ES2647387T3

ES2647387T3 - Proceso para obtener anticuerpos

Info

Publication number: ES2647387T3
Application number: ES11702974.4T
Authority: ES
Inventors: Jean-Pascal Pierre Bilgischer; Philip Jonathan Bassett; Mark Robert Pearce-Higgins; Andrew John Kenny
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2011-02-02
Publication date: 2017-12-21
Anticipated expiration: 2031-02-02
Also published as: IL249501B; GB201001791D0; IL249501A0; US20220348641A1; US10487136B2; AU2011212493A1; CA2788967A1; PL3275896T3; US20130060009A1; EP2531526A1; IL221266A; HUE055717T2; HUE037191T2; LT2531526T; CN102812042A; BR112012019404B1; PT3275896T; EP2531526B1; BR112012019404B8; JP6141937B2

Abstract

Un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes seleccionados de un Fab, Fab modificado, un Fab de bisagra alterado, Fab', F(ab')2 o fragmento de Fv; un anticuerpo de cadena simple; un Fv de cadena simple, en el que los dominios variables de cadena pesada y de cadena liviana se unen por medio de un ligador de péptidos y un anticuerpo de especificidad dual, como un Fab-dAb que comprende a) cultivar una muestra de células huésped de bacterias gram-negativas transformadas con un vector de expresión que codifica una molécula de anticuerpo recombinante; b) añadir un tampón de extracción con un pH de 7,5 a 9 a la muestra; y c) someter la muestra a una etapa de tratamiento térmico dentro de un intervalo de 40 °C a 70 °C durante 1 a 24 horas; caracterizado por que el pH de la muestra se detecta después de la adición del tampón de extracción y se ajusta para asegurar que el pH de la muestra sea de 7 a 9 antes de la etapa de tratamiento térmico.

Description

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como 200 RPM. Sin embargo, la RPM apropiada variará según la escala del método.

Fermentación

La etapa de cultivo de una muestra de células huésped puede comprender la fermentación en cualquier escala deseada. En los métodos de la invención, una muestra puede ser el producto de una fermentación que comprende bacterias, en especial bacterias gram–negativas. Más preferiblemente, la muestra es el producto de una fermentación que comprende E. coli que expresa un anticuerpo recombinante, en donde dichos anticuerpos producidos pueden ser una mezcla mixture de anticuerpos funcionales y no funcionales. Si se desea, las células huésped se pueden someter a una colección del medio de fermentación, por ejemplo, células huésped se pueden coleccionar de la muestra por centrifugación, filtración o concentración. En particular, los métodos de la invención son apropiados para la producción industrial en gran escala de anticuerpos de calidad terapéutica.

Otras etapas

También se revela un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que comprende una o varias otras etapas.

Se revela en la presente temperatura ambiente un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que comprende una etapa de centrifugación después de la etapa de cultivo, seguido por suspensión de las células por adición del tampón de extracción.

El método puede comprender adicionalmente procedimientos de purificación primarios tales como filtración y/o centrifugación. También se incluye la cromatografía en lecho fluidizado. Los procedimientos de purificación corriente abajo preferidos incluyen cromatografía de intercambio iónico, microfiltración, ultrafiltración, diafiltración y captura en lecho fijo y captura en lecho expandido y combinaciones de cualquiera de ellos.

Etapa de tratamiento de no lisis

El método también puede comprender someter la muestra a una etapa de tratamiento de no lisis antes de someter la muestra a la etapa de tratamiento térmico. Esta etapa también se puede referir a una etapa de homogeneización (etapa homog.). La etapa de tratamiento de no lisis puede incrementar también el rendimiento de anticuerpos funcionales aislados u obtenidos y facilidad de manipulación de la muestra en una gran escala. La lisis causa un incremento en la viscosidad que puede causar problemas en el procesamiento corriente abajo y la purificación de anticuerpos funcionales. En particular, la lisis de células huésped causa la liberación de proteínas de células huésped que vuelven más costosa la purificación y consume más tiempo, ya que se pueden requerir más etapas de purificación y/o mayores cantidades de materiales de cromatografía se necesitarán para lograr la pureza requerida. La liberación sustancial del ADN de células huésped aumenta la viscosidad de la muestra que causa dificultades de filtración y centrifugación que es una causa principal de pérdida de proteínas durante la clarificación. Una muestra lisada (es decir, que contiene proteínas de células huésped y ADN) también puede causar el bloqueo de los materiales cromatográficos. La etapa de tratamiento de no lisis se lleva a cabo preferiblemente como se describe en el documento WO 2006/054063. La etapa de tratamiento de no lisis incluye cualquier tratamiento que no produce lisis de una proporción sustancial de las bacterias, células de mamíferos, levaduras, células de insectos u otro organismo usado para expresión de anticuerpos recombinantes, por ejemplo, de E. coli. En una realización de máxima preferencia, el tratamiento de no lisis comprende tratamiento a presión. De modo alternativo, el tratamiento de no lisis comprende una etapa de preacondicionamiento de agitación. Una "proporción sustancial" incluye una proporción del 80% o más de los organismos en una fermentación o cultivo presentes en forma intacta, más preferiblemente, más del 85%, incluso más preferiblemente, más del 90% y más preferiblemente, del 95% o más intacta.

La lisis se puede juzgar en cualquier forma conocida en la técnica, incluyendo: al mirar bajo un microscopio, análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y ensayo de proteína total versus proteína en sobrenadante y/o en un pellet de organismo (célula). En una realización, la lisis se puede juzgar después de un tratamiento de no lisis al comparar la proteína total en una muestra antes y después del tratamiento. Si un tratamiento causa la lisis, la proteína total presente en el sobrenadante de la muestra tratada se incrementará en comparación con la proteína total presente en dicha muestra no tratada, por ejemplo, medida usando un ensayo de Bradford. En una realización preferida, se lleva a cabo el análisis de FACS, en el que la muestra se rotula con una tintura fluorescente seguido por tratamiento de no lisado y análisis de FACS. Con máxima preferencia, el análisis de FACS se lleva a cabo antes del tratamiento para dar un valor basal para comparación.

De esta manera, el tratamiento de no lisis puede incluir el preacondicionamiento por resuspensión moderada durante un período de tiempo, por ejemplo, por agitación o por resuspensión manual como pipeteado en, por ejemplo, un tampón. En una realización, el preacondicionamiento se lleva a cabo durante 1 hora a 24 horas, preferiblemente entre 1 hora y 20 horas, más preferiblemente, entre 2 horas y 18 horas, 4 horas y 16 horas, 6 horas y 16 horas y más preferiblemente, durante 12, 14 ó 16 horas. De esta manera, el tiempo mínimo para el preacondicionamiento es de 1, 2 ó 4 horas y el máximo es de 16, 18 ó 24 horas. El preacondicionamiento se puede llevar a cabo por rotación de 50 a 250 rpm, preferiblemente de 60 rpm a 100 rpm y más preferiblemente, durante 14 ó 16 horas. Durante el preacondicionamiento, las células se mantienen a una temperatura dentro del intervalo de 4 °C a 30 °C, más preferiblemente, entre 4 °C y 20 °C y más preferiblemente, a temperatura ambiente.

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También se describe en la presente un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que también comprende someter la muestra a un tratamiento de no lisis incluyendo una etapa de preacondicionamiento que no comprende parte del proceso.

También se describe en la presente un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que también comprende un tratamiento de no lisis que comprende someter las células huésped a mayores presiones, por ejemplo, usando una prensa francesa o descompresión con nitrógeno. En un ejemplo específico, la muestra es el producto de una fermentación de E. coli, donde dicha E. coli expresa un anticuerpo recombinante, que se somete a tratamiento de presión en una prensa francesa. Las presiones pueden variar de 750 psi a aproximadamente 5000 psi

o aproximadamente. En una realización, el tratamiento de presión se lleva a cabo a 1000 psi o 1250 psi, 1500 psi, 1750 psi, 2000 psi, 2250 psi, 2500 psi, 2750 psi, 3000 psi, 3250 psi, 3500 psi, 4000 psi, 4250 psi, 4500 psi o 4750 psi. Con mayor preferencia, el tratamiento de presión se lleva a cabo entre 1000 psi y 3000 psi y más preferiblemente, a 2000 psi. El tratamiento de presión que es sustancialmente no lisis (es decir, que causa menos del 20% de lisis) se puede determinar por simple experimentación según el tampón y el tipo celular que comprende la muestra y la presión.

También se describe en la presente un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que no incluye una etapa de tratamiento de no lisis como se describió con anterioridad, como someter las células huésped a mayores presiones o preacondicionamiento por resuspensión moderada durante un período de tiempo. La inclusión de tal etapa de tratamiento de no lisis se conoce por mejorar al rendimiento de una proteína recombinante (documento WO 2006/054063). Sin embargo, se ha hallado sorprendentemente que el mayor rendimiento de anticuerpo se logra por medio del método de la presente invención con o sin tal etapa de tratamiento de no lisis. Por consiguiente, en la realización en la que el método no comprende una etapa de tratamiento de no lisis, la presente invención proporciona un medio más simplificado y rentable para proporcionar un anticuerpo recombinante.

Etapa de mantenimiento

Se revela en la presente también un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que comprende una etapa de interrupción del método entre la etapa de cultivo de la muestra de células huésped y antes de la adición del tampón de extracción. Durante la etapa de interrupción, la muestra se mantiene a una temperatura apropiada. Esta etapa de interrupción del método se lleva a cabo preferiblemente como se describe en el documento WO 2005/019466. Esta etapa también se puede mencionar como una etapa de mantenimiento de suspensión celular (CSH). Con preferencia, el método se interrumpe durante un período de al menos aproximadamente una hora, 1 hora a 72 horas, 12 horas a 48 horas, durante 12 horas, 24 horas, 33 horas o 48 horas.

La muestra se mantiene preferiblemente a una temperatura apropiada durante la interrupción del método, como 18 °C.

También se describe en la presente un método para la producción de moléculas de anticuerpos recombinantes que no incluye una etapa de interrupción después de la etapa de cultivo de la muestra de células huésped, tal como se describe en el documento WO 2005/019466. La inclusión de tal interrupción se conoce para mejorar el rendimiento de una proteína recombinante (documento WO 2005/019466). Se halló sorprendentemente que se logra una mejora similar de rendimiento del anticuerpo por medio del método de la presente invención con o sin tal etapa de interrupción, es decir, no se observó un mayor incremento del rendimiento cuando se incluía la etapa de interrupción en el método. Por consiguiente, el método que no comprende una etapa de interrupción proporciona un medio más simplificado y rentable para proporcionar un anticuerpo recombinante. Por consiguiente, el período de tiempo entre la etapa de cultivo de la muestra de células huésped y la etapa de adición del tampón de extracción puede ser inferior a 12 horas, preferiblemente 10 horas o menos, 5 horas o menos, 4 horas o menos, 3 horas o menos, 2 horas o menos o 1 hora o menos o menos de 1 hora.

Anticuerpo

Como se usa en la presente, ‘anticuerpo funcional’ incluye moléculas de anticuerpo que retienen la capacidad de reconocer específicamente o de unirse con el antígeno contra el que se criaron (antígeno cognado). La producción de un anticuerpo funcional se muestra por la presencia de una banda simple en SDS–PAGE no reductor correspondiente al peso molecular esperado del anticuerpo o por ensayo de unión directo usando BIAcore u otros métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, ELISA. Los anticuerpos no funcionales incluyen fragmentos que no reconocen su antígeno cognado e incluyen anticuerpos incorrectamente plegados o incorrectamente ensamblados, cadenas pesadas y livianas libres y sus fragmentos, incluyendo fragmentos parcialmente degradados de anticuerpos que no reconocen o se unen con su antígeno cognado.

En un ejemplo preferido, la molécula de anticuerpo recombinante es al menos parte de una cadena liviana de anticuerpo y al menos parte de una cadena pesada de anticuerpo, como al menos algunas de las moléculas de anticuerpo de cadena liviana y pesada expresada son capaces de combinarse para formar anticuerpo funcional.

Como se usan en la presente, ’anticuerpos’ incluyen anticuerpos que tienen cadenas pesadas y liviana de longitud total; fragmentos funcionalmente activos, sus derivados o análogos y pueden ser, pero sin limitación, VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, un Fab de bisagra alterado, Fab’, F(ab’)2 o fragmento Fv; un monómero o dímero de cadena liviana o de cadena pesada; un anticuerpo de cadena simple, por ejemplo, un Fv de cadena simple, en el que los dominios variables de cadena pesada y liviana se unen por medio de un ligador de péptidos o un anticuerpo de

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especificidad dual como un Fab–dAb, tal como se describe en el documento PCT/GB2008/003331.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, monoclonales, bi–, tri– o tetravalentes, humanizados o quiméricos. Estos anticuerpos y sus fragmentos pueden ser anticuerpos naturales, humanizados, quiméricos o injertados con CDR y se pueden usar técnicas de biología molecular estándar para modificar, añadir o suprimir aminoácidos o dominios según se desee. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o varias regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de las especies no humanas y una región de marco de una molécula de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, el documento US 5.585.089). Las moléculas de anticuerpo purificadas usando los métodos de la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o una subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los métodos para crear estas moléculas de anticuerpo se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341:544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322:323; Bird et al, 1988, Science, 242:423; Queen et al., US 5.585.089; Adair, WO 91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10:1–142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165–181).

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por medio de cualquier método conocido en la técnica como la técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495–497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV–hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp 77–96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos quiméricos son aquellos anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina que fueron genéticamente manipulados por ingeniería de modo que los genes de cadena liviana y pesada están compuestos por segmentos génicos de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies. Estos anticuerpos quiméricos son probablemente menos antigénicos. Los anticuerpos bivalentes se pueden preparar por medio de métodos conocidos en la técnica (Milstein et al., 1983, Nature 305:537–539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655–3659). Los anticuerpos bi–, tri– y tetravalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos (ver, por ejemplo, el documento WO 92/22853).

Las secuencias de anticuerpo también se pueden generar usando métodos de anticuerpos linfocíticos simples a base de clonación molecular y expresión de cADN de región variable de inmunoglobulina generado de linfocitos simples que se seleccionaron para la producción de anticuerpos específicos tal como se describe por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843–7848 y en el documento WO 92/02551. Los últimos métodos se basan en el aislamiento de células productoras de anticuerpos individuales que luego se expanden clonalmente seguido por control de estos clones que producen un anticuerpo que reconoce su antígeno cognado y, si se desea, la posterior identificación de la secuencia de sus genes de cadena pesada (VH) y liviana (VL) variable. De modo alternativo, los anticuerpos que producen células que reconocen su antígeno cognado se pueden cultivar juntos seguido de control.

Los anticuerpos preparados usando los métodos de la invención son más preferiblemente anticuerpos humanizados que se pueden ligar posteriormente a toxinas, fármacos, compuestos citotóxicos o polímeros u otros compuestos que prolongan la vida útil del anticuerpo cuando se administran a un paciente.

El anticuerpo puede ser específico de cualquier antígeno diana. El antígeno puede ser una proteína asociada a células, por ejemplo, una proteína de superficie celular en células tales como células bacterianas, células de levadura, células T, células endoteliales o células tumorales o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína médicamente relevante tales como aquellas proteínas reguladas hacia arriba durante la enfermedad o la infección, por ejemplo, receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos particulares de proteínas de superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo, integrinas tales como integrinas β1, por ejemplo, VLA–4, E–selectina, P–selectina o L–selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, símil nectina 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembriónico (CEA), globulina de grasa de la leche humana (HMFG1 y 2), antígenos MHC de clase I y MHC de clase II, KDR y VEGF y, de ser apropiado, sus receptores.

Los antígenos solubles incluyen interleuquinas tales como IL–1, IL–2, IL–3, IL–4, IL–5, IL–6, IL–8, IL–12, IL–13, IL–14, IL–16 o IL–17, tales como IL17A y/o IL17F, antígenos virales, por ejemplo, virus sincicial respiratorio o antígeno de citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones tales como interferón α, interferón β o interferón γ, factor de necrosis tumoral TNF (antes conocido como factor de necrosis tumoral α), factor de necrosis tumoral β, factores estimulantes de colonias tales como G–CSF o GM– CSF y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF–α y PDGF–β y, de ser apropiado, sus receptores. Otros antígenos incluyen antígenos de superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus tales como gripe, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorismo, radionúclidos y metales pesados y venenos y toxinas de serpientes y arañas.

En una realización, el anticuerpo se puede usar para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antígeno, directa o

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indirectamente.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti–TNF, más preferiblemente, un Fab’ anti–TNF, como se describe en el documento WO 01/094585.

Los métodos para la expresión de proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos apropiados de células huésped para la expresión de moléculas de anticuerpos recombinantes incluyen bacterias tales como bacterias gram positivas o gram negativas, por ejemplo E. coli. Con máxima preferencia, en los métodos de la invención, se produce un anticuerpo recombinante en bacterias, por ejemplo E. coli (ver Verma et al., 1988, J. Immunol. Methods 216:165–181; Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods 263:133–147).

Células

El término "muestra" usado en la presente invención se refiere a una población de células que fueron transformadas con un vector de expresión que codifica una molécula de anticuerpo recombinante. La muestra puede estar en cualquier escala apropiada para producción de anticuerpos en menor escala a producción de anticuerpo en gran escala para fines comerciales.

Las células usadas en la presente invención pueden ser, por ejemplo, pero sin limitación, bacterias, en especial bacterias gram–negativas. Con máxima preferencia, las células son E. coli. Las células pueden ser células de tipo salvaje o células recombinantes que fueron genéticamente manipuladas. Las células huésped de E. coli pueden ser cepas de E. coli naturales o cepas mutadas capaces de producir proteínas recombinantes. Los ejemplos de cepas de

E. coli huésped específicas incluyen MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5a, DH1, BL21, K12, XL1Blue y JM109. Un ejemplo es W3110 de E. coli (ATCC 27.325), una cepa huésped comúnmente usada para fermentaciones de proteínas recombinantes. Los ejemplos también incluyen cepas de E. coli modificadas, por ejemplo, mutantes metabólicas y cepas deficientes de proteasa.

El anticuerpo recombinante producido usando los métodos de la presente invención se expresa normalmente en el periplasma de célula huésped de E. coli o en el sobrenadante de cultivo de células huésped, según la naturaleza de la proteína y la escala de producción. Los métodos para proteínas diana dirigidas a estos compartimientos son bien conocidos en la técnica, para una reseña, ver Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512–538. Los ejemplos de secuencias señal apropiadas para dirigir proteínas al periplasma de E. coli incluyen las secuencias señal PhoA, OmpA, OmpT, LamB y OmpF de E. coli. Las proteínas se pueden dirigir al sobrenadante confiando en las vías secretoras naturales o por inducción de fuga limitada de la membrana exterior para causar la secreción de la proteína, ejemplos de los cuales son el uso de pelB líder, la proteína A lider, la coexpresión de proteína de liberación de bacteriocina, la proteína de liberación de bacteriocina inducida por mitomicina junto con la adición de glicina al medio de cultivo y la coexpresión del gen kil para la permeabilización de la membrana. Con máxima preferencia, en los métodos de la invención, la proteína recombinante se expresa en el periplasma de E. coli huésped.

La expresión de la proteína recombinante en las células huésped de E. coli también puede estar bajo el control de un sistema inducible, donde la expresión del anticuerpo recombinante en E. coli está bajo el control de un promotor inducible. Muchos promotores inducibles apropiados para usar en E. coli son bien conocidos en la técnica y según el promotor, la expresión de la proteína recombinante se puede inducir por distintos factores tales como temperatura o la concentración de una sustancia particular en el medio de crecimiento (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411–421; Goldstein y Doi, 1995, Biotechnol. Annu. Rev, 105–128). Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los promotores lac, tac y trc de E. coli que son inducibles con lactosa o el análogo de lactosa no hidrolizable, isopropil–β–D–1–tiogalactopiranósido (IPTG) y los promotores phoA, trp y araBAD que se inducen por fosfato, triptófano y L–arabinosa, respectivamente. La expresión se puede inducir, por ejemplo, por la adición de un inductor o un cambio en la temperatura donde la inducción depende de la temperatura. Cuando se logra la inducción de expresión de proteína recombinante por adición de un inductor al cultivo, el inductor se puede añadir por cualquier método apropiado según el sistema de fermentación y el inductor, por ejemplo, por adiciones repentinas simples o múltiples o por una adición gradual de inductor a través de una materia prima. Se apreciará que puede haber una demora entre la adición del inductor y la inducción real de la expresión de la proteína, por ejemplo, cuando el inductor es lactosa, puede haber una demora antes de que ocurra la inducción de expresión de proteína mientras se utiliza cualquier fuente de carbono preexistente antes de la lactosa.

Los cultivos de células huésped de E. coli (fermentaciones) se pueden cultivar en cualquier medio que soportará el crecimiento de E. coli y expresión de la proteína recombinante. El medio puede ser cualquier medio químicamente definido, como aquellos proporcionados en Pirt S.J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications, con modificaciones apropiadas para controlar la tasa de crecimiento como se describe en la presente. Un ejemplo de un medio apropiado es ’SM6E’ como se describe por Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309–320.

El cultivo de las células huésped de E. coli puede tener lugar en cualquier recipiente apropiado como un recipiente de agitación o un fermentador según la escala de producción requerida. Varios fermentadores en gran escala están disponibles con una capacidad de más de 1000 litros hasta aproximadamente 100000 litros. Con preferencia, se usan fermentadores de 1000 a 50000 litros, más preferiblemente, de 1000 a 10000 ó 12000 litros. Se pueden usar también

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8,3: 5,26 7,98 7,4 6,17

8,4: 5,27 8,07 7,62 6,44

8,5: 5,26 8,16 7,84 6,9

8,6: 5,28 8,23 7,98 7,23

8,7: 5,27 8,3 8,12 7,59

8,8: 5,26 8,37 8,19 7,73

8,9: 5,27 8,42 8,31 8,03

9: 5,28 8,51 8,41 8,17

La Tabla 1 y la Figura 2b muestran el pH de las muestras celulares (suspensión celular resuspendida) directamente después de la adición del tampón de extracción con un pH de 7,4 a 9,0 y el pH de las muestras celulares 1 hora después de la adición del tampón de extracción antes de la fase de calentamiento.

5 EJEMPLO 3: Efecto del pH antes de la fase de calentamiento sobre el rendimiento del anticuerpo

La etapa de cultivo celular, la etapa de adición de tampón de extracción, la etapa de homogeneización, la etapa de ajuste del pH antes del calentamiento, la fase de calentamiento y la etapa de tratamiento térmico se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos generales. El control no se sometió a una etapa de ajuste del pH.

En el experimento de control, el tampón de extracción era de pH 7,4 y en los otros experimentos, cuando el pH se 10 ajustaba antes de la fase de calentamiento, el tampón de extracción era de pH 8,0.

La etapa de mantenimiento de la suspensión celular y la etapa de ajuste del pH durante el calentamiento no se llevaron a cabo.

En el control, no se llevó a cabo un ajuste del pH antes de la fase de calentamiento. En los otros experimentos, el pH de la muestra se ajustó antes de la fase de calentamiento a pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 y 7,8.

15 Los resultados se muestran en la Figura 3a que indica que esta etapa de ajuste del pH daba como resultado mayor recuperación de Fab’. La Figura 3a demuestra cómo el ajuste del pH indica dentro de un intervalo de pH 7,0 a 7,8 una mayor recuperación de producto de un 26 a un 40% en comparación con la muestra de control que no se sometió a un ajuste del pH.

Tabla 2

20 Etapa de proceso

1: 2 3 4 5

Muestra: pH de la suspensión celular pH de adición postampón Ajusta del pH pre pH Posajuste del pH / pH de precalentamiento pH de postratamiento térmico

Control: 5,44 6,84 5,99 5,99 5,52

ajuste del pH a 7,0: 5,44 7,7 6,82 7 5,61

ajuste del pH a 7,2: 5,44 7,7 6,75 7,2 5,67

ajuste del pH a 7,4: 5,44 7,7 6,65 7,4 5,62

ajuste del pH a 7,6: 5,44 7,7 6,61 7,6 5,71

ajuste del pH a 7,8: 5,44 7,7 6,55 7,8 5,7

El pH de la muestra se detectó en varios puntos en el método. La Tabla 2 anterior y la Figura 3b muestran el pH variante de las muestras a través de las distintas etapas del método: la suspensión celular (después del cultivo y la centrifugación); adición postampón (directamente después de la adición del tampón de extracción); preajuste del pH;

25 posajuste del pH pero fase de precalentamiento; y etapa de postratamiento térmico.

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El gel de SDS–PAGE en la Figura 4 muestra los perfiles de proteína de las muestras de posextracción. El carril 1 es un marcador de peso molecular, El carril 2 es una muestra de anticuerpo A, El carril 3 es la muestra después de ningún ajuste del pH y los carriles 4 a 8 muestran las muestras después del ajuste del pH a 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 y 7,8 respectivamente antes de la etapa de tratamiento térmico.

El peso de carga de la muestra se normalizó en 1 µg de Fab’. No se observaron significativas diferencias en los perfiles de proteína entre el control y las muestras con ajuste del pH de precalentamiento.

EJEMPLO 4: Efecto del pH del tampón de extracción y ajuste del pH sobre el rendimiento de anticuerpo en presencia y en ausencia de una etapa de mantenimiento celular y etapa de homogeneización

Los siguientes experimentos se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos generales.

•: Control (con homog.): etapa de cultivo celular, etapa de adición de tampón de extracción (pH 7,4), etapa de homogeneización, fase de calentamiento y etapa de tratamiento térmico;

•: Tampón a pH 8 y ajuste de precalentamiento a pH 7,4 (con homog.): etapa de cultivo celular, etapa de adición de tampón de extracción (pH 8), etapa de homogeneización, etapa de ajuste del pH antes del calentamiento a pH 7,4, fase de calentamiento y etapa de tratamiento térmico;

•: Control (sin homog. o CSH): etapa de cultivo celular, etapa de adición de tampón de extracción (pH 7,4), fase de calentamiento y etapa de tratamiento térmico;

•: Tampón a pH 8 y ajuste de precalentamiento a pH 7,4 (sin homog. o CSH): etapa de cultivo celular, etapa de adición de tampón de extracción (pH 8), etapa de ajuste del pH antes del calentamiento a pH 7,4, fase de calentamiento y etapa de tratamiento térmico;

•: Control (con CSH): etapa de cultivo celular, etapa de mantenimiento de la suspensión celular, etapa de adición de tampón de extracción (pH 7,4), fase de calentamiento y etapa de tratamiento térmico; y

•: Tampón a pH 8 y ajuste de precalentamiento a pH 7,4 (con CSH): etapa de cultivo celular, etapa de mantenimiento de la suspensión celular, etapa de adición de tampón de extracción (pH 8), etapa de ajuste del pH antes del calentamiento a pH 7,4, fase de calentamiento y etapa de tratamiento térmico.

Figura 5 muestra los resultados de los experimentos anteriores. Se puede ver que la adición de la etapa de ajuste del pH antes del calentamiento daba como resultado aproximadamente el 34% de títulos de mayor extracción en comparación con el control. También se puede ver que la inclusión de la etapa de homogeneización no tenía efecto sobre el rendimiento en comparación con el método con la etapa de ajuste del pH. El mantenimiento de suspensión celular da un mayor rendimiento cuando se compara con extracciones de control, pero no cuando se los compara con la etapa de ajuste del pH.

El gel de SDS–PAGE en la Figura 6 muestra los perfiles de proteína de muestras de posextracción. El carril 1 es un marcador de peso molecular;

El carril 2 es una muestra de anticuerpo A;

El carril 3 es la muestra después de una etapa de homogeneización pero ningún ajuste del pH y ningún mantenimiento de la suspensión celular;

El carril 4 es la muestra después del tratamiento con tampón de extracción a pH 8 y ajuste a pH 7,4 antes del tratamiento térmico y una etapa de homogeneización y ningún mantenimiento de la suspensión celular;

El carril 5 es la muestra después de ningún ajuste del pH, ninguna homogeneización y ningún mantenimiento de la suspensión celular; el carril 6 es la muestra después del tratamiento con tampón de extracción a pH 8 y ajuste a pH 7,4 antes del tratamiento térmico y ninguna homogeneización y ningún mantenimiento de la suspensión celular;

El carril 7 es la muestra después del mantenimiento de la suspensión celular pero ningún ajuste del pH y ninguna homogeneización; el carril 8 es la muestra después del tratamiento con tampón de extracción a pH 8 y ajuste a pH 7,4 antes del tratamiento térmico y un mantenimiento de la suspensión celular pero ninguna homogeneización.

Los perfiles de proteína de extractos con ajuste del pH eran comparables con los controles de mantenimiento de la suspensión celular.

EJEMPLO 5: Efecto del pH del tampón de extracción y/o la etapa de ajuste del pH antes del calentamiento sobre el pH de la muestra y rendimiento de Fab’.

La etapa de cultivo celular, la etapa de adición de tampón de extracción, la fase de calentamiento y la etapa de tratamiento térmico se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos generales. Dos experimentos incluían un ajuste del pH antes de la etapa de calentamiento y dos no incluyeron esta etapa.

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Los datos de abajo también se representan en la Figura 12.

sin pretratamiento, sin ajuste del pH

Pretratamiento: Ajuste del pH Posextracción (g/L) Aumento respecto del control (%)

CSH: na 0,419 19,27

CSH: n/a 0,402 14,52

CSH: 7 0,412 17,40

CSH: 7,4 0,408 16,29

CSH: 7,8 0,435 23,86

Ninguno: na 0,351 0,00

Ninguno: 6,6 0,421 19,89

Ninguno: 7 0,412 17,40

Ninguno: 7,4 0,399 13,63

Ninguno: 7,8 0,403 14,72

Homogeneización: na 0,359 2,29

Homogeneización: 6,6 0,392 11,79

Homogeneización: 7 0,394 12,16

Homogeneización: 7,4 0,403 14,80

Homogeneización: 7,8 0,420 19,60

El control era ningún pretratamiento y ningún control del pH

Claims

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