ES2648169T3 - Productos de virus recombinantes y métodos para inhibición de la expresión de DUX4 - Google Patents

Productos de virus recombinantes y métodos para inhibición de la expresión de DUX4 Download PDF

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Abstract

Un virus adeno-asociado recombinante que comprende el ADN que codifica miARN de DUX4 que se presenta en la SEQ ID NO: 1 o 2, en el que el virus adeno-asociado recombinante carece de los genes rep y cap.

Description

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microorganismos puede ser provocada por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando rAAV en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización con filtro. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de la solución previamente filtrada de forma estéril del mismo.
La transducción con rAAV también se puede realizar in vitro. En una realización, las células musculares diana deseadas se retiran del sujeto, se transducen con rAAV y se reintroducen en el sujeto. Como alternativa, se pueden usar células musculares singénicas o xenogénicas en las que esas células no generarán una respuesta inmunológica inapropiada en el sujeto.
En la técnica se conocen métodos adecuados para la transducción y reintroducción de células transducidas en un sujeto. En una realización, las células se pueden transducir in vitro por combinación de rAAV con células musculares, por ejemplo, en medios apropiados, e identificando sistemáticamente esas células que albergan el ADN de interés usando técnicas convencionales tales como transferencias de Southern y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. A continuación las células transducidas se pueden formular en composiciones farmacéuticas, y la composición se puede introducir en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como mediante inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal, o mediante inyección en músculo liso y cardiaco, usando por ejemplo, un catéter.
La transducción de células con rAAV de la invención como resultado una expresión sostenida de los miARN de DUX4. Por lo tanto la presente invención proporciona métodos para administrar/proporcionar rAAV que expresa los miARN de DUX4 a un animal, preferentemente un ser humano. Estos métodos incluyen transducción de tejidos (que incluyen, pero no se limitan a, tejidos tales como músculo, órganos tales como hígado y cerebro, y glándulas tales como glándulas salivares) con uno o más rAAV de la presente invención. La transducción se puede realizar con casetes genéticos que comprenden elementos de control específicos de tejido. Por ejemplo, una realización de la invención proporciona métodos para transducir células musculares y tejidos musculares dirigidos por elementos de control específicos del músculo, que incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos a partir de las familias de genes de actina y miosina, tales como a partir de la familia de genes myoD [Véase Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], el factor MEF-2 de unión a potenciador específico de miocitos [Cserjesi y Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], elementos de control obtenidos a partir gen de actina del esqueleto humano [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], el gen de actina cardiaco, elementos de secuencia de creatina quinasa muscular [Véase Johnson et al., Mol Cell Biol, 9: 3393-3399 (1989)] y el elemento potenciador de creatina quinasa de murino (mCK), elementos de control obtenidos a partir del gen de la troponina C de contracción rápida esquelética, el gen de la troponina C de contracción lenta cardiaca y el gen de la troponina I de contracción lenta: factores nucleares inducibles por hipoxia [Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)], elementos inducibles por esteroides y promotores que incluyen el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) [Véase Mader y White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)], y otros elementos de control.
El tejido muscular es una diana atractiva para administrar el ADN in vivo, porque no es un órgano vital y tiene un acceso fácil. La invención contempla la expresión sostenida de los miARN de miofibras transducidas.
Por "célula muscular" o "tejido muscular" se hace referencia a una célula o grupos de células obtenidas a partir de músculo de cualquier tipo (por ejemplo, músculo esquelético y músculo liso, por ejemplo del tracto digestivo, vejiga urinaria, vasos sanguíneos o tejido cardiaco). Las células musculares de este tipo pueden ser diferenciadas o no diferenciadas, tales como mioblastos, miocitos, miotubos, cardiomiocitos y cardiomioblastos.
El término "transducción" se usa para hacer referencia a la administración/suministro de miARN de DUX4 a una célula receptora ya sea in vivo o in vitro, a través de rAAV con déficit de replicación de la invención dando como resultado una expresión de un miARN de DUX4 por la célula receptora.
Por lo tanto, la invención proporciona métodos para administrar una dosis eficaz (o dosis, administradas esencialmente de forma simultánea o dosis administradas a intervalos) de rAAV que codifica miARN de DUX4 a un paciente con necesidad del mismo.
Breve descripción de las figuras
La Figura1 muestra la secuencia de ADN de DUX4 humano.
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proteína DUX4 de ~50 kDa de longitud completa se encuentran en biopsias y en líneas celulares de pacientes con FSHD. Estos datos son coherentes con un modelo de desrepresión transcripcional de la patogénesis de FSHD.
Además, a diferencia de los pseudogenes, las repeticiones de D4Z4 y DUX4 probablemente tienen importancia funcional, ya que las repeticiones de D4Z4 dispuestas en tándem se conservan en al menos once especies diferentes de mamíferos placentarios (los animales no placentarios carecen de repeticiones de D4Z4), con la mayor conservación de secuencia produciéndose dentro del ORF de DUX4. En segundo lugar, el DUX4 sobreexpresado es tóxico para células de cultivo tisular y precursores embrionarios de organismos inferiores en desarrollo in vivo. Esta toxicidad se produce al menos parcialmente a través de un mecanismo proapoptótico, indicado por activación de Caspasa-3 en células transfectadas con DUX4, y presencia de núcleos TUNEL-positivos en embriones de Xenopus con su desarrollo detenido a los que se inyecta ARNm de DUX4 en la etapa de dos células. Estos hallazgos son coherentes con estudios que muestran algunas proteínas pro-apoptóticas, incluyendo Caspasa-3, están presentes en músculos del paciente con FSHD. Además de estimular la apoptosis, DUX4 puede regular negativamente la miogénesis. DUX4 humano inhibe la diferenciación de mioblastos de C2C12 de ratón in vitro, potencialmente al interferir con PAX3 y/o PAX7, y provoca detención del desarrollo y una menor tinción de algunos marcadores musculares cuando se administra a células precursoras de pez cebra o embriones de Xenopus. Por último, la función anómala de DUX4 se asocia directamente con los cambios moleculares potencialmente importantes observados en los músculos del paciente con FSHD. De forma específica, el DUX4 humano de longitud completa codifica un factor de transcripción de homeodominio doble de aproximadamente 50 kDa, y su única diana conocida, Pitx1, estaba elevada en los músculos del paciente con FSHD que sobreexpresan DUX4. Estos datos respaldan que DUX4 cataliza numerosos cambios moleculares cadena abajo que son incompatibles con el mantenimiento de la integridad muscular normal.
Por lo tanto, mediante los siguientes se ilustran ejemplos aspectos y realizaciones de la invención. El Ejemplo 1 describe los miARN específicos para el gen DUX4. El Ejemplo 2 describe el efecto de los miARN en la expresión de DUX4 tal como se mide con el ensayo de luciferasa. El Ejemplo 3 describe el efecto in vitro de plásmidos provirales que expresan los miARN en la expresión de DUX4 tal como se mide mediante transferencia de Western. El Ejemplo 4 describe vectores rAAV que codifican los miARN de DUX4. El Ejemplo 5 describe el alivio de la miopatía inducida por DUX4 por vectores AAV6.miDUX4.405. El Ejemplo 6 describe la protección de los músculos contra los cambios patológicos musculares asociados con FSHD. El Ejemplo 7 describe la protección de ratones a partir de los déficits de fuerza de agarre asociados a DUX4.
Ejemplo 1
MicroARN específicos para el gen DUX4
Dos miARN específicos para el gen DUX4 gene se generaron mediante PCR. Se usaron cuatro cebadores de PCR que tenían las siguientes secuencias.
Cebador 662 (miDUX4hum405F):
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Cebador 663 (miDUX4hum405R): TTTTACTAGTAGGCAGTCCAGGATTCAGATCTGGTTTCCCATCTGTGGCTTTCAG (SEQ ID NO: 4) Cebador 665 (miDUX4hum1156F):
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Cebador 667 (miDUX4hum1156R):
TTTTACTAGTAGGCACAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACCCATCTGTGGCTTTCAG (SEQ ID NO: 6)
El ADN que codifica un miARN denominado hDux.mi405 se generó usando los cebadores 662 y 663. El ADN que codifica un miARN denominado hDux.mi1156 se generó usando los cebadores 665 y 667.
Un µg de cada cebador se añadió a una reacción de extensión de cebador de 1 ciclo: 95 ºC durante 5 min.; 94 ºC durante 2 min.; 52 ºC durante 1 min.; 72 ºC durante 15 min.; y a continuación manteniendo a 4 ºC. Los productos de PCR se limpiaron con el kit de Purificación de PCR QIAquick de Qiagen antes de su digestión durante una noche con enzimas de restricción XHOI y SPEI. A continuación el producto de digestión se desarrolló en un gel de TBE al
1,5 % y la banda se escindió y se purificó usando el Kit de Extracción en Gel QIAquick de Qiagen. Las secuencias de los miARN se presentan a continuación y en las Figuras 2A y 2B, respectivamente.
miDux4.405
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miDux4.1156
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10 Los dos productos de PCR se ligaron durante una noche a un vector U6T6 (a través de XhoI y XbaI) que contiene un promotor U6 de ratón y una señal de terminación de ARN polimerasa III (seis nucleótidos de timidina). Los miARN se clona en sitios de restricción XhoI y XbaI situados entre el extremo en la posición 3' del promotor U6 y la señal de terminación (el sitio SpeI en el extremo la posición 3' del molde de ADN para cada miARN tiene extremos cohesivos
15 complementarios con el sitio XbaI). El producto de ligación se transformó en células de E. coli químicamente competentes con un choque térmico a 42 ºC e incubado a 37 ºC con agitación durante 1 hora antes de su siembra en placas de selección de kanamicina. Se permitió que las colonias crecieran durante una noche a 37 ºC. Al día siguiente se mini-prepararon y se secuencian para precisión.
20 Ejemplo 2
Ensayo de Luciferasa para Efecto de Expresión de los miARN de DUX4
Se sometió a ensayo la expresión de la secuencia diana de DUX4 en presencia de los miARN de DUX4. Una
25 transfección con lipofectamina 2000 se realizó en 293 células en una placa de ensayo con paredes de color blanco, de 96 pocillos. Se transfectaron 140.000 células con 20 ng de un plásmido de Renilla-luciérnaga que contenía la secuencia diana de DUX4 (Figura 3A) y 180 ng de diversos vectores codificantes de miARN de DUX4, incluyendo los vectores miDux4.405 o miDux4.1156 dirigidos por U6T6 del Ejemplo 1. Un ensayo de luciferasa se realizó 24 horas más tarde.
30 El medio se retiró de las células y se añadieron 20 µl de tampón de lisis por pocillo. La placa se colocó en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de añadir 50 µl de sustrato de luciferasa. La primera lectura se tomó 10 minutos más tarde. A continuación, se añadieron 50 µl de sustrato de luciferasa Stop y Glo y la segunda lectura se tomó 10 minutos más tarde. La expresión de Renilla se dividió entre la expresión de luciérnaga
35 para calcular la expresión relativa. La expresión relativa se normalizó a continuación con respecto a la expresión de células que se transfectar aun con un miARN de control que se dirige a eGFP. Los resultados se muestran en la Figura 3B. Los miARN de DUX4, miDUX4.405 y miDUX4.1156, eran los más eficaces para reducir la expresión de proteína de luciferasa en células transfectadas.
40 Ejemplo 3
Ensayo de Transferencia de Western para Efecto de Expresión de los miARN de DUX4 de rAAV
A continuación, los casetes de expresión de miARN de U6T6.miDUX4 se clonaron en plásmidos provirales
45 AAV.CMV.hrGFP como se muestra en la Figura 4A. Los plásmidos provirales se co-transfectaron a continuación con un plásmido de expresión DUX4.V5 en 293 células y el efecto de la expresión de los miARN de DUX4 de los plásmidos provirales se sometió a ensayo mediante transferencia de Western. Una secuencia de U6.miGFP, que No se dirige a DUX4, se usó como control negativo para silenciamiento genético.
50 Un día antes de la transfección, se sembraron 293 células en una placa de 24 pocillos a 1,5 x 105 células/pocillo. A continuación las células se transfectaron con AAV-CMV-DUX4-V5 y AAV-CMV-miDUX4 (405 o 1156) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, N.º de Cat. 11668-019):
Grupo 1: 50 ng de AAV-CMV-DUX4-V5 + 800 ng de AAV-CMV-miDUX4 (1:16) 55 Grupo 2: 100 ng de AAV-CMV-DUX4-V5 + 800 ng de AAV-CMV-miDUX4 (1:8)
Treinta y seis h después de la transfección, las células se recogieron y se lavaron con PBS frío una vez. A continuación se añadieron setenta µl de tampón de lisis (NaCl 137 mM, Tris 10 mM pH = 7,4, NP40 al 1 %). Las células se volvieron a suspender completamente y se incubaron en hielo durante 30 min. Las muestras se
60 centrifugaron durante 20 min a 13.000 rpm a 4 ºC y el sobrenadante se recogió. El lisado celular se diluyó 5 veces Para el ensayo de concentración de proteína de Lowry (Reactivo A, B, S de Ensayo de Proteína Dc de Bio-Rad; N.º de Cat. 500-0113, 500-0114, 500-115). Se tomaron veintitrés µg de cada muestra y se añadieron 2x de tampón de
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muestra (Tris 100 mM a pH = 6,8, DTT 100 mM, glicerol al 10 %, SDS al 2 %, azul de bromofenol al 0,006 %). Las muestras se llevaron la ebullición durante 10 min y a continuación se pusieron en hielo.
Las muestras se cargaron sobre geles de poliacrilamida al 10 % (basándose en una proporción de 37,5:1 de acrilamida:bis acrilamida, Bio-Rad, N.º de Cat. 161-0158), 3,5 µg y 18 µg en dos geles para cada muestra. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF a 15 V durante 1 h usando transferencia semiseca (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad, N.º de Cat. 170-3940). Las transferencias se colocaron en tampón de bloqueo (leche seca sin grasa al 5 %, Tris 30 mM a pH = 7,5, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05 %) y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El tampón de bloqueo se decantó y se añadió una solución de anticuerpo primario anti-DUX4 (DUX4 p12, Santa Cruz, N.º de Cat. sc-79927,1:1,000) y se incubó con agitación durante una noche a 4 ºC. A continuación las membranas se lavaron durante 30 min, cambiando el tampón de lavado (NaCl 150 mM, Tris 30 mM a pH = 7,5, Tween-20 al 0,05 %) cada 10 min. Se añadió Anticuerpo de Burro Anti-Cabra conjugado con Peroxidasa (Jackson ImmunoReserch, N.º de Cat. 705-035-003, 1: 100.000) y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación las membranas se lavaron durante 30 min, cambiando el tampón de lavado cada 10 min. Las transferencias se colocaron en una solución de trabajo quimioluminiscente (Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore, N.º de Cat. WBKLS0500), incubado con agitación durante 5 min a temperatura ambiente, Y a continuación se expuso a una película de rayos X.
Las membranas se lavaron durante 20 min, cambiando el tampón de lavado cada 10 min. A continuación, se añadió tampón de separación (SDS al 2 %, Tris 62,5 mM a pH=6.7, b-ME 100 mM) a las transferencias y se incubó a 50 ºC durante 30 min. Las membranas se lavaron de nuevo durante 30 min, cambiando el tampón de lavado cada 10 min.
A continuación las membranas se bloquearon de nuevo y se volvieron a sondear con una solución de anticuerpo primario anti-GAPDH (Chemicon, N.º de Cat. MAB374, 1:200) y como anticuerpo secundario se usó Anticuerpo de Cabra Anti-Ratón conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoReserch, N.º de Cat. 115-035-146, 1:100.000).
Por último, las membranas se separaron de nuevo y se volvieron a sondear con anticuerpo anti-V5 (Invitrogen, N.º de Cat. R960-25, 1:5.000).
Los plásmidos provirales de AAV.miDUX4 reducían la expresión de proteína DUX4 in vitro. AAV-CMV-miDUX4.405 era el más eficaz para atenuación genética de la expresión de DUX4.
Ejemplo 4
Producción de rAAV Que Codifica MicroARN de DUX4
El vector se produjo mediante co-transfección en células HEK293 de tres plásmidos (auxiliar de pAd, auxiliar de AAV, y el genoma de rAAV que contenía miDUX4; descrito con detalle a continuación), seguido de cosecha celular, unificación de vector, valoración, y ensayos de control de calidad.
Plásmidos: el pAd auxiliar contiene los genes E2A, E4 ORF6, y VA I/II de adenovirus; los plásmidos auxiliares de AAV contienen rep2 y cap6 de AAV (por ejemplo, ha una preparación del serotipo 6 de AAV, el gen de la cápside se podría denominar cap6); el plásmido de rAAV contiene secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV que los elementos genéticos a empaquetar en el vector. Para el AAV.miDUX4, esto incluye el clonado U6.miDUX4 cadena arriba del indicador CMV.eGFP.
Transfección: los plásmidos se transfectaron en 293 células (Corning 10-Stack) usando CaPO4 a una proporción de
4:4:1 (20 ug de auxiliar de pAd: 20 ug de auxiliar de AAV: 5 ug de auxiliar de rAAV por placa.
Cosecha celular: Cuarenta y ocho h después de la transfección, las células se cosecharon y se volvieron a suspender en Tris 20 mM (pH 8,0), MgCl2 1 mM y NaCl 150 mM (T20M1N150) a una densidad de 5 x 106 células/ml. Las células se lisaron mediante cuatro ciclos secuenciales de congelación/descongelación y se añadió nucleasa Benzonasa (AIC, Solución de Reserva: 250 U/ul) para una concentración final de 90 U/ml antes de clarificación del lisado celular.
Purificación y Valoración del Vector: Los lisados clarificados se sometieron a purificación con gradiente en etapas de iodixanol como se ha descrito anteriormente (Xiao, X, et al., J. Virol 72: 2224-32). La fase de iodixanol al 40 % (que contiene rAAV) se diluyó 5 veces con un tampón de dilución no salino (pH que varía dependiendo del serotipo) y se aplicó a una columna Hi-Trap HP-Q/S. Después de elución con un gradiente salino de NaCl, se combinaron fracciones máximas de 1 ml (por lo general 3-5), se dializaron con T20M1N200 (pH 8,0), a continuación se filtraron de manera estéril y se complementaron con Pluronic F68 al 0,001 %. El vector se almacenó a -80 ºC. El virus purificado se valoró para vg usando Q-PCR como se ha descrito anteriormente [Schnepp y Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002)].
Los diagramas esquemáticos de los genomas de rAAV se muestran en la Figura 5.
imagen11

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US (4) US9469851B2 (es)
EP (3) EP2736539B1 (es)
AU (4) AU2012286994B2 (es)
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ES (2) ES2990023T3 (es)
WO (1) WO2013016352A1 (es)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2606152B2 (en) 2010-08-18 2025-03-12 Fred Hutchinson Cancer Center Methods for determining the presence or risk of developing facioscapulohumeral dystrophy (fshd)
EP2426203B1 (en) 2010-09-02 2016-07-13 Université de Mons Agents useful in treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
AU2012286994B2 (en) * 2011-07-25 2017-08-10 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of DUX4
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
LT2958943T (lt) 2013-02-20 2020-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vėžio gydymas, naudojant humanizuotą anti-egfrviii chimerinio antigeno receptorių
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
KR20160010526A (ko) 2013-05-15 2016-01-27 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 중추 신경계로의 아데노-연관 바이러스 매개 유전자 전달
CA2931684C (en) 2013-12-19 2024-02-20 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
US10538809B2 (en) * 2014-01-28 2020-01-21 Qiagen Gmbh Method of amplification of a short tandem repeat locus
IL322264A (en) 2014-04-07 2025-09-01 Novartis Ag Cancer treatment using chimeric antigen receptor (CAR) against CD19
JP6736540B2 (ja) 2014-07-21 2020-08-05 ノバルティス アーゲー Ｃｌｌ−１キメラ抗原受容体を使用した癌の処置
US9777061B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
SG11201700770PA (en) 2014-08-19 2017-03-30 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
ES2891332T3 (es) 2014-09-17 2022-01-27 Novartis Ag Direccionamiento a células citotóxicas con receptores quiméricos para la inmunoterapia adoptiva
AU2015330898B2 (en) 2014-10-08 2022-03-10 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
IL292999A (en) 2014-11-14 2022-07-01 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN112410338A (zh) 2014-11-14 2021-02-26 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
CN107567461A (zh) 2014-12-29 2018-01-09 诺华股份有限公司 制备嵌合抗原受体表达细胞的方法
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016115490A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of dux4
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
WO2016124793A1 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 Association Institut De Myologie Treatment of facioscapulohumeral dystrophy
MX2017012939A (es) 2015-04-08 2018-05-22 Novartis Ag Terapias cd20, terapias cd22 y terapias de combinacion con una celula que expresa un receptor quimerico de antigeno (car) de cd19.
AU2016249005B2 (en) 2015-04-17 2022-06-16 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US20170009230A1 (en) * 2015-07-08 2017-01-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting dux4 gene expression and uses thereof
WO2017015427A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
CN116334205A (zh) 2015-09-03 2023-06-27 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
EP3377042A4 (en) 2015-11-16 2019-05-29 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital MATERIALS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF TITIN-BASED MYOPATHIES AND OTHER TITINOPATHIES
CN108699557B (zh) 2015-12-04 2025-08-15 诺华股份有限公司 用于免疫肿瘤学的组合物和方法
PT3393504T (pt) 2015-12-22 2025-12-30 Novartis Ag Recetor de antigénio quimérico (car) de mesotelina e anticorpo contra o inibidor de pd-l1 para utilização combinada em terapia anticancerígena
AU2017222653B2 (en) * 2016-02-26 2023-06-01 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant virus products and methods for inducing DUX4 exon skipping
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
KR102775461B1 (ko) 2016-04-01 2025-02-28 어비디티 바이오사이언시스 인크. 핵산-폴리펩타이드 조성물 및 이의 용도
WO2017173411A1 (en) * 2016-04-02 2017-10-05 Research Institute At Nation Wide Children's Hospital Modified u6 promoter system for tissue specific expression
DK3442602T3 (da) 2016-04-15 2025-05-19 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adeno-associeret virusvektors frigørelse af mikrodystrofin til behandling af muskeldystrofi
AU2017250298B2 (en) 2016-04-15 2024-10-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type II
SG11201809699XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
CA3074723A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 University Of Massachusetts Silencing of dux4 by recombinant gene editing complexes
WO2018067992A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
DK3596222T5 (da) 2017-03-17 2024-09-02 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adenoassocieret virusvektorfremføring af muskelspecifik mikro-dystrophin til behandling af muskeldystrofi
MA47800A (fr) 2017-03-17 2020-01-22 Univ Newcastle Délivrance par vecteur viral adéno-associé d'un fragment de micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
KR20190130608A (ko) 2017-03-22 2019-11-22 노파르티스 아게 면역종양학을 위한 조성물 및 방법
CA3099522C (en) * 2017-09-19 2024-10-08 The Governors Of The University Of Alberta GAPMERES AND METHODS OF USING THESE FOR THE TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY
JP7449223B2 (ja) 2017-09-22 2024-03-13 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症ｉｉ型を治療するための遺伝子療法
EP3668997A4 (en) * 2017-10-02 2021-05-19 Research Institute at Nationwide Children's Hospital SYSTEM FOR MIRNA DETARGETING FOR TISSUE-SPECIFIC INTERFERENCE
WO2019078916A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Research Institute At Nationwide Children's Hospital ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR ADMINISTRATION OF MUSCLE-SPECIFIC MICRO-DYSTROPHINE TO TREAT MUSCLE DYSTROPHY
KR20200086278A (ko) 2017-10-18 2020-07-16 노파르티스 아게 선택적 단백질 분해를 위한 조성물 및 방법
IL321310A (en) 2017-10-20 2025-08-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Methods and materials for NT-3 gene therapy
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
AR114350A1 (es) 2018-01-31 2020-08-26 Res Institute At Nationwide Children’S Hospital Terapia genética para la distrofia muscular de cinturas del tipo 2c
AU2019284911B2 (en) 2018-06-13 2026-04-09 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
BR112020025995A2 (pt) 2018-06-18 2021-03-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital administração de microdistrofina músculo-específica por vetor de vírus adeno-associado para tratar a distrofia muscular
WO2020006458A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
US20220193250A1 (en) 2018-08-02 2022-06-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
AU2019419494B2 (en) * 2018-12-31 2026-03-26 Research Institute At Nationwide Children's Hospital DUX4 RNA silencing using RNA targeting CRISPR-Cas13b
CA3131390A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Research Institute Of Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
BR112021018793A2 (pt) 2019-03-29 2021-11-23 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Oligonucleotídeo modificado, composição farmacêutica compreendendo o mesmo composto para modular a expressão de dux4 e uso
US20220364086A1 (en) * 2019-07-12 2022-11-17 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE CAPABLE OF ALTERING SPLICING OF DUX4 pre-mRNA
EP4488287A3 (en) 2019-08-21 2025-03-05 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of alpha-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
KR20220104217A (ko) 2019-11-26 2022-07-26 노파르티스 아게 Cd19 및 cd22 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
US20230088865A1 (en) * 2020-01-10 2023-03-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
AU2021224186A1 (en) 2020-02-18 2022-09-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital AAV-mediated targeting of mirna in the treatment of X-linked disorders
WO2021188390A1 (en) * 2020-03-19 2021-09-23 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
BR112022019889A2 (pt) * 2020-04-02 2023-03-07 Mirecule Inc Inibição direcionada com o uso de oligonucleotídeos modificados geneticamente
US20240391969A1 (en) * 2020-05-22 2024-11-28 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods and compositions to spread protein cargoes across multi-nucleated cells
BR112022025586A2 (pt) 2020-06-15 2023-03-07 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Liberação de vetor de vírus adenoassociado para distrofias musculares
CA3189861A1 (en) * 2020-09-01 2022-03-10 Sean Christopher DAUGHERTY Dux4 inhibitors and methods of use thereof
AU2021342155A1 (en) 2020-09-11 2023-04-13 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents for inhibiting expression of DUX4, compositions thereof, and methods of use
JP2023541444A (ja) 2020-09-15 2023-10-02 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 筋ジストロフィー患者における多様なｄｍｄ変異の補正のためのａａｖ媒介性の相同性非依存的標的化組み込み遺伝子編集
JP2023551279A (ja) 2020-11-30 2023-12-07 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ｆｓｈｄ）を治療するための組成物及び方法
JP2024504377A (ja) * 2021-01-22 2024-01-31 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｄｕｘ４の発現を低減するための化合物及び方法
AU2022216260A1 (en) * 2021-02-03 2023-08-17 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for treating disease associated with dux4 overexpression
AU2022229489A1 (en) 2021-03-04 2023-08-31 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treatment of dystrophin-based myopathies using crispr-cas9 to correct dmd exon duplications
MX2023013561A (es) 2021-05-17 2024-02-12 Sarepta Therapeutics Inc Produccion de vectores de aav recombinantes para tratamiento de distrofia muscular.
EP4108263A3 (en) 2021-06-02 2023-03-22 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
WO2022272043A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Research Institute At Nationwide Children's Hospital , Inc. Salvianoic acid or adenosine dialdehyde for treating fagcioscapulohumeral muscular dystrophy (fshd)
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
CN117677698A (zh) * 2021-07-14 2024-03-08 米雷楚来股份有限公司 用于神经肌肉障碍的寡核苷酸及其组合物
MX2024003266A (es) 2021-09-16 2024-04-03 Avidity Biosciences Inc Composiciones y metodos de tratamiento de la distrofia muscular facioescapulohumeral.
US12285497B2 (en) 2021-10-15 2025-04-29 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
EP4186919A1 (en) 2021-11-30 2023-05-31 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
US20260097132A1 (en) 2022-09-23 2026-04-09 Sarepta Therapeutics, Inc. Recombinant aav vectors for treating muscular dystrophy
WO2024137767A1 (en) * 2022-12-22 2024-06-27 Mammoth Biosciences, Inc. Compositions and methods for modifying dux4
EP4704919A1 (en) 2023-05-02 2026-03-11 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Treatment of multiple sclerosis using nt-3 gene therapy
EP4705453A2 (en) 2023-05-02 2026-03-11 Research Institute at Nationwide Children's Hospital A modular system to convert therapeutic microrna expression cassettes from polymerase iii-based to polymerase ii-based promoters
WO2025096498A1 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for treating diseases or conditions associated with progerin expression
US12522830B2 (en) * 2023-11-22 2026-01-13 Wyvern Pharmaceuticals Inc. Composition for regulating production of interfering ribonucleic acid
WO2025179121A1 (en) 2024-02-21 2025-08-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Exon 17-targeted nucleic acids, compositions, and methods for treatment of dystrophin-based myopathies
WO2025212838A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treating diseases or disorders associated with dux4 overexpression
WO2025240690A2 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treating diseases or conditions associated with progerin expression from an aberrant lmna gene
WO2025260007A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods for diagnosing and treating muscular dystrophy diseases
WO2026011009A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Kate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for muscle disorders
WO2026030242A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Kate Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus compositions for the treatment of facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2026097050A1 (en) 2024-11-04 2026-05-07 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for measuring the potency of a silencing gene therapy

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
PT733103E (pt) 1993-11-09 2004-07-30 Targeted Genetics Corp Criacao de elevados titulos de vectores de aav recombinantes
ATE272123T1 (de) 1993-11-09 2004-08-15 Ohio Med College Stabile zellinie, die in der lage ist, das replikationsgen des adenoassoziertenvirus zu exprimieren
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
CA2207927A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
AU722196B2 (en) 1995-08-30 2000-07-27 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and AAV
EP1983057A3 (en) 1995-09-08 2009-01-07 Genzyme Corporation Improved AAV vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
AU723497C (en) 1996-09-06 2001-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1944362T3 (en) 1997-09-05 2016-01-25 Genzyme Corp Fremgangsmåder til fremstilling af hjælpevirusfri præparater med høj titer af rekombinante AAV-vektorer
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
AU2001255575B2 (en) 2000-04-28 2006-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
WO2002053703A2 (en) 2001-01-05 2002-07-11 Children's Hospital, Inc. Aav2 vectors and methods
EP1590471A4 (en) 2002-12-31 2009-12-09 Metamorphix Inc COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS OF INFERENCE RELATING TO CATTLE CHARACTERISTICS
WO2006107826A2 (en) 2005-04-04 2006-10-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Micro-rna's that regulate muscle cells
ES2569365T3 (es) * 2006-11-29 2016-05-10 Nationwide Children's Hospital Inhibición de miostatina para la potenciación de músculo y/o la mejora de la función muscular
US20110130442A1 (en) * 2008-06-04 2011-06-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid capable of controlling degranulation of mast cell
EP3072961A1 (en) * 2010-04-16 2016-09-28 Children's Medical Center Corporation Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
EP2606152B2 (en) 2010-08-18 2025-03-12 Fred Hutchinson Cancer Center Methods for determining the presence or risk of developing facioscapulohumeral dystrophy (fshd)
EP2426203B1 (en) * 2010-09-02 2016-07-13 Université de Mons Agents useful in treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
AU2012286994B2 (en) * 2011-07-25 2017-08-10 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of DUX4
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法

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