ES2648591T3 - Modelo animal farmacocinético - Google Patents

Abstract

Metodo para la evaluacion de una o mas propiedades farmacocineticas de una HSA variante en comparacion con HSA tipo salvaje que comprende a. seleccionar un conejo transgenico doble o un roedor transgenico doble donde los transgenes son albumina humana y un FcRn con una histidina en la posicion que corresponde con la posicion 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.o: 16; b. administrar la HSA variante a un animal y la HSA tipo salvaje a otro animal de conejo o roedor seleccionado en (a); y c. medir la una o mas propiedades farmacocineticas de la HSA variante y la HSA tipo salvaje.

Description

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DESCRIPCIÓN

Modelo animal farmacocinético Referencia al listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en la forma legible por ordenador.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a un método de la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una variante de albúmina de suero humano (incluida la albúmina modificada tales como fusiones genéticas, conjugados y asociados) utilizando un conejo transgénico doble o roedor transgénico doble. La presente invención también se refiere a modelos animales que son especialmente adecuados para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de las variantes de albúmina de suero humano o modificaciones de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] La albúmina es una proteína que se encuentra de forma natural en el plasma sanguíneo de mamíferos donde es la proteína más abundante. Tiene funciones importantes en el mantenimiento de la presión osmótica deseada de la sangre y también en el transporte de varias sustancias en el flujo sanguíneo.

[0004] El receptor de Fc neonatal (FcRn) "Brambell" es una molécula bifuncional que contribuye a mantener un alto nivel de inmunoglobulinas de isotipo G (IgGs) y albúmina en el suero en mamíferos tales como seres humanos. FcRn ha sido descubierto para recuperar la albúmina e IgG de la degradación intracelular por un mecanismo dependiente de pH así prolongando su vida media en el suero. Se ha descubierto que la vida media en el plasma de la albúmina de suero humano (HSA) tipo salvaje es de aproximadamente 19 días.

[0005] El uso de albúmina en la administración de fármacos está bien descrito. Agentes activos terapéuticos pueden por ejemplo ser conjugados con albúmina (WO 2000/69902) o polipéptidos activos terapéuticos se pueden fusionar genéticamente a la albúmina y expresarse como proteínas quiméricas (WO 2001/79271 y WO 2003/59934) o agentes activos terapéuticos pequeños acídicos o hidrofóbicos pueden asociarse reversiblemente a la albúmina (Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25,695 y WO 2000/71079). La unión reversible a la albúmina puede también ser conseguida para compuestos beneficiosos farmacéuticamente, que tienen pocas o ningunas propiedades de adhesión de albúmina por la asociación de tales compuestos a una fracción que tiene propiedades de unión de albúmina (Kurtzhals et al, 1997, J. Pharm. Sci. 86: 1365, y WO 2010/065950). Kratz, 2008, J. Controlled Release 132,171-183 proporciona una revisión de todas estas tecnologías. Los beneficios del uso de albúmina para administración de fármacos son vida media más larga y/o liberación controlada de un agente terapéutico y/o destino hacia tejidos u órganos selectivos.

[0006] Un número de variantes de albúmina natural se han descrito. Otagiri et al, 2009, Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534, divulga 77 variantes de albúmina conocidas, 22 se encuentran en el dominio I, 30 en el dominio II y 25 se encuentran en el dominio III. Se ha identificado un número de otras variantes naturales y algunas de estas han sido analizadas para unión de FcRn (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43,367-372; Galliano et al (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225,27-32; Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916,411-418; Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,4413-4417; Carlson et al (1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89,8225- 8229; (Peach, R. J. y Brennan, S. 0., (1991) Biochim Biophys Acta.1097:49-54). La vida media de variantes de albúmina humana de origen natural que utilizan un modelo de ratón fue descrita en Iwao, et. al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774,1582-1590. Además, una serie de variantes de albúmina hechas por el hombre con unión alterada al FcRn ha sido descrita en WO 2011/051489; WO2011/124718, WO 2012/059486, WO 2012/150319 WO 2011/103076, y WO 2012/112188, ninguna de estas publicaciones revela datos sobre las mediciones de la vida media de la variante de albúmina en modelos animales.

[0007] Los animales son frecuentemente usados en el desarrollo preclínico para predecir la farmacocinética de los agentes terapéuticos en seres humanos antes de la primera administración en el hombre. Para asistir en estas predicciones, se usan frecuentemente animales de diferentes tamaños y peso. La clasificación alométrica de interespecies se basa en la suposición de que hay similitudes anatómicas fisiológicas y bioquímicas entre animales que pueden ser descritas por modelos matemáticos simples. Un número de especies de animales se ha usado exitosamente en la clasificación alométrica de interespecies incluyendo el ratón, rata, cobaya, conejo, macaco cangrejero, babuino, macaco rhesus, perro, cerdo y oveja (Mahmood I. (2004) New Drug Development, Regulatory Paradigms for Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics, editado por Chandrahas G. Sahajwalla, Informa Healthcare, páginas 137-163, ISBN impreso: 978-0-82475465-5). Los cerdos son un modelo aceptado para moléculas pequeñas (Hall C. et al. (2012) J. Pharma Sci.

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101,1221-1241) y proteínas (Larsen M. O. y Rolin B. (2004) ILAR Journal 45, 303-313; Zheng Y. et al. (2012) mAbs 4, 243-255). De hecho el minicerdo Gottingen está ganando importancia como un gran modelo animal en la investigación farmacéutica debido a sus similitudes fisiológicas y anatómicas con los humanos y está sustituyendo a perros y primates no humanos en estudios preclínicos (Suenderhauf C. y Parrott N. (2013) Pharm. Res. 30,1-15).

[0008] El único modelo animal no primate disponible actualmente para evaluar la prueba del concepto de que las variantes mejoradas de HSA de unión a FcRn tendrán una vida media extendida son los ratones transgénicos de FcRn humano (homocigoto knock-out (KO) del gen de ratón y un heterozigoto knock-in (KI) del gen humano) (Roopenian et al (2003) J. Immunol. Vol 170, págs. 3528-3533). Este modelo, sin embargo, tiene limitaciones importantes desde el punto de vista de medir la vida media de HSA puesto que el ratón contiene una alta concentración circulante de albúmina de suero de ratón que se enlaza a FcRn humano con una afinidad 6 veces superior que HSA tipo salvaje (Andersen J.T. (2010) J Biol. Chem. 12,285(7): 4826-36).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0009]

La Figura 1 muestra la unión de variantes de albúmina para shFcRn. Diluciones en serie de cada variante de albúmina (10 |jM - 0.3 |jM) fueron inyectadas sobre shFcRn inmovilizado a pH 6.0. (A) HSA tipo salvaje, (B) HSA K573P, (C) HSA K573F, (D) HSA K573W, (E) HSA K573H y (F) HSA K573Y.

La Figura 2 muestra la unión de variantes de albúmina a FcRn soluble de rata (srFcRn). Diluciones en serie de cada variante de albúmina (10 jM-0.3 jM) fueron inyectadas sobre srFcRn inmovilizado a pH 6.0. (A) HSA tipo salvaje, (B) albúmina de suero de rata tipo salvaje (RSA); (C) HSA K573P, (D) HSA K573f, (E) HSA K573W, (F) HSA K573H y (G) HSA K573Y.

La Figura 3 muestra la unión de variantes de albúmina a albúmina soluble de suero de ratón (smFcRn). Diluciones en serie de cada variante de albúmina (10 jM-0.3 jM) fueron inyectadas sobre smFcRn inmovilizado a pH 6.0, con la excepción de HSA tipo salvaje (100 jM-3.0 jM). (A) HSA tipo salvaje, (B) MSA,

(C) RSA, (D) HSA K573P, (E) HSA K573F, (F) HSA K573W, (G) HSA K573H y (h) HSA K573Y.

La Figura 4 muestra la unión de variantes de albúmina a FcRn soluble de macaco rhesus (srmFcRn). Diluciones en serie de cada variante de albúmina (10 jM-0.3 jM) fueron inyectadas sobre srmFcRn inmovilizado a pH 6.0. (A) albúmina de suero de tipo salvaje de macaco rhesus (rmSA); (B) MSA, (C) RSA,

(D) HSA K573P, (E) HSA K573F, (F) HSA K573W, (g) HSA K573H, (H) HSA K573Y y (I) HSA tipo salvaje.

La Figura 5 muestra la unión de variantes de albúmina a FcRn soluble de perro (dFcRn). Diluciones en serie de variantes de albúmina inyectadas sobre FcRn soluble inmovilizado de perro a pH 6.0. (A) albúmina tipo salvaje de suero de perro (DSA) (B) HSA, (C) HSA K500A (D) HSA K573P, (E) HSA K573W, (F) HSA K573F, (G) HSA K573Y y (H) HSA K573H (I) rmSA, (J) albúmina de suero de cerdo tipo salvaje (PSA); (K) RSA, (L) MSA.

La Figura 6 muestra la unión de variantes de albúmina a FcRn soluble de cerdo (pFcRn). Diluciones en serie de variantes de albúmina inyectadas sobre FcRn soluble inmovilizado de cerdo a pH 6.0. (A) PSA (B) HSA, (C) HSA K500A (D) HSA K573P, (E) HSA K573W, (F) HSA K573F, (G) HSA K573Y y (H) HSA K573H (i) rmSA, (J) DSA, (K) RSA, (L) MSA.

La Figura 7 muestra áreas seleccionadas de un alineamiento de ClustalW de FcRn HC de (humano, macaco, vaca, cabra, oveja, camello, cerdo, perro, cobaya, conejo, rata y ratón). Los residuos de aminoácidos que son idénticos en todas las secuencias se indican por (*), Las sustituciones conservadas se indican por (:), y las sustituciones semiconservadoras se indican por (.). V52 Y H161 de SEQ ID N.°: 16 se subrayan en negrita. Los parámetros de alineamiento fueron penalización 10 para gaps de apertura y terminales, penalización 0.5 para gaps de extensión y de separación usando la matriz de puntuación Blosum.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0010] La presente invención proporciona un método para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una albúmina de suero humano (HSA) variante en comparación con HSA tipo salvaje. Las propiedades farmacocinéticas de moléculas donde HSA tipo salvaje y HSA variante se modifica por fusión, conjugación o asociación con un socio tal como agentes terapéuticos, vacunas o agentes de diagnóstico son de interés particular.

[0011] Una ventaja de la presente invención es que esta reduce la necesidad de modelos animales de primates para el cribado de albúmina que contiene fármacos mediante un modelo de animal no primate que puede producir perfiles de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas que pueden ser extrapoladas de forma razonable para indicar en qué se pueden parecer los perfiles farmacocinéticos humanos.

[0012] El modelo animal usado en el método de la presente invención se caracteriza por que la afinidad de unión de HSA tipo salvaje al FcRn nativo de dicho animal es el mismo que o superior a la afinidad de unión de la albúmina nativa de dicho animal.

Definiciones

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[0013] El término "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza del total de la suma de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, IgG o albúmina) y su socio de unión (por ejemplo, un antígeno o FcRn). A menos que se indique lo contrario, como se utiliza en este caso, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, albúmina y FcRn). La afinidad de una molécula (X) con su socio (Y) puede generalmente ser representada por la constante de disociación de equilibrio (Kd), que se calcula como la proporción koff/kon (kd/ka). La afinidad de unión se puede medir por métodos conocidos en la técnica. Un método preferido es la resonancia de plasmón de superficie (SPR) por ejemplo usando un instrumento Biacore (GE Healthcare) como se ejemplifica aquí. La afinidad de unión de pares endógenos de FcRn y albúmina (por ejemplo HSA a hFcRn, albúmina de perro a FcRn de perro, etcétera) generalmente varían de 0.2 a 3.2 micro Molar)

[0014] El término "modificado" o "modificación" en relación con la albúmina se refiere a cambiar la albúmina añadiendo o borrando moléculas no relacionadas con la secuencia de aminoácidos de la albúmina, por ejemplo eliminando ácidos grasos o añadiendo una molécula de un socio. La albúmina puede en particular ser modificada por conjugación, fusión o asociación de un socio. Los cambios en la secuencia de aminoácidos de la albúmina (por ejemplo SEQ ID N.°: 2) se denominan variantes y no se consideran modificaciones.

[0015] El término "conjugado" o "conjugación" en relación con albúmina se refiere a HSA tipo salvaje o una HSA variante o un fragmento de la misma que se conjuga a un socio de conjugación tal como un agente beneficioso, por ejemplo un agente terapéutico y/o agente de diagnóstico. La conjugación puede hacerse en el extremo N y/o extremo C de la albúmina, pero puede alternativamente o además hacerse en una o más (diferentes) posiciones adecuadas del aminoácido en la albúmina. En particular los residuos de cisteína que no están implicados en enlaces de disulfuro son adecuados para la conjugación. WO 2010/092135 describe una albúmina variante con residuos de cisteína adicionales adecuados para la conjugación. Técnicas para la conjugación de un socio de conjugación a una albúmina o fragmento de la misma se conocen en la técnica. WO 2009/019314 divulga ejemplos de técnicas adecuadas para la conjugación de un socio de conjugación, por ejemplo, un agente terapéutico, a un polipéptido cuyas técnicas también pueden ser aplicadas a la presente invención. Además, las páginas 37 a 44 de WO 2009/019314 revelan ejemplos de compuestos y fracciones que se pueden conjugar con la transferrina y estos compuestos y fracciones también se pueden conjugar con una variante de albúmina de la presente invención.

[0016] El término "fusionado" o "fusión" en relación con la albúmina se refiere a HSA tipo salvaje o una HSA variante o un fragmento de la misma que se fusiona genéticamente con un socio de fusión tal como un agente beneficioso por ejemplo un polipéptido terapéutico y/o polipéptido de diagnóstico. Las fusiones se hacen normalmente en el extremo N o extremo C de la albúmina, o a veces en ambas extremidades. Las fusiones pueden en principio, de forma alternativa o adicional hacerse en la molécula de albúmina, en este caso se prefiere localizar el socio de fusión entre los dominios de albúmina. Por ejemplo, un socio de fusión se puede situar entre dominio I y dominio II y/o entre dominio II y dominio III. Instrucciones con respecto a fusiones de albúmina o un fragmento de la misma se conocen en la técnica y la persona experta apreciará que tales instrucciones también pueden ser aplicadas a a la presente invención. Tabla 1 de WO 2001/79271, tabla 1 (página 11) de WO 2001/79258, tabla 1 (página 11) de WO 2001/79442, tabla 1 (página 12) de WO 2001/79443, tabla 1 (página 11) de WO 2001/79443, tabla 1 de WO 2003/060071, tabla 1 de WO 2003/59934, tabla 1 de WO 2005/003296, tabla 1 de WO 2007/021494 y tabla 1 de WO 2009/058322 contienen ejemplos de socios de fusión, por ejemplo polipéptidos terapéuticos, que se pueden fusionar con la albúmina o fragmentos de la misma, y estos ejemplos se aplican también a la presente invención.

[0017] El término "asociado", "asociar", o "asociación" con respecto a la albúmina se refiere a una composición que comprende HSA tipo salvaje o HSA variante o un fragmento de la misma y un socio de asociación, tal como un agente terapéutico y/o agente de diagnóstico, ligado o asociado a la albúmina o fragmento de la misma por unión no covalente. Un ejemplo de tal asociado es una albúmina y un lípido asociado a la albúmina por una interacción hidrofóbica. Tales asociados se conocen en la técnica y se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas. Las moléculas adecuadas para la asociación con albúmina se conocen en la técnica, preferiblemente son acídicas, lipofílicas y/o tienen características electronegativas. Ejemplos de tales moléculas se dan en la tabla 1 de Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695. Además, WO 2000/71079 describe la asociación de albúmina con paclitaxel y paclitaxel se incluye en la presente invención.

[0018] El término "nativo" con respecto a la albúmina y FcRn se refiere a la albúmina o proteínas FcRn que son genéticamente expresadas en un animal específico. La albúmina nativa en un ratón es normalmente la albúmina de suero de ratón endógeno que corresponde con el número de registro de UniProt P07724. FcRn comprende una cadena pesada (HC) de FcRn y una microglobulina beta2 (beta2m). La FcRn nativa en un ratón es normalmente FcRn HC de ratón endógeno que corresponde con número de registro de UniProt Q61559 y beta2m de ratón con número de registro de UniProt Q91Z73. Una albúmina nativa o FcRn puede

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sin embargo ser un gen transgénico que se integra en el genoma del animal de una manera estable y donde el gen correspondiente del animal ha sido desactivado. Un ejemplo es el ratón transgénico donde FcRn HC humano ha sido integrada en el genoma del ratón y el hFcRn HC de ratón ha sido desactivada (Roopenian et al (2003) J. Immunol. Vol 170, págs. 3528-3533). En este animal el hFcRn HC humano sería considerado para formar parte del FcRn nativo del animal transgénico. El FcRn nativo también puede ser una variante de FcRn, bien de origen natural o una variante producida por intervención humana. Un ejemplo de tal variante es un FcRn de ratón (SEQ ID N.°: 13) con una o varias de las siguientes mutaciones M73v y E184H.

[0019] El término "tipo salvaje" (Wt) en relación con albúmina o FcRn significa una albúmina o FcRn que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la albúmina o FcRn naturalmente encontrada en un animal o en un humano (la secuencia de gen endógeno del animal o humano). Se entiende que albúmina tipo salvaje o FcRn tipo salvaje es sin alteraciones genéticas producidas por intervención humana por ejemplo por desactivación/activación de genes como en la producción de animales transgénicos. SEQ ID N.°: 2 es una albúmina tipo salvaje madura de Homo sapiens. Más albúminas tipo salvaje y moléculas de FcRn tipo salvaje se enumeran en las tablas 1 y 3.

[0020] El término "identidad de secuencias" describe la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos. Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por apertura de gaps de 10, penalización por extensión de gaps de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera: (residuos idénticos x 100)/(Longitud de alineamiento - número Total de gaps en el alineamiento).

[0021] El término "agente terapéutico", "compuesto terapéutico", "molécula terapéutica" o "medicamento" se usa de forma intercambiable y se refiere a un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, o una macromolécula biológica (por ejemplo un péptido, proteína, lípido, ácido nucleico (por ejemplo ADN o ARN), virus) o una macromolécula biológica en asociación con un compuesto químico. Agentes terapéuticos incluyen agentes que pueden prevenir, mejorar o curar una condición médica. El agente terapéutico puede ser purificado, purificado sustancialmente o purificado parcialmente. Un "agente", según la presente invención, también incluye un agente de terapia de radiación y vacunas.

[0022] El término "variante de HSA" o "HSA variante" significa un polipéptido derivado a partir de una albúmina de suero humano que incluye una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o eliminación, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa una sustitución de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición. La variante también puede ser un fragmento funcional de HSA. Los fragmentos pueden consistir en una secuencia ininterrumpida derivada de albúmina o puede comprender dos o más secuencias derivadas de distintas partes de la albúmina. Los fragmentos según la invención tienen un tamaño superior a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente más de 150 residuos de aminoácidos, más preferido más de 200 residuos de aminoácidos, más preferido más de 300 residuos de aminoácidos, aún más preferido más de 400 residuos de aminoácidos y más preferido más de 500 residuos de aminoácidos. En una forma de realización preferida un fragmento corresponde a uno o más (varios) de los dominios de albúmina. Dominios de albúmina preferidos de la invención son dominio I de HSA consistente en residuos de aminoácidos 1 a 194 ± 1 a 15 aminoácidos de SEQ ID N.°: 2; dominio II de HSA consistente en residuos de aminoácidos 192 a 387 ± 1 a 15 aminoácidos de SEQ ID N.°: 2 y dominio III de HSA consistente en residuos de aminoácidos 381 a 585 ± 1 a 15 aminoácidos de SEQ ID N.°: 2 o una combinación de uno o más (varios) de estos dominios, por ejemplo dominio I y II, dominio II y III o dominio I y III fusionados juntos. El polipéptido alterado (variante) puede ser obtenido por intervención humana por alternancia de la secuencia de polinucleótidos que codifica la HSA. La albúmina variante es preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferible al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99.5% o al menos 99.8% idéntica a la SEQ ID N.°: 2 y mantiene al menos una de las propiedades principales de HSA. Generalmente, variantes o fragmentos de HSA tendrán al menos 10% (preferiblemente al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%) de actividad de unión de ligandos de HSA (por ejemplo unión de bilirrubina) y al menos 50% (preferiblemente al menos 70%, 80%, 90% o 95%) de actividad oncótica de HSA, peso en peso. La actividad oncótica, conocida también como presión coloidosmótica, de albúmina, variantes de albúmina o fragmentos de albúmina se puede determinar por el método descrito por Hoefs, J.C. (1992) Hepatology 16:396-403. La unión de bilirrubina se puede medir por realce de fluorescencia a 527 nm con respecto a HSA. La bilirrubina (1.0mg) se disuelve en 50microL de 1M de NaOH y se diluye a 1.0mL con agua desmineralizada. La materia prima de bilirrubina se diluye en 100mM Tris-HCl pH8.5,1mM EDTA para dar 0.6nmol de bilirrubina/mL en una cubeta de fluorómetro. La fluorescencia

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se mide por excitación a 448nm y la emisión a 527nm (anchuras de ranura de 10nm) durante la titulación con HSA sobre una gama de proporciones de HSA:bilirrubina de 0 a 5 mol:mol. La variante puede poseer unión alterada a FcRn cuando se compara con la HSA. La secuencia polipeptídica variante es preferiblemente una que no se encuentra en la naturaleza.

[0023] El término "secuencias reguladoras" significa todos los componentes (por ejemplo secuencias de ácidos nucleicos) necesarios para la expresión de un polinucleótido insertado en un animal. Cada secuencia reguladora puede ser nativa (es decir del mismo gen) o foránea (es decir a partir de un gen diferente) al polinucleótido que codifica el polipéptido transgénico. Tales secuencias reguladoras incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias reguladoras incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional.

[0024] El término "enlazado operativamente" significa una configuración donde una secuencia reguladora se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia transgénica de un polinucleótido de manera que la secuencia reguladora dirige la expresión de la secuencia transgénica.

[0025] Un número de proteínas terapéuticas fusionado con la albúmina tipo salvaje ha introducido el desarrollo clínico. Algunos ejemplos son interferón-alfa fusionado con la albúmina tipo salvaje, GCSF fusionado con la albúmina tipo salvaje, GLP-1 fusionado con la albúmina tipo salvaje y Factor IX fusionado con la albúmina tipo salvaje. Al probar la vida media de estos compuestos en un modelo animal, la prueba comparará la proteína terapéutica sola contra la proteína terapéutica fusionada con la albúmina, por ejemplo GLP1 y GLP1-albúmina. En tal caso será completamente fácil ver un cambio en la vida media entre las moléculas solamente debido a la diferencia en la filtración renal sin tener en cuenta qué modelo animal se usa.

[0026] Sin embargo, si se desea investigar la diferencia en una o más (diferentes) propiedades farmacocinéticas de albúmina tipo salvaje y variantes de albúmina donde el cambio en la vida media no será debido a la diferencia de tamaño y filtración renal consecuente, es importante tener un modelo animal que permita la identificación de tales diferencias.

[0027] Las albúminas han sido caracterizadas de muchas especies incluido humano, cerdo, ratón, rata, conejo y cabra y comparten un alto grado de secuencia y homología estructural (ver tabla 1). La albúmina de suero humano (HSA) es un polipéptido bien caracterizado de 585 aminoácidos con una masa molecular de 67 kDa. Muchas características de las albúminas se resumen en Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 103).

Tabla 1. Lista no exclusiva de albúminas tipo salvaje de varias especies

Nombre común

Especies Número de acceso GenBank o SwissProt % identidad con SEQ ID N.°: 2* Residuos de secuencia madura

Humano

Homo sapiens P02768.2 100.0 25-609

Chimpancé

Pan troglodytes XP 517233 (secuencia predicha) 98.8 25-609

Orangután de Sumatra

Pongo abelii Q5NVH5.2 98.5 25-609

Macaco (Macaco Rhesus)

Macaca mulatta NP 001182578 93.3 25-608

Macaco cangrejero (macaco cynomolgous)

Macaca fascicularis A2V9Z4 93.3 25-608

Gato

Felis catus P49064.1 81.9 25-608

Perro

Canis lupus familiaris P49822.3 80.0 25-608

Vaca

Bos taurus P02769.4 75.8 25-607

Cerdo

Sus scrofa P08835.2 75.1 25-607

Oveja

Ovis aries P14639.1 75.0 25-607

Cabra

Capra hircus B3VHM9 74.8 1-583

Conejo

Oryctolagus cuniculus P49065.2 SEQ ID N.°: 8 74.3 25-608

Rata

Rattus norvegicus P02770.2 73.3 25-608

Ratón

Mus musculus P07724.3 72.3 25-608

Cobaya

Cavia porcellus Q6WDN9 72.1 25-608

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* la identidad de secuencia fue calculada utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch como se implementa en el programa de Needle de EBLOSUM62 (paquete de programas EMBOSS, versión 6,1,0) usando la penalización por apertura de gaps de 10, penalización por extensión de gaps de 0,5 y seleccionando la opción no brief para obtener la identidad más larga._______________________________________________

[0028] Como se puede observar de la tabla 1, la albúmina de cerdo (75,1% de identidad con la albúmina humana) tiene un grado similar de identidad con la albúmina humana como la albúmina de ratón (72,3% identidad con la albúmina humana), albúmina de conejo (74,3% identidad con la albúmina humana) o albúmina de rata (73,3% identidad con la albúmina humana), mientras los primates no humanos: chimpancé (98,9% identidad con la albúmina humana), macaco (93,3% identidad con la albúmina humana) y orangután (98,5% identidad con la albúmina humana), tienen un grado más alto de identidad con la albúmina humana que la albúmina de cerdo.

[0029] La albúmina humana se sintetiza predominantemente en el hígado. Los hepatocictos no contienen un grupo grande de albúmina intracelular almacenada, más bien la proteína es rápidamente segregada desde la célula dando como resultado aproximadamente 13-14g de albúmina que se introduce en el espacio intravascular cada día, equivalente a 3,7%/día de la masa de albúmina total del cuerpo de 360g para una persona de 70kg. La concentración de albúmina de plasma humano normal es 42±3.5 g/L y con un volumen medio de plasma de 2.5-3.0L para una persona de 70kg, la masa de albúmina intravascular media es 113- 126g (~120g). La albúmina Intravascular es constantemente cambiada a razón de 4-5%/hr por transporte a través del endotelio con el grupo de albúmina extravascular de 240g, dando como resultado una masa de albúmina total del cuerpo de 360g para una persona de 70kg. La albúmina extravascular retorna al compartimento vascular por drenaje a través del sistema linfático. Del grupo de albúmina extravascular de 240g unos 175g están en intercambio libre con el grupo intravascular (grupo intercambiable total = 295g) mientras otros 65g no están en intercambio libre. Aproximadamente 80% del grupo extravascular total es igualmente dividido entre el músculo y la piel. Una masa de albúmina equivalente a aquella que se introduce en el espacio intravascular (13-14g) es catabolizada del espacio intravascular cada día. El índice de degradación fraccional, 3.7% del grupo intravascular de 120g/día, equivale a una vida media (t1/2) de 19 días (Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 10-3); C.L. Anderson, et al (2006) Trends in Immuno. 27: 343-348; y J. Kimet al. (2007) Clinical Immuno. 122: 146-155). La albúmina es un componente de muchas secreciones del cuerpo humano incluida leche, sudor, lágrimas y saliva. La albúmina es principalmente perdida desde la circulación por degradación en los órganos mayores, como la piel y el músculo que tiene la circulación más extensa y en consecuencia un grupo grande de células endoteliales que alinean la vasculatura.

[0030] El destino de una molécula de albúmina será la degradación, transporte a través de grupos o compartimentos o intercambio entre ellos, la recuperación y reciclaje se controla en gran parte por la interacción con receptores de albúmina gp18 y gp30, (Ghinea A. et al. (1988) J. Cell Biol. 107: 231-239; Schnitzer J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24544-24553; Schnitzer J. Et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 7562-7570), gp60 (Schnitzer J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 6072-6082; Minshall R. et al. (2002) Histochem. Cell. Biol. 117: 105-112; Malik A. B. (2009) J. Med. Sci. 2,13-17; y Predescu D. y Palade G. E. (1993) Am. J. Physiol. 265; H725-H733) y FcRn (Anderson C. L. et al. (2006) Trends in Immuno. 7, 343-348; Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725, Baker K. et. al (2009) Semin Immunopathol. 31, 223-236; Andersen J. T. and Sandlie I. (2009) Drug Metab. Farmacokinet. 24,318-332 y Kuo T. T. et al. (2010) J. Clin. Immunol 30,777-789). gp18 y gp30 están presentes en fibroblastos cultivados, células de músculo liso y células endoteliales; están distribuidos también ubicuamente encontrándose en el corazón, pulmón, músculo, riñón, grasa, cerebro, suprarrenal, páncreas y hígado. La albúmina dañada (por ejemplo mutaciones puntuales, truncamientos, mutantes de glicosilación, oxidación o incluso yodación) tiene una afinidad 1000 veces más alta para ambos gp18 y gp30 que la albúmina nativa. Las albúminas dañadas, una vez internalizadas, son degradadas, un proceso que se puede inhibir por inhibidores conocidos de la degradación lisosómica al igual que inibieron gp18 y gp30 medió la degradación de albúmina dañada. Por lo tanto gp18 y gp30 parecen proteínas secuestrantes y así pueden mediar la unión de afinidad alta, endocitosis y degradación de albúminas dañadas, pero no albúminas nativas.

[0031] Un análisis de orina de sujetos sanos revela trazos de cantidades (<0.03g/L) de albúmina, que es significativamente menos del 3-6g de albúmina que pasa a través del glomérulo cada día aunque riñones humanos procesan sangre conteniendo 37kg de albúmina a diario (Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 103); Gekle M. (2005) Ann. Rev. Physiol. 67,573-594). En individuos sanos menos del 1% de la carga de albúmina filtrada glomerular a diario aparece en la orina.

[0032] En seres humanos la larga vida media circulatoria de la albúmina es dependiente de la interacción funcional con FcRn y la naturaleza de la barrera de filtración glomerular que retiene proteínas de más de ~60kDa en el retenido glomerular mientras que las proteínas menores de ~60kDa se filtran y aparecen a una extensión superior progresivamente en el ultrafiltrado glomerular cuando el tamaño de la proteína se reduce.

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[0033] Se ha mostrado que la vida media circulatoria de la albúmina afectó hasta varios grados por glicación, glicosilación, oxidación, cambios estructurales y mutaciones puntuales en la secuencia primaria de albúmina, especialmente los daños que afectan la hidrofobicidad y la carga neta de las moléculas reducen la vida media (Nakajou et al. Biochim Biophys Acta. (2003) 1623,88-97; (Iwao Y. Et al. (2006) Biochim Biophys Acta. 1764,743-749; Iwao Y et al. (2007) Biochim Biophys Acta. 1774,1582-1590; Sheffield W. P. et al. (2000) Thrombosis Research 99, 613-621).

[0034] Dada la importancia de la interacción con FcRn no es inesperado que las albúminas dañadas o variantes que no interactúan con FcRn hayan reducido la vida media, con la consecuencia de que la concentración de albúmina en el plasma es reducida, una condición conocida como analbuminemia. Las variantes naturales de albúmina (Bartin, Bazzano, Venezia) que tienen truncamientos en el extremo C de albúmina todas han reducido la vida media y en el caso de variantes de Bazzano y Venezia están también asociadas a un aumento en la absorción en el hígado, en el riñón y en el bazo. Investigaciones adicionales han revelado que en el caso de la variante de Bartin la vida media reducida se asoció también a una ausencia de cualquier unión de FcRn dependiente del pH (Iwao Y. Et al. (2009) Biochim Biophys Acta. 1794,634-641; Andersen J. T. et al. (2010) Clin Biochem. 43,367-372). Se debe establecer todavía si muchas de las vidas medias alteradas y absorción en el órgano de albúminas dañadas o variantes in vivo observadas son de hecho como el resultado de la unión de FcRn alterada.

[0035] Las vidas medias circulatorias de albúmina de tipo salvaje (Wt) en varios animales ha sido estudiada in vivo por un número de diferentes técnicas. La Tabla 2, a continuación, resume algunas de las vidas medias publicadas de albúmina en especies diferentes.

Tabla 2. Vida media de albúmina en especies diferentes

Animal

Vida media de albúmina (días) Referencia

Ratón

1.2 1 Dixon et al. (1953) Exp. Biol. Med. 83,287-288 Stevens et al. (1992) Fundam. Appl. Toxicol. 19,336-342

Rata

2.0-2.5 Sell S. (1974) Cancer Research 34,1608-1611

Conejo

5.7 ± 0.3 Dixon et al. (1953) Exp. Biol. Med. 83,287-288

5.5 ± 0.11 Hatton et al. (1993) J. Theor. Biol. 161,481-490

Perro

8.2 ± 1.2 Dixon et al. (1953) Exp. Biol. Med. 83,287-288

Cerdo

7.4 a 9.5 Dich & Nielsen (1963) Can. J. Comp. Med. Vet. Sci.27,269-273

Oveja

14 a 28 Campbell et al (1961) J. Physiol. 158 113

Humano

19 Peters, T., Jr. (1996) All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando

15.0 ± 1.9 Dixon et al. (1953) Exp. Biol. Med. 83,287-288

14 a 23 Cohen et al (1961) Clin. Sci. 20 161

12.7 a 18.2 Beeken et al (1962) J. Clin. Invest 62 1312

Vaca

20.7 ± 1.1 Dixon et al. (1953) Exp. Biol. Med. 83,287-288

14 a 19 Cornelius et al (1962) Amer. J. Vet. Res. 23 837

[0036] Muchas de las referencias desde 1960 han usado albúmina marcada I-131 para medir la vida media de albúmina, una exposición general cuando se usa albúmina marcada I-131 es grados variables de desnaturalización que incurrieron durante la preparación de la proteína y su marcado radioisotópico (Beeken et al (1962) J. Clin. Invest 62 1312). Generalmente se puede observar que la vida media de albúmina aumenta con el tamaño de las especies

[0037] La albúmina se enlaza in vivo a su receptor, el receptor de Fc neonatal (FcRn) "Brambell" y esta interacción se conoce por ser importante para la vida media en el plasma de albúmina en que esta salva a la albúmina de la degradación intracelular (Roopenian D. C. y Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7,715725.). FcRn es una proteína unida a la membrana, expresada en muchos tipos de célula y de tejido incluidos los endotelios vasculares, renales (podocitos y túbulo contorneado proximal (PCT)) y cerebrales; células presentadoras de antígenos; intestino, vía respiratoria superior y epitelios alveolares. FcRn es un receptor heterodimérico consistente en una cadena pesada de transmembrana (HC) de 46kDa tipo clase I de MHC que está asociada de manera no covalente a un 12kDa (beta2m). FcRn solo tiene afinidad a la albúmina e IgG a pH ácido (debajo de pH6.5). Los complejos de IgG y albúmina:FcRn, formados en el pH ácido del endosoma, se clasifican en vesículas separadas, así desviando las moléculas hacia afuera desde la ruta de degradación lisosómica predeterminada. Los complejos de albúmina:FcRn son reciclados de nuevo a la superficie de membrana plasmática donde encuentran pH fisiológico y tanto la albúmina como IgG son liberados de FcRn que es luego preparado para rescatar más albúmina e IgG, así aumentando la vida media en el plasma de albúmina e IgG. Por el contrario proteínas internalizadas que no se unen a FcRn se clasifican para la degradación en el lisosoma.

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[0038] El principal sitio de unión de FcRn se localiza dentro de DIII (381-585), (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43,367-372). Un modelo de la interacción de albúmina humana con FcRn humano ha sido descrito. Un número de aminoácidos clave en la albúmina han demostrado ser importantes en la unión, sobre todo histidinas H464; H510 y H536 y lisina Lys500 (Andersen et al (2010), Nat. Commun. 3:610. DOI:10.1038/ ncomms1607). Los datos indican que los aminoácidos dentro de DI (1-197) de la albúmina contribuyen a a la interacción de la albúmina con FcRn. De manera importante, la albúmina interactúa con el hFcRn HC y no el beta2munit (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43,367-372; (Andersen et al (2012) Nature Communications Vol. 3, págs. 610). Los datos indican que IgG y albúmina se enlazan de forma no cooperativa a sitios diferentes en FcRn (Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36,3044-3051; Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45, 4983-4990; (Anderson C. L. et al. (2006) Trends in Immuno. 7, 343-348; Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725; Baker K. et. al (2009) Semin Immunopathol. 31, 223-236; Andersen J. T. and Sandlie I. (2009) Drug Metab. Farmacokinet. 24,318-332 y Kuo T. T. Et al. (2010) J. Clin. Immunol 30,777-789).

[0039] Estructuras de cristal de FcRn muestran la parte extracelular de la cadena pesada con una plataforma aminoterminal alfa1-alfa 2 de ocho cadenas plisadas en beta antiparalelas recubiertas por dos alfa-hélices largas seguidas del dominio alfa-3 de la membrana proximal (revisado en Roopenian D. C. y Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7,715-725.). El beta2munit se une de forma estrecha a los residuos situados debajo de la plataforma alfa1-alfa2 y al dominio alfa3 de la cadena pesada.

[0040] El hFcRn HC ha sido caracterizada de muchas especies incluido humano, cerdo, ratón, rata, conejo y cabra y comparten un alto grado de homología de secuencias y estructural (ver tabla 3).

Tabla 3. Lista no exclusiva de FcRn HC tipo salvaje de varias especies

Nombre común

Especie Número de registro Longitud (aa) Secuencia madura % identidad con FcRn HC humano (SEQ ID N.°: 9)*

Humano

Homo sapiens P55899 365 24-365 100

Chimpancé

Pan troglodytes XP 512822 370 29-370 97.8

Orangután de Sumatra

Pongo abelii NP 001125939 365 24-365 97.5

Macaco cangrejero (macaco cynomolgous)

Macaca fascicularis Q8SPV9 365 24-365 97.0

Macaco (macaco Rhesus)

Macaca mulatta I0FJX2 365 24-365 96.7

Gorila occidental

Gorilla gorilla gorilla XP 004061232 392 51-392 84.5

Perro

Canis lupus familiaris XP 533618 354 23-392 83.1

Gato

Felis catus XP 003997640 448 116-448 79.7

Vaca

Bos taurus NP 788830 Q3T119 354 24-354 77.1

Camello

Camelus dromedarius Q2KN22 355 25-355 76.8

Cabra

Capra hircus XM 005692722 306 ? 75.8

Oveja

Ovis aries NP 001116875 Q8HZV2 354 24-354 76.3

Cerdo

Sus scrofa Q866U4 358 23-358 74.6

Cobaya

Cavia porcellus H0VXB0 354 25-354 77.3

Conejo

Oryctolagus cuniculus NP 001116409 A9Z0W1 358 24-358 72.9

Ratón

Mus musculus BAA07110 365 22-365 66.9

Rata

Rattus norvegicus P13599 366 23-366 65.1

* la identidad de secuencia fue calculada utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch como se implementa en el programa Needle de EBLOSUM62 (conjunto de programas EMBOSS, versión 6,1,0) usando penalización por apertura de gaps de 10, penalización por extensión de gaps de 0,5 y seleccionando la opción no brief para obtener la identidad más larga.

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[0041] Como se puede observar de tabla 3 (identidad de FcRn HC), FcRn HC de cerdo (74.6 % de identidad a FcRn HC humano) tiene un grado similar de identidad con FcRn HC humano como FcRn HC de ratón (66.9% identidad con FcRn HC humano), o FcRn HC de rata (65.1% identidad con FcRn HC humano), mientras los primates no humanos chimpancé (97.8% identidad con FcRn HC humano +), macaco (97% identidad con FcRn HC humano), macaco Rhesus (96.7% identidad con FcRn HC humano), gorila (84.5% identidad con FcRn HC humano) y orangután (97.5% identidad con FcRn HC humano), tienen un grado más alto de identidad con FcRn HC humano que FcRn HC de cerdo.

[0042] La farmacocinética de HSA, incluidas las variantes de HSA y modificaciones en un modelo animal serán influidas por la afinidad de HSA para el FcRn animal nativo en comparación con la afinidad de la albúmina animal nativa para el FcRn de animal nativo. Si la afinidad de la albúmina animal nativa para el FcRn animal es superior a la afinidad de HSA para el mismo FcRn animal, la albúmina animal nativa llevará a una competición superior para el FcRn que sería el caso en un humano.

[0043] Es conocido que FcRn de ratón se enlaza a IgG de ratones y seres humanos mientras que FcRn humano resulta ser más distintivo (Ober et al. (2001) Int. Immunol 13,1551-1559). La unión de albúmina de varias especies a FcRn humano muestra la misma imagen como su unión a IgG. Según el Ejemplo 5 de WO 2011/051489, la jerarquía de unión de albúmina a FcRn humano soluble que varía de unión más fuerte a unión más débil es cobaya =/> conejo > hámster/perro > rata/ratón > asno > humano > bovino > cabra/oveja > pollo. Estos datos muestran que las albúminas animales tienen afinidades de unión diferentes para shFcRn. Esta selectividad de especies en relación con la interacción FcRn-albúmina es pertinente cuando se considera un modelo animal farmacocinético. La reactividad de especies cruzadas entre albúmina de ratón (MSA) y HSA para FcRn de ratón soluble (smFcRn) y FcRn humano soluble (shFcRn) fue investigada en Andersen et al (2010) Journal of Biological Chemistry vol 285 pp 4826-4836. Un extracto de tabla 2 de este documento se incluye aquí como tabla 4:

Tabla 4: Cinética de las interacciones de albúmina con variantes de FcRn

Especie de albúmina

Especie FcRn de Ka 103/Ms Kd 10-3/s KD mM KD estado de equilibrio

MSA

Ratón salvaje tipo 4.2 ± 0.5 39.4±3.1 9.3 ± 0.4 ND

MSA

Humano salvaje tipo 3.8 ± 0.0 3.1 ± 0.1 0.8 ± 0.2 ND

HSA

Ratón salvaje tipo NA NA NA 86. 2±4.1

HSA

Humano salvaje tipo 2.7 ± 1.3 12.2 ± 5.9 4.5 ± 0.1 4.6 ± 0.5

[0044] Ninguna unión de albúmina de cualquier especie fue observada a pH fisiológico para cualquier receptor. La jerarquía de afinidad de unión a pH 6.0 fue de la siguiente manera; shFcRn:MSA > shFcRn:HSA > smFcRn:MSA > smFcRn:HSA. La cinética de unión de smFcRn:HSA fue tan rápida que la afinidad de unión no pudo ser determinada, lo que significa que en un ratón, HSA se enfrentaría a una competición muy fuerte desde la MSA nativa. A pH ácido, la afinidad de albúmina de suero de ratón para FcRn de ratón es 9.2 veces superior a la afinidad de albúmina de suero humano para FcRn de ratón, mientras la afinidad de albúmina de suero de ratón para FcRn humano es 5,6 veces superior a la afinidad de albúmina de suero humano para FcRn humano. Se mostró que la afinidad de albúmina de suero de ratón para FcRn humano fue 107,5 veces superior a la afinidad de albúmina de suero humano para FcRn de ratón. En cualquier caso, albúmina e IgG podrían unirse al FcRn al mismo tiempo (la unión fue adicional). El efecto de estas afinidades de unión diferenciales de albúmina humana para FcRn de ratón es que en un modelo farmacocinético de ratón, la albúmina humana tipo salvaje, o fusiones, conjugados o asociados de agentes terapéuticos para albúmina humana tipo salvaje son completamente o parcialmente excluidos de la interacción con FcRn de ratón debido a su afinidad reducida para el receptor de FcRn de ratón y/o por competición debido a la abundancia más alta de la albúmina de ratón endógeno. Consecuentemente, el perfil farmacocinético observado y la vida media circulatoria de la albúmina humana tipo salvaje, o fusiones, conjugados o asociados de agentes terapéuticos a la albúmina humana tipo salvaje es comprometido significativamente. De hecho, cuando se usa un ratón para comparar la vida media de un agente terapéutico con el mismo agente terapéutico fusionado o conjugado a HSA como se hizo en Muller et al (2007) Journal of Biological Chemistry vol 282 págs. 1265012660 será generalmente posible observar un aumento en la vida media de la fusión de HSA. Este aumento puede sin embargo sencillamente deberse a un aumento del peso molecular del agente terapéutico sobre el umbral de depuración renal y no deberse al rescate mediado por FcRn de los agentes terapéuticos fusionados, conjugados o asociados a albúmina.

[0045] FcRn de ratón es promiscuo con relación a especificidad de unión y se enlaza a IgG de muchas especies (es decir humano, primate, ratón, conejo, cobaya, bovino, oveja, y rata). En cambio, FcRn humano es más estricto, y se enlaza solo a IgG de origen humano, de primate, de conejo, y de cobaya (Ober R. J. et al. (2001) Int. Immunol. 13,1551-1559; Stein C. et al. (2011) Mamm. Genome 23:259-269). En consecuencia,

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la farmacocinética de IgG humanas o anticuerpos monoclonales se puede evaluar sin competición de IgG de ratón endógeno en el ratón transgénico con FcRn humano (KO homocigótico del gen de ratón y un KI heterozigoto del gen humano) (Roopenian et al (2003) J. Immunol. Vol 170, págs. 3528-3533), mientras en el mismo modelo la farmacocinética de albúmina humana o compuestos fusionados, conjugados o asociados a la albúmina humana será comprometida por competición de albúmina de ratón endógeno de la afinidad superior de albúmina de ratón para FcRn humano y la abundancia superior de la albúmina de ratón en comparación con la fusión, conjugado o asociado la de albúmina humana.

[0046] Como se ilustra en Muller et al (2007) Journal of Biological Chemistry vol 282 págs. 12650, un modelo de ratón puede ser suficiente generalmente para observar un aumento en la vida media de la fusión de HSA debido al aumento del peso molecular del agente terapéutico sobre el umbral de depuración renal. Sin embargo, si un modelo animal debe usarse para comparar la vida media de una HSA variante o una HSA variante modificada con HSA tipo salvaje o una HSA tipo salvaje modificada el rescate mediado por FcRn es importante y luego la competición desde la albúmina nativa jugará un papel importante.

[0047] Un modelo matemático ha sido desarrollado para el reciclaje de FcRn para asistir en el diseño de variantes de albúmina de suero humano con vidas medias circulatorias extendidas (Bergmann K. et al. (2012) 21st PAGE meeting, 5-8 junio, Venecia Italia). Los autores usan el modelo para predecir la vida media circulatoria de variantes de albúmina humana con afinidad aumentada a FcRn humano en un ratón, mono y seres humanos transgénicos con FcRn humano, y concluyen que los aumentos de la vida media observados son menores para el ratón transgénico con FcRn humano que para mono y humano.

[0048] En la presente solicitud, los inventores han constatado que cuando se evalúan las diferencias farmacocinéticas de una HSA variante en comparación con HSA tipo salvaje se necesita que haya la menor competición posible desde la albúmina nativa. Esto se puede conseguir si HSA se enlaza a FcRn nativo de modo similar a la unión de albúmina nativa al mismo FcRn. Este es naturalmente el caso en primates donde las secuencias de aminoácidos de albúmina y FcRn muestran un alto nivel de identidad entre especies (ver tablas 1 y 3). Sin embargo, al moverse a especies no primates la diversidad aumenta y se vuelve más difícil encontrar un modelo animal adecuado para la evaluación de la farmacocinética de una HSA variante en comparación con HSA tipo salvaje.

[0049] La comprensión de la interacción entre HSA y hFcRn es importante para identificar un modelo animal no primate que imita esta interacción lo mejor posible. En el dominio alfa-1 de FcRn HC humano maduro (SEQ ID N.°: 16) el ácido glutámico conservado en la posición 54 es crucial para la unión de HSA y las mutaciones en la posición 56 muestran la disminución en la unión a HSA (Anderson et al 2012 Nature Communication 3:610). En el dominio alfa-2 de FcRn HC humano maduro la histidina conservada en la posición 166 es crucial para la unión de HSA, y si el H en la posición 161 (SEQ ID N.°: 16) se muta a una alanina entonces la unión de HSA se reduce 10 veces (Andersen et al. 2006, Eur. J. Immunol. 36,3044-3051). Un alineamiento de especies cruzadas de regiones seleccionadas de los dominios alfa-1 y alfa-2 se muestra en la figura 7. Basado en este alineamiento los inventores sugieren que la posición 52 y posición 161 de FcRn humano maduro (SEQ ID N.°: 16) son parcialmente responsables de la selectividad de especies anteriormente descrita.

[0050] Un primer aspecto de la presente invención proporciona un método para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una variante de HSA en comparación con HSA tipo salvaje que comprende a) seleccionar un conejo transgénico doble o un roedor transgénico doble donde los transgenes son albúmina humana y un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16; b) administrar la variante de HSA a un animal y HSA tipo salvaje a otro animal como conejo o roedor seleccionado en a); y c) medir una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de la variante de HSA y la HSA tipo salvaje.

[0051] Una especie animal no primate preferida es una donde la afinidad de unión de HSA para el FcRn nativo es aproximadamente la misma (1 vez ± 0.15) que la afinidad de unión de la albúmina nativa al FcRn nativo. Tal modelo se parecería mucho a la competición a la que HSA tipo salvaje o HSA variante estaría sometida cuando se inyecta en un humano. En una forma de realización preferida de la presente invención la afinidad de unión de HSA tipo salvaje al FcRn nativo de dicho animal está entre 0.8 y 3.5 veces cuando se compara con la afinidad de unión de la albúmina nativa de dicho animal, más preferido entre 0.9 y 3, más preferido entre 1 y 2.5, más preferido entre 1 y 2, más preferido entre 1 y 1.5, y más preferido la afinidad de unión de HSA tipo salvaje es entre 1 y 1.1 veces superior a la afinidad de unión de la albúmina nativa de dicho animal. Otra especie animal no primate preferida de la presente invención es una donde la afinidad de unión de HSA con el FcRn nativo sería superior a la afinidad de unión de la albúmina nativa de dichas especies animales al FcRn nativo. Tal modelo haría más fácil valorar la diferencia en una o más (diferentes) propiedades farmacocinéticas entre HSA tipo salvaje y la HSA variante y sería muy adecuado para el cribado de un número de HSA variantes para seleccionar uno o más (varios) candidatos principales para conjugación, fusión o asociación con un socio tal como un agente terapéutico. En una forma de realización preferida de la presente invención la afinidad de unión de HSA tipo salvaje al FcRn nativo de dicho animal es al menos 1.5

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veces superior a la afinidad de unión de la albúmina nativa de dicho animal, más preferido al menos 2 veces más alta, más preferido al menos 3 veces más alta, más preferido al menos 3.5 veces más alta y más preferido es al menos 4 veces superior a la afinidad de unión de la albúmina nativa de dicho animal. Afinidades de unión entre albúmina y FcRn nativa se miden preferiblemente utilizando una cadena pesada soluble de FcRn de las especies animales seleccionadas acopladas a un chip y medidas por SPR por ejemplo utilizando un instrumento de Biacore. El hFcRn HC soluble es una cadena alfa sin el dominio de transmembrana o un hFcRn HC consistente en tres ectodominios (a1-a3). El FcRn soluble también puede incluir aminoácidos desde el péptido de conexión del FcRn, que está entre el ectodominio y la región de transmembrana del FcRn. Preferiblemente el FcRn HC soluble se coexpresa con beta2-microglobulina desde las mismas especies como se describe en el ejemplo 4. En una forma de realización preferida el FcRn animal soluble comprende una cadena pesada de FcRn y una beta2-globulina desde las mismas especies animales. Más preferiblemente los FcRn solubles están compuestos por FcRn HC soluble de cerdo y p2-microglobulina de cerdo. Preferiblemente, el método descrito en la sección "Materiales y Métodos" se utiliza para seleccionar una especie animal no primate en el método de la presente invención donde se aplican las variaciones en el ejemplo 4.

[0052] Una especie animal no primate preferida de la presente invención es una especie animal tipo salvaje que expresa su FcRn tipo salvaje y albúmina tipo salvaje. Animales tipo salvaje incluyen especies que han sido criadas por el apareamiento de animales con genotipos de origen natural específico, pero no incluyen animales donde los genes han sido desactivados o insertados por intervención humana. Un animal tipo salvaje no primate preferido es un cerdo, preferiblemente un minicerdo de Gottingen. El cerdo ha sido reconocido como un modelo aceptable para el escalado alométrico de interespecies predictivas (Larsen M. O. and Rolin B. (2004) ILAR Journal 45, 303-313; Zheng Y. et al. (2012) mAbs 4, 243-255; Suenderhauf C. and Parrott N. (20l3) Pharm. Res. 30,1-15). Sin embargo, no hay nada en estas descripciones que apunte al cerdo como un sistema modelo preferido para el estudio de la farmacocinética de la albúmina humana o fusiones, conjugados o asociados a la albúmina humana, o albúminas humanas variantes o fusiones, conjugados o asociados a la albúmina humana variante.

[0053] El Ejemplo 2 de la presente invención muestra que la afinidad de la albúmina humana a FcRn soluble de cerdo (spFcRn) es 2.9 veces superior a la afinidad de la albúmina de cerdo a pFcRn soluble. La afinidad de variantes de albúmina humana seleccionadas para pFcRn también ha sido mostrada ser más alta que la afinidad de HSA tipo salvaje para pFcRn. La capacidad para diferenciar entre las propiedades farmacocinéticas de HSA tipo salvaje y HSA variante en los estudios animales en cerdos ha sido mostrada en el ejemplo 5.

[0054] Otras especies animales no primates tipo salvaje preferidas son cabra, oveja, vaca o camello.

[0055] Una característica común entre FcRn de primate y FcRn de cerdo, cabra, oveja, vaca y camello, como se indica por letras en negrita en la figura 7, es que tienen una V en la posición que corresponde con la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y una H en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con SEQ ID N.°: 16. Todos los demás aminoácidos en las regiones alineadas se conservan completamente a través de todas las especies, salvo la posición 55, 164 y 165. En la posición 164 y 165 humano y macaco tienen R y E respectivamente mientras que todas las otras especies tienen L y G respectivamente. En la posición 55 las especies tienen bien N o S. Ya que el cerdo ha sido mostrado para ser un buen modelo animal como se ilustra en el ejemplo 2, no esperamos que la variación en estas posiciones tenga una influencia significativa en la selectividad de especies en la interacción de FcRn-albúmina. En una forma de realización de la presente invención FcRn nativo tiene una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con SEQ ID N.°: 16.

[0056] En otra forma de realización preferida de la presente invención FcRn nativo tiene una valina en la posición que corresponde con la posición 52 cuando se alinea con SEQ ID N.°: 16.

[0057] En una forma de realización aún más preferida el FcRn nativo tiene una valina en la posición que corresponde con la posición 52 y una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

[0058] Un animal transgénico preferido para usar en el método de la presente invención es un animal no primate que tiene su FcRn (endógeno) tipo salvaje y albúmina (endógena) tipo salvaje desactivada y una cadena pesada de FcRn humano y albúmina de suero humano insertadas en el genoma. Preferiblemente el FcRn humano es 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100% idéntico a la secuencia madura de SEQ ID N.°: 9 y la HSA humana es 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100% idéntica a la SEQ ID N.°: 2. En tal animal transgénico la cadena pesada de FcRn humano y la HSA tipo salvaje se consideran como el FcRn nativo y la albúmina nativa, y se entiende que no hay (o no sustancialmente) expresión subyacente de la cadena pesada de FcRn endógeno animal de tipo salvaje y albúmina. En una forma de realización preferida de la presente invención el animal transgénico doble es un roedor o conejo. Preferiblemente, el roedor es seleccionado de ratón, cobaya, y rata. Más preferido el roedor es un ratón transgénico doble.

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[0059] La especie animal de la presente invención también puede ser un animal donde el FcRn tipo salvaje ha sido mutado de manera que contiene una valina en la posición que corresponde con la posición 52 y/o una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con SEQ ID N.°: 16. En tal animal se mantienen los aminoácidos conservados E54, Q56 y H166 cuando se alinean con SEQ ID N.°: 16. Estas especies animales pueden bien contener albúmina (endógena) tipo salvaje o pueden ser transgénicos con respecto a la albúmina, de manera que la albúmina endógena se desactiva y sustituye con HSA. Un ejemplo de tal animal podría ser un ratón con una variante de FcRn HC de ratón que comprende una valina en la posición 52 y una histidina en la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID NO:16 y donde la variante es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia madura de SEQ ID NO:13 y el ratón también comprende una HSA transgen y preferiblemente la expresión de MSA nativo y la expresión de FcRn tipo salvaje ha sido abolida.

[0060] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un animal transgénico doble. Más específicamente, el genoma del animal transgénico comprende una interrupción homocigótica en su gen de FcRn HC endógeno y gen de albúmina de suero que previene la expresión de una proteína de FcRn HC animal funcional y albúmina de suero animal funcional y el genoma comprende además una secuencia de ADN heterólogo que codifica FcRn HC humano (hFcRn HC) y una secuencia de ADN heterólogo que codifica la albúmina de suero humano (HSA), y donde el animal expresa una proteína de hFcRn HC funcional y HSA funcional. Las secuencias pertinentes para albúmina se indican en la tabla 1 y las secuencias de FcRn HC pertinentes se indican en la tabla 3. Preferiblemente el FcRn humano es 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100% idéntico a la secuencia madura de SEQ ID N.°: 9 o a la SEQ ID N.°: 16, más preferido el FcRn HC humano tiene una histidina en la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16, y los aminoácidos conservados E54, Q56 y H166 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 se mantienen. Preferiblemente la HSA humana es 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5,100% idéntica a la SEQ ID N.°: 2. Preferiblemente, el animal transgénico doble es un roedor o un conejo. Preferiblemente el roedor es seleccionado de ratón, cobaya, y rata. El animal transgénico doble más preferido es un ratón. Las secuencias de ADN heterólogo que han sido insertadas en el genoma del animal pueden ser operativamente enlazadas a la misma o diferentes secuencias reguladoras como los genes endógenos. La interrupción de los genes endógenos puede hacerse mediante sustitución con el ADN heterólogo correspondiente (genes humanos). Sin embargo, la interrupción puede alternativamente hacerse independientemente de la inserción del ADN heterólogo (genes humanos transgénicos), permitiendo que el ADN heterólogo sea insertado en una posición diferente del genoma que el gen endógeno. La generación de un ratón con FcRn HC humano transgénico como FcRn nativo ha sido descrita en US 7,358,416. Asimismo US 6,949,691 describe cómo producir un ratón con albúmina de suero humano transgénico como la albúmina nativa. Un experto en la técnica de producir animales transgénicos, basado en estos dos documentos, podría ser capaz de producir un animal transgénico que tiene su gen FcRn HC tipo salvaje y gen de albúmina tipo salvaje desactivado y un ADN de FcRn HC humano tipo salvaje y ADN de albúmina de suero humano tipo salvaje insertado en el genoma de manera que FcRn HC humano y HSA se produce en el animal en vez de FcRn de tipo salvaje y albúmina.

[0061] En otra forma de realización de la invención el animal transgénico es un conejo o roedor cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen de cadena pesada de FcRn endógeno y gen de albúmina de suero endógeno y comprende además una secuencia de ADN heterólogo que expresa un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y una secuencia de ADN heterólogo que codifica suero humano (HSA), donde las secuencias de ADN heterólogo son operativamente enlazadas a la misma o diferentes secuencias reguladoras, y donde dicha interrupción homocigótica previene la expresión de una proteína de FcRn HC funcional de conejo o roedor y albúmina de suero funcional de conejo o de roedor, y donde el animal expresa una proteína de FcRn HC funcional con una histidina en la posición 161 cuando se alinea con SEQ ID N.°: 16 y HSA funcional.

[0062] En otro aspecto de la invención un conejo transgénico o roedor que expresa un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y albúmina humana y que ha sido desactivado para las proteínas nativas correspondientes se utiliza para comparar una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una molécula de control y una molécula de prueba donde la molécula de control comprende HSA tipo salvaje y la molécula de prueba comprende una variante de HSA. En otra forma de realización el FcRn comprende además una valina en la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16. En una forma de realización preferida el transgen FcRn es seleccionado de humano, chimpancé, macaco, vaca, cabra, oveja, camello y cerdo. Alternativamente, el FcRn es una variante del FcRn tipo salvaje con una H en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y/o una V en la posición que corresponde con la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16, y donde la variante es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99% idéntica al FcRn tipo salvaje del animal. En tal variante, se mantienen los aminoácidos conservados E54, Q56 y H166 cuando se alinean con SEQ ID N.°: 16. Otros aminoácidos más preferidos que son conservados entre humano, chimpancé, macaco, vaca, cabra, oveja, camello, cerdo, perro, cobaya, conejo, rata y ratón son mantenidos.

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[0063] Como se ha descrito anteriormente, el método de la presente invención puede utilizarse para filtrar moléculas de HSA variantes para identificar el efecto in vivo de la afinidad de unión de FcRn alterado cuando se compara con HSA tipo salvaje. Preferiblemente, las variantes evaluadas en el método de la presente invención han aumentado la unión de FcRn humano en comparación con HSA tipo salvaje. En una forma de realización preferida la KD de la albúmina variante es al menos 2X inferior a la KD de hSa tipo salvaje, más preferiblemente la KD de la albúmina variante es al menos 5X, 10X, 15X o 20X, 30X, 50X, 75X inferior al KD de HSA tipo salvaje, de la forma más preferible la KD de la albúmina variante es al menos 100X inferior al KD de HSA tipo salvaje (la variante tiene cien veces la afinidad de unión a FcRn humano que HSA tipo salvaje). En otra forma de realización la albúmina variante tiene una unión más débil a FcRn humano que HSA tipo salvaje. En una forma de realización preferida la KD de la albúmina variante es al menos 2X superior a la KD de hSa tipo salvaje (la variante tiene la mitad de la afinidad de unión a FcRn humano que HSA tipo salvaje), más preferiblemente la KD de la albúmina variante es al menos 5X, 10X, 15X o 20X, 30X, 50X, 75X superior a la KD de HSA tipo salvaje, de la forma más preferible la KD de la albúmina variante es al menos 100X superior a la KD de HSA tipo salvaje (la variante tiene un centésimo de la afinidad de unión con FcRn humano que HSA). El método de la presente invención puede en particular usarse para seleccionar una HSA variante para usar en una prueba preclínica, donde la HSA variante ha mejorado una o más (varias) propiedades farmacocinéticas cuando se compara con HSA tipo salvaje. En una forma de realización preferida la HSA variante tiene una vida media más larga que HSA tipo salvaje.

[0064] La presente invención también se refiere a moléculas de HSA variante como tal, que han sido seleccionadas utilizando el método de la presente invención. En particular una HSA variante con una o más (varias) propiedades farmacocinéticas mejoradas cuando se compara con HSA tipo salvaje que se selecciona para usar en una prueba preclínica está comprendida por la presente invención. Propiedades farmacocinéticas mejoradas son propiedades que se cambian en comparación con HSA tipo salvaje y que dará lugar a una ventaja en relación con por ejemplo régimen de administración, dosis, objetivo, o eficacia de tratamiento en comparación con HSA tipo salvaje. Se prefiere una HSA variante que tiene una vida media más larga que HSA tipo salvaje.

[0065] El método de la presente invención también puede usarse para ensayar el efecto de modificaciones a HSA o HSA variante. Por ejemplo, el método se puede utilizar para valorar el efecto de a) varios enlaces entre un socio, tal como un agente terapéutico, y HSA (tanto enlaces de fusión como enlaces de conjugación) o b) la posición en HSA con la que se hace la conjugación o fusión o c) la química usada para conjugación del socio. Esta lista no es exhaustiva y la persona experta sabrá usar el método de la presente invención para valorar otros efectos de modificación. Generalmente, modificaciones a HSA pueden afectar la unión de FcRn como se ha visto con algunos de los daños naturales como glicosilación y oxidación anteriormente descritas. El presente modelo es por lo tanto pertinente para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de modificaciones a HSA tipo salvaje y HSA variante, ya que estas modificaciones pueden afectar a la unión de FcRn de la HSA tipo salvaje o variante. En una forma de realización preferida la HSA tipo salvaje y HSA variante son modificadas añadiendo una funcionalidad adicional. La funcionalidad adicional puede coger la forma de una molécula compañera por ejemplo un agente terapéutico, agente de diagnóstico, molécula objetivo que puede asegurar la entrega de la HSA a células específicas en un humano, una etiqueta de purificación o etiqueta de identificación como His, FLAG, GST, o marcadores de fluorescencia. En una forma de realización preferida la HSA variante y tipo salvaje modificadas por fusión, conjugación o asociación con un socio. Preferiblemente el socio es un agente terapéutico, incluidas las vacunas. Para comparar la diferencia entre la HSA variante modificada y HSA tipo salvaje modificada la modificación debería ser idéntica para ambas moléculas, por ejemplo en forma de una fusión, conjugación o asociación al mismo socio. En una forma de realización preferida de la presente invención el modelo animal se utiliza para valorar el efecto en una o más (varias) de las propiedades farmacocinéticas de un socio seleccionado, por ejemplo agente terapéutico, y el método de unir el socio a la molécula de control y de prueba es evaluado. La molécula de control puede por ejemplo ser HSA tipo salvaje unida al socio y la molécula de prueba es una HSA variante unida al mismo socio en la misma posición. El método de la unión de la albúmina y el socio seleccionado puede por ejemplo ser uno o más (varios) de a) a c) mencionados anteriormente. En una forma de realización el socio se conjuga en posiciones diferentes en la albúmina. Las posiciones son idénticas para tanto la molécula de control como de prueba, así si por ejemplo la posición 1 y 34 en HSA tipo salvaje (SEQ ID NO:2) se evalúa para conjugación, la misma posición se evalúa en la HSA variante usando del mismo socio, así se evalúa el efecto de las posiciones diferentes en la unión de FcRn. En otra forma de realización el socio se conjuga con tecnologías de conjugación diferentes al control de albúmina y moléculas de prueba. La tecnología o química de conjugación usada es idéntica para tanto la molécula de prueba como de control, así si por ejemplo uno o más grupos de maleimida se evalúan para conjugación, los mismos grupos se evalúan en la HSA variante usando el mismo socio, así evaluando el efecto de las diferentes técnicas de conjugación en la unión de FcRn. En otra forma de realización el socio se fusiona con o sin enlazadores diferentes en el extremo C y/o extremo N de la albúmina. Los enlazadores son idénticos para tanto las moléculas de control como de prueba. El péptido de enlace entre las partes fusionadas (albúmina y socio) proporciona separación física superior entre las fracciones y así maximiza la accesibilidad del socio de fusión, por ejemplo el agente terapéutico, por ejemplo, para la unión a su receptor cognado. El péptido de enlace puede consistir en aminoácidos de manera que son flexibles o más rígidos.

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[0066] En una forma de realización preferida el socio, por ejemplo agente terapéutico, se fusiona al extremo N de la albúmina. En una forma de realización alternativa el socio, por ejemplo agente terapéutico, se fusiona al extremo C de la albúmina.

[0067] Por lo tanto, como se ha descrito anteriormente, los polipéptidos de fusión de albúmina de la invención pueden tener la fórmula siguiente R2-R1 R1-R2 R2-R1-R2 R2-L-R1-L-R2 R1-L-R2 R2-L-R1 o R1-L-R2-L-R1, donde R1 es al menos una secuencia compañera de fusión (con fragmentos o variantes de la misma), y no necesariamente los mismos polipéptidos, L es un enlazador y R2 es una secuencia de albúmina (que incluye fragmentos o variantes de la misma). Ejemplos de enlaces incluyen (GGGGS)n o (GGGS)n o (gGs)n, donde N es un número entero mayor que o igual a 1 y donde G representa glicina y S representa serina. Los enlaces pueden tener una longitud variable de 1 a 50 aminoácidos, preferiblemente de 3 a 40 aminoácidos, más preferiblemente de 5 a 35 aminoácidos, aún más preferiblemente de 7 a 30 aminoácidos y de la forma más preferible de 10 a 25 aminoácidos. Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión entre el socio de fusión y la albúmina, por ejemplo en forma de un enlazador escindible. El sitio se puede dividir tras la secreción del polipéptido de fusión, liberando los dos polipéptidos. El enlazador puede ser alternativamente escindible, por ejemplo por una proteasa que existe en el paciente, de manera que la fracción compañera de fusión es liberada de la albúmina en el paciente, potencialmente en relación con un evento de activación. Un ejemplo de un evento de activación conducido por proteasa es la cascada de coagulación (WO 91/09125, wO 2007/090584 y WO 2007/144173). Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotecnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotecnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0068] La albúmina se usa en preparaciones de compuestos beneficiosos farmacéuticamente por ejemplo como fusiones, conjugaciones o asociaciones con un agente terapéutico. La presente invención también incluye HSA variante modificada tal como una HSA variante que es fusionada, conjugada o asociada a un agente terapéutico, donde la fusión, conjugación o asociación se selecciona por un método de la presente invención. En particular una HSA variante fusionada, conjugada o asociada a un socio, por ejemplo agente terapéutico, con una o más (varias) propiedades farmacocinéticas mejoradas cuando se compara con HSA tipo salvaje fusionada, conjugada o asociada al mismo socio, donde la HSA variante modificada se selecciona para usar en una prueba preclínica está comprendida por la presente invención. Más preferida es una HSA variante fusionada, conjugada o asociada a un socio, por ejemplo agente terapéutico, que tiene una vida media más larga que HSA tipo salvaje fusionada, conjugada o asociada al mismo socio, por ejemplo un agente terapéutico.

[0069] HSA variante y la HSA variante modificada de la presente invención se puede formular en una composición farmacéutica que comprende la HSA variante y un excipiente. Una manera de formular HSA variante o HSA variante modificada puede ser como nanopartículas o micropartículas. La incorporación de un socio, por ejemplo agente terapéutico, en una partícula de albúmina ha sido por ejemplo descrita en WO 00/71079. Técnicas para incorporación de una molécula en nano- o micropartículas se conocen en la técnica. Métodos preferidos para la preparación de nano- o micropartículas que se pueden aplicar a la variante de albúmina, fragmento, fusión, conjugado o asociado del mismo según la invención se describe en WO 2004/071536 o WO2008/007146 u Oner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, páginas 1387 a 1388).

[0070] Para todos los aspectos de la invención polipéptidos socios de fusión y/o conjugados y/o asociados pueden comprender uno o más (varios) de: ligando BB 4-1, 5-hélices, una quimiocina C-C humana, una quimiocina L105 humana, una quimiocina L105 humana designada huL105_3, una monocina inducida por gamma-interferón (MIG), una proteína CXCR4B parcial, una proteína básica plaquetaria (PBP), a1- antitripsina, homólogo de ACRP-30; componente del complemento C1q C, quimiocina expresada por adenoides (ADEC), aFGF; FGF-1, AGF, proteína AGF, albúmina, un etopósido, angiostatina, vacuna contra el ántrax, anticuerpos específicos para colapsina, antistasina, anticuerpos de la familia beta Anti-TGF, antitrombina III, APM-1; ACRP-30; Famoxina, especies de apo-lipoproteína, Arilsulfatasa B, proteína b57, BCMA, proteína Beta-tromboglobulina (beta-TG), bFGF; FGF2, factores de coagulación sanguínea, enzima furina de procesamiento de BMP, BMP-10; BMP-12; BMP-15; BMP-17; BMP-18; BMP-2B, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, Proteína-2 morfogénica de hueso, calcitonina, Calpaína-10a, Calpaína-10b, Calpaína-10c, vacuna contra el cáncer, carboxipeptidasa, quimiocina C-C, MCP2, variante CCR5, CCR7; CD11a Mab, CD137, proteína del receptor BB 4-1, CD20 Mab, CD27; CD27L, CD30; ligando CD30, inmunotoxina CD33, CD40; CD40L, CD52 Mab, proteína Cerebus, eotaxinas quimiocinas, quimiocina hIL-8, quimiocina hMCP1, quimiocina hMCP1a, quimiocina hMCP1b, quimiocina hMCP2, quimiocina hMCP3, quimiocina hSDF1b, quimiocina MCP-4, quimiocina TECK y variante TECK, proteína IL-8M1 tipo qumiocina en toda su longitud y madurez, proteína IL-8M10 tipo quimiocina en toda su longitud y madurez, proteína IL-8M3 tipo quimiocina en

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toda su longitud y madurez, proteína IL-8M8 tipo quimiocina en toda su longitud y madurez, proteína IL-8M9 tipo quimiocina en toda su longitud y madurez, proteína PF4-414 tipo quimiocina en toda su longitud y madurez, proteína PF4-426 tipo quimiocina en toda su longitud y madurez, proteína PF4-M2 tipo quimiocina en toda su longitud y madurez, vacuna contra el cólera, proteína tipo condromodulina, ligando c-kit; SCF; factor de crecimiento de mastocito; MGF; factor de célula madre derivado de fibrosarcoma, CNTF y fragmento del mismo (tal como CNTFAx15'(Axokine™)), factores de coagulación en ambas formas pre y activas, colágenos, complemento C5 Mab, tejido conjuntivo que activa la proteína III, CTAA16,88 Mab, CTAP- III CTLA4-Ig, CTLA-8, CXCR3; receptor 3 de quimiocina CXC, cianovirina-N, Darbepoetina, designado exodus, designado huL105 7; DIL-40, ADNsa, EDAR, receptor de EGF Mab, ENA-78, Endostatina, eotaxina, neutrofilo epitelial que activa la proteína-78, receptor EPO;, EPOR, eritropoyetina (EPO) y simuladores EPO, Eutropina, proteína Exodus, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X y factor XIII, proteína inhibitoria de ligando FAS (DcR3), FasL, FGF, FGF-12; homólogos de factor de crecimiento de fibroblasto factor-1, FGF- 15, FGF-16, FGF-18, FGF-3 INT-2, FGF-4; gelonina, HST-1 HBGF-4, FGF-5, FGF-6; factor-2 transformante segregado ligante de heparina, FGF-8, FGF-9; factor de activación de Glia, fibrinógeno, flt-1, ligando flt-3, subunidad alfa de hormona estimulante del folículo, subunidad Beta de hormona estimulante del folículo, folitropina, Fractalquina, proteína Troponina I de fragmento. miofibrilar, FSH, galactosidasa, Galectina-4, G- CSF, GDF-1, terapia genética, factor de crecimiento derivado de glioma, glucagón, péptidos de tipo glucagón, glucocerebrosidasa, glucosa-oxidasa, glucosidasa, Glicodelina-A; proteína endométrica asociada a la progesterona, GM-CSF, gonadotropina, proteína-2 quimiotáctica de granulocito (GCP-2), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos, hormona del crecimiento, oncogen alfa relacionado con el crecimiento (GRO-alfa), oncogen beta relacionado con el crecimiento (GRO-beta), oncogen gamma relacionado con el crecimiento (GRO-gamma), hAPO-4; TROY, hCG, antígeno de superficie de Hepatitus B, vacuna contra Hepatitus B, receptor Mab de HER2, hirudina, gp120 de VIH, gp41 de VIH, péptido inhibidor de VIH, péptidos inhibidores de proteasa de VIH, inhibidores de proteasa de HIV-1, vacuna contra HPV, proteína 6CKine humana, proteína Act-2 humana, factor inhibitorio de adipogénesis humana, receptor de factor-2 estimulante de células B humanas, quimiocina beta humana H1305 (MCP-2), quimiocina C-C DGWCC humana, proteína ELC de quimiocina C-C humana, interleucina C de quimiocina tipo CC humana, proteína CCC3 humana, quimiocina CCF18 humana, proteína quimiocina tipo CC humana designada SLC (quimiocina linfoide secundaria), formas cortas beta-8 de quimiocina humana, quimiocina humana C10, quimiocina humana CC-2, quimiocina humana CC-3, quimiocina humana CCR-2, quimiocina humana Ckbeta-7, quimiocina humana ENA-78, quimiocina eotaxina humana, quimiocina gROalpha humana, quimiocina gRObeta humana, quimiocina HCC-1 humana, quimiocina I-309 humana, quimiocina IP-10 humana, quimiocina L105_3 humana, quimiocina L105_7 humana, quimiocina MIG humana, proteína quimiocina MIG- beta humana, quimiocina MIP-1alfa humana, quimiocina MIP1beta humana, quimiocina MIP1beta humana, quimiocina MIP-3alfa humana, quimiocina MIP-3beta humana, quimiocina PF4 humana, proteína quimiocina 331D5 humana, proteína quimiocina 61164 humana, receptor de quimiocina humana CXCR3, quimiocina SDF1alfa humana, quimiocina SDF1beta humana, quimiocina ZSIG-35 humana, proteína Chr19Kine humana, CKbeta-9 humana, quimiocina de aminoácido CX3C 111 humana, interleucina-40 DNAX humana, quimiocina C-C DVic-1 humana, secuencia de proteína EDIRF I humana, secuencia de proteína EDIRF II humana, quimiocina eotaxina tipo CC de eosinocitos humana, quimiocina expresada en eosinofilocito humana (EEC), troponina C de músculo esquelético de contracción rápida humana, troponina I de músculo esquelético de contracción rápida humana, subunidad C de troponina de músculo esquelético de contracción rápida humana, proteína de subunidad I de troponina de músculo esquelético de contracción rápida humana, subunidad T de troponina de músculo esquelético de contracción rápida humana, troponina T de músculo esquelético de contracción rápida humana, quimiocina expresada en el bazo fetal humano, FSEC, receptor GM-CSF humano, quimiocina gro-alfa humana, quimiocina gro-beta humana, quimiocina gro-gamma humana, proteína IL-16 humana, secuencia de proteína IL-1RD10 humana, IL-1RD9 humana, cadena alfa del receptor IL-5 humano, receptor IL-6 humano, proteína hIL8RA del receptor IL-8 humano, proteína hIL8RB del receptor IL-8 humano, proteína del receptor IL-9 humano, variante #3 de proteína del receptor IL-9 humano, fragmento de variante de proteína del receptor IL-9 humano, fragmento#3 variante de proteína del receptor IL-9 humano, interleucina 1 delta humana, interleucina 10 humana, interleucina 18 humana, derivados de interleucina 18 humana, precursor de interleucina-1 beta humana, precursor de interleucina-1 beta humana, proteína accesoria de receptor de interleucina-1 humana, receptor antagonista beta de interleucina-1 humana, receptor tipo-3 de interleucina-1 humana, (precursor) Interleucina-10 humana, receptor de interleucina-11 humana, subunidad de 40 kD de interleucina-12 humana, receptor beta-1 de interleucina-12 humana, receptor beta-2 de interleucina-12 humana, proteína p35 de Interleucina-12 humano, proteína p40 Interleucina-12 humana, receptor de interleucina-12 humana, receptor alfa de interleucina-13 humana, receptor beta de interleucina-13 humana, interleucina-15 humana, receptor de clon P1 de interleucina-15 humana, receptor de interleucina-17 humana, proteína interleucina-18 (IL-18) humana, interleucina-3 humana, receptor de interleucina-3 humana, variante de interleucina-3 humana, receptor de interleucina-4 humana, interleucina-5 humana, interleucina-6 humana, interleucina-7 humana, interleucina-8 (IL-8) humana, antagonista de receptor IL-1 intracelular humano, proteína de fusión de región hipervariable IP-10 y gp120 de HIV-1 humana, proteína de fusión de epítopo de núcleo (VNT) Muc-1 humano e IP-10 humano, quimiocina hepática y regulada por activación (LARC) humana, proteína en toda su longitud y madura LKn-1 humana, proteína en toda su longitud y madura de quimiocina asociada mamaria humana (MACK), quimiocina madura humana Ckbeta-7, gro-alfa maduro humano, polipéptido gro-gamma maduro humano usado para tratar

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sepsis, proteína de fusión de epítopo de núcleo de MCP-3 humano y Muc-1 (VNT) humano, proteína MI10 humana, proteína MI1A humana, factor quimioatrayente de monocito humano hMCP-1, factor quimioatrayente de monocito humano hMCP-3, secuencia de proproteína quimiotáctica de monocito humano (MCPP), dominio tipo quimiocina neurotactina humana, CXC quimiocina H174 no ELR humana, CXC quimiocina IP10 no ELR humana, CXC quimiocina Mig no ELR humana, mutantes PAI-1 humanos, proteína humana con actividad IL-16, proteína humana con actividad IL-16, quimiocina linfoide secundaria humana, proteína SISD (SLC) humana, STCP-1 humana, quimiocina derivada de célula estromal humana, SDF-1, quimiocina expresada por reacción de linfocitos mezclados con células T (TMEC) humanas, citocina regulada por activación (TARC) y del timo humano, timo humano expresado, TNF-alfa humano, TNF-alfa humano, TNF-beta humano (LT-alfa), secuencia de proteína quimiocina eotaxina 3 tipo CC humana, receptor interleucina-1 tipo II humano, proteína interleucina-4 (hIL-4) tipo salvaje humana, proteína ZCHEMO-8 humana, anticuerpos Anti-VEGF humanizados, y fragmentos de los mismos, anticuerpos Anti-VEGF humanizados, y fragmentos de los mismos, hialuronidasa, subunidad ICE 10 kD, subunidad ICE 20 kD, subunidad ICE 22 kD, Iduronato-2-sulfatasa, Iduronidasa, IL-1 alfa, IL-1 beta, inhibidor IL-1 (IL-1i), IL-1 maduro, receptor de IL-10, IL-11, subunidad p40 de IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, receptor de IL-15, IL-17, receptor IL-17, IL-19, fragmentos de IL-1i, antagonista del receptor IL1, IL-21 (TIF), proteína de fusión que contiene IL-3, proteínas mutantes de IL-3, variantes de IL-3, IL-4, muteína de IL-4, muteína Y124G de IL-4, muteína Y124X de IL-4, muteínas de IL-4, receptor IL-5, IL-6, receptor de IL-6, clon receptor de IL-7, receptor de IL-8, variante de proteína madura de IL-9 (versión Met117), inmunoglobulinas o moléculas basadas en inmunoglobulina o fragmento de estas (por ejemplo un Small Modular ImmunoPharmaceutical™ ("SMIP") o dAb, fragmentos Fab’, F(ab')2, scAb, scFv o fragmento de scFv), inlcuyendo pero no limitado a plasminógeno, vacuna contra la gripe, inhibina alfa, inhibina beta, insulina, factor de crecimiento de tipo insulina, integrina Mab, inhibidor de tripsina interalfa, proteína inducible por interferón gama (IP-10), interferones (tales como especies y sub-especies de interferón alfa, especies y sub-especies de interferón beta, especies y subespecies de interferón gamma), interleucina 6, receptor de interleucina 8 (IL-8), receptor B de interleucina 8, interleucina-1 alfa, proteína p43 asociada al receptor de Interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4 muteínas, proteína Interleucina-8 (IL-8), interleucina-9, proteína madura (versión Thr117) interleucina-9 (IL-9), interleucinaas (tales como IL10, IL11 e IL2), vacuna contra encefalitis japonesa, inhibidor de calicreína, factor de crecimiento de queratinocito, proteína de dominio de Kunitz (tal como aprotinina, proteína amiloide precursora y aquellas descritas en WO 03/066824, con o sin fusiones de albúmina), proteína de dominio de Kunitz (tal como aprotinina, proteína amiloide precursora y aquellas descritas en WO 03/066824, con o sin fusiones de albúmina), LACI, lactoferrina, proteína II de unión a TGF-beta latente, leptina, quimiocina-1 expresada en el hígado (LVEC-1), quimiocina-2 expresada en el hígado (LVEC-2), LT-alfa, LT-beta, hormona leuteinizante, vacuna contra Lyme, Linfotactina, análogo MDC de quimiocina derivada de macrófagos (n+1), análogo de quimiocina derivada de macrófagos, análogo MDC-eyfy de quimiocina derivada de macrófagos, análogo MDC-yl de quimiocina derivada de macrófagos, quimiocina derivada de macrófagos (MDC), Maspina; inhibidor 5 de proteasa, receptor MCP-1, MCP-1a, MCP-1b, MCP-3, receptor MCP-4, M-CSF, proteína inhibidora de melanoma, proteínas unidas a la membrana, interleucina 9 de Met117 humana, MIP-3 alfa, MIP-3 beta, MIP-Gamma, MIRAP, Rantes modificado, anticuerpo monoclonal, MP52, interleucina mutante 6 S176R, troponina I de proteína contráctil miofibrilar, péptido natriurético, factor beta de crecimiento nervioso, Factor-beta2 de crecimiento nervioso, Neuropilina-1, Neuropilina-2, Neurotactina, Neurotrofina-3, Neurotrofina-4, Neurotrofina-4a, Neurotrofina-4b, Neurotrofina-4c, Neurotrofina-4d, péptido-2 de activación neutrofílica (NAP-2), Receptor NOGO-66, NOGO-A NOGO-B NOGO-C, quimiocina beta nueva designada PTEC, quimiocina modificada N-terminal GroHEK/hSDF-1alfa, quimiocina modificada N-terminal GroHEK/hSDF-1beta, quimiocina modificada N-terminal met-hSDF-1 alfa, quimiocina modificada N-terminal met-hSDF-1 beta, OpGl, Proteína -1 osteogénica, OP-1; BMP-7, Proteína-2 osteogénica, OX40; ACT-4, OX40L, oxitocina (Neurofisina I), hormona paratiroidea, parcheado, parcheado-2, PDGF-D, toxoide de tos ferina, quimiocina expresada por glándula pituitaria (PGEC), factor de crecimiento de placenta, Factor-2 de crecimiento de placenta, Inhibitor-1 activador del plasminógeno; PAI-1, Inhibitor-2 activador del plasminógeno; PAI-2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas Bv-sis, precursor de factor de crecimiento derivado de plaqueta un, precursor de factor de crecimiento derivado de plaqueta B, plaqueta Mab, factor de crecimiento de la célula endotelial derivado de las plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas, cadena de factor A, cadena de factor B de crecimiento derivado de las plaquetas, polipéptido usado para tratar sepsis, variante “milano” de Preproapolipoproteína, variante “paris” de Preproapolipoproteína, pre-trombina, quimiocina CC "ILINCK" de Primate, quimiocina CXC "IBICK” de Primate, proinsulina, prolactina, Prolactina2, prosáptido, péptidos inhibidores de proteasa, proteína C, proteína S, pro-trombina, prourocinasa, RANTES, RANTES 8-68, RANTES 9-68, péptido RANTES, receptor RANTES, interleucina-16 recombinante, resistina, restrictocina, inhibidores de proteasa retrovírica, ricina, vacuna contra rotavirus, Mab de RSV, saporina, sarcina, polipéptidos segregados y de transmembrana, polipéptidos segregados y de transmembrana, colinesterasa de suero, proteína sérica (tal como un factor de coagulación sanguínea), Proteína cinasa 3 del receptor de BMP soluble, Receptor de VEGF Soluble, Factor inhibitorio de células madre, vacuna contra Straphylococcus, Factor alfa 1 derivado del estroma, Factor beta 1 derivado del estroma, sustancia P (taquiquinina), péptido T1249, péptido T20, endonucleasa T4, TACI, Tarc, TGF-beta 1, TGF-beta 2, interleucina humana 9 Thr117, trombina, trombopoyetina, derivado 1 de trombopoyetina, derivado 2 de trombopoyetina, derivado 3 de trombopoyetina, derivado 4 de trombopoyetina, derivado 5 de trombopoyetina,

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derivado 6 de trombopoyetina, derivado 7 de trombopoyetina, quimiocina expresada por el timo (TECK), hormona estimulante de la tiroides, péptido de anticoagulante de garrapata, proteína Tim-1, precursor de TNF-alfa, TNF-R, TNF-RII; Receptor p75 de TNF; Receptor de muerte, tPA, transferrina, factor beta de crecimiento transformante, péptidos de troponina, proteína quimiotáctica 2 de monocito truncado (6-76), proteína RANTES truncada (3-68), factor de necrosis tumoral, urato-oxidasa, uroquinasa, vasopresina (Neurofisina II), VEGF R-3 flt-4, Receptor VEGF; KDR; flk-1, VEGF-110, VEGF-121, VEGF-138, VEGF-145, VEGF-162, VEGF-165, VEGF-182, VEGF-189, VEGF-206, VEGF-D, VEGF-E; VEGF-X, factor de von Willebrand, proteína quimiotáctica 2 de monocito tipo salvaje, proteína quimiotáctica 2 de monocito tipo salvaje, ZTGF-beta 9, andamios de anticuerpo alternativos por ejemplo anticalina(s), adnectina(s), fragmento(s) de fibrinógeno, nanocuerpos tales como nanocuerpos de camélido, infestina, y/o cualquiera de las moléculas mencionadas en WO01/79271 (particularmente página 9 y/o tabla 1), WO 2003/59934 (particularmente tabla 1), WO03/060071 (particularmente tabla 1) o WO01/079480 (particularmente tabla 1).

[0071] Además, conjugados pueden comprender uno o más (varios) de fármacos para quimioterapia tales como: ácido 13-cis-retinoico, 2-CdA, 2-Clorodeoxiadenosina, 5-Azacitidina, 5-Fluorouracilo, 5-FU, 6- Mercaptopurina, 6-MP, 6-TG, 6-Tioguanina, Abraxane, Accutane®, Actinomicina D, Adriamycin®, Adrucil®, Agrylin®, Ala-Cort®, Aldesleucina, Alemtuzumab, ALIMTA, Alitretinoina, Alkaban-AQ®, Alkeran®, Ácido holo- transretinoico, Interferón alfa, Altretamina, Ametopterina, Amifostina, aminoglutetimida, Anagrelida, Anandron®, Anastrozol, Arabinosilcitosina, Ara-C, Aranesp®, Aredia®, Arimidex®, Aromasin®, Arranon®, Trióxido arsénico, Asparaginasa, ATRA, Avastin®, Azacitidina, BCG, BCNU, Bevacizumab, Bexaroteno, BEXXAR®, Bicalutamida, BiCNU, Blenoxane®, Bleomicina, Bortezomib, Busulfano, Busulfex®, C225, Leucovorina de calcio, Campath®, Camptosar®, Camptotecina-11, Capecitabina, Carac™, Carboplatina, Carmustina, oblea de carmustina, Casodex®, CC-5013, CCNU, CDDP, CeeNU, Cerubidine®, Cetuximab, Clorambucilo, Cisplatina, Factor Citrovórum, Cladribina, Cortisona, Cosmegen®, CPT-11, Ciclofosfamida, Cytadren®, Citarabina, Citarabina, Cytosar-U® liposómico, Cytoxan®, dacarbazina, Dacogen, Dactinomicina, Darbepoetina Alfa, Dasatinib, Daunomicina, Daunorubicina, hidrocloruro de daunorubicina, Daunorubicina, DaunoXome ® liposómico, Decadron, Decitabina, Delta-Cortef®, Deltasone®, Denileucina diftitox, DepoCyt™, Dexametasona, Acetato de dexametasona, Fosfato sódico de dexametasona, Dexasona, Dexrazoxana, DHAD DIC, Diodex, Docetaxel, Doxil®, Doxorrubicina, Doxorrubicina liposómica, Droxia™, DTIC, DTIC-Dome®, Duralone®, Efudex®, Eligard™, Ellence™, Eloxatin™, Elspar®, Emcyt®, Epirrubicina, Epoetina alfa, Erbitux™, Erlotinib, Erwinia L-asparaginasa, Estramustina, Etiol, Etopophos®, Etoposida, Fosfato de Etoposidae, Eulexin®, Evista®, Exemestano, Fareston®, Faslodex®, Femara®, Filgrastim, Floxuridina, Fludara®, Fludarabina, Fluoroplex®, Fluorouracil, Fluorouracil (crema), Fluoximesterona, Flutamida, Ácido folínico, FUDR®, Fulvestrant, G-CSF, Gefitinib, Gemcitabina, Gemtuzumab ozogamicina, Gemzar®, Gleevec™, oblea de Gliadel®, GM-CSF, Goserelina, factor estimulador de colonias de granulocitos, Factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos, Halotestin®, Herceptin®, Hexadrol, Hexalen®, Hexametilmelamina, HMM Hycamtin®, Hydrea®, Hydrocort Acetate®, Hidrocortisona, Fosfato sódico de hidrocortisona, Succinato sódico de hidrocortisona, Fosfato de hidrocortisona, Hidroxiurea, Ibritumomab, Ibritumomab Tiuxetan, Idamycin®, Idarrubicina, Ifex®, IFN-alfa, ifosfamida, IL-11, IL-2, Imatinib mesilato, Imidazol carboxamida, interferón alfa, interferón Alfa-2b (conjugado PEG), Interleucina-2, Interleucina-11, Intrón A® (interferón alfa-2b), Iressa®, Irinotecán, Isotretinoina, Kidrolase®, Lanacort®, Lapatinib, L-asparraginasa, LCR, Lenalidomida, letrozol, leucovorina, Leukerán, Leukine™, Leuprolida, Leurocristina, Leustatin™, Ara-C liposómico, Pred® líquido, Lomustina, L-PAM, L-Sarcolisina, Lupron®, Lupron Depot®, Matulane®, Maxidex, Mecloretamina, Hidrocloruro de mecloretamina, Medralone®, Medrol®, Megace®, Megestrol, Acetato de Megestrol, Melfalán, Mercaptopurina, Mesna, Mesnex™, Metotrexato, Metotrexato sódico, Metilprednisolona, Meticorten®, Mitomicina, Mitomicina-C, Mitoxantrona, M-Prednisol®, MTC, MTX, Mustargen®, Mustina, Mutamycin®, Myleran®, Mylocel™, Mylotarg®, Navelbine®, Nelarabina, Neosar®, Neulasta™, Neumega®, Neupogen®, Nexavar®, Nilandron®, Nilutamida, Nipent®, Mostaza de nitrógeno, Novaldex®, Novantrone®, Octreotida, Acetato de octreotida, Oncospar®, Oncovin®, Ontak®, Onxal™, Oprevelcina, Orapred®, Orasone®, Oxaliplatino, un taxol o derivado de taxol por ejemplo Paclitaxel o Paclitaxel enlazado a proteína, Pamidronato, Panitumumab, Panretin®, Paraplatin®, Pediapred®, interferón de PEG, Pegaspargasa, Pegfilgrastim, PEG-INTRON™, PEG-L-asparaginasa, PEMETREXED, Pentostatina, Mostaza de fenilalanina, Platinol®, Platinol-AQ®, Prednisolona, Prednisona, Prelone®, Procarbazina, PROCRIT®, Proleukin®, Prolifeprospan 20 con implante de carmustina, Purinethol®, Raloxifeno, Revlimid®, Rheumatrex®, Rituxan®, Rituximab, Roferon-A® (interferón Alfa-2a), Rubex®, Hidrocloruro de rubidomicina, Sandostatin®, Sandostatin LAR®, Sargramostim, Solu-Cortef®, Solu-Medrol®, Sorafenib, SPRYCEL™, STI- 571, Estreptozocina, SU11248, Sunitinib, Sutent®, Tamoxifeno, Tarceva®, Targretin®, Taxol®, Taxotere®, Temodar®, Temozolomida, Teniposida, TESPA, Talidomida, Thalomid®, TheraCys®, Tioguanina, Thioguanine Tabloid®, Tiofosfoamida, Thioplex®, Tiotepa, TICE®, Toposar®, Topotecan, Toremifeno, Tositumomab, Trastuzumab, tretinoina, Trexall™, Trisenox®, tSPA TYKERB®, vCR Vectibix™, Velban®, Velcade®, VePesid®, Vesanoid®, Viadur™, Vidaza®, Vinblastina, Sulfato de vinblastina, Vincasar Pfs®, Vincristina, Vinorelbina, Tartrato de vinorelbina, VLB, VM-26, Vorinostat, VP-16, Vumon®, Xeloda®, Zanosar®, Zevalin™, Zinecard®, Zoladex®, Zoledronato, Zolinza, Zometa®; radiofármacos tales como: Carbono-11, Carbono-14, Cromo-51, Cobalto-57, Cobalto-58, Erbio-169, Flúor-18, Galio-67, Oro-198, Indio- 111, Indio-113m, Yodo-123, Yodo-125, Yodo-131, Hierro-59, Criptón-81m, Nitrógeno-13, Oxígeno-15, Fósforo-32, Renio-186, Rubidio-82, Samario-153, Selenio-75, Estroncio-89, Tecnecio-99m, Talio-201, Tritio,

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Xenón-127, Xenón-133, Itrio-90 agentes de formación de imágenes tal como gadolinio, magnetita, manganeso, tecnecio, 1125, 1131, P32, TI201, lopamidol, PET-FDG.

[0072] Otros socios de fusión, socios de conjugación y/o moléculas para inclusión en una nanopartícula, asociado o composición según la invención incluyen: fármacos de acromegalia por ejemplo somatulina, lanreótido, octreótido, Sandostatina; antitrombóticos por ejemplo bivalirudina, Angiomax, dalteparina, Fragmina, enoxaparina, Lovenox, Drotrecogina alfa (por ejemplo Activada), Xigris, heparina; compuestos de terapia reproductiva asistida por ejemplo coriogonadotropina, Ovidrel, folitropina, alfa/beta; enzimas por ejemplo hialuronidasa, Hylenex; fármacos para la diabetes por ejemplo exenatida, Byetta, glucagón, insulina, liraglutida, albiglutida, agonistas de GLP-1, exendina o un análogo de exendina; compuestos útiles en el diagnóstico por ejemplo protirelina, Thyrel TRH Thypinone, Secretina (por ejemplo humano sintético), Chirhostim, tirotropina (por ejemplo alfa), Thyrogen eritropoiesis fármacos por ejemplo Darbepoetina alfa, Aranesp, Epoetina alfa, Epogen, Eprex, fármacos para el tratamiento de defectos genéticos por ejemplo pegademasa, fármacos para el tratamiento de fallo de crecimiento por ejemplo Adagen, mecasermina, rinfabato, fármacos para el tratamiento de fibrosis cística por ejemplo Dornasa alfa, Pulmozyme, fármacos para el tratamiento de trastornos metabólicos por ejemplo Agalsidasa beta, Fabrazyme, alglucosidasa alfa, Myozyme, Laronidasa, Aldurazyme, fármacos para el tratamiento de verruga genital intralesional por ejemplo interferón alfa-n3, Alferon N, fármacos para el tratamiento de enfermedad granulomatosa por ejemplo interferón gamma-1b, Actimmune; fármacos para el tratamiento de retraso del crecimiento por ejemplo pegvisomant, Somavert, somatotropina, Genotropina, Nutropina, Humatrope, Serostim, Protropina; fármacos para el tratamiento de colapso cardíaco por ejemplo Nesiritida, Natrecor; fármacos para el tratamiento de hemofilia por ejemplo un factor de coagulación por ejemplo Factor VIII, Helixate FS, Kogenate FS, Factor IX, BeneFIX, factor VIIa, Novoseven, Desmopressin, Stimate, DDAVP; fármacos hemopoéticos por ejemplo Filgrastim (G-CSF), Neupogen, Oprelvekin, Neumega, Pegfilgrastim, Neulasta, Sargramostim, Leukine; fármacos para el tratamiento de hepatitis C por ejemplo interferón alfa-2a, Roferón A, Interferón alfa-2b, Intrón A, Interferón alfacon-1, Infergen, Peginterferón alfa-2a, Pegasys, Peginterferón alfa-2b, PEG-intrón; fármacos para el tratamiento de VIH por ejemplo Enfuvirtida, Fuzeon; Fabs por ejemplo Fab (antitrombina), Abciximab, ReoPro; anticuerpos monoclonales por ejemplo Daclizumab, Zenapax; anticuerpos monoclonales antivíricos por ejemplo Palivizumab, Synagis; anticuerpos monoclonales para el tratamiento del asma por ejemplo Omalizumab, Xolair; anticuerpos monoclonales para usar en la formación de imágenes de diagnóstico por ejemplo Arcitumomab, exploración de antígenos carcinoembrionarios, Capromab Pendetide, ProstaScint, Satumomab Pendetide, OncoScint CR/OV, Fabs para usar en la formación de imágenes de diagnóstico por ejemplo Nofetumomab, Verluma; anticuerpos monoclonales inmunosupresores por ejemplo Basiliximab, Simulect, Muromonab-CD3, Orthoclone OKT3; anticuerpos monoclonales para el tratamiento de malignidad por ejemplo Alemtuzumab, Campath, Ibritumomab tiuxetan, Zevalin, Rituximab, Rituxan, Trastuzumab, Herceptin; anticuerpos monoclonales para el tratamiento de artritis reumatoide (AR) por ejemplo Adalimumab, Humira, Infliximab, Remicade; anticuerpos monoclonales para uso como un radioinmunoterapéutico por ejemplo Tositumomab y yodo I131, Tositumomab, Bexxar; fármacos para el tratamiento de degeneración macular por ejemplo pegaptanib, Macugen; fármacos para el tratamiento de malignidad por ejemplo Aldesleucina, Proleucina, Interleucina-2, Asparaginasa, Elspar, Rasburicasa, Elitek, Denileukin diftitox, Ontak, Pegaspargasa, Oncaspar, goserelina, leuprolida; fármacos para el tratamiento de esclerosis múltiple (MS) por ejemplo acetato de glatirámero (por ejemplo copolímero-1), Copaxone, interferón beta-1a, Avonex, interferón beta-1a, Rebif, interferón beta-1b, Betaseron; fármacos para el tratamiento de mucositis por ejemplo palifermin, Kepivance; fármaco para el tratamiento de distonia por ejemplo, neurotoxina, toxina botulínica tipo A, BOTOX, BOTOX Cosmetic, toxina botulínica tipo B, MYOBLOC; fármacos para el tratamiento de osteoporosis por ejemplo teriparatida, Forteo; fármacos para el tratamiento de psoriasis por ejemplo Alefacept, Amevive; fármacos para el tratamiento de RA por ejemplo abatacept, Orencia, Anakinra, Kineret, Etanercept, Enbrel; trombolíticos por ejemplo Alteplasa, Activasa, rtPA, Anistreplasa, Eminasa, Reteplasa, Retavase, Estreptoquinasa, Estreptasa, Tenecteplasa, TNKase, uroquinasa, Abbocinasa, Kinlytic; fármacos para el tratamiento de osteoporosis por ejemplo calcitonina (por ejemplo salmón), Miacalcin, Fortical, fármacos para el tratamiento de úlceras de la piel por ejemplo Becaplermin, Regranex, colagenasa, Santyl.

[0073] No está claro qué determina la vida media en plasma de conjugados de albúmina, polipéptidos de fusión o asociados (por ejemplo pero no limitado a Levemir®, Kurtzhals P et al. Biochem. J. 1995,312:725- 731), pero parece ser un resultado de la combinación de la albúmina y el agente terapéutico seleccionado. Sería deseable poder controlar la vida media en plasma de conjugados de albúmina dados, asociados o polipéptidos de fusión de albúmina de modo que una vida media más larga o más corta de plasma se pueda conseguir que la que se da por los componentes individuales de la asociación, conjugación o fusión, con el objetivo de poder diseñar un fármaco particular según los particulares de la indicación destinados a ser tratados.

[0074] Para ayudar a este diseño la presente invención proporciona un método para valorar una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una variante HSA en comparación con HSA tipo salvaje utilizando un modelo animal no primate. La "farmacocinética" se entiende como la determinación del destino de sustancias administradas externamente a un organismo vivo. Las vías de administración pueden, por

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ejemplo, ser oral, enteral (rectal), mucosa o parenteral. Preferiblemente, la administración es parenteral. Vías de administración parenteral preferidas son seleccionadas de, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o intrapleural. En la presente invención la propiedad farmacocinética preferida o propiedades medidas son seleccionadas de vida media, volumen de distribución, biodisponibilidad, área bajo la curva (AUC), índice de aclaramiento e inmunogenicidad. La propiedad farmacocinética preferida medida en relación con albúmina, variantes y fragmentos de albúmina y modificaciones de la misma es la vida media. La vida media de HSA se mide generalmente por la inyección de un animal modelo subcutáneamente, intramuscularmente o por vía intravenosa con una muestra HSA pertinente (por ejemplo HSA tipo salvaje, o HSA variante o HSA modificada). Para formulaciones dirigidas a la administración oral, enteral (rectal) o mucosa otras vías de administración pueden ser seleccionadas. La dosis se puede variar dependiendo del modelo animal, una dosis entre 1 a 100mg/kg, preferiblemente 5 a 50 mg/kg, preferiblemente de 10 a 40 mg/kg, más preferiblemente de 15 a 30 mg/kg será generalmente apropiada a menos que la molécula sea muy grande luego la dosis puede ser aumentada. Muestras de sangre son recogidas de los animales antes de la inyección y a intervalos posteriores. Los intervalos dependerán del modelo animal ya que se prevé que la vida media varíe con el tamaño del animal (ver tabla 2). Para un ratón, tiempos de muestreo pueden por ejemplo ser 12, 24, 72, 168, 240 y 300 horas post inyección. Para un cerdo los tiempos de muestreo pueden por ejemplo ser 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 y 32 días. La persona experta generalmente conocerá qué tiempos de muestreo son apropiados basándose en las moléculas y el animal. El plasma se puede separar de las muestras y almacenar a -80°C. La cantidad de muestra de HSA restante en el suero se puede analizar por ejemplo por ELISA, espectrometría de masas o Meso escala de descubrimiento (MSD). En resumen, las placas recubiertas con anticuerpo dirigido al agente terapéutico o etiqueta de detección pueden utilizarse para capturar las varias moléculas de albúmina y un anticuerpo de detección secundaria (por ejemplo bien dirigido hacia HSA o epítopo alternativo del agente terapéutico o etiqueta de detección) se añaden para cuantificar la cantidad de HSA presente en la muestra o se pueden utilizar moléculas de albúmina radiomarcadas alternativamente para cuantificar la cantidad de albúmina restante en el suero (en todos los casos los medios de detección no deberían alterar el acoplamiento de la albúmina con el receptor de FcRn en su manera característica. Además, las referencias citadas en la tabla 2 describen varios métodos para medir la vida media de la albúmina en los modelos animales diferentes. Los métodos que usan etiquetado radiactivo de la albúmina son menos preferidos ya que es una modificación adicional a la albúmina o variante y pueden por lo tanto influir en la vida media de la albúmina.

Formas de realización

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1. Un método para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una HSA variante en comparación con HSA tipo salvaje que comprende

a. Selección de un conejo transgénico doble o un roedor transgénico doble donde los transgenes son albúmina humana y un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16;

b. Administración de HSA variante a un animal y HSA tipo salvaje a otro animal como conejo o roedor seleccionado en a); y

c. Medición de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de HSA variante y HSA tipo salvaje.

2. El método según la forma de realización 1, donde la afinidad de unión de HSA tipo salvaje al FcRn nativo de dicho animal es entre 0.8 y 3.5 veces cuando se comparó con la afinidad de unión de la albúmina nativa de dicho animal.

3. El método según la forma de realización 1 o 2, donde la afinidad de unión es evaluada usando resonancia de plasmón de superficie y un FcRn de animal soluble que comprende una cadena pesada de FcRn y una beta2-globulina desde la misma especie animal.

4. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde el FcRn nativo tiene una valina en la posición que corresponde con la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

5. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde el FcRn nativo tiene una valina en la posición que corresponde con la posición 52 y una histidina en la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

6. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde el animal transgénico es un conejo transgénico doble o un roedor transgénico doble, preferiblemente un ratón, cobaya o rata, y los transgenes son albúmina humana y un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

7. El método según la forma de realización 6 donde el FcRn además tiene una valina en la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

8. El método según la forma de realización 6 o 7, donde el FcRn además tiene un ácido glutámico en la posición 54, una glutamina en la posición 56 y una histidina en la posición 166 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

9. El método según cualquiera de las formas de realización 6 a 8, donde el transgen FcRn es seleccionado de humano, chimpancé, macaco, vaca, cabra, oveja, camello y cerdo.

10. El método según cualquiera de las formas de realización 6 a 8, donde el transgen FcRn es humano.

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11. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la HSA variante y HSA tipo salvaje se modifica por fusión, conjugación o asociación con un socio.

12. El método según la forma de realización 11, donde el socio es un agente terapéutico o una vacuna.

13. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde una o más (varias) propiedades farmacocinéticas medidas son seleccionadas de vida media, volumen de distribución, AUC, biodisponibilidad, índice de aclaramiento e inmunogenicidad.

14. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la propiedad farmacocinética medida es vida media.

15. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la albúmina se administra subcutáneamente, por vía intramuscular o intravenosa.

16. El método según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde una HSA variante o HSA variante modificada con una o más (varias) propiedades farmacocinéticas mejoradas cuando se compara con HSA tipo salvaje o HSA tipo salvaje modificada, se selecciona para usar en una prueba preclínica.

17. El método según la forma de realización 16, donde la HSA variante tiene una vida media más larga que HSA tipo salvaje.

18. Una HSA variante seleccionada por el método de cualquiera de las formas de realización 15 a 17.

19. Una HSA variante modificada por fusión, conjugación o asociación con un socio, donde la fusión, conjugación o asociación se selecciona por el método de cualquiera de las formas de realización 15 a 17.

20. La variante según la forma de realización 19, donde el socio es un agente terapéutico o una vacuna.

21. Uso de un modelo transgénico de conejo o de roedor que expresa un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con SEQ ID N.°: 16 y albúmina humana y que ha sido desactivada para las proteínas nativas correspondientes para comparar una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una molécula de control con una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de una molécula de prueba donde la molécula de control comprende HSA tipo salvaje y la molécula de prueba comprende una variante de HSA.

22. El uso según la forma de realización 21, donde el FcRn además tiene una valina en la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

23. El uso según la forma de realización 21 o 22, donde el transgen FcRn es seleccionado de humano, chimpancé, macaco, oveja, vacas y cerdo.

24. El uso según cualquiera de las formas de realización 21 a 23, donde la molécula que comprende HSA tipo salvaje y la molécula que comprende HSA variante además comprende un socio de conjugación, socio de fusión o socio de asociación.

25. El uso según la forma de realización 24, donde el socio es un agente terapéutico o una vacuna.

26. El uso según cualquiera de las formas de realización 21 a 25, donde se evalúa el efecto en las propiedades farmacocinéticas de un socio seleccionado y el método de unión a la molécula de control y de prueba.

27. El uso según la forma de realización 26, donde la molécula de control es HSA tipo salvaje unida al socio y la molécula de prueba es una HSA variante unida al mismo socio usando el mismo método de unión de las moléculas.

28. El uso según la forma de realización 26 o 27, donde el socio es un socio de conjugación conjugado en posiciones diferentes en la albúmina (las posiciones son idénticas para tanto la molécula de control como de prueba).

29. El uso según la forma de realización 26 o 28, donde el socio es un socio de conjugación conjugado con tecnologías de conjugación diferentes con la albúmina (la tecnología de conjugación es idéntica para la molécula de control y de prueba).

30. El uso según la forma de realización 26 o 28, donde el socio es un socio de fusión fusionado con o sin enlaces diferentes en el extremo C y/o extremo N de la albúmina (los enlazadores son idénticos para la molécula de control y de prueba).

31. Un conejo transgénico o roedor cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen de cadena pesada FcRn endógeno y gen de albúmina de suero endógeno que previene la expresión de una proteína de FcRn HC funcional de conejo o roedor y albúmina de suero funcional de conejo o de roedor y el genoma comprende además una secuencia de ADN heterólogo que expresa un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y una secuencia de ADN heterólogo que codifica para suero humano (HSA), y donde el animal expresa una proteína de FcRn HC funcional con una histidina en la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y HSA funcional.

32. Un animal transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen FcRn HC endógeno y gen de albúmina de suero que previene la expresión de una proteína de FcRn HC funcional de animal y albúmina de suero de animal funcional y el genoma comprende además una secuencia de ADN heterólogo que codifica para FcRn HC humano (hFcRn HC) y una secuencia de ADN heterólogo que codifica para una albúmina de suero humano (HSA), y donde el animal expresa una proteína de hFcRn HC funcional y HSA funcional.

33. El animal transgénico según la forma de realización 31 o 32, donde el FcRn es 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5,100% idéntico a la secuencia madura de SEQ ID N.°: 9 o a SEQ ID N.°: 16 y el FcRn HC tiene una histidina en la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.

34. El animal transgénico según la forma de realización 31 o 32, donde el FcRn HC comprende SEQ ID N.°: 16

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35. El animal transgénico según cualquiera de las formas de realización 32 a 34, donde la HSA humana es 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100% idéntica a la SEQ ID N.°: 2.

36. El animal transgénico según cualquiera de las formas de realización 32 a 35, donde el animal o roedor es un ratón.

37. El animal transgénico según cualquiera de las formas de realización 31 a 36, donde el ADN heterólogo reemplaza al gen endógeno y así lo interrumpe

38. El animal transgénico según cualquiera de las formas de realización 31 a 36, donde la interrupción del gen endógeno se hace independientemente de la inserción del ADN heterólogo, permitiendo que el ADN heterólogo se inserte en una posición diferente del genoma que el gen endógeno.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

[0076] Amine Coupling Kit de GE Healthcare (BR-1000-50) que comprende hidrocloruro de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), 1.0 M HCl de etanolamina pH 8.5

Albúminas:

[0077] Las albúminas usadas en los presentes ejemplos fueron en la forma madura. Albúmina de suero humano, ratón, conejo y oveja se produjeron recombinantemente utilizando secuencias proporcionadas de bases de datos disponibles públicamente (ver secuencias más abajo) utilizando el método de producción como se describe para las variantes en WO 2012/059486 "métodos 1". Albúminas de suero de perro, cerdo, macaco cangrejero, cobaya y rata fueron preparadas usando los mismos métodos.

• albúmina de suero humano tipo salvaje (HSA) (SEQ ID N.°: 1, secuencia madura de aminoácido 25 a 609 también indicada en SEQ ID N.°: 2).

• albúmina de suero de macaco rhesus tipo salvaje (rmSA) (SEQ ID N.°: 3, secuencia madura de aminoácido 25 a 608).

• albúmina de suero de perro tipo salvaje (DSA) (SEQ ID N.°: 4, secuencia madura de aminoácido 25 a 608).

• albúmina de suero de cerdo tipo salvaje (PSA) (SEQ ID N.°: 5, secuencia madura de aminoácido 25 a 607).

• albúmina de suero de rata tipo salvaje (RSA) (SEQ ID N.°: 6, secuencia madura de aminoácido 25 a 608).

• albúmina de suero de ratón tipo salvaje (MSA) (SEQ ID N.°: 7, secuencia madura de aminoácido 25 a 608).

• cobaya tipo salvaje (GPSA) (SEQ ID N.°: 18, secuencia madura de aminoácido 25 a 608).

• macaco cangrejero tipo salvaje (CSA) (SEQ ID N.°: 19, secuencia madura de aminoácido 24-608)

[0078] Las moléculas de HSA variante fueron generadas por la substitución de K573 nativo con P, F, W, H o Y o HSA K500 nativa con A. La variante de K500A es conocida por no enlazarse con FcRn humano (un ligante nulo). Las variantes fueron preparadas como se describe en WO 2011/051489 ejemplo 1, método 3 y 4. Las moléculas de HSA variantes con las sustituciones siguientes T83N+N111E+K573P fueron preparadas como se describe en WO 2013/135896 ejemplo 1. La molécula de HSA variante con las sustituciones siguientes E492G+K573P+K574H+Q580K fue preparada como se describe en PCT/EP2013/073426 ejemplo 1, método 2.

[0079] Albúmina y variantes de albúmina con una etiqueta c-myc fueron generadas para habilitar la detección de albúmina humana y variantes de albúmina humana en el mono y cerdo ya que los anticuerpos hacia HSA no pueden distinguir rmSA nativa y PSA nativa de HSA. La etiqueta c-myc fue añadida por la fusión del epítopo con la secuencia EQKLISEEDL al extremo N-terminal de la secuencia de albúmina, para detalles véase ejemplo 3.

Moléculas de FcRn solubles:

[0080] Se han descrito vectores que codifican las versiones truncadas de los tres ectodominios (a1-a3) de cDNA de cadena pesada de FcRn de ratón y humano, fusionados genéticamente a un cDNA que codifica la glutationa S-transferasa de Schistosoma japonicum (GST) (Andersen et al (2008) FEBS J 275(16), 40974110; Andersen et al. (2010) J Biol. Chem. 12,285(7): 4826-36, Andersen et al., 2011 J. Biol. Chem286:5234- 5241). Versiones truncadas de los tres ectodominios (a1-a3) de cDNA de FcRn HC de macaco rhesus, rata, cerdo y perro fueron sintetizadas por GenScript, y subclonadas en el mismo sistema de vector utilizando los sitios de restricción Xhol (NEB) e Hindlll (NEB). Todos los vectores también contienen un cDNA que codifica p2-microglobulina humana y el origen de replicacón del virus de Epstein-Barr (oriP). Las moléculas de FcRn solubles marcadas por GST fueron producidas en células 293E de riñón embrionario humano adherentes, y los receptores segregados fueron purificados utilizando una columna GSTrap como se describe (Berntzen et al. (2005) J Immunol Methods 298,93-104).

[0081] Las secuencias proteínicas de las cadenas de FcRn son enumeradas a continuación.

• humano (shFcRn) corresponde a los aminoácidos 24 a 291 de SEQ ID N.°: 9

• macaco rhesus (srmFcRn) corresponde a los aminoácidos 22 a 290 de SEQ ID N.°: 10

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• cerdo (pFcRn) corresponde a los aminoácidos 23 a 290 de SEQ ID N.°: 11

• perro (dFcRn) corresponde a los aminoácidos 23 a 289 de SEQ ID N.°: 12

• ratón (smFcRn) corresponde a los aminoácidos 21 a 293 de SEQ ID N.°: 13

• rata (srFcRn) corresponde a los aminoácidos 23 a 292 de SEQ ID N.°: 14

• p2-microglobulina humana se indica en SEQ ID N.°: 15 (secuencia madura de los aminoácidos 21 a 119).

• cobaya (gpFcRn) corresponde a los aminoácidos 25 a 298 de SEQ ID N.°: 17

• macaco cangrejero (CynoFcRn) corresponde a los aminoácidos 24-297 de SEQ ID N.°: 20. p2- microglobulina de macaco cangrejero se indica en SEQ ID N.°: 21 (secuencia madura de aminoácidos 21 a 119)

• p2-microglobulina de cerdo se indica en SEQ ID N.°: 22 (secuencia madura es de aminoácidos 21 a 118)

• p2-microglobulina de cobaya se indica en SEQ ID N.°: 23 (secuencia madura de aminoácidos 27 a 125)

Resonancia de plasmón de superficie (SPR):

[0082] Experimentos de SPR fueron efectuados utilizando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). Células de flujo de chips sensores de CM5 fueron acopladas con FcRn soluble de una de las siguientes especies, humano (shFcRn), rata (srFcRn), ratón (smFcRn), macaco rhesus (srmFcRn), perro (dFcRn) o cerdo (pFcRn) (~ 900 - 2500 unidades de resonancia (RU)) usando química de acoplamiento de amina de GE Healtchcare según las instrucciones del fabricante. El acoplamiento fue realizado por la inyección de 2 o 10 |jg/ml de FcRn en 10 mM pH de acetato sódico 5.0 (GE Healthcare). Tampón fosfato (67 mM de tampón fosfato, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20) a pH 6.0) fue usado como tampón de desplazamiento y búfer de dilución. La regeneración de las superficies se hizo usando inyecciones de tampón HBS-EP (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% tensioactivo P20) a pH 7.4 (GE Healthcare). Para la determinación de la cinética de unión, diluciones en serie de albúmina (10-0.3 jM) fueron inyectadas sobre receptores inmovilizados a un caudal constante (50 jl/min) a 25 °C. En todos los experimentos, los datos fueron ajustados a cero y la referencia celular sustraída. Índices de asociación (ka) e índices de disociación (kd) fueron calculados utilizando un modelo de unión de uno en uno simple (BIAevaluation 4.1 software (BIAcore AB)) (Karlsson et al. (1997). J. Immunol. Methods 200,121-133).

Ensayo para cuantificación de modelo animal de albúmina de suero humano

[0083] Placas para EIA de Maxisorb (Nunc) fueron recubiertas durante toda la noche con anticuerpo de captura anti-c-myc (Abcam ab9132) a 1.25jg/mL en suero salino tamponado con fosfato (PBS) lavadas luego 3 veces con 300jL PBS+0.05%(v/v) Tween-20 (PBST), pH 7.4. Las placas fueron bloqueadas durante 2h con 300jL PBS + 5%(p/v) de leche desnatada en polvo + 1% (v/v) Tween-20 + 10% (v/v) de suero de rata (Sigma), pH 7.4. Muestras de plasma fueron diluidas 1:10 en PBST luego mezcladas con 10% plasma de citrato sódico de minicerdo de Gottingen o plasma de citrato sódico de macaco cangrejero hembra (catálogo SeraLab n° PSCGOF-444-M-32556 y PSCF-118-M-32555, respectivamente) en PBST. Una curva estándar con una concentración superior de 1000ng/mL y doce puntos de dilución dobles fue incluida en cada placa con HSA de c-myc purificada diluida en 10% plasma de minicerdo o plasma de macaco cangrejero en PBST. Placas fueron incubadas a temperatura ambiente (TA) durante 1h luego lavadas como anteriormente. 100jl de biotina anti-HSA (Abcam ab81426) a 1.5jg/mL en PBST fueron añadidas a cada pozo y las placas fueron incubadas durante 30 min a TA. Las placas fueron lavadas como anteriormente y 100jl de 1.25jg/mL estreptavidina-HRP (Sigma) en PBST fueron añadidas a cada pozo y las placas fueron incubadas durante 30 min a TA. Las placas fueron lavadas como anteriormente y la señal fue desarrollada con 100jL de sustrato TMB-Ultra (Pierce). La absorbancia fue medida a 450nm utilizando un lector de placas EnSpire Multimode (Perkin Elmer). En ambos casos la curva estándar en cada placa fue equipada en un modelo de regresión no lineal de 4 parámetros y la concentración de HSA en el plasma fue calculada en cada momento utilizando las diluciones que entraron en la gama lineal de la curva estándar.

Análisis de PK

[0084] Los perfiles de concentración en el plasma medios del grupo fueron sometidos a análisis farmacocinético no compartimental usando Phoenix WinNonLin 6.3. Momentos y dosis nominales fueron usados y todos los puntos de datos fueron igualmente ponderados en el análisis. Concentraciones medias en plasma versus perfiles temporales para cada una de las variantes de HSA fueron ajustadas con un modelo bicompartimental para generar el ajuste de la curva. Los parámetros farmacocinéticos siguientes fueron evaluados:

Cmax La concentración en suero máxima

AUC Área bajo la curva de concentración en suero de 0 a infinito tv2 Vida media de eliminación terminal en el plasma

Vz Volumen de distribución durante la fase de eliminación Cl Aclaramiento total del cuerpo

Ejemplo 1 Cinética de unión de albúminas hacia FcRn de humano, rata, ratón y macaco rhesus

[0085] La afinidad de unión de HSA y HSA variante a FcRn soluble de humano, ratón, rata y macaco rhesus fue analizada y la unión de HSA fue comparada con la unión de la albúmina nativa.

[0086] Los resultados de SPR se muestran en la figura 1 a 4 y la cinética de unión se resumen en la tabla 5.

Tabla 5: Cinética de unión de albúminas hacia FcRn de humano, rata, ratón y macaco rhesus

Variante de albúmina

Ka (103/Ms) Kd (10-3/s) KDa (mM) KDb (mM)

FcRn humano

HSA tipo salvaje

7.4±0.1 8.40±0.1 1.1 1.2

K573P

4.4±0.1 0.43±0.1 0.097 ND

K573F

7.3±0.2 0.48±0.1 0.065 ND

K573H

7.2±0.0 0.57±0.1 0.079 ND

K573W

4.4±0.1 0.30±0.1 0.068 ND

K573Y

7.4±0.1 0.29±0.1 0.040 ND

K500A

NA NA NA 25.0c

FcRn de rata

HSA tipo salvaje

NA NA NA ND

RSA tipo salvaje

7.6±0.1 26.0±0.0 3.20 4.1

K573P

3.8±0.1 7.7±0.1 2.00 2.3

K573F

5.6±0.1 8.5±0.1 1.50 2.2

K573H

7.0±0.0 19.0±0.2 2.70 2.3

K573W

3.2±0.2 5.7±0.0 1.80 2.9

K573Y

4.8±0.1 4.6±0.1 1.00 2.0

K500A

NA NA NA NA

FcRn de ratón

HSA tipo salvaje

NA NA NA 25.0

MSA tipo salvaje

16.1±0.1 12.2±0.0 0.80 1.0

RSA tipo salvaje

13.0±0.0 34.1±0.1 2.60 2.6

K573P

7.7±0.2 12.2±0.0 1.60 1.7

K573F

12.0±0.1 17.0±0.0 1.40 1.5

K573H

12.1±0.0 28.1±0.2 2.3 2.3

K573W

8.2±0.1 8.4±0.1 1.00 1.4

K573Y

12.3±0.1 8.0±0.0 0.70 0.9

K500A

ND ND ND ND

FcRn de macaco Rhesus

HSA tipo salvaje

8.9±0.2 16.0±0.1 1.80 ND

RmSA tipo salvaje

5.3±0.2 13.0±0.1 2.4 ND

RSA tipo salvaje

4.5±0.1 10.1±0.2 2.20 ND

MSA tipo salvaje

4.9±0.2 6.6±0.1 1.30 ND

K573P

5.7±0.1 1.3±0.1 0.23 ND

K573F

6.8±0.0 1.4±0.2 0.21 ND

K573H

7.6±0.1 1.8±0.1 0.24 ND

K573W

4.8±0.2 0.8±0.2 0.17 ND

K573Y

6.4±0.1 0.8±0.1 0.12 ND

K500A

ND ND ND ND

a. Las constantes de índice cinético fueron obtenidas utilizando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1). Los valores cinéticos representan el promedio de duplicados. b. La constante de afinidad de estado estable se obtuvo utilizando un modelo de unión de equilibrio (Req) suministrado por el software BIAevaluation 4.1. c. Los datos son tomados de Andersen et al., Nature Commun., In press ND = no determinado. NA = no adquirido debido a cinética rápida.

Conclusiones

10 [0087] Todas las variantes de HSA mostraron unión considerablemente mejorada a FcRn humano a pH ácido

en comparación con el tipo salvaje, y el aumento fue principalmente debido a índices de disociación más lentos.

[0088] HSA se enlaza muy débilmente a FcRn de rata y ratón cuando se compara con las albúminas nativas. 15 Consecuentemente, albúmina de rata o de ratón superará la HSA para la unión de FcRn de rata o ratón. Por esta razón, rata y ratón no son modelos animales deseados para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de HSA in vivo. Por otro lado, HSA tiene una afinidad de unión cuantificable

5

10

15

20

25

30

para FcRn de macaco rhesus, y la unión es 1,3 veces mejor que la unión de la albúmina nativa de macaco rhesus. Esto indica que el macaco rhesus es un modelo animal adecuado para estudios farmacocinéticos de HSA y variantes de HSA ya que la albúmina de macaco rhesus nativa no superará la HSA para la unión a FcRn.

Ejemplo 2 cinética de unión de albúminas hacia FcRn de perro y cerdo

[0089] En este ejemplo la afinidad de unión de HSA y HSA variante para FcRn de perro y cerdo fue analizada y la unión de HSA fue comparada con la unión de la albúmina nativa.

[0090] Los resultados de SPR se muestran en la figura 5 y 6 y la cinética de unión se resumen en la tabla 6.

Tabla 6: Cinética de unión de albúminas hacia FcRn de perro y cerdo

Variante de albúmina

Ka (103/Ms) Kd (10-3/s) KDa (mM)

FcRn de perro

HSA tipo salvaje

9.10±0.10 17.0±0.02 1.90

DSA

12.0±0.20 3.40±0.1 0.28

PSA

NA NA 23.0b

rmSA

1.30±0.10 20.0±0.0 1.54

RSA

8.30±0.00 48.0±0.01 5.80

MSA

7.40±0.10 13.0±0.02 1.75

K573P

8.30±0.10 2.00±0.00 0.24

K573W

6.70±0.20 2.60±0.10 0.38

K573F

9.20±0.00 3.80±0.20 0.41

K573Y

8.10±0.10 2.40±0.10 0.29

K573H

13.0±0.10 5.10±0.00 0.39

HSA K500A

NA NA 360

FcRn de Cerdo

HSA tipo salvaje

16.0±0.31 15.0±0.05 0.93

PSA

20.0±0.30 53.0±0.10 2.70

DSA

9.20±0.10 13.0±0.02 1.40

rmSA

10.0±0.20 12.0±0.01 1.20

RSA

11.0±0.20 71.0±0.02 6.40

MSA

10.0±0.10 22.0±0.01 2.20

K573P

9.20±0.10 2.60±0.03 0.28

K573W

8.70±0.20 2.20±0.10 0.25

K573F

10.0±0.10 2.80±0.20 0.28

K573Y

9.80±0.05 2.30±0.02 0.23

K573H

14.0±0.02 3.50±0.01 0.25

HSA K500A

NA NA 38.0b

a. Las constantes de índice cinético fueron obtenidas utilizando un modelo de interacción bimolecular simple

de primer orden (1:1). Los valores cinéticos representan el promedio de duplicados b. KD estimado basado en mediciones de afinidad de estado estable.

NA = no adquirido debido a cinética rápida.

Conclusiones

[0091] HSA se enlaza a FcRn de perro con una afinidad que es 6,8 veces inferior a la afinidad de unión de albúmina de perro nativo. Consecuentemente, es muy posible que la albúmina de perro supere la HSA para FcRn de perro. Por esta razón, el perro no es un modelo animal deseado para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de HSA in vivo.

[0092] Por otro lado la HSA tiene afinidad de unión a FcRn de cerdo que es 2,9 veces superior a la unión de la albúmina de cerdo nativa. Esto indica que el cerdo es un modelo animal adecuado para estudios farmacocinéticos de HSA y variantes de HSA ya que la albúmina de cerdo nativa, aunque está presente en cantidades en exceso en comparación con HSA, no superará la HSA para la unión de pFcRn.

Ejemplo 3 Preparación de HSA marcada con c-myc y variantes de HSA

[0093] HSA y variantes de HSA fueron expresadas utilizando técnicas de biología molecular estándar, tal como se describe en Sambrook, J. y D.W. Russell, 2001 (Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

[0094] El objetivo fue segregar de levadura, albúmina humana tipo salvaje (Wt) y albúminas humanas variantes que incorporan las modificaciones K573P, o E492g+K573P+K574H+Q580K o T83N+N111E+K573P que incorporaron un epítopo c-myc en el extremo N-terminal de la secuencia de albúmina madura. La secreción de levadura fue habilitada por el uso de una secuencia líder prepro, conocida como el líder de fusión modificada (mFL con la secuencia de aminoácidos MKWVFIVSILFLFSSAiS), incorporando otra modificación en la región pro (aminoácidos RSLD). El líder de fusión modificado (mFL), fue además modificado por la inclusión de la secuencia de aminoácidos EEAEAEAESSRLKR que incluye el sitio de escisión 12568 dibásico (KR) con Kex2p y un epítopo c-myc con la secuencia EQKLISEEDL insertada en el extremo N-terminal de la secuencia de albúmina.

[0095] Todos los cassetes de expresión comprenden el promotor PRB1 de S. Cerevisiae y un terminador ADH1 de S. Cerevisiae modificado (mADHt)

[0096] Los plásmidos que codifican la albúmina tipo salvaje y las variantes han sido previamente descritas (ver referencia en la sección Materiales y Métodos). Los plásmidos fueron digeridos de forma similar hasta finalización con BglM/SacM y el gran fragmento de 8.585kb aislado y sustituido con el fragmento análogo BglM/SacM de 0.26kb que codifica la secuencia líder de fusión modificada MKWVFIVSILFLFSSAYS RSLDEEAEAEAESSRLKREQKLISEEDL.

[0097] Los plásmidos de expresión fueron generados in vivo (es decir vía recombinación homóloga en S. Cerevisiae; una técnica referida como reparación de gaps o clonación in vivo- ver Orr-Weaver & Szostak. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4417-4421). Los plásmidos modificados que comprenden la etiqueta c- myc fueron digeridos hasta la finalización con NsiI/PvuI y los fragmentos de 7.41 kb aislados. 100ng de los 4 fragmentos aislados fueron mezclados individualmente con 100ng de pDB3936 digerido con Acc65I/BamHI (descritos en WO 2010/092135) y usados para transformar directamente una cepa A cir0 de S. Cerevisiae. La cepa A es un derivado de DYB7 de S. Cerevisiae (Payne et al (2008) Applied and Environmental Microbiology Vol 74(24): 7759-7766) con cuatro copias de PDI integradas en el genoma. La transformación de la cepa A fue conseguida utilizando el Sigma Yeast Transformation kit como se describe en WO2011/051489. El crecimiento de los transformantes de levadura en el cultivo en el matraz de agitación, la preparación de reservas de trehalosa de levadura y fermentación alimentada de la albúmina marcada con c-myc y variantes de albúmina fueron esencialmente hechas como se describe también en WO 2011/051489 ejemplo 1, con la modificación de que la base nitrogenada de levadura del caldo BMMS (0.17% (p/v) sin aminoácido y sulfato de amonio (Difco), 37.8mM sulfato de amonio, 36 mM ácido cítrico, 126mM ortofosfato de hidrógeno disódico pH6.5, 2% (p/v) sacarosa, ajustado a pH 6.5 con NaOH) fue usado en ambos casos. Un segundo paso de purificación de la albúmina marcada con c-myc y variantes de albúmina fue realizado usando cromatografía de matriz de AlbuPure™ (ProMetic BioSciences) seguida de DE-FF como se describe en (Evans et al. (2010) Protein Expression and Purification, Volumen 73, Edición 2, páginas 113-124) seguido de purificación en filtración en gel de alta resolucióhn Sephacryl S200 (GE Healthcare) para reducir el nivel de un líder +2058 Da mal clivado hasta menos del 5% (p/v).

Ejemplo 4 Cinética de unión de albúminas hacia FcRn de cerdo, macaco cangrejero y de cobaya

[0098] En este ejemplo, la afinidad de unión de HSA, albúmina de HSA variante y HSA marcada con c-myc para FcRn de cerdo, macaco cangrejero y cobaya fue analizado y la unión de HSA fue comparada con la unión de la albúmina nativa (cerdo o cobaya).

[0099] El ensayo SPR fue realizado con las variaciones siguientes al ensayo descrito en la sección Materiales y Método:

[0100] Los receptores de FcRn solubles fueron sintetizados por GeneArt y expresados en células HEK. El FcRn soluble contenía una etiqueta de HIS en el C-terminal de la cadena beta en vez de un GST en la cadena pesada y la cadena beta usada fue la cadena beta nativa del animal (ver la sección materiales y método para las secuencias correspondientes). El FcRn soluble fue purificado por una columna His trap seguida de una purificación adicional que utiliza una columna de IgG. El receptor de FcRn soluble fue diluido a 20|jg/mL el tampón fosfato usado como tampón de desplazamiento en el ensayo SPR fue a pH 5.5 en vez de pH 6.0. Las albúminas fueron diluidas en el rango de 20jM a 0.156jM y fluyeron a 30jL/min. Se usó 1:1 de modelo de Langmuir y de estado estable.

[0101] La cinética de unión se resume en la tabla 7.

Tabla 7: Cinética de unión de albúminas hacia cerdo y cobaya

Variante de albúmina

Ka (103/Ms) Kd (10-3/s) KD mM Veces > PSA

FcRn de Cerdo

PSA

- - 210* -

HSA tipo salvaje

- - 232* 0.9

c-myc-HSA tipo salvaje

- - 468* 0.4

5

10

15

20

25

30

35

K573P

32.7 62.2 1.9 110

c-myc-K573P

31.2 40.1 1.3 161

T83N+N111E+K573P

60.1 62.5 1.0 210

C-myc-T83N+N 111E+K573P

48.8 49.0 1.0 210

E492G+K573P+K574H+Q580K

27.8 12.1 0.4 525

C-myc-E492G+K573P+K574H+Q580K

34.5 13.6 0.4 525

FcRn de macaco cangrejero

CSA

2.8 98 35 -

HSA tipo salvaje

2.7 108 40 0.9

Cmyc-HSA tipo salvaje

2.5 108 43 0.8

K573P

5.1 22 4 8.8

C-myc-K573P

5.7 20 4 8.8

T83N+N111E+K573P

7.6 18 2 17.5

C-myc-T83N+N 111E+K573P

7.0 22 3 11.7

E492G+K573P+K574H+Q580K

4.6 5.5 1 35

C-myc-E492G+K573P+K574H+Q580K

4.9 5.9 1 35

gpFcRN

GPSA

36.2 41.9 1.1

PSA

NA NA NA

HSA tipo salvaje

NA NA NA

C-myc-HSA

NA NA NA

K573P

1.5 297 190

C-myc-K573P

0.5 181 360

T83N+N111E+K573P

0.7 279 410

C-myc-T83N+N 111E+K573P

0.4 216 550

E492G+K573P+K574H+Q580K

5.8 62.8 10.9

C-myc-E492G+K573P+K574H+Q580K

5.7 76.8 13

*KD valores sin cinética fueron determinados usando un modelo estable NA = no adquirido debido a cinética rápida.

Conclusiones

[0102] Afinidades de unión de HSA tipo salvaje y PSA a FcRn de cerdo son comparables. Las afinidades de unión son algo inferiores a lo previsto y se pueden deber a la calidad del receptor soluble que no es tan alta como estaba previsto. La diferencia de 0.9 veces entre la albúmina de cerdo nativo y HSA tipo salvaje sin embargo todavía indica que el cerdo es un modelo animal adecuado para estudios farmacocinéticos de HSA y variantes de HSA puesto que la albúmina de cerdo nativo, aunque está presente en cantidades en exceso en comparación con HSA, no superará la HSA para la unión de pFcRn.

[0103] La etiqueta c-myc parece afectar a la unión de HSA tipo salvaje al FcRn de cerdo, sin embargo, a tal baja afinidad (KD alta) cualquier pequeño trastorno en la molécula puede afectar a la unión. Para las variantes de albúmina, la etiqueta c-myc parece mejorar la unión (K573P) o no afectarla. Todas las variantes de HSA se enlazan con FcRn de cerdo con afinidad superior que HSA tipo salvaje y PSA. La variante de HSA T83N+N111E+K573P tiene la asociación más rápida a FcRn de cerdo y la variante de HSA E492G+K573P+K574H+Q580K forma los complejos más estables (índice de disociación más bajo (kd)).

[0104] Un estudio comparativo usando FcRn de macaco cangrejero mostró que la afinidad de unión de HSA tipo salvaje es 0,9 veces cuando se compara con la unión de albúmina de macaco cangrejero nativo para FcRn de macaco cangrejero. Esto indica que macaco cangrejero y cerdo son comparables respecto a las proporciones aunque las afinidades de unión como tal son algo más altas para el FcRn de macaco cangrejero, como se ha mencionado anteriormente esto puede sin embargo deberse a FcRn de cerdo de baja calidad en el presente estudio. Las etiquetas c-myc tienen muy poco efecto en la afinidad de unión.

[0105] HSA tipo salvaje y SA de cerdo se enlazan muy mal con FcRn de cobaya. La fusión de una etiqueta c- myc a las albúminas parece inhibir el enlace. La SA de cobaya tiene la afinidad máxima para FcRn de cobaya cuando se compara con SA tipo salvaje de cerdo y humano al igual que variantes de albúmina humana. Por esta razón la cobaya no es un modelo animal deseado para la evaluación de una o más (varias) propiedades farmacocinéticas de HSA in vivo.

Ejemplo 5 Estudio de PK en cerdos

[0106] Estudios de PK fueron realizados en 8 minicerdos de Gottingen hembra (Ellegaard Gottingen Minipigs A/S, Sor0 Landevej 302, DK-4261 Dalmose). Al principio del periodo de aclimatación los minicerdos tenían aproximadamente 5 meses de edad y un peso corporal de 7.8 - 9.7 kg. Los animales fueron divididos en 4

5

10

15

20

25

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35

40

grupos con 2 animales por grupo. HSA tipo salvaje marcada con c-myc en el extremo N-terminal, variante de albúmina K573P marcada con c-myc en el extremo N-terminal, variante de albúmina E492G+K573P+K574H+Q580K marcada con c-myc en el extremo N-terminal y variante de albúmina T83N+N111E+K573P marcada con c-myc en el extremo N-terminal fueron administradas i.v. por medio de un venflon en una vena de oreja en dos animales en una dosis de 1 mg/kg (0,2 ml/kg) de una solución de dosis de 5 mg/ml según tabla 8:

Tabla 8: tabla de administración de dosis para estudio de PK en cerdos

Grupo n°.

Animal n°. N° de animales Compuesto Vía de admin. Dosis (mg/kg) Volumen de dosis (ml/kg)

1

1-2 2 HSA tipo salvaje marcada con c-myc en el extremo N-terminal i.v. 1 0.2

2

3-4 2 Variante de albúmina K573P marcada c- myc en el extremo N-terminal i.v. 1 0.2

3

5-6 2 Variante de albúmina marcada con c-myc E492G+K573P+K574H+Q580K en el extremo N-terminal i.v. 1 0.2

4

7-8 2 Variante de albúmina T83N+N111E+K573P marcada con c- myc en el extremo N-terminal i.v. 1 0.2

[0107] Muestras de sangre de dos ml (2ml) fueron recogidas a partir de una vena yugular en los tubos de ensayo de citrato sódico en los intervalos siguientes: predosis, 0.25, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312, 360, 408, 456, y 504 horas después de la dosificación. Muestras de sangre fueron mantenidas en hielo hasta max 20 min. antes de la centrifugación a 4°C, 10 min., 2000 G. Plasma fue inmediatamente transferido de cada muestra a tres tubos de 750 gL de Micronic marcados de forma apropiada, aproximadamente 250 gl en cada uno y finalmente el plasma restante compartido entre los tres tubos, y colocados en estanterías. Las muestras de plasma fueron almacenadas a -80°C hasta realizar el ensayo.

Resultados:

[0108] El análisis de PK fue exitoso solo para 4 animales de los 8 animales evaluados como juzgados desde el coeficiente de determinación para la pendiente de fase de eliminación terminal de la curva concenctración- tiempo en el plasma, R2 (Rsq), que necesita ser superior a 0.85 para obtener estimaciones aceptables de AUC, t1/2, Vz, y CL. El resultado del estudio farmacocinético de los animales 1,2,5 y 7 se muestra en tabla 9.

Tabla 9: parámetros farmacocinéticos de estudio de PK en cerdos

Compuesto

Animal R2 Cmax (Ng/ml) AUC (H.gg/mL) ti/2 (h) Vz (ml/kg) CI (ml/H/kg)

HSA tipo salvaje

1 0.86 16.4 926.12 192.34 299.63 1.08

2

0.95 9.25 554.03 197.75 514.94 1.8

Media

0.9 12.83 740.08 195.05 407.28 1.44

SD

0.06 5.06 263.11 3.82 152.25 0.51

E492G+K573P+K574H+Q580K

5 0.95 8.55 817.82 354.95 626.15 1.22

T83N+N111E+K573P

7 0.93 10.47 1059.89 333.24 453.6 0.94

Conclusión:

[0109] Las variantes de albúmina humana E492G+K573P+K574H+Q580K y T83N+N111E+K573P mostraron una vida media 1.8 y 1.7 veces más larga, respectivamente, en comparación con albúmina humana tipo salvaje. Esto indica claramente que la extensión de vida media de variantes de albúmina puede ser comparado con la vida media de HSA tipo salvaje y una diferenciación clara en la vida media entre una HSA variante y HSA tipo salvaje se pueden observar con el modelo corriente.

[0110] De manera suficientemente interesante la variante de HSA con la vida media más larga se correlaciona con la variante de HSA que tiene la afinidad de unión más fuerte en el Biacore en el FcRn de cerdo (véase ejemplo 4). Sin embargo, antes de concluir que tal correlación existe hay que tener en cuenta que los datos de PK para las variantes se basan en solo un animal para cada variante.

[0111] La prolongación en la vida media es un resultado de índice de aclaramiento disminuido que a su vez refleja AUC aumentado.

Ejemplo 6 Estudio de PK de macaco cangrejero comparativo

5

10

15

20

25

30

[0112] Los estudios de PK fueron realizados en 8 macacos cangrejero hembra (Huntingdon Life Sciences, Huntingdon Research Centre. Woolley Road, Alconbury. Huntingdon. Cambridgeshire PE28 4HS. UK). Al inicio del periodo de aclimatación los macacos cangrejero tenían 2.5 - 3.0 años de edad y tenían un peso corporal de 2.5 - 3.5kg. Los animales fueron divididos en 4 grupos con 2 animales por grupo. HSA tipo salvaje marcada con c-myc en el extremo N-terminal, la variante K573P de albúmina marcada con c-myc en el extremo N-terminal, la variante E492G+K573P+K574H+Q580K de albúmina marcada con c-myc en el extremo N-terminal y la variante T83N+N111E+K573P de albúmina marcada con c-myc en el extremo N- terminal fueron administradas i.v. por medio de una vena safena para dos animales en una dosis de 1 mg/kg (1 ml/kg) de una solución de dosis de 1 mg/ml según la tabla 10.

Tabla 10: Tabla de administración de dosis para estudio de PK de macaco cangrejero

Grupo n°.

Animal n°. N° de animales Compuesto Vía de admin. Dosis (mg/kg) Volumen de dosis (ml/kg)

1

412, 414 2 HSA tipo salvaje marcada con c-myc en el extremo N-terminal i.v. 1 1.0

2

416, 418 2 Variante K573P de albúmina marcada con c-myc en el extremo N-terminal i.v. 1 1.0

3

420, 422 2 Variante E492G, K573P, K574H, Q580K de albúmina marcada con c- myc en el extremo N-terminal i.v. 1 1.0

4

424, 426 2 Variante T83N+N111E+K573P de albúmina marcada con c-myc en el extremo N-terminal i.v. 1 1.0

[0113] Muestras de sangre de 0.8mL fueron extraidas de animales no anestesiados por medio de punción de vena adecuada usando una lanceta estéril en los tubos estándar de HLS con citrato sódico 3.8% (0.13M) en los intervalos siguientes: predosis, 0.25, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192, 240, 288, 336, 384, 432, 480, 528, 576, 624, 720, 816, 912, 1008,1104 y 1200 horas después de la dosificación. Muestras fueron mezcladas íntegramente por inversión e inmediatamente colocadas en el hielo húmedo para un máximo de 10 minutos antes de centrifugación (2000 x g durante 10 minutos a 4°C). Plasma fue pipetado en tubos de 1.4 mL de Micronic marcados, congelado en el hielo seco y mantenido a - 80°C. Las muestras de plasma fueron almacenadas a -80°C hasta que se realizó el ensayo.

Resultados

[0114] Los resultados del estudio farmacocinético se muestran en la tabla 11.

Tabla 11 parámetros farmacocinéticos de estudio de PK de macaco cangrejero

Compuesto

R2 Cmax (Mg/ml) AUC (H.Mg/ml) ti/2 (h) Vz (ml/kg) CI (ml/H/kg)

HSA tipo salvaje

0.97 11.48 511.46 133.29 375.98 1.96

0.98

14.36 573.58 130.2 327.49 1.74

Media

0.97 12.92 542.52 131.76 351.74 1.85

SD

0.004 2.035 43.92 2.19 34.29 0.15

K573P

0.97 11.78 865.94 212.85 354.61 1.15

0.98

10.32 830.54 208.64 362.42 1.2

Media

0.98 11.05 848.24 210.75 358.52 1.18

SD

0.01 1.03 25.03 2.97 5.52 0.04

E492G+K573P+K574H+ Q580K

0.94 10.54 908.44 293.88 466.71 1.1

0.93

25.51 1560.2 279.04 258.02 0.64

Media

0.94 18.02 1234.32 286.46 362.37 0.87

SD

0.01 10.58 460.86 10.50 147.57 0.33

T83N+N111E+K573P

0.96 12.21 1383.1 339.36 353.98 0.72

0.92

15.8 1357.29 301.28 320.24 0.74

Media

0.94 14.00 1370.19 320.32 337.11 0.73

SD

0.03 2.54 18.25 26.93 23.86 0.01

Conclusión:

[0115] Las variantes de albúmina humana K573P, E492G+K573P+K574H+Q580K y T83N+N111E+K573P mostraron una vida media 1.6, 2.1 y 2.4 veces más larga, respectivamente, en comparación con albúmina humana tipo salvaje

[0116] La prolongación en la vida media es un resultado de índice de aclaramiento disminuido que a su vez refleja AUC aumentado.

LISTADO DE SECUENCIAS 5

[0117]

<110> Novozymes Biopharma DK A/S Universidad de Oslo

10 <120> Modelo de animal farmacocinético

<130> 12568-WO-PCT

<150> EP13155554.2 15 <151> 2013-02-16

<150> EP13180587.1 <151> 2013-08-15

20 <160> 23

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

25 <211> 609

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Método para la evaluación de una o más propiedades farmacocinéticas de una HSA variante en comparación con HSA tipo salvaje que comprende

   a. seleccionar un conejo transgénico doble o un roedor transgénico doble donde los transgenes son albúmina humana y un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16;

   b. administrar la HSA variante a un animal y la HSA tipo salvaje a otro animal de conejo o roedor seleccionado en (a); y

   c. medir la una o más propiedades farmacocinéticas de la HSA variante y la HSA tipo salvaje.
2. 2. Método según la reivindicación 1, donde el FcRn nativo tiene una valina en la posición que corresponde con la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.
3. 3. Método según la reivindicación 2, donde el roedor transgénico doble es un ratón, cobaya o rata.
4. 4. Método según la reivindicación 3, donde el FcRn además tiene una valina en la posición 52 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16.
5. 5. Método según la reivindicación 3 o 4, donde el transgen FcRn es seleccionado de humano, chimpancé, macaco, vaca, cabra, oveja, camello y cerdo.
6. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la HSA variante y HSA tipo salvaje se modifica por fusión, conjugación o asociación con un socio, tal como un agente terapéutico.
7. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde una HSA variante o HSA variante modificada con una o más propiedades farmacocinéticas mejoradas cuando se compara con HSA tipo salvaje o HSA tipo salvaje modificada, se selecciona para usar en una prueba preclínica.
8. 8. Método según la reivindicación 7, donde la HSA variante tiene una vida media más larga que HSA tipo salvaje.
9. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la HSA variante comprende una sustitución, inserción y/o deleción con respecto a HSA tipo salvaje.
10. 10. Uso de un modelo transgénico de conejo o de roedor que expresa un FcRn con una histidina en la posición que corresponde con la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y albúmina humana y que se ha desactivado para las proteínas nativas correspondientes para comparar una o más propiedades farmacocinéticas de una molécula de control con una o más propiedades farmacocinéticas de una molécula de prueba donde la molécula de control comprende HSA tipo salvaje y la molécula de prueba comprende una variante de HSA.
11. 11. Uso según la reivindicación 10, donde la molécula que comprende HSA tipo salvaje y la molécula que comprende HSA variante además comprenden un socio de conjugación, socio de fusión o socio de asociación, tal como un agente terapéutico.
12. 12. Uso según la reivindicación 10 u 11, donde se evalúa el efecto en las propiedades farmacocinéticas de un socio seleccionado y el método para unirlo a la molécula de control y de prueba.
13. 13. Uso según la reivindicación 12, donde el socio es un socio de fusión fusionado con o sin enlaces diferentes en el extremo C-terminal y/o N-terminal de la albúmina (los enlazadores son idénticos para la molécula de control y de prueba).
14. 14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde la HSA variante comprende una sustitución, inserción y/o deleción con respecto a HSA tipo salvaje.
15. 15. Animal transgénico de conejo o de roedor cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen endógeno FcRn HC y gen de albúmina de suero que previene la expresión de una proteína de FcRn HC de animal funcional y albúmina de suero de animal funcional y el genoma comprende además una secuencia de ADN heterólogo que codifica un FcRn HC humano (hFcRn HC) que es al menos 90% idéntico a la SEQ ID N.°: 16 y tiene una histidina en la posición 161 cuando se alinea con la SEQ ID N.°: 16 y una secuencia de ADN heterólogo que codifica la albúmina de suero humano que es al menos 95% idéntico a la SEQ ID N.°: 2, y donde el animal expresa una proteína hFcRn HC funcional y HSA funcional.
16. 16. Animal transgénico según la reivindicación 15, donde el animal es un ratón.

    co

    00

    imagen1

    cy

    imagen2

    Figura 2

    Unidades de resonancia (UR)

    imagen3

    imagen4

    imagen5

    l5‘

    c

    imagen6

    Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s)

    imagen7

    imagen8

    imagen9

    Unidades de resonancia (UR)

    imagen10

    imagen11

    Unidades de resonancia (UR)

    imagen12

    i5‘

    c

    CU

    UJ

    co

    Ul

    imagen13

    imagen14

    Unidades de resonancia (UR)

    imagen15

    imagen16
17. 31.

    id' £

    OJ

    imagen17

    CD

    Unidades de resonancia (UR)

    Unidades de resonancia (UR)

    imagen18

    imagen19

    imagen20

    Unidades de resonancia (UR) mmm Unidades de resonancia (UR) ___ Unidades de resonancia (UR)

    Figura 5

    A

    dFcRn

    imagen21

    Tiempo (3} dFcRn

    imagen22

    0 100200300 400 500600 700600 Tiempo (s)

    dFcRn

    imagen23

    B

    dFcRn

    imagen24

    Tiempo (3) dFcRn

    imagen25

    J

    Tiempo (s)

    dFcRn

    imagen26

    dFcRn

    dFcRn

    imagen27

    Tiempo (S) dFcRn

    imagen28

    H

    Tiempo (s} dFcRn

    imagen29

    0 100200300400 500 600 700 800 Tiempo (s)

    imagen30

    K

    dFcRn

    Tiempo (s)

    dFcRn

    imagen31

    imagen32

    Tiempo (s)

    Tiempo {s)

    100200 300400 500600 700800 Tiempo (5)

    Unidades de resonancia (UR) Unidades de resonancia (UR) Unidades de resonancia (UR)

    imagen33

    Figura 7

    humano

    macaco

    vaca

    cabra

    oveja

    camello

    cerdo

    perro

    cobaya

    conejo

    rata

    ratón

    52

    AWVWENQVSWYW...

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    AWVWESQVSWYW...

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    AWVWETQVSWYW...

    AWIWESQVSWYW...

    AWIWENQVSWYW...

    AWMWENQVSWYW...

    ★★★★★★

    pFcRn pFcRn

    imagen34

    G

    pFcRn

    imagen35

    K

    pFcRn

    imagen36

    H

    pFcRn

    imagen37

    L

    pFcRn

    imagen38

    161

    CPHRLREHLER

    CPHRLREHLER

    CPHRLLGHLER

    CPHRLLGHLER

    CPHRLLGHLER

    CPHRLLGHLER

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    CPQRLLGHLER

    CPQRLLGHLER

    CPQRLLGHLER

    CPERLLGHLER

    CPERLLGHLER

    ★ ★ ★★ ★★★★ *