ES2647925T3 - Métodos para reducir los eventos adversos causados por preparados farmacéuticos que comprenden proteínas derivadas del plasma - Google Patents

Abstract

Método para reducir la actividad de FXIa en un preparado farmacéutico de inmunoglobulina derivado de una fracción de plasma, comprendiendo dicha fracción de plasma antitrombina III, comprendiendo el método poner en contacto la fracción de plasma con heparina, lo que reduce así la actividad de FXIa por mL de la fracción de plasma, donde la heparina está acoplada covalentemente a una matriz y la fracción de plasma se ha preadsorbido a una matriz de intercambio aniónico, donde la matriz de intercambio aniónico es una membrana de intercambio aniónico.

Description

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DESCRIPCION

Métodos para reducir los eventos adversos causados por preparados farmacéuticos que comprenden proteínas derivadas del plasma

La presente invención proporciona un método para reducir la actividad del FXIa en un preparado farmacéutico inmunológico derivado de una fracción de plasma, comprendiendo dicha fracción de plasma antitrombina III, comprendiendo el método poner en contacto la fracción de plasma con heparina, lo que reduce así la actividad de FXIa por mL de la fracción de plasma, donde la heparina se acopla covalentemente a una matriz y la fracción de plasma se ha preadsorbido a una matriz de intercambio aniónico, donde la matriz de intercambio aniónico es una membrana de intercambio aniónico.

En el modelo de cascada clásico, la coagulación sanguínea tiene lugar mediante una serie de reacciones que implican la activación de zimógenos mediante una proteolisis limitada que culmina con la generación de trombina, la cual convierte el fibrinógeno plasmático en fibrina y activa las plaquetas. A su vez, las plaquetas que se adhieren a colágeno o fibrina facilitan la generación de trombina en varios órdenes de magnitud mediante la exposición de fosfolípidos procoagulantes (principalmente fosfatidilserina) en su superficie exterior, lo que propaga el ensamblaje y la activación de complejos de proteasas de coagulación, y mediante la interacción directa entre los receptores de plaquetas y los factores de coagulación.

Existen dos vías convergentes para la coagulación que están desencadenadas por componentes extrínsecos (pared vascular) o intrínsecos (transportados por la sangre) del sistema vascular (Figura 1). La vía “extrínseca” es iniciada por el complejo de la serinproteasa factor VII (FVII) con la proteína integral de membrana factor tisular (TF), un cofactor de la coagulación esencial que se encuentra ausente en la superficie luminal pero fuertemente expresado en las capas subendoteliales del vaso y que es accesible o se libera a través de una lesión tisular. El TF expresado en microvesículas circulantes podría contribuir también a la propagación de trombos sustentando la generación de trombina en la superficie de las plaquetas activadas.

La vía “intrínseca” o “vía de activación por contacto” se inicia cuando la serinproteasa factor XII (FXII, factor de Hageman) entra en contacto con superficies cargadas negativamente en una reacción que involucra al cininógeno de alto peso molecular y la serinproteasa calicreína plasmática (activación por contacto). El FXII puede ser activado por constituyentes macromoleculares de la matriz subendotelial tales como glicosaminoglicanos y colágenos, sulfátidos, nucleótidos y otros polianiones solubles o materiales no fisiológicos tales como vidrio o polímeros. Uno de los activadores por contacto más potentes es el caolín y esta reacción sirve como base mecanística para la principal prueba de coagulación clínica, el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT, por sus siglas en inglés), que mide la función de coagulación de la vía “intrínseca”. En las reacciones propagadas por las plaquetas, el FXII activado activa a continuación la serinproteasa FXI a FXIa y posteriormente FXIa activa la serinproteasa FIX a FIXa. El complejo de FVIIIa, donde dicho FVIIIa ha sido activado previamente por trazas de FXa y/o trombina, y FIXa (el complejo tenasa) posteriormente activa la serinproteasa FX a FXa, que a su vez activa con FVa la serinproteasa protrombina a trombina.

El factor XIIa tiene una serie de proteínas objetivo, incluidas la precalicreína plasmática y el factor XI. La calicreína plasmática activa además activa el factor XII, lo que conduce a una amplificación de la activación por contacto. La activación por contacto es un proceso mediado por superficies responsable en parte de la regulación de la trombosis y la inflamación, y está mediado, al menos en parte, por la vía fribrinolítica, del complemento, de cininógeno/cinina y otras vías celulares y humorales. El precursor inactivo de la calicreína plasmática, la precalicreína, se sintetiza en el hígado en forma de a-globulina monocatenaria con un peso molecular de aproximadamente 88 kilodaltons (kDa) [3]. La precalicreína circula en el plasma en forma de complejo 1:1 con el HMWK en una concentración de 35-50 pg/mL. La calicreína se forma mediante la escisión de la precalicreína en dos cadenas que se mantienen juntas mediante un puente disulfuro. La activación de la precalicreína a calicreína viene provocada por el FXII activo (FXIIa). La calicreína plasmática activa escinde del HMWK el péptido bradicinina, muy activo biológicamente, que produce una fuerte disminución de la presión sanguínea, aumento de la permeabilidad vascular, liberación del activador de plasminógeno tisular (t-PA) y movilización del ácido araquidónico. A través de estos mecanismos, el sistema calicreína-cinina influye en la regulación de la presión sanguínea, la función renal y cardiaca, así como los procesos patológicos de inflamación (para consultar una revisión, remítase a Coleman, R. Contact Activation Pathway, páginas 103-122 en Hemostasis and Thrombosis, Lippincott Williams Wilkins 2001; Schmaier A. H. Contact Activation, páginas 105-128 en Thrombosis and Hemorrhage, 1998).

En algunas afecciones patológicas, la cascada de coagulación se puede activar de forma inapropiada, lo que da lugar a continuación a la formación de tapones que actúan de forma hemostática en el interior de los vasos sanguíneos. Por ende, los vasos pueden ocluirse y el suministro de sangre a los órganos distales es limitado. Además, la trombina formada se puede desprender y producir embolias en otras partes del cuerpo, lo que da lugar a oclusión isquémica. Este proceso se conoce como tromboembolismo y está asociado con una elevada mortalidad.

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Las proteasas activadas que se originan a partir de proteínas del plasma sanguíneo pueden contaminar los preparados farmacéuticos de proteínas derivadas del plasma sanguíneo humano y pueden ser la causa de eventos tromboembólicos adversos (TAE, por sus siglas en inglés). Los proveedores de productos farmacéuticos derivados del plasma deben garantizar, por tanto, que sus productos no causen tales tAe, que también se han asociado recientemente con el uso de un preparado de inmunoglobulina intravenosa (IVIG). Algunos autores atribuyen al Factor de coagulación XI activado (FXIa) una función relevante en el potencial trombogénico de las IVIG (Alving BM, Tankersley DL, Mason BL, Rossi F, Aronson DL, Finlayson JS. Contact-activated factors: contaminants of inmunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties. J. Lab. Clin. Med 1980; 96(2): 334-46).

Además de eventos trombóticos como la embolia, un preparado proteico del plasma que comprende concentraciones aumentadas de calicreína, FXIa o FXIIa puede causar otros eventos adversos tales como reacciones cutáneas, broncoespasmos, hipoxia, fuertes escalofríos, taquicardia, dolores de estómago y presión sanguínea elevada.

El desarrollo de preparados puros y seguros es un objetivo principal de los fabricantes de derivados del plasma, que incluye disminuir o eliminar virtualmente el riesgo de TAE asociados a IVIG. Marzo et al. describieron que la pasteurización puede ser un medio para reducir las proteasas activadas en los preparados de inmunoglobulinas (Jose M, Marzo N, Bono M, Carretero M, Maite L, Ristol P, Jorquera J. Pasteurization Inactivates Clotting Enzymes During Flebogamma® And Flebogamma® Dif. Production. WebmedCentral IMMUNOTHERAPY 2010; 1(12): WMC001425).

En 2010 se retiró un producto de inmunoglobulina i.v. debido a eventos tromboembólicos (Agencia Europea de Medicamentos. Preguntas y respuestas sobre la suspensión de las autorizaciones de comercialización de Octagram (inmunoglobulina humana normal 5% y 10%). Resultado de un procedimiento realizado de conformidad con el Artículo 107 de la Directiva 2001/83/EC. 23 de septiembre de 2010) que condujo a la suspensión de la autorización de comercialización del respectivo producto.

Existe una clara necesidad médica de desarrollar métodos de fabricación alternativos que se puedan utilizar para mejorar la seguridad de los preparados farmacéuticos derivados del plasma.

La presente invención proporciona una solución a este problema. En el método, se descubrió que la adsorción de un preparado farmacéutico, o su fracción intermedia, derivado del plasma que comprende antitrombina III a matrices de tipo heparina o heparina puede reducir sustancialmente la cantidad de proteasas activadas y puede, por tanto, mejorar considerablemente la seguridad de dicho preparado farmacéutico.

El plasma sanguíneo humano se ha utilizado industrialmente durante décadas para la fabricación de productos proteicos del plasma ampliamente consolidados y aceptados tales como, p. ej., preparados de inmunoglobulina (IgG), albúmina humana, concentrados de factores de coagulación (Factor de coagulación VIII, Factor de coagulación IX, complejo de protrombina, etc.) e inhibidores (antitrombina III, inhibidor de C1, etc.). A lo largo del desarrollo de tales fármacos derivados del plasma, se han consolidado los métodos de fraccionamiento del plasma, lo que ha conducido a productos intermedios enriquecidos en ciertas fracciones de proteínas, que sirven después como material de partida para el producto proteico del plasma correspondiente. Los procesos típicos se revisan, p. ej., en Schultze HE, Heremans JF; Molecular Biology of Human Proteins. Volumen I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; págs. 236-317 y en la Figura 2 (Cohn/Oncley) y Figura 3 (Kistler Nitschmann) se proporcionan representaciones esquemáticas simplificadas de tales procesos. Estos tipos de tecnologías de separación permiten la fabricación de varios productos proteicos del plasma terapéuticos a partir de la misma fuente donante de plasma, lo que resulta ventajoso desde el punto de vista económico en comparación con la producción de un único producto proteico del plasma a partir de una fuente donante de plasma y, por lo tanto, se han adoptado como estándar industrial en el fraccionamiento del plasma sanguíneo.

En un primer paso, se precipitan el FVIII, el factor de von Willebrand y el fibrinógeno a partir del plasma (crioprecipitación) y el plasma pobre en crioprecipitado restante se puede adsorber a matrices para aislar las proteínas del complejo de protrombina (adsorción de PT, PPSB) y/o para adsorber el inhibidor de C1 (adsorción de C1). Normalmente esta adsorción se realiza utilizando matrices de intercambio aniónico (AEX) como DEAE o QAE.

En el proceso de Cohn, se lleva a cabo entonces una precipitación con etanol al 8% que precipita el FXIII y más fibrinógeno. El sobrenadante de etanol al 8% se somete directamente a pasos de precipitación adicionales aumentando la concentración de etanol que conducen, en última instancia, a productos como inmunoglobulinas, albúmina, factor H del complemento, transferrina e inhibidor de alfa-I-proteinasa.

Opcionalmente, el sobrenadante al 8% se puede adsorber adicionalmente para aislar la antitrombina III (adsorción de AT III). Este paso se lleva a cabo normalmente utilizando heparina o sustancias de tipo heparina.

Los procesos de fabricación actuales normalmente permiten alguna flexibilidad de forma que no siempre se realizan todas las adsorciones en función de la demanda relativa de los diferentes productos. En la producción de

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inmunoglobulinas y albúmina puede haber:

1: Ningún paso de adsorción realizado

2: Solamente el paso de adsorción de PT realizado

3: Adsorción de PT seguida de la adsorción del inhibidor de C1-esterasa

4: Adsorción de PT seguida de la adsorción de AT III

5: Proceso de adsorción completo (adsorción de PT, inhibidor de C1-esterasa y AT III)

En la Figura 4 se muestra un gráfico que representa dichos métodos de fabricación alternativos. En el Ejemplo 1.2 se describe un ejemplo no limitante de un proceso de fabricación de este tipo. El alcance de la invención, sin embargo, no se limita a los preparados farmacéuticos que comprenden inmunoglobulinas, como se hará evidente más adelante.

Se acaba de descubrir que, especialmente después de una adsorción con matrices de AEX durante la adsorción de PT y C1, se podían detectar serinproteasas activadas como calicreína, FXIa o FXIIa en productos posteriores. Sorprendentemente, las muestras que además de la adsorción a una matriz de AEX se adsorbieron también a heparina o sustancias de tipo heparina mostraron niveles significativamente reducidos de actividad de tipo FXIa y/o calicreína. Esto deriva en una actividad procoagulante significativamente reducida de los productos en los que se ha adsorbido la AT III. Esta actividad procoagulante reducida disminuye el riesgo de eventos adversos cuando se administra un producto de este tipo a los pacientes, eventos tromboembólicos, reacciones cutáneas, broncoespasmos, hipoxia, fuertes escalofríos, taquicardia, dolores de estómago y presión sanguínea elevada.

Sin pretender ceñirse a ninguna teoría, este efecto se puede explicar por que las matrices de AEX activan el FXII a FXIIa, que a su vez activa la precalicreína a calicreína y el fXi a FXIa. Una adsorción adicional para eliminar el inhibidor de C1 puede conducir a una activación adicional y también elimina el inhibidor de C1, un inhibidor importante de la calicreína. Cuando estas muestras que contienen calicreína, FXIa y FXIIa entran ahora en contacto con matrices de tipo heparina o heparina, la AT III, que normalmente está presente en esta etapa del procesado de proteínas del plasma, se une a la matriz de tipo heparina o heparina, se activa y posteriormente inactiva el FXIa y la calicreína uniéndose irreversiblemente a ambas proteínas, con lo que elimina de esta forma estas proteínas potencialmente trombogénicas. Por lo tanto, la invención se podrá aplicar a cualquier disolución que comprenda proteínas del plasma que puede contener serinproteasas activadas siempre que la disolución comprenda también AT III.

La AT III es una proteína del plasma y un inhibidor de serinproteinasas que inactiva la trombina y las otras serinproteasas responsables de la generación de trombina. La actividad anticoagulante de la heparina o las sustancias de tipo heparina se deriva de su capacidad para potenciar la actividad inhibidora de la AT III mediante mecanismos que son similares a la activación fisiológica de la AT III por los proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPG) de la pared vascular. La AT III sirve como regulador importante de la hemostasia y la trombosis a varios niveles bloqueando (a) la formación de coágulo de fibrina mediada por trombina, (b) la generación de trombina mediada por el factor Xa de la vía común y (c) factores de coagulación que se encuentran en puntos superiores de las vías intrínseca y extrínseca (FIXa, FXIa, FXIIa y calicreína del plasma, y FVIIa (Colman et al., Hemostasis and Thrombosis, 5.a edición, 2006 Lippincott Williams, pág. 235 f.).

La unión de AT III a heparina o una sustancia de tipo heparina deriva en un cambio conformacional en la AT III que transforma la molécula en un estado altamente activo que posee una actividad inhibidora aumentada varios miles de veces hacia las serinproteasas activadas como factores de coagulación activadas mediante la formación de forma irreversible de un enlace covalente con la serinproteasa activada. Tras la formación de este enlace covalente, la serinproteasa pierde de forma irreversible su función biológica como serinproteasa.

La invención versa, por lo tanto, sobre un método para reducir la actividad del FXIa en un preparado farmacéutico de inmunoglobilina derivado de una fracción de plasma, donde dicha fracción de plasma comprende antitrombina III, comprendiendo el método poner en contacto la fracción de plasma con heparina, lo que reduce de este modo la actividad de FXIa por mL de la fracción de plasma, donde la heparina está acoplada covalentemente a una matriz y la fracción de plasma se ha preadsorbido a una matriz de intercambio aniónico, donde la matriz de intercambio aniónico es una membrana de intercambio aniónico.

Una “heparina o sustancia de tipo heparina” en el sentido de la invención es cualquier forma de heparina o sustancia relacionada con la heparina que cause la activación de la AT III cuando entre en contacto con la AT III, es decir, que la AT III adopte la conformación que tiene una elevada afinidad por la formación de complejos covalentes con serinproteasas activadas, preferencialmente factores de coagulación activados.

Las sustancias de tipo heparina están integradas por un grupo de productos derivados de la heparina, producidos mediante una o más modificaciones químicas. Por ejemplo, la heparina sulfatada es un derivado en el que todos los hidroxilos primarios de los residuos de glucosamina y una gran proporción de los grupos hidroxilo secundarios en las unidades de disacárido se han sustituido con ésteres O-sulfato; la heparina con carboxilo reducido es un derivado en el que los grupos carboxilo de los residuos de ácido urónico de la heparina se han reducido a alcoholes; la heparina

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oxidada con peryodato es un derivado en el que todos los residuos de ácido urónico no sulfatados de la heparina se oxidan con ácido peryódico. Otros derivados de heparina incluyen, por ejemplo, la heparina O-desulfatada, heparina 2-O-desulfatada, heparina completamente N-acetilada, heparina completamente N-sulfatada, heparina N- desulfatada, heparina N-deacetilada. La expresión “heparina o sustancias de tipo heparina”, en el sentido de la invención, engloba heparina no fraccionada, heparinas de alto peso molecular, heparinas de bajo peso molecular y análogos sintéticos de la heparina como fondaparinux.

La “heparina o sustancias de tipo heparina” se pueden utilizar de acuerdo con la invención poniéndolas en contacto con una fracción de plasma que comprende serinproteasas activadas, preferencialmente factores de coagulación donde la heparina o sustancia de tipo heparina está acoplada covalentemente a una matriz. Aquí, el complejo covalente de la AT III con el factor de coagulación activado permanece unido a la matriz. Como alternativa, la heparina o sustancia de tipo heparina se puede añadir a una fracción de plasma en forma de sustancia soluble. A continuación, el complejo covalente de At III con el factor de coagulación activado precipita o permanece en disolución.

La expresión “reducir la actividad específica de al menos una serinproteasa activada por mL de la fracción de plasma” en el sentido de la invención se refiere a que el método de la invención conduce a una disminución de la actividad de al menos una serinproteasa por volumen de la fracción de plasma que comprende la antitrombina III. La reducción de la actividad puede deberse únicamente a la unión irreversible de la serinproteasa activada a la antitrombina III activada por heparina, cuando la heparina o la sustancia de tipo heparina se añade en disolución, mientras que el contenido de antígeno de la serinproteasa activada no cambia, o puede también conducir a una reducción de la cantidad de serinproteasa activada si la heparina o sustancia de tipo heparina se acopla a una matriz que posteriormente se separa de la fracción de plasma y donde la serinproteasa permanece acoplada covalentemente a la antitrombina III en la matriz.

Un “evento adverso”, en el sentido de la invención, es cualquier efecto causado por la administración del preparado farmacéutico causado por serinproteasas activadas y puede comprender trombosis, reacciones cutáneas, broncoespasmos, hipoxia, fuertes escalofríos, taquicardia, dolores de estómago y presión sanguínea elevada.

Las “proteínas derivadas del plasma” pueden comprender cualquier proteína que se aísla a partir de plasma humano después del paso de precipitación en etanol al 8% de acuerdo con Cohn o un paso equivalente de acuerdo con otros métodos para el fraccionamiento del plasma. En un ejemplo, la expresión “proteínas derivadas del plasma” se refiere a todas las proteínas que se aíslan a partir de plasma humano donde los intermedios de estas se han puesto en contacto con una matriz de AEX. Las “proteínas derivadas del plasma” comprenden, por ejemplo, inmunoglobulinas, albúmina, factor H del complemento, inhibidor proteinasa alfa 1 y transferrina.

Una “fracción de plasma” puede ser cualquier disolución o precipitado redisuelto derivados del plasma, donde al menos una parte de las proteínas proceden del plasma humano.

El Factor XI es una proteína de coagulación y una serinproteasa producida en el hígado y circula en el plasma con una concentración de aproximadamente 5 pg/mL (30 nM). El FXI consta de dos subunidades idénticas de 80 kDa unidas por enlaces disulfuro. La escisión del FXI por el factor XII activado o la trombina convierte cada subunidad en una forma bicatenaria y genera dos sitios activos por molécula de FXIa (Bagila FA, Seaman FS, Walsh PN. The Apple 1 and 4 domains of factor XI act to synergistically promote the surface-mediated activation of factorXI by factor XlIa. Blood 1995; 85:2078). La actividad del FXIa está regulada por las plaquetas y por varios inhibidores de proteinasas. El sustrato natural para el FXIa es únicamente el FIX; el único cofactor requerido para esta reacción son iones de calcio.

La precalicreína es una glicoproteína monocatenaria de 88 kDa producida en el hígado. La concentración plasmática de PK es de 50 pg/mL (550 nM) de la cual aproximadamente el 75% circula en forma de complejo con el cininógeno de alto peso molecular y el resto como PK libre (Hojima Y, Pierce JV, Pisano JJ. Purification and characterization of multiple forms of human plasma prekalikrein. J. Biol. Chem. 1985; 260: 400-406). La proteólisis limitada de la PK por el FXIIa genera la serinproteasa calicreína activa (Dela Cadena R, Watchtfogel YT, Colman RW. Hemostasis and Thrombosis, 3.a edición 1994, págs. 219-240).

El factor XII (factor de Hageman) es una glicoproteína monocatenaria de 76 kDa producida en el hígado. En el plasma, el FXII circula como un zimógeno de proteasa en una concentración de aproximadamente 30 pg/mL (400 nM). Tras una lesión vascular, el FXII se une a las superficies extravasculares cargadas negativamente, que facilitan la activación del zimógeno a la serinproteasa activa (Pixley RA, Schapira M, Coleman RW. The regulation of human factor XIIa by plasma proteinase inhibitors. J. Biol. Chem. 1985; 260(3): 1723-1729). La actividad del FXIIa en el plasma está regulada predominantemente por el inhibidor de C1.

Un “intermedio” de un preparado farmacéuticamente activo que comprende una o más proteínas del plasma puede ser cualquier fracción intermedia durante la purificación de dichas una o más proteínas del plasma y comprende, por ejemplo, cualquier sobrenadante de un paso de precipitación durante la purificación o cualquier eluato de una matriz

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utilizada para la purificación de una proteína derivada del plasma.

El método de la invención es especialmente útil porque la fracción de plasma que se pone en contacto con heparina se adsorbe primero a una matriz de intercambio aniónico.

En el sentido de la invención una “matriz de intercambio aniónico” se refiere a una fase sólida que está cargada positivamente en el momento de la unión a proteína, con lo cual tiene, por tanto, uno o más ligandos cargados positivamente unidos a ella. Se puede utilizar cualquier ligando cargado positivamente unido a una fase sólida adecuado para formar la matriz de intercambio aniónico tal como grupos amonio cuaternarios. Por ejemplo, un ligando utilizado en una AEC puede ser un amonio cuaternario tal como una alquilamina cuaternaria y una alquilalcanolamina cuaternaria o amina, dietilamina, dietilaminopropilo, amino, trimetilamoniometilo, trimetilbencilamonio, dimetiletanolbencilamonio y poliamina. Como alternativa, para la AEC, se puede utilizar una membrana que tenga un ligando cargado positivamente, tal como un ligando descrito anteriormente, en lugar de una matriz de intercambio aniónico.

Las matrices de intercambio aniónico que se pueden adquirir de proveedores comerciales incluyen, sin carácter limitante, DEAE celulosa, POROS® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 de Applied Biosystems, MonoQ®, MiniQ, SourceTM 15Q y 3OQ, Q, DEAE y ANX Sepharose® Fast Flow, Q Sepharose® de alto rendimiento, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE® de GE Healthcare, WP PEI, WP DEAM, WP QUAT de J. T. Baker, Hydrocell DEAE e Hydrocell QA de Biochrom Labs Inc., UNOsphere™ Q, Macro-Prep® DEAE y Macro-Prep® High Q de Biorad, Ceramic HyperD® Q, ceramic HyperD® DEAE, Q HyperZ®, Trisacryl® M y LS DEAE, Spherodex® LS DEAE, QMA Spherosil® LS, QMA Spherosil® M de Pall Technologies, matriz aniónica DOWEX® de base fuerte de malla fina Tipo I y Tipo II y DOWEX® MONOSPHER E 77, de aniones de base débil de Dow Liquid Separations, Matrex Cellufine A200, A500, Q500 y Q800, de Millipore, Fractogel® EMD TMAE3 Fractogel® EMD DEAE y Fractogel® EMD DMAE de EMD, intercambiadores aniónicos fuertes y débiles de tipo I y II de Amberlite™, intercambiadores aniónicos fuertes y débiles de tipo I y II de DOWEX®, intercambiadores aniónicos fuertes y débiles de tipo I y II de Diaion, Duolite® de Sigma-Aldrich, TSKgel® Q y DEAE 5PW y 5PW-HR, Toyopearl® SuperQ-650S, 650M y 650C3 QAE-550C y 650S, DEAE-650M y 650C de Tosoh y QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-IonTM D y Express-IonTM Q de Whatman.

La matriz de AEX es una membrana de intercambio aniónico. Las membranas de intercambio aniónico que se pueden adquirir de proveedores comerciales incluyen, sin carácter limitante, Sartobind® Q de Sartorius, Mustang® de Pall Technologies y la membrana Intercept™ Q de Millipore.

Figuras

Figura 1: Cascada de coagulación.

Figura 2: Representación esquemática de un fraccionamiento del plasma industrial de Cohn/Oncley modificado. Figura 3: Representación esquemática de un fraccionamiento del plasma industrial de Kistler/Nitschmann modificado.

Figura 4: Alternativas de procesado para la fabricación de la fracción II/III Figura 5: Resultados analíticos (gráfico de respuesta predicha).

El análisis estadístico de los resultados de las pruebas se llevó a cabo utilizando el programa informático Cornerstone versión 5.0 (Applied Materials Co.).

Figura 6: Correlación entre la actividad de tipo calicreína y Ag de precalicreína (a); correlación entre la actividad de tipo Factor XI y Ag de Factor XI (b).

EJEMPLOS

Ejemplo 1:

Ejemplo 1.1 - Introducción

Se llevó a cabo una investigación analítica de una inmunoglobulina para administración subcutánea (inmunoglobulina SC). Se aplicaron varios métodos analíticos en relación con la presencia potencial de cantidades traza de factores de coagulación activados y actividad proteolítica en la inmunoglobulina SC.

La evaluación de los datos analíticos reveló que los lotes de inmunoglobulina SC contienen niveles de actividad procoagulante en correlación con las variaciones aplicadas del esquema de adsorción. Una comparación de los esquemas de adsorción de los lotes individuales reveló que los niveles más elevados de actividad procoagulante se correlacionan con niveles de adsorción de PT elevados y niveles de adsorción de AT III bajos durante los pasos del proceso de fraccionamiento del plasma.

Sobre la base del resultado de actividad procoagulante, se adaptó el proceso de producción para que incluyera la máxima adsorción de AT III. Los ejemplos sucesivos proporcionan una evidencia sólida de que un nivel de adsorción de AT III elevado conduce a una disminución significativa de la actividad procoagulante del producto de

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inmunoglobulina SC.

Ejemplo 1.2 - Proceso de fabricación para una inmunoglobulina SC

La sustancia farmacológica se preparó mediante un fraccionamiento de Cohn modificado (Cohn EJ, Strong LE, et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins; a system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J. Am. Chem. Soc. 1946; 68:459-75). El plasma se descongeló, el crioprecipitado formado se separó y contenía fibrinógeno y complejo de factor de von Willebrand/Factor VIII antihemofílico. Con el sobrenadante, plasma empobrecido en crioprecipitado, se podría llevar a cabo, opcionalmente, una adsorción discontinua del complejo de protrombina y del inhibidor de C1-esterasa opcional (remítase a la Figura 4). Posteriormente, se añadió etanol al plasma empobrecido en crioprecipitado o al filtrado procedente de una o varias adsorciones previas para ajustar una concentración de etanol del 8%. El precipitado, Fracción I de Cohn, contenía principalmente fibronógeno y factor XIII y se separó mediante filtración. Con el sobrenadante se podría llevar a cabo una adsorción discontinua de antitrombina III opcional.

Se suspendieron de 60 a 100 mL de resina de afinidad de heparina por litro de plasma empobrecido en crioprecipitado con la misma cantidad de sobrenadante de la Fracción I en una columna cromatográfica. La suspensión obtenida se añade a la cantidad residual del lote para el fraccionamiento. El valor de pH se ajusta a 6.5 (± 0.1) con ácido clorhídrico mientras se agita. El tiempo de agitación total es de 45 a 60 min con una temperatura del producto de 0 (± 2) °C. Posteriormente, la disolución del producto se filtra a través de una bolsa de filtro y el filtrado se transfiere para un fraccionamiento del plasma adicional.

El sobrenadante de la Fracción I o la fracción no retenida procedente de la adsorción de AT III previa se precipitó con una concentración de un 25% de etanol. El precipitado resultante, la Fracción II/III de Cohn, se obtuvo mediante centrifugación y contenía principalmente inmunoglobulinas. La Fracción II/III se congela y almacena a una temperatura de -20 °C o inferior.

Tras disolverla en una disolución de glicina acuosa, la fracción II/III se precipitó adicionalmente con una concentración de un 10% de etanol en presencia de un 0.5% de un alcohol graso (también denominada preprecipitación al 10% porque precede a la precipitación principal al 20%). El precipitado que contenía principalmente IgM, IgA y lipoproteínas se eliminó por filtración.

El sobrenadante se precipitó adicionalmente con una concentración de un 20% de etanol. El precipitado formado que constaba principalmente de IgG (pasta de gammaglobulina) se obtuvo por filtración. La pasta de gammaglobulina cruda se congeló. Posteriormente, se disolvió y se sometió a adsorción utilizando una resina de intercambio iónico y carbón activado para eliminar la albúmina y el alcohol graso residuales. Las impurezas unidas a la resina y al carbón activado se eliminaron por filtración, respectivamente. El filtrado se estabilizó posteriormente con sacarosa y glicina. La disolución estabilizada se pasteurizó como un paso de reducción de virus eficaz. Una vez que se completó la pasteurización, los estabilizantes se eliminaron por ultrafiltración (diálisis). La disolución se concentró a continuación para obtener la sustancia farmacológica, el ultraconcentrado de inmunoglobulina.

Tras el proceso de agrupamiento de los lotes de ultraconcentrado de inmunoglobulina, se llevó a cabo un ajuste del producto a granel y la disolución a granel ajustada se sometió a continuación a una filtración a través de filtros de cartuchos de clarificación seguida de una filtración esterilizante. Inmediatamente después de completar el proceso de rellenado, los viales se taparon y sellaron automáticamente con tapones a presión.

EJEMPLO 1.2 - MÉTODOS ANALÍTICOS

1.2.1 Actividad de tipo Factor Xla (estrategia del aPTT en plasma empobrecido en FXI)

El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una prueba de coagulación que engloba todos los pasos de la vía intrínseca de coagulación sanguínea desde la activación del sistema de la fase de contacto hasta la formación de fibrina. Durante la fase de preincubación del ensayo del aPTT, el Factor XII fue activado por superficies cargadas negativamente (p. ej., Pathromtin SL) y activó el Factor XI a Factor XIa en presencia de cininógeno de alto peso molecular. El resultado de este paso inicial fue la producción de FXIa. La fase de medición del coágulo del ensayo del aPTT tuvo lugar después de una recalcificación durante la cual el FXIa activó al FIX, con lo cual, por tanto, continuó la cascada a través de FXa hasta la trombina.

Se aplicó plasma deficiente en Factor XI y la presencia de factor XI de coagulación activado en la muestra condujo especialmente a una disminución del tiempo de coagulación. La muestra se consideró “activada” con tiempos de coagulación inferiores provocados por la actividad de tipo FXIa en la muestra. Un tiempo de coagulación más prolongado indicó una actividad procoagulante inferior.

El plasma deficiente en Factor XI y el reactivo Pathromtin SL se incubaron durante 6 minutos a +37 °C. El Pathromtin SL es un reactivo compuesto por un fosfolípido y un activador superficial (partículas de dióxido de silicio) utilizado para activar los factores del sistema de coagulación intrínseca. Posteriormente, se añadió una muestra, junto con

5

10

15

20

25

30

35

40

una disolución de CaCl2 25 mM, que desencadena el proceso de coagulación. Se midió el tiempo entre la adición de CaCl2 y la formación del coágulo. Se utilizó un tampón como muestra de control y como diluyente para la preparación de las muestras de los productos. El tampón utilizado para los experimentos de prueba del FXIa estaba compuesto por un tampón de imidazol adquirido de proveedores comerciales y un 1% de albúmina humana. El material de referencia del Factor XIa se utilizó a efectos de cuantificación y los datos de la prueba se presentaron como la equivalencia de FXIa.

1.2.2 Actividad de tipo calicreína (sustrato cromogénico S-2302)

La actividad de tipo calicreína se estimó por medio de la escisión del sustrato cromogénico H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (sustrato cromogénico S-2302, Chromogenix Co.) y medición de la absorbancia del pNA a 405 nm. El S-2302 es un sustrato cromogénico que reacciona principalmente con la calicreína del plasma y, por lo tanto, se utiliza para la determinación de la actividad de tipo calicreína.

Tras la adición de la disolución de sustrato cromogénico, las muestras se incubaron a +37 °C durante 30 minutos. La calicreína activa en la muestra puede escindir el sustrato de manera dependiente de la concentración. Esto condujo a una diferencia en la absorbancia (densidad óptica) entre el pNA formado y el sustrato original que se midió fotométricamente a 405 nm. Además, la evaluación se llevó a cabo basándose en una curva de calibración aplicando un material de referencia estándar comercial de calicreína.

1.2.3 Actividad proteolítica (sustratos cromogénicos)

La determinación colorimétrica de la actividad proteolítica en las muestras se llevó a cabo aplicando sustratos cromogénicos. Tras la adición de la disolución de sustrato cromogénico, las muestras (diluidas por un factor 1:20) se incubaron a +37 °C durante 30 minutos. La actividad proteolítica de la muestra puede escindir el sustrato de manera dependiente de la concentración. El método para la determinación de la actividad se basa en la diferencia en la absorbancia (densidad óptica) entre el pNA formado y el sustrato original. La tasa de formación de pNA, es decir, el incremento en la absorbancia por segundo a 405 nm, es proporcional a la actividad enzimática y se determinó.

La siguiente tabla (Tabla 1) proporciona una visión general de los sustratos aplicados en este estudio y la respectiva especificidad.

Tabla 1a: Visión general de los sustratos cromogénicos aplicados

Etiqueta (Cromogenix Co.)

Sustrato cromogénico principalmente para*

S-2302

Actividad de tipo calicreína

S-2366

Proteína C activada, FXIa

S-2238

Trombina

S-2765

FXa

S-2251

Plasmina, plasminógeno activado por estreptocinasa

S-2288

Amplio espectro de serinproteasas, varias proteasas con especificidad por arginina

* según Chromogenix Co., Italia

1.2.4 ELISA del Factor XI

El antígeno del FXI humano en las muestras de inmunoglobulina SC se determinó cuantitativamente utilizando anticuerpos emparejados (ELISA tipo sándwich) que se pueden adquirir de proveedores comerciales, p. ej., suministrados por Coachrom Diagnostika Co. Los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con un anticuerpo policlonal para FXI y este captura el FXI que se puede obtener de la muestra o de la disolución de referencia estándar. Posteriormente, se añadió un anticuerpo para FXI (policlonal) conjugado con peroxidasa de rábano picante al pocillo, destinado a unirse al FXI capturado. Tras la eliminación de los anticuerpos no unidos mediante varios pasos de lavado, se añadió una disolución de un sustrato que reacciona con peroxidasa, lo que deriva en una coloración de manera dependiente de la concentración.

La coloración se formó en proporción a la cantidad de FXI presente en la muestra. Esta reacción se terminó mediante la adición de ácido y se mide fotométricamente a 450 nm utilizando los sistemas BEPII o BEPIII (Siemens Co.). Además, se aplicó una curva de calibración utilizando plasma humano estándar (Siemens Co.).

El FXI humano se detectó, así como también el FXIa humano, debido a la reactividad cruzada de ambos con los anticuerpos emparejados policlonales aplicados.

1.2.5 ELISA de la precalicreína

El antígeno de la precalicreína humana en las muestras de inmunoglobulina SC se determinó cuantitativamente

5

10

15

20

25

30

35

40

utilizando anticuerpos emparejados (ELISA tipo sándwich) que se pueden adquirir de proveedores comerciales suministrados por Affinity Biologicals Co. Los pocillos de una placa de microtitulación se recubren con un anticuerpo policlonal para precalicreína y este captura la precalicreína que se puede obtener de la muestra o de la disolución de referencia estándar. Posteriormente, se añadió un anticuerpo para precalicreína (policlonal) conjugado con peroxidasa de rábano picante al pocillo, destinado a unirse a la precalicreína capturada. Tras la eliminación de los anticuerpos no unidos mediante varios pasos de lavado, se añadió una disolución de un sustrato que reacciona con peroxidasa, lo que derivó en una coloración de manera dependiente de la concentración.

La coloración se formó en proporción a la cantidad de precalicreína presente en la muestra. Esta reacción se terminó mediante la adición de ácido y el color producido se cuantificó mediante una medición fotométrica a 450 nm. Para la determinación se utilizaron los sistemas BEPII o BEPIII (Siemens Co.).

La precalicreína humana se detectó, así como también la calicreína humana, debido a la reactividad cruzada de ambas con los anticuerpos emparejados policlonales aplicados.

1.2.6 ELISA del Factor XII

El antígeno del FXII humano en las muestras de inmunoglobulina SC se determinó cuantitativamente utilizando anticuerpos emparejados que se pueden adquirir de proveedores comerciales (ELISA tipo sándwich), p. ej., suministrados por Kordia Co. La estrategia de prueba aplicada es comparable a la determinación de FXI y PK mediante la tecnología ELISA según se ha mencionado anteriormente.

1.3 Resultados de las pruebas

Se analizó la actividad procoagulante de 29 lotes de producto farmacológico de inmunoglobulina SC fabricados en CSL Behring Marburg (Alemania). Los lotes se seleccionaron basándose en su esquema de adsorción. El porcentaje de la tasa de adsorción por lote de inmunoglobulina SC enunciado es el resultado de mezclar varios lotes de intermedios de fracción II/NI con diferentes niveles de adsorción.

Por ejemplo, se adsorbió la PT de la cantidad total (100%) de pastas de fracción II/III utilizadas para la muestra de inmunoglobulina SC n.° 13, mientras que un 59.8% también se sometió al paso de adsorción del inhibidor de C1- esterasa y un 1.8% a la adsorción de AT III.

También se iniciaron análisis y actividades de pruebas suplementarios de la inmunoglobulina SC en relación con la presencia potencial de cantidades traza de factores de coagulación activados y actividad proteolítica en el producto farmacológico de inmunoglobulina SC. Para la identificación y cuantificación de factores de coagulación residuales se llevaron a cabo varias estrategias complementarias:

• Se midieron las cantidades traza de FXI y FXIa mediante una prueba del aPTT modificada llevada a cabo con plasma deficiente de FXI.

• Se midió la actividad de tipo calicreína aplicando el sustrato cromogénico S-2302 (Chromogenix Co.) debido a que generalmente se supone que son las impurezas principales de los preparados de inmunoglobulina.

• Se investigó la presencia potencial de actividad proteolítica utilizando sustratos cromogénicos que caracterizan una amplia gama de proteasas.

• Se utilizó la tecnología ELISA para la determinación de antígenos de FXI, PK y FXII, respectivamente.

Los resultados del producto farmacológico de inmunoglobulina SC investigados mediante la actividad de tipo FXIa, actividad de tipo calicreína y actividad proteolítica se resumen en la Figura 5. El análisis estadístico de los resultados de las pruebas se llevó a cabo utilizando el programa informático Cornerstone versión 5.0 (Applied Materials Co.). La evaluación comprende 29 lotes de inmunoglobulina SC en total.

Tabla 1b: Lotes seleccionados de producto farmacológico de inmunoglobulina SC para evaluación analítica adicional

N.° de muestra

Esquema de adsorción [%] Actividad de tipo FXIa equiv. de FXIa [pg/mL] Actividad de tipo calicreína (S-2302)

PT C1 AT III [Mg/mL]

Lotes sin ningún paso de adsorción:

1 2 3 4

0 0 0 0.06 0.03 0.18 0.08 < 0.8 < 0.8 < 0.8 < 0.8

Lotes con un 100% de adsorción tanto de PT como de AT III, pero diferentes cantidades de material con C1

adsorbido:

5

41.3 < 0.01 < 0.8

6

100 43.4 100 <0.01 < 0.8

7

60.5 <0.01 < 0.8

Lotes con un 100% de adsorción de

PT y casi sin ninguna adsorción de AT III, pero diferentes cantidades de

material con C1 adsorbido:

8

0 0 14.14 20.0

9

8.8 0 6.56 11.9

10

13.1 0 11.10 15.9

100

11

30.8 0 12.90 19.5

12

34.8 0 17.96 18.8

13

59.8 1.8 23.98 23.7

Lotes con un 100% de material con PT adsorbida y de un 70 a un 80% de material con C1 adsorbido, pero diferentes

cantidades de material con AT III adsorbida:

14

76.4 15.1 14.94 21.6

100

15

72.3 59.2 3.73 12.3

Lotes adicionales seleccionados aleatoriamente:

16

41.1 41.1 63.2 0.13 < 0.8

17

4.6 0 86.4 <0.01 < 0.8

18

77.7 25.0 100 <0.01 < 0.8

19

86.5 13.5 0.3 2.13 6.0

20

77.4 0 30.3 1.51 3.0

21

6.2 55.0 0.33 5.0

22

3.3 11.9 3.42 9.8

23

26.8 29.6 5.66 11.3

24

14.1 58.4 2.67 7.6

25

100 0.9 1.8 8.11 14.4

26

1.9 4.0 5.40 13.4

27

30.7 40.4 8.19 10.1

28

17.6 22.6 5.57 15.9

29

20.4 10.1 3.71 17.5

5

10

15

20

25

Se seleccionó la muestra n.° 13 de inmunoglobulina SC como un lote con un nivel elevado de actividad procoagulante, mientras que la muestra n.° 7 representa un producto farmacológico de inmunoglobulina SC con un nivel bajo de actividad procoagulante en lo referente a todos los métodos analíticos aplicados. Se compararon ambos lotes y los resultados de las pruebas se muestran en la Tabla 3. Ambos lotes difieren en los procesos de fabricación de la fracción M/MI (precipitada al 25%) utilizada como fracción intermedia de partida para el proceso de fabricación adicional del respectivo producto farmacológico de inmunoglobulina SC. Se había adsorbido la PT de la cantidad total (100%) de pastas de fracción M/MI utilizada para ambos lotes y aproximadamente un 60% había pasado la adsorción de inhibidor de C1-esterasa en ambos casos. Sin embargo, se había adsorbido la AT III de un 100% de la fracción II/III utilizada para la muestra n.° 7, mientras que solo una cantidad insignificante de la fracción II/III que se utilizó posteriormente para la muestra n.° 13 había superado el paso de adsorción de AT III (1.8%).

Los datos demuestran que el producto farmacológico con una tasa de adsorción de AT III elevada en el proceso (muestra n.° 7) contiene niveles muy bajos de factores de coagulación activados y de actividad proteolítica en el producto farmacológico (remítase a la Tabla 3), en comparación con un producto fabricado con muy poca adsorción de AT III (muestra n.° 13).

El método utilizado para la determinación de la actividad proteolítica en el producto farmacológico de inmunoglobulina SC se llevó a cabo aplicando sustratos cromogénicos (S-2765, S-2238, S-2251 y S-2288) e indicó un efecto significativamente más bajo en el producto farmacológico cuando se llevó a cabo un paso de adsorción de ATIII posteriormente. Debido a la reacción relativamente baja al utilizar el sustrato S-2251, parece que la presencia de plasmina es menos relevante para el producto farmacológico de inmunoglobulina SC. Además, se determinó un mayor empobrecimiento en Ag de FXI (factor de 3.2), Ag de PK (factor de 6.6) y Ag de FXII (factor de 1.2) medidos mediante ELISA y se correlacionó con la adsorción de AT III procesada en un nivel elevado. Los datos anteriores fueron avalados por los resultados analíticos de las fracciones intermedias obtenidos antes y después del paso de adsorción de AT III (“sobrenadante de la fracción I antes de la adsorción de AT III” vs. “después del paso de adsorción de AT III”) según se presenta en la siguiente tabla, que muestra una disminución significativa en la actividad de tipo FXIa, así como también en el contenido de antígeno de PK, FXI y FXII.

Tabla 2: Comparación de fracciones intermedias antes y después del paso de adsorción de AT III

Fracción intermedia

Contenido de AT III [UI/mL] ELISA del FXI [Hg/mL] Actividad de tipo FXIa [ng/mL] ELISA del FXII [mUI/mL] ELISA de la PK [Hg/mL]

Sobrenadante de la fracción I antes de la adsorción de AT III

0.7 3.4 295 601 6.3

Después del paso de adsorción de AT III

0.1 0.3 < 10 16 4.5

Tabla 3: Comparación de las muestras de inmunoglobulina SC (7 vs. 13)

Esauema de adsorción

N.° de lote de inmunoglobulina SC

7 13

PT [%]

100 100

C1 [%]

60.5 59.8

AT III [%]

100 1.8

Métodos analíticos

< 0.01 23.98

Actividad de tipo FXIa

[equiv. de FXIa, Hg/mL]

Actividad de tipo calicreína (S-2302) [Hg/mL]

< 0.8 23.7

S-2765 [mDO/min]

0.3 26.8

5

10

15

20

25

S-2238 [mDO/min]

0.7 38.2

S-2251 [mDO/min]

0.1 3.9

S-2366 [mDO/min]

0.7 51.7

S-2288 [mDO/min]

1.2 53.2

Ag de Factor XI (ELISA) [pg/mL]

5.9 19.1

Ag de Precalicreína (ELISA) [pg/mL]

8.2 54.5

Ag de Factor XII (ELISA) [mUI/mL]

29.3 35.7

Los resultados de las pruebas revelaron que un nivel elevado de adsorción de AT III conduce a una disminución significativa de la actividad procoagulante del producto farmacológico de inmunoglobulina SC. Para detallar adicionalmente el efecto de la adsorción de AT III se midió el contenido de factores de coagulación específicos en el producto farmacológico mediante ELISA. La sólida correlación entre tanto la actividad de tipo calicreína y el Ag de precalicreína, como la actividad de tipo FXIa y el Ag de FXI se muestra en la Figura 6.

El aumento de la adsorción de AT III condujo a un empobrecimiento en FXI, PK y FXII, medidos en forma de antígeno mediante ELISA, así como también a una reducción de la actividad de tipo calicreína y FXIa, según se muestra en la Tabla 2, Tabla 3 y Figura 5.

Los análisis revelaron que los lotes de inmunoglobulina SC fabricados con un nivel elevado de adsorción de AT III presentan una actividad procoagulante baja. Estos lotes muestran concentraciones más bajas de actividad de tipo FXI (en plasma empobrecido en FXI), así como unos valores de actividad de tipo calicreína más bajos (valor del blanco de PKA). La determinación de la actividad proteolítica en un producto farmacológico de inmunoglobulina SC mediante la aplicación de varios sustratos cromogénicos (S-2765, S-2238, S-2251 y S-2288) indicó una actividad proteolítica significativamente más baja en el producto farmacológico cuando el nivel de adsorción de AT III es elevado.

El aumento de la adsorción de AT III condujo a un empobrecimiento en FXI, PK y FXII, medido en forma de antígeno mediante ELISA, así como a una reducción de la actividad de tipo calicreína y FXIa según se muestra en la Figura 5.

Se mostró una sólida correlación entre tanto el Ag de precalicreína y el Ag de calicreína como el Ag de FXI y la actividad de tipo FXIa. Se mostró que la actividad procoagulante detectada en la inmunoglobulina SC está causada principalmente por el contenido de calicreína y FXIa. Los datos generados en este estudio proporcionan una evidencia sólida de que un nivel elevado de adsorción de AT III conduce a una disminución significativa de la actividad procoagulante del producto farmacológico de inmunoglobulina SC.

Claims (2)

1. 10

   REIVINDICACIONES

   1. Método para reducir la actividad de FXIa en un preparado farmacéutico de inmunoglobulina derivado de una fracción de plasma, comprendiendo dicha fracción de plasma antitrombina III, comprendiendo el método poner en contacto la fracción de plasma con heparina, lo que reduce así la actividad de FXIa por mL de la fracción de plasma, donde la heparina está acoplada covalentemente a una matriz y la fracción de plasma se ha preadsorbido a una matriz de intercambio aniónico, donde la matriz de intercambio aniónico es una membrana de intercambio aniónico.
2. 2. El método de la reivindicación 1, donde la heparina acoplada covalentemente a una matriz se separa posteriormente de la fracción de plasma.