valle, Fernando y Noemí Flores, Overexpression of Chromosomal

Genes in Escherichia coli. vol. 267, Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols. Totowa: Humana Press, 2004 y Palmeros et al., Gene, 247: 255-64 (2000) para protocolos detallados). En resumen, se usaron los cebadores LB284 (SEQ ID NO: 83) y LB285 (SEQ ID NO: 84) para amplificar por PCR el casete loxPcat a partir de pLoxCat2 (SEQ ID NO: 89; n.º de registro de Genebank AJ401047). Entonces se transformó el producto de amplificación en MG1655 fadE que contenía el plásmido pKD46 (n.º de registro de Genebank AY048746). Tras la selección para 5 detectar la integración del casete loxPcat, se curó la cepa de pKD46, seguido por la eliminación de la resistencia a cloramfenicol usando el plásmido pJW168 (Palmeros et al., Gene, 247: 255-64 (2000)). Tras la confirmación del reemplazo del promotor de fadD por el promotor de T5, se curó la cepa de pJW168. La cepa resultante es E. coli MG1655 fadE, fadD(+).

EJEMPLO 2 10

Este ejemplo demuestra que la expresión de OleA, OleC y OleD en bacterias da como resultado la producción de olefinas.

Se amplificaron las secuencias de ácido nucleico de oleA, oleC y oleD de S. maltophilia usando PCR. Se insertaron estas secuencias en vectores de expresión bacteriana usando técnicas de clonación convencionales, tal como se describe en el ejemplo 1. Se usaron entonces los plásmidos que contenían oleA, oleC y oleD para transformar E. coli 15 C41(DE3) fadE. La cepa bacteriana resultante con el genotipo E. coli C41(DE3) fadE; pET-21b(+)_OleA, pCOLADuet-1_OleC, pCDFDuet-1_OleD se sometió a prueba usando el protocolo de fermentación de 5 ml y se extrajo usando el método de extracción 1. Entonces se analizó el extracto mediante CG/EM usando el método de detección 1, tal como se describe en el ejemplo 1, para la detección de hidrocarburos (por ejemplo, olefinas) y cetonas alifáticas. Los hidrocarburos observados mediante CG/EM eran olefinas mono-, di- y triinsaturadas que 20 oscilaban en la longitud de la cadena de carbono entre C27 y C31 (véanse las figuras 1 y 2A-J). Esto demostró que la expresión de oleA, oleC y oleD en E. coli daba como resultado la producción de olefinas. Pueden usarse métodos similares para expresar oleA, oleC y oleD en cualquier célula de interés. Además, pueden usarse métodos similares para analizar la producción de cetonas alifáticas o hidrocarburos.

Para demostrar que la expresión de oleA, oleB, oleC y oleD conduce a la producción de hidrocarburos en una amplia 25 gama de bacterias, se preparó un plásmido pWH1520_OleCDAB para la expresión de oleA, oleB, oleC y oleD en Bacillus megaterium (véase el ejemplo 1). Se tranformaron protoplastos preparados previamente de B. megaterium WH320 (de Mo Bi Tec, Alemania) con pWH1520_OleCDAB para crear la cepa B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB. Se transformaron los protoplastos preparados previamente de B. megaterium WH320 (de Mo Bi Tec, Alemania) con pWH1520 para preparar B. megaterium WH320; pWH1520 va a usarse como control de 30 vector vacío.

Las secuencias de ácido nucleico se amplificaron por PCR usando un plásmido que contiene las secuencias con codones optimizados para E. coli de oleC, oleD, oleA y oleB de S. maltophilia. Se insertaron estas secuencias en vectores de expresión bacteriana usando técnicas de clonación convencionales para E. coli (véase el ejemplo 1). Se usaron entonces el plásmido que contenía oleA, oleB, oleC y oleD (pWH1520_OleCDAB) y un plásmido de control 35 de vector vacío (pWH1520) para transformar B. megaterium WH320.

Se transformaron protoplastos de B. megaterium WH320 (Mo Bi Tec, Alemania) con los plásmidos mencionados anteriormente usando el protocolo proporcionado con los protoplastos (véase, por ejemplo, el manual del sistema de expresión de proteínas en Bacillus megaterium de 2007), que es una modificación del método de Puyet et al., FEMS Microbiol. Lett., 40: 1-5. (1987). 40

Se sometieron a prueba las cepas bacterianas resultantes con el genotipo B. megaterium WH320; pWH1520_OleCDAB y B. megaterium WH320; pWH1520 usando el protocolo de fermentación de 5 ml (se usó tetraciclina 15 mg/l para seleccionar células transformadas con el plásmido) que se modificó para usar xilosa al 0,5% para inducir los cultivos en lugar de IPTG. El método de extracción usado fue el método de extracción 1.

Se realizó el análisis para determinar la presencia de hidrocarburos mediante análisis por CG/EM usando el método 45 de detección 4 tal como se describe en el ejemplo 1. Los datos de CG/EM fueron el ión extraído para distintos iones parentales 350, 364, 378, 392 y 406, que muestran la producción de olefinas monoinsaturadas que contenían 25, 26, 27, 28 y 29 carbonos, respectivamente (véanse las figuras 17A-J).

Estos compuestos se eluyen ligeramente más pronto que la olefina de cadena lineal del mismo número de carbonos analizada en las mismas condiciones. Esto sugiere que B. megaterium producía olefinas de cadena ramificada. 50 Debido a que B. megaterium producía de manera natural sustratos de acilo graso de cadena ramificada, es probable que las olefinas observadas sean olefinas de cadena ramificada. No se detectaron hidrocarburos en los extractos de control a partir de B. megaterium WH320; pWH1520.

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que pueden modificarse por ingeniería genética una variedad de bacterias para expresar oleA, oleB, oleC y oleD y producir hidrocarburos. Además, este 55 ejemplo demuestra que pueden modificarse por ingeniería genética bacterias Gram-positivas para expresar oleA, oleB, oleC y oleD y producir hidrocarburos. Además, este ejemplo demuestra que las bacterias del género Bacillus

pueden modificarse por ingeniería genética para expresar oleA, oleB, oleC y oleD y producir hidrocarburos. Además, este ejemplo demuestra que los tipos de cadenas de acilo graso producidas de manera natural por el organismo huésped influyen en los tipos de hidrocarburos producidos.

También se extrajeron cetonas alifáticas e hidrocarburos (por ejemplo, olefinas) de los sedimentos de células bacterianas de S. maltophilia y se analizaron usando CG/EM usando el método de detección 1. Las olefinas 5 producidas por S. maltophilia (véanse las figuras 3, 4A y 4C) difieren de las producidas por E. coli oleA, oleC y oleD (véase la figura 1). Por tanto, las estructuras de olefinas (por ejemplo, el grado de saturación, longitud de cadena y presencia de cadenas ramificadas o no ramificadas) dependen del huésped. Estas diferencias son un reflejo directo de la capacidad del organismo para producir diversos tipos de cadenas de acilo graso. Esto demuestra que si se altera la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, se producen diferentes tipos de olefinas. 10

Para determinar si se requiere oleA para la producción de olefinas en S. maltophilia, se generó una cepa deficiente en oleA de S. maltophilia usando un método basado en vector suicida de recombinación homóloga (intercambio alélico) que conduce a deleciones de genes. En resumen, la deleción de la región del gen oleA se produjo usando los métodos de reemplazo de genes descritos por Hoang et al., Gene, 212: 77-86, (1998). Más específicamente, se amplificaron las regiones en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ de la región del gen oleA y se colocaron juntas 15 usando la técnica de SOE PCR (véase, por ejemplo, Horton et al., Gene, 77: 61-8 (1989)). Se cortó el producto de PCR de SOE con Xbal y Hindlll y se clonó en un vector suicida pEX18Tc (véase Hoang et al., citado anteriormente) digerido con Xbal y Hindlll. La región flanqueante en 5’ usó los cebadores de PCR LB200 (SEQ ID NO: 58) y LB203 (SEQ ID NO: 61). La región flanqueante en 3’ usó los cebadores de PCR LB201 (SEQ ID NO: 59) y LB205 (SEQ ID NO: 63). El producto de delección de PCR combinado (SEQ ID NO: 75), que se clonó en pEX18Tc, se produjo 20 mediante amplificación por PCR de la combinación de los productos de PCR en 5’ y 3’ usando los cebadores de PCR LB202 (SEQ ID NO: 60) y LB204 (SEQ ID NO: 62).

Se analizaron las extracciones a partir de S. maltophilia silvestre y S. maltophilia oleA mutante (S. maltophilia que carece de oleA) mediante CG/EM, usando el método de detección 2. Se observaron olefinas en la S. maltophilia silvestre (véase la figura 4A). No se observaron olefinas en S. maltophilia oleA (véase la figura 4B). Estos 25 resultados demuestran que la deleción del gen oleA dio como resultado la pérdida de la producción de olefinas en S. maltophilia.

Para determinar si se requiere oleC para la producción de olefinas en S. maltophilia, se generó una cepa deficiente en oleC de S. maltophilia usando un método basado en vector suicida de recombinación homóloga (intercambio alélico) que conduce a deleciones de genes. En resumen, la deleción de la región del gen oleC se produjo usando 30 los métodos de reemplazo de genes descritos por Hoang et al., Gene, 212: 77-86, (1998). Más específicamente, se amplificaron las regiones en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ de la región del gen oleC y se colocaron juntas usando la técnica de SOE PCR (véase, por ejemplo, Horton et al., Gene, 77: 61-8 (1989)). Se cortó el producto de PCR de SOE con Xbal y Hindlll y se clonó en un vector suicida pEX18Tc (véase Hoang et al., citado anteriormente) digerido con Xbal y Hindlll. 35

La región flanqueante en 5’ usó los cebadores de PCR LB110 (SEQ ID NO: 465) y LB112 (SEQ ID NO: 467). La región flanqueante en 3’ usó los cebadores de PCR LB111 (SEQ ID NO: 466) y LB114 (SEQ ID NO: 469). El producto de deleción de PCR combinado (SEQ ID NO: 471), que se clonó en pEX18Tc, se produjo mediante amplificación por PCR de la combinación de los productos de PCR en 5’ y 3’ usando los cebadores de PCR LB113 (SEQ ID NO: 468) y LB115 (SEQ ID NO: 470). 40

Se analizaron las extracciones de S. maltophilia silvestre y S. maltophilia oleC mutante (S. maltophilia que carece de oleC) mediante CG/EM, usando el método de detección 2. Se observaron olefinas en la S. maltophilia silvestre (véase la figura 4A). No se observaron olefinas en S. maltophilia oleC (véase la figura 4D). Se observaron cetonas alifáticas en la S. maltophilia oleC (véase la figura 4D). Estos resultados demuestran que la deleción del gen oleC dio como resultado la pérdida de la producción de olefinas en S. maltophilia. 45

Para determinar si se requiere oleD para la producción de olefinas en S. maltophilia, se generó una cepa deficiente en oleD de S. maltophilia usando un método basado en vector suicida de recombinación homóloga (intercambio alélico) que conduce a deleciones de genes. En resumen, se produjo la deleción de la región del gen oleD usando los métodos de reemplazo de genes descritos por Hoang et al., Gene, 212: 77-86, (1998). Más específicamente, se amplificaron las regiones en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ de la región del gen oleD y se colocaron juntas 50 usando la técnica de SOE PCR (véase, por ejemplo, Horton et al., Gene, 77: 61-8 (1989)). Se cortó el producto de PCR de SOE con Xbal y Hindlll y se clonó en un vector suicida pEX18Tc (véase Hoang et al., citado anteriormente) digerido con Xbal y Hindlll.

La región flanqueante en 5’ usó los cebadores de PCR LB122 (SEQ ID NO: 472) y LB124 (SEQ ID NO: 474). La región flanqueante en 3’ usó los cebadores de PCR LB123 (SEQ ID NO: 473) y LB127 (SEQ ID NO: 476). El 55 producto de deleción de PCR combinado (SEQ ID NO: 477), que se clonó en pEX18Tc, se produjo mediante amplificación por PCR de la combinación de los productos de PCR 5’ y 3’ usando los cebadores de PCR LB125 (SEQ ID NO: 475) y LB127 (SEQ ID NO: 476).

Se analizaron las extracciones a partir de S. maltophilia silvestre y S. maltophilia oleD mutante (S. maltophilia que carece de oleD) mediante CG/EM, usando el método de detección 2. Se observaron olefinas en la S. maltophilia silvestre (véase la figura 4C). No se observaron olefinas en S. maltophilia oleD. Se observaron cetonas alifáticas en la S. maltophilia oleD (véase la figura 4E). Estos resultados demuestran que la deleción del gen oleD dio como resultado la pérdida de la producción de olefinas en S. maltophilia. 5

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que la expresión de oleA, oleC y oleD en bacterias da como resultado la producción de olefinas. Las olefinas producidas pueden diferir pueden diferir en estructura dependiendo del huésped. Adicionalmente, los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que se requieren OleA, OleC y OleD para la producción de olefinas en S. maltophilia.

EJEMPLO 3 10

Este ejemplo demuestra que la expresión de oleA en bacterias daba como resultado la producción de cetonas alifáticas.

Se expresó oleA en E. coli tal como se describe en los ejemplos 1 y 2. Se usó el plásmido que contenía oleA para transformar E. coli C41(DE3). La cepa bacteriana resultante con el genotipo E. coli C41(DE3); pET-21b(+)_OleA se sometió a prueba usando el protocolo de fermentación de 5 ml. Se realizó el análisis para la producción de cetonas 15 alifáticas e hidrocarburos (por ejemplo, olefinas) usando el método de extracción 1 seguido por el análisis de CG/EM, usando el método de detección 1 tal como se describe en el ejemplo 1. Las cetonas alifáticas observadas mediante CG/EM eran cetonas alifáticas saturadas, monoinsaturadas y diinsaturadas. Las cetonas alifáticas oscilaban en la longitud de la cadena de carbono entre C27 y C31 (véanse las figuras 5A-C y 6A-H).

Para demostrar que la expresión de oleA conduce a la producción de cetonas alifáticas en una amplia gama de 20 bacterias, se preparó el plásmido pHT01_OleA para la expresión de oleA en Bacillus subtilis (véase el ejemplo 1). Se transfirmó B. subtilis IHA01 con pHT01_OleA para crear la cepa B. subtilis IHA01; se transformó pHT01_OleA. B. subtilis IHA01 con pHT01 para preparar B. subtilis IHA01; pHT01 que actuó como control.

Se amplificaron las secuencias de ácido nucleico mediante PCR usando un plásmido que contenía la secuencia de codones optimizados para E. coli de oleA de S. maltophilia. Se insertaron estas secuencias en vectores de expresión 25 bacteriana usando técnicas de clonación convencionales para E. coli (véase, por ejemplo, el ejemplo 1).

Entonces se usaron el plásmido que contenía oleA (pHT01_OleA) y un plásmido de control de vector vacío (pHT01) para transformar B. subtilis IHA01. Se transformó B. subtilis mediante transformación natural según los protocolos de Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44: 1072-1078 (1958).

Se sometieron a prueba las cepas bacterianas resultantes con el genotipo B. subtilis IHA01; pHT01_OleA y B. 30 subtilis IHA01; pHT01 usando el protocolo de fermentación de 5 ml. El método de extracción usado fue el método de extracción 1. Se realizó el análisis para determinar la presencia de cetonas alifáticas e hidrocarburos (por ejemplo, olefinas) mediante CG/EM usando el método de detección 4 tal como se describe en el ejemplo 1. Se observaron cetonas alifáticas saturadas que contenían 25, 27 y 29 carbonos. Los múltiples picos para cada cetona alifática C25, C27 y C29 respectiva reflejan que estaban presentes varios isómeros ramificados diferentes de las cetonas alifáticas 35 (véanse las figuras 18A-E).

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que pueden modificarse por ingeniería genética una variedad de bacterias para expresar oleA y producir cetonas alifáticas. Además, este ejemplo demuestra que pueden modificarse por ingeniería genética bacterias Gram-positivas para expresar oleA y producir cetonas alifáticas. Además, este ejemplo demuestra que pueden modificarse por ingeniería genética bacterias del 40 género Bacillus para expresar oleA y producir cetonas alifáticas. Además, este ejemplo demuestra que los tipos de cadenas de acilo graso producidas de manera natural por el organismo huésped influyen en los tipos de hidrocarburos producidos.

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra la capacidad de observar producción de cetonas alifáticas usando un ensayo in vitro que 45 combina lisado de células de E. coli que expresan oleA (SEQ ID NO: 2) con sustratos de acil-CoA.

Se expresó oleA en E. coli tal como se describe en los ejemplos 1 y 3. Las bacterias recombinantes resultantes se cultivaron, se indujeron, se sedimentaron y se usaron para preparar un lisado celular que contenía OleA (lisado celular de OleA) tal como se describe en el ejemplo 1. La mezcla de ensayo in vitro consistía en 10 l de una disolución madre 10 mM de sal de litio de miristoil-CoA (el sustrato) (M4414 de Sigma-Aldrich St. Louis, MO) 50 suspendida en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0, 1 l de agente reductor de tris(hidroxipropil)fosfina (THP) 500 mM, 50 l de lisado celular de OleA y 39 l de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. También se prepararon muestras de control que contenían combinaciones con y sin sustrato o extracto celular de OleA. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora. Tras el periodo de incubación, se añadieron 10 l de disolución de hexacosano 0,1 mg/ml como adición conocida de control a cada reacción antes de la extracción. Se extrajeron las muestras usando 500 l de acetato de 55 etilo que contenía ácido acético al 1%. Se mezcló la mezcla en una mezcladora de vórtex seguido por

centrifugación. Se transfirió la fase superior (fase de acetato de etilo) a un tubo de vidrio limpio y se secó a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, Eppendorf, Westbury, NY). Se resuspendió la muestra en 50 l de acetato de etilo. Se analizaron entre 1 y 10 l mediante o bien CG/EM o bien CG/FID según los métodos descritos en el ejemplo 1. Pueden usarse métodos similares para incubar cualquier lisado celular de OleA con un sustrato en condiciones suficientes para producir cetonas alifáticas y posteriormente analizar la producción de cetonas alifáticas. 5

Las cetonas alifáticas resultantes observadas mediante CG/EM y CG/FID eran saturadas, monoinsaturadas y diinsaturadas. Las cetonas alifáticas oscilaban en longitud de cadena de carbono entre C27 y C31 (véanse las figuras 7A y 7B). Se comparó la muestra que contenía sustrato y extracto de OleA con todas las otras combinaciones de muestras de control. La producción de una cantidad aumentada de cetona alifática C27 en relación con todas las muestras de control era indicativa de la actividad de condensación de acilos encontrada en OleA (véase la figura 10 7C).

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que acil coenzima A es un sustrato para la producción de cetona alifática en un ensayo in vitro y que se requiere la expresión de oleA para la producción de cetonas alifáticas.

EJEMPLO 5 15

Este ejemplo demuestra la capacidad para observar cetonas alifáticas usando un ensayo in vitro que combina enzima purificada (por ejemplo, proteína OleA) con sustrato purificado (por ejemplo, acil-coenzima A, acil-ACP, etc.) en un tampón fosfato 0,1 M pH 7,0.

Se expresó oleA en E. coli tal como se describe en los ejemplos 1 y 3. Las bacterias recombinantes resultantes se cultivaron, se indujeron, se sedimentaron y se usaron para preparar proteína OleA purificada tal como se describe en 20 el ejemplo 1. La mezcla de ensayo in vitro consistía en un sustrato (por ejemplo, acil-coenzima A, acil-ACP, o una mezcla de acil-coenzima A y acil-ACP) diluido hasta una concentración final de 0,1 mM a 1 mM, 20 l de una disolución 0,6 mg/ml de proteína OleA purificada en un tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 con cloruro de magnesio 500 mM. Se incubó cada mezcla de ensayo a 37ºC durante 1 hora. Tras el periodo de incubación, se añadieron 250 l de acetato de etilo a cada mezcla de ensayo y se mezcló cada mezcla de ensayo en una mezcladora de 25 vórtex durante 10 minutos. Se separó la fracción de acetato de etilo de la mezcla de ensayo de la fase acuosa mediante centrifugación en una microcentrífuga a 13000 rpm durante 5 minutos. Se transfirieron 15 l de la fracción de acetato de etilo (la fase superior) a un vial de CG/EM al que se le añadieron 1,5 l de una disolución 0,1 mg/ml de disolución de hexacosano como adición conocida de control a cada fracción de acetato de etilo antes de que se analizara cada fracción de acetato de etilo en la CG/EM usando métodos de detección de ionización química que se 30 conocen bien en la técnica (véase la figura 8A-B).

Se observaron cetonas alifáticas saturadas, monoinsaturadas y diinsaturadas con longitudes de cadena de carbono que oscilan entre C19 y C31. No se observó cetona alifática en ninguna de las mezclas de ensayo de control (por ejemplo, mezclas de ensayo que contienen una enzima purificada sin un sustrato o mezclas de ensayo que contienen un sustrato purificado sin una enzima purificada). 35

Las tablas 16-18 ilustran las combinaciones de sustratos que se sometieron a prueba y los tipos de cetonas alifáticas que se produjeron. Se formaron cetonas alifáticas mediante las siguientes combinaciones de sustratos: acil-CoA con acil-CoA, acil-ACP con acil-ACP y acil-CoA con acil-ACP (los datos de cada combinación se muestran en las tablas 16, 17 y 18, respectivamente). Los sustratos se muestran a lo largo del lado superior e izquierdo de la tabla y cada entrada muestra la longitud de la cadena de carbono seguido por el número de dobles enlaces para cada cetona 40 alifática que se formó (por ejemplo, C27:1 se refiere a una cetona alifática con 27 carbonos y un único doble enlace, C23 se refiere a una cetona alifática completamente saturada con 23 carbonos, etc.).

TABLA 16

acil-CoA/acil-CoA: C10 C12 C14 C16 C16:1

C10: C19 N/A C23 N/A N/A

C12: - C23 C25 C27:1

C14: - - C27 C29 C29:1

C16: - - - C31 C31:1

C16:1: - - - - C31:2

N/A = no se ha sometido a prueba.

45

acil-ACP/acil-ACP: C10 C12 C14 C14:1 C16:1

C10: C19 N/A C23 N/A N/A

C12: - C23 C25 N/A C27:1

C14: - - C27 C27:1 C29:1

C14:1: - - - C27:2 N/A

C16:1: - - - - C31:2

N/A = no se ha sometido a prueba.

TABLA 18

Sustrato: C14-ACP

C16:1-CoA: C27, C29:1, C31:2

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que puede utilizarse un ensayo in vitro para detectar la actividad de OleA mediante la presencia de cetonas alifáticas. Además, los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que pueden usarse tanto acil-coenzima A como acil-ACP como 5 sustratos mediante OleA solo o en combinación para producir cetonas alifáticas. La longitud de cadena y el grado de saturación del sustrato pueden variar para producir una amplia gama de productos de cetona alifática.

EJEMPLO 6

Este ejemplo describe la identificación de secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de oleA, oleC y oleD adicionales usando las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico S. maltophilia descritas en el presente 10 documento.

Las secuencias de aminoácidos de proteínas relacionadas con las secuencias de OleA, OleC y OleD de S. maltophilia se determinaron usando el programa de alineación de proteínas NCBI BLAST para realizar búsquedas en la base de datos nr database así como varias de otras bases de datos accesibles públicamente. Para demostrar cómo identificar y someter a prueba la actividad de miembros adicionales de la familia de genes de oleA, oleC y 15 oleD, se clonaron y sometieron a prueba genes de un organismo estrechamente relacionado, Xanthomonas axonopodis (oleA, oleC y oleD) y genes de dos organismos relacionados de manera distante, Chloroflexus aggregans (oleA, oleC y oleD) y Plesiocystis pacifica (oleC), tal como sigue.

Los plásmidos usados en este ejemplo se prepararon usando las mismas cepas bacterianas, marcadores de resistencia y técnicas de PCR descritas en el ejemplo 1. Para una descripción más detallada de los plásmidos, 20 véase la tabla 15. De manera similar, se usaron el protocolo de fermentación de 5 ml, el método de extracción de hidrocarburos 1 y el método de detección de hidrocarburos por CG/EM 1 descritos en el ejemplo 1 para identificar hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburos.

Se diseñaron los genes de interés para que estuviesen optimizados para la expresión en E. coli usando el software Protein-2-DNA (véase, por ejemplo, Gustafsson et al., Trends Biotechnol. 22: 346-353 (2004)) para seleccionar una 25 distribución de codones que imite a las proteínas de E. coli altamente expresadas naturales (véase, por ejemplo, Henaut et al., Analysis and predictions from E. coli sequences, en E. coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, volumen 2, editado por: Neidhardt et al., Washington DC, ASM press, págs. 2047-2066 (1996)). Se sintetizó/sintetizaron el/los gene(s) mediante PCR sin molde similar a lo que se ha descrito previamente en la bibliografía (véase, por ejemplo, Dillon et al., Biotechniques, 9: 298-300 (1990)). Se realizó la síntesis de genes 30 mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA).

Se clonaron los marcos de lectura abiertos sintéticos en el plásmido pJ201 (DNA 2.0, Menlo Park, CA). Se subclonaron estos genes en pET21d en el sentido de 5’ del promotor T7 en el sitio de clonación múltiple entre los sitios Ncol y Hindlll. Se diseñaron los cebadores para que conservaran los extremos 5’ y 3’ de las secuencias de proteína. Se amplificó por PCR la versión con codones optimizados de oleA basándose en la secuencia de 35 aminoácidos de S. maltophilia (SEQ ID NO: 3) a partir del plásmido de DNA 2.0 usando los cebadores LF305 (SEQ ID NO: 37) y LF306 (SEQ ID NO: 38) (véase la tabla 14 para secuencias cebador). Se digirió el producto de PCR con Pcil y Hindlll y se clonó en el vector pET21d. Se amplificó por PCR el marco de lectura abierto de oleA (SEQ ID NO: 11) basado en la secuencia de aminoácidos de Xanthomonas axonopodis, n.º de registro de GenBank NP_640589.1 GI:21241007 (SEQ ID NO: 12) a partir del plásmido de DNA 2.0 usando los cebadores LF307 (SEQ ID 40 NO: 39) y LF308 (SEQ ID NO: 40). Se digirió el producto de PCR con Pcil y Hindlll y se clonó en el vector pET21d. Se amplificó por PCR el marco de lectura abierto de oleA (SEQ ID NO: 17) basado en la secuencia de aminoácidos de Chloroflexus aggregans DSM 9485 NCBI, n.º de registro de GenBank ZP_01515932.1 GI:118047293 (SEQ ID NO: 18) a partir del plásmido de DNA 2.0 usando los cebadores LF313 (SEQ ID NO: 41) y LF314 (SEQ ID NO: 42). Se digirió el producto de PCR con Pcil y Hindill y se clonó en el vector pET21d. Las versiones sintéticas de los genes 45

oleC (SEQ ID NO: 13) y oleD (SEQ ID NO: 15) de Xanthomonas axonopodis, los genes oleC (SEQ ID NO: 19) y oleD (SEQ ID NO: 21) de Chloroflexus aggregans, y el gen oleC de Plesiocystis pacifica (SEQ ID NO: 87) se subclonaron directamente a partir de los vectores de DNA 2.0 pJ201 en frente del promotor T7 en los vectores pCOLADuet y pET21d usando Ncol y Hindlll.

Se evaluó la actividad de producción de cetonas alifáticas de OleA a partir de S. maltophilia, Xanthomonas 5 axonopodis y Chloroflexus aggregans detectando las cetonas alifáticas cuando se expresó la OleA respectiva en E. coli. Se transformaron células de E. coli C41(DE3) con el plásmido de interés, y se indujeron usando el protocolo de expresión de T7 descrito. A continuación, se extrajeron los sedimentos usando el método de extracción 1 y se observaron cetonas alifáticas mediante el Método de detección por CG/EM 1. Pueden usarse métodos similares para expresar OleA a partir de cualquier organismo de interés y para detectar posteriormente cetonas alifáticas 10 mediante CG/EM. Las cetonas alifáticas observadas mediante CG/EM eran saturadas, monoinsaturadas y diinsaturadas que oscilaban en longitud de cadena de carbono entre C27 y C33 (véase la figura 9 y la tabla 19).

Se evaluaron las actividades de hidrocarburo sintasa de OleA, OleC y OleD a partir de Xanthomonas axonopodis y Chloroflexus aggregans y OleC a partir de Plesiocystis pacifica usando un ensayo de complementación que somete a prueba la producción de olefinas. Se evaluó la actividad de OleA a partir de X. axonopodis y C. aggregans en una 15 cepa de E. coli que también expresó OleC y OleD de S. maltophilia. Se evaluó la actividad de OleC en una cepa de E. coli que también expresaba OleA y OleD a partir de S. maltophilia. Más específicamente, para someter a prueba la actividad de hidrocarburo sintasa de OleA, se transformaron células con tres plásmidos que portaban oleA a partir del organismo de interés, oleC (S. maltophilia) y oleD (S. maltophilia). Entonces se sometieron las células transformadas a fermentación, extracción y métodos de detección por CG/EM. 20

Para someter a prueba la actividad de hidrocarburo sintasa de OleC, se transformaron células con tres plásmidos que portaban oleAB (S. maltophilia), oleC a partir del organismo de interés y oleD (S. maltophilia). La adición de OleB a la E. coli es opcional. Entonces se sometieron las células transformadas a fermentación, extracción y métodos de detección por CG/EM.

Para someter a prueba la actividad hidrocarburo sintasa de OleD, se transformaron células con tres plásmidos que 25 portaban oleAB (S. maltophilia), oleC (S. maltophilia) y oleD a partir del organismo de interés. La adición de OleB a la E. coli es opcional. Entonces se sometieron las células transformadas a fermentación, extracción y métodos de detección por CG/EM.

Por ejemplo, las cepas usadas para evaluar la actividad de oleC a partir de C. aggregans, X. axonopodis y P. pacifica eran de los siguientes genotipos: E. coli C41(DE3) fadE; pCOLADuet_OleAB, pCDFDuet_OleD, 30 pET21d_OleC(Chl). E. coli C41(DE3) fadE; pCOLADuet_OleAB, pCDFDuet_OleD, pET21d_OleC(Xan). E. coli C41(DE3) fadE; pCOLADuet_OleAB, pCDFDuet_OleD, pET21d_OleC(Ple). Las cepas usadas para evaluar la actividad de oleD a partir de C. aggregans y X. axonopodis fueron de los siguientes genotipos: E. coli C41(DE3) fadE; pCOLADuet_OleAB, pCDFDuet_OleC, pET21d_OleD(Chl). E. coli C41(DE3) fadE; pCOLADuet_OleAB, pCDFDuet_OleC, pET21d_OleD(Xan). Las cepas usadas para evaluar la actividad de oleA a partir de C. aggregans 35 y X. axonopodis fueron del siguiente genotipo: E. coli C41(DE3); fadE; pET21d_OleA(Chl); pACYCDuet_OleCD; pCDFDuet_fadD y E. coli C41(DE3); fadE; pET21d_OleA(Xan); pACYCDuet_OleCD; pCDFDuet_fadD.

Para demostrar que los genes ole basados únicamente en las secuencias de aminoácidos de S. maltophilia no se requieren para la producción de hidorcarburos en E. coli, se usó una cepa con los genes oleA, oleC y oleD que codifican para las tres secuencias de proteína de X. axonopodis para someter a prueba la producción de 40 hidrocarburos en E. coli. Se preparó E. coli C41(DE3) fadE; pET21d_OleA(Xan), pCOLADuet_OleD(Xan), pCDF_Duet_OleC(Xan) y se evaluó para determinar la capacidad para producir hidrocarburos. Entonces se extrajeron los sedimentos y se analizaron para determinar la producción de hidrocarburos mediante CG/EM. Los hidrocarburos observados mediante CG/EM eran olefinas mono-, di- y triinsaturadas que oscilaban en longitud de cadena de carbono entre C27 y C31 (tabla 19). 45

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que las tres secuencias de proteína OleA relacionadas a partir de S. maltophilia, Xanthomonas axonopodis y Chloroflexus aggregans funcionan todas produciendo cetonas alifáticas cuando se expresan en E. coli C41(DE3) fadE. Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo también demuestran que las secuencias de proteína OleA a partir de S. maltophilia, Xanthomonas axonopodis y Chloroflexus aggregans funcionan todas produciendo hidrocarburos cuando se 50 expresan en E. coli C41(DE3) fadE que expresa genes oleC y oleD funcionales conocidos. Adicionalmente, los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que las tres secuencias de proteína OleC relacionadas a partir de Xanthomonas axonopodis, Chloroflexus aggregans y Plesiocystis pacifica funcionan todas produciendo olefinas cuando se expresan en E. coli C41(DE3) fadE que expresa genes oleA y oleD funcionales conocidos. De manera similar, las dos secuencias de proteína OleD relacionadas a partir de Xanthomonas 55 axonopodis y Chloroflexus aggregans funcionan ambas produciendo olefinas cuando se expresan en E. coli C41(DE3) fadE que expresa genes oleA y oleC funcionales conocidos. Además, los genes ole que muestran actividad en combinación con otros genes ole funcionales producen hidrocarburos, ya se deriven o no del mismo organismo. Por ejemplo, genes ole de Xanthomonas axonopodis funcionan junto con genes ole derivados de S.

maltophilia produciendo hidrocarburos.

TABLA 19

Proteína: Organismo ADN Cetona alifática



: C27 C27:1 C27:2 C29 C29:1 C29:2 C31:1 C31:2

OleA: S. maltophilia ATCC17679 nativo + + + + + + + +

OleA: S. maltophilia R551-3 sintético + + + + + + + +

OleA: Xanthomonas axonopodis sintético + + + + + + + +

OleA: Chloroflexus aggregans sintético + + + + + + + +

Olefina*



: C27:1 C27:2 C27:3 C29:1 C29:2 C29:3 C31:2 C31:3

OleA: S. maltophilia R551-3 sintético + + + + + + + +

OleA: Xanthomonas axonopodis sintético + + + + + + + +

OleA: Chloroflexus aggregans sintético + + + + + + + +

OleC: S. maltophilia ATCC17679 nativo + + + + + + + +

OleC: Xanthomonas axonopodis sintético + + + + + + + +

OleC: Chloroflexus aggregans sintético + + + + + + + +

OleC: Plesiocystis pacifica sintético + + + + + + + +

OleD: S. maltophilia ATCC17679 nativo + + + + + + + +

OleD: Xanthomonas axonopodis sintético + + + + + + + +

OleD: Chloroflexus aggregans sintético + + + + + + + +

OleACD: Xanthomonas axonopodis sintético + + + + + + + +

* Se sometió a prueba OleC en presencia de OleA y OleD a partir de S. maltophilia ATCC17679. Se sometió a prueba OleD en presencia de OleA y OleC a partir de S. maltophilia ATCC17679. Se sometió a prueba OleA en presencia de OleC y OleD a partir de S. maltophilia ATCC17679. 5

Este ejemplo demuestra un método de ensayo in vivo para identificar proteínas OleA con actividad de cetona alifática. Además, este experimento demuestra un método de ensayo in vivo para identificar proteínas OleA, OleC y OleD con actividad hidrocarburo sintasa.

EJEMPLO 7

Este ejemplo demuestra que pueden usarse motivos de aminoácidos para identificar secuencias de proteína OleA, 10 OleB, OleC y OleD adicionales en bases de datos disponibles públicamente.

En resumen, en Internet están disponibles programas para realizar búsquedas en bases de datos de proteínas de patrones de aminoácidos específicos (motivos). Uno de tales programas es el ofrecido por el servicio GenomeNet a partir del Kyoto University Bioinformatics Center. El sitio web, con fecha de 1 de agosto de 2007, era http://motif.genome.jp/MOTIF2.html. Este programa de búsqueda de motivos ofrece al usuario la capacidad para 15 realizar búsquedas en las siguientes bases de datos: Swiss-Prot, PDBSTR, PIR, PRF, GENES y NR-AA. El usuario introduce el patrón de aminoácidos específico en el formato PROSITE (véase, por ejemplo, Hofmann et al., Nucleic Acids Res. 27: 215-219 (1999)). Por ejemplo, cada residuo debe estar separado por un - (menos); x representa cualquier aminoácido; [DE] significa o bien D o bien E; {FWY} significa cualquier aminoácido excepto P, W y Y; A(2,3) significa que A aparece de 2 a 3 veces consecutivamente; la sucesión del patrón debe estar terminada con un 20 periodo. El usuario selecciona “buscar en bases de datos de secuencias un patrón dado”, introduce un patrón de aminoácidos específico tal como se describió anteriormente en recuadro de patrón y selecciona la base de datos en

la que va a realizarse la búsqueda.

Los motivos proporcionados en las tablas 3, 7 y 10 pueden usarse para identificar proteínas OleA adicionales. Por ejemplo, se introdujo el motivo [LF]-X-X-[IVLM]-[ATSV]-G-[IV]-X-[EAHS]-R-R-X-W (SEQ ID NO: 64), que es un motivo que define la agrupación de proteína OleA, en el programa de búsqueda de motivos tal como se describió anteriormente. En la tabla 20 se muestran resultados de búsqueda a modo de ejemplo para esta consulta. 5

TABLA 20

Patrón de consulta: [LF]-X-X-[IVLM]-[ATSV]-G-[IV]-X-[EAHS]-R-R-X-W Buscado en la base de datos NR-AA

: Nombre de entrada Posición Descripción

1.: pir:H82615 43..55 [H82615] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III XF1970 [importada] - Xilella fastidiosa (cepa 9a5c)>tr:Q3RAR4_XYLFA [Q3RAR4] 3-oxoacil-(ACP) sintasa III.>tr:Q87D54_XILFT [Q87D54] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III

2.: prf:2816338E 50..62 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa - Photobacterium profundum>tr:Q93CH0_PHOPR [Q93CH0] 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa lll.>gp:AF409100_5 [AF409100] 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa III [Photobacterium profundum SS9]

3.: prf:3108482HQG 43..55 3-oxoacil sintasa - Xanthomonas oryzae oryzae>tr:Q5GV10_XANOR [Q5GV10] 3-oxoacil-sintasa lll.>tr:Q2NY94_XANOM [Q2NY94] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III.

4.: prf:3117429DGF 43..55 proteína de tipo 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa III - Colwellia psychrerythraea>tr:Q482Y9_COLP3 [Q482Y9] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III, homólogo.>gp:CP000083_2096 [CP000083] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III, homólogo [Colwellia psychrerythraea 34H]

5.: prf:3122281XR 43..55 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa - Xanthomonas campestris vesicatoria>tr:Q3BZ43_XANC5 [Q3BZ43] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa III (EC 2.3.1.41).>gpu:AM039952_239 [AM039952] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa III [Xanthomonas campestris pv. vesicatoria cepa 85-10]

6.: tr:A0H249_9CHLR 43..55 [A0H249] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

7.: tr:A1R7R4_ARTAT 81..93 [A1R7R4] Regulador transcripcional supuesto, familia TetR.>gp:CP000474_2443 [CP000474] regulador transcripcional supuesto, familia TetR [Arthrobacter aurescens TC1]

8.: tr:A1S4T3_SHEAM 43..55 [A1S4T3] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III supuesta.>gp:CP000507_1177 [CP000507] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III supuesta [Shewanella amazonensis SB2B]

9.: tr:A2V0V9_SHEPU 43..55 [A2V0V9] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C terminal.>tr:A1RLD2_SHESW [A1RLD2] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>tr:A4Y5D7_SHEPU [A4Y5D7] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.

10.: tr:Q0HTF5_SHESR 43..55 [Q0HTF5] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000444_2594 [CP000444] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Shewanella sp. MR-7]

11.: tr:Q0KY22_9GAMM 43..55 [Q0KY22] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III supuesta.

12.: tr:Q1K1K3_DESAC 43..55 [Q1K1K3] Factor de von Willebrand, tipo A.

13.: tr:Q3R6U7_XYLFA 43..55 [Q3R6U7] 3-oxoacil-(ACP) sintasa III.>tr:Q3REG9_XYLFA [Q3REG9] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

14.: tr:A1R681_ARTAT 49..61 [A1R681] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III supuesta.>gp:CP000474_1910 [CP000474] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III supuesta [Arthrobacter aurescens TC1]

15.: tr:A3D2V1_9GAMM 43..55 [A3D2V1] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>tr:A4MM52_9GAMM [A4MM52] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa Ill C, proteína de dominio terminal.>tr:A5NBF7_9GAMM [A5NBF7] 3-Oxoacil-(Proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa Ill C, proteína de dominio terminal.

16.: tr:Q084U7_SHEFN 43..55 [Q084U7] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000447_1355 [CP000447] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Shewanella frigidimarina NCIMB 400]

17.: tr:Q0HH48_SHESM 43..55 [Q0HH48] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000446_2537 [CP000446] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Shewanella sp. MR-4]

18.: tr:A0X3V3_9GAMM 43..55 [A0X3V3] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.

19.: tr:A1IES4_9DELT 43..55 [A1IES4] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III supuesta.

20.: tr:Q1ZDM4_9GAMM 43..55 [Q1ZDM4] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

21.: tr:A0J5A0_9GAMM 43..55 [A0J5A0] 3-oxoacil-(Proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C terminal.

22.: tr:A0KYS3_SHESA 43..55 [A0KYS3] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000469_2697 [CP000469] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Shewanella sp. ANA-3]

23.: tr:A1SW97_PSYIN 43..55 [A1SW97] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000510_1891 [CP000510] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Psychromonas ingrahamii 37]

24.: tr:A5CT00_CLAM3 51..63 [A5CT00] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa supuesta (EC 2.3.1.41).>gp:AM711867_2161 [AM711867] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa supuesta [Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382]

25.: tr:Q12PH1_SHEDO 43..55 [Q12PH1] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa Ill supuesta.>gp:CP000302_1358 [CP000302] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III supuesta [Shewanella denitrificans OS217]

26.: tr:Q1YZ92_PHOPR 43..55 [Q1YZ92] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

27.: tr:A1ATM6_PELPD 43..55 [A1ATM6] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000482_3055 [CP000482] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Pelobacter propionicus DSM 2379]

28.: tr:A4A9J6_9GAMM 49..61 [A4A9J6] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa III.

29.: tr:A5GFJ5_9DELT 43..55 [A5GFJ5] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000698_1982 [CP000698] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Geobacter uraniumreducens Rf4]

30.: tr:A0W5R8_9DELT 43..55 [A0W5R8] 3-oxoacil-(Proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C terminal.

31.: tr:A3QDN2_SHELP 43..55 [A3QDN2] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.>gp:CP000606_1707 [CP000606] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal [Shewanella loihica PV-4]

32.: tr:A3ZXB5_9PLAN 43..55 [A3ZXB5] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

33.: tr:Q3DYP6_CHLAU 43..55 [Q3DYP6] 3-oxoacil-(ACP) sintasa III.

34.: tr:A1FUB4_XANMA 43..55 [A1FUB4] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

35.: tr:A4LZ02_9DELT 43..55 [A4LZ02] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III C, proteína de dominio terminal.

36.: tr:Q0YLU4_9DELT 43..55 [Q0YLU4] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa III supuesta.

37.: tr:Q40YV3_KINRA 87..99 [Q40YV3] Similar a 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo).

38.: tr:A6G0Q4_9DELT 43..55 [A6G0Q4] 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (EC 2.3.1.41).

39.: tr:Q8EG66_SHEON 43..55 [Q8EG66] Proteína sin caracterizar supuesta.>gp:AE014299_1709 [AE014299] proteína hipotética conservada [Shewanella oneidensis MR-1]

40.: tr:Q7UI20_RHOBA 79..91 [Q7UI20] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III (EC 2.3.1.41).>gp:BX294155_248 [BX294155] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III [Rhodopirellula baltica SH 1]

41.: tr:Q6LS53_PHOPR 38..50 [Q6LS53] 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa III.>gp:CR378667_231 [CR378667] 3-oxoacil-proteína portadora de acilo sintasa III [Photobacterium profundum SS9]

42.: tr:Q4V064_XANC8 43..55 [Q4V064] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III.>tr:Q8PDX2_XANCP [Q8PDX2] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III.>gp:CP000050_215 [CP000050] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III [Xanthomonas campestris pv. campestris cepa 8004]

43.: tr:Q8PQT8_XANAC 43..55 [Q8PQT8] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III.>gp:AE011648_4 [AE011648] 3-oxoacil-[ACP] sintasa III [Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306]

44.: tr:Q6AQA3_DESPS 44..56 [Q6AQA3] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa III probable.>gp:CR522870_741 [CR522870] 3-oxoacil-[proteína portadora de acilo] sintasa III probable [Desulfotalea psychrophila LSv54]

45.: gpu:CP000750_1676 65..77 [CP000750] 3-Oxoacil-(proteína portadora de acilo (ACP)) sintasa III, proteína de dominio [Kineococcus radiotolerans SRS30216]

De manera similar, los motivos proporcionados en las tablas 4, 9 y 12 pueden usarse para identificar enzimas OleD adicionales que tienen actividad hidrocarburo sintasa. Estos motivos pueden usarse también para identificar enzimas OleD que tienen actividad deshidrogenasa. Los motivos proporcionados en las tablas 5, 8 y 11 pueden usarse para identificar enzimas OleC adicionales que tienen actividad hidrocarburo sintasa. Los motivos proporcionados en la tabla 6 pueden usarse para identificar enzimas OleB adicionales que tienen actividad hidrocarburo sintasa. 5

Los resultados de este ejemplo demuestran que los motivos de aminoácido de OleA, OleB, OleC y OleD pueden usarse para identificar secuencias de aminoácidos de OleA, OleB, OleC y OleD adicionales. Un experto habitual en la técnica, usando las secuencias de aminoácidos de OleA, OleB, OleC y OleD, también podría identificar los genes oleA, oleB, oleC y oleD correspondientes que codifican para la secuencia de aminoácidos correspondiente. Más específicamente, estos resultados demuestran que pueden usarse SEQ ID NO: 64-74 y 91-133 para realizar 10 búsquedas en bases de datos para identificar enzimas OleA, OleB, OleC y OleD adicionales.

EJEMPLO 8

Este ejemplo demuestra que la expresión de OleA en células en las que la ruta de biosíntesis de ácidos grasos está alterada da como resultado una producción potenciada de cetonas alifáticas.

Se expresó OleA en una variedad de células de E. coli tal como se describe en los ejemplos 1 y 3. Las bacterias 15 recombinantes resultantes se cultivaron, se indujeron, se sedimentaron y se extrajeron usando el método de fermentación 2, el método de extracción 1 y el método de detección 1. Las cetonas alifáticas observadas mediante CG/EM eran saturadas, monoinsaturadas y diinsaturadas que oscilaban en longitud de cadena de carbono entre C27 y C31.

Se sometieron a prueba ocho huéspedes de E. coli diferentes: 20

(1) E. coli C41(DE3) silvestre;

(2) E. coli C41(DE3) fadE, que tiene una deleción completa de la acil-CoA deshidrogenasa fadE;

(3) E. coli C41(DE3) con un plásmido que expresa fadD tras la inducción con IPTG;

(4) E. coli C41(DE3) fadE con un plásmido que expresa fadD tras la inducción con IPTG;

(5) E. coli C41(DE3) con un plásmido que expresa ‘tesA, una versión truncada del gen de tioesterasa A tesA, tras la inducción con IPTG;

(6) E. coli C41(DE3) fadE con un plásmido que expresa ‘tesA, una versión truncada del gen de tioesterasa A tesA, tras la inducción con IPTG;

(7) E. coli C41(DE3) con tanto ‘tesA como fadD contenidos en plásmidos individuales que se expresan tras la 5 inducción con IPTG; y

(8) E. coli C41(DE3) fadE con tanto ‘tesA como fadD contenidos en plásmidos individuales que se expresan tras la inducción con IPTG.

Los plásmidos (por ejemplo, fadD y ‘tesA) que alteran la producción de productos intermedios de la ruta de ácidos grasos se prepararon usando métodos de biología molecular convencionales. Todos los genes clonados se pusieron 10 bajo el control de promotores inducibles por IPTG (por ejemplo, promotores T7, tac o lac). El gen ‘tesA (SEQ ID NO: 25; gen de tioesterasa A, registro NP 415027 sin secuencia líder (Cho et al., J.Biol. Chem., 270: 4216-9 (1995), EC: 3,1,1,5,3.1.2,-)) de E. coli se clonó en pETDuet-1 digerido con NdeI/Avrll (pETDuet-1, descrito en el presente documento, está disponible de EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA).

Se clonó el gen fadD (SEQ ID NO: 492) que codifica para acil-CoA sintasa de E. coli en un pCDFDuet-1 digerido con 15 NcoI/HindIll. La tabla 15 proporciona un resumen de los plásmidos generados para preparar varias cepas de producción a modo de ejemplo. Un experto habitual en la técnica apreciará que pueden usarse diferentes plásmidos y modificaciones genómicas para lograr cepas similares.

La producción de cetonas alifáticas aumentó cuando se expresaba oleA en cada una de las cepas de E. coli con diferentes alteraciones en fadE, fadD y/o tesA descritas anteriormente (véase la figura 10). Por ejemplo, la 20 sobreexpresión de ‘tesA de E coli (pETDuet-1-’tesA) en un sistema logró un aumento de 2,6 veces en la producción de cetonas alifáticas en comparación con E. coli C41(DE3) que expresa proteína OleA. En otro ejemplo, la expresión de oleA en la cepa que combina la sobreexpresión de ‘tesA y fadD de E. coli con una deleción de fadE logró un aumento de 5 veces en la producción de cetonas alifáticas en comparación con E. coli C41(DE3) que expresa proteína OleA. 25

Los resultados de este ejemplo demuestran la capacidad para observar aumentos en cetonas alifáticas producidas por células bacterianas que expresan oleA en combinación con alteraciones en genes implicados en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos de la célula.

EJEMPLO 9

Este ejemplo demuestra que la expresión de oleA, oleC y oleD en células en las que la ruta de biosíntesis de ácidos 30 grasos se ha alterado da como resultado una producción de olefinas potenciada.

Se expresaron oleA, oleC y oleD en las cepas de E. coli descritas en el ejemplo 8. Las bacterias recombinantes resultantes se cultivaron, se indujeron, se sedimentaron y se extrajeron usando el método de fermentación 2, el método de extracción 1 y el método de detección 1. Las olefinas resultantes observadas mediante CG/EM eran monoinsaturadas, diinsaturadas y triinsaturadas que oscilaban en longitud de cadena de carbono entre C27 y C31. 35

La expresión de oleA, oleC y oleD en cepas de E. coli que combinan la sobreexpresión de ‘tesA y fadD con una deleción de fadE dio como resultado un aumento de cuatro veces en la cantidad de olefinas observadas en comparación con la cepa de E. coli que expresa oleA, oleC y oleD en los antecedentes de E. coli silvestre (véase la figura 11).

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que se observan cantidades 40 significativamente aumentadas de olefinas en células en las que se expresan oleA, oleC y oleD en combinación con alteraciones en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos.

EJEMPLO 10

Este ejemplo demuestra que se observan aldehídos, cetonas alifáticas y olefinas en un ensayo in vitro que contiene OleA y OleD. 45

Se expresaron proteínas OleA y OleD etiquetadas con His en E. coli C41(DE3) fadE usando medio TB instantáneo de expresión durante la noche según el protocolo del fabricante (Novagen, CA). Se purificaron las proteínas usando cromatografía en columna His Bind usando NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM, imidazol 5 mM pH 7,9 y Tris(hidroxipropil)fosfina (THP) 1 mM (tampón de unión 1X). A esto le siguió NaCl 500 mM, imidazol 60 mM, Tris-HCl 20 mM pH 7,9 y THP 1 mM (tampón de lavado 1X) según las instrucciones en el protocolo de usuario TB054 Rev. 50 F0106 (Novagen de EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA). Se eluyó la proteína OleA de las columnas His-bind usando imidazol 1 M, NaCl 0,5 M y Tris-HCI 20 mM pH 7,9. Se eluyó la proteína OleD de la columna His-bind usando NaCl 0,5 M, EDTA 100 mM y Tris-HCI 20 mM pH 7,9. Se intercambió el tampón de todas las proteínas a Tris

50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, THP 1 mM y glicerol al 10% usando columnas PD-10 según el protocolo del fabricante (GE Healthcare, NJ).

Se usaron las proteínas OleA y OleD purificadas, etiquetadas con His en un ensayo in vitro. La reacción de ensayo in vitro contenía miristoil coenzima A 1 mM, MgCl2 10 mM, OleA 2,3 M, OleD 2,4 M, NADPH 10 mM y tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 l. La NADPH usada en este ensayo se obtuvo de Sigma 5 (N7505, St Louis MO) y se preparó como disolución madre 100 mM en Tris pH 7,5 50 mM. Se incubaron muestras a 37ºC durante 1 hora. Se extinguió la reacción con 500 l de acetato de etilo que contenía ácido acético al 1%. Se mezcló la mezcla agitando con vórtex seguido por centrifugación. Se transfirió la fase superior (fase de acetato de etilo) a un tubo de vidrio limpio y se secó a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, Eppendorf, Westbury, NY). Se resuspendió la muestra en 40 l de acetato de etilo y 10 l de disolución 0,1 mg/ml de hexacosano (preparada en 10 acetato de etilo), que actuó como adición conocida de control, y se analizó mediante CG/EM (tiempo de ejecución: 37,33 minutos; columna: HP-5-MS (5% de difenilsiloxano, 95% de dimetilsiloxano) n.º de parte 19091S-433E, longitud: (metros) 30, diámetro interno: orificio estrecho de (mm) 0,25, película: (M) 0,25; intervalo de barrido de MSD: 50-550 m/z; inyector: entrada Agilent 6890 N de 1 l; entrada: 300ºC sin desdoblamiento; gas portador: Helio (velocidad de flujo: 1,3 ml/min); temp. del horno: 3 minutos mantenida a 60ºC; 15ºC/minuto hasta 320ºC; 17 minutos 15 mantenida a 320ºC; det.: Agilent 5975B XL EI/CI MSD; temp. de det.: 300ºC). Se analizaron entre 1 y 10 l par determinar el contenido en hidrocarburos.

Los aldehídos, cetonas y olefinas resultantes detectados mediante CG/EM fueron tetradecanal, 14-heptacosanona e isómeros de heptacosano (véase la figura 12A-E). Los compuestos se identificaron basándose en el tiempo de retención y los perfiles espectrales de EM. 20

Los resultados del experimento reflejado en este ejemplo demuestran la capacidad para observar aldehídos, cetonas alifáticas y olefinas usando OleA y OleD en un ensayo in vitro. Específicamente, estos resultados demuestran que se observan aldehídos, cetonas alifáticas y olefinas tras la incubación de OleA y OleD en presencia de miristoil coenzima A, MgCl2 y NADPH en un ensayo in vitro.

EJEMPLO 11 25

Este ejemplo demuestra que la cantidad de aldehídos y olefinas observadas en un ensayo in vitro que comprende un sustrato de acil coenzima A, OleA y OleD se potencia significativamente cuando se añade proteína OleB purificada al ensayo in vitro.

Se expresaron proteínas OleA y OleD etiquetadas con His y se purificaron usando cromatografía en columna His Bind tal como se describe en el ejemplo 10. Se expresaron proteínas OleB etiquetadas con His y se purificaron 30 usando el método descrito en el ejemplo 10. Se eluyeron las proteínas OleA y OleB de las columnas His-bind usando imidazol 1 M, NaCl 0,5 M y Tris-HCl 20 mM pH 7,9. Se eluyó la proteína OleD de la columna His-bind usando NaCl 0,5 M, EDTA 100 mM y Tris-HCl 20 mM pH 7,9. Se intercambió el tampón de todas las proteínas a Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, THP 1 mM y glicerol al 10% usando columnas PD-10 según el protocolo del fabricante (GE Healthcare, NJ). 35

Se usaron las proteínas OleA, OleD y OleB purificadas, etiquetadas con His en un ensayo in vitro. La reacción de ensayo in vitro contenía miristoil coenzima A 1 mM, MgCl2 10 mM, OleA 2,3 M, OleD 2,4 M, OleB 2,3 M, NADPH 10 mM y tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 l. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora. Se extinguió la reacción con 500 l de acetato de etilo que contenía ácido acético al 1%. Se mezcló la mezcla agitando con vórtex seguido por centrifugación. Se transfirió la fase superior (fase de acetato de etilo) a un 40 tubo de vidrio limpio y se secó a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, Eppendorf, Westbury, NY). Se resuspendió la muestra en 40 l de acetato de etilo y 10 l de disolución 0,1 mg/ml de hexacosano (preparada en acetato de etilo), que actuó como adición conocida de control, y se analizó mediante CG/EM. Se analizaron entre 1 y 10 l para determinar la cantidad de aldehídos, cetonas alifáticas y olefinas presentes.

Los aldehídos, cetonas alifáticas y olefinas resultantes detectados mediante CG/EM fueron tetradecanal, 14-45 heptacosanona e isómeros de heptacosano (véanse las figuras 13A-C). Se identificaron los compuestos basándose en el tiempo de retención y perfiles espectrales de EM. Se evaluó área bajo el pico (AP) para cada compuesto usando el software MSD ChemStation (Agilent technologies). Se calcularon los valores relativos normalizando cada uno de los productos de reacción producidos por OleA/OleD a 1,0 (por ejemplo, aldehído producido por OleA+ OleD+ OleB = AP (reacción de OleA+ OleD+ OleB) / AP (reacción de OleA+ OleD)). En la tabla 21 se muestran los 50 valores relativos de aldehído, olefinas y cetonas alifáticas producidos por OleA+OleD y OleA+OleD+OleB.

TABLA 21

Reacción: Aldehído Olefinas Cetona alifática


: C27:1 Olefina 1 C27:1 Olefina 2

OleA+ OleD: 1 1 1 1

OleA + OleD + OleB: 8,3 8,2 8,2 0,2

Los resultados del experimento reflejado en este ejemplo demuestran que la cantidad de aldehído u olefina observada en un ensayo in vitro que comprende OleA, OleD y OleB es mayor que la cantidad de aldehído u olefina observada en un ensayo in vitro que comprende OleA y OleD.

EJEMPLO 12

Este ejemplo demuestra que pueden convertirse ácidos grasos en olefinas por bacterias que expresan un gen de 5 acil-CoA sintasa en combinación con los genes de olefina sintasa (oleA, oleB, oleC y oleD).

El gen de acil-CoA sintasa convierte ácidos grasos libres en acil graso-CoA activados, uno de los sustratos para los genes de olefina sintasa. Se transformaron varias cepas huésped diferentes con un gen de acil-CoA sintasa. Se usaron los genes de olefina sintasa en una serie de experimentos de bioconversión. Todas las cepas huésped dieron resultados similares y se produjeron usando técnicas de biología molecular convencionales con los plásmidos 10 descritos en el ejemplo 1. Se usaron las siguientes cepas huésped para generar los datos mostrados en este ejemplo: Huésped 1: E. coli MG1655 fadE transformada con el operón de olefina sintasa pCL1920pTrcOleABpTrcOleCD (SEQ ID NO: 78) y el plásmido de sobreexpresión de acil-CoA sintasa FadD pACYCpTrcFadD.

Huésped 2: E. coli C41 (DE3) fadE transformada con el operón de olefina sintasa pCL1920pTrcOleABpTrcOleCD 15 (SEQ ID NO: 78) y el plásmido de sobreexpresión de acil-CoA sintasa FadD pETDuetFadD.

Se realizaron experimentos de bioconversión usando el procedimiento de fermentación de 25 ml descrito en el ejemplo 1. En el momento de la inducción, se añadieron ácidos grasos libres al medio de cultivo hasta una concentración final de entre el 0,01% y el 0,05% en peso por volumen de ácido graso. Se usó el método de cultivo de células completas de 1 ml para extraer los hidrocarburos. Se analizaron los productos usando CG/EM tal como se 20 describe en el ejemplo 1.

Los hidrocarburos detectados mediante CG/EM eran cadenas mono-, di- y triinsaturadas que oscilaban entre C19 y C33. En la tabla 22 se muestran el tipo sustratos de ácido graso añadidos a las fermentaciones y los productos de olefinas que se detectaron. La cantidad y el tipo de olefina detectada variaban dependiendo del tipo de sustrato de ácido graso que se añadiera al medio de cultivo. Esto es lo más notable cuando las cepas producen olefinas que no 25 se detectan en la cepa de control, que no se alimentó. Por ejemplo, la tabla 22 muestra que un ácido graso C10 se convierte en una olefina C19:1, lo que reflejaría la condensación de dos moléculas de acil graso-CoA C10. También se forman olefinas C23:1 y C23:2. Esto refleja la condensación del acil graso CoA C10 con un éster activado con acil graso C14:0 o C14:1, que se produce de manera natural por la cepa huésped de E. coli. Se forman olefinas de cadena más larga tales como C31:3 cuando la célula convierte ácidos grasos C16:1 en olefinas. Cuando se 30 alimentaron sustratos de ácidos grasos no nativos, tales como los ácidos grasos de cadena impar C13, C15 y C17, se detectaron olefinas de cadena par únicas de C26, C28 y C30. Esto sugiere que los ácidos grasos exógenos están convirtiéndose en olefinas.

TABLA 22

Olefina producida (mg/l/DO): Alimentación de ácidos grasos de longitud de cadena diferente

Ninguno: C10 C12 C13 C14 C15 C17 C14:1 C16:1* C18:1

019:1: 0,32

023:2: 0,60

023:1: 0,44 0,82

025:2: 0,73 0,82 0,01 0,02 0,11 0,06

025:1: 0,30 0,50 1,37 0,10 0,34 0,04

026:2: 1,05

026:1: 0,72

027:3: 0,60 0,15 0,17 0,33 0,18 0,44 0,40 2,20 0,31 0,85

027:2: 0,97 0,29 0,84 0,46 2,33 0,40 0,43 13,72 0,62 1,50

027:1: 0,28 0,14 0,44 0,35 5,29 0,35 0,10 0,12 0,51

028:2: 0,76 0,60

028:1: 0,55 0,26

029:3: 0,46 0,17 0,23 0,42 0,14 0,78 0,50 1,32 2,00 0,85

029:2: 0,58 0,24 0,34 0,54 1,01 0,56 0,41 5,70 1,39 1,10

029:1: 0,15 0,10 0,13 0,24 0,80 0,40 0,17 0,82 0,44

030:2: 0,03 0,40

030:1: 0,06 0,14

031:3: 0,04 0,02 0,16 0,04 0,27 0,11 0,15

031:2: 0,03 0,01 0,14 0,05 0,12 0,08 0,34 2,00 0,20

033:3: 1,39

*cultivo realizado usando E. coli C41 (DE3) fadE, en lugar de E. coli MG 1655 fadE

La bioconversión de ácidos grasos potenció la producción total de olefinas en la mayoría de los experimentos. Por ejemplo, la cantidad total de olefina producida tras la alimentación de ácidos grasos C13, C14, C14:1 y C16:1 aumentó más de dos veces en comparación con la cantidad de olefina producida en la cepa de control que no se alimentó (véase la tabla 23).

TABLA 23 5

Bioconversión de ácidos grasos en olefinas

Ácido graso: DO600 Olefina total (mg/l/DO)

Ninguno: 1,51 3,13

C10: 1,62 3,47

C12: 1,89 4,3

C13: 3,53 7,18

C14: 2,78 9,96

C15: 3,45 4,71

C17: 2,55 2,18

C14:1: 2,4 24,44

C16:1: 3,79 7,95

C18:1: 2,24 5,7

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que la expresión de OleA, OleB, OleC, OleD y FadD en E. coli da como resultado la producción de olefinas derivadas de ácidos grasos exógenos y endógenos. Además, los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que la expresión de OleA, OleB, OleC, OleD y FadD en bacterias alimentadas con ácidos grasos da como resultado la bioconversión de ácidos grasos en olefinas y un aumento significativo en la producción total de olefinas. Además, este ejemplo 10 demuestra que la bioconversión puede usarse para controlar los tipos de olefinas producidas por el huésped.

EJEMPLO 13

Este ejemplo demuestra que pueden convertirse ácidos grasos en cetonas alifáticas por bacterias que expresan un gen de acil-CoA sintasa en combinación con la enzima de condensación de acilos OleA.

El gen de acil-CoA sintasa convierte ácidos grasos libres en acil graso-CoA activados, uno de los sustratos para la 15 reacción de condensación de acil-CoA de OleA.

Se usó la siguiente cepa huésped para generar los datos mostrados en este ejemplo: E. coli MG1655 fadE, con un gen fadD expresado de manera constitutiva generado reemplazando el promotor nativo por un promotor T5 constitutivo (véase el ejemplo 1), transformada con el plásmido pCL1920pTrcOleA para la expresión de OleA (véase el ejemplo 1 para una descripción de este plásmido). Se cultivó la cepa huésped, se indujo con IPTG y se 20 alimentaron ácidos grasos de diferente longitud de cadena según los procedimientos descritos en el ejemplo 12. Se usó el método de cultivo de células completas de 1 ml para extraer los hidrocarburos. Se analizaron los productos usando CG/EM tal como se describe en el ejemplo 1.

Los hidrocarburos detectados mediante CG/EM eran cetonas alifáticas saturadas así como mono- y diinsaturadas que oscilaban entre C19 y C31 (véase la tabla 24). En la tabla 18 se muestran el tipo de ácido graso añadido a las 25 fermentaciones y las cetonas alifáticas que se observaron. Se produjeron cetonas alifáticas de cadena de carbono de número par tras la alimentación de ácidos grasos no nativos tales como C13, C15 y C17.

TABLA 24

Cetona alifática producida (mg/l/DO): Alimentación de ácidos grasos de longitud de cadena diferente

Ninguno: C10 C12 C13 C14 C15 C17 C14:1 C16:1 C18:1

25:1: 0,10 0,01 0,02 0,05 0,04

25:0

26:1: 0,05

26:0: 0,02

27:2: 0,06 0,39 0,72 0,19 0,26 0,97 1,46 0,85 0,85 0,53

27:1: 0,07 0,43 0,70 0,25 0,50 1,07 1,41 3,77 1,87 1,17

27:0: 0,01 0,05 0,11 0,04 0,14 0,14 0,21 2,58 0,42 0,36

28:1: 0,03 0,19 0,02

28:0: 0,02 0,07 0,01

29:2: 0,02 0,19 0,37 0,09 0,14 0,52 0,71 0,33 0,80 0,16

29:1: 0,02 0,13 0,27 0,08 0,21 0,60 0,70 1,37 1,41 0,16

29:0: 0,04 0,06 0,07 0,99 0,17

31:2: 0,03 0,12

31:1: 0,14

La bioconversión de ácidos grasos potenció la producción de cetonas alifáticas en todas las muestras sometidas a prueba con una potenciación mayor de 50 veces cuando se alimentó un sustrato preferido tal como C14:1 (véase la tabla 25).

TABLA 25

Bioconversión de ácidos grasos en cetonas alifáticas

Ácido graso: DO600 Cetonas alifáticas totales (mg/l/DO)

Ninguno: 3,53 0,19

C10: 3,43 1,20

C12: 4,26 2,28

C13: 4,29 0,78

C14: 5,48 1,29

C15: 4,09 3,65

C17: 4,04 4,59

C14:1: 4,63 9,91

C16:1: 4,15 5,83

C18:1: 4,18 2,42

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que la expresión de OleA y FadD en E. 5 coli dio como resultado la producción de cetonas alifáticas derivadas de ácidos grasos exógenos y endógenos. Además, los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que la expresión de OleA y FadD en bacterias alimentadas con ácidos grasos dio como resultado la bioconversión de ácidos grasos en cetonas alifáticas y un aumento significativo en la producción total de cetonas alifáticas. Este ejemplo demuestra que la bioconversión puede usarse para controlar los tipos de cetonas alifáticas producidas por la cepa huésped así como 10 para potenciar las cantidades de cetonas alifáticas producidas.

EJEMPLO 14

Este ejemplo demuestra modos para controlar los tipos de olefinas que pueden producirse en bacterias.

Con el fin de producir acil-CoA (un sustrato para la síntesis de cetonas alifáticas y olefinas) de diferente longitud de cadena en bacterias, se produjeron diferentes tioesterasas, incluyendo Uc FatB1 (Voelker et al., Science, 257: 72-74 15 (1992)), Ch FatB2 (Dehesh et al., Plant J., 9: 167-72 (1996)), ‘TesA (Cho et al., citado anteriormente) o Cc FatB1 (Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 92: 10639-43 (1995)) en combinación con una acil-CoA sintasa (FadD; EC 6.2.1.3). Con el fin de producir olefinas con diferentes longitudes de cadena, se combinaron variaciones en el tipo de sustratos de acil-CoA producidos (es decir, bacterias que expresan diferentes tioesterasas) con los genes de olefina sintasa oleA, oleB, oleC y oleD. 20

Se generaron varias cepas que demuestran la capacidad para producir una gama de olefinas con longitudes de cadena variables (véase la tabla 26). Todas las cepas se prepararon en el huésped de E. coli C41(DE3) fadE usando métodos de transformación convencionales, tales como electroporación o transformación química. Para mantener cada plásmido dentro de la cepa, se aplicó la selección con antibioticos apropiados a lo largo de todo el experimento. Se generó una cepa de control (OS333), que no contiene el plásmido de tioesterasa. Además, se 25 generaron cepas que expresan la combinación de una tioesterasa, una acil graso-CoA sintasa, y los genes de olefina. En el ejemplo 1 puede encontrarse una descripción detallada de la construcción de cada plásmido. En la tabla 26 se muestra una lista de las cepas usadas en este ejemplo.

TABLA 26

Cepa n.º: Olefina sintasa Acil-CoA sintasa Tioesterasa

OS333: pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD pACYCDuet-fadD Ninguna

OS335: pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD pACYCDuet-fadD pLS9-80 (Uc FatB1)

OS336: pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD pACYCDuet-fadD pLS9-82 (Ch FatB2)

OS338: pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD pACYCDuet-fadD pLS9-85 (‘TesA)

OS342: pCL1920pTrcOleABpTrcLOleCD pACYCDuet-fadD pLS9-77 (Cc FatB1)

Se realizaron fermentaciones de 25 ml convencionales y extracciones de cultivo de células completas de 1 ml 30 convencionales tal como se describe en el ejemplo 1. Se analizaron las muestras mediante el método de CG/EM descrito en el ejemplo 1. Se usó un patrón interno de hexacosano para determinar las cantidades de cada olefina producida (véase la tabla 27).

En 1962 Marr y Ingraham publicaron un artículo demostrando que la temperatura influye en el grado de saturación en los lípidos producidos por E. coli (Marr et al., J Bacteriol., 84: 1260-7 (1962)). Bajas temperaturas dan como resultado la producción de lípidos con un mayor grado de insaturación mientras que temperaturas más altas dan como resultado cantidades superiores de lípidos saturados. Para determinar si la temperatura influye en el grado de saturación, se realizaron las fermentaciones a dos temperaturas diferentes, 37ºC y 25ºC. La parte superior de la 5 tabla 27 muestra los resultados para fermentaciones realizadas a 37ºC, y la mitad inferior de la tabla 27 muestra los resultados para fermentaciones realizadas a 25ºC.

TABLA 27

Olefina ((mg/l)/unidad de DO600)

37ºC: C23:2 C23:1 C25:2 C25:1 C27:3 C27:2 C27:1 C29:3 C29:2 C29:1 C31:3 C31:2 C33:1 Total Unida-des de DO600

no TE: 0,354 0,253 0,037 0,314 0,423 0,050 0,168 0,012 1,611 3,105

UcFatB1: 0,150 0,591 0,106 0,633 0,488 0,114 0,459 0,383 0,014 0,168 3,106 1,342

ChFatB2: 0,936 0,729 0,095 0,793 1,093 0,136 0,273 4,055 1,754

tesA: 0,767 0,650 0,104 0,708 0,583 0,091 0,173 0,076 3,153 3,136

CcFatB1: 0,668 0,654 0,130 0,453 0,644 0,106 0,222 0,042 2,919 3,567

25ºC

no TE: 0,787 0,378 1,737 0,863 1,621 0,305 0,300 5,991 1,542

UcFatB1: 0,981 1,955 0,298 1,640 0,403 0,466 5,742 0,402

ChFatB2: 0,225 0,236 0,364 0,191 0,821 0,381 0,675 0,129 0,135 2,933 2,030

tesA: 0,069 1,175 1,201 0,263 2,599 1,589 0,173 1,255 0,094 8,417 2,192

CcFatB1: 0,335 0,118 2,168 2,384 0,533 2,300 1,424 0,179 1,818 0,684 0,191 12,135 3,168

La longitud de la olefina y el grado de insaturación se indican como CX:Y, en el que X representa el número de carbonos en la olefina e Y indica el número de dobles enlaces. 10

Los resultados reflejados en la tabla 27 demuestran que la expresión de una tioesterasa en combinación con una acil graso-CoA sintasa y genes de olefina sintasa produce olefinas con diferentes longitudes de cadena dependiendo de la tioesterasa usada. Pueden usarse tioesterasas tales como Uc FatB1, que se conoce como proteína portadora de lauroil-acilo tioesterasa con especificidad por acil graso-ACP C12:0, y Ch FatB2 para producir olefinas de longitud C23 y C25, que no se observan en la cepa de control. Estos resultados también demuestran que la cantidad de una 15 olefina específica, tal como olefina C27, puede potenciarse mediante la adición de una tioesterasa con especificidad por acil graso-ACP C14, tales como Cc FatB1. Alternativamente, la cantidad de C27 y C29 puede potenciarse mediante la adición de ‘TesA, que tiene especificidad por acil graso-ACP de longitud de cadena C14 y C16.

Los resultados expuestos en la tabla 27 también demuestran que la temperatura a la que se realiza la fermentación influirá en los tipos de olefinas que producen las bacterias. En particular, la temperatura influye en el nivel de 20 saturación de las olefinas producidas. Se forman olefinas con un único doble enlace a partir de la condensación de dos ácidos grasos saturados. Las fermentaciones realizadas a 37ºC dan como resultado la producción de olefinas con un grado de saturación superior en comparación con fermentaciones que se realizaron a 25ºC.

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que combinando genes de olefina sintasa con genes que producen acil graso-CoA de longitud de cadena diferente, puede controlarse la longitud de la 25 olefina producida. Además, los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que el grado de saturación en las olefinas producidas por las bacterias puede controlarse alterando las condiciones medioambientales, tales como la temperatura de las fermentaciones.

EJEMPLO 15

Este ejemplo demuestra que la expresión funcional de oleA en Saccharomyces cerevisiae da como resultado la 30 producción in vitro de cetonas alifáticas.

Se amplificó por PCR la secuencia de ácido nucleico de oleA mediante métodos convencionales a partir de un plásmido que contiene la secuencia del gen oleA de Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17679 (SEQ ID NO: 1) y se clonó en vectores de expresión de levaduras usando técnicas convencionales, tal como se describe en el presente documento. En resumen, se amplificó oleA (SEQ ID NO: 1) usando los cebadores LB217 (SEQ ID NO: 43) 35 y LF304 (SEQ ID NO: 44). Se clonó el producto de amplificación de oleA en pESC-HIS usando las enzimas de restricción Apal y Xhol creando el plásmido pESC-His-oleA (SEQ ID NO: 134).

Se transformaron entonces células de levadura de S. cerevisiae (BY4741) con o bien un plásmido que contiene oleA (SEQ ID NO: 134) o bien un plásmido que no contiene oleA. Se cultivaron las células de levadura transformadas para permitir la expresión de oleA. Se sedimentaron las células y luego se lisaron usando YeastBuster™ (Novagen, 40 Madison, Wl). Se añadió miristoil-CoA al lisado celular. Se extrajeron las cetonas alifáticas de la reacción usando ácido acético al 1% en acetato de etilo y se analizaron usando CG/EM, tal como se describe en el ejemplo 1.

Se identificó la cetona alifática 14-heptacosanona, una cetona alifática C27, mediante CG/EM en lisados celulares a partir de células de levadura transformadas con el plásmido de oleA pESC-His-oleA (véase la figura 14A). Esto demuestra que oleA puede expresarse en S. cerevisiae para producir cetonas alifáticas. Pueden usarse métodos similares para expresar oleA en cualquier célula de interés, preparar un lisado celular y posteriormente analizar la producción de cetonas alifáticas. 5

Los resultados del experimento reflejado en este ejemplo demuestran que puede expresarse oleA en S. cerevisiae conduciendo a la producción in vitro de cetonas alifáticas.

EJEMPLO 16

Este ejemplo demuestra que se observan olefinas y aldehídos deuterados en un ensayo in vitro que contiene OleA purificada, lisado celular que contiene OleD y NADPH deuterada. 10

Se produjo proteína OleA para estos experimentos mediante fermentación de E. coli C41(DE3) transformada con pET-21b(+)_OleA. Se purificó la OleA etiquetada con His tal como se describe en el ejemplo 10. Se produjo lisado celular de OleD para estos experimentos mediante fermentación de E. coli C41(DE3) transformada con pET-21b(+)_OleD usando medio TB instantáneo de expresión durante la noche según el protocolo del fabricante (Novagen, CA). Se usaron 10 ml de cultivo durante la noche para preparar los lisados celulares. Se centrifugó el 15 cultivo para concentrar las células para dar un sedimento. Se retiró el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento en 2 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0). Entonces se lisó la suspensión celular usando sonicación (5 veces en pulsos de 5 segundos 0,5 de potencia). Se añadieron 2 l de Benzonase® (Novagen, CA) al lisado celular y se mantuvo la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se usó este lisado celular como fuente de proteína OleD. 20

Se preparó deutero-NADPH según el siguiente protocolo. Se añadieron 5 mg de NADP+ y 3,6 mg de D-glucosa-1-d a 2,5 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0). Se inició la producción enzimática de NADPH marcada mediante la adición de 5 unidades de glucosa deshidrogenasa a partir de o bien Bacillus megaterium (USB Corporation) para la producción de R-(4-2H)NADPH o bien Thermoplasma acidophilum (Sigma) para la producción de S-(4-2H)NADPH. Se incubó la reacción durante 15 minutos a 37ºC, se filtró con centrífuga usando un filtro de centrífuga Amicon Ultra 25 de MWCO de 10 KDa (Millipore), se congeló inmediatamente en hielo seco y se almacenó a -80ºC.

La reacción de ensayo in vitro contenía miristoil coenzima A 0,1 mM, MgCl2 10 mM, 10 l de dilución 1/10 de lisado de OleD, 50 l de deutero-NADPH (preparada tal como se describió anteriormente), OleA 2,1 M y tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) en un volumen total de 0,1 ml. La miristoil coenzima A usada se obtuvo de Sigma (M4414, St Louis MO) y se preparó como disolución madre 10 mM en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Se incubaron las muestras a 37ºC 30 durante 1 hora. Se extinguió la reacción con 500 l de acetato de etilo que contenía ácido acético al 1%/ácido fórmico al 0,15%. Se mezcló la mezcla agitando con vórtex seguido por centrifugación. Se transfirió la fase superior (fase de acetato de etilo) a un tubo de vidrio limpio y se secó a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, Eppendorf, Westbury, NY). Se resuspendió la muestra en 40 l de acetato de etilo y 10 l de disolución 0,1 mg/ml de hexacosano (preparada en acetato de etilo), que actuó como adición conocida de control, y se analizó mediante 35 CG/EM. Se analizaron entre 1 y 10 l para detectar hidrocarburos específicos.

Los aldehídos y olefinas resultantes detectados mediante CG/EM eran tetradecanal e isómeros de heptacosano (véase la figura 15A-H). Debido a que la transferencia de hidruro a partir de NADPH es estereoespecífica, se sintetizaron tanto R-(4-2H)NADPH como S-(4-2H)NADPH. Se observaron aldehído y olefinas con una masa de más una unidad usando solo la R-(4-2H)NADPH. El hecho de que el aldehído y las olefinas estuvieran marcados indica 40 que el hidrógeno deuterado se ha transferido desde la NADPH marcada hasta la olefina o el aldehído marcado. Esto demuestra que se usa NADPH en la reacción enzimática. El hecho de que la transferencia de hidruro sea estereoespecífica es indicativo de una reacción enzimática.

Los resultados del experimento reflejado en este ejemplo demuestran que oleD codifica para un nucleótido de piridina oxidorreductasa. Además, estos resultados demuestran que OleD cataliza la transferencia de hidruro desde 45 NADPH hasta productos intermedios en biosíntesis de olefina, de manera que el hidruro transferido permanece en el producto de olefina. La transferencia de hidruro que se produce en presencia de OleA y miristoil CoA dio como resultado la detección de tanto C1-deutero-tetradecanal como C14-deutero, delta-13, heptacosano.

EJEMPLO 17

Este ejemplo demuestra la capacidad para sintetizar olefinas alifáticas in vitro. 50

Protocolo para la expresión de proteínas y la preparación de lisado para evaluar la actividad de proteínas OleA/B/C/D

Se usó E. coli C41(DE3) transformada con pETDuet_OleAB y pCOLADuet_OleCD para crear un lisado bacteriano que contenía las cuatro proteínas Ole (OleA, OleB, OleC y OleD).

Se hicieron crecer células de E. coli C41(DE3) transformadas con pETDuet_OleAB y pCOLADuet_OleCD en caldo 55

Luria que contenía kanamicina (concentración final 50 g/ml) y carbenecilila (concentración final 100 g/ml) hasta una DO600 de 0,5 - 1,0 a 37ºC. Entonces se indujeron los cultivos con IPTG 1 mM y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Se centrifugaron los cultivos que se hicieron crecer durante la noche a 3000 rpm durante 20 minutos. Se desechó el sobrenadante. Se congelaron los sedimentos a -80ºC para usarse más tarde. Se resuspendieron los sedimentos celulares obtenidos a partir de 10 ml de cultivos durante la noche inducidos en 2 ml de tampón y se 5 lisaron usando sonicación (5 veces en pulsos de 5 s a 0,5 de potencia). En el lisado sonicado, se añadieron 2 l de Benzonase® (Novagen, CA), y se mantuvo la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se usó este lisado como fuente de proteínas OleA, OleB, OleC y OleD.

Protocolo para la preparación de miristoil-ACP

Se sintetizó miristoil-ACP tal como se describe en Rock et al., Methods Enzymol., 72: 397-403 (1981), con algunas 10 modificaciones. En resumen, una mezcla de reacción que contenía ATP 5 mM, DTT 2 mM, Triton X-100 al 2%, LiCl 10 mM, sal de sodio de ácido mirístico 160 M, ACP-SH 65 M, MgCl2 10 mM, Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 y acil-ACP sintasa 1,5-3 g/ml en un volumen final de 1-4 ml se incubó a 37ºC durante 3 horas y luego se incubó durante la noche a 30ºC. La acil-ACP sintasa usada se adquirió de Invitrogen. Se diluyó la mezcla de reacción con tres volúmenes de agua y se valoró el pH hasta 6,0 con ácido acético. Se aplicó la disolución a una columna HiTrap 15 DEAE FF de 5 ml (GE Healthcare). Se lavó la columna con tres volúmenes de columna de bis-Tris-HCl 10 mM, pH 6,0, para eliminar el volumen del Triton X-100. Se eliminaron el Triton X-100 y el ácido graso libre residuales eluyendo la columna con tres volúmenes de columna de 2-propanol al 80%. Se aclaró el 2-propanol con tres volúmenes de columna de bis-Tris-HCl 10 mM, pH 6,0. Se eluyeron el miristoil-ACP y el ACP-SH sin reaccionar de la columna con 10 ml de LiCl 0,6 M en bis-Tris-HCl 10 mM, pH 6,0. Se intercambió el tampón del eluato que contenía 20 miristoil-ACP a tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7,0 y se concentró hasta 1 ml usando concentradores de 3 kDa de MWCO (Millipore). Se determinó la concentración de miristoil-ACP usando el ensayo de Bradford (BioRad) y análisis de densitometría en gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 12% NuPAGE (lnvitrogen) en dos etapas: en primer lugar, se determinó la concentración de proteína total de la fracción de C14-ACP/ACP-SH mediante un ensayo de Bradford (ensayo de proteína de BioRad); en segundo lugar, se calculó la concentración de C14-ACP como porcentaje de la 25 concentración de proteína total basándose en SDS-PAGE seguido por un análisis de densitometría. Se almacenó C14-ACP en tampón fosfato de Na 50 mM, pH 7,0 a -20ºC y era estable durante hasta 3 meses.

Un método para producir olefinas

Se usó E. coli C41(DE3) transformada con pETDuetOleAOleB y pCOLADuetOleCOleD para crear un lisado celular que contenía proteínas OleA, OleB, OleC y OleD tal como se describió anteriormente. La reacción de ensayo in vitro 30 contenía miristoil coenzima A 0,1 mM o miristoil-ACP 0,1 mM, MgCl2 10 mM, 360 l de lisado celular a partir de E. coli C41(DE3) transformada con pETDuetOleAOleB y pCOLADuetOleCOleD, NADPH 1 mM (Sigma, MO), ATP 1 mM (Sigma, MO), HSCoA 1 mM (Sigma, MO) y tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) en un volumen total de 1 ml. La miristoil coenzima A usada se obtuvo de Sigma (M4414, St Louis MO) y se preparó como disolución madre 10 mM en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora. Se extinguió la reacción con 5 ml 35 de acetato de etilo que contenía ácido acético al 1%/ácido fórmico al 0,1%. Se mezcló la mezcla agitando con vórtex seguido por centrifugación. Se transfirieron 4 ml de la fase superior (fase de acetato de etilo) a un tubo de vidrio limpio y se secó a vacío en una centrífuga (Vacufuge 5301, Eppendorf, Westbury, NY). Se resuspendió la muestra en 40 l de acetato de etilo y 10 l de disolución 0,1 mg/ml de hexacosano (preparada en acetato de etilo), que actuó como adición conocida de control, y se analizó mediante CG/EM. Se analizó 1 l para determinar 40 hidrocarburos específicos.

Las olefinas resultantes detectadas mediante CG/EM fueron C27:1, C27:2 y C27:3 (véanse las figuras 16A-C). La tabla 28 muestra el porcentaje de olefina C27:1 producida por lisados celulares de E. coli C41(DE3) transformada con pETDuetOleAOleB y pCOLADuetOleCOleD en presencia de C14-CoA o C14-ACP. Se calculó el porcentaje de olefina C27:1 mediante: [área de pico de C27:1/(área de pico de C27:1+área de pico de C27:2+área de pico de 45 C27:3)] x 100. Los resultados mostrados en la tabla 28 indican que la adición de C14-CoA o C14-ACP a lisado celular de E. coli C41(DE3) transformada con pETDuetOleAOleB y pCOLADuetOleCOleD conduce a un aumento en la cantidad de olefina C27:1. Esto indica que E. coli C41(DE3) transformada con pETDuetOleAOleB y pCOLADuetOleCOleD presentes en el lisado puede usar C14-CoA o C14-ACP para formar olefina C27:1.

TABLA 28 50

: % de C27:1 en alquenos C27

Lisado + C14-CoA: 47

Lisado + C14-ACP: 41

Lisado solo: 24

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que puede usarse un ensayo in vitro que comprende miristoil-ACP o miristoil coenzima A en combinación con OleA, OleB, OleC y OleD para sintetizar olefinas.

Este ejemplo demuestra que las secuencias de proteínas OleA, OleB, OleC y OleD pueden usarse para identificar organismos que producen de manera natural hidrocarburos.

Se usó el programa bioinformático pBLAST para identificar secuencias de proteínas que pertenecen a las familias de proteínas OleA, OleB, OleC y OleD. Se identificó un pequeño número de organismos que contienen las cuatro secuencias de proteínas Ole agrupadas juntas (véase, por ejemplo, la tabla 1). De estos organismos, los siguientes 5 cuatro organismos se ha mostrado en la bibliografía que producen los tipos de olefinas descritos en el presente documento: Stenotrophomonas maltophilia, Kineococcus radiotolerans, especies de Chloroflexus y diversas especies de Micrococcus, incluyendo la Micrococcus luteus recientemente secuenciada (Tornabene et al., citado anteriormente, Suen et al., citado anteriormente, Morrison et al., citado anteriormente; van der Meer et al., citado anteriormente; Albro et al., citado anteriormente; Philips et al., citado anteriormente). Para confirmar que otros 10 organismos que contienen OleA, OleB, OleC y OleD producirán de manera natural olefinas, se seleccionó Arthrobacter aurescens TC1 (ATCC BAA-1386) de la tabla 1 para someter a prueba la producción de olefinas. No se ha notificado en la bibliografía que Arthrobacter aurescens TC1 produzca olefinas.

Se hizo crecer Arthrobacter aurescens TC1 en 100 ml de caldo de Corynebacterium que se compone de 10 g de peptona de caseína (digesto tríptico), 5 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl por litro en un frasco 15 de 500 ml con agitación a 30ºC durante 48 horas. Tras 48 horas, se extrajeron 5 ml del caldo según un método de extracción 1 modificado. Específicamente, tras la sedimentación inicial del cultivo celular, se resuspendió el sedimento en 1 ml de agua y volvió a centrifugarse para eliminar el caldo de cultivo residual. Se resuspendió el sedimento final en 100 l de agua. Se siguió el resto del método de extracción 1 (véase el ejemplo 1). Se analizó el extracto mediante CG/EM usando el método de detección 1. Las olefinas detectadas mediante CG/EM fueron olefina 20 monoinsaturada C29 (véase la figura 19A-B).

Los resultados reflejados en este ejemplo demuestran que organismos con secuencias de proteína para OleA, OleB, OleC y OleD producen olefinas. Además, este ejemplo demuestra que puede usarse bioinformática para identificar organismos que producen olefinas identificando organismos con OleA, OleB, OleC y OleD en su secuencia de proteínas. Más específicamente, estos ejemplos demuestran que Arthrobacter aurescens TC1, que tiene las 25 secuencias de proteínas OleA, OleB, OleC y OleD, produce olefina monoinsaturada C29.

EJEMPLO 19

Este ejemplo demuestra que las olefinas de base biológica pueden distinguirse de las olefinas a base de petróleo. En particular, este ejemplo demuestra que las olefinas producidas por organismos, tales como E. coli que expresa los genes oleA, oleB, oleC y oleD, pueden distinguirse de las olefinas a base de petróleo. 30

Se compararon olefinas de base biológica purificadas producidas mediante fermentación de E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD con una olefina a base de petróleo, (Z)-9-tricoseno (97%, Sigma-Aldrich, número CAS: 27519-02-4), usando técnicas de datación de carbono convencionales. Se enviaron las muestras a Beta Analytic, Inc. (Miami, FL, EE.UU.) para las pruebas. Se midió el contenido de carbono de base biológica de las muestras usando espectrometría de masas con acelerador (AMS) basándose en la norma ASTM 06866. La AMS 35 mide la razón de isótopos de carbono de 13C con respecto a 12C y 14C en grafito derivado de los polvos de muestra. Entonces se calculó el contenido de carbono de base biológica a partir de la razón de isótopos de carbono de 13C con respecto a 12C y la cantidad de 14C presente.

Se produjeron las muestras de olefina analizadas y se purificaron usando el siguiente método. Se hizo crecer E. coli C41(DE3); pETDuet-1_OleAB; pCOLADuet-1_OleCD en 5 ml de medio LB complementado con carbenicilina 40 100 mg/l y kanamicina 50 mg/l durante 12 horas. Se usó este cultivo de 12 horas para inocular un cultivo mayor compuesto por 200 ml de medio de frasco de agitación F1 que contenía: KH2PO4 3 g/l, K2HPO4 6,62 g/l, (NH4)2SO4 4 g/l, MgSO4 0,15 g/l, glucosa 5 g/l (dextrosa DX0145-5 EMD Chemicals, Inc. NJ), 1,25 ml/l de disolución de oligoelementos y 1,25 ml/l de disolución de vitaminas traza complementado con carbenicilina 100 mg/l y kanamicina 50 mg/l. La disolución de oligoelementos contenía por litro: 27 g de FeCl3·6H2O, 2 g de ZnCl2·4H2O, 2 g de 45 CaCl2·6H2O, 2 g de Na2MoO4·2H2O, 1,9 g de CuSO4·5H2O, 0,5 g de H3BO3 y 100 ml de HCI concentrado. La disolución de vitaminas traza contenía por litro: 0,42 g de riboflavina, 5,4 g de ácido pantoténico, 6 g de niacina, 1,4 g de piridoxina, 0,06 g de biotina y 0,04 g de ácido fólico. Se usaron 50 ml de cultivo simiente para inocular un biorreactor Biostat Aplus de 2 l (Sartorius BBI) que contenía inicialmente 1 l de medio de fermentación F1 esterilizado. El medio de fermentación F1 esterilizado contenía: KH2PO4 1,5 g/l, K2HPO4 trihidratado 4,34 g/l, 50 (NH4)2SO4 4 g/l, MgSO4 heptahidratado 0,150 g/l, glucosa filtrada estéril 5 g/l (dextrosa EMD Chemicals, lnc. NJ), 1,25 ml/l de disolución de oligoelementos, 1,25 ml/l de disolución de vitaminas traza y antibióticos a la misma concentración que se utilizó en el frasco de agitación. Se mantuvo el pH del cultivo a 7,2 usando H2SO4 1 M y NH4OH al 30% p/v. Se mantuvo la temperatura a 37ºC, la velocidad de aireación a 2 lpm (2 v/v/m) y la tensión de oxígeno disuelto al 30% de saturación, utilizando un bucle de agitación en cascada al controlador de DO. Se controló 55 la formación de espuma mediante la adición automatizada de una disolución esterilizada en autoclave de Antifoam 204 (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). Se proporcionó una alimentación de nutrientes compuesta por (NH4)2SO4 60 g/l, MgSO4 heptahidratado 3,9 g/l, glucosa 430 g/l, 10 ml/l de la disolución de oligoelementos y 10 ml/l de la disolución de vitaminas en condiciones de fermentación aerobias durante 48 horas en el fermentador. La fuente de azúcar de glucosa para las fermentaciones se derivó de maíz. 60

Se proporcionó una alimentación de nutrientes compuesta por (NH4)2SO4 60 g/l, MgSO4 heptahidratado 3,9 g/l, glucosa 430 g/l, 10 ml/l de la disolución de oligoelementos y 10 ml/l de la disolución de vitaminas cuando se agotó el medio inicial (aproximadamente 6 horas tras la inoculación). Se aumentó o disminuyó gradualmente la alimentación de nutrientes durante la fermentación para mantener un nivel de glucosa residual en el medio de menos de 10 g/l. Se indujo la producción de olefinas en el biorreactor cuando el cultivo logró una DO600 de 30 UA (aproximadamente 5 8-9 horas tras la inoculación) mediante la adición de una disolución madre de IPTG 1 M hasta una concentración final de 1 mM. También se disminuyó la temperatura de la fermentación en la inducción hasta 30ºC. Se cosechó el biorreactor aproximadamente 48 horas tras la inducción.

Tras 48 horas, se centrifugaron los cultivos de fermentación a 3500 rpm durante 20 minutos (centrífuga Allegra X-15R con rotor SX-4750A, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Se resuspendió el sedimento celular en 50 ml de agua 10 destilada estéril. Se añadieron 100 ml de metanol a la muestra que entonces se sonicó en un baño de agua de sonicación durante 60 minutos. Se transfirió la mezcla a un embudo de separación de 1 l en donde se añadió n-hexano hasta un volumen final de 750 ml. Se mezcló la muestra bien mediante agitación suave, tras lo cual la mezcla se asentó para separar la fase de hexano de la fase acuosa. Una vez que se formó la bicapa, se extrajo mediante sifón la fase acuosa inferior del embudo de separación. Se añadió Na2SO4 a la fase orgánica restante para 15 eliminar cualquier H2O en exceso en la fase orgánica. Entonces se filtró la fase orgánica dos veces a través de un filtro de 150 mm Whatman n.º 4 sin aplicar vacío. Se transfirió la fase orgánica filtrada dos veces a un matraz de fondo redondo conectado a una columna de destilación. Se eliminaron el hexano y la acetona mediante destilación con la temperatura fijada a 56ºC seguido por 66-68ºC. La muestra restante era de color negro. Para purificar adicionalmente la muestra, se filtró la muestra a través de una columna gel de sílice 60 de 200 ml (tamaño de 20 partícula 0,063 - 0,300 mm, 70-230 de malla ASTM). Se retiró la muestra de la columna mediante elución con hexano. Se eliminó el hexano del eluyente que contenía olefina mediante un evaporador rotatorio a temperatura ambiental. Se usó Magnesol D-sol (Dallas Group of American, lnc) en el procedimiento de purificación final. Se resuspendió la muestra en metil terc-butil éter (MTBE) hasta un volumen final de 8 ml. Se añadió magnesol a la muestra en una razón 10:1 de magnesol frente a muestra (p/v). Se mezcló la mezcla de muestra-magnesol durante 25 1 hora a 37ºC en un agitador rotatorio. Se filtró la mezcla a través de un filtro de PTFE de 0,2 m al interior de un vial de centelleo de 20 ml. Se lavó el sólido restante con 2,5 ml de MTBE. Se combinaron el lavado y la mezcla filtrada en un vial de centelleo. Se evaporó el MTBE en la campana extractora para productos químicos a temperatura ambiental.

Se determinó 14C por AMS en Beta Analytic, Inc., usando la norma ASTM D6866 método B. Se obtuvo el contenido 30 de carbono de base biológica derivando la razón de 14C en la muestra con respecto al de un patrón de referencia moderno. La razón se notifica como porcentaje con las unidades ‘pMC’ (porcentaje de carbono moderno).

El patrón de referencia moderno usado en la datación de radiocarbono es un patrón de NIST (National Institute of Standards and Technology) con un contenido en radiocarbono conocido equivalente a aproximadamente el año 1950 DC. Se eligió 1950 DC puesto que representa un tiempo antes de que las pruebas con armas termonucleares 35 introdujeran grandes cantidades de 14C en la atmósfera con cada prueba (el 14C en exceso se conoce como “carbono de bombas”). Para un arqueólogo o geólogo que usa dataciones de 14C, 1950 DC es igual “cero años de edad”. Esto también representa 100 pMC. El “carbono de bombas” en la atmósfera alcanzó casi el doble del nivel normal en 1963 en el máximo de las armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores que son superiores a 100 pMC para plantas y animales vivos 40 desde 1950 DC. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor actual próximo a 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como maíz, tendrá una firma de 14C próxima a 107,5 pMC. Los compuestos a base de petróleo tendrán un valor de pMC de cero. Combinar carbono fósil con carbono actual dará como resultado una dilución del contenido de pMC actual. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido de 14C de los materiales de biomasa actuales y 0 pMC representa el contenido de 14C de los productos a base de 45 petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componentes. Por ejemplo, un material derivado al 100% de semillas de soja actuales dará una firma de radiocarbono próxima a 107,5 pMC. Si ese material se diluyó al 50% con productos a base de petróleo, daría una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC.

Un contenido de carbono de base biológica se deriva asignando el 100% igual a 107,5 pMC y el 0% igual a 0 pMC. 50 Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC dará un contenido de carbono de base biológica equivalente del 93%. Este valor se denomina el resultado de carbono de base biológica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originaron o bien de material biológico actual o bien de material a base de petróleo.

La razón de isótopos de carbono estables (13C/12C) en un material derivado biológicamente dado es una consecuencia de la razón de 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en el que se fija el dióxido 55 de carbono. También refleja la ruta metabólica precisa de la planta que fija dióxido de carbono. La razón de 13C/12C se expresa normalmente como 13C que se calcula tal como sigue:

13C (‰) = [(13C/12C)muestra - (13C/12C)patrón] / (13C/12C)patrón x 1000

La 13C de petróleo y plantas C4 (maíz, sorgo, etc.) tienen un intervalo similar (desde -7 hasta -13 ppt), mientras que 13C/12C de plantas C3 (trigo, avenas, arroz, etc.) disminuye en un intervalo de desde -19 hasta -27 ppt (véanse, por 60

ejemplo, Stuiver et al., citado anteriormente, y Gupta, et al., Radiocarbon dating practices at ANU. Handbook, Radiocarbon Dating Laboratory, Research School of Pacific Studies, ANU, Canberra (1985)). La diferencia del valor de 13C para plantas C4 y C3 se debe al ciclo fosfosintético diferente de cada planta.

En la tabla 29 se enumeran los valores de pMC y 13C del producto de olefina de base biológica y el 9-tricoseno a base de petróleo. 5

TABLA 29

: pMC 13C (‰) Contenido de base biológica medio, %

Producto de olefina: 94,2  0,4 -12,3 88

Cis-9-tricoseno: 0  0 -30,5 0

Basándose en los resultados de 14C, la olefina de fase biológica producida por E. coli tiene un contenido de carbono que se deriva al menos al 88% de carbono de base biológica. Es posible que el MTBE residual, un producto a base de petróleo usado durante la purificación, disminuya el contenido de carbono de base biológica en la muestra de olefina. Además, el valor de 13C del producto de olefina de base biológica proporciona pruebas adicionales de que 10 el producto de olefina, y el carbono contenido en la misma, se deriva principalmente de una fuente biológica.

Los resultados de los experimentos reflejados en este ejemplo demuestran que los hidrocarburos de base biológica pueden distinguirse de los hidrocarburos a base de petróleo. En particular, este ejemplo demuestra que las olefinas producidas por organismos, tales como E. coli que expresa los genes oleA, oleB, oleC y oleD, pueden distinguirse de las olefinas a base de petróleo. 15

El uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y referentes similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” han de interpretarse como términos de extremos abiertos (es decir, que significan “que incluye, pero no se limita a”) a menos que se indique lo contrario. La 20 mención de intervalos de valores en el presente documento pretende meramente servir como método de abreviatura de la referencia individual a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el 25 contexto lo contradiga claramente de otra forma. El uso todos y cada uno de los ejemplos, o expresiones a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento, pretende meramente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación sobre el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención. 30

A lo largo de toda la memoria descriptiva, puede hacerse una referencia usando un nombre de polipéptido o nombre de gen abreviado, pero se entiende que tal nombre de polipéptido o gen abreviado representa el género de genes o polipéptidos. Tales nombres de genes incluyen todos los genes que codifican para el mismo polipéptido y polipéptidos homólogos que tienen la misma función fisiológica. Los nombres de polipéptidos incluyen todos los polipéptidos que tienen la misma actividad (por ejemplo, que catalizan la misma reacción química fundamental). 35

Los números de registro a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenido por el National Institute of Health, EE.UU. Los números de registro son tal como se proporcionan en la base de datos el 15 de abril de 2007.

Los números de EC los establece el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB) (disponible en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Los números de EC a los que se 40 hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos KEGG Ligand, mantenida por la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, patrocinada en parte por la Universidad de Tokyo. Los números de EC son tal como se proporcionan en la base de datos en abril de 2007.

En el presente documento se describen realizaciones preferidas de esta invención, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Pueden resultar evidentes variaciones de las 45 realizaciones preferidas para los expertos habituales en la técnica tras la lectura de la descripción anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Célula modificada genéticamente para expresar una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido de OleA que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 2, en la que la célula es una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de animal no humano, una célula de insecto, una célula bacteriana o una célula de 5 algas, y en la que el polipéptido de OleA está implicado en la biosíntesis de cetonas alifáticas u olefinas.
2. Célula según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica además para un polipéptido de OleC que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido de OleC está implicado en la biosíntesis de olefinas. 10
3. Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica además para un polipéptido de OleD que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 8, en la que el polipéptido de OleD está implicado en la biosíntesis de olefinas.
4. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica 15 además para un polipéptido de OleB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 10, en la que el polipéptido de OleB está implicado en la biosíntesis de olefinas.
5. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la célula se selecciona del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, 20 Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Stenotrophamonas, Kineococcus, Yarrowia o Streptomyces.
6. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la célula comprende una mutación en un gen que codifica para una acil-CoA deshidrogenasa. 25
7. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la célula comprende adicionalmente una acil-CoA sintasa.
8. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la célula comprende adicionalmente una tioesterasa.
9. Método para producir una olefina que comprende cultivar la célula según la reivindicación 3 ó 4 con un 30 sustrato en condiciones suficientes para producir dicho hidrocarburo.
10. Método para producir una cetona alifática que comprende cultivar la célula según la reivindicación 1 con un sustrato en condiciones suficientes para producir dicha cetona alifática.
11. Método para producir una cetona alifática que comprende incubar un sustrato con un polipéptido de OleA que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% 35 con SEO ID NO: 2 en condiciones suficientes para producir una cetona alifática.
12. Célula según la reivindicación 1, en la que los genes que codifican para OleC y/o OleD se delecionan o atenúan.
13. Método para producir una cetona alifática que comprende cultivar la célula según la reivindicación 12.
14. Método para identificar una enzima útil para la producción de olefinas que comprende 40

(a) transformar una célula que comprende polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en

(i) OleA y OleD,

(ii) OleA y OleC,

(iii) OleA, OleB y OleD, y

(iv) OleA, OleC y OleD, 45

con un ácido nucleico que codifica para una enzima que se sospecha que tiene la capacidad para producir olefinas; y

(b) determinar si la célula produce olefinas, en el que la existencia de producción de olefinas por la célula indica que el ácido nucleico codifica para un polipéptido útil para la producción de olefinas;

en el que el polipéptido de OleA comparte una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEO ID NO: 2, el polipéptido de OleC comparte una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEO ID NO: 6 y el polipéptido de OleD comparte una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEO ID NO: 8, en el que el polipéptido de OleA, el polipéptido de OleC y el polipéptido de OleD están implicados en la biosíntesis de olefinas. 5
15. Polipéptido de OleA aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO: 2.
16. Uso de un polipéptido de OleA aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO: 2 para producir cetonas alifáticas.